ES2296050T3

ES2296050T3 - Productos intermedios para sintesis de antagonistas de lhrh, procedimiento para su produccion y procedimiento para la produccion de antagonistas de lhrh.

Info

Publication number: ES2296050T3
Application number: ES05025717T
Authority: ES
Inventors: Jon H. Rasmussen; Palle H. Rasmussen; Wolfgang O. Wachs; Stefan Hansen; Jens Fomsgaard
Original assignee: CARLBIOTECH Ltd AS; Polypeptide Laboratories AS
Current assignee: CARLBIOTECH Ltd AS; Polypeptide Laboratories AS
Priority date: 2001-12-29
Filing date: 2002-12-23
Publication date: 2008-04-16
Anticipated expiration: 2022-12-23
Also published as: DE60215544D1; HK1075052A1; KR100844520B1; ATE371666T1; CY1107025T1; CY1107580T1; NO20043047L; PT1465917E; DE60222189T2; DK1465917T3; CN1622954A; NZ534245A; ATE342913T1; KR20040090965A; CN1304417C; DK1630169T3; CA2471723C; EP1465917A1; ES2275012T3; JP4272529B2

Abstract

Un procedimiento para preparar un tripéptido, incluyendo una sal del mismo, de la fórmula (IX) Boc-D-2Nal-D-4ClPhe-D-3Pal-OH (IX) que comprende las siguientes etapas consecutivas: (a) hacer reaccionar Boc-D-4ClPhe-OH con HONSu para formar Boc-D-4CIPhe-OSu (VII); (b) hacer reaccionar Boc-D-4ClPhe-OSu (VII) con H-D-3Pal-OH para formar Boc-D-4CIPhe-D-3Pal-OH (VIII); (c) desproteger Boc-D-4ClPhe-D-3Pal-OH (VIII) y hacer reaccionar con Boc-D-D2Nal-OSu preparado haciendo reaccionar Boc-D-2Nal-OH con HONSu para formar Boc-D-2Nal-D-4ClPhe-D-3Pal-OH (IX).

Description

Productos intermedios para síntesis de antagonistas de LHRH, procedimiento para su producción y procedimiento para la producción de antagonistas de LHRH.

Campo de la invención

La presente invención se refiere a productos intermedios para la síntesis de antagonistas de LHRH, a un procedimiento para la producción de estos productos intermedios y a un procedimiento para la producción de antagonistas de LHRH.

Antecedentes de la invención

La hormona liberadora de hormona luteinizante, LHRH, controla la secreción de hormona estimulante de folículos (FSH) y hormona luteinizante (LH). Los antagonistas de LHRH son compuestos capaces de bloquear la secreción de FSH y LH. Generalmente son nona- y deca-péptidos (pero pueden ser más cortos o más largos) que comprenden parte de o la estructura completa de LHRH en los que uno o varios aminoácidos se han intercambiado por otros aminoácidos naturales y/o otros aminoácidos no encontrados en la naturaleza.

Antagonistas de LHRH sintéticos pueden usarse para la anticoncepción y en el tratamiento de hiperplasia benigna de la glándula prostática, tumores de mama y ovarios dependientes de hormonas, dismenorrea, endometriosis y otros estados. Estos antagonistas de LHRH sintéticos tienen la fórmula general

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en la que X es de 5 a 6 residuos de aminoácido natural y/o sintético. Más particularmente, tienen la fórmula general mencionada anteriormente en la que X es AA1-AA2-Leu-AA3-Pro-D-Ala, en particular en la que AA1 es un aminoácido natural o sintético y AA2 es un aminoácido natural o sintético o cero, AA3 es un aminoácido natural o sintético.

Aunque existe un número de métodos sintéticos para preparar análogos de LHRH conocidos en la técnica, existe una necesidad de mejora ya que el rendimiento total de análogos de LHRH obtenidos a partir de procedimientos conocidos no es alto y los productos, además, pueden requerir una purificación intensiva. Por otra parte, los métodos para la síntesis de análogos de LHRH conocidos en la técnica son bastante costosos.

Una estrategia de síntesis descrita en la Patente de EE.UU. Nº 5.710.246 para elaborar antagonistas de LRHR decapeptídicos o nonapeptídicos comprende el acoplamiento de un tripéptido intermedio que representa los residuos amino 1 a 3 (la cuenta empieza en el extremo amino del péptido) con un heptapéptido o un hexapéptido, que representa respectivamente los residuos de aminoácido 4-10 y 4-9, respectivamente. El tripéptido intermedio descrito en US 5710246 A es un éster, Boc-D-2Nal-D-4ClPhe-D-3Pal-O-Me, o el correspondiente éster bencílico o alílico.

Objetivos de la invención

Así, un objetivo de la invención es proporcionar un producto intermedio tripeptídico para la síntesis 3+7 y 3+6 de análogos de LHRH en la que se mejora el rendimiento y/o la pureza del producto.

Otro objetivo de la invención es proporcionar un procedimiento para la producción de tal producto intermedio tripeptídico.

Otro objetivo más de la invención es proporcionar un procedimiento para la producción de análogos de LHRH en el que un tripéptido se acopla a un heptapéptido.

Objetivos adicionales de la invención serán obvios a partir del siguiente sumario de la invención, la descripción de modalidades preferidas y las reivindicaciones de patente adjuntas.

Definiciones y abreviaturas

Para las definiciones y las abreviaturas usadas en esta solicitud que son aceptadas generalmente en el campo de la invención se hace referencia en particular a US 5710246 A.

Sumario de la invención

De acuerdo con la invención, se proporciona un tripéptido que representa los aminoácidos 1-3 de un antagonista de LRHR, cuyo grupo amino terminal está protegido con Boc y cuyo grupo carboxilo terminal (esto es, el grupo terminal del aminoácido Nº 3) no está protegido.

De acuerdo con la invención, se describe el tripéptido

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Por otra parte, de acuerdo con la invención, se describe un procedimiento para preparar un tripéptido de la fórmula (IX)

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que comprende las siguientes etapas consecutivas para la preparación de (IX):

(a): hacer reaccionar Boc-D-4ClPhe-OH con HONSu para formar Boc-D-4ClPhe-OSu (VII);

(b): hacer reaccionar Boc-D-4ClPhe-OSu (VII) con H-D-3Pal-OH para formar Boc-D-4ClPhe-D-3Pal-OH (VIII);

(c): desproteger y hacer reaccionar Boc-D-4ClPhe-D-3Pal-OH (VIII) con Boc-D-2Nal-OSu preparado haciendo reaccionar Boc-D-2Nal-OH con HONSu para formar Boc-D-2Nal-D-4ClPhe-D-3Pal-OH (IX);

o las etapas consecutivas (a) a (c) para la preparación de (IX).

El procedimiento de la invención para preparar un antagonista de LHRH comprende la etapa de acoplar el tripéptido (IX)

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con un heptapéptido (IV) de la fórmula general

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en donde P^{1} se selecciona de H o un grupo protector de amino, P^{2} es H o un grupo protector de OH, P^{4} es H o un grupo protector de amino tal como Boc, AA1 es un aminoácido natural o sintético y AA2 es un aminoácido natural o sintético o cero, en particular con un heptapéptido (V) de la fórmula general

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o,

aún más preferiblemente, con un heptapéptido de la fórmula general (Va)

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en la que P^{1} se selecciona de H o un grupo protector de amino, P^{2} y P^{3} se seleccionan independientemente de H y un grupo protector de -OH, P^{4} tiene el significado mencionado anteriormente, seguido por substituir el grupo Boc N-terminal por un grupo acilo, en particular un grupo acetilo.

El heptapéptido (V) se describe en US 5710246. El heptapéptido de la fórmula general (IV), incluyendo el heptapéptido (Va), puede sintetizarse mediante modificaciones habituales de la síntesis de (V) o acoplando los Boc-aminoácidos correspondientes en un sintetizador de péptidos (Beckman Modelo 990), según se describe en WO 94/40757, donde también se describe el antagonista de LHRH (III).

Más particularmente, el heptapéptido de la fórmula general (V) es el heptapéptido (VI)

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o, aún más preferiblemente, el heptapéptido (VIa)

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Una ventaja particular con el método de la invención es que puede usarse un material de partida más económico, H-D-Pal-OH\cdot2HCl, en lugar del éster H-Pal-OR-2HC1; el grupo protector del material de partida no necesita retirarse. Por lo tanto, la síntesis de la invención es una etapa más corta y evita que se pierda material en la etapa adicional. Otra ventaja es que se evita la formación de impurezas en la saponificación. La formación de tales impurezas es bien conocida. Por ejemplo, condiciones básicas en la etapa de hidrólisis del éster provocan la racemización parcial de D-Pal. La otra alternativa de la técnica anterior para retirar el grupo éster mediante hidrogenación catalítica (en el caso de grupos éster alílico o bencílico) se arriesga a provocar una pérdida de Cl de 4ClPhe produciendo Phe. Aunque los grupos alilo pueden retirarse mediante otros reactivos adicionales, la retirada total es difícil de controlar.

La invención se explicará ahora con más detalle mediante referencia a una modalidad preferida.

Descripción de una modalidad preferida de la invención Síntesis de Ac-D-2Nal-4ClPhe-D-3Pal-OH (I)

Ejemplo 1

Boc-D-4ClPhe-OSu

Boc-D-4ClPhe-OH (299,75 g; 1,0 eq.) y HONSu (184,1 g; 1,6 eq.) se disuelven en 2-propanol (4,5 l). La mezcla se enfría hasta 0ºC y se añade DIC (164,1 g; 1,3 eq.). La mezcla se agita durante 16 h mientras se calienta hasta temperatura ambiente. El producto se separa por filtración, se lava con 2-propanol (1,5 l) y se seca. Rendimiento: 85%. Pureza por HPLC: 98,8%.

Ejemplo 2 Boc-D-4ClPhe-D-3Pal-OH

H-D-3Pal-OH, 2 HCl (251,1 g; 1,05 eq.) y Boc-D-4ClPhe-OSu (396,8 g; 1, 0 eq.) se disuelven en DMSO (3,33 l) y se añade NMM (318,8 g; 3,15 eq.). La mezcla se agita durante 16 h a temperatura ambiente. Se añade agua (17 l) y el pH se ajusta hasta 4-4,5, lo que hace que el producto precipite. La mezcla se filtra y el producto se lava con agua (3 x 5 l) para retirar trazas de DMSO, H-D-3Pal-OH y Boc-D-4ClPhe-OH. El producto se seca. Rendimiento: 80%. Pureza por HPLC: 97,8%.

Ejemplo 3 Boc-D-2Nal-OSu

Boc-D-2Nal-OH (315,4 g; 1,0 eq.) se disuelve en 2-propanol (6,8 l) a -10ºC y se añaden IBC (157 g; 1,15 eq.) y NMM (116 g; 1,15 eq.). Después de agitar durante 5-10 min se añade una mezcla de HONSu (230,1 g; 2,0 eq.) en 2-propanol (1,4 l). Se añade NMM adicional (10,1 g; 0,1 eq.). Después de media hora, se añade agua (0,82 l) para disolver NMM\cdotHCl precipitado. El producto se aísla mediante filtración, se lava con 2-propanol (1 l) y se seca. Rendimiento: 90%. Pureza por HPLC: 98,3%.

Ejemplo 4 Boc-D-Nal-D-4ClPhe-D-3Pal-OH

a): Desprotección: Boc-D-4ClPhe-D-3Pal-OH (447,93 g; 1,0 eq.) se disuelve en una mezcla de acetato de etilo (3,4 l), ácido acético (675 ml) y MSA (454; 7,0 eq.) a 0ºC y se mantiene a esta temperatura durante dos horas. Se añade TEA ((1669 ml; 12 eq.).

b): Condensación. Se añade Boc-D-Nal-OSu (412,4 g; 1,0 eq.) a la mezcla de desprotección neutralizada a temperatura ambiente. La mezcla de reacción se mantiene a esta temperatura durante 2-4 h. Se añade NH_{3} acuoso al 25% (154 ml; 2,0 eq.) para extinguir el éster de hidroxisuccinimida restante. Se añade 1-butanol (4,5 l) para evitar la precipitación en las extracciones subsiguientes.

c): Purificación y aislamiento. La mezcla de reacción se extrae dos veces a pH 6 (2 x 4,5 l de agua) para retirar TEA, a pH 9 (4,5 l de agua) para retirar MSA y finalmente a pH 7 (4,5 l de agua). Las extracciones se llevan a cabo a 40-45ºC para evitar la precipitación. Se añade a la fase orgánica ácido acético (4,5 l; 1 vol.) y la mezcla se concentra a vacío y se coevapora con ácido acético (4,5 l) para dar un sólido.

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Ejemplo 5 Ac-D-2Nal-D-4ClPhe-D-3Pal-ONa

a): Desprotección. Se añaden al Boc-D-2Nal-D-4ClPhe-D-3Pal-OH sólido agua (90 ml), ácido acético (1,8 l) y MSA (454 ml; 7,0 eq.) y la mezcla se agita durante 1-2 h a temperatura ambiente. La mezcla se enfría hasta 0ºC y se neutraliza con TEA (1071 ml; 7,7 eq.). La solución se concentra a vacío y se coevapora dos veces con tolueno (2 x 2,5 l) para dar un aceite.

b): Acetilación. El aceite procedente de la etapa de desprotección se disuelve en tolueno (2,0 l) y se añade acetilimidazol (132,14 g). La mezcla se agita a temperatura ambiente durante 1 h y a continuación se añade agua (100 ml) para extinguir el acetilimidazol restante.

d): Purificación. La mezcla procedente de la acetilación se calienta hasta 30-35ºC y se añade 1-butanol (4,5 l) para evitar la precipitación. La mezcla se extrae dos veces a pH 5 (2 x 2,6 l de agua) y dos veces a pH 11 (2 x 2,6 l de agua) usando NaOH para ajustar el pH hasta 11. Se añade metanol (2,25 l) a las últimas extracciones para evitar la precipitación. Se añade NaCl (130 g) a la primera y la última extracción para minimizar la pérdida de producto en las fases acuosas.

e): Aislamiento. Se añade heptano (15 l) a la fase orgánica vigorosamente agitada procedente de las extracciones y la suspensión resultante se deja a temperatura ambiente mientras se agita durante al menos 1 h. La mezcla se filtra y el producto se lava dos veces con heptano (2 x 3,5 l) y se seca. Rendimiento: 75% (a partir Boc-D-4ClPhe-D-3Pal-OH). Pureza por HPLC: 92%. Análisis de aminoácidos: 2Nal: 1,1; 4ClPhe: 1,0; 3Pal: 0,9. MS: PM 586. Na: 4,6%.

Ejemplo 6 Ac-D-2Nal-D-4ClPhe-D-3Pal-OH\cdotDCHA

b): Acetilación. El aceite procedente de la desprotección se disuelve en tolueno (2,0 l) y se añade acetilimidazol (132,14 g). La mezcla se agita a temperatura ambiente durante 1 h seguido por la adición de agua (100 ml) para extinguir el acetilimidazol restante.

c): Purificación. La mezcla se calienta hasta 30-35ºC y se añade 1-butanol (4,5 l) para evitar la precipitación. La mezcla se extrae dos veces a pH 7 (2 x 2,6 l de agua), una vez a pH 9-9,5 (2,6 l de agua) y una vez a pH 7 (2,6 l de agua). Se añade DCHA (diciclohexilamina) y la mezcla se concentra a vacío. El producto se suspende en 1-butanol (4,5 l) a 50ºC y se añade lentamente a heptano vigorosamente agitado (27 l). La mezcla se agita a 0ºC durante la noche, se filtra y el producto se extrae dos veces con 1-butanol/heptano (1:3; 2 x 4,8 l) y dos veces con heptano (2 x 4,5 l). Rendimiento: 65% (a partir de Boc-D-4ClPhe-D-3Pal-OH). Pureza por HPLC: 94,2%. Análisis de aminoácidos: 2Nal: 1,1; 4ClPhe: 1,0; 3Pal: 0,9. MS: PM 586 (péptido libre).

Ejemplo 7 Ac-D-2Nal-D-4ClPhe-D-3Pal-OH

b): Acetilación. El aceite procedente de la desprotección se disuelve en tolueno (2,0 l) y se añade acetilimidazol (132,14 g). La mezcla se agita a temperatura ambiente durante 1 h y a continuación se añade agua (100 ml) para extinguir el acetilimidazol restante.

c): Purificación. La mezcla procedente de la acetilación se calienta hasta 30-35ºC y se añade 1-butanol (4,5 l) para evitar la precipitación. La mezcla se extrae dos veces a pH = 7 (2 x 2,6 l de agua) y una vez a pH = 9-9,5 (2,6 l de agua) y una vez a pH = 7 (2,6 l de agua). La mezcla se concentra a vacío hasta un aceite, que se disuelve en ácido acético (750 ml), se concentra, se redisuelve en ácido acético (750 ml) y se añade lentamente a heptano/acetato de etilo (3:1; 3,6 l) agitados vigorosamente. La mezcla se deja agitar a 0ºC durante la noche. La mezcla se filtra y el producto se lava dos veces con acetato de etilo/heptano (1:3; 2 x 3,6 l) y dos veces con heptano (2 x 3,6 l). Rendimiento: 70% (a partir de Boc-D-4ClPhe-D-3Pal-OH). Pureza por HPLC: 93,9%. Análisis de aminoácidos: Nal: 1,1; 4ClPhe: 1,0; 3Pal: 0,9 MS: PM 586 (péptido libre).

Claims

1. Un procedimiento para preparar un tripéptido, incluyendo una sal del mismo, de la fórmula (IX)

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que comprende las siguientes etapas consecutivas:

(a): hacer reaccionar Boc-D-4ClPhe-OH con HONSu para formar Boc-D-4CIPhe-OSu (VII);

(b): hacer reaccionar Boc-D-4ClPhe-OSu (VII) con H-D-3Pal-OH para formar Boc-D-4CIPhe-D-3Pal-OH (VIII);

(c): desproteger Boc-D-4ClPhe-D-3Pal-OH (VIII) y hacer reaccionar con Boc-D-D2Nal-OSu preparado haciendo reaccionar Boc-D-2Nal-OH con HONSu para formar Boc-D-2Nal-D-4ClPhe-D-3Pal-OH (IX).

2. Un procedimiento para preparar un antagonista de LHRH o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo, en el que

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se acopla con un heptapéptido (IV) de la fórmula general

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en la que P^{1} se selecciona de H o un grupo protector de amino, P^{2} es H o un grupo protector de OH, P^{4} es H o un grupo protector de amino tal como Boc, AA1 es un aminoácido natural o sintético y AA2 es un aminoácido natural o sintético o cero.

3. El procedimiento de acuerdo con la reivindicación 2, en el que el heptapéptido de la fórmula general (IV) es

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en la que P^{3} es H o un grupo protector de -OH.

4. El procedimiento de acuerdo con la reivindicación 3, en el que el heptapéptido de la fórmula general (V) es H-Ser(tBu)-NMeTyr-D-Lys(Nic)-Leu-Lys(iPr,Boc)-Pro-D-AlaNH_{2} (VI).

5. El procedimiento de acuerdo con la reivindicación 2, en el que el heptapéptido de la fórmula general (IV) es

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seguido por substituir el grupo Boc por un grupo acilo, en particular un grupo acetilo.

6. El procedimiento de acuerdo con la reivindicación 5, en el que el heptapéptido de la fórmula general (IV) es

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seguido por substituir el grupo Boc N-terminal por un grupo acilo, en particular un grupo acetilo.

7. El tripéptido Boc-D-2Nal-D-4ClPhe-D-3Pal-OH (IX) o una sal del mismo.

8. Uso del tripéptido Boc-D-2Nal-D-4ClPhe-D-3Pal-OH (IX) para preparar un antagonista de LHRH o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo en un procedimiento que comprende el acoplamiento del tripéptido (IX) con un heptapéptido P^{1}-Ser(P^{2})-AA1-AA2-Leu-Lys(iPr,P^{4})-Pro-D-AlaNH_{2} (IV).

9. Uso del tripéptido Boc-D-2Nal-D-4ClPhe-D-3Pal-OH (IX) para preparar un tripéptido de la fórmula (I)

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en un procedimiento que comprende las etapas de:

a): desprotección añadiendo agua, ácido acético y MSA, seguido por neutralización con TEA y concentración a vacío para dar un aceite y

b): acetilación disolviendo el aceite en tolueno y acetilimidazol.