ES2296064T3

ES2296064T3 - Lineas celulares transfectadas de manera estable que expresan receptores gaba-a humanos con una combinacion de subunidades alfa-2, beta-3 y gamma-2.

Info

Publication number: ES2296064T3
Application number: ES05076864T
Authority: ES
Inventors: Karen L. Neuroscience Res. Center Hadingham; Paul J. Neuroscience Res. Center Whiting
Original assignee: Merck Sharp and Dohme Ltd
Current assignee: Organon Pharma UK Ltd
Priority date: 1992-12-10
Filing date: 1993-12-07
Publication date: 2008-04-16
Anticipated expiration: 2013-12-07
Also published as: DE69333923T2; WO1994013799A1; JP3464672B2; EP0673419B1; EP1605046B1; DE69334187T2; DE69333923D1; DK0856581T3; EP0856581A2; US5652100A; ATE170921T1; EP0856581B1; ATE311449T1; DE69320985D1; AU680852B2; DE69334187D1; JPH08504330A; DE69320985T2; ES2251011T3; AU5655494A

Abstract

1. Una secuencia de ADN aislada y/o recombinante que tiene actividad anti-represora, seleccionada dicha secuencia del grupo que consiste en: (a) el SEQ ID: 7 de la Figura 20; (b) un fragmento del SEQ ID: 7 de la Figura 20; (c) un homólogo o derivado funcional del SEQ ID: 7 de la Figura 20; donde la actividad anti-represora de dicha secuencia confiere a una célula de osteosarcoma U-2 OS humana la capacidad para crecer después de 4-5 semanas de cultivo en presencia de 250 mig/ml de Zeocina y 0,1 ng/ml de doxiciclina, cuando dicha célula comprende una proteína de fusión represora de LexA que contiene el dominio de unión a ADN de LexA y una región codificadora de HP1 o HPC2 bajo el control del sistema regulador de la transcripción Tet-Off, cuando dicha secuencia de ADN aislada y/o recombinante es clonada en una secuencia poliligadora en un plásmido, estando situado dicho poliligador entre cuatro sitios operadores de LexA y el promotor de SV40 que controla el gen de resistencia a zeocina, cuando el plásmido está presente en dicha célula.

Description

Lineas celulares trasfectadas de manera estable que expresan receptores GABA_{A}A humanos con una combinación de subunidades \alpha_{2}, \beta_{3} y \gamma_{2}.

Esta invención se refiere a una línea celular, y en concreto se refiere a una línea celular estable capaz de expresar los receptores GABA_{A} humanos que comprenden la combinación de la subunidad \alpha_{2}\beta_{3}\gamma_{2}. La invención se refiere de manera adicional a la clonación de nuevas secuencias de ADN_{c} que codifican esta subunidad concreta del receptor GABA_{A} humano. De manera adicional, la invención se refiere al uso de la línea celular en una técnica de selección para el diseño y desarrollo de medicamentos específicos del subtipo.

El ácido gamma-amino butírico (GABA) es un neurotransmisor inhibidor principal en el sistema nervioso central. Media la inhibición sináptica rápida operando el canal de cloruro, intrínseco al receptor GABA_{A}. Este receptor comprende una proteína multimérica de un tamaño molecular de 230-270 kDa con emplazamientos de enlace específicos para una variedad de fármacos que incluyen benzodiazepinas, barbituratos y \beta-carbolinas, de manera adicional a los emplazamientos del ligando agonista de GABA (para revisiones véanse Stephenson, Biochem. J., 1988, 249, 21; Olsen y Tobin, Faseb J., 1990, 4, 1469; y Sieghart, Trends in Pharmacol, Sci., 1989, 10, 407).

Los estudios biológicos moleculares demuestran que el receptor se compone de varios tipos distintos de subunidades, que se dividen en cuatro clases (\alpha, \beta, \gamma, y \delta) basadas en sus similaridades en la secuencia. Hasta la fecha, se han identificado seis tipos de \alpha (Schofield y col., Nature (Londres), 1987, 328, 221; Levitan y col., Nature (Londres), 1988, 335, 76; Ymer y col., EMBO J., 1989, 8, 1665; Pritchett & Seeberg, J. Neurochem., 1990, 54, 802; Luddens y col., Nature (Londres), 1990, 346, 648; y khrestchatisky y col., Neuron, 1989, 3, 745), tres tipos de \beta (Ymer y col., EMBO J., 1989, 8, 1665), dos tipos de \gamma (Ymer y col., EMBO J., 1990, 9, 3261; y Shivers y col., Neuron, 1989, 3, 327) y una subunidad \delta (Shivers y col., Neuron, 1989, 3, 327).

Se ha caracterizado mediante hibridación in situ la distribución diferencial de muchas de las subunidades (Sequier y col., Proc. Natl. Acad. Sci. Estados Unidos de América, 1988, 85, 7815; Malherbe y col., J. Neurosci., 1990, 10, 2330; y Shivers y col., Neuron, 1989, 3, 327) y esto ha permitido especular acerca de qué subunidades, a través de su colocalización, podrían existir teóricamente en el mismo complejo receptor.

Se han cotransfectado en células diversas combinaciones de subunidades para identificar las combinaciones sintéticas de las subunidades que tienen paralelos farmacológicos que de buena tinta son receptores GABA_{A} in vivo (Pritchett y col., Science, 1989, 245, 1389; Malherbe y col., J. Neurosci., 1990, 10, 2330; Pritchett y Seeberg, J. Neurochem., 1990, 54, 1802; y Luddens y col., nature (Londres), 1990, 346, 648). Esta hipótesis ha revelado que, de manera adicional a una subunidad \alpha y \beta, se requiere generalmente también cualquiera de las \gamma_{1} o \gamma_{2} (Pritchett y col., Nature (Londres), 1989, 338, 582; Ymer y col., EMBO J., 1990, 9, 3261; y Malherbe y col., J. Neurosci., 1990, 10, 2330) o \gamma_{3} (Herb y col., Proc. Natl. Acad. Sci. Estados Unidos de América, 1992, 89, 1433; Knoflach y col., FEBS Lett., 1991, 293, 191; y Wilson-Shaw y col., FEBS Lett., 1991, 284, 211) para conferir sensibilidad a la benzodiazepina, y que la farmacología de la benzodiazepina del receptor expresado es dependiente en gran medida de la identidad de las subunidades \alpha y \gamma presentes. No parece que los receptores que contienen una subunidad \delta (es decir, \alpha\beta\delta) enlacen con las benzodiazepinas (Shivers y col., Neuron, 1989, 3, 327). Se han identificado combinaciones de subunidades que presentan el perfil farmacológico de un receptor de tipo BZ_{1} (\alpha_{1}\beta_{1}\gamma_{2}) y un receptor de tipo BZ_{2} (\alpha_{2}\beta_{1}\gamma_{2} o \beta_{1}\gamma_{2}, Pritchett y col., Nature (Londres), 1989, 338, 582), así como los dos receptores GABA_{A} con una nueva farmacología, \alpha_{5}\beta_{2}\gamma_{2} (Pritchett y Seeberg, J. Neurochem., 1990, 54, 1802) y \alpha_{6}\beta_{2}\gamma_{2} (Luddens y col., Nature (Londres), 1990, 346, 648). Aunque la farmacología de estos receptores expresados parece similar a la de aquellos identificados en el tejido cerebral mediante enlace de un radioligando, no se ha demostrado, sin embargo, que existan in vivo estas combinaciones de subunidades en el receptor.

El Documento US 5.166.066 describe una célula HEK 293 transformada estable que comprende un receptor GABA_{A} funcional que comprende una subunidad \alpha\beta\gamma.

La presente invención se refiere a la producción de células permanentemente transfectadas que contienen el receptor GABA_{A} que comprende la combinación de la subunidad \alpha_{2}\beta_{3}\gamma_{2} que podría ser útil para seleccionar fármacos que actúen sobre este receptor. Se ha expresado anteriormente el receptor GABA_{A} en oocitos de Xenopus (Sigel y col., Neuron, 1990, 5, 703-711) y en células de mamífero transfectadas transitoriamente (Pritchett y col., Science, 1989, 245, 1389-1392). Sin embargo, ambos sistemas implican la expresión transitoria y son inadecuados para los objetivos de selección.

Hemos conseguido ahora la expresión estable del receptor.

De acuerdo con esto, la presente invención proporciona una célula eucariota cotransfectada estable capaz de expresar un receptor GABA_{A} humano que comprende la combinación de la subunidad \alpha_{2}\beta_{3}\gamma_{2}.

Se ha conseguido esto cotransfectado células con tres vectores de expresión, cada uno de ellos alberga un ADNc que codifica una subunidad del receptor \alpha, \beta o \gammaGABA_{A}. En un aspecto adicional, por tanto, la presente invención proporciona un procedimiento para la preparación de una línea celular eucariota capaz de expresar dicho receptor GABA_{A}, que comprende cotransfectar de manera estable una célula huésped eucariota con al menos tres vectores de expresión, uno de dichos vectores alberga la secuencia de ADNc que codifica un alfa_{2}, albergando otro de dichos vectores la secuencia de ADNc que codifica beta_{3}, y albergando un tercero de dichos vectores la secuencia de ADNc que codifica la subunidad del receptor gamma_{2} de GABA_{A}. La línea celular estable que se establece expresa el receptor \alpha_{2}\beta_{3}\gamma_{2} GABA_{A}. Cada receptor expresado de esta manera, que comprende dicha combinación de subunidades \alpha, \beta y \gamma, se denominará a partir de ahora en el presente documento como "combinación de la subunidad" del receptor GABA_{A}. Los datos farmacológicos y electrofisiológicos confirman que el receptor \alpha_{2}\beta_{3}\gamma_{2} recombinante expresado por las células de la presente invención tiene las propiedades esperadas de un receptor GABA_{A} nativo.

Se puede llevar a cabo la expresión del receptor GABA_{A} mediante una variedad de sistemas de expresión del promotor en una variedad de células huésped diferentes. Las células huésped eucariotas adecuadas incluyen células de levaduras, insectos y mamíferos. De manera preferible, las células eucariotas que pueden proporcionar el huésped para la expresión del receptor son las células de mamíferos. Las células huésped adecuadas incluyen líneas de fibroblastos de roedor, por ejemplo Ltk^{-} de ratón, ovario de hámster chino (CHO) y riñón de cría de hámster (BHK); HeLa; y células HEK293. Es necesario incorporar al menos una subunidad \alpha, una \beta y una \gamma en la línea celular con el fin de producir el receptor requerido. Dentro de esta limitación, la elección de la combinación de la subunidad del receptor se hace de acuerdo con el tipo de actividad o selectividad que se este seleccionando. Por ejemplo, las benzodiazepinas (designadas como BZ) representan una clase de fármacos que actúan sobre el receptor GABA_{A} La presencia de una subunidad \alpha_{1} es específica de una clase de benzodiazepinas que tienen la designación farmacológica de BZ_{1}; mientras que de \alpha_{2} a \alpha_{5} definen diferentes perfiles farmacológicos, designados de manera amplia como BZ_{2}. No es crítico el tipo de subunidad \beta en la definición de la clase de benzodiazepina, aunque se necesita una subunidad \beta. La subunidad \gamma es también importante en la definición de la selectividad de BZ. Es posible que se confiera la diferenciación entre la selectividad de la subunidad \alpha mediante la identidad de la subunidad \gamma presente.

Con el fin de emplear la invención de manera más efectiva para los objetivos de selección, es preferible crear una biblioteca de líneas celulares, cada una con diferentes combinaciones de subunidades. Normalmente, es conveniente para este objetivo una biblioteca de 5 ó 6 tipos de líneas celulares.

La presente invención proporciona una línea celular eucariota cotransfectada de manera estable capaz de expresar un receptor GABA_{A} humano que comprende la combinación de la subunidad \alpha_{2}\beta_{3}\gamma_{2}.

Se pueden obtener los ADN para las subunidades del receptor a partir de fuentes conocidas, y se obtienen generalmente en forma de secuencias específicas de nucleótidos contenidas en un vector de clonación estándar tal como los que se describen en, por ejemplo, Maniatis y col. en Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Press, Nueva York, 2ª edición, 1989: De manera preferible, las secuencias del ADNc se derivan del gen humano. Sin embargo, para objetivos de selección, son también adecuados los ADNc procedentes de otras especies, tales como ADN bovino o de rata. Las fuentes conocidas de los ADNc de la subunidad del receptor GABA_{A} son las siguientes:

\alpha_{1} bovino) \beta_{1} bovino): {}\hskip0.15cm Schofield y col., Nature, 1987, 328, 221-227.

\alpha_{1} humano) \beta_{1} humano): Schofield y col., FEBS Lett., 1989, 244, 361-364.

\alpha_{2} de rata: Khrestchatisky y col., J. Neurochem., 1991, 56, 1717.

\alpha_{2} bovino) \alpha_{3} bovino): {}\hskip0.15cm Levitan y col., Nature, 1988, 335, 76-79.

\alpha_{4} de rata: Wisden y col., FEBS Lett., 1991, 289, 227.

\alpha_{4} bovino: Ymer y col., FEBS Lett., 1989, 258, 119-122.

\alpha_{5} de rata: Pritchett y Seeburg, J. Neurochem., 1990, 54, 1802-1804.

\alpha_{6} de rata) \alpha_{6} bovino): {}\hskip0.15cm Luddens y col., Nature, 1990, 346, 648-651.

\beta_{2} bovino) \beta_{2} de rata) \beta_{3} bovino) \beta_{3} de rata): {}\hskip0.15cmYmer y col., EMBO J., 1989, 8, 1665-1670.

\beta_{3} humano: Wagstaff y col., Am. J. Hum. Genet., 1991, 49, 330.

\gamma_{1} humano) \gamma_{1} de rata) \gamma_{1} bovino): Ymer y col., EMBO J., 1990, 9, 3261-3267.

\gamma_{2} humano: Pritchett y col., Nature, 1989, 338, 582-585.

\gamma_{2} bovino: Whiting y col., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1990, 57, 9966-9970.

\gamma_{3} de rata: Herb y col., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1992, 89, 1433; y Knoflach y col., FEBS Lett., 1991, 293, 191.

\gamma_{3} de ratón: Wilson-Shaw y col., FEBS Lett., 1991, 264, 211.

\delta de rata: Shivers y col., Neuron., 1989, 3, 327.

Algunas secuencias de ADNc que codifican diversas subunidades del receptor GABA_{A} humano no han estado hasta ahora disponibles. Estas incluyen en concreto las secuencias que codifican las subunidades \alpha_{2}, \alpha_{3}, \alpha_{5}, \alpha_{6} y \beta_{2}, cuyas secuencias de nucleótidos son, de acuerdo con esto, nuevas. Hemos esclarecido ahora la secuencia de ADNc de la subunidad \alpha_{2} del receptor GABA_{A} humano. Esta secuencia de nucleótidos, junto con las secuencias de aminoácidos deducidas correspondientes del anterior, se representan gráficamente en la Figura 2 de los dibujos acompañantes. La presente invención, de acuerdo con esto, proporciona en diversos aspectos adicionales moléculas de ADN que codifican la subunidad \alpha_{2} del receptor GABA_{A} humano que comprende toda o una parte de la secuencia representada gráficamente en las Figuras 2 o en secuencias sustancialmente similares.

Puede llevarse a cabo de manera conveniente el secuenciamiento de las nuevas moléculas de ADNc de acuerdo con la invención mediante el procedimiento estándar descrito en el Ejemplo 3 acompañante; o se puede llevar a cabo mediante técnicas de clonación moleculares alternativas que se conocen bien en la técnica, tales como las descritas por
Maniatis y col. en Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Press, Nueva York, 2ª edición, 1989.

En otro aspecto, la invención proporciona un vector de expresión recombinante que comprende la secuencia de nucleótidos de una subunidad del receptor GABA_{A} junto con secuencias adicionales capaces de dirigir la síntesis de dicha subunidad del receptor GABA_{A} en cultivos de células eucariotas cotransfectadas de manera estable.

El término "vectores de expresión" tal como se usa en el presente documento se refiere a las secuencias de ADN que se necesitan para la transcripción de las copias clonadas de las secuencias o los genes de ADN recombinante y la traducción de sus ARNm en un huésped adecuado. Se pueden usar dichos vectores para expresar genes eucarióticos en una variedad de huéspedes tales como bacterias, algas verde azuladas, células de levaduras, células de insectos, células de plantas y células de animales. Los vectores diseñados de manera específica permiten el transporte del ADN entre las células de bacterias-algas, bacterias-plantas o bacterias-animales. Un vector de expresión apropiadamente construido debería contener: un origen de replicación para la replicación autónoma en las células huésped, marcadores selectivos, un número limitado de emplazamientos de enzimas de restricción útiles, un número elevado de copias, y promotores fuertes. Un promotor se define como una secuencia de ADN que dirige la ARN polimerasa para enlazar con el ADN e iniciar la síntesis de ARN. Un promotor fuerte es el que produce los ARNm que se van a iniciar con una frecuencia elevada. Los vectores de expresión pueden incluir, pero no se limitan a, vectores de clonación, vectores de clonación modificados, plásmidos específicamente diseñados o virus.

El término "vector de clonación" tal como se usa en el presente documento se refiere a una molécula de ADN, normalmente un plásmido pequeño o ADN de bacteriófago capaz de autorreplicación en un organismo huésped, y se usa para introducir un fragmento de ADN extraño en una célula huésped. El ADN extraño combinado con el ADN del vector constituye una molécula de ADN recombinante que se deriva a partir de tecnología recombinante. Los vectores de clonación pueden incluir plásmidos, bacteriófagos, virus y cósmidos.

Se puede preparar el vector de expresión recombinante de acuerdo con la invención insertando la secuencia de nucleótidos de la subunidad GABA_{A} escogida en un vector de expresión precursor adecuado (denominado a partir de ahora en el presente documento como "vector precursor") usando la metodología convencional de ADN recombinante conocida de la técnica. El vector precursor puede obtenerse comercialmente, o construirse mediante técnicas estándar a partir de vectores de expresión conocidos. El vector precursor contiene de manera adecuada un marcador de selección, normalmente un gen con resistencia a un antibiótico, tal como un gen con resistencia a la neomicina o la ampicilina. El vector precursor contiene de manera preferible un gen con resistencia a la neomicina, adyacente al ayustamiento temprano del SV40 y a la región de poliadenilación; un gen con resistencia a la ampicilina; y un origen de la replicación, por ejemplo, pBR322 ori. El vector contiene también de manera preferible un promotor inducible, tal como MMTV-LTR (inducible con dexametasona) o metalotionina (inducible con zinc), de tal manera que se puede controlar la transcripción en la línea celular de esta invención. Esto reduce o evita cualquier problema de toxicidad en las células debido al canal de cloruro intrínseco al receptor GABA_{A}.

Un vector precursor adecuado es pMAMneo, disponible de Clontech Laboratories Inc (Lee y col., Nature, 1981, 294, 228; y Sardet y col., Cell, 1989, 56, 271). Se puede construir de manera alternativa el vector precursor pMSGneo a partir de los vectores pMSG y pSV2neo tal como se describe en el Ejemplo 1 en el presente documento.

A continuación, se produce el vector de expresión recombinante de la presente invención mediante clonación del ADNc de la subunidad del receptor GABA_{A} en el vector precursor anterior. El ADNc requerido de la subunidad del receptor se subclona a partir del vector en el que se contiene, y se liga a un emplazamiento del enzima de restricción, por ejemplo, el emplazamiento HindIII, en el poliligante del vector precursor, por ejemplo pMAMneo o pMSGneo, mediante la metodología estándar de clonación conocida en la técnica, y en concreto, mediante técnicas análogas a las descritas en el Ejemplo 1, etapa (b) en el presente documento. Antes de esta subclonación, es a menudo ventajoso, con el fin de mejorar la expresión, modificar el extremo del ADNc de una subunidad con secuencias adicionales 5' sin traducir, modificando por ejemplo el extremo 5' del ADN de la subunidad \gamma_{2L} mediante la adición de secuencias de la región 5' sin traducir procedentes del ADN de la subunidad \alpha_{1}.

Se ilustra en la Fig. 1 de los dibujos acompañantes un vector de expresión adecuado de la presente invención en el que R representa una secuencia de nucleótidos de una subunidad alfa, beta o gamma dada del receptor GABA_{A}, y el resto del vector de expresión representado gráficamente en el anterior se deriva del vector precursor pMSGneo y se construye y describe en las etapas (a) y (b) del Ejemplo 1 acompañante.

Para la línea celular de la presente invención, serán necesarios tres de dichos vectores, conteniendo uno una subunidad \alpha_{2}, uno conteniendo una subunidad \beta_{2}, y conteniendo el tercero una subunidad \gamma_{2}.

A continuación se cotransfectan las células con la combinación deseada de los tres vectores de expresión. Existen diversas técnicas comúnmente usadas para la transfección de células eucariotas in vitro. La precipitación de ADN mediante fosfato de calcio es la más comúnmente usada (Bachetti y col., Proc. Natl. Acad. Sci. Estados Unidos de América, 1977, 74, 1590-1594; Maitland y col., Cell, 1977, 14, 133-141), y representa una técnica favorita en el contexto de la presente invención.

Un pequeño porcentaje de las células huésped captura el ADN recombinante. En un pequeño porcentaje de aquellas, el ADN se integrará en el cromosoma de la célula huésped. Debido a que se habrá incorporado el gen de resistencia a la neomicina en estas células huésped, se pueden seleccionar aislando los clones individuales que crecerán en presencia de la neomicina. A continuación se ensaya cada uno de dichos clones para identificar aquellos que producirán el receptor. Esto se consigue induciendo la producción, por ejemplo con dexametasona, y detectando a continuación la presencia del receptor por medio del enlace del radioligando.

En un aspecto adicional, la presente invención proporciona preparaciones de proteína de combinaciones de la subunidad del receptor GABA_{A} humano que comprenden la combinación de la subunidad \alpha_{2}\beta_{3}\gamma_{2} derivada de cultivos de células eucarióticas transfectadas de manera estable. La invención proporciona también preparaciones de membranas que contienen la combinación de la subunidad \alpha_{2}\beta_{3}\gamma_{2} del receptor GABA_{A} humano derivada de cultivos de células eucarióticas transfectadas de manera estable. En concreto, las preparaciones de proteína y preparaciones de membrana de acuerdo con la invención contendrán de manera adecuada la combinación de la subunidad \alpha_{2}\beta_{3}\gamma_{2} del receptor GABA_{A} humano, y contendrán de manera preferible un receptor GABA_{A} humano constituido por las combinaciones de la subunidad \alpha_{2}\beta_{3}\gamma_{2S}. En una forma de realización especialmente preferida, la invención proporciona membranas celulares que contienen un receptor GABA_{A} humano constituido por la combinación de la subunidad \alpha_{2}\beta_{3}\gamma_{2S} aislada a partir de células de fibroblastos Ltk^{-} de ratón, transfectadas de manera estable.

La línea celular, y las preparaciones de membrana procedentes de la anterior de acuerdo con la presente invención, tienen utilidad en la selección y diseño de los fármacos que actúan sobre el receptor GABA_{A}, por ejemplo benzodiazepinas, barbituratos, \beta-carbolinas y neuroesteroides. De acuerdo con esto, la presente invención proporciona el uso de la línea celular descrita anteriormente, y las preparaciones de membrana derivadas de la misma, en la selección de y para el diseño de medicamentos que actúan sobre el receptor GABA_{A}. De particular interés en este contexto son las moléculas capaces de interactuar selectivamente con los receptores GABA_{A} fabricados mediante diferentes combinaciones de subunidades. Como será fácilmente aparente, la línea celular de acuerdo con la presente invención, y las preparaciones de membrana derivadas de la misma, proporcionan sistemas ideales para el estudio de la estructura, farmacología y función de los diversos subtipos del receptor GABA_{A}.

Los siguientes Ejemplos no limitantes ilustran la presente invención.

Ejemplo 1 Preparación de células transfectadas \alpha_{1}\beta_{1}\gamma_{2}L a) Construcción del vector de expresión eucariota pMSGneo

Se sustituyeron los aproximadamente 2.500 pares de bases del fragmento HindIII-EcoRI del vector pMSG (comercializado por Pharmacia Biosystems Limited, Milton Keynes, Reino Unido), que contienen el gen estructural gpt y las señales de poliadenilación SV40 por los aproximadamente 2.800 pares de bases del fragmento HindIII-EcoRI de pSV2neo (Southern, P. J y Berg, P. J., Molecular and Applied Genetics, 1, 327-341, 1982) que contienen el gen con resistencia a la neomicina Neo^{r} y las señales de poliadenilación del SV40. A continuación se eliminaron los emplazamientos EcoRI y HindIII mediante digestión con restricción, enromado del extremo con polimerasa klenow, y reenlazado. A continuación se insertaron los emplazamientos de clonación EcoRI y HindIII en los emplazamientos Xhoi y SmaI del poliligante mediante técnicas convencionales usando los ligantes EcoRI y HindIII.

b) Clonación de los ADNc de la subunidad en pMSGneo

Se obtuvieron los ADNc del receptor \alpha_{1} bovino y \beta_{1} GABA_{A} de la Unidad de Neurobiología Molecular, Centro MRC, Hills Road, Cambridge (Scholfield, P. y col. nature, 328, 221-227, 1987) Se clonó el ADNc de \gamma_{2} bovino mediante el procedimiento de Witting, P. y col. (Proc. Natl. Acad. Sci. Estados Unidos de América, 87, 9966-9970). Se subclonó el \alpha_{1} bovino procedente de pbGR\alpha de sentido directo mediante digestión con EcoRI, enromado del extremo del ADN con polimerasa klenow, adición de ligantes HindIII mediante ligadura, digestión con HindIII y ligadura en el emplazamiento HindIII de pMSGneo. Se subclonó el \beta_{1} bovino procedente de pbGR\beta de sentido directo mediante digestión con restricción con EcoRI (digestión parcial), enromado con polimerasa klenow, ligadura de los ligantes HindIII, digestión con restricción con HindIII y ligadura en el emplazamiento HindIII de pMSGneo. Antes de subclonar en pMSGneo, se modificó el ADNc de \gamma_{2} bovino a partir de la secuencia publicada como sigue. Se añadió la región 5' sin traducir del ADNc de \alpha_{1} bovino (bases 60-200 de la secuencia publicada) al extremo 5' de la secuencia de \gamma_{2} publicada amplificando la región \alpha_{1} sin traducir usando la reacción en cadena de la polimerasa, y a continuación se subclonó el producto en los emplazamientos 5' BamHI (emplazamiento en el poliligante del vector de clonación Bluescript Sk^{-}; vector Bluescript comercializado por Stratagene, San Diego, Estados Unidos de América) y HindIII del ADNc de \gamma_{2}. A continuación se subclonó el ADNc del \gamma_{2} modificado en pMSGneo mediante digestión con XbaI (emplazamiento en el poliligante del vector de clonación), enromado con polimerasa klenow, ligadura de ligantes XhoI, digestión con XhoI (emplazamiento en el poliligante del vector de clonación), y ligadura en el emplazamiento XhoI de pMSGneo.

c) Cotransfección de células Ltk^{-} de ratón

Se obtuvieron células Ltk^{-} del Salk Institute for Biological Studies, San Diego, California. Se hicieron crecer las células a 37ºC, 5-8% de CO_{2} en medio Eagles modificado que contenía penicilina, estreptomicina y suero fetal de ternero al 10%. Se preparó el vector de expresión que albergaba los ADN de la subunidad del receptor GABA_{A} para cotransfección mediante un protocolo estándar (Chen, C y Okayama, H., BioTechniques, 6, 632-638, 1988). Para la cotransfección, se plaquearon las células Ltk^{-} en placas de petri (aproximadamente, 2 x 10^{5} células/placa) y se hicieron crecer durante la noche. Se llevó a cabo la transfección mediante precipitación con fosfato de calcio usando un kit (comercializado por 5 Prime \rightarrow 3 Prime Products, Westchester, Pensilvania). Se llevó a cabo la cotransfección de acuerdo a las instrucciones del fabricante, usando 5 \mug de cada constructo de ADN de la subunidad por placa de células de 10 cm. Tras 2 días de cultivo, se dividieron las células 1:8 en medio de cultivo que contenía 1 mg/ml de neomicina [Geneticin (obtenible de Gibco BRL, Paisley, Escocia, Reino Unido)]. Tras una semana más se aumentó la concentración a 1,5 mg/ml, y a continuación 2 mg/ml 1 semana después de esto. Se aislaron los clones de células resistentes y se subclonaron usando cilindros de clonación. Se analizaron los subclones usando el enlace del radioligando; se hicieron crecer los subclones en placas de cultivo de 10 cm y cuando fueron confluentes se cambiaron a medio de cultivo que contenía 1 \muM de dexametasona (obtenible de Sigma Chemical Company, Poole, Dorset, Reino Unido). 3-5 días más tarde se cosecharon las células, se prepararon las membranas y se usaron para el enlace del radioligando (véase el Ejemplo 2, etapa (a) a continuación) usando el antagonista de la benzodiazepina ^{3}H Ro15-1788 (obtenido de New England Nuclear, Du Pont (Reino Unido) Ltd, Stevenage, Reino Unido). Se subclonó el clon que expresaba la cantidad más elevada del enlace de ^{3}H Ro15-1788 a partir de una célula única mediante dilución limitante. La población clonal resultante de células descrita a continuación se denomina como población A.

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Ejemplo 3 Aislamiento y secuenciamiento de los ADN que codifican la subunidad \alpha_{2} del receptor GABA_{A} humano a) Bibliotecas de ADNc

Se clonaron los ADNc que codificaban la subunidad \alpha_{2} del receptor GABA_{A} humano a partir de librerías de ADNc del bacteriófago lambda de cerebro fetal humano. Se construyeron todas las librerías de ADNc en el vector lambda ZAP, adquiriéndose de Stratagene (San Diego, California). Para la selección, se plaquearon las librerías de acuerdo con las instrucciones del fabricante, a 40.000 ufc por placa de 137 mm. Se tomaron filtros de anillos usando filtros Hybond N (Amersham) de acuerdo con las instrucciones del fabricante.

b) Aislamiento del ADNc que codifica la subunidad \alpha_{2}

Se marcó un ADNc de \alpha_{2} bovino (obtenido de E. Barnard, Molecular Neurobiology, University of Cambridge, Hills Road, Cambridge; Levitan y col., Nature, 1988, 335, 76) con elevada actividad específica (> 1,10^{9} cpm/\mug) con ^{32}P mediante cebado aleatorio y se usó como sonda. Se prehibidizaron filtros de la biblioteca (8 réplicas por filtro) durante 3-6 horas a 42ºC en 5x SSPE (1x SSPE es NaCl 0,18 M, Na_{3}PO_{4} 0,01 M (pH 7,4), EDTA 1 mM), 5x solución de Denhardt, 100 \mug/ml de ADN de esperma de salmón, dodecil sulfato de sodio al 0,1% (SDS), formamida al 30%. Se llevó a cabo la hibridación en el mismo tampón durante 18 horas a 42ºC, incluyendo 0,5-1,10^{6} cpm de sonda marcada con ^{32}P por ml de tampón de hibridación. Se lavaron los filtros a 55ºC en 5x SSPE (2x 15 minutos) y 1x SSPE (2 x 15 minutos) y se expusieron a película Kodak XAR durante 1-3 días. Los clones positivos se purificaron en placa usando las técnicas estándar, y el plásmido Bluescript (Stratagene) fue "rescatado" de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Se secuenciaron clones de ADNc en ambas cadenas mediante técnicas estándar usando el enzima Sequenase II (United States Biochemicals). Se muestra en la Fig. 2 de los dibujos acompañantes, la secuencia de nucleótidos del ADNc que codifica la subunidad \alpha_{2} del receptor GABA_{A} humano, junto con la secuencia deducida de aminoácidos que se corresponde con la anterior.

Ejemplo 4 Preparación de las combinaciones de la subunidad \alpha_{2}\beta_{3}\gamma_{2s} que expresan células transfectadas de manera estable del receptor GABA_{A} humano

Se ha descrito en el Ejemplo 3 el aislamiento y la secuencia de los ADNc de \alpha_{2} humano. Se había publicado anteriormente la secuencia de \gamma_{2} humano por Pritchett y col., Nature, 1989, 338, 582. Se aisló un ADNc de \gamma_{2} humano mediante PCR usando las condiciones descritas en otra parte (Witting y col., Proc. Natl. Acad. Sci. Estados Unidos de América, 1990, 87, 9966-9970) usando una biblioteca de ADNc hipocámpica humana como plantilla y cebadores de oligonucleótidos derivados de las regiones 5' y 3' sin traducir de la secuencia publicada de \gamma_{2}, que incorpora un emplazamiento de restricción Hind III: 5'GGGAGGGAAGCTTCTGCAACCAAGAGGC3', 5'ACCACATAGAAGCTTATTTAAGTGGAC3'. El secuenciamiento indicó que la forma de \gamma_{2} usado es la forma corta \gamma_{2S}, que carece de 24 pb insertas en la región supuesta del bucle citoplásmico (Witting y col., Proc. Natl. Acad. Sci. Estados Unidos de América, 1990, 87, 9966-9970). Se ha publicado por Wagstaff y col., Am. J. Hum. Genet., 1991, 41, 330-337 la secuencia de \beta_{3} humano. Se aisló el ADNc de \beta_{3} humano seleccionando una biblioteca de ADNc de cerebro fetal humano (véase el Ejemplo 3) con una sonda pequeña de ADNc de \beta_{3} humano que codifica la región supuesta del bucle citoplásmico que se había obtenido usando la PCR.

Se subclonaron los ADNc de \alpha_{1,} \beta_{3} y \gamma_{2S} humano en el vector de expresión eucariota pMSGneo (véase el Ejemplo 1) usando las técnicas estándar (cf. Maniatis y col. en Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Press, Nueva York, 2ª Edición, 1989) y se establecieron líneas celulares estables que expresaban los receptores \alpha_{2}\beta_{3}\gamma_{2S} humanos tal como se ha descrito en el Ejemplo 1.

(1) INFORMACIÓN GENERAL

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(i): SOLICITANTE

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(A): NOMBRE: Merck Sharp & Dohme Limited

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(B): CALLE: Hertford Road

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(C): Hoddesdon

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(D): ESTADO: Hertfordshire

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(E): PAÍS: Inglaterra

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(F): CÓDIGO POSTAL (ZIP): EN11 9BU

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(ii): TITULO DE LA INVENCIÓN: líneas celulares transfectadas de forma estable que expresan receptores GABA-A

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(iii): NÚMERO DE SECUENCIAS: 10

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(iv): FORMULARIO LEGIBLE POR ORDENADOR:

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(A): TIPO DE MEDIO: disco flexible

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(B): ORDENADOR: PC IBM compatible

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(C): SISTEMA OPERATIVO: PC-DOS/MS-DOS

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(D): SOFTWARE: PatentIn #1.0 Versión #1.25 (EPO)

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(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC. DE ID Nº 1

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(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA

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(A): LONGITUD: 2310 pares de bases

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(B): TIPO: ácido nucleico

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(C): TIPO DE CADENA: simple

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(D): TOPOLOGÍA: lineal

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(ii): TIPO DE MOLÉCULA: ADNc

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(ix): PRESENTACIÓN

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(A): NOMBRE/CLAVE: CDS

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(B): LOCALIZACIÓN: 298..1683

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(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC. DE ID Nº 1

1

2

3

4

5

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(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC. DE ID Nº 2

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(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA

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(A): LONGITUD: 462 aminoácidos

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(B): TIPO: aminoácido

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(D): TOPOLOGÍA: lineal

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(ii): TIPO DE MOLÉCULA: proteína

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(ix): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC. DE ID Nº 2

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6

7

8

9

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(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC. DE ID Nº 3

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(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA

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(A): LONGITUD: 1408 pares de bases

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(B): TIPO: ácido nucleico

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(C): TIPO DE CADENA: simple

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(D): TOPOLOGÍA: lineal

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(ii): TIPO DE MOLÉCULA: ADNc

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(ix): PRESENTACIÓN

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(A): NOMBRE/CLAVE: CDS

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(B): LOCALIZACIÓN: 27..1385

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(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC. DE ID Nº 3

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10

11

12

13

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(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC. DE ID Nº 4

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(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA

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(A): LONGITUD: 453 aminoácidos

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(B): TIPO: aminoácido

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(D): TOPOLOGÍA: lineal

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(ii): TIPO DE MOLÉCULA: proteína

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(ix): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC. DE ID Nº 4

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14

15

16

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(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC. DE ID Nº 5

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(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 1866 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: ácido nucleico

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(C): TIPO DE CADENA: simple

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

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(ii): TIPO DE MOLÉCULA: ADNc

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(ix): PRESENTACIÓN

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(A): NOMBRE/CLAVE: CDS

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(B): LOCALIZACIÓN: 225..1646

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(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC. DE ID Nº 5

17

18

19

20

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(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC. DE ID Nº 6

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(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 474 aminoácidos

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(B): TIPO: aminoácido

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(D): TOPOLOGÍA: lineal

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(ii): TIPO DE MOLÉCULA: proteína

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(ix): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC. DE ID Nº 6

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21

22

23

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(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC. DE ID Nº 7

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(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA

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(A): LONGITUD: 2189 pares de bases

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(B): TIPO: ácido nucleico

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(C): TIPO DE CADENA: simple

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(D): TOPOLOGÍA: lineal

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(ii): TIPO DE MOLÉCULA: ADNc

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(ix): PRESENTACIÓN

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(A): NOMBRE/CLAVE: CDS

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(B): LOCALIZACIÓN: 214..1566

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(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC. DE ID Nº 7

24

25

26

27

28

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(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC. DE ID Nº 8

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(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 451 aminoácidos

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(B): TIPO: aminoácido

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(D): TOPOLOGÍA: lineal

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(ii): TIPO DE MOLÉCULA: proteína

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(ix): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC. DE ID Nº 8

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29

30

31

32

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(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC. DE ID Nº 9

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(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA

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(A): LONGITUD: 1638 pares de bases

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(B): TIPO: ácido nucleico

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(C): TIPO DE CADENA: simple

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(D): TOPOLOGÍA: lineal

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(ii): TIPO DE MOLÉCULA: ADNc

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(ix): PRESENTACIÓN

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(A): NOMBRE/CLAVE: CDS

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(B): LOCALIZACIÓN: 87..1562

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(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC. DE ID Nº 9

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33

34

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36

37

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(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC. DE ID Nº 10

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(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA

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(A): LONGITUD: 492 aminoácidos

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(B): TIPO: aminoácido

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(D): TOPOLOGÍA: lineal

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(ii): TIPO DE MOLÉCULA: proteína

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(ix): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC. DE ID Nº 10

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38

39

40

41

Claims

1. Una línea celular eucariota cotransfectada de manera estable capaz de expresar un receptor GABA_{A} humano que comprende la combinación de la subunidad \alpha_{2}\beta_{3}\gamma_{2}.

2. Una preparación de membrana que contiene las combinaciones de la subunidad del receptor GABA_{A} humano derivadas de un cultivo de las células eucariotas cotransfectadas de manera estable que se reivindican en la reivindicación 1.

3. Una preparación tal como se reivindica en la reivindicación 2 que contiene un receptor GABA_{A} humano constituido por la combinación de la unidad \alpha_{2}\beta_{3}\gamma_{2S} aislada a partir de células de fibroblastos Ltk^{-} de ratón cotransfectadas de manera estable.

4. El uso de la línea celular que se reivindica en la reivindicación 1, y las preparaciones de membrana derivadas de la anterior, en la selección y diseño de medicamentos que actúan sobre el receptor GABA_{A} humano.