ES2295886T3

ES2295886T3 - Metodo de amplificacion.

Info

Publication number: ES2295886T3
Application number: ES04743697T
Authority: ES
Inventors: Alexander Graham; Andrew Cassidy
Original assignee: AstraZeneca AB
Current assignee: AstraZeneca AB
Priority date: 2003-08-16
Filing date: 2004-08-12
Publication date: 2008-04-16
Anticipated expiration: 2024-08-12
Also published as: US20070105090A1; DE602004010273D1; JP2007502610A; EP1654360A1; GB0319332D0; DK1654360T3; EP1654360B1; DE602004010273T2; WO2005019452A1

Abstract

Híbrido de ADNc-ARN que comprende la síntesis de una primera hebra de ADNc hibridada a un ARN, en el que el ADNc comprende, a partir del extremo 5'', una secuencia amplificadora a partir de la que existe en 3'' un promotor de ARN polimerasa unido, de manera operacional, a una región de hibridación del ARN, y en el que al menos un nucleótido no moldeado, en el extremo 3'' de la primera hebra del ADNc, se hibrida con un oligonucleótido de intercambio de moldes, y en el que la secuencia amplificadora y el oligonucleótido de intercambio de moldes contienen la misma secuencia.

Description

Método de amplificación.

Campo de la invención

La presente invención se refiere generalmente al campo de la tecnología de ADN recombinante.

En particular, la presente invención se refiere a métodos mejorados para producir poblaciones heterogéneas amplificadas de ARN a partir de cantidades limitadas de ARN de partida.

Antecedentes de la invención

En los últimos años ha aumentado enormemente el campo de la obtención de perfiles de expresión génica, y ahora se puede realizar en una amplia escala genómica. La identificación de genes expresados diferencialmente se está usando para la investigación médica, clínica y biológica para ayudar a comprender los mecanismos moleculares que subyacen a los procesos biológicos, incluyendo la diferenciación y desarrollo de enfermedades - tal como la tumorigénesis -. La obtención de perfiles de expresión génica se puede usar a lo largo de un amplio intervalo de aplicaciones, por ejemplo para la identificación de nuevas dianas para la intervención terapéutica, identificación de marcadores de diagnóstico y de pronóstico potenciales, para ayudar a comprender la respuesta clínica a fármacos y su resultado, e identificar respuestas toxicológicas. Los conjuntos de ADN de secuencias específicas de genes inmovilizadas (sondas) en una variedad de plataformas - tales como macroconjuntos, microconjuntos o conjuntos de oligonucleótidos de alta densidad - sobre diferentes soportes sólidos (por ejemplo, nailon, membranas, portaobjetos de vidrio o chips de silicio/de cerámica) son aplicables ampliamente en diferentes áreas de la investigación genómica.

El mecanismo usado de forma más habitual para la amplificación de ARN es un método de amplificación lineal a base de T7 desarrollado en primer lugar por Van Gelder et al (1990), Eberwine et al (1992) y Philips y Eberwine (1996), y se describe en los documentos US 6.291.170, US 5.891.636, US 5.716.785 y US 5.545.522. En este procedimiento, se usa un cebador poly(dT) sintético, que contiene el promotor de ARN polimerasa del fago T7, para cebar la síntesis de la primera hebra de ADNc mediante transcripción inversa. La segunda hebra de ADNc se sintetiza mediante digestión limitada con ARNasa H, seguido de la síntesis de la segunda hebra con ADN polimerasa I de E. coli. El ARN antisentido amplificado (ARNa) se obtiene a partir de la transcripción in vitro del molde de ADNc bicatenario, usando ARN polimerasa de T7.

Este procedimiento es la base de los conjuntos de oligonucleótidos de Affymetrix GeneChip, en los que se incorporan ribonucleótidos biotinilados en el ARNa, también conocido como ARN complementario o (véase el Manual Técnico del Análisis de Expresión de Affymetrix GeneChip®, y Mahadevappa y Warrington (1999)), y también es la base de los microconjuntos de vidrio (Pabón et al., (2001)).

Aunque este método implica una etapa de amplificación con ARN polimerasa de T7, típicamente se usa con 5-25 \mug de ARN total. Sin embargo, a fin de obtener cantidades suficientes de ARN amplificado (ARNa) para experimentos con microconjuntos, los investigadores han recurrido a dos o más rondas de síntesis de ADNc acopladas con la amplificación con T7, para generar un perfil de ARNm representativo, y esto les ha permitido combinar la microdisección con la tecnología de conjuntos (Luo et al. (1999), Ohyama et al. (2000), Affymetrix Technical Note GeneChip® Eukaryotic Small sample Target Labelling Assay Version II, y Luzzi et al. (2001)).

El documento WO 2001/073134 y Wang et al. (2000) describen un método que usa "intercambio de moldes", y que disminuye la cantidad requerida de ARN de partida, e incrementa la producción de mensaje de longitud completa durante la producción de ADNc ds (véase más abajo para antecedentes adicionales en SMART). El sistema "SMART^{TM}" (mecanismo de intercambio en el extremo 5' de los moldes de ARN), ofrecido por CLONTECH Laboratories (Palo Alto, CA), es un sistema de intercambio de moldes comercialmente disponible recomendado para uso en construcción de librerías. El método de Wang et al. también difiere de los métodos previos (véanse Phillips y Eberwine, 1996; y el documento US 5.891.636), por cuanto usó el intercambio de moldes en lugar de usar el método de Gubler-Hoffman (Gene 25:263-269, 1983) que emplea ARNasa H y ADN polimerasa I de E. coli para sintetizar la segunda hebra de ADNc.

Wang et al. (2000) han descrito un protocolo de amplificación a base de T7 modificado con un cebador de intercambio de moldes SMART^{TM} que se usa para generar teóricamente un ADNc bicatenario de longitud completa. Se demostró que la fidelidad de ARNa amplificado era comparable entre los perfiles de expresión de 1:10000 a 1:100000 del ARN de entrada usado habitualmente, y los observados con ARN de polyA+ convencional o con ARN total. Hu y colaboradores (2002) compararon muestras amplificadas y no amplificadas para evaluar un protocolo similar a base de T7 con un mecanismo de intercambio de moldes adoptado a partir de Wang et al. Sus resultados mostraron una concordancia entre las muestras amplificadas y las no amplificadas, y se verificaron cuatro genes expresados y dos genes expresados diferencialmente usando un ensayo

\hbox{inmunohistoquímico y un
ensayo de  transferencia Northern y Western.}

Incyte Pharmaceuticals ha descrito un método en el documento WO 99/025873 en el que primero se convierte ARNm en ADNc ds con un cebador que contiene un promotor de ARN polimerasa y al menos un sitio de cebado. El ADNc ds resultante se amplifica entonces enzimática y asimétricamente, mediante PCR, usando un cebador capturable individual, por ejemplo un cebador biotinilado, para producir cantidades amplificadas de ADNc antisentido. Tras la captura del ADNc capturable sobre un soporte sólido, el ADNc capturado resultante se convierte en ADNc ds, que entonces se puede usar para una variedad de fines.

Las modificaciones de la tecnología de amplificación a base de T7 también se han usado en dos kits de amplificación comercialmente disponibles. Los kits de amplificación de ARN RiboAmp^{TM} (Arcturus) logran rendimientos elevados de ARN amplificado, con un método de amplificación lineal patentado. Este método utiliza una o dos rondas de amplificación a base de T7, dependiendo de las cantidades de material de partida. El kit de amplificación de ARNm RealArt^{TM} (Artus GmbH) proporciona una tecnología de amplificación a base de T7. El ARNm se convierte a ADNc con un cebador poly(dT) anclado, y entonces se realiza la síntesis de la segunda hebra usando una "mezcla de Box/cebador aleatorizado", que genera una representación al azar del ADNc completo. El ADNc cebado al azar se desnaturaliza y se ceba con un promotor de T7/cebador poly(dT). Esto conduce a ADNc bicatenario con un promotor T7 en un extremo, que se puede usar como un molde para una transcripción in vitro.

La reacción en cadena de polimerasa (PCR) es una técnica extremadamente poderosa para amplificar secuencias específicas de ácidos nucleicos, como se describe en los documentos US 4.683.202 y US 4.683.195. La PCR comprende típicamente tratar hebras complementarias separadas de un ADN diana con dos cebadores oligonucleotídicos para formar productos de extensión de cebadores complementarios en ambas hebras, que pueden actuar como moldes para sintetizar copias de las secuencias de ácidos nucleicos deseadas. Las etapas de separación y síntesis se repiten en un sistema automatizado usando polimerasas termoestables, pudiéndose lograr la duplicación esencialmente exponencial de las secuencias diana.

La amplificación de ADNc mediante PCR requiere la presencia de sitios de unión de cebadores en ambos extremos del ADNc. Estos sitios de cebadores se pueden unir mediante un número de métodos, incluyendo a) la adición de una cola de homopolímero en el extremo 3' de la primera hebra de ADNc (Akowitz y Manuelidis, (1989), Belyavsky et al., (1989), Domec, et al. (1990), y Brady, et al. (1990)); b) la ligación de oligonucleótido de anclaje monocatenario al extremo 3' de la primera hebra de ADNc (Apte y Siebert, (1993)); c) la ligación de la secuencia oligonucleotídica de anclaje monocatenaria al extremo 5' de ARNm (Fromont-Racine et al. (1993), Kato, et al. (1994), Maruyama y Sugano, S. (1994)); d) la ligación de los adaptadores bicatenarios al extremo 5' del ADNc bicatenario (Frohman y Dush, (1988)); y e) la adición de una secuencia amplificadora en los extremos 5' y 3' del ADNc monocatenario en la reacción de síntesis de la primera hebra mediante un mecanismo de intercambio de moldes (SMART^{TM}, Mecanismo de Intercambio en el Extremo 5' de Transcritos de ARN, BD Biosciences Clontech), como se describe en Chenchik et al. (1998) y Zhu, et al. (2001)). El intercambio de moldes también se describe en los documentos US 5.962.271 y US 5.962.272.

Las técnicas de amplificación basándose en la reacción en cadena de polimerasa mediante transcripción inversa (RT-PCR) han sido descritas para la amplificación global de los ARNm a partir de células individuales (Rappolee, et al. (1989), Brady, et al. (1990), Cheng, et al. (1996), O'Brien, et al. (1994)). Los enfoques a base de PCR, tales como los descritos por Brady et al. (1990), también se han empleado para observar la expresión génica mediante amplificación de ARNm global, seguido del análisis de conjuntos de ADNc (Theilgaard-Monch, et al. (2001)). Sin embargo, este método está diseñado para limitar el tamaño de la primera hebra de ADNc a alrededor de 300-700 bases, y de esta manera se han de diseñar conjuntos correspondientes de forma que los clones dispuestos en conjuntos contengan los extremos 3' de cada ADNc.

Recientemente, se ha descrito un procedimiento de RT-PCR global rápido y muy optimizado (Iscove, et al. (2002)), que también se basa en métodos descritos previamente por Brady et al. (1990). Este procedimiento implica la transcripción inversa de una primera hebra de ADNc cebada mediante poly(dT), la adición de una cola de poly(dA) con transferasa terminal, y la amplificación exponencial subsiguiente usando un cebador que contiene poly(dT) individual. La transcripción inversa está limitada a sólo unos pocos cientos de bases de secuencia de extremo 3' limitando las concentraciones de desoxinucleótidos y el tiempo de la reacción. Estas condiciones pretendían proporcionar una probabilidad más uniforme de muestrear transcritos de ARNm individuales y una eficacia de la amplificación más uniforme a lo largo de todos los ciclos. Este enfoque de RT-PCR global conservó la abundancia de relaciones a través de la amplificación, y produjo resultados reproducibles a partir del intervalo de picogramos del ARN total obtenido a partir de células individuales.

Se ha desarrollado un método de amplificación a base de PCR, la PCR de amplificación del extremo tres prima (TPEA-PCR), que da como resultado la amplificación global del extremo 3' de todos los ARNm presentes en una muestra (Dixon, et al. (1998)). La amplificación mediante PCR se produce entre cebadores incorporados en la primera hebra de ADNc durante la transcripción inversa, y un cebador de segunda hebra que tiene un extremo 3' parcialmente degenerado y está diseñado para hibridarse una vez cada kilobase.

Recientemente, otro método de amplificación a base de PCR "la PCR equilibrada" fue descrito por Makrigiorgos, et al. (2002). La PCR equilibrada permite una amplificación equilibrada de fragmentos a partir de dos ADN complejos, incluso después de tres rondas secuenciales de PCR. Se etiquetan dos muestras distintas de ADN genómico o ADNc con oligonucleótidos que contienen tanto una secuencia de ADN común como una secuencia de ADN única. Las muestras se reúnen y se amplifican en un tubo de PCR individual, usando la etiqueta de ADN común, y por lo tanto no deberían de haber diferencias en la eficiencia de la amplificación. Las muestras reunidas amplificadas mediante PCR se pueden separar usando la etiqueta de ADN única para cada muestra de ADN genómico individual. El principio de este método ha sido validado con ADN sintético, ADN genómico, y ADNc aplicado sobre microconjuntos. Eliminando la tendencia de la PCR, este enfoque de PCR equilibrada debería de permitir el análisis genético en tejidos microdiseccionados con láser muy pequeños, material archivado embebido en parafina, o células individuales. Sin embargo, el uso normal de este

\hbox{método para la amplificación  de los ARN
procedentes de biopsias no se ha dado a conocer.}

Roche Applied Science, en su kit de amplificación Microaarray Target Amplification kit (número de catálogo 3310191), ha descrito un método de amplificación mediante PCR basado en la transcripción inversa, seguido de una amplificación mediante PCR al azar del ADNc y de la transcripción in vitro del producto de PCR resultante con ARN polimerasa de T7. En este procedimiento, se transcriben de forma inversa cantidades de nanogramos de ARN total en ADNc usando un cebador de poly(dT) modificado (TAS-T7 poly(dT)24). La Secuencia de Amplificación de Diana (TAS) única no tiene ninguna homología con ninguna secuencia humana conocida, genera el anclaje 3' en el ADNc para la amplificación mediante PCR subsiguiente. La secuencia del promotor de T7 se añade para permitir la generación de dianas de ARNc marcadas, mediante la transcripción in vitro. Se usa un cebador TAS-(dN)10 a fin de incluir una secuencia amplificadora 5' en el ADNc, y se usa para la iniciación de la síntesis de la segunda hebra de ADNc. Después se lleva a cabo la PCR con el cebador de TAS, y se ha de determinar el número óptimo de ciclos. Después, los productos de la PCR se purifican y se usan para la transcripción in vitro.

El ADNc generado mediante SMART^{TM} se ha usado para varias aplicaciones, incluyendo la construcción de librerías de ADNc, y como sondas de hibridación para ADNc y microconjuntos a base de oligonucleótidos. La tecnología de SMART^{TM}, acoplada con PCR, ha permitido el uso de menores cantidades de ARN total de partida, aunque sólo hay datos limitados para apoyar la utilidad de esta tecnología en los análisis de microconjuntos, en los que es importante mantener la representación de ARNm [Spirin, et al. (1999), Gonzales et al. (1999), Vernon, et al. (2000), Livesey, et al. (2000), Zhumabayeva, et al. (2001) y Fink, et al. (2002)].

La limitación de estas tecnologías es el requisito de cantidades relativamente grandes de ARN total intacto. A título de ejemplo, los procedimientos de marcaje de microconjuntos típicos requieren 0,5-4 \mug de ARN de poly(A)+, o 5-50 \mug de ARN total, por microconjunto. Esta cantidad de ARN de poly(A)+ o de ARN total se puede obtener a partir de muestras de tejido que pesan más de 50-100 mg; sin embargo, muchas muestras tienen cantidades significativamente menores que esto, por ejemplo muchas biopsias clínicas. Un estudio piloto reciente, de Assersohn et al. (2002), mostró que sólo el 15% de los aspirados de agujas finas (FNA) procedentes de cáncer de mama humano produjeron suficiente ARNm para el análisis de conjuntos de expresión.

Es muy deseable en la técnica un método simple y robusto que no esté restringido por una baja eficiencia y el uso de múltiples etapas que consumen tiempo, y que permita la amplificación a partir de cantidades pequeñas de ARN, a la vez que mantenga la sensibilidad, reproducibilidad, y que pueda identificar eficazmente genes expresados diferencialmente.

Aspectos de sumario de la presente invención

La presente invención combina el uso de intercambio de moldes con amplificación de ácidos nucleicos - tal como PCR - para generar productos de amplificación representativos de una población de ARN completa. Una secuencia promotora de ARN polimerasa permite que se realice la amplificación a base de transcripción sobre los productos de amplificación derivados, de forma que se produzca ARN amplificado antisentido (ARNa) o ARN complementario (ARNc) para aplicaciones posteriores subsiguientes.

Ventajosamente, el ARN generado según la presente invención es antisentido, y por lo tanto tiene utilidad para uso en conjuntos de ADNc y conjuntos de oligonucleótidos (oligos en puntos u oligos sintetizados en fase sólida tales como Affymetrix). Los conjuntos comerciales o "caseros" se basan en ADNc o en oligos (típicamente se disponen oligos de sentido), y por lo tanto la producción del ARNc antisentido que se describe aquí tiene utilidad en cualquier montaje. Si se genera ARN sentido, entonces su uso estaría limitado a conjuntos de ADNc y no a la mayoría de los conjuntos de oligonucleótidos más corrientes.

La presente invención también supera el obstáculo de las muestras de tejidos limitadas.

En un primer aspecto, la presente invención se refiere a un híbrido de ADNc-ARN que comprende una síntesis de una primera hebra de ADNc hibridada sustancialmente a ARN, en la que el ADNc comprende una secuencia amplificadora y una región de hibridación de ARN ligada operablemente a un promotor de ARN polimerasa, y en el que se hibrida al menos un oligonucleótido no moldeado, en el extremo 3' de la primera hebra de ADNc, a un oligonucleótido de intercambio de moldes.

En un segundo aspecto, la presente invención se refiere a un método para amplificar ARN en una muestra, que comprende las etapas de: (a) producir un oligonucleótido de síntesis de ADNc que comprende una secuencia amplificadora y una región de hibridación de ARN ligada operablemente a un promotor de ARN polimerasa; (b) hibridar la región de hibridación de ARN del oligonucleótido de síntesis de ADNc al ARN, en condiciones adecuadas para producir un complejo de ADNc-ARN; (c) incubar dicho complejo de ADNc-ARN en condiciones que permitan la extensión, dependiente del molde, del oligonucleótido de síntesis de ADNc, para generar un híbrido de ADNc-ARN; (d) poner en contacto dicho híbrido de ADNc-ARNm con un oligonucleótido de intercambio de moldes, en condiciones que permitan la extensión, dependiente del molde, de dicho ADNc, de tal manera que el extremo 3' del ADNc comprenda una secuencia complementaria a dicho oligonucleótido de intercambio de moldes; (e) proporcionar un cebador de amplificación en condiciones para generar productos de amplificación bicatenarios que corresponden sustancialmente a la síntesis de la primera hebra de ADNc, de tal manera que los productos de amplificación de ADNc comprendan un promotor de ARN polimerasa bicatenario; y (f) incubar dichos productos de amplificación de ADNc, que comprenden dicho promotor de ARN polimerasa bicatenario, en condiciones que permitan la transcripción in vitro para generar ARN amplificado.

En un tercer aspecto, la presente invención se refiere a un método para preparar una librería de expresión de una célula o una población de células, que comprende las etapas de: (a) proporcionar un oligonucleótido de síntesis de ADNc, que comprende una secuencia amplificadora y una región de hibridación de ARN ligada operablemente a un promotor de ARN polimerasa; (b) poner en contacto dicho oligonucleótido de síntesis de ADNc con una población de ARNm procedente de dicha célula o población de células, en condiciones para permitir la hibridación de dicho oligonucleótido de síntesis de ADNc a ARNm, para producir un complejo de ADNc-ARNm; (c) incubar dicho complejo de ADNc-ARNm en condiciones que permitan la extensión, dependiente del molde, de dicho oligonucleótido de síntesis de ADNc, para generar un híbrido de ADNc-ARNm; (d) poner en contacto dicho híbrido de ADNc-ARNm con un oligonucleótido de intercambio de moldes, en condiciones que permitan la extensión, dependiente del molde, de dicho ADNc, de forma que el extremo 3' del ADNc del híbrido de ADNc-ARNm comprenda una secuencia complementaria a dicho oligonucleótido de intercambio de moldes; (e) poner en contacto un cebador de la amplificación con dicho híbrido de ADNc-ARNm, en condiciones que generen productos de amplificación bicatenarios que correspondan a la síntesis de la primera hebra de ADNc, de forma que los productos de amplificación de ADNc bicatenarios comprendan un promotor de ARN polimerasa bicatenario; y (f) incubar dichos productos de amplificación de ADNc bicatenarios que comprenden dicho promotor de ARN polimerasa bicatenario, en condiciones que permitan la transcripción in vitro para generar ARN amplificado.

En un cuarto aspecto, la presente invención se refiere a un método para preparar una librería de ADNc a partir de una colección de moléculas de ARNm, que comprende las etapas de: (a) proporcionar un oligonucleótido de síntesis de ADNc, que comprende una secuencia amplificadora y una región de hibridación de ARN ligada operablemente a un promotor de ARN polimerasa; (b) poner en contacto dicho oligonucleótido de síntesis de ADNc con la colección de los ARNm, en condiciones que permitan la hibridación de dicho oligonucleótido de síntesis de ADNc a ARNm, para producir un complejo de ADNc-ARNm; (c) incubar dicho complejo de ADNc-ARNm, en condiciones que permitan la extensión, dependiente del molde, de dicho oligonucleótido de síntesis de ADNc, para generar un híbrido de ADNc-ARNm; (d) poner en contacto dicho híbrido de ADNc-ARNm con un oligonucleótido de intercambio de moldes, en condiciones que permitan la extensión, dependiente del molde, de dicho ADNc de dicho híbrido, de forma que el extremo 3' del ADNc del híbrido de ADNc-ARNm comprenda una secuencia complementaria a dicho oligonucleótido de intercambio de moldes; (e) poner en contacto un cebador de PCR con dicho híbrido de ADNc-ARNm, en condiciones que generen productos de amplificación bicatenarios, que corresponden a la síntesis de la primera hebra de ADNc, de forma que los productos de amplificación de ADNc bicatenarios comprendan un promotor de ARN polimerasa bicatenario; (f) incubar dichos productos de amplificación de ADNc bicatenarios, que comprenden dicho promotor de ARN polimerasa bicatenario, en condiciones que permitan la transcripción in vitro para generar ARN amplificado; y (g) preparar una librería de ADNc a partir del ARN amplificado.

En un quinto aspecto, la presente invención se refiere a un método para llevar a cabo la hibridación sustractiva, que comprende las etapas de: (a) proporcionar un oligonucleótido de síntesis de ADNc, que comprende una secuencia amplificadora y una región de hibridación de ARN ligada operablemente a un promotor de ARN polimerasa; (b) poner en contacto el oligonucleótido de síntesis de ADNc con una colección de los ARNm, en condiciones que permitan la hibridación de dicho oligonucleótido de síntesis de ADNc a ARNm, en dicha muestra de ARN, para producir un complejo de ADNc-ARNm; (c) incubar dicho híbrido de ADNc-ARNm con una enzima, dNTPs y tampón, en condiciones que permitan la extensión, dependiente del molde, de dicho oligonucleótido de síntesis de ADNc, para generar un híbrido de ADNc-ARNm; (d) poner en contacto dicho híbrido de ADNc-ARNm con un oligonucleótido de intercambio de moldes, en condiciones que permitan la extensión, dependiente del molde, de dicho ADNc de dicho híbrido, de tal forma que el extremo 3' del ADNc del híbrido de ADNc-ARNm comprenda una secuencia complementaria a dicho oligonucleótido de intercambio de moldes; (e) poner en contacto un cebador de la amplificación con dicho híbrido de ADNc-ARNm, en condiciones para generar productos de amplificación bicatenarios que corresponden a la síntesis de la primera hebra de ADNc, de tal manera que los productos de amplificación de ADNc bicatenarios comprendan un promotor de ARN polimerasa bicatenario; (f) incubar dichos productos de amplificación de ADNc bicatenarios, que comprenden dicho promotor de ARN polimerasa bicatenario, en condiciones que permitan la transcripción in vitro para generar ARN amplificado; (g) poner en contacto dicho ARN amplificado con una población de ácidos nucleicos monocatenaria en el sentido opuesto a dicho ARN amplificado; (h) proporcionar la hibridación de las secuencias presentes en el ARN amplificado y en la población de ácidos nucleicos monocatenaria; e (i) aislar la población de ácidos nucleicos que siga siendo monocatenaria.

En un sexto aspecto, la presente invención se refiere a un método para detectar la expresión de un gen de interés, que comprende las etapas de: (a) proporcionar un oligonucleótido de síntesis de ADNc, que comprende una secuencia amplificadora y una región de hibridación de ARN ligada operablemente a un promotor de ARN polimerasa, en el que la región de hibridación de ARN comprende una secuencia que es sustancialmente homóloga al ARNm expresado por el gen de interés; (b) poner en contacto dicho oligonucleótido de síntesis de ADNc con una población de los ARNm en una célula o en una población de células, en condiciones que permitan la hibridación de dicho oligonucleótido de síntesis de ADNc a ARNm, para producir un complejo de ADNc-ARNm; (c) incubar dicho híbrido de ADNc-ARNm en condiciones que permitan la extensión, dependiente del molde, de dicho oligonucleótido de síntesis de ADNc, para generar un híbrido de ADNc-ARNm; (d) poner en contacto dicho híbrido de ADNc-ARNm con un oligonucleótido de intercambio de moldes, en condiciones que permitan la extensión, dependiente del molde, de dicho ADNc de dicho híbrido, de tal manera que el extremo 3' del ADNc del híbrido de ADNc-ARNm comprenda una secuencia complementaria a dicho oligonucleótido de intercambio de moldes; (e) poner en contacto un cebador de la amplificación con dicho híbrido de ADNc-ARNm, en condiciones para generar productos de amplificación bicatenarios que corresponden a la síntesis de la primera hebra de ADNc, de tal manera que los productos de la amplificación del ADNc bicatenarios comprendan un promotor de ARN polimerasa bicatenario; (f) incubar dichos productos de amplificación de ADNc bicatenarios, que comprenden dicho promotor de ARN polimerasa bicatenario, en condiciones que permitan la transcripción in vitro para generar ARN amplificado; y (g) determinar la presencia o ausencia de ARN amplificado, ARN

\hbox{amplificado el cual es complementario a ARNm que
corresponde  al gen de interés.}

En un séptimo aspecto, la presente invención se refiere a ARN amplificado obtenible mediante el método según el segundo aspecto de la presente invención.

Ventajosamente, el ARN amplificado se podría usar en un ensayo de diagnóstico, de pronóstico o predictivo, partiendo de cantidades limitantes pequeñas de muestras biológicas o clínicas, por ejemplo, pero sin limitarse a, biopsias, aspirados de agujas finas, secciones tisulares, lavados broncoalveolares, tejidos macrodiseccionados o microdiseccionados.

En un octavo aspecto, la presente invención se refiere a una librería de expresión obtenible mediante el método según el tercer aspecto de la presente invención.

En un noveno aspecto, la presente invención se refiere a una librería de ADNc obtenible mediante el método según el cuarto aspecto de la presente invención.

En un décimo aspecto, la presente invención se refiere al uso de un híbrido de ADNc-ARN según el primer aspecto de la presente invención, en la amplificación de ARN.

En un undécimo aspecto, la presente invención se refiere al uso de un híbrido de ADNc-ARN según el primer aspecto de la presente invención, en la preparación de una librería de ADNc.

En un duodécimo aspecto, la presente invención se refiere al uso de un híbrido de ADNc-ARNm según el primer aspecto de la presente invención, en una hibridación sustractiva.

En un decimotercer aspecto, la presente invención se refiere al uso de un híbrido de ADNc-ARNm según el primer aspecto de la presente invención, para medir la expresión génica.

En un decimocuarto aspecto, la presente invención se refiere a un kit para la amplificación de ARN en una muestra, que comprende: (a) un oligonucleótido de síntesis de ADNc, que comprende una secuencia amplificadora y una región de hibridación de ARN ligada operablemente a un promotor de ARN polimerasa; (b) un oligonucleótido de intercambio de moldes que tiene sustancialmente la misma secuencia que la secuencia amplificadora; y (c) un cebador de la amplificación que tiene sustancialmente la misma secuencia que el oligonucleótido de intercambio de moldes.

Otros aspectos de la presente invención están presentes en las reivindicaciones que se acompañan y en las siguientes descripciones y discusiones. Estos aspectos se presentan en encabezamientos de sección separadas.

Realizaciones preferidas

Preferiblemente, el ARN del híbrido de ADNc-ARN es ARNm.

Preferiblemente, el promotor de ARN polimerasa es un promotor de bacteriófago. Más preferiblemente, el promotor de bacteriófago se selecciona del grupo que consiste en T7, T3 y SP6.

Preferiblemente, la región de hibridación de ARN comprende poly(dT). Más preferiblemente, la región oligo(T) tiene una longitud desde alrededor de 10 hasta alrededor de 30 restos de T.

Preferiblemente, el extremo 3' de la región de hibridación de ARN comprende una pinza de VN (VN-3'), en la que V es A, G o C, y N es A, G, C o T.

Preferiblemente, al menos un nucleótido no moldeado en el extremo 3' de la síntesis de la primera hebra de ADNc es desoxicitidina.

Preferiblemente, al menos tres nucleótidos no moldeados en el extremo 3' de la síntesis de la primera hebra de ADNc se hibridan a un oligonucleótido de intercambio de moldes.

Preferiblemente, al menos tres de los nucleótidos no moldeados en el extremo 3' de la síntesis de la primera hebra de ADNc son nucleótidos de desoxicitidina.

Preferiblemente, el oligonucleótido de intercambio de moldes tiene al menos tres restos de guanina en su extremo 3'.

Preferiblemente, la secuencia amplificadora, el cebador de la amplificación y el oligonucleótido de intercambio de moldes contiene la misma secuencia.

Preferiblemente, el extremo 3' de la síntesis de la primera hebra de ADNc se extiende de forma que es sustancialmente complementario al oligonucleótido de intercambio de moldes.

Preferiblemente, la síntesis de la primera hebra de ADNc se sintetiza mediante una transcriptasa inversa.

Preferiblemente, la transcriptasa inversa carece de actividad de ARNasa H, pero retiene la actividad de polimerasa de tipo natural. Más preferiblemente, la transcriptasa inversa es una transcriptasa inversa del Virus de la Leucemia Murina de Moloney (MMLV), o un mutante del mismo. Lo más preferible, la transcriptasa inversa es transcriptasa inversa PowerScript^{TM} (BD Biosciences Clontech).

Preferiblemente, el híbrido de ADNc-ARN se incuba con una transcriptasa inversa que añade al menos un resto de desoxicitidina al extremo 3' de la síntesis de la primera hebra de ADNc.

Preferiblemente, la reacción comprende 1 mM de dNTPs.

Preferiblemente, los productos de amplificación bicatenarios se obtienen mediante PCR.

Preferiblemente, el oligonucleótido de síntesis de ADNc y el cebador de la PCR tienen la misma concentración.

Preferiblemente, el oligonucleótido de síntesis de ADNc y el cebador de la PCR tienen una concentración de alrededor de 0,5 \muM.

Preferiblemente, la amplificación mediante PCR se realiza usando la mezcla de polimerasa Advantage@ 2 (BD Biosciences Clontech).

Preferiblemente, el número óptimo de ciclos para generar los productos de amplificación bicatenarios se determinan mediante un método que comprende las etapas de: (a) proporcionar una pluralidad de muestras con una cantidad conocida de ARN; (b) realizar la amplificación durante un número definido de ciclos sobre una pluralidad de muestras; (c) purificar los productos de amplificación bicatenarios; (d) proporcionar la transcripción in vitro de los productos de amplificación purificados; y (e) determinar el número de ciclos de amplificación que dan como resultado la cantidad mínima de ARN amplificado que se requiere.

Preferiblemente, la muestra de ARN es una muestra clínica seleccionada del grupo que consiste en una biopsia, un tejido microdiseccionado, un aspirado de aguja fina, una célula clasificada mediante flujo, una célula microdiseccionada capturada por láser o una célula individual.

Preferiblemente, la expresión génica se mide usando un microconjunto.

Preferiblemente, el kit según el decimocuarto aspecto de la presente invención comprende además, en un recipiente separado, una transcriptasa inversa.

Preferiblemente, el kit comprende además, en un recipiente separado, una ARN polimerasa específica para el promotor de ARN polimerasa del oligonucleótido de la síntesis de ADNc.

Preferiblemente, el kit comprende además un tampón de amplificación y una o más enzimas de amplificación. Más preferiblemente, el tampón de amplificación y la enzima o enzimas de amplificación son un tampón de amplificación de PCR y una enzima o enzimas de amplificación de PCR.

Preferiblemente, el kit comprende además un ácido nucleico de control.

Ventajas

La presente invención tiene un número de ventajas. Estas ventajas serán manifiestas a partir de la siguiente descripción.

A título de ejemplo, la presente invención es ventajosa puesto que proporciona un método comercialmente útil.

A título de un ejemplo adicional, la presente invención es ventajosa puesto que el método de la presente invención es técnicamente más simple y más rápido que los métodos de amplificación alternativos, pero con un comportamiento equivalente o mejorado con respecto a tales métodos.

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A título de otro ejemplo, la presente invención es ventajosa puesto que la presente invención proporciona un método para la amplificación reproducible y robusta de cantidades pequeñas de ARN total (típicamente 5 ng-50 ng o menos), o el equivalente aproximado de 500-5000 células, con la posibilidad de usar cantidades incluso más bajas dentro de un alcance adicional.

A título de un ejemplo adicional, la presente invención es ventajosa porque proporciona un nuevo método para la amplificación de cantidades limitadas de ARN, a la vez que mantiene la representación relativa de los ARNm.

Breve descripción de las figuras

La Figura 1 muestra una representación del método de amplificación según la presente invención (A = síntesis de la primera hebra y adición de dC mediante RTasa, B = intercambio de moldes y extensión mediante RTasa, C = transcripción in vitro del producto de la PCR, ds = bicatenario, ARNa = ARN antisentido amplificado).

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Etapa 1

Incubar una muestra de ARN poly(A)+ o de ARN total en presencia de un oligonucleótido de síntesis de ADNc que se puede hibridar al ARN.

Este oligonucleótido tiene, en el extremo 5', un cebador de amplificación - tal como un cebador de PCR - seguido de una secuencia promotora de T7 y una región de hibridación de ARN. El cebador de la amplificación genera el anclaje de 3' sobre el ADNc para la amplificación subsiguiente, y la secuencia promotora de T7 permite la generación de dianas de ARN amplificado, mediante transcripción in vitro. Se incluye una enzima que posee actividad de transcriptasa inversa, en condiciones adecuadas para generar un híbrido de ARN-ADNc, y también se incluye un oligonucleótido de intercambio de molde, que puede proporcionar la extensión, dependiente de CAP, del ADNc de longitud completa mediante transcriptasa inversa usando el oligonucleótido de intercambio de moldes como molde, y añadiendo de ese modo la secuencia complementaria al oligonucleótido de intercambio de moldes al extremo 3' del ADNc de longitud completa.

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Etapa 2

Incubar el híbrido de ADNc:ARN anclado (es decir, la población de los ADNc de longitud completa) generado en la etapa 1, con un cebador de amplificación individual que corresponde sustancial o completamente a la secuencia del oligonucleótido de intercambio de moldes.

Se usan condiciones adecuadas para generar productos de amplificación, correspondiendo los productos de amplificación a la población de los ADNc presentes. Ventajosamente, las condiciones de la amplificación se predeterminan para dar como resultado cantidades suficientes de producto amplificado para aplicaciones posteriores, pero con el número mínimo de ciclos de amplificación para minimizar cualquier tendencia de la amplificación. Después, los productos de la amplificación se purifican mediante procedimientos estándar.

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Etapa 3

Los productos de la amplificación purificados obtenidos sufren una amplificación, a base de una transcripción, usando T7 polimerasa, para generar ARN amplificado (ARNa), también conocido como ARN complementario
(ARNc), para aplicaciones subsiguientes. La región del promotor T7 que se incorpora en el oligonucleótido de síntesis de ADNc es capaz de inducir la transcripción mediante T7 polimerasa.

La Figura 2 muestra una comparación de los rendimientos de ARNc de síntesis mediante sonda, en \mug. Las barras 17-20 son aquellas preparadas según el protocolo estándar.

La Figura 3 ilustra conjuntos cruzados métricos de control de calidad. Se muestran los valores de RawQ, BG log y el factor de escala para cada hibridación de GeneChip (A = Raw Q, B = BG log, C = factor de escala).

Figura 4. Parte superior: relaciones 3' a 5' para los conjuntos de sonda de beta-actina (x00351). Centro: relaciones de 3' a 5' para los conjuntos de sondas de GAPDH (m33197). Parte inferior: el porcentaje de conjuntos de sondas denominados "presente" según se determina mediante el algoritmo Affymetrix MAS 5.0.

La Figura 5 muestra la detección de 5', en el centro, y los extremos 3' de adiciones de polyA+. Parte superior: transcrito de Lys añadido a 1 pM. Parte central: transcrito de Phe añadido a 5 pM. Parte inferior: transcrito de Thr añadido a 20 pM. Cada gráfica muestra las señales para el extremo 5', parte central, y los conjuntos de sondas de extremo 3' para las adiciones de polyA+.

La Figura 6 representa un dendrograma de agrupamiento usando el método de Ward. Las variables agrupadas se muestran a lo largo del eje Y, y la distancia de enlace a lo largo del eje X.

La Figura 7 muestra una gráfica de dispersión (escala logarítmica) para \sim22.000 genes. La gráfica es representativa de aquellas obtenidas para todas las comparaciones.

La Figura 8 muestra una gráfica de dispersión de Spotfire que muestra genes que cambian más de 2 veces (> |log_{10}\ 0.3|) entre muestras. La gráfica es representativa de aquellas obtenidas para todas las comparaciones.

La Figura 9 representa una gráfica de dispersión que compara las relaciones logarítmicas del conjunto A ("9 \mug 384 non amp rep 1 frene a 9 \mug 842 non amp rep 1") frente al Conjunto D. Se ha eliminado el ruido de fondo de la gráfica, es decir, cuando se dio una señal de <100 para un cruzamiento para un gen particular a lo largo de todas las hibridaciones de chip. Como comparación, se da el valor de correlación de Pearson (R). También se prepararon las gráficas de dispersión que comparan el conjunto A frente al conjunto B (R = 0,87), el conjunto A frente al conjunto C (R = 0,83), el conjunto A frente al conjunto E (R = 0,82) y el conjunto A frente al conjunto F (R = 0,81) pero no se muestran. La distribución para el conjunto A frente al conjunto D es representativo de aquellas para las otras comparaciones.

La Figura 10 muestra histogramas de agrupamiento, el eje X es el agrupamiento y el eje Y es el número de genes. El histograma superior muestra todos los genes en todos los agrupamientos [negro = genes que cambian <2 veces, subrayado (blanco) = genes que cambian >2 veces]. El histograma inferior muestra sólo los genes que cambian >2 veces (eje Y alargado).

La Figura 11 muestra un agrupamiento ejemplar de 53 genes que no indica expresión diferencial génica entre muestras. Nótese que las sondas amplificadas y no amplificadas se comportan de forma similar.

La Figura 12 muestra un agrupamiento ejemplar de 21 genes que indican la regulación a la baja de la expresión génica en la muestra 384. Nótese que las sondas amplificadas y no amplificadas se comportan de forma similar.

La Figura 13 muestra un agrupamiento ejemplar de 9 genes que indica la regulación al alza de la expresión génica en la muestra 842. Nótese que las sondas amplificadas y no amplificadas se comportan de forma similar.

Descripción detallada de la invención Oligonucleótido

Los oligonucleótidos según la presente invención pueden ser ADN, ARN, mezclas quiméricas o derivados o versiones modificadas de los mismos, que se modifican en el resto de la base, en el resto de azúcar o en la cadena principal, y pueden incluir otros grupos colgantes o marcadores, en tanto que sean capaces todavía de funcionar en la reacción deseada.

A título de ejemplo, el oligonucleótido puede ser un oligonucleótido de síntesis de ADNc que comprende ADN.

A título de un ejemplo adicional, el oligonucleótido puede ser un oligonucleótido de intercambio de moldes que comprende ADN.

En una realización muy preferida, el oligonucleótido de intercambio de moldes es el oligonucleótido de intercambio de moldes descrito en los documentos US 5.962.271 y 5.962.272.

A título de un ejemplo adicional, el oligonucleótido puede ser un cebador de la amplificación - tal como un cebador de PCR - que comprende ADN.

Los oligonucleótidos según la presente invención se pueden modificar de forma que aún sean capaces de funcionar en la reacción deseada.

Los oligonucleótidos se pueden modificar en el resto de la base, en el resto de azúcar, o en la cadena principal de fosfato, y pueden incluir otros grupos colgantes o marcadores.

Los oligonucleótidos pueden comprender al menos una cadena principal de fosfato modificada - tal como fosforotioato, un fosforoditioato, un fosforamidotioato, un fosforamidato, un fosfordiamidato, un metilfosfonato, un fosfotriéster de alquilo, o un formacetal o un análogo de los mismos.

Los oligonucleótidos pueden derivar mediante ruptura de un fragmento de ácido nucleico más grande, usando compuestos químicos que rompen el ácido nucleico no específicos, o enzimas, o endonucleasas de restricción específicas del sitio; o mediante síntesis por métodos estándar conocidos en la técnica, por ejemplo mediante el uso de un sintetizador de ADN automatizado comercialmente disponible y química de fosforamidito estándar.

Una vez que se sintetiza el oligonucleótido deseado, se rompe de un soporte sólido sobre el que se sintetizó y se trató, mediante métodos conocidos en la técnica, para eliminar cualquiera de los grupos protectores presentes. El oligonucleótido se puede purificar entonces mediante cualquier método conocido en la técnica, incluyendo la extracción y purificación en gel. La concentración y pureza del oligonucleótido se puede determinar, por ejemplo, examinando el oligonucleótido en un gel de acrilamida, mediante HPLC, o midiendo la densidad óptica a 260 nm en un espectrofotómetro.

En una realización preferida de la presente invención, el oligonucleótido es un oligonucleótido de síntesis de ADNc que comprende la secuencia expuesta en SEQ ID No 1:

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100

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en la que V es A, G, o C, y N es cualquier base.

En otra realización preferida, el oligonucleótido es un oligonucleótido de síntesis de ADNc que comprende la secuencia expuesta en SEQ ID No 4:

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101

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en la que V es A, G, o C, y N es cualquier base.

En aún otra realización preferida de la presente invención, el oligonucleótido es un oligonucleótido de intercambio de moldes, que comprende la secuencia expuesta en SEQ ID No 2:

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102

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En aún otra realización preferida, el oligonucleótido es un cebador de la amplificación que comprende la secuencia expuesta en SEQ ID No 3:

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103

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Los oligonucleótidos correspondientes a las SEQ ID Nos 2 y 3 han sido descritos en los documentos US 5.962.271 y 5.962.272.

En el contexto de la presente invención, el oligonucleótido de síntesis de ADNc comprende una secuencia amplificadora y una región de hibridación de ARN ligada operablemente a un promotor de ARN polimerasa.

Secuencia amplificadora

La secuencia amplificadora en el contexto de la presente invención se refiere a una porción del oligonucleótido de síntesis de ADNc que contiene la misma secuencia, o sustancialmente la misma secuencia, que el oligonucleótido de intercambio de moldes y el cebador de la amplificación, como se describe aquí.

El cebador de la amplificación es capaz de hibridarse a la secuencia complementaria de la secuencia amplificadora, de forma que la síntesis de la segunda hebra del ADNc se puede amplificar, por ejemplo, mediante PCR.

Preferiblemente, la secuencia amplificadora está localizada en el extremo 5' del oligonucleótido de síntesis de ADNc, y generalmente no se traducirá en ARN.

Una persona experta en la técnica apreciará que se puede usar cualquier secuencia para la secuencia amplificadora, en tanto que el cebador de la amplificación sea capaz de hibridarse, o de hibridarse sustancialmente, a la secuencia complementaria de la secuencia amplificadora.

El oligonucleótido de intercambio de moldes sustancialmente idéntico y la secuencia amplificadora en ambos extremos del ADNc sirven como sitios de cebado universales para la amplificación extremo a extremo de la población de ADNc.

En una realización preferida, la secuencia amplificadora, el cebador de la amplificación y el oligonucleótido de intercambio de moldes contienen sustancialmente la misma secuencia - tales como regiones con la misma secuencia.

En otra realización preferida, la secuencia amplificadora comprende la secuencia expuesta en SEQ ID No 3.

Región de hibridación de ARN

Como se usa aquí, la expresión "región de hibridación de ARN" se refiere a una porción del oligonucleótido de síntesis de ADNc que es capaz de hibridarse a ARN.

Para muchas aplicaciones, es deseable enriquecer preferentemente un tipo de ARN con respecto a los otros ARN celulares, tales como ARN mensajero (ARNm), ARN de transferencia (ARNt) y ARN ribosómico (ARNr). Ventajosamente, la mayoría de los ARNm contienen una cola poly(A) en su extremo 3', que les permite ser enriquecidos mediante cromatografía de afinidad, por ejemplo usando oligo(dT) o poly(U) acoplados a un soporte sólido - tal como celulosa o Sephadex (Ausubel et al., eds., 1994, Current Protocols in Molecular Biology, vol. 2, Current Protocols Publishing, Nueva York).

En consecuencia, en una realización preferida de la presente invención, las regiones de hibridación de ARN comprenden poly(dT). Preferiblemente, el poly(dT) es una región de politimidilato que comprende alrededor de 10 hasta 30, Preferiblemente alrededor de 15 hasta 25, lo más preferible alrededor de 20 restos de T, que se unen con la cola de poly(A) presente en el término 3' de cada ARNm.

Si está disponible más información de secuencia para un ARN dado, entonces la región de hibridación de ARN se puede diseñar más específicamente para que se hibride con una población más específica de ARN. Además, la región de hibridación de ARN puede comprender una colección de regiones de hibridación de ARN.

También, si hay ambigüedad en la información de secuencia, puede haber un número de regiones de hibridación de ARN. De este modo, a título de ejemplo, cuando varias secuencias posibles de ácidos nucleicos que codifican una proteína puedan ser correctas basándose en una secuencia proteínica, se puede preparar una colección de regiones de hibridación de ARN que contienen secuencias que representan la mayoría o todas las variaciones de codones
posibles.

Si se conoce la información de secuencia para el ARN deseado, la región de hibridación de ARN no necesita reflejar la secuencia exacta del ARN, y puede ser "degenerada". Se pueden colocar a intervalos bases no complementarias o secuencias más largas en la región de hibridación de ARN, con tal de que la región de hibridación de ARN tenga la suficiente complementariedad con la secuencia de la hebra a amplificar, para permitir la hibridación.

Típicamente, la región de hibridación de ARN está localizada en el extremo 3' del oligonucleótido de síntesis de ADNc, y está ligada operablemente al promotor de ARN polimerasa.

La expresión "ligada operablemente" se refiere a una yuxtaposición, en la que la región de hibridación de ARN y el promotor de ARN polimerasa están en una relación que les permite funcionar en la manera pretendida. De este modo, en el contexto de la presente invención, la región de hibridación de ARN y el promotor de ARN polimerasa están en una relación que permite que la región de hibridación de ARN se exprese a partir del promotor de ARN
polimerasa.

Ventajosamente, el extremo 3' de la región de hibridación de ARN puede comprender uno o más nucleótidos que ayudan al cebado del ARNm. Preferiblemente, los oligonucleótidos comprenden una pinza de VN, en la que V es A, G o C, y N es A, G, C o T.

Promotor de ARN polimerasa

Las secuencias promotoras son regiones en las que la ARN polimerasa se une fuertemente al ADN y contienen el sitio de comienzo y la señal para que comience la síntesis del ARN.

El promotor de ARN polimerasa comprenderá habitualmente entre alrededor de 15 y 250 nucleótidos, preferiblemente entre alrededor de 15 y 60 nucleótidos, lo más preferiblemente entre alrededor de 15 y 40 nucleótidos, a partir de un promotor de ARN polimerasa de origen natural o una región promotora de consenso (Alberts et al., en Molecular Biology of the Cell, 2ª Ed., Garland, N.Y. (1989)). Los promotores potentes nativos contienen típicamente dos secuencias de ADN muy conservadas, cada una de alrededor de seis nucleótidos de longitud, que están localizadas desde el sitio de partida, y están separadas entre sí por alrededor de 17 nucleótidos de ADN no
reconocido.

La ARN polimerasa que se usa para la transcripción debe de ser capaz de unirse a la región del promotor de ARN polimerasa particular que está presente en el oligonucleótido de síntesis de ADNc según la presente invención. En la práctica, se puede usar cualquier combinación de ARN polimerasa y promotor de ARN polimerasa, en tanto que la polimerasa tenga la suficiente especificidad por ese promotor para iniciar la transcripción in vitro.

El promotor puede ser un promotor eucariota o procariota. Preferiblemente, el promotor es un promotor procariota. Más preferiblemente, el promotor procariota es un promotor fágico o vírico. Lo más preferible, el promotor de ARN polimerasa es un promotor derivado de un bacteriófago, por ejemplo T3, T7 o SP6 polimerasa (Chamberlin y Ryan, en The Enzymes, ed. P. Boyer (Academic Press, Nueva York) p. 87-108 (1982)).

Una secuencia típica del promotor de ARN polimerasa de T3 es:

104

También se conoce un número de secuencias promotoras de T3 variantes, especialmente aquellas en las que las tres primeras bases de la hebra no moldeada (mostrada anteriormente) son5' TTA 3', en lugar de AAA. Véase, por ejemplo, el documento US 5.037.745.

Una secuencia típica del promotor de ARN polimerasa de T7 es:

105

También se conoce en la técnica un número de formas variantes de ARN polimerasa de T7. A título de ejemplo solamente, otras variantes del promotor de ARN polimerasa de T7 son:

106

y

107

Una secuencia típica del promotor de ARN polimerasa de SP6 es:

108

El promotor de ARN polimerasa puede ser un promotor híbrido.

El promotor puede incluir adicionalmente características para asegurar o incrementar el nivel de expresión.

El promotor más preferido es un promotor de ARN polimerasa de T7. El grado tan elevado de especificidad mostrado por la ARN polimerasa de T7 por su sitio promotor (Chamberlin et al., en The Enzymes, ed. P. Boyer (Academic Press, Nueva York) p. 87-108 (1982)) ha hecho que a esta enzima un reactivo ampliamente usado en una variedad de técnicas de ADN recombinante. Los promotores de T7 naturales comparten una secuencia muy conservada que cubre alrededor de -17 hasta alrededor de +6 pb, con relación al comienzo de la cadena de ARN (Dunn y Studier, J. Mol. Biol. 166:477-535 (1983) y J. Mol. Biol. 175:111-112 (1984)). La falta de señales de terminación eficientes para la T7 polimerasa también permite obtener transcritos a partir de casi cualquier ADN (véase, Rosenberg et al., Gene 56:125-135 (1987)).

Las ARN polimerasas están ampliamente disponibles a partir de un número de fuentes comerciales - tales como Promega Corporation, Ambion Inc., Enzo Diagnostics Inc., Epicentre Technologies.

El promotor de ARN polimerasa puede ser monocatenario o bicatenario. Ventajosamente, tras la etapa de amplificación mediante PCR del método descrito aquí, el promotor se convierte en bicatenario.

En una realización muy preferida, la orientación del promotor de ARN polimerasa es tal que se expresa el ARNa antisentido. Ventajosamente, el ARNa antisentido se puede usar en conjuntos de ADNc y en conjuntos de oligonucleótidos - tales como oligonucleótidos dispersos en puntos u oligonucleótidos sintetizados en fase sólida, por ejemplo Affymetrix. Los conjuntos comerciales o "caseros" se basan en ADNc o en oligonucleótidos (típicamente se disponen en conjuntos los oligonucleótidos de sentido), y por lo tanto la producción de ARNc antisentido, como se describe aquí, tiene utilidad en cualquier presentación.

Intercambio de moldes

El intercambio de moldes se refiere al proceso de síntesis, dependiente del molde, de la hebra complementaria mediante una enzima - tal como transcriptasa inversa - usando dos moldes en orden consecutivo, y que no están ligados covalentemente entre sí por enlaces de fosfodiéster.

El proceso del intercambio de moldes se describe en Chenchik, et al. (1998), Clark, (1988) y Hu y Temin, (1990), documentos US 5.962.271 y US 5.962.272.

El intercambio de moldes en el contexto de la presente invención se logra utilizando dos de las propiedades intrínsecas de la transcriptasa inversa, a saber, la capacidad de añadir nucleótidos no moldeados al extremo 3' de la primera hebra de ADNc, y la capacidad para intercambiar moldes.

Preferiblemente, el oligonucleótido de intercambio de moldes comprende más de un resto - en su extremo 3' esos pares de bases con los restos complementarios que se añaden en el extremo 3' del ADNc. Más preferiblemente, el oligonucleótido de intercambio de moldes comprende al menos dos restos en su extremo 3' de los pares de bases con los restos de complementariedad que se añaden en el extremo 3' del ADNc. Más preferiblemente, el oligonucleótido de intercambio de moldes comprende al menos tres restos en su extremo 3' de los pares de bases con los restos complementarios que se añaden en el extremo 3' del ADNc.

Preferiblemente, al menos uno de los restos en el extremo 3' del oligonucleótido de intercambio de moldes comprende nucleótidos de desoxiguanidina. Más preferiblemente, al menos dos de los restos en el extremo 3' del oligonucleótido de intercambio de moldes comprende nucleótidos de desoxiguanidina. Más preferiblemente, al menos tres de los restos en el extremo 3' del oligonucleótido de intercambio de moldes comprende nucleótidos de desoxiguanidina. Lo más preferible, tres de los restos en el extremo 3' del oligonucleótido de intercambio de moldes comprende nucleótidos de desoxiguanidina.

La transcriptasa inversa se replica hacia el extremo 5' del ARNm, después cambia moldes y continúa replicándose hacia el extremo del oligonucleótido de intercambio de moldes. La síntesis de la primera cadena de ADNc resultante contiene los extremos 5' completos de los ARNm, así como secuencias complementarias al oligonucleótido de intercambio de moldes.

El oligonucleótido de intercambio de moldes sustancialmente idéntico y la secuencia amplificadora en ambos extremos del ADNc sirven como sitios de cebado universales para la amplificación del ADNc que extremo a extremo de la población de ADNc.

La persona experta en la técnica apreciará que se puede usar cualquier secuencia para el oligonucleótido de intercambio de moldes, en tanto que sea idéntica o sustancialmente idéntica al cebador de la amplificación. En consecuencia, en una realización preferida de la presente invención, el oligonucleótido de intercambio de moldes tiene sustancialmente la misma secuencia que la secuencia del amplificador.

El extremo 3' de la síntesis de la primera hebra de ADNc se extiende de forma que es complementario o sustancialmente complementario al oligonucleótido de intercambio de moldes. Ventajosamente, se usa un cebador de la amplificación que es capaz de hibridarse a la secuencia que es complementaria al oligonucleótido de intercambio de moldes. Después, una ADN polimerasa es capaz de extenderse desde el extremo 3' del cebador de la amplificación hibridado o sustancialmente hibridado, dando como resultado de ese modo la síntesis de una segunda hebra de ADNc.

Híbrido de ADNc-ARN

En el contexto de la presente invención, un híbrido de ADNc-ARN se refiere a un híbrido que se forma entre ARN y una síntesis de una primera hebra de ADNc, en el que el ADNc se extiende de forma que la síntesis de ADNc de primera cadena es complementaria o sustancialmente complementaria al ARN.

Típicamente, al menos se hibrida un nucleótido no moldeado en el extremo 3' de la primera cadena de ADNc a un oligonucleótido de intercambio de moldes en un híbrido de ADNc-ARN.

Preferiblemente, al menos un nucleótido no moldeado en el extremo 3' de la síntesis de la primera cadena de ADNc es desoxicitidina. Más preferiblemente, al menos dos nucleótidos no moldeados en el extremo 3' de la síntesis de la primera cadena de ADNc se hibridan a un oligonucleótido de intercambio de moldes. Más preferiblemente, al menos tres nucleótidos no moldeados en el extremo 3' de la síntesis de la primera cadena de ADNc se hibridan a un oligonucleótido de intercambio de moldes.

Preferiblemente, al menos uno de los nucleótidos no moldeados en el extremo 3' de la síntesis de la primera cadena de ADNc son nucleótidos de desoxicitidina. Más preferiblemente, al menos dos de los nucleótidos no moldeados en el extremo 3' de la síntesis de la primera cadena de ADNc son nucleótidos de desoxicitidina. Lo más preferible, al menos tres de los nucleótidos no moldeados en el extremo 3' de la síntesis de la primera cadena de ADNc son nucleótidos de desoxicitidina.

Preferiblemente, el híbrido es un híbrido de ADNc-ARNm.

Típicamente, la síntesis de la primera cadena de ADNc se cataliza mediante transcriptasa inversa usando el ARN del ADNc-ARNm como molde.

Complejo de ADNc-ARN

Un complejo de ADNc-ARN se refiere a un complejo que se forma entre ARN y un oligonucleótido de síntesis de ADNc, en el que la región de hibridación de ARN del oligonucleótido de síntesis de ADNc se hibrida, o se hibrida sustancialmente, a un ARN complementario o sustancialmente complementario.

La extensión dependiente del molde de ARN del oligonucleótido de síntesis de ADNc da como resultado la extensión del oligonucleótido de síntesis de ADNc, de forma que la síntesis de la primera cadena de ADNc es complementaria o sustancialmente complementaria al ARN, formando de este modo un híbrido de ADNc-ARNm.

Preferiblemente, el complejo es un complejo de ADNc-ARNm.

Muestra

Una muestra, en el contexto de la presente invención, puede ser cualquier entidad que comprenda ARN.

En el método de la presente invención se puede utilizar cualquier ARN, en forma pura o no pura, con la condición de que contenga o que se sospeche que contenga el ARN de interés. El ARN deseado puede ser una fracción secundaria o principal de una mezcla compleja. En consecuencia, la presente invención es útil no sólo para introducir grandes cantidades de una secuencia de ácidos nucleicos específica, sino también para amplificar simultáneamente una o más secuencias de ácidos nucleicos específicas diferentes.

El ARN - tal como ARN clonado o ARN total - se puede obtener a partir de una fuente procariota o eucariota, por ejemplo bacterias, levadura, virus, organelos, y organismos superiores tales como plantas o animales. El ARN se puede extraer de sangre, material tisular o células, mediante una variedad de técnicas tales como las descritas por Maniatis et al., más arriba.

En consecuencia, la muestra puede ser o puede derivar de un material biológico.

La muestra puede ser una muestra clínica - tal como una biopsia, tejido microdiseccionado o células capturadas por láser. Preferiblemente, la muestra es una muestra pequeña, por ejemplo una pequeña biopsia, un aspirado de aguja fina, un tejido macrodiseccionado, una célula seleccionada por flujo, una célula microdiseccionada capturada por láser o un número pequeño de células - tal como una célula individual.

Ventajosamente, la presente invención proporciona un método para la amplificación reproducible y robusta de cantidades pequeñas de ARN total. Preferiblemente, la presente invención es capaz de amplificar 5-50 ng de ARN total, más preferiblemente la presente invención es capaz de amplificar 5-25 ng de ARN total; lo más preferible, la presente invención es capaz de amplificar 5 ng o menos de ARN total, con la posibilidad de usar dentro de un alcance adicional cantidades incluso menores.

La cantidad de 5-50 ng de ARN total es igual al equivalente aproximado de 500-5000 células.

Se puede usar ARN celular total, ARN citoplásmico o ARN de poly(A)+. Los métodos para preparar ARN total y poly(A)+ son bien conocidos y se describen generalmente en Sambrook et al. (1989, Molecular Cloning - A Laboratory Manual (2ª Ed.), Vols. 1-3, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, N.Y.) y Ausubel et al., eds. (1994, Current Protocols in Molecular Biology, vol. 2, Current Protocols Publishing, Nueva York).

Preferiblemente, el ARN total se prepara mediante las técnicas descritas en Chirgwin et al., (1987), Chomczynski y Sacchi (1987), Sambrook et al., (1989), o Farrell Jr. (1993), y también están disponibles un gran número de kits comerciales de calidad muy buena. Más preferiblemente, el ARN total usado se prepara usando el método de tiocianato de guanidinio de Chirgwin et al., (1987).

La integridad del ARN total se puede comprobar usando métodos diversos que son conocidos en la técnica. A título de ejemplo, el ARN se puede analizar usando electroforesis en gel de ARN (por ejemplo, formaldehído/gel de agarosa, o Agilent LabChip. Para ARN total de mamífero, deberían de ser visibles dos bandas a aproximadamente 4,5 y 1,9 kb. Estas bandas representan ARN ribosómico 28S y 18S, respectivamente, y la relación de intensidades de estas bandas debería de ser típicamente 1,5-2,5:1.

Existen kits de purificación de ARN para la preparación de ARN a microescala a partir de un número de proveedores comerciales (por ejemplo, Absolutely RNA^{TM} Nanoprep, Stratagene; PicoPure^{TM}, Arcturus; RNeasy®, Qiagen; RNAqueous^{TM} Microkit, Ambion).

Generalmente, las muestras de ARN se congelan inmediatamente en nitrógeno líquido, y después se almacenan a -80ºC hasta la extracción del ARN.

Típicamente, los ARN totales se tratan con ADNasa I libre de ARNasa, que se puede obtener a partir de diversos fabricantes - tales como el kit DNA-free^{TM} de Ambion.

Síntesis de ADNc

Según la presente invención, la síntesis de la primera y de la segunda cadena de ADNc se puede realizar en tubos separados. Ventajosamente, la síntesis de la primera y de la segunda cadena se realiza en el mismo tubo, lo que potencia el procedimiento de síntesis, maximiza la recuperación del ADNc, y hace que el método se pueda realizar de forma más simple y más rápida.

El oligonucleótido de síntesis de ADNc para la síntesis de la primera cadena de ADNc se puede hibridar a ARN en un tampón adecuado a una temperatura entre alrededor de 60ºC y 90ºC, preferiblemente alrededor de 70ºC, durante alrededor de 5 minutos, seguido del enfriamiento hasta alrededor de 4ºC, antes de que se añada la transcriptasa inversa.

Tras la hibridación del oligonucleótido de síntesis de ADNc a ARN, se sintetiza una primera hebra de ADNc. Esta primera hebra de ADNc se produce preferiblemente a través del proceso de transcripción inversa, en el que se obtiene ADN a partir de ARN, utilizando transcriptasa inversa, siguiendo métodos que son familiares para una persona experta en la técnica.

Ventajosamente, se puede usar cualquier transcriptasa inversa en la presente invención, en tanto que la encima añada desoxirribonucleótidos al término 3' tras la extensión (Varmus, Science 240: 1427-1435 (1988)) y la enzima carezca de actividad de ARNasa H.

Preferiblemente, la transcriptasa inversa carece de actividad de ARNasa H pero retiene la actividad de polimerasa de tipo natural, de forma que se pueden sintetizar ADNc más largos. Más preferiblemente, la transcriptasa inversa es transcriptasa inversa del virus de leucemia murina de Molones (MMLV), o su mutante. Lo más preferible, la transcriptasa inversa es transcriptasa inversa PowerScript ^{TM} (BD Biosciences Clontech).

La cantidad de transcriptasa inversa empleada puede variar como se apreciará por la persona experta en la técnica. La transcripción inversa se realiza mediante incubación durante, por ejemplo, aproximadamente una hora con transcriptasa inversa a una temperatura apropiada, que debe de estar en un intervalo de temperaturas en el que la transcriptasa inversa retenga la actividad enzimática.

La reacción se puede realizar a una temperatura entre 37ºC y 55ºC, preferiblemente entre 37ºC y 42ºC.

Lo más preferible, la reacción se realiza a una actividad óptima de la enzima - tal como a alrededor de 42ºC.

La reacción de transcripción inversa se puede terminar calentando la mezcla de reacción hasta 95ºC durante alrededor de 5 minutos, para inactivar la enzima, seguido, opcionalmente, del enfriamiento en hielo.

La etapa de síntesis de la primera hebra de ADNc se puede modificar incluyendo dNTP - tal como 1 mM de dNTP -
en la etapa inicial en el procedimiento en el que el ARN se hibrida al oligonucleótido de síntesis de ADNc, por ejemplo calentando hasta 70ºC durante 2 minutos. Se ha demostrado previamente que esta inclusión de los dNTP aumenta la eficiencia en otra aplicación, a saber, las reacciones de RT-PCR (Huang, et al., (2000)). Ventajosamente, esta modificación puede aumentar el rendimiento de ARNc, a partir de cantidades pequeñas definidas de ARN total de partida. Aunque no se conoce el mecanismo para esta observación, sin desear estar ligados por ninguna teoría particular, esto puede ser debido a la estabilización de la hibridación del ARN-cebador, y/o puede ayudar a la estabilización del mecanismo de intercambio de moldes.

Ventajosamente, esta modificación permite un número reducido de ciclos de amplificación (por ejemplo, PCR) con un material limitado de partida, y por lo tanto puede ayudar a minimizar cualquier distorsión en la distribución del ARNm.

Típicamente, se lleva a cabo un único ciclo de transcripción inversa. Se puede realizar más de un ciclo de transcripción inversa (con desnaturalización entre ciclos).

Amplificación

"Amplificación" se refiere a un proceso para multiplicar in vitro hebras de ácidos nucleicos.

En una realización muy preferida, el método de amplificación de la presente invención se usa para multiplicar hebras de ADN - tal como ADNc - in vitro.

Una técnica ejemplar es PCR, que amplifica exponencialmente moléculas de ácidos nucleicos.

La PCR se describe en los documentos US 4.683.195 y US 4.683.202. La PCR consiste en ciclos repetidos de reacciones de extensión de cebador generado por ADN polimerasa. El ADN diana se desnaturaliza por calor, y se hibridan dos oligonucleótidos, que encierran la secuencia diana en hebras opuestas del ADN a amplificar. Estos oligonucleótidos se convierten en cebadores para uso con ADN polimerasa. El ADN se copia mediante extensión del cebador, para obtener una segunda copia de ambas hebras. Repitiendo el ciclo de desnaturalización por calor, de hibridación del cebador y de extensión, se puede amplificar el ADN diana un millón de veces o más en alrededor de dos a cuatro horas. La PCR es una herramienta de biología molecular que se debe de usar conjuntamente con una técnica de detección para determinar los resultados de la amplificación. Una ventaja de la PCR es que aumenta la sensibilidad amplificando la cantidad de ADN diana en un millón hasta un billón de veces en aproximadamente 4 horas.

La PCR se puede usar en los métodos de la presente invención según lo siguiente. Se añade ADN polimerasa - tal como ADN polimerasa de Taq - a la reacción, además de un único cebador de PCR que comprende sustancialmente la misma secuencia que la secuencia amplificadora del oligonucleótido de síntesis de ADNc.

En una realización preferida, la polimerasa que se usa es Advantage® 2 polymerase Mix (BD Biosciences Clontech), que permite la amplificación eficaz y exacta de moldes de ADNc mediante PCR de larga distancia (Barnes, 1994). La Advantage® 2 Polymerase Mix contiene ADN polimerasa de Taq TITANIUM^{TM}, una supresión N-terminal, deficiente en nucleasa, de ADN polimerasa de Taq, y una cantidad minoritaria de una polimerasa de revisión. La Advantage® 2 Polymerase Mix también contiene el anticuerpo Taqstart^{TM} antibody (BD Biosciences Clontech) para proporcionar una PCR de comienzo en caliente automática (Kellogg et al., 1994), y reducir el cebado no específico del molde. Esta combinación permite la amplificación eficiente de los ADNc de longitud completa, con una tasa de error significativamente menor que la de la PCR convencional (Barnes, 1994).

El cebador de PCR individual se hibrida sustancialmente al extremo 3' de la síntesis de la primera hebra de ADNc (después de la desnaturalización), que corresponde a la secuencia complementaria del oligonucleótido de intercambio de moldes. La ADN polimerasa se extiende desde el extremo 3' del cebador de PCR, dando como resultado una síntesis de segunda hebra de ADNc complementaria. En rondas subsiguientes de PCR, el cebador de PCR individual es capaz de hibridarse al extremo 3' de la primera hebra de la molécula de ADNc (y a todas las copias amplificadas de la primera hebra) y al extremo 3' de la segunda hebra de la molécula de ADNc (y a todas las copias amplificadas de la segunda hebra) dando como resultado la amplificación.

El cebador es preferiblemente un oligodesoxinucleótido de una sola hebra. El cebador debe ser suficientemente largo para actuar como un molde para la síntesis de productos de extensión en presencia de la enzima replicante. Las longitudes exactas de los cebadores, y las cantidades usadas, dependerán de muchos factores, incluyendo la temperatura, el grado de homología, y otras condiciones.

Por ejemplo, cuando se amplifica una secuencia específica, el cebador oligonucleotídico contiene típicamente entre alrededor de 10 y 50 nucleótidos, preferiblemente 15-25 o más nucleótidos, aunque, dependiendo, puede contener unos pocos nucleótidos. Para otras aplicaciones, el cebador oligonucleotídico es típicamente, pero no necesariamente, más corto, por ejemplo 7-15 nucleótidos. Tales moléculas cebadores cortas generalmente requieren temperaturas más frías para formar complejos de híbridos suficientemente estables.

En una realización preferida de la presente invención, el cebador de PCR y el oligonucleótido de síntesis de ADNc se proporcionan a la misma concentración en la reacción.

En otra realización preferida, el oligonucleótido de síntesis de ADNc y el cebador de PCR tienen una concentración de alrededor de, por ejemplo, 0,5 \muM.

Los cebadores oligonucleotídicos se pueden preparar usando cualquier método adecuado, tal como, por ejemplo, los métodos bien conocidos de fosfotriéster y fosfodiéster, o sus realizaciones automatizadas. En el documento US 4.458.066 se describe un método para sintetizar oligonucleótidos sobre un soporte sólido modificado. También es posible usar un cebador que se ha aislado de una fuente biológica (tal como una digestión con endonucleasa de restricción).

En una realización preferida, el cebador de PCR comprende la secuencia expuesta en SEC ID nº 3.

La amplificación se realiza usando métodos que son bien conocidos en la técnica. A título de ejemplo solo, los parámetros de ciclación térmica de las reacciones de PCR pueden comprender 60 segundos a 95ºC para el comienzo en caliente seguido de un ciclo de 3 etapas durante un número predeterminado de ciclo de desnaturalización durante 15 segundos a 95ºC, la hibridación durante 30 segundos a 65ºC, y la extensión durante 6 minutos a 68ºC. Después, las reacciones se pueden mantener a 4ºC en un ciclador térmico, hasta la purificación.

Ventajosamente, se puede utilizar un método mejorado para determinar el número óptimo de ciclos de amplificación que se requieren a partir de una cantidad dada de material de partida. Para cualquier método de amplificación - tal como PCR -, uno de los factores clave es realizar el número mínimo de ciclos (para una cantidad dada de material de partida) que darán como resultado suficiente diana para la aplicación posterior pretendida. Si se realizan demasiados ciclos, entonces es probable que la representación de los ARN - tales como ARNm - se pudiese desviar de lo esperado, ya que las reacciones de amplificación no son probablemente idénticas para cada molde de ARN en la mezcla de complejo, y la reacción de amplificación también puede alcanzar una meseta. Si se realizan muy pocos ciclos, entonces se puede obtener un producto de amplificación insuficiente para las aplicaciones subsiguientes.

En el método descrito aquí, para una cantidad dada de ARN total de partida (por ejemplo, 50 ng o 5 ng), los números mínimos de ciclos de amplificación que se requieren se determinan empíricamente de forma que, cuando entonces se usan todos los productos de amplificación para las reacciones de transcripción in vitro (IVT) para generar ARNc, se obtenga suficiente ARNc para la aplicación posterior pretendida. Esto se puede realizar partiendo de una cantidad dada de ARN total (por ejemplo 5 ng o 50 ng) ajustando reacciones idénticas y realizando una reacción de amplificación para números definidos de ciclos (o retirando alícuotas de una reacción de amplificación para análisis, y realizando ciclos originales sobre el resto de la reacción de amplificación). Los productos de amplificación completos procedentes de cada reacción (por ejemplo, 50 ng de ARN total de partida que ha sufrido un ciclo térmico de PCR durante 9, 10, 11, 12, 13 o 14 ciclos) se purifican y se usan para IVT. Después se determina el número de ciclos que da la cantidad mínima de ARNc que es suficiente para la aplicación posterior. Este número de ciclos se puede usar entonces de forma normal para estudios similares con otros ARN a las mismas concentraciones de partida.

Ventajosamente, la etapa de amplificación también se puede potenciar añadiendo dNTP en la etapa inicial en el procedimiento en el que el ARN se calienta hasta 70ºC durante 2 minutos.

En una realización preferida, se añade alrededor de 1 mM de dNTP a la mezcla de ARN/cebador cuando las muestras se desnaturalizan antes de la transcripción inversa.

Esto significa que se requiere menos amplificación con cantidades limitadas de material de partida, y por lo tanto ayuda a minimizar cualquier distorsión de las distribuciones de ARNm.

Los productos de amplificación que se obtienen se purificarán típicamente. Esto se puede lograr usando diversos métodos que son conocidos en la técnica. A título de ejemplo, los productos de PCR se pueden purificar usando columnas QIAGEN Qiaquick, según las instrucciones del fabricante.

Sustancialmente

El término "sustancialmente", cuando se usa en relación con hibridación, significa que un oligonucleótido - tal como un cebador - debería de ser suficientemente complementario para hibridarse a su ácido nucleico respectivo.

La secuencia nucleotídica no necesita reflejar la secuencia exacta de su ácido nucleico respectivo, y puede, de hecho, ser "degenerada". Se pueden intercalar bases no complementarias u otras secuencias en el oligonucleótido o el ácido nucleico, con tal de que la secuencia oligonucleotídica tenga suficiente complementariedad con la secuencia para permitir la hibridación. De este modo, a título e ejemplo, los cebadores usados para la amplificación mediante PCR se pueden seleccionar para que sean "sustancialmente" complementarios a la secuencia específica a amplificar.

Hibridación

Como se usa aquí, el término "hibridación" se refiere al proceso mediante el cual una hebra de ácido nucleico se une con una hebra complementaria a través de un emparejamiento de bases, así como el proceso de amplificación como se lleva a cabo en, por ejemplo, las tecnologías de reacción de cadena de polimerasa (PCR).

La presente invención engloba el uso de secuencias nucleotídicas que son capaces de hibridarse a secuencias nucleotídicas.

Transcripción

La etapa de reacción de PCR descrita anteriormente da como resultado un promotor de ARN polimerasa de T7 bicatenario que esta operablemente ligado a una secuencia de ADN bicatenaria.

Mediante el uso de un promotor de T7 bicatenario, se puede transcribir la secuencia de ADN que esta ligada operablemente al promotor en ARN. En la técnica son bien conocidos diversos métodos para la transcripción in vitro, y existen fácilmente muchos kits comerciales.

A título de ejemplo sólo, se pueden usar el kit ENZO® BioArray^{TM} HighYield^{TM} RNA Transcript Labelling Kit, Afflymetrix (900182). Los reactivos necesarios para la transcripción in vitro se combinan con las reacciones de PCR, y la transcripción in vitro se realiza a un tiempo y temperatura apropiados - tal como 37ºC durante 5 h. El tiempo de incubación puede variar dependiendo de cuántos transcritos se deseen generar.

Dependiendo del uso último del ARN, se incluirán en la mezcla de reacción de transcripción los trifosfatos de ribonucleótidos necesarios. Se pueden marcar uno o más de los ribonucleótidos, por ejemplo con un marcador radioactivo, con biotina, o similar. Se conoce por el experto en la técnica una amplia variedad de técnicas de marcado, y se pueden usar según procedimientos estándar, como se describen, por ejemplo, en el documento US 4.755.619.

Una vez que se han obtenido los transcritos de ARN, se pueden emplear diversos procedimientos bien conocidos para su procesamiento. Los transcritos se pueden eliminar de la mezcla de reacción y se pueden purificar usando diversos métodos conocidos en la técnica - tales como las minicolumnas RNeasy® (QIAGEN), según las instrucciones del fabricante. El ARNa se puede usar como molde para la síntesis de ADNc, y se puede someter a PCR para expandir adicionalmente las secuencias deseadas. El ARNa se puede usar sin modificar para una clonación posterior, una expresión, un uso como sonda o como ácido nucleico conductor en hibridación sustractiva, y similar.

ARN amplificado

Como se usa aquí, la expresión ARN amplificado (ARNa) se usa de forma intercambiable con la expresión ARN complementario (ARNc).

El ARNa se refiere al ARN antisentido amplificado que se obtiene a partir de la transcripción in vitro del molde de ADNc bicatenario, usando una ARN polimerasa.

Marcador

Según la presente invención, el ARN amplificado se puede marcar durante la transcripción in vitro para facilitar su detección/uso en etapas subsiguientes.

El ARN amplificado se puede marcar directamente como cualquier marcador conocido en la técnica, incluyendo, pero sin limitarse a, marcadores radioactivos, fluoróforos, moléculas quimioluminiscentes, o marcadores enzimáticos - tales como aquellos que producen una señal detectable cuando se realiza una reacción química particular -, y similares.

Como alternativa, se pueden obtener ribonucleótidos que están marcados, por ejemplo, con CTP biotinilado y UTP, cuando estos ribonucleótidos se incorporarán en el ARN amplificado. Después, la biotina se puede usar para unirla a avidina, que se marca con un marcador apropiado capaz de proporcionar una detección. Se pueden incorporar en el ARN amplificado otros ribonucleótidos modificados - tales como cianina 3 y cianina 5 CTP y UTP, o aminoalil UTP. Una amplia variedad de técnicas de marcaje son bien conocidas por los expertos en la técnica.

El marcado del ARN se puede lograr incluyendo uno o más NTP marcados, en la mezcla de reacción de transcripción in vitro. Los NTP se pueden marcar directamente con un radioisótopo, tal como ^{32}P, ^{35}S, ^{3}H. Los NTP se pueden marcar directamente con un marcador fluorescente - tal como isotiocianato de fluoresceína, lisamina, Cy3, Cy5 y rodamina 110.

El ARN también se puede marcar indirectamente incorporando un nucleótido enlazado covalentemente a un hapteno o a una molécula - tal como biotina - a la que se puede unir una molécula de avidina marcada, o digoxigenina, a la que se puede unir un anticuerpo anti-digoxigenínico marcado. El ARN se puede marcar con restos de marcado durante la síntesis química, o el marcador se puede unir después de la síntesis, por métodos conocidos en la
técnica.

A menudo se desea comparar la expresión génica en dos poblaciones diferentes de células, quizás derivadas de tejidos diferentes, o quizás expuestas a diferentes estímulos. Tales comparaciones se facilitan marcándolos a ARN de una población con un primer fluoróforo, y los ARN de la otra población con un segundo fluoróforo, en los que los dos fluoróforos tienen distintos espectros de emisión. Nuevamente, Cy3 y Cy5 son los fluoróforos particularmente preferidos para uso en la comparación de la expresión génica entre dos poblaciones diferentes de células.

Secuencia nucleotídica

Como se usa aquí, la expresión "secuencia nucleotídica" es sinónima del término "polinucleótido".

Aspectos de la presente invención implican el uso de secuencias nucleotídicas, que pueden estar disponibles en bases de datos.

La secuencia nucleotídica puede ser ADN o ARN de origen genómico o sintético o recombinante. La secuencia nucleotídica puede ser bicatenaria o monocatenaria, ya sea que represente la hebra sentido o antisentido, o sus combinaciones.

La secuencia nucleotídica se puede preparar mediante uso de técnicas de ADN recombinante (por ejemplo, ADN recombinante).

La secuencia nucleotídica puede ser la misma que la forma de origen natural, o puede derivar de ella.

Variantes/homólogos/derivados

En el contexto de la presente invención, la referencia a secuencias de ácidos nucleicos y de aminoácidos incluyen mutantes, variante, homólogos, derivados o sus fragmentos. Además, la referencia a un polipéptido particular incluye mutantes, variantes, homólogos, derivados o sus fragmentos que tienen la actividad del polipéptido de origen natural e incluyen aquellos polipéptidos que difieren de las formas de origen natural por tener supresiones, sustituciones y adiciones de aminoácidos.

De este modo, la presente invención engloba el uso de variante, homólogos y derivados de secuencias nucleotídicas y de aminoácidos. Aquí, el término "homólogo" significa una entidad que tiene una cierta homología con secuencias de aminoácidos o secuencias nucleotídicas. Aquí, el término "homología", puede ser igual a "identidad".

En el presente contexto, una secuencia homóloga incluye una secuencia de aminoácidos que puede ser al menos 75, 85 ó 90% idéntica, preferiblemente 95 ó 98% idéntica, a la secuencia sujeto. Aunque la homología también se puede considerar en términos de similitud (es decir, restos de aminoácidos que tienen propiedades químicas/funciones similares), se prefiere expresar la homología en términos de identidad de secuencias.

Una secuencia homóloga incluye una secuencia nucleotídica que puede ser al menos 75, 85 ó 90% idéntica, preferiblemente al menos 95 ó 98% idéntica a la secuencia sujeto.

Las comparaciones de homología se pueden realizar visualmente, o de forma más habitual con la ayuda de programas de comparación de secuencias, fácilmente disponibles. Estos programas de ordenador comercialmente disponibles pueden calcular el % de homología entre dos o más secuencias.

El % de homología se puede calcular sobre secuencias contiguas, es decir, una secuencia se alinea con la otra secuencia, y cada aminoácido en una secuencia se compara directamente con el aminoácido correspondiente en la otra secuencia, un resto cada vez. Esto se denomina alineación "sin salto". Típicamente, tales alineaciones sin salto se realizan sólo a lo largo de un número relativamente corto de restos.

Aunque este es un método muy simple y consistente, no tiene consideración que, por ejemplo, en un par de secuencias de otro modo idénticas, una inserción o supresión provocará que los siguientes restos de aminoácidos se desalineen, dando como resultado potencialmente de este modo una gran reducción del % de homología cuando se realiza una alineación global. En consecuencia, la mayoría de los métodos de comparación de secuencias se diseñan para producir alineaciones óptimas que tienen en consideración posibles inserciones y supresiones sin penalizar indebidamente la puntuación global de la homología. Estos se logra insertando "saltos" en la alineación de secuencias, para tratar de minimizar la homología local.

Sin embargo, estos métodos más complejos asignan "penalizaciones de saltos" a cada salto que se produzca en la alineación, de forma que, para el mismo número de aminoácidos idénticos, una alineación de secuencias con tan pocos saltos como sea posibles - que refleja una mayor relación entre las dos secuencias comparadas - logrará una puntuación mayor que aquella con muchos saltos. Típicamente, se usan "costes de saltos afines", que cargan un coste relativamente elevado por la existencia de un salto, y una penalización más pequeña para cada resto subsiguiente en el salto. Este es el sistema de puntuación de saltos habitualmente más usado. Por supuesto, las penalizaciones de salto elevadas producirán alineaciones optimizadas con menor número de saltos. La mayoría de los programas de alineación permiten que se modifiquen las penalizaciones de saltos. Sin embargo, se prefieren usar los valores por defecto cuando se usa tal programa de ordenador para comparaciones de secuencias. Por ejemplo, cuando se usa el paquete GCG Wisconsin Bsetfit, la penalización de

\hbox{salto por defecto para la  secuencia de aminoácido es -12
para un salto y -4 para cada extensión.}

Por lo tanto, el cálculo del % máximo de homología requiere en primer lugar la producción de una alineación óptima, teniendo en cuenta las penalizaciones de saltos. Un programa de ordenador adecuado para llevar a cabo tal alineación es el paquete GCG Wisconsin Bestfit (University of Wisconsin, U.S.A.; Devereux et al., 1984, Nucleic Acids Research 12:387). Los ejemplos de otro programa de ordenador que puede realizar comparaciones de secuencias incluyen, pero no se limitan a, el paquete BLAST (véase Ausubel et al., 1999 ibid - Capítulo 18), FASTA (Atschul et al., 1990, J. Mol. Biol., 403-410) y el conjunto GENEWORKS de herramientas de comparación. Tanto BLAST como FASTA están disponibles para una búsqueda fuera de línea y en línea (véase Ausubel et al., 1999 ibid, páginas 7-58 a 7-60). Sin embargo, para algunas aplicaciones, se prefiere usar el programa GCG Bestfit. También existe una nueva herramienta, denominada BLAST 2 Sequences, para comparar secuencias proteínicas y nucleotídicas (véase FEMS Microbiol Lett 1999 174(2): 247-50; FEMS Microbiol Lett 1999 177(1): 187-8).

Aunque el % final de homología se puede medir en términos de identidad, el propio proceso de alineación no se basa típicamente en una comparación de pares de todo o nada. En su lugar, generalmente se usa una matriz de puntuación de similitud de escala, que asigna puntuaciones a cada comparación por pares basándose en similitud química o distancia evolutiva. Un ejemplo de tal matriz usada habitualmente es la matriz BLOSUM62 - la matriz por defecto para el paquete de programas BLAST. Los programas GCG Wisconsin usan generalmente los valores por defecto públicos, o, si se suministra, una tabla de comparación de símbolos personalizada (véase el manual de usuario para más detalles). Para algunas aplicaciones, se prefiere usar los valores por defecto públicos para el paquete GCG, o en el caso de otro programa de ordenador, la matriz por defecto, tal como BLOSUM62.

Una vez que el programa de ordenador ha producido una alineación óptima, es posible calcular el % de homología, preferiblemente el % de identidad de secuencias. El programa de ordenador típicamente hace esto como parte de la comparación de secuencias, y genera un resultado numérico.

Las secuencias también pueden tener supresiones, inserciones o sustituciones de restos de aminoácidos, que producen un cambio silencioso y dan como resultado una sustancia funcionalmente equivalente. Se pueden hacer sustituciones deliberadas de aminoácidos en base a la similitud de la polaridad, carga, solubilidad, hidrofobia, hidrofilia, y/o la naturaleza anfipática de los restos, en tanto que se retenga la actividad de unión secundaria de la sustancia. Por ejemplo, los aminoácidos cargados negativamente incluyen ácido aspártico y ácido glutámico; los aminoácidos cargados positivamente incluyen lisina y arginina; y los aminoácidos con grupos de cabeza polares no cargados, que tienen valores similares de hidrofilia, incluyen leucina, isoleucina, valina, glicina, alanina, asparagina, glutamina, serina, treonina, fenilalanina, y tirosina.

Se pueden hacer sustituciones conservativas, por ejemplo según la Tabla a continuación. Los aminoácidos en el mismo bloque en la segunda columna, y preferiblemente en la misma línea en la tercera columna, se pueden sustituir entre sí:

\vskip1.000000\baselineskip

1

\vskip1.000000\baselineskip

Se puede producir una sustitución homóloga (sustitución o reemplazo se usan aquí ambos para significar el intercambio de un resto de aminoácido resistente, con un resto alternativo), es decir, una sustitución similar por similar, tal como básico por básico, ácido por ácida, polar por polar, etc. También se puede producir una sustitución no homóloga, es decir, de una clase de resto por otra, o que implica alternativamente la inclusión de aminoácidos no naturales tales como ornitina (en lo sucesivo denominada Z), ornitina del ácido diaminobutírico (en lo sucesivo denominada B), ornitina de norleucina (en lo sucesivo denominada como O), pirilalanina, tienilalanina, naftilalanina y
fenilglicina.

También se pueden realizar reemplazos por aminoácidos no naturales que incluyen aminoácidos alfa* y alfa-disustituidos*, aminoácidos N-alquílicos*, ácido láctico*, derivados de haluro de aminoácidos naturales tales como trifluorotirosina*, p-Cl-fenilalanina*, p-Br-fenilalanina*, p-I-fenilalanina*, L-alil-glicina*, \beta-alanina*, ácido L-\alpha-aminobutírico*, ácido L-\gamma-aminobutírico*, ácido L-\alpha-aminoisobutírico*, ácido L-\varepsilon-aminocaproico^{#}, ácido 7-aminoheptanoico*, L-metioninasulfona^{#}*, L-norleucina*, L-norvalina*, p-nitro-L-fenilalanina*, L-hidroxiprolina^{#}, L-tioprolina*, derivados metílicos de fenilalanina (Phe), tales como 4-metil-Phe*, pentametil-Phe*, L-Phe(4-amino)^{#}, L-Tyr(metilo)*, L-Phe(4-isopropilo)*, ácido L-Tic(1,2,3,4-tetrahidroisoquinolin-3-carboxílico)* ácido L-diaminopropiónico^{#} y L-Phe(4-bencilo)*. El símbolo * se ha utilizado con el fin de la exposición anterior (que se refiere a la sustitución homóloga o no homóloga), para indicar la naturaleza hidrófoba del derivado, mientras que # se ha utilizado para indicar la naturaleza hidrófila del derivado, y #* indica características anfipáticas.

Las secuencias variantes de aminoácidos pueden incluir grupos espaciadores adecuados que se pueden insertar entre cualquiera de los restos de dos aminoácidos de la secuencia, incluyendo grupos alquílicos tales como grupos metilo, etilo o propilo, además de espaciadores de aminoácidos tales como restos de glicina o de \beta-alanina.

Usos

Se apreciará que el ARN amplificado producido según la presente invención representa un intermedio útil para una amplia variedad de aplicaciones posteriores.

Librerías de ADNc

El ARN amplificado puede facilitar la construcción de librerías de ADNc complejas a partir de cantidades extremadamente limitadas de tejido.

El ARN amplificado se puede convertir fácilmente en ADNc bicatenario, usando diversos métodos que son bien conocidos en la técnica.

Opcionalmente, el ADNc bicatenario que se genera se puede insertar en un vector. Esto permite que se introduzcan las moléculas de ADN recombinante, que comprenden la librería de ADNc, en células hospedantes - tales como hospedantes eucariotas y procariotas.

Sondas ribonucleotídicas

El ARN amplificado también se puede usar para la producción de sondas ribonucleotídicas específicas sin la clonación previa de ADNc en vectores de ribosonda.

Hibridación sustractiva

Adicionalmente, el ARN amplificado proporciona una fuente de grandes cantidades de material antisentido, monocatenario, para uso como un conductor en la hibridación sustractiva. Por ejemplo, se puede permitir que dos poblaciones de ácidos nucleicos, una sentido y una antisentido, se mezclen con una población presente en un exceso molar (conductor). Las secuencias presentes en ambas poblaciones formarán híbridos, mientras que las secuencias presentes en sólo una población permanecerán monocatenarias. Después, se usan diversas técnicas bien conocidas para separar las moléculas no hibridadas que representan secuencias expresadas diferencialmente. En consecuencia, el ARN amplificado también se puede aplicar para mejorar métodos de detección y aislamiento de secuencias de ácidos nucleicos que varían en abundancia entre diferentes poblaciones, tales como en la comparación de la expresión de ARNm entre diferentes tejidos o dentro del mismo tejido según el estado fisiológico. Los ejemplos de tecnologías de hibridación sustractiva incluyen la tecnología de hibridación sustractiva de supresión (documento US 5.565.340), el análisis de diferencia de representación (documento US 5.436.142); y la sustracción de captura de ligador (Anal. Biochem. (1996) 237:109-114).

ARN antisentido

El ARN antisentido tiene una amplia variedad de usos tanto en la investigación analítica como en terapéutica. El ARN antisentido funciona en varios sistemas procariotas para regular la expresión génica. De forma similar, el ARN antisentido puede regular la expresión de muchos genes eucariotas. Esto permite bloquear la expresión de genes indeseables. Por lo tanto, el uso terapéutico de ARN antisentido implica la síntesis in vitro de ARN antisentido con la introducción subsiguiente en el sujeto (véase, generalmente, Melton, Antisense RNA and DNA, Cold Spring Harbor (1988)).

Conjuntos

La aplicación de la tecnología de conjuntos está limitada a menudo debido a que se requieren cantidades sustanciales de ARN para la preparación de la diana. Por lo tanto, la presente invención es particularmente adecuada para la generación de dianas para conjuntos - tales como análisis de microconjuntos, en particular conjuntos Affymetrix.

La tecnología de conjuntos y las diversas técnicas y aplicaciones asociadas con ella se describen generalmente en numerosos libros de texto y documentos. Estos incluyen Lemieux et al., (1998), Molecular Breeding 4, 277-289, Schena y Davis. Parallel Analysis with Biological Chips. en PCR Methods Manual (eds. M. Innis, D. Gelfand, J. Sninsky), Schena y Davis, (1999), Genes, Genomes and Chips. En DNA Microarrays: A Practical Approach (ed. M. Schena); Oxford University Press, Oxford, UK, 1999), The Chipping Forecast (Nature Genetics special issue; suplemento de enero de 1999), Mark Schena (Ed.), Microarray Biochip Technology, (Eaton Publishing Company), Cortes, 2000, The Scientist 14[17]:25, Gwynne y Page, Microarray analysis: the next revolution in molecular biology, Science, 6 de agosto de 1999; y Eakins y chu, 1999, Trends in Biotechnology, 17, 217-218.

Detección

En un aspecto adicional, los métodos de la presente invención se pueden usar para identificar una o más secuencias en una muestra, detectando las secuencias amplificadas en el ARN amplificado.

Amplificación diferencial

En un aspecto adicional, la presente invención se puede usar para la detección de genes expresados diferencialmente. Por lo tanto, es útil para determinar los niveles relativos de una secuencia dada con relación a otras secuencias.

Tales métodos pueden ser particularmente útiles, por ejemplo, en el diagnóstico molecular, en el que el diagnóstico no se basa en la presencia o ausencia de una secuencia, sino en los niveles relativos de una secuencia dada.

Kits

Los materiales para uso en los métodos de la presente invención son idealmente adecuados para la preparación de kits.

Tal kit puede comprender recipientes, cada uno con uno o más de los diversos reactivos (típicamente en forma concentrada) usados en los métodos, incluyendo, por ejemplo, tampones, los trifosfatos de nucleótidos apropiados (por ejemplo, dATP, dCTP, dGTP y dTTP; o rATP, rCTP, rGTP y UTP), transcriptasa inversa, ADN polimerasa, ARN polimerasa, y uno o más oligonucleótidos de la presente invención.

Los oligonucleótidos en los recipientes pueden estar en cualquier forma, por ejemplo, liofilizados, o en disolución (por ejemplo, una disolución de agua destilada o tamponada), etc. Los oligonucleótidos listo para uso en la misma reacción de amplificación se pueden combinar en un solo recipiente, o pueden estar en recipientes separados.

El kit comprende además opcionalmente, en un recipiente separado, una ARN polimerasa específica para el promotor de ARN polimerasa, y/o un tampón para PCR, y/o una ADN polimerasa.

El kit comprende además opcionalmente un ácido nucleico de control.

También se incluirá típicamente un conjunto de instrucciones.

Técnicas de metodología de ADN recombinante generales

La presente invención emplea, excepto que se indique de otro modo, técnicas convencionales de química, biología moleceular, microbiología, ADN recombinante e inmunología, que están dentro de las capacidades de una persona experta normal en la técnica. Tales técnicas se explican en la bibliografía. Véase, por ejemplo, J. Sambrook, E. F. Fritsch, y T. Maniatis, 1989, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Segunda Edición, Libros 1-3, Cold Spring Harbor Laboratory Press; Ausubel, F. M. et al. (1995 y suplementos periódicos; Current Protocols in Molecular Biology, cap. 9, 13, y 16, John Wiley & Son's, New York, N.Y.); B. Roe, J. Crabtree, y A. Kahn, 1996, DNA Isolation and Sequencing: Essential Techniques, John Wiley & Sons; M. J. Gait (Editor), 1984, Oligonucleotide Synthesis: A Practical Approach, Irl Press; y, D. M. J. Lilley y J. E. Dahlberg, 1992, Methods of Enzymology: DNA Structure Part A: Synthesis and Physical Analysis of DNA Methods in Enzymology, Academic Press. Cada uno de estos textos generales se incorpora aquí como referencia.

La invención se describirá ahora adicionalmente mediante los Ejemplos, que sirven para ayudar al experto normal en la técnica a llevar a cabo la invención, y no están destinados de ninguna manera a limitar el alcance de la invención.

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Ejemplos

Ejemplo 1

Materiales y Métodos

La tecnología SMART^{TM} de BD Biosciences Clontech permite la amplificación mediante PCR de la primera hebra de ADN incorporando un sitio de cebado en los extremos 5' y 3' vía el mecanismo de intercambio de moldes. Se usó el cebador (SEQ ID No. 1):

109

un 94-mero, para cebar la síntesis de ADNc. La región de mayúsculas en el extremo 5' es idéntico al 5' PCR Primer II A proporcionado en el kit de síntesis de ADNc por PRC SMART^{TM} de BD Biosciences Clontech, y esta secuencia genera el anclaje de 3' sobre el ADNc para la amplificación subsiguiente mediante PCR. La región de minúsculas es idéntica a la secuencia del promotor T7 usada actualmente en el cebador de síntesis de ADNc de Affymetrix. La secuencia del promotor T7 se añade para permitir la generación de dianas de ARNc marcadas, mediante transcripción in vitro. La región (T)30 se unirá a la cola de poly A de los ARN mensajeros, y la pinza VN 3'-terminal (en la que V es A, G, o C, y N es cualquier base) ayuda a asegurar el cebado del ARNm. Este oligonucleótido se purificó mediante electroforesis en gel de poliacrilamida antes del uso.

El oligonucleótido "SMART^{TM} II A" (10 uM, BD Biosciences Clontech) (SEQ ID No. 2):

110

y "5' PCR Primer II A" (10 uM, BD Biosciences Clontech) (SEQ ID No. 3):

111

tienen una secuencia idéntica a aquellas del kit de síntesis de ADNc por PCR SMART^{TM} de BD Biosciences Clontech.

Todas las reacciones se realizan en tubos de PCR de paredes delgadas, de 0,2 ml.

ARN

El ARN usado en estos estudios se preparó usando el método de tiocianato de guanidinio [Chirgwin et al., (1987)], con todas las precauciones habituales para la manipulación del ARN. En esta técnica también se pudo usar ARN citoplásmico o ARN poliA+. La integridad del ARN total se debería de comprobar mediante análisis de una muestra sobre electroforesis en gel de ARN (por ejemplo formaldehído/gel de agarosa), o Agilent LabChip. Para ARN total de mamífero, deberían de ser visibles dos bandas a aproximadamente 4,5 y 1,9 kb; estas bandas representan, respectivamente, ARN ribosómico 28S y 18S, y la relación de intensidades de estas bandas debería ser 1,5-2,5:1. Existen kits de purificación de ARN para la preparación de ARN a microescala a partir de un número de proveedores comerciales (por ejemplo Absoluty RNA^{TM} Nanoprep,

\hbox{Stratagene;
PicoPure ^{TM} ,  Arcturus; RNeasy®, Qiagen; RNAqueous ^{TM} 
Microkit, Ambion).}

Los ARN totales para los estudios dados a conocer aquí se aislaron a partir de dos biopsias de tumor de vejiga humanas que se obtuvieron de una colaboración externa entre Astrazeneca y Institut Curie, Paris y Henri Mondor Hospital, Creteil, Paris. Estas biopsias de carcinoma de células transicionales de vejiga tuvieron un grado 3 de T3 (muestra 384) y un grado 1 de Ta superficial (muestra 842). Las biopsias de vejiga se retiraron quirúrgicamente mediante resección transuretral por Dominique Chopin en el hospital Henri Mondor, Creteil, Paris. Las muestras se congelaron inmediatamente en nitrógeno líquido, y después se almacenaron a -80ºC hasta la extracción del ARN. El ARN total se purificó mediante extracción con tiocianato de guanidinio, seguido de ultracentrifugación en un gradiente de cloruro de cecesio (Chirgwin et al., (1987)) en el instituto Curie, Paris, se cuantificó mediante medida de A260, y la integridad se comprobó mediante electroforesis en gel de ARN. Los ARN totales se trataron con ADNasaI libre de ARNasa (Ambion, DNA-free^{TM} kit), según las instrucciones del fabricante, de tal manera que las concentraciones finales fueron 1ug/ul. Como referencia, las dianas también se prepararon según el protocolo estándar (Afflymetrix GeneChip® Expresión Analysis Technical Manual) partiendo de 9 ug de los mismos ARN totales.

Los ARN totales tratados con ADNasaI se diluyeron entonces con agua libre de ARNasa, y entonces se usaron 5 ng o 50 ng de ARN total en cada reacción de amplificación.

Se añadieron 4 cantidades minúsculas de poliA+ sentido de control de ARN a los ARN totales, usando un lote (20x) que consiste en Lys, Phe y Thr procedente de B. subtilis (ATCC) y ARN poliA+ de control positivo para kanamicina (Promega Corporation, Cat C1381). Los plásmidos para Lys, Phe y Thr se obtuvieron a partir de ATCC [pGIBS-Lys, ATCC 87482; pGIBS-Phe, ATCC 87483; y pGIBS-Thr ATrC 87484], y se generaron y se purificaron transcritos de ARN de sentido según se describe en el manual técnico de Afflymetrix GeneChip® Expression Analysis Technical Manual [http://www. affymetrix.com/].

Se añadieron cantidades minúscula de Lys, Phe, Thr y kanamicina, a concentraciones finales de 1, 5, 20 y 1 pM respectivamente para muestras de ARN no amplificadas.

La Tabla (1) da un resumen de las sondas sintetizadas y sus rendimientos de ARNc respectivos. Obsérvese que, para el protocolo estándar de Afflymetrix convencional, la hibridación de ARN/T7(dT)24 se llevo a cabo en presencia de dNTP, que se añadieron subsiguientemente a la mezcla maestra de la primera hebra.

Síntesis de la primera hebra de ADNc mediante SMART^{TM}

La síntesis de la primera y de la segundo hebra se realizó en el mismo tubo que potencia el procedimiento de síntesis y maximiza la recuperación de ADNc. El método descrito aquí usa transcriptasa inversa PowerScript^{TM} Reverse Transcriptase (BD Biosciences Clontech), un mutante de punto de transcriptasa inversa del virus de la leucemia murina de Molones (MMLV). PowerScript^{TM} carece de actividad de ARNasaH, pero retiene la actividad de polimerasa de tipo natural, de forma que se pueden sintetizar fragmentos de ADNc más largos que la RT del MMLV de tipo natural.

El protocolo de SMART^{TM} recomendado (BD Biosciences Clontech) se modificó incluyendo 1 mM de dNTP en la etapa inicial en el procedimiento en el que el ARN se calienta hasta 70ºC durante 2 minutos. Se muestra aquí que esta modificación incrementó el rendimiento de ARNc, a partir de cantidades definidas de ARN total de partida (véase la Tabla 2 a continuación). Esta modificación permite un número reducido de ciclos de PCR con material de partida limitado, y debería de ayudar a minimizar cualquier distorsión en la distribución del ARNm.

Los ARNc se sintetizaron a partir de 50 ng o 5 ng de ARN total. Se añadió 1 mM de dNTP en la etapa de hibridación del ARN-cebador, más la mezcla de síntesis de ADNc [dNTP en las etapas 1 y 2], o solo en la mezcla de síntesis de ADNc [dNTP en la etapa 2 solamente]. En la Tabla 2 se muestran los números de ciclos de PCR requeridos para generar subsiguientemente - 20 \mug de ARNc. La mezcla de cebador se preparó mezclando volúmenes iguales de 1 \muM del oligonucleótido SMART^{TM}-T7-oligo(dt)30VN SEC ID 1 y 1 \muM de oligonucleótido SMART^{TM} II A SEC ID 2 (BD Biosciences Clontech), de forma que ambos tuvieron una concentración de 0,5 \muM. Se uso una concentración reducida de ambos cebadores [Baugh, et al. (2001)] dados, que redujo las concentraciones de cebador de oligo dT, redujo los artefactos no específicos cuando se usan cantidades menores de ARN molde, y se razonó que las concentraciones reducidas del nuevo cebador olignucleótido SMART^{TM}-T7-oligo(dT)30VN SEC ID 1 y SMART^{TM} II A oligonucleótido SEC ID 2 se requerían ya que se parte de un ARN total mucho menor que el requerido en el protocolo de SMART^{TM} estándar.

Se mezclaron 3 \mul de ARN total con 2 \mul de mezcla de cebador 0,5 \muM. El ARN/cebador se calentó a 70ºC durante 2 minutos después a 4ºC durante 5 minutos en un ciclador térmico.

A 4ºC, se añadió a cada reacción mezcla maestra de la primera hebra. La mezcla maestra de la primera hebra se preparó a partir de los componentes del kit de síntesis de ADNc por PCR SMART^{TM} (BD Bioscience Clontech, # K1052-1) y se añadieron 2 ul 5x de tampón de primera hebra (250 mM de Tris-HCl, pH 8,3, 30 mM de cloruro de magnesio y 375 mM de cloruro de potasio), 1 ul de 20 mM de ditiotreitol (DTT), 1 ul de 10 mM de dNTP (10 mM cada uno de dATP, dCTP, dGTP, dTTP), 1 ul de transcriptasa inversa PowerScript^{TM}. Las reacciones se mezclaron mediante pipeteo suave, después se calentaron durante 1h a 42ºC, después 4ºC durante 5 minutos en un ciclador térmico.

Amplificación mediante PCR de ADNc sintetizado mediante SMART^{TM}

El método descrito aquí usa mezcla Advantage® 2 Polymerase Mix (BD Biosciences Clontech), que permite la amplificación eficiente y exacta de moldes de ADNc mediante PCR de larga distancia [Barnes, 1994]. Los productos Advantage TM 2 se describen en el documento US 5.436.149.

La mezcla de polimerasa Advantage® 2 Polymerase Mix contiene ADN polimerasa de Taq TITANIUM^{TM}, una supresión N-terminal deficiente en nucleasa de ADN polimerasa de Taq, y una cantidad minoritaria de una polimerasa de verificación. La mezcla de polimerasa Advantage® 2 también contiene anticuerpo TaqStart^{TM} (BD Biosciences Clontech) para proporcionar una PCR de comienzo en caliente automática (Kellogg et al., 1994) y reducir el cebado no específico del molde. Esta combinación permite la amplificación eficiente de los ADNc de longitud completa, con una tasa de error significativamente menor que la de la PCR convencional (Barnes, 1994).

Se añadieron 90 \mul de mezcla maestra de PCR a cada síntesis de ADNc usando el mismo tubo que para la síntesis de ADNc mediante SMART^{TM}. El cebador 5' PCR IIA SEC ID 3 tuvo una secuencia idéntica a la usada en el kit de síntesis de ADNc de SMART^{TM} de BD Biosciences Clontech (Número de catálogo K1052-1). Este cebador se unirá a ambos extremos del ADNc de SMART^{TM}, y permite la amplificación mediante PCR. La PCR se ajustó usando componentes a partir del kit de polimerasa Advantage® 2 (BD Biosciences Clontech, número de catálogo 8430-1) con 10 ul 10X de tampón de PCR Advantage® 2 (40 mM de Tricita-KOH, pH 9,2, 15 mM de acetato de potasio, 3,5 mM de acetato de magnesio), 2 ul de 50X de mezcla de dNTP (10 mM de cada uno de dNTP), 2 ul de 10 uM de cebador 5' PCR Primer II A SEC ID 3, y 2 ul de 50X de mezcla de polimerasa Advantage® 2 y 74 ul de agua.

Los parámetros de la ciclación térmica de las reacciones de PCR fueron 60 segundos a 95ºC para el comienzo en caliente, seguido de una ciclación en 3 etapas durante un número predeterminado de ciclos (por ejemplo, 11 ciclos para 50 ng de ARN total de partida, o 15 ciclos para 5 ng de ARN total) de desnaturalización durante 15 segundos a 95ºC, hibridación durante 30 segundos a 65ºC y extensión durante 6 minutos a 68ºC. Las reacciones se mantuvieron entonces a 4ºC en un ciclador térmico hasta la purificación. Las reacciones con 50 ng se ciclarón típicamente durante 10 u 11 ciclos, y las reacciones con 5 ng durante 14 o 15 ciclos.

Se ha ideado un método mejorado para determinar el número óptimo de ciclos de PCR que se requieren a partir de una cantidad dada de material de partida. Para cualquier método basado en PCR, uno de los factores clave es realizar los números mínimos de ciclos de PCR (para una cantidad dada de material de partida) que darán como resultado suficiente diana para la aplicación posterior pretendida. Si se realizan demasiados ciclos, entonces es probable que se desvié la representación de los ARNm, ya que es improbable que las reacciones de PCR sean idénticas para cada molde de ARN en la mezcla compleja, y la PCR también puede alcanzar una meseta. Si se realizan muy pocos ciclos, entonces se obtiene insuficiente producto de PCR para aplicaciones subsiguientes. La metodología de SMART^{TM} de BD Biosciences Clontech recomienda una estrategia de optimización que implica el examen de los productos de PCR amplificados generados después de diferentes números de ciclos en electroforesis de gel de agarosa, y luego la estimación visual de la amplificación óptima. En el método descrito aquí, se determina empíricamente, para una cantidad dada de ARN total de partida (por ejemplo 50 ng o 5 ng), los números mínimos de ciclos de PCR que se requieren de forma que cuando entonces se usen los productos enteros de PCR para las reacciones de transcripción in vitro (IVT) para generar ARNc se obtenga suficiente ARNc para la aplicación posterior pretendida, esto se puede hacer fácilmente partiendo de una cantidad dada de ARN total (por ejemplo 5 ng o 50 ng), ajustando reacciones idénticas y llevando a cabo PCR para números definidos de ciclos (o eliminando alícuotas de una reacción de PCR para análisis, y realizando ciclos adicionales sobre el resto de la reacción de PCR). Los productos completos de PCR, procedentes de cada reacción (por ejemplo, 50 ng de ARN total de partida que ha sufrido una ciclación térmica mediante PCR durante 9, 10, 11, 12, 13 ó 14 ciclos), se purifica y se usa para IVT. Después se determina el número de ciclos de PCR que da la cantidad mínima de ARNc que es suficiente para la aplicación posterior. Este número de ciclos se puede usar entonces de forma normal para estudios similares con otros ARN a las mismas concentraciones de
partida.

Por ejemplo, en este estudio dado a conocer aquí se describe el uso posterior en conjuntos de sonda Afflymetrix GeneChip®. Si el producto de PCR se va a usar para otra aplicación posterior, entonces se podría usar una estrategia idéntica. Los parámetros de ciclación en este protocolo se han optimizado usando un ciclador térmico MJ Research PTC200. Sin embargo, los números de ciclos requeridos para cantidades diferentes de ARN total de partida se deberían de determinar empíricamente en experimentos iniciales, ya que los parámetros óptimos pueden variar con diferentes moldes, cicladotes térmicos, o si se usan diferentes enzimas para la síntesis de ADNc o para la PCR. Una vez que se determinan las condiciones óptimas para una cantidad específica de ARN total de partida, entonces experimentos subsiguientes con esta cantidad de ARN en condiciones idénticas deben de dar como resultados rendimientos similares de producto.

Esta etapa de PCR también se puede potenciar por adición de dNTP en la etapa inicial en el procedimiento en el que el ARN se calienta a 70ºC durante 2 minutos (para más detalle, véase anteriormente). Esto significa que se requiere un número reducido de ciclos de PCR con cantidades limitadas de material de partida, y por lo tanto ayuda a minimizar cualquier distorsión de las distribuciones de ARNm.

Los productos de PCR se purificaron usando columnas QIAGEN Qiaquick según las instrucciones del fabricante. Para la elución: se aplicó 30 \mul de tampón de elución a la columna, y se dejó reposar durante 2 minutos antes de la centrifugación. Se ajustaron volúmenes eluidos hasta 30 \mul con agua de grado de biología molecular. La purificación mediante PCR se podía haber realizado usando otros métodos de purificación de PCR o kits comerciales.

Síntesis de ARNc marcada con biotina (IVT) a partir de los ADNc amplificados

Para la IVT, se uso el kit de marcaje de transcrito de ARN ENZO® BioArray^{TM} HighYeld^{TM}, Affymetrix 900182 pero éste se pudo obtener a partir de otros proveedores. A cada 30 \mul de PCR purificada se añadieron 20 \mul de mezcla maestra. [5 \gammal de 10x de tampón de reacción HY, 5 \mul de 10x de ribonucleótidos marcados con biotina, 4 \mul de 10X de DDT, 4 \mul de 10x de mezcla de inhibidor de ARNasa, 2 \mul de 20x de ARN polimerasa de T7]. Las reacciones de IVT se incubaron a 37ºC durante 5 h, usando tubos de PCR de 0,2 ml de paredes delgadas.

Se añadieron 50 ul de agua por muestra, y después todas las reacciones se purificaron usando minicolumnas RNeasy® (QIAGEN) según las instrucciones del fabricante. El ARN purificado se diluyó con dos aplicaciones secuenciales de 50 \mul de agua libre de ARNasa, es decir, 100 \mul de volumen final.

Se añadieron 5 ul de ARN eluido a 95 ul de agua por pocillo de una placa de UV de 96 pocillos (Costar #3635), y se uso para la medida de A260 (Molecular Devices, Spectramax), para cuantificar la cantidad de ARN.

Fragmentación e hibridación

Síganse las instrucciones descritas en el manual técnico Affymetrix GeneChip® Analysis Technical Manual.

Análisis de los datos

Los datos se analizaron para un número de criterios de comportamiento de ensayo, a fin de evaluar la eficacia del nuevo protocolo de amplificación para el análisis de expresión de conjuntos Affimetrix GeneChip®. Estos criterios fueron el rendimiento de ARNc marcado; la metría de la calidad del conjunto estándar incluyendo Raw Q, fondo, factor de escala, porcentaje de llamadas presentes, y la relación de intensidad de señal de 3' y 5' para conjuntos de sondas de control; la linealidad y sensibilidad de la amplificación según se cuantifica usando controles de poliA bacterianos añadidos en cantidades pequeñas; la reproducibilidad; el análisis de concordancia de la expresión génica diferencial entre el protocolo Affimetrix estándar y el nuevo protocolo de amplificación; la confirmación en los cambios de expresión génica mediante una técnica independiente (RT-PCR).

Rendimiento de ARNc marcado

El rendimiento de ARNc marcado es crítico debido a que se ha de generar suficiente diana para aplicaciones posteriores como por ejemplo conjuntos de sondas Affymetrix GeneChip®. La cantidad requerida de ARNc marcado para Affimetrix GeneChip® es 10-15 \mug para cada conjunto genómico. Se llevo a cabo una serie de experimentos usando cantidades diferentes de materiales de partida. Los ARN totales se extrajeron a partir de un carcinoma de vejiga de célula transicional de grado 3 de T3 (muestra 384) y de grado 1 de Ta superficial (muestra 842), y se usaron como molde para preparar sondas. Se prepararon sondas por replicado a partir de 9 \mug de ARN total, usando el protocolo de Affimetrix convencional, y a partir de 50 ng y 5 ng de ARN total usando el nuevo método de amplificación descrito aquí. La tabla 3 más abajo da un resumen de las sondas sintetizadas, el número de termociclos usados y sus rendimientos de ARNc respectivos, e indica qué sondas se usaron para la fragmentación e hibridación subsiguiente a Affimetrix GeneChips. Obsérvese que se llevo a cabo la hibridación de oligo dT de síntesis de sonda convencional sin la presencia de dNTP. La cantidad de ARNc obtenida se midió mediante absorbancia a 260 nanómetros (nm) tras la purificación, y se representó gráficamente (Figura 2) para demostrar la repetibilidad de las reacciones de amplificación. Como se muestra en la Figura 2, las cantidades del ARNc marcado obtenido a partir de las muestras de 5 ng o 50 ng de ARN total con el nuevo protocolo de amplificación fueron comparables con el intervalo anticipado del protocolo estándar.

Metría de la calidad de conjuntos de GeneChip® estándar

Para evaluar adicionalmente si el nuevo protocolo de amplificación es adecuado para preparar dianas para el análisis de expresión de conjuntos GeneChip®, se hibridaron 10 \mug de dianas de ARNc, generadas a partir de los experimentos descritos previamente, sobre los conjuntos de genoma humano U133A (HG-U133A) de GeneChip®, en condiciones estándar, y se lavaron usando el protocolo de fluidos de EukGEWS2v4. Después del barrido, los chips se sometieron a una comprobación QC visual para determinar el fondo excesivo y la presencia de artefactos de tinción. Los datos se analizaron entonces usando el programa de ordenador Affymetrix Microarray Suite 5.0 (MAS 5.0), y se obtuvieron diversas metrías de control de calidad.

La Tabla 3 da un resumen de las metrías de QC tomadas a partir de los archivos .RPT. Los factores de escala fueron consistentes para todas las hibridaciones del chip sin que se observaran valores extremos.

Se examinaron los valores Raw Q, de fondo, y del factor de escala, para evaluar la calidad global de la muestra con las dianas preparadas según los dos protocolos (nuevo protocolo de amplificación y el protocolo estándar) (véase la Fig. 3). Como se muestra en la Tabla 4, se obtuvieron valores comparables para los tres parámetros. Por ejemplo, los valores del Fondo fueron todos de alrededor de 100, según se anticipó para experimentos típicos. Los factores de escala también estuvieron dentro del intervalo de unas tres veces - incluso cuando se comparan los datos de 5 ng de material de partida amplificado con el nuevo protocolo de amplificación.

Los conjuntos Affymetrix GeneChip® se diseñaron predominantemente con sondas seleccionadas adyacentes a la cola de poly-A del ARNm. Esta estrategia de diseño, junto con la generación inherente de un fragmento más corto a partir de amplificaciones adicionales, puede crear dianas que se encuentran en la distribución hacia el extremo 3'. Para examinar este fenómeno, Affymetrix ha creado conjuntos de sondas para genes de mantenimiento específicos (por ejemplo, GAPDH, actina), y estos conjuntos de sondas se diseñan para las regiones 3', central, y 5' del transcrito. Después, la intensidad de señal del conjunto de sonda de 3' se puede comparar con la intensidad de señal del conjunto de sondas de 5' (relación 3'/5'), para evaluar la eficacia de la reacción de la transcripción. Como se muestra en la Fig. 4 (parte superior y central), las muestras de 5 ng y 50 ng de ARN total con el nuevo protocolo de amplificación descrito aquí, produjeron la relación 3'/5' para los genes de GAPDH y actina, de aproximadamente 1, que equivale a aquellas muestras procesadas con el protocolo estándar y están muy bien dentro del intervalo recomendado de Affymetrix de 3. El transcrito de actina representado en el conjunto fue más largo que el gen de GAPDH, con 1.761 bases (con el conjunto de sondas de 5' dentro de las 1178-1712 bases, y el conjunto de sondas centrales dentro de las 589-1117 bases), pero las relaciones 3'/5' aún se mantuvieron. También se calculó la relación de conjunto de sondas de 3'/central (3'/M) de los genes de GAPDH y de actina (datos no mostrados), que también fue muy similar a los de las muestras procesadas con el protocolo estándar.

La comparación de las llamadas presentes en porcentaje se usó para evaluar globalmente la representación de datos. Como se muestra en la Fig. 4 (parte inferior), se obtuvieron valores comparables de llamada presente en porcentaje, con cantidades reducidas de materiales de partida. Incluso a 5 ng de ARN total de partida, alrededor de 50 por ciento de los conjuntos de sonda aún se podían llamar como presentes por el algoritmo del programa de ordenador Affymetrix MAS5.0.

Linealidad y Sensibilidad

La capacidad de cualquier protocolo de amplificación para detectar exactamente diferencias en los niveles de expresión depende enormemente de la linealidad y sensibilidad del ensayo.

El nuevo protocolo de amplificación se evaluó para determinar ambos parámetros analizando los transcritos de control de poly-A añadidos en una muestra compleja. Se añadieron 4 transcritos de control añadidos en las muestras de ARN total procedentes de biopsia de vejiga humana compleja, a diversas concentraciones. Tres estaban en controles de poly-A bacterianos generados in vitro - lys, phe, y thr, y la otra adición fue un ARN de control poly-A comercialmente disponible para canamicina. Lys, phe, y thr se representan mediante conjuntos de sonda en los GeneChips de U133A, y de esta manera las adiciones se pueden detectar cuando se añaden a muestras de ARN para la determinación del perfil. El transcrito de control de poly-A añadido de canamicina se puede medir mediante una PCR en tiempo real específica basada en el ensayo TaqMan. Se marcaron 5 ng y 50 ng de ARN total con el nuevo protocolo de amplificación, la diana se hibridó en conjuntos de HG-U133A, y las intensidades de las señales para los controles se representaron gráficamente (Figura 5), y los tres transcritos se detectaron mediante todas las sondas, independientemente del método.

Reproducibilidad de las réplicas

La reproducibilidad es un requisito clave para cualquier protocolo de amplificación, y es esencial para generar resultados fiables. Se hibridaron dos preparaciones diana independientes con 5 ng y 50 ng de dos ARN totales diferentes (las ID de ARN 384 y 842), usando el nuevo protocolo de amplificación, a conjuntos de HG-U133A.

Se calcularon valores de correlación de Pearson (Tablas 5 y 6) para las sondas amplificadas y no amplificadas derivadas de cada muestra. Los coeficientes de correlación de Pearson fueron todos >0,95, indicando de este modo una buena concordancia entre cada conjunto de réplicas. Sin embargo, puesto que el protocolo de amplificación estándar y el nuevo protocolo de amplificación usan cantidades diferentes de ARN total y diferentes protocolos, no se recomienda que los resultados obtenidos a partir de las muestras amplificadas y no amplificadas se comparen directamente.

Los conjuntos de datos para cada hibridación de chip se agruparon usando programa de ordenador Statistica (Tulsa, USA): el diagrama de árbol (Figura 6) preparado usando el método de Ward muestra que las dos muestras se agruparon separadamente, y que, como era de esperar, dentro de cada muestra las sondas amplificadas eran distinguibles de las sondas no amplificadas.

Gráficas de dispersión de las réplicas

Las gráficas de dispersión de escala logarítmica para las muestras de réplicas indican perfiles típicos alrededor de la diagonal xy lo que fue indicativo de una buena reproducibilidad para las réplicas. Una gráfica de dispersión de escala logarítmica representativa para 384 50 ng rep1 frente rep2 (Figura 7) ilustra el perfil típico. La mayoría de la dispersión fue notable a valores de señal <500; esto es debido principalmente a las limitaciones de la plataforma de tecnología, y es independiente del método de síntesis de sonda.

Análisis de los datos

Se identificaron los números de genes que cambian más de 2 veces en cualquier dirección, usando el programa de ordenador Spotfire (Goteborg, Suecia), y se resume en las Tablas 7 y 8. Las gráficas de dispersión de escala logarítmica indican que los genes cambian >2 veces (equivalente a > |log_{10} 0,3|). La Figura 8 muestra una gráfica de dispersión de escala logarítmica para 384 v 842 50 ng rep1, que es típica de las gráficas de dispersión para todas las otras comparaciones.

Se han comparado las gráficas de dispersión para todos los conjuntos de relaciones logarítmicas de todas las comparaciones por pares de muestras no amplificadas frente a las amplificadas, para obtener una medida de la expresión génica relativa para las muestras que se comparan. La Figura 9 muestra el Conjunto A de relación logarítmica en comparación con el Conjunto D. Todos los conjuntos de relación logarítmica, cuando se comparan con el conjunto A, muestran una distribución similar a lo largo de la diagonal xy. Como observación cualitativa, es razonable asumir que los conjuntos de relaciones son todos parecidos - de hecho las relaciones derivadas del nuevo método de amplificación no son más diferentes que la comparación del Conjunto A frente al Conjunto B, en la que todos los datos se obtuvieron usando el protocolo estándar. Los coeficientes de correlación de Pearson varían desde 0,81 hasta 0,87, con el número más elevado dado para la comparación entre sondas no amplificadas, y con el número más bajo de 0,81 dado para el Conjunto A frente al Conjunto F. - Estos son todos buenos valores de correlación para comparaciones de relación logarítmica. Obsérvese que los datos, incluyendo los presentados en la Figura 9, se filtraron para eliminar el ruido, es decir, para cualquier gen dado en el que las señales tuvieron <100 a lo largo de las doce hibridaciones de GeneChip®. La Tabla 4 muestra la señal de fondo media dada para este experimento, que fue 110 \pm
22 SD.

La Tabla 6 muestra que hubo números similares de genes que cambian >2 veces para cada comparación entre muestras 384 y 842 (promedio = 7844 \pm 444 SD), independientemente del método de síntesis de sonda. A fin de determinar cuántos de estos cambios son para los mismos genes en cada conjunto, se usó el Conjunto A como referencia, debido a que estos datos se obtuvieron usando el protocolo estándar de Affymetrix. Sin embargo, tomando la comparación del Conjunto A frente a todos los otros conjuntos (Tabla 6), se puede observar que el número de genes en común es menor que la cifra de 7844 dada anteriormente, y que esto incluye el Conjunto A frente al Conjunto B, en el que todos los datos se obtuvieron usando el protocolo estándar de Affymetrix. Además, se puede observar que sólo había 2385 genes en común a lo largo de las cinco comparaciones con el Conjunto A. Este resultado es, al menos en parte, debido a la limitación del ajuste de un valor de corte arbitrario (en este caso >2 veces).

Se empleó el agrupamiento de la media k en los conjuntos de datos usando el programa de ordenador Spotfire con ajustes por defecto, y se escogieron arbitrariamente para calcular 70 agrupamientos. Los conjuntos de datos se dejaron intactos sin que se emplease ningún filtro de señal de fondo. Los histogramas de frecuencias (Figura 10) representan los números de genes en cada agrupamiento, y si hubo cambio de >2 veces en el que se muestren destacado (blanco). Nótese que el agrupamiento más grande contiene 5488 genes, y que los primeros cuatro agrupamientos comprenden aproximadamente el 60% de todos los genes. Colectivamente, los agrupamientos en el histograma de la parte inferior representan los 2385 genes que cambian > 2 veces en común - véase la Tabla 7.

Ahora se prestará atención a los agrupamientos representativos seleccionados, para ilustrar que los perfiles de los transcritos génicos se pueden capturar exactamente usando el método de CPA. En primer lugar, algunos puntos para ayudar con el análisis de los agrupamientos presentados en las Figuras 11, 12 y 13.

\bullet: Los nombres de las muestras se etiquetan en el eje X

\bullet: el eje Y de cada agrupamiento está en la escala log_{10}

Mirando a los agrupamientos representativos en detalle, la Figura 11 muestra un agrupamiento que no demuestra una expresión génica diferencial significativa entre los tumores de grado 3 de T3 (muestra 384) y de grado 1 de Ta superficial (muestra 842), puesto que los perfiles génicos individuales parecen ser horizontales a lo largo de todas las muestras. Sin embargo, cuando no se produce la expresión génica diferencial, como se ejemplifica por los agrupamientos representados en las Figuras 12 y 13, se puede observar que las sondas amplificadas y no amplificadas están generando datos equivalentes, y que no hay ninguna tendencia observable.

Como se establece previamente, los primeros cuatro agrupamientos comprenden alrededor del 60% de los genes en el GeneChip®, y, en el caso del agrupamiento 1, todos los genes demuestran magnitudes de señales muy bajas (\sim<100). Esto es muy próximo al umbral de detección de la tecnología de Affymetrix, y las señales en esta región pueden ser debidas o no a la expresión génica real, independientemente del método de síntesis de sondas. Al inspeccionar todos los agrupamientos en el conjunto de datos, es manifiesto que la expresión diferencial está representada exactamente por perfiles de expresión derivados usando el nuevo protocolo de amplificación y también el protocolo estándar de Affymetrix.

Es este análisis cualitativo, junto con las gráficas de dispersión de relaciones logarítmicas y de las metrías de QC, lo que demuestra que el nuevo protocolo de amplificación puede generar perfiles de transcritos a partir de 5-50 ng de ARN total, con un mantenimiento aceptable de la integridad del perfil.

Varios cambios génicos se han confirmado mediante RT-PCR usando los mismos ARN totales (384 y 842), y están de acuerdo con los resultados de Affymetrix GeneChip® (datos no mostrados).

Conclusiones

Se ha encontrado que el nuevo protocolo de amplificación es adecuado para amplificar de forma robusta y marcar una cantidad tan baja como 5 ng de ARN total para la obtención del perfil de expresión. El ensayo demostró un buen rendimiento de ARNc, sensibilidad, y reproducibilidad. En el trabajo ejemplificado aquí se ha centrado en la aplicación posterior del ARNc, que se genera vía el nuevo método de amplificación, para conjuntos de sondas de Affymetrix GeneChip®. Sin embargo, el ARNc se podría usar para otras aplicaciones posteriores, incluyendo otras plataformas de obtención de perfiles de expresión génica. Los resultados se aproximan mucho al método estándar de Affymetrix, manteniendo así la integridad del perfil del transcrito y la metría de QC son comparables a las obtenidas usando el protocolo estándar. El protocolo proporciona un alcance para otra mejora, en particular el número de termociclos que se podría reducir adicionalmente todavía de forma que el rendimiento final del ARNc biotinilado es aproximadamente 10 \mug, puesto que esta es la cantidad mínima actualmente requerida para la hibridación a un Affymetrix
GeneChip®.

Como se describe aquí, también se abarca el uso de cantidades menores de ARN total.

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TABLA 1

2

3

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TABLA 2 Efecto de la adición de dNTP en la etapa de hibridación del cebador sobre el rendimiento de ARNc

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4

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TABLA 3 Rendimiento de ARNc en la síntesis de sonda, y número de termociclos usados

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5

6

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TABLA 4 Comparaciones de la metría de la calidad de conjuntos

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7

8

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Las dianas generadas a partir del protocolo estándar o a partir del nuevo protocolo de amplificación se hibridaron a Genechips de genoma humano U133A en condiciones estándar, y se lavaron usando el protocolo de fluidos EukGE-WS2v4. La Tabla 2 da un resumen de la metría de QC tomada a partir de los perfiles de .rpt de Affymetrix MAS5.0. Toda la metría está dentro del intervalo aceptable de valores.

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TABLA 5 Matriz de correlación de Pearson para las muestras "842" de biopsia comparadas entre sí

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9

10

TABLA 6 Matriz de correlación de Pearson para las muestras "384" de biopsia comparadas entre sí

11

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TABLA 7 Genes que cambian > 2 veces para cada conjunto de réplicas

12

TABLA 8 Intersección de conjuntos que demuestra el número de cambios de la expresión génica en común para cada comparación por pares

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14

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Secuencias

SEQ ID Nº 1

140

en la que V es A, G, o C y N es cualquier base

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SEQ ID Nº 2 (descrita en los documentos US 5.962.271 y US 5.962.272)

141

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SEQ ID Nº 3 (descrita en los documentos US 5.962.271 y US 5.962.272)

142

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SEQ ID Nº4

143

en la que V es A, G, o C y N es cualquier base.

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SEQ ID Nº 5

144

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SEQ ID Nº 6

145

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SEQ ID Nº 7

146

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SEQ ID Nº 8

147

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SEQ ID Nº 9

148

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<110> AstraZeneca AB

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<120> Método de amplificación

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<130> CCH/101162

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<140> GB 0319332.3

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<141> 16-08-2003

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<150> GB 0319332.3

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<151> 16-08-2003

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<160> 9

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<170> PatentIn version 3.2

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<210> 1

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<211> 94

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<212> ADN

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<213> Artificial

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<220>

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<223> PCR, CEBADOR

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<220>

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<221> misc_feature

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<222> (94)..(94)

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<223> n es a, c, g, o t

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<400> 1

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1000

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<210> 2

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<211> 30

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<212> ADN

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<213> Artificial

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<220>

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<223> PCR CEBADOR

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<400> 2

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\hskip-.1em\dddseqskip

aagcagtggt atcaacgcag agtacgcggg

\hfill

30

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<210> 3

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<211> 23

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<212> ADN

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<213> Artificial

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<220>

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<223> PCR CEBADOR

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<400> 3

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aagcagtggt atcaacgcag agt

\hfill

23

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<210> 4

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<211> 71

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<212> ADN

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<213> Artificial

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<220>

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<223> PCR CEBADOR

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<220>

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<221> misc_feature

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<222> (71)..(71)

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<223> n es a, c, g, o t

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<400> 4

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1001

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<210> 5

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<211> 18

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<212> ADN

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<213> Artificial

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<220>

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<223> PROMOTOR ARN POLIMERASA

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<400> 5

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gcattaaccc tcactaac

\hfill

18

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<210> 6

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<211> 17

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<212> ADN

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<213> Artificial

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<220>

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<223> PROMOTOR ARN POLIMERASA

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<400> 6

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taatacgact cactata

\hfill

17

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<210> 7

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<211> 22

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<212> ADN

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<213> Artificial

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<220>

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<223> PROMOTOR ARN POLIMERASA

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<400> 7

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aatacgactc actataggga ga

\hfill

22

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<210> 8

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<211> 39

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<212> ADN

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<213> Artificial

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<220>

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<223> PROMOTOR ARN POLIMERASA

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<400> 8

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ggccagtgaa ttgtaatacg actcactata gggaggcgg

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39

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<210> 9

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<212> ADN

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<213> Artificial

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<220>

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<223> PROMOTOR ARN POLIMERASA

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<400> 9

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atttaggtga cactata

\hfill

17

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Claims

1. Híbrido de ADNc-ARN que comprende la síntesis de una primera hebra de ADNc hibridada a un ARN, en el que el ADNc comprende, a partir del extremo 5', una secuencia amplificadora a partir de la que existe en 3' un promotor de ARN polimerasa unido, de manera operacional, a una región de hibridación del ARN, y en el que al menos un nucleótido no moldeado, en el extremo 3' de la primera hebra del ADNc, se hibrida con un oligonucleótido de intercambio de moldes, y en el que la secuencia amplificadora y el oligonucleótido de intercambio de moldes contienen la misma secuencia.

2. Híbrido de ADNc-ARN según la reivindicación 1, en el que el promotor de ARN polimerasa es un promotor de bacteriófago elegido del grupo que consiste en T7, T3 y SP6.

3. Híbrido de ADNc-ARN según una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que la región de hibridación del ARN comprende un poli(T) de una longitud de alrededor de 10 a alrededor de 30 restos de T.

4. Híbrido de ADNc-ARN según una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que el extremo 3' de la región de hibridación del ARN comprende una pinza VN, en la que V es A, G o C, y N es A, G, C o T.

5. Híbrido de ADNc-ARNm según una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que al menos un nucleótido no moldeado en el extremo 3' de la síntesis de la primera hebra del ADNc es una desoxicitidina.

6. Híbrido de ADNc-ARNm según una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que al menos tres nucleótidos no moldeados en el extremo 3' de la síntesis de la primera hebra del ADNc se hibridan con un oligonucleótido de intercambio de moldes.

7. Híbrido de ADNc-ARNm según una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que al menos tres nucleótidos no moldeados en el extremo 3' de la síntesis de la primera hebra del ADNc son nucleótidos de desoxicitidina.

8. Híbrido de ADNc-ARNm según una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que el oligonucleótido de intercambio de moldes tiene al menos tres restos de guanina en su extremo 3'.

9. Híbrido de ADNc-ARNm según una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, que comprende además un cebador de amplificación, y en el que el cebador de amplificación contiene la misma secuencia que la secuencia amplificadora y el oligonucleótido de intercambio de moldes.

10. Híbrido de ADNc-ARNm según una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que el extremo 3' de la síntesis de la primera hebra del ADNc se extiende de forma que sea sustancialmente complementaria al oligonucleótido de intercambio de moldes.

11. Híbrido de ADNc-ARNm según la reivindicación 10, en el que la síntesis de la primera hebra del ADNc se sintetiza mediante una transcriptasa inversa, y en el que la transcriptasa inversa está desprovista de actividad de ARNsaH pero conserva una actividad de polimerasa de tipo natural.

12. Procedimiento de amplificación de ARN en una muestra, que comprende las etapas que consisten en:

(a): suministrar un oligonucleótido de síntesis de ADNc que comprende, a partir del extremo 5', una secuencia amplificadora a partir de la que existe en dirección 3' un promotor de ARN polimerasa enlazado, de manera operacional, a una región de hibridación del ARN;

(b): hibridar la región de hibridación del ARN, del oligonucleótido de síntesis de ADNc, a un ARN en condiciones apropiadas para producir un complejo de ADNc-ARN;

(c): incubar dicho complejo de ADNc-ARN en condiciones que permitan una extensión, dependiente de un molde, del oligonucleótido de síntesis de ADNc, para generar un híbrido de ADNc-ARN;

(d): poner en contacto dicho híbrido de ADNc-ARNm con un oligonucleótido de intercambio de moldes, en condiciones que permitan una extensión, dependiente de un molde, de dicho ADNc, de manera que el extremo 3' del ADNc comprenda una secuencia complementaria a dicho oligonucleótido de intercambio de moldes, en el que la secuencia amplificadora y el oligonucleótido de intercambio de moldes contienen la misma secuencia;

(e): proporcionar un cebador de amplificación en condiciones que permitan generar productos de amplificación bicatenarios que corresponden a la síntesis de la primera hebra del ADNc, de manera que los productos de amplificación del ADNc comprendan un promotor de ARN polimerasa bicatenario; y

(f): incubar dichos productos de amplificación del ADNc, que comprenden dicho promotor de ARN polimerasa bicatenario, en condiciones que permitan una transcripción in vitro para generar el ARN amplificado.

13. Procedimiento según la reivindicación 12, en el que dicho híbrido de ADNc-ARN se incuba con una transcriptasa inversa que añade al menos un resto de desoxicitidina en el extremo 3' de la síntesis de la primera hebra del ADNc.

14. Procedimiento según la reivindicación 12 o la reivindicación 13, en el que al menos tres nucleótidos no moldeados en el extremo 3' de la síntesis de la primera hebra del ADNc se hibridan con un oligonucleótido de intercambio de moldes.

15. Procedimiento según una cualquiera de las reivindicaciones 12 a 14, en el que al menos tres de los nucleótidos no moldeados en el extremo 3' de la síntesis de la primera hebra del ADNc son restos de desoxicitidina.

16. Procedimiento según una cualquiera de las reivindicaciones 12 a 15, en el que la transcriptasa inversa está desprovista de actividad de ARNasaH, pero conserva una actividad de polimerasa de tipo natural.

17. Procedimiento según una cualquiera de las reivindicaciones 12 a 16, en el que dicho oligonucleótido de intercambio de moldes comprende al menos tres restos ribonucleotídicos.

18. Procedimiento según una cualquiera de las reivindicaciones 12 a 17, en el que dicho oligonucleótido de intercambio de moldes comprende al menos tres restos de guanina.

19. Procedimiento según una cualquiera de las reivindicaciones 12 a 18, en el que dicho cebador de amplificación tiene la misma secuencia que la secuencia amplificadora de dicho oligonucleótido de síntesis del ADNc.

20. Procedimiento según una cualquiera de las reivindicaciones 12 a 19, en el que los productos de amplificación bicatenarios se obtienen mediante PCR.

21. Procedimiento según una cualquiera de las reivindicaciones 12 a 20, en el que el oligonucleótido de síntesis del ADNc y el cebador de PCR tienen la misma concentración.

22. Procedimiento según una cualquiera de las reivindicaciones 12 a 21, en el que el número óptimo de ciclos para generar los productos de amplificación bicatenarios se determina mediante un procedimiento que comprende las etapas que consisten en:

(a): suministrar una multitud de muestras que tienen una cantidad conocida de ARN;

(b): realizar una amplificación, para un número definido de ciclos, sobre la multitud de muestras;

(c): purificar los productos de amplificación bicatenarios;

(d): proporcionar una transcripción in vitro de los productos de amplificación; y

(e): determinar el número de ciclos de amplificación que conduce a la cantidad mínima requerida de ARN amplificado.

23. Procedimiento según una cualquiera de las reivindicaciones 12 a 22, en el que la muestra de ARN es una muestra clínica seleccionada del grupo que consiste en una biopsia, un tejido microdiseccionado, un aspirado de aguja fina, una célula clasificada por flujo, una célula microdiseccionada capturada por láser, o una célula individual.

24. Procedimiento de preparación de una biblioteca de expresión de una célula o de una población de células, que comprende las etapas que consisten en:

(a): proporcionar un oligonucleótido de síntesis de ADNc que comprende, a partir del extremo 5', una secuencia amplificadora a partir de la que existe en dirección 3' un promotor de ARN polimerasa enlazado, de manera operacional, a una región de hibridación del ARN;

(b): poner en contacto dicho oligonucleótido de síntesis de ADNc con una población de ARNm que provienen de dicha célula o de dicha población de células, en condiciones que permitan una hibridación de dicho oligonucleótido de síntesis de ADNc con el ARNm, para producir un complejo de ADNc-ARNm;

(c): incubar dicho complejo de ADNc-ARNm en condiciones que permitan una extensión, dependiente de un molde, de dicho oligonucleótido de síntesis de ADNc, para generar un híbrido de ADNc-ARNm;

(d): poner en contacto dicho híbrido de ADNc-ARNm con un oligonucleótido de intercambio de moldes, en condiciones que permitan una extensión, dependiente de un molde, de dicho ADNc, de manera que el extremo 3' del ADNc del híbrido de ADNc-ARNm comprenda una secuencia complementaria a dicho oligonucleótido de intercambio de moldes, en el que la secuencia amplificadora y el oligonucleótido de intercambio de moldes contienen la misma secuencia;

(e): poner en contacto un cebador de amplificación con dicho híbrido de ADNc-ARNm, en condiciones que permitan generar productos de amplificación bicatenarios que corresponden a la síntesis de la primera hebra del ADNc, de manera que los productos de amplificación del ADNc bicatenarios comprendan un promotor de ARN polimerasa bicatenario; e

(f): incubar dichos productos de amplificación del ADNc bicatenarios, que comprenden dicho promotor de ARN polimerasa bicatenario, en condiciones que permitan una transcripción in vitro para generar un ARN amplificado.

25. Procedimiento de preparación de una biblioteca de ADNc a partir de una colección de moléculas de ARNm, que comprende las etapas que consisten en:

(b): poner en contacto dicho oligonucleótido de síntesis de ADNc con la colección de ARNm en condiciones que permitan hibridar dicho oligonucleótido de síntesis del ADNc con un ARNm, para producir un complejo de ADNc-ARNm;

(c): incubar dicho complejo de ADNc-ARNm en condiciones que permitan una extensión, dependiente de un molde, de dicho oligonucleótido de síntesis del ADNc, para generar un híbrido de ADNc-ARNm;

(d): poner en contacto dicho híbrido de ADNc-ARNm con un oligonucleótido de intercambio de moldes, en condiciones que permitan una extensión, dependiente de un molde, de dicho ADNc de dicho híbrido, de manera que el extremo 3' del ADNc del híbrido de ADNc-ARNm comprenda una secuencia complementaria a dicho oligonucleótido de intercambio de moldes, en el que la secuencia amplificadora y el oligonucleótido de intercambio de moldes contienen la misma secuencia;

(e): poner en contacto un cebador de PCR con dicho híbrido de ADNc-ARNm, en condiciones que permitan generar productos de amplificación bicatenarios que corresponden a la síntesis de la primera hebra del ADNc, de manera que los productos de amplificación del ADNc bicatenarios comprendan un promotor de ARN polimerasa bicatenario;

(f): incubar dichos productos de amplificación del ADNc bicatenarios, que comprenden dicho promotor de ARN polimerasa bicatenario, en condiciones que permitan una transcripción in vitro para generar un ARN amplificado; y

(g): preparar una biblioteca de ADNc a partir del ARN amplificado.

26. Procedimiento de ejecución de una hibridación sustractiva, que comprende las etapas que consisten en:

(b): poner en contacto dicho oligonucleótido de síntesis de ADNc con una colección de ARNm, en condiciones que permitan hibridar dicho oligonucleótido de síntesis del ADNc con un ARNm en dicha muestra de ARN, para producir un complejo de ADNc-ARNm;

(c): incubar dicho híbrido de ADNc-ARNm con una enzima, unos dNTP y un tampón, en condiciones que permitan una extensión, dependiente de un molde, de dicho oligonucleótido de síntesis de ADNc, para generar un híbrido de ADNc-ARNm;

(d): poner en contacto dicho híbrido de ADNc-ARNm con un oligonucleótido de intercambio de moldes en condiciones que permitan una extensión, dependiente de un molde, de dicho ADNc de dicho híbrido, de manera que el extremo 3' del ADNc del híbrido de ADNc-ARNm comprenda una secuencia complementaria a dicho oligonucleótido de intercambio de moldes, en el que la secuencia amplificadora y el oligonucleótido de intercambio de moldes contienen la misma secuencia;

(e): poner en contacto un cebador de amplificación con dicho híbrido de ADNc-ARNm, en condiciones que permitan generar productos de amplificación bicatenarios que corresponden a la síntesis de la primera hebra del ADNc, de manera que los productos de amplificación del ADNc bicatenarios comprendan un promotor de ARN polimerasa bicatenario;

(f): incubar dichos productos de amplificación del ADNc bicatenarios, que comprenden dicho promotor de ARN polimerasa bicatenario, en condiciones que permitan una transcripción in vitro para generar un ARN amplificado;

(g): poner en contacto dicho ARN amplificado con una población de ácidos nucleicos monocatenaria, en el sentido opuesto a dicho ARN amplificado;

(h): proporcionar la hibridación de las secuencias presentes en el ARN amplificado y la población de ácidos nucleicos monocatenaria; y

(i): aislar la población de ácidos nucleicos que sigue siendo monocatenaria.

27. Procedimiento de detección de la expresión de un gen de interés que comprende las etapas que consisten en:

(a): proporcionar un oligonucleótido de síntesis de ADNc que comprende, a partir del extremo 5', una secuencia amplificadora a partir de la que existe en dirección 3' un promotor de ARN polimerasa enlazado, de manera operacional, a una región de hibridación del ARN, en el que la región de hibridación del ARN comprende una secuencia que es sustancialmente homóloga al ARNm expresado por el gen de interés;

(b): poner en contacto dicho oligonucleótido de síntesis de ADNc con una población de ARNm en una célula o en una población de células en condiciones que permitan hibridar dicho oligonucleótido de síntesis del ADNc con un ARNm, para producir un complejo de ADNc-ARNm;

(c): incubar dicho híbrido de ADNc-ARNm en condiciones que permitan una extensión, dependiente de un molde, de dicho oligonucleótido de síntesis del ADNc, para generar un híbrido de ADNc-ARNm;

(d): poner en contacto dicho híbrido de ADNc-ARNm con un oligonucleótido de intercambio de moldes en condiciones que permitan una extensión, dependiente de un molde, de dicho ADNc de dicho híbrido, de manera que el extremo 3' del ADNc del híbrido de ADNc-ARNm comprenda una secuencia complementaria de dicho oligonucleótido de intercambio de moldes, en el que la secuencia amplificadora y el oligonucleótido de intercambio de moldes contienen la misma secuencia;

(e): poner en contacto un cebador de amplificación con dicho híbrido de ADNc-ARNm en condiciones que permitan generar productos de amplificación bicatenarios que corresponden a la síntesis de la primera hebra del ADNc, de manera que los productos de amplificación del ADNc bicatenarios comprendan un promotor de ARN polimerasa bicatenario;

(g): determinar la presencia o la ausencia de ARN amplificado, el cual es complementario al ARNm que corresponde al gen de interés.

28. Uso de un híbrido de ADNc-ARNm según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 11, en una etapa cualquiera de:

: la amplificación de un ARN;

: la preparación de una biblioteca de ADNc;

: una hibridación sustractiva; o

: una medición de la expresión de un gen.

29. Kit para la amplificación de ARN en un muestra, que comprende las etapas que consisten en:

(b): un oligonucleótido de intercambio de moldes que tiene la misma secuencia que la secuencia amplificadora; y

(c): un cebador de amplificación que tiene la misma secuencia que el oligonucleótido de intercambio de moldes.

30. Kit según la reivindicación 29, en el que el kit comprende además, en un recipiente separado, una transcriptasa inversa, en el que la transcriptasa inversa está desprovista de actividad de ARNasaH pero conserva una actividad de polimerasa de tipo natural.

31. Kit según una cualquiera de las reivindicaciones 29 a 30, en el que el kit comprende además, en un recipiente separado, una ARN polimerasa específica del promotor de ARN polimerasa del oligonucleótido de síntesis del ADNc.

32. Kit según una cualquiera de las reivindicaciones 29 a 30, en el que el promotor de la ARN polimerasa se elige entre el promotor de la ARN polimerasa de un T7, de un T3 o de un SP6.

33. Kit según una cualquiera de las reivindicaciones 29 a 32, en el que el kit comprende además un tampón de amplificación y una o varias enzima(s) de amplificación, en el que el tampón de amplificación y la(s) enzima(s) de amplificación son un tampón de amplificación para PCR y una(s) enzima(s) de amplificación para PCR.