ES2296332T3 - Microparticulas que son utilizadas como agentes de contraste para la liberacion de medicamentos en el flujo sanguineo. - Google Patents
Microparticulas que son utilizadas como agentes de contraste para la liberacion de medicamentos en el flujo sanguineo. Download PDFInfo
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Abstract
Una composición que comprende una pluralidad de micropartículas, una mayoría de las cuales tienen diámetros en el intervalo de 1 a 10 micras, cada una de las cuales comprende una cubierta que engloba un núcleo hueco, donde dicha cubierta comprende una capa externa que comprende un material anfífilo biológicamente compatible entrecruzado y una capa interna que comprende un polímero biodegradable soluble en disolventes orgánicos.
Description
Micropartículas que son utilizadas como agentes
de contraste para la liberación de medicamentos en el flujo
sanguíneo.
Las micropartículas huecas, denominadas a veces
microburbujas o microesferas, son eficaces para la energía
ultrasónica de dispersión retrógrada. Así, pequeñas microburbujas
inyectadas en la corriente sanguínea, pueden potenciar la formación
de imágenes ecográficas ultrasónicas para ayudar a la visualización
de estructuras internas, tales como el corazón y los vasos
sanguíneos. El contraste ultrasónico se logra cuando la diferencia
de impedancia acústica entre dos materiales en una interfase es
diferente. De este modo, a mayor diferencia de impedancia acústica
entre los materiales, mayor intensidad de eco ultrasónico de esta
interfase. Puesto que existe una gran diferencia entre la
impedancia acústica entre el tejido corporal y el gas, las
micropartículas que contienen el gas circulantes en el tejido o la
sangre son fuertes dispersores retrógrados de la energía
ultrasónica. Para su uso en el sistema circulatorio, las
micropartículas deben tener un diámetro de menos de aproximadamente
diez micras con el fin de pasar a través de los capilares del
sistema circulatorio. El límite inferior para la suficiente
ecogenicidad de una micropartícula es de aproximadamente una a dos
micras.
En cardiología, las micropartículas son útiles
para la inyección intravenosa, proporcionando de ese modo contraste
ultrasónico en las cámaras derechas de corazón, potenciando la
identificación de las estructuras cardíacas, el funcionamiento de
las válvulas y la identificación de derivaciones (shunts)
intracardíacas. No obstante, con el fin de visualizar las cámaras
izquierdas del corazón, las micropartículas deben pasar primero a
través del sistema circulatorio pulmonar. Tales partículas deben
ser suficientemente pequeñas para pasar a través de los capilares
pulmonares. De otro modo son atrapadas en el interior de los
pulmones. Deben tener también suficiente resistencia estructural
para sobrevivir a las presiones dentro de las cámaras izquierdas del
corazón.
Las micropartículas también permiten la
definición de volúmenes, el movimiento de las paredes, y otros
factores que identifican los estados de enfermedad del corazón. El
uso de agentes de contraste también facilita el uso de técnicas
ultrasónicas Doppler puesto que las fuertes fuentes de eco que se
mueven en la corriente sanguínea son mucho más ecogénicas que los
glóbulos rojos, que son las fuentes de eco habituales utilizadas en
las técnicas ultrasónicas Doppler. También se pueden utilizar
agentes de contraste en la sangre para localizar la presencia de
sangre en zonas del cuerpo o identificar la ausencia de sangre por
la carencia de ecogenicidad en zonas que deben ser ecogénicas. Los
ejemplos de tales usos son el uso de micropartículas para la
evaluación de la perfusión del miocardio, y para la evaluación de
defectos en el tabique coronario mediante el flujo de partículas a
través del tabique que separa las cámaras cardíacas. Otro ejemplo es
el uso de micropartículas para identificar embolias vasculares
tales como coágulos sanguíneos, y crecimientos anómalos en las
cámaras vasculares por la ausencia del contraste ultrasónico.
Otros usos de los agentes de contraste son para
examinar la perfusión en órganos, por ejemplo para evaluar el daño
ocasionado por un infarto, para examinar órganos tales como el
hígado, o para diferenciar entre tejidos normales y anormales, tales
como tumores y quistes.
En EP 0458745 se describen microglobos
ecográficos con un diámetro entre 0,5 y 10 \mum que comprenden una
membrana polimérica cargada de aire o gas.
La presente invención proporciona agentes de
contraste de micropartículas que son liberados intravenosamente
pero son capaces de pasar a través del sistema circulatorio pulmonar
para la potenciación del examen y la diagnosis de ambos lados del
corazón así como el examen de otros tejidos y órganos como se ha
descrito antes.
Además de la formación de imágenes para
diagnóstico, las micropartículas según la presente invención también
se utilizan para la liberación de fármacos donde el fármaco se
libera de la partícula mediante difusión desde la micropartícula,
mediante degradación de la micropartícula, o mediante rotura de la
partícula utilizando energía ultrasónica.
La presente invención proporciona composiciones
de micropartículas de las cuales la mayoría de las micropartículas
tienen diámetros en el intervalo de una a diez micras, cada una de
las cuales comprende una cubierta que engloba un núcleo hueco donde
dicha cubierta comprende una capa exterior que comprende un material
anfífilo compatible biológicamente entrecruzado, y una capa interna
que comprende un polímero biodegradable soluble en disolventes
orgánicos. Las micropartículas pueden tener un núcleo hueco, que
contiene un gas o un líquido, o un núcleo sólido.
La capa externa se puede elegir sobre la base de
la biocompatibilidad con la corriente sanguínea y los tejidos,
mientras que la capa interna se puede seleccionar sobre la base de
las propiedades mecánicas y acústicas deseadas. Los materiales de
ambas capas se pueden seleccionar para predeterminar la resistencia
de la micropartícula, por ejemplo para proporcionar una frecuencia
resonante deseada y estabilidad dentro de unos niveles umbrales de
formación de imágenes diagnosticas de la radiación ultrasónica.
También se proporcionan los métodos para formar las micropartículas
multicapa y el uso en la formación de imágenes diagnósticas
ultrasónicas y la liberación de fármacos. Las capas también se
pueden elegir por su capacidad para contener y liberar fármacos.
La Figura 1 es un gráfico del transcurso del
tiempo de la intensidad ultrasónica reflejada en el atrio izquierdo
en una prueba de un agente de contraste según el ejemplo 7.
La Figura 2 es un gráfico del transcurso del
tiempo de la intensidad ultrasónica reflejada en el atrio izquierdo
del agente de contraste probado de acuerdo con el ejemplo 8.
La Figura 3 es un gráfico de la distribución de
tamaño volumétrica de las microcápsulas no filtradas elaboradas en
el ejemplo 13, y de la distribución de tamaño cuando se filtra la
suspensión.
La Figura 4 muestra las frecuencias resonantes
de dos preparaciones de microcápsulas que tienen diferentes
composiciones de la pared que se sometieron a ensayo según el
ejemplo 18.
Según se utiliza en la presente memoria se
pretende que el término micropartículas incluya microcápsulas,
microesferas y microburbujas que son partículas huecas que engloban
un núcleo hueco que puede estar cargado con un gas o un líquido.
También incluye partículas en las que el núcleo puede ser un
material sólido. No es necesario que las micropartículas sean
exactamente esféricas aunque serán generalmente esféricas y se
describirán por tener diámetros medios. Si las micropartículas no
son esféricas, los diámetros son remitidos o vinculados al diámetro
de una micropartícula esférica correspondiente que tiene la misma
masa y que abarca aproximadamente el mismo volumen de espacio
interior que una micropartícula no esférica.
Las micropartículas según la presente invención
tienen una cubierta bicapa. La capa externa de la cubierta será un
material compatible biológicamente o biomaterial puesto que define
la superficie que se expondrá a la sangre y los tejidos en el
organismo. La capa interna de la cubierta será un polímero
biodegradable, que puede ser un polímero sintético, que puede ser
adaptado para proporcionar las propiedades mecánicas y acústicas
deseadas a la cubierta o proporcionar las propiedades de liberación
de fármacos. Para su uso como agentes de contraste ultrasónicos,
los núcleos de las micropartículas contienen gas, típicamente aire o
nitrógeno. No obstante, para los fines de liberación de los
fármacos el núcleo puede ser un líquido o un material sólido
diferente de las capas de la cubierta. Para confeccionar partículas
rompibles mediante energía ultrasónica de baja intensidad, no
obstante, deben contener un gas para permitir el acoplamiento
acústico y la oscilación de la partícula. Las micropartículas se
construyen en la presente memoria de manera que la mayoría de las
preparadas en una composición tendrán diámetros en el intervalo de
aproximadamente uno a diez micras con el fin de pasar a través del
sistema capilar del organismo.
Puesto que las micropartículas tienen una capa
externa e interna, las capas se pueden adaptar para servir a
diferentes funciones. La capa externa que se expone a la sangre y
los tejidos sirve como interfase biológica entre las
micropartículas y el organismo. De este modo se elaborarán de un
material biocompatible que es típicamente anfífilo, esto es, tiene
características tanto hidrófobas como hidrófilas. Los materiales
compatibles con la sangre son particularmente preferidos. Tales
materiales preferidos son materiales biológicos que incluyen
proteínas tales como colágeno, gelatina o seralbúminas o globulinas,
derivadas de seres humanos o que tienen una estructura similar a
las proteínas humanas, glicosaminoglicanos tales como ácido
hialurónico, heparina y sulfato de condroitina y combinaciones o
derivados de los mismos. También se pueden utilizar polímeros
biodegradables sintéticos, tales como el polietilenglicol, el óxido
de polietileno, el polipropilenglicol y combinaciones o derivados.
La capa externa es típicamente anfífila, y tiene una estructura
química que permite la modificación de carga y química. La
versatilidad de la superficie permite modificaciones tales como la
alteración de la carga de la cubierta externa, por ejemplo
seleccionando una gelatina de tipo A que tiene un punto isoeléctrico
por encima del pH fisiológico, o utilizando una gelatina de tipo B
que tiene un punto isoeléctrico por debajo del pH fisiológico. Las
superficies externas también se pueden modificar químicamente para
aumentar la biocompatibilidad, por ejemplo mediante PEGilación,
succinilación o amidación, así como unir químicamente al radical de
búsqueda de superficie para su unión a tejidos seleccionados. Los
radicales de búsqueda pueden ser anticuerpos, receptores celulares,
lectinas, selectinas, integrinas o estructuras o análogos químicos
de las dianas receptoras de tales sustancias. Las propiedades
mecánicas de la capa externa también se pueden modificar, por
ejemplo mediante entrecruzamiento, para volver las micropartículas
adecuadas para el paso al ventrículo izquierdo, para proporcionar
una frecuencia resonante particular para un armónico seleccionado
del sistema de formación de imágenes diagnósticas, o para
proporcionar estabilidad al nivel umbral de formación de imágenes
diagnosticas de la radiación ultrasónica.
La cubierta interna será un polímero
biodegradable, que puede ser un polímero sintético. Una ventaja de
la cubierta interna es que proporciona propiedades mecánicas o de
liberación de fármaco adicionales a la partícula que no son
proporcionadas o son proporcionadas insuficientemente por la capa
externa, o aumenta las propiedades mecánicas no proporcionadas
suficientemente por la capa externa, sin ser constreñidos por los
requerimientos de las propiedades de superficie. Por ejemplo, una
capa externa biocompatible de un hidrogel proteináceo entrecruzado
puede ser soportada físicamente utilizando un polímero sintético de
elevado módulo como capa interna. El polímero se puede seleccionar
por su módulo de elasticidad y elongación, que define las
propiedades mecánicas deseadas. Los polímeros biodegradables
típicos incluyen policaprolactona, poli(ácido láctico), copolímeros
de poli(ácido láctico)-poli(ácido glicólico),
copolímeros de lactidas y lactonas, tales como
épsilon-caprolactona,
delta-valerolactona, polialquilcianoacrilatos,
poliamidas, polihidroxi-butiratos, polidioxanonas,
poli-beta-aminocetonas,
polianhídridos, poli-(orto)ésteres, poliaminoácidos, tales como
poli(ácido glutámico) y poli(ácido aspártico) o ésteres de
poli(ácido glutámico) y poli(ácido aspártico). Las referencias sobre
muchos polímeros biodegradables son citadas por Langer, et.
al. (1983) Macromol. Chem. Phys. C23,
61-125.
La capa interna permite la modificación de las
propiedades mecánicas de la cubierta de la micropartícula que no
son proporcionadas por la capa externa sola. Por otra parte, la capa
interna puede proporcionar un portador de fármacos y/o la capacidad
de liberación de fármacos que no sea proporcionable suficientemente
por la capa externa sola. Para su uso como agente de contraste
ultrasónico, la capa interna tendrá típicamente un grosor que no es
mayor del necesario para cumplir las propiedades mecánicas o de
transporte/liberación de fármacos mínimas, con el fin de maximizar
el volumen de gas interior de las micropartículas. A mayor volumen
de gas en la micropartícula mejores propiedades ecogénicas.
El grosor combinado de las capas externa e
interna de la cubierta de la micropartícula dependerá en parte de
las propiedades mecánicas y de transporte/liberación de fármacos
requeridas de la micropartícula, pero típicamente el grosor total de
la cubierta estará en el intervalo de 25 a 750 nm.
Las micropartículas se pueden preparar mediante
un procedimiento de emulsión para controlar el depósito interfacial
sucesivo de los materiales de la cubierta. Debido al carácter
anfífilo del material que forma la capa externa, se pueden preparar
emulsiones de aceite/agua estables que tienen una proporción de la
fase interna a la fase externa que se aproxima a 3:1 sin inversión
de fases que pueden ser dispersables en agua para formar gotitas
estables de la fase orgánica sin necesidad de tensioactivos,
aumentadores de la viscosidad o altas velocidades de cizalla.
Se preparan dos soluciones, siendo la primera
una solución acuosa del biomaterial externo. La segunda es una
solución del polímero que se utiliza para formar la capa interna, en
un líquido inmiscible con agua relativamente volátil que es un
disolvente para el polímero, y un líquido inmiscible con agua
relativamente no volátil que es un no disolvente para el polímero.
El disolvente inmiscible con agua relativamente volátil es
típicamente un éster C5-C7, tal como acetato de
isopropilo. El no disolvente inmiscible con agua relativamente no
volátil es típicamente un hidrocarburo
C_{6}-C_{20} tal como decano, undecano,
ciclohexano, y ciclooctano. En la segunda solución que contiene el
polímero para la capa interna, el polímero en los disolventes
inmiscibles con agua se combina de manera que el polímero se
disuelve completamente y los dos disolventes son miscibles
agitando. La solución polimérica (fase orgánica) se añade lentamente
a la solución de biomaterial (fase acuosa) para formar una espuma
líquida. Típicamente se añaden aproximadamente tres partes de la
solución polimérica orgánica que tiene una concentración de 0,5 a
10 por ciento en peso del polímero a una parte de la solución
acuosa de biomaterial que tiene una concentración de 1 a 20 por
ciento del biomaterial. Las concentraciones relativas de las
soluciones y la razón de la fase orgánica a la fase acuosa
utilizadas en esta etapa determinan esencialmente el tamaño de la
micropartícula final y el grosor de la pared. Después de la mezcla
completa de la espuma líquida, ésta se dispersa en agua y se templa
típicamente a 30-35ºC con agitación suave. Si bien
no se pretende adherirse a ninguna teoría concreta, se cree que el
biomaterial en la espuma se dispersa en el agua templada para
estabilizar la emulsión del polímero en la fase orgánica encapsulada
en una envuelta de biomaterial. Para volver la envuelta de
biomaterial insoluble en agua, se añade un agente de
entrecruzamiento, tal como glutaraldehído, a la mezcla para que
reaccione con la envuelta de biomaterial y la vuelva insoluble en
agua, estabilizando la cubierta externa. Se pueden utilizar otros
agentes de entrecruzamiento, incluyendo el uso de agentes de
entrecruzamiento de carbodiimida.
Puesto que en este momento el núcleo interno
contiene una solución de un polímero, un disolvente y un no
disolvente con diferentes volatilidades, a medida que se evapora el
disolvente más volátil, o se diluye, el polímero precipita en
presencia del no disolvente menos volátil. Este procedimiento forma
una película de precipitado en la interfase con la superficie
interna de la cubierta del biomaterial, formando de este modo la
cubierta interna de la micropartícula después de que se haya
reducido la concentración del disolvente más volátil mediante
dilución, o evaporación. El núcleo de la micropartícula contiene
entonces predominantemente el no disolvente orgánico. Las
micropartículas se pueden aislar después mediante centrifugación,
lavar, formular en un sistema tampón, si se desea, y secar.
Típicamente, el secado mediante liofilización elimina no sólo el
núcleo líquido no disolvente sino también el agua residual para
producir micropartículas huecas cargadas de gas.
Puede ser deseable modificar adicionalmente la
superficie de la micropartícula, por ejemplo, con el fin de pasivar
las superficies contra los macrófagos o el sistema
reticuloendotelial (RES) en el hígado. Esto se puede lograr, por
ejemplo modificando químicamente la superficie de la micropartícula
para que esté cargada negativamente puesto que parece que las
partículas cargadas negativamente evaden mejor el reconocimiento de
los macrófagos y el RES que las partículas cargadas positivamente.
Asimismo, el carácter hidrófilo de la superficie se puede cambiar
anclando productos conjugados hidrófilos, tales como
polietilenglicol (PEGilación) o ácido succínico (succinilación) a la
superficie, ya sea solo o junto con la modificación de la carga.
La superficie de biomaterial también se puede
modificar para proporcionar características de búsqueda a la
micropartícula. La superficie se puede marcar mediante métodos
conocidos con anticuerpos o receptores biológicos. Por ejemplo, si
las micropartículas fueran tratadas para dirigirse a tumores y
fueran huecas, se podrían utilizar para la detección ultrasónica
para potenciar la diagnosis de tumores. Si las micropartículas
estuvieran cargadas con fármacos se podrían utilizar para la
búsqueda de tumores donde el fármaco se podría liberar
preferentemente en el sitio diana, por ejemplo, incrementando la
energía ultrasónica para romper las partículas en el momento y la
localización apropiados.
Las micropartículas también se pueden clasificar
por tamaño o transformar después de la elaboración. Esta es una
ventaja sobre las micropartículas de tipo lípido que no se pueden
someter a tratamiento mecánico después de ser formadas debido a su
fragilidad.
La formulación final de las micropartículas
después de la preparación, pero antes de su uso, está en forma de
una torta liofilizada. La última reconstitución de las
micropartículas puede ser facilitada mediante liofilización con
agentes de relleno que proporcionan una torta que tiene una alta
porosidad y área de superficie. Los agentes de relleno también
pueden incrementar la velocidad de secado durante la liofilización
proporcionando canales para el agua y el vapor de disolvente que se
van a eliminar. Esto también proporciona un área de superficie
mayor que podría colaborar en la posterior reconstitución. Los
agentes de relleno típicos son azúcares tales como dextrosa,
manitol, sorbitol y sacarosa, y polímeros tales como PEG y PVP.
No es deseable que las partículas se agreguen,
ya sea durante la formulación o durante la posterior reconstitución
del material liofilizado. La agregación se puede minimizar
manteniendo un pH de al menos una o dos unidades de pH por encima o
por debajo del punto isoeléctrico (P_{i}) del biomaterial que
forma la superficie externa. La carga en la superficie se determina
mediante el pH del medio de formulación. Así, por ejemplo, si la
superficie del biomaterial tiene un P_{i} de 7 y el pH del medio
de formulación está por debajo de 7, la micropartícula poseerá una
carga de la superficie positiva neta. Alternativamente, si el pH del
medio de formulación es mayor de 7, la micropartícula poseería una
carga negativa. El potencial máximo para la agregación existe cuando
el pH del medio de formulación se aproxima al P_{i} del
biomaterial utilizado en la cubierta externa. Por lo tanto
manteniendo el pH del medio de formulación al menos una o dos
unidades por encima o por debajo del P_{i} de la superficie, se
puede minimizar la agregación de la micropartícula. Como
alternativa, las micropartículas se pueden formular al o casi al
P_{i} con el uso de tensioactivos para su estabilización contra la
agregación. En cualquier caso, los sistemas tampón de la
formulación final que se va a inyectar al sujeto deben ser
fisiológicamente compatibles.
Los agentes de relleno utilizados durante la
liofilización de las micropartículas también se pueden utilizar
para controlar la osmolalidad de la formulación final para su
inyección. Puede ser deseable una osmolalidad distinta de la
osmolalidad fisiológica durante la liofilización para minimizar la
agregación. No obstante, cuando las micropartículas se formulan
para su uso, se debe tener en cuenta el volumen de líquido utilizado
para reconstituir las micropartículas.
Se pueden incluir otros aditivos con el fin de
evitar la agregación o para facilitar la dispersión de las
micropartículas tras la formulación. En la formulación se pueden
utilizar tensioactivos tales como poloxámeros (copolímeros de
bloques de
polietilenglicol-polipropilenglicol-polietilenglicol).
También pueden colaborar en la dispersión de la micropartícula
polímeros solubles en agua, tales como polietilenglicoles de peso
molecular medio y polivinilpirrolidonas de peso molecular medio.
Si la formulación es para contener un núcleo que
contiene fármaco, las micropartículas se pueden empapar en una
solución del fármaco con lo que la solución se difunde en el
interior. En particular, el uso de las micropartículas bicapa donde
la cubierta interna tiene características porosas permite la
difusión rápida de una solución de fármaco en el núcleo hueco. Las
micropartículas se pueden volver a secar por ejemplo mediante
liofilización para producir una micropartícula que contiene
fármaco, cargada de gas. La combinación del fármaco con las
partículas prefabricadas permite evitar la transformación que puede
conducir a la degradación del fármaco. Para proporcionar
micropartículas que tienen un núcleo sólido que contiene un fármaco,
durante la formulación de las micropartículas, se puede aumentar el
grosor de las capas internas para ocupar más o todo el volumen
interior. Después, mediante el posterior remojo en la solución que
contiene el fármaco, el núcleo sólido interno absorberá el fármaco
y proporcionará un reservorio sólido para el fármaco.
Alternativamente, el fármaco se puede disolver en la fase orgánica
con el biopolímero durante el procedimiento de formación de la
micropartícula. La evaporación de los disolventes orgánicos hace
que el fármaco precipite simultáneamente con el biopolímero en el
interior de la micropartícula.
Por ejemplo, el grosor de la pared de las capas
tanto interna como externa se puede ajustar variando la
concentración de los componentes en las soluciones formadoras de
micropartículas. Las propiedades mecánicas de las micropartículas
se pueden controlar, no sólo mediante el grosor total de la pared y
los grosores de las capas respectivas, sino también mediante la
selección de los materiales utilizados en cada una de las capas por
sus módulos de elasticidad y elongación, y el grado de
entrecruzamiento de las capas. Después de ciertas condiciones que
implican un rápido depósito del polímero interno o un contenido de
polímero interno muy bajo se observa la porosidad de la cubierta
polimérica interna. Los poros oscilan de 0,1 a 2 \mum (micras) de
diámetro según se observa bajo microscopia electrónica. Las
propiedades mecánicas de las capas se pueden modificar también con
plastificadores y otros aditivos. El ajuste de la resistencia de la
cubierta se puede modificar, por ejemplo, mediante la presión
interna en las micropartículas. Las características acústicas
precisas de la micropartícula se pueden lograr controlando las
propiedades mecánicas de la cubierta, el grosor, así como una
distribución de tamaño estrecha. Las micropartículas se pueden
romper mediante energía ultrasónica para liberar los gases
atrapados en el interior de las micropartículas a la corriente
sanguínea. En concreto, ajustando apropiadamente las propiedades
mecánicas, se puede hacer que las partículas permanezcan estables a
la energía umbral de formación de imágenes diagnósticas, mientras
que son rompibles mediante un incremento de la energía y/o
exponiéndolas a su frecuencia resonante. Se puede hacer que la
frecuencia resonante esté dentro del intervalo de frecuencias
transmitidas de los sistemas de formación de imágenes corporales
diagnósticas o puede ser un armónico de tales frecuencias. Durante
el procedimiento de formulación las micropartículas se pueden
preparar para que contengan diferentes gases, incluyendo gases
solubles en la sangre o insolubles en la sangre. Una característica
de la invención es que las composiciones de micropartículas se
puedan elaborar con una frecuencia resonante superior o igual a 2
MHz, y típicamente superior o igual a 5 MHz.
El diagnóstico típico o las dianas terapéuticas
para las micropartículas de la invención son el corazón y los
tumores.
Los siguientes ejemplos se proporcionan a modo
de ilustración pero no se pretende que limiten la invención de
ningún modo.
Se preparó una solución de 1,0 g de gelatina
(275 bl, punto isoeléctrico de 4,89) disueltos en 20 ml de agua
desionizada a aproximadamente 60ºC. El pH natural de la solución fue
de 5,07. Separadamente, se disolvieron 1,0 g de policaprolactona
(P.M. 50.000) y 6,75 ml de ciclooctano en 42 ml de acetato de
isopropilo agitando a aproximadamente 70ºC. Después de enfriar a
37ºC, la mezcla orgánica se incorporó lentamente a la solución de
gelatina mantenida a 30ºC y mezclando a cizalla moderada utilizando
un mezclador giratorio. Una vez que la fase orgánica se incorporó
completamente, la velocidad de mezclado se aumentó a 2.500 rpm
durante 5 minutos y después se agitó a baja cizalla durante 5
minutos adicionales. La emulsión de aceite-agua
resultante se añadió después agitando a 350 ml de agua desionizada
mantenida a 30ºC y que contenía 1,2 ml de glutaraldehído al 25%.
Inmediatamente después de la adición de la emulsión, el pH del baño
se ajustó a 4,7. Al cabo de 30 minutos, el pH se ajustó a 8,3. Se
continuó mezclando a baja cizalla durante aproximadamente 2 horas y
media hasta que se hubo volatilizado completamente el acetato de
isopropilo. Después se disolvió en el baño Poloxámero 188 en una
cantidad de 0,75 g. Las micropartículas resultantes se recobraron
mediante centrifugación y se lavaron dos veces en una solución
acuosa de poloxámero 188 al 25%.
La inspección microscópica de las
micropartículas reveló cápsulas esféricas que tenían una cubierta
polimérica de pared delgada encapsulando un núcleo orgánico líquido.
La tinción de la preparación del porta con azul de Coomassie G
indicó la presencia de una capa de proteína externa que rodeaba
uniformemente la cubierta polimérica.
El espectro del tamaño de partícula se determinó
utilizando Malvern Micro. El diámetro medio fue de 4,78 micras con
una extensión del espectro de 0,94.
Se suspendió una cantidad de micropartículas de
una manera similar a la del ejemplo 1 en una solución acuosa de
glicina 25 mM, Pluronic f-127 al 0,5%, sacarosa al
1,0%, manitol al 3,0%, y PEG-3400 al 5,0%. Después
se liofilizó la suspensión. El polvo seco resultante se
reconstituyó en agua desionizada y se examinó al microscopio
revelando que las micropartículas contenían ahora un núcleo gaseoso.
La coloración de la preparación con azul de Coomassie G confirmó
que la capa proteica externa que rodeaba las cápsulas estaba intacta
y había sobrevivido al proceso de liofilización.
La ecogenicidad se confirmó insonando a 2,5 y 5
MHz una cantidad de micropartículas liofilizadas dispersas en 120
ml de agua desionizada. La medición se tomó al menos 15 minutos
después de la dispersión de las microcápsulas para asegurarse de
que la señal de dispersión retrógrada era debida solamente al gas
contenido en el interior de las micropartículas. La presentación en
modo B mostró un alto contraste indicando que las micropartículas
estaban cargadas de gas.
Se preparó una solución de 1,2 g de gelatina
(225 bloom, punto isoeléctrico de 5,1) disueltos en 20 ml de agua
desionizada a aproximadamente 50ºC. El pH de la solución se ajustó a
6,1 utilizando NaOH 1 M. Separadamente, se disolvieron 0,07 g de
parafina, 4,5 ml de decano, y 0,69 g de
poli-DL-lactida (viscosidad
inherente de 0,69 dL/g en CH_{2}Cl_{2} @ 30ºC) en 37 ml de
acetato de isopropilo. La mezcla orgánica se incorporó lentamente a
la solución de gelatina que se mantuvo a 30ºC bajo mezclado a
cizalla moderada utilizando un mezclador giratorio. Una vez que la
fase orgánica se incorporó completamente, la velocidad de mezclado
se incrementó a 2.000 rpm durante 2 minutos y después se redujo a
aproximadamente 1.000 rpm durante 4 minutos. La espuma líquida
resultante se mezcló en 350 ml de agua desionizada mantenida a 30ºC
y después se añadió gota a gota 1 ml de glutaraldehído al 25%. El
mezclado giratorio continuó durante aproximadamente 3 horas hasta
que se hubo volatilizado el acetato de isopropilo. Las
micropartículas resultantes se recobraron mediante centrifugación y
se lavaron dos veces en una solución acuosa de Pluronic
f-127 al 0,25%.
La inspección microscópica reveló
micropartículas esféricas huecas que tenían una capa proteica
externa y un núcleo líquido orgánico interno.
Las micropartículas se liofilizaron y se
sometieron a ensayo de una manera similar al ejemplo 2. Los
resultados confirmaron que las micropartículas contenían un núcleo
gaseoso y eran fuertemente ecogénicas.
Se preparó una solución de 1,0 g de gelatina
(225 bloom, punto isoeléctrico de 5,1) disueltos en 20 ml de agua
desionizada a aproximadamente 60ºC. El pH de la solución fue de 4,8.
Separadamente, se disolvieron 0,57 g de policaprolactona (P.M.
50.000) en 1,72 ml de tetrahidrofurano. A esto se le añadió agitando
una mezcla de 0,07 gramos de parafina, 0,475 g de citrato de
trietilo, 4,5 ml de ciclooctano, y 42 ml de acetato de isopropilo.
La mezcla orgánica se incorporó después lentamente a la solución de
gelatina que se mantuvo a 30ºC y bajo mezcla a cizalla moderada
utilizando un mezclador giratorio. Una vez que la fase orgánica se
incorporó completamente, la velocidad de mezclado se incrementó a
4.700 rpm durante 2 minutos y después se redujo a 2.000 rpm durante
4 minutos. La espuma líquida resultante se añadió después agitando a
350 ml de agua desionizada a 30ºC. Para entrecruzar la gelatina, se
añadió gota a gota 1 ml de glutaraladehído al 25%. El mezclado
continuó durante aproximadamente 3 horas hasta que se hubo
volatilizado el acetato de isopropilo. Las micropartículas
resultantes se recobraron mediante centrifugación y se lavaron dos
veces en una solución de Pluronic f-127 al
0,25%.
La inspección microscópica reveló
micropartículas poliméricas esféricas huecas discretas que tenían
una capa proteica externa y un núcleo líquido orgánico interno.
Las micropartículas se liofilizaron y se
sometieron a ensayo de una manera similar al ejemplo 2. Los
resultados confirmaron que las micropartículas contenían un núcleo
gaseoso y eran fuertemente ecogénicas.
Se preparó una solución de 1,0 g de gelatina
(225 bloom, punto isoeléctrico de 5,1) disueltos en 20 ml de agua
desionizada a aproximadamente 60ºC. El pH de la solución se ajustó a
5,5 con NaOH 1 M. Separadamente, se disolvieron 0,85 g de
policaprolactona (P.M. 80.000) en 2,5 ml de tetrahidrofurano. A
esto se le añadió agitando una mezcla de 0,07 gramos de parafina,
4,5 ml de ciclooctano y 42 ml de acetato de isopropilo. La mezcla
orgánica se incorporó después lentamente a la solución de gelatina
que se mantuvo a 30ºC y bajo mezcla a cizalla moderada utilizando
un mezclador giratorio. Una vez que la fase orgánica se incorporó
completamente, la velocidad de mezclado se incrementó a 3.500 rpm
durante 6 minutos y después se redujo a aproximadamente 3.000 rpm
durante 4 minutos. La espuma líquida resultante se dispersó después
como mezclado a baja cizalla en 350 ml de una solución de NaCl 0,5
M mantenida a 30ºC. El entrecruzamiento de la gelatina se completó
mediante la adición lenta de 200 mg de
1-etil-3-(3-dimetilamino-propil)carbodiimida
disuelta en 3,0 ml de agua desionizada. El mezclado continuó
durante aproximadamente 3 horas hasta que se hubo volatilizado el
acetato de isopropilo. Las micropartículas resultantes se
recobraron mediante centrifugación y se lavaron dos veces en una
solución acuosa de Pluronic f-127 al 0,25%.
La inspección microscópica reveló
micropartículas poliméricas esféricas huecas discretas que tenían
una capa proteica externa y un núcleo líquido orgánico interno.
Se prepararon microcápsulas de una manera
similar al ejemplo 1. Después de la centrifugación se recobró la
crema (aproximadamente 15 ml) y se dispersó en una solución de 65 ml
de agua desionizada, 0,50 mg de
metoxi-PEG-NCO (P.M. 5.000) y 0,50
ml de trietilamina. Después de dejar reaccionar la mezcla durante la
noche a temperatura ambiente y con agitación suave, las cápsulas se
recobraron mediante centrifugación y se lavaron tres veces en una
solución tamponada neutra de Pluronic f-127 al
0,25%.
Se reconstituyó un vial de micropartículas
liofilizadas preparadas en el Ejemplo 2 utilizando agua. Se situó
una sonda ultrasónica transesofágica en el esófago de un perro
anestesiado de manera que se obtuvo una vista de las cuatro cámaras
del corazón. La suspensión de micropartículas se inyectó en la vena
femoral del perro. La apariencia del agente de contraste se observó
claramente en la imagen ultrasónica de las cámaras derechas del
corazón. Con posterioridad, el agente se observó en las cámaras
izquierda del corazón indicando el paso a través del sistema capilar
de los pulmones. El transcurso del tiempo de la intensidad
ultrasónica reflejada en el atrio izquierdo se determinó mediante
videodensitometría. Se observó que el agente persistió en las
cámaras izquierdas del corazón durante aproximadamente 6 minutos
(Fig. 1).
Se reconstituyó un vial de micropartículas
liofilizadas preparadas en el Ejemplo 6 utilizando agua. Se situó
una sonda ultrasónica transesofágica en el esófago de un perro
anestesiado de manera que se obtuvo una vista de las cuatro cámaras
del corazón. La suspensión de micropartículas se inyectó en la vena
femoral del perro. La apariencia del agente de contraste se observó
claramente en la imagen ultrasónica de las cámaras derechas del
corazón. Con posterioridad, el agente se observó en las cámaras
izquierdas del corazón indicando el paso a través del sistema
capilar de los pulmones. El transcurso del tiempo de la intensidad
ultrasónica reflejada en el atrio izquierdo se determinó mediante
videodensitometría. Se observó que el agente persistió en las
cámaras izquierdas del corazón durante aproximadamente 16 minutos
(Fig. 2) momento después del cual no se recogieron nuevos datos.
Se preparó una solución acuosa al 6% a partir de
una solución al 25% de seralbúmina humana de grado USP (Alpha
Therapeutic Corp.) mediante dilución con agua desionizada. La
solución se ajustó a un pH de 3,49 utilizando HCl 1 N.
Separadamente, se disolvieron 8 partes en peso de policaprolactona
(P.M. 50.000) y 45 partes de ciclooctano en 300 partes de acetato
de isopropilo a aproximadamente 70ºC. Una vez completada la
disolución, la solución orgánica se dejó enfriar a 37ºC. Agitando
suavemente, se incorporaron 42,5 g de la solución orgánica preparada
a 25,0 g de la solución de albúmina mientras la mezcla se mantenía
a 30ºC. La emulsión grosera de aceite-agua
resultante se hizo circular después a través de un elemento de
filtro de material sinterizado de acero inoxidable que tenía un
tamaño de poro nominal de 7 micras. La recirculación de la emulsión
prosiguió durante 8 minutos. La emulsión se añadió después agitando
a 350 ml de agua desionizada mantenida a 30ºC y que contenía 1,0 ml
de glutaraldehído al 25%. Durante la adición, se vigiló el pH del
baño para asegurarse de que permanecía entre 7 y 8. El pH final fue
de 7,1. El mezclado a baja cizalla continuó durante aproximadamente
2 horas y media hasta que se hubo volatilizado completamente el
acetato de isopropilo. Después se disolvió en el baño Poloxámero 188
en una cantidad de 0,75 g. Las micropartículas resultantes se
recobraron mediante centrifugación y se lavaron dos veces en una
solución acuosa de poloxámero al 0,25%.
La inspección microscópica de la suspensión
reveló partículas esféricas que tenían una cubierta polimérica de
pared delgada con una capa proteica externa y un núcleo líquido
orgánico. El diámetro pico, determinado mediante el analizador del
tamaño de partícula Malvern Micro fue de 4,12 micras.
La suspensión se liofilizó después de una manera
similar a la descrita en el Ejemplo 2. La torta seca resultante se
reconstituyó con agua desionizada y se examinó al microscopio
revelando que las micropartículas eran esféricas, discretas, y
contenían un núcleo gaseoso.
Las micropartículas se prepararon según el
ejemplo 9. Después de la centrifugación aproximadamente 1 ml de la
crema que contenía micropartículas se recobró y se diluyó 10 a 1
utilizando agua desionizada. A partir de la crema diluida, se
prepararon después muestras de 20 microlitros por triplicado en
diluciones 1x, 2x, y 4x con agua desionizada. El contenido de
proteína de las muestras se determinó utilizando un análisis BCA
colorimétrico de Pierce y un patrón de seralbúmina bovina. Se
determinó que la proteína media total de la crema diluida era de
0,441 mg/ml. Para determinar el peso seco total de la crema diluida,
se secaron 2 ml en un horno a 40ºC hasta que no se observó ningún
cambio de peso adicional (aproximadamente 16 horas). El peso medio
de 4 replicas fue de 6,45 mg/ml. El porcentaje de peso seco de
proteína que se puede utilizar como una medida de la proporción de
la capa externa proteica respecto a la capa interna polimérica de la
pared de la microcápsula se puede determina con la siguiente
fórmula.
Proteína media
total/ml - peso seco/ml x
100.
Se calculó que el porcentaje de peso seco de
proteína era 6,8%.
Se preparó una solución acuosa al 6% a partir de
una solución al 25% de seralbúmina humana de grado USP mediante
dilución con agua desionizada. Después se añadió a la solución
resina de intercambio iónico (AG 501-X8, BioRad
Laboratories) a una razón de 1,5 g de resina con respecto a 1,0 g de
peso seco de albúmina. Al cabo de 3 horas la resina se separó
mediante filtración y el pH de la solución se ajustó de 4,65 a 5,5.
Separadamente, se disolvieron 0,41 g de
d-1-lactida (0,69 dL/g en
CHCl_{3}; a 30ºC) y se disolvieron 5,63 g de ciclooctano en 37,5
g de acetato de isopropilo. La solución orgánica se incorporó
después lentamente a 25,0 g de la solución de albúmina preparada
agitando suavemente mientras la mezcla se mantenía a 30ºC. La
emulsión grosera de aceite-agua resultante se hizo
circular después a través de un elemento de filtro de material
sinterizado de acero inoxidable que tenía un tamaño de poro nominal
de 7 micras. La recirculación de la emulsión prosiguió durante 8
minutos. La emulsión se añadió después agitando a 350 ml de agua
desionizada mantenida a 30ºC y que contenía 1,0 ml de
glutaraldehído al 25%. Durante la adición, se vigiló el pH del baño
para asegurarse de que permanecía entre 7 y 8. El pH final fue de
7,0. El mezclado a baja cizalla continuó durante aproximadamente 2
horas y media hasta que se hubo volatilizado completamente el
acetato de isopropilo. Después se disolvió en el baño Poloxámero 188
en una cantidad de 0,75 g. Las microesferas resultantes se
recobraron mediante centrifugación y se lavaron dos veces en una
solución acuosa de poloxámero al 0,25%.
La inspección microscópica reveló
micropartículas poliméricas esféricas huecas que tenían una capa
proteica externa y un núcleo líquido orgánico interno. La suspensión
se formuló con una solución excipiente de glicina/PEG 3350, después
se liofilizó. La torta seca resultante se reconstituyó con agua
desionizada y se examinó al microscopio revelando que las
micropartículas eran esféricas, discretas, y contenían un núcleo
gaseoso.
Las micropartículas se prepararon de una manera
similar a la del ejemplo 9. Después de la centrifugación, se
resuspendieron 4 ml de la crema (aproximadamente 11 ml de
rendimiento total) que contenía las micropartículas en 31 ml de
agua desionizada. A esto se le añadió una solución de 10 ml que
contenía 0,3 g de metoxi-peg-NCO
5000 y el pH se ajustó a 8,7. Se dejó que la mezcla reaccionara a
temperatura ambiente con agitación suave durante 4 horas y media.
Al final de este período se midió que el pH era 7,9. Las
micropartículas se recobraron mediante centrifugación y se lavaron
dos veces en una solución de poloxámero 188. La suspensión se
formuló con una solución excipiente de glicina/PEG 3350, después se
liofilizó. La torta seca resultante se reconstituyó con agua
desionizada y se examinó al microscopio revelando que las
micropartículas eran esféricas, discretas, y contenían un núcleo
gaseoso.
Primero se preparó una cantidad de
micropartículas de una manera similar al ejemplo 1 con
procedimientos modificados para proporcionar un espectro de tamaño
ensanchado. Después del lavado y la recuperación mediante
centrifugación se diluyó aproximadamente la mitad de la crema que
contenía las micropartículas hasta 125 ml con una solución al 0,25%
de poloxámero 188. La suspensión se filtró después utilizando un
tamiz de 5 micras de tipo filtro de membrana pc (Nuclepore) alojado
en una celda agitada (Amicon). El producto retenido se descartó
mientras que el producto que había penetrado se filtró de nuevo
utilizando un filtro de tipo tamiz de 3 micras en el sistema de
celdas agitadas hasta que el volumen de producto retenido alcanzó
aproximadamente 20 ml. El producto retenido se diluyó hasta un
volumen de 220 ml utilizando una solución de poloxámero 188 al
0,25%. El procedimiento de filtración de 3 micras se repitió hasta
que el volumen de producto retenido fue de nuevo aproximadamente 20
ml.
La Figura 3 proporciona una comparación de la
distribución de tamaño volumétrica de la suspensión de
micropartículas no filtrada con el producto que había penetrado de
5 micras y el producto retenido de 3 micras. Los resultados,
derivados de un analizador del tamaño de partícula Malvern Micro
muestran un estrechamiento por etapas del espectro de tamaño hacia
un intervalo de tamaño específico definido por el tamaño de poro de
los filtros utilizados.
A un perro Mongrel macho toracotomizado, de 31
kg se le inyectó 1 cc de una composición de micropartículas
reconstituida elaborada según el ejemplo 4. Ésta se liberó en la
circulación a través de una inyección venosa periférica. Se realizó
una formación de imagen ultrasónica armónica provocada (una vez cada
latido) del ventrículo izquierdo durante 9 minutos. Se podría
observar un efecto de contraste en el miocardio durante la formación
de imagen provocada. La formación de imagen ultrasónica armónica en
tiempo real (30 Hz) a lo largo de los siguientes 4 minutos aumentó
la destrucción de burbujas. La opacificación ventricular izquierda
persistió a lo largo del período de formación de imagen de 13
minutos. No se observaron efectos hemodinámicos adversos.
En un estudio separado, se administraron 0,1 cc
de agente de micropartículas reconstituido de un modo similar a un
perro mongrel macho toracotomizado. La formación de imagen
ultrasónica armónica provocada se realizó durante 1 minuto, seguido
de 4 minutos de aumento de la destrucción de micropartículas con
formación de imágenes en tiempo real. De nuevo, no se observaron
efectos hemodinámicos adversos, y la opacificación ventricular
izquierda resultó aparente y persistente.
Una torta liofilizada en un vial de suero de 10
ml, compuesta de excipiente y micropartículas que contienen lactida
preparadas de una manera similar al Ejemplo 11 se colocó en un tubo
de centrífuga de 50 ml. Se añadió alcohol isopropílico suficiente
para cubrir la torta y se dejó que se empapara durante 30 segundos.
Se añadió una solución acuosa (0,25% p/p) de Pluronic F68 para
cargar el tubo. Después de centrifugar, el sobrenadante se eliminó
y se realizó otro enjuagado. Se añadió una solución filtrada,
saturada de rodamina B a las micropartículas y se dejó empapar
durante la noche. Al microscopio, las micropartículas aparecían
cargadas con una solución de colorante. Se elaboró una solución de
F68 saturada de colorante para utilizarla como excipiente de
liofilización. Se combinaron 4 ml de excipiente con aproximadamente
2 ml de la solución que contenía microcápsulas y la mezcla
resultante se dividió entre dos viales de suero de 10 ml. Los viales
se congelaron a -80ºC y se liofilizaron en un secador de bandejas
FTS. Ambos viales se purgaron con gas perfluorobutano mediante cinco
ciclos de purgado con evacuación con una bomba de vacío. La
observación mostró algunas micropartículas que estaban medio llenas
de solución de color rojo y medio llenas de gas. No hubo una pérdida
obvia de colorante desde estas micropartículas durante la
observación. Las micropartículas se enjuagaron con cuatro porciones
de 20 ml de solución de F68 en un filtro de vacío. Las
micropartículas se colocaron en una cubeta, se centrifugaron, y se
recogió el espectro inicial. La cubeta se sometió a sonicación en
un baño ultrasónico, se centrifugó, y se recogió otro espectro.
| Abs. Inicial (553-800) | Abs. sometida a sonicación (553-800) |
| 1,164 | 1,86 |
La mayor absorción tras la sonicación indicó que
el colorante encapsulado fue liberado tras la insonación de las
micropartículas.
Se prepararon microcápsulas recubiertas de
albúmina de una manera similar al ejemplo 9 con la excepción de que
también se disolvieron 0,20 g de parafina en la solución orgánica
junto con la policaprolactona y el ciclooctano.
La inspección microscópica de la suspensión de
micropartículas acabadas reveló partículas esféricas que tenían una
morfología y apariencia virtualmente idéntica a las preparadas sin
la adición de parafina.
Una torta liofilizada en un vial de suero de 10
ml, compuesta de excipiente y micropartículas que contenían
parafina preparadas de acuerdo con el ejemplo 16 se colocó en un
tubo de centrífuga de 50 ml. La torta se cubrió con metanol y se
dejó que se empapara durante 30 segundos. El tubo se cargó después
con una solución acuosa de Pluronic F68 al 0,25% (p/p), se mezcló
suavemente, y se centrifugó con el fin de precipitar las
micropartículas cargadas ahora con líquido. Se retiró el
sobrenadante y los tubos se cargaron de nuevo con la solución de
Pluronic. Las micropartículas se volvieron a suspender mediante
vórtice y se centrifugaron de nuevo. Después de retirar la solución
de sobrenadante, se añadieron 2 ml de una solución saturada,
filtrada de colorante azul brillante G en F68 acuoso al 0,25%
(p/p). Se dejó que las micropartículas se empaparan durante
aproximadamente 72 horas. El examen microscópico reveló que el
90-95% de las micropartículas estaban cargadas con
la solución de colorante. Se preparó un excipiente para la
liofilización. Se añadieron 4 ml del excipiente a la solución de
micropartículas y se mezcló mediante vórtice. Dos viales de suero de
10 ml se cargaron cada uno con 3 ml de solución y se congelaron a
-80ºC. Los viales se liofilizaron en un liofilizador de matraz FTS.
Ambos viales y una porción de agua desionizada se purgaron con
perfluorobutano durante 10 minutos. Ambos viales se reconstituyeron
con agua desionizada y se enjuagaron con dos porciones de 40 ml de
solución de F68 al 0,25% (p/p) en un filtro de vacío. La solución
de micropartículas resultante se dividió en porciones de 3 ml. Una
porción se sometió a sonicación en un baño ultrasónico para romper
las burbujas. Ambas porciones se diluyeron 1/10 con la solución de
F68 y se colocaron en cubetas UV-visible. Las
cubetas se centrifugaron y se recogió un espectro visible.
Absorción (a 605
nm-800
nm)
- Sometida a sonicación
- 0,193
- No sometida a sonicación
- 0,136
\newpage
La mayor absorción tras la sonicación indica que
el colorante encapsulado fue liberado tras la insonación de las
microcápsulas.
Para demostrar un método para sintonizar
acústicamente el constructo de micropartículas, se reconstituyeron
las micropartículas preparadas de acuerdo con los procedimientos
descritos en los ejemplos 9 y 16 con agua desionizada y se
compararon en cuanto a sus propiedades acústicas utilizando los
procedimientos descritos a continuación.
Se colocaron dos transductores de 5 MHz pareados
en un tanque cargado con agua desgasificada uno frente al otro. La
profundidad del agua fue de aproximadamente 7,62 cm (3 pulgadas).
Los transductores, uno un emisor y el otro un receptor, se
colocaron separados 15,24 cm (6 pulgadas) para maximizar las señales
recibidas. Se colocó una cámara circular de 5,08 cm (2 pulgadas) de
diámetro, 2 cm de ancho entre los dos transductores con la posición
de la cámara media a 7,62 cm (3 pulgadas) del emisor. Las dos caras
circulares de la cámara se cubrieron con película de polietileno de
0,0762 mm (3 mil) y la cámara se cargó después con agua
desgasificada. Las ondas sonoras se propagaron rápidamente desde el
emisor a través de la cámara hasta el receptor. La fuente de sonido
se ajustó al Ruido Gausiano con una salida de amplitud de pico a
pico de 10 Volt desde el generador ultrasónico. La señal del
receptor se amplifica con un preamplificador de 17 dB y un
osciloscopio. Los dispositivos electrónicos digitales del
osciloscopio pueden realizar Transormadas de Fourier Rápidas (FFT de
"Fast Fourier Transforms") de las formas de onda recibidas y
presentar estas distribuciones. Después de realizar las lecturas de
la línea base, los materiales de contraste de las micropartículas de
ensayo se liberaron en la cámara a través de una jeringa
hipodérmica y se mezclaron cuidadosamente bombeando la jeringa.
Durante la evaluación post-ensayo, los datos de las
FFT se convirtieron en la Función de Transferencia del agente de
ensayo.
La Función de Transferencia (TF) se determina
dividiendo los datos espectrales de transmisión con burbujas por los
datos espectrales sin burbujas, es decir:
TF =
T(f)_{con \ burbujas}/T(f)_{sin \
burbujas}
donde T(f) es requerida por
la
FFT.
El agente de contraste atenúa selectivamente las
ondas sonoras dependiendo de su distribución espectral, esto es, se
absorbe más energía sonora en o cerca de la resonancia de las
burbujas que fuera de la resonancia. De este modo el procedimiento
se puede utilizar para evaluar la distribución espectral resonante
del agente.
Los datos derivados de los dos agentes con
distribución de tamaño casi idéntica pero con grosor de la cubierta
interna diferente se recogieron el mismo día con el mismo equipo
ajustado del mismo modo. Todo lo demás se mantuvo constante para una
variedad de dosificaciones del agente.
La normalización de los espectros se realizó
dividiendo la matriz espectral por el valor mínimo. Así el valor del
pico se hizo la unidad y cuando se trazó en el mismo gráfico se hizo
bastante más fácil diferenciar los dos gráficos. Estos datos
normalizados se presentan en la Fig . 4.
La inspección de los resultados mostrados en la
Fig . 4 muestra claramente que cuando aumenta la conformidad de la
pared de la cubierta, se puede hacer que la frecuencia resonante se
desplace de 2,3 MHz a 8,9 MHz. Así, la frecuencia resonante de un
agente se puede controlar controlando la composición y el grosor de
la pared.
Se evaluaron dos formulaciones de
micropartículas que contenían aire en cuanto a la eficacia in
vivo. Se preparó un vial de micropartículas liofilizadas como se
describe en los Ejemplos 1 y 2 (formulación A). Se preparó un
segundo vial de micropartículas liofilizadas de una manera similar a
la descrita en los Ejemplos 1 y 2 excepto que se utilizó cuatro
veces la cantidad de polímero, produciendo microcápsulas con una
pared interna gruesa y por tanto una mayor frecuencia resonante
(formulación B). Ambos viales se reconstituyeron inmediatamente
antes de su uso. A partir del análisis del tamaño de partícula,
ambas formulaciones tuvieron un diámetro medio de micropartícula de
aproximadamente 4 micras y una concentración de micropartículas casi
idéntica. La caracterización acústica in vitro mostró que la
formulación A tenía una frecuencia resonante de casi 5 MHz, y la
formulación B tenía una frecuencia resonante superior a 10 mHz. Una
sonda ultrasónica transesofágica de 5 MHz se colocó en el esófago
de un perro anestesiado de manera que se obtuvo una vista de las
cuatro cámaras del corazón. La suspensión de micropartículas
reconstituida (4 cc de la formulación A) se inyectó en la vena
femoral del perro. La apariencia del agente de contraste se observó
claramente en la imagen ultrasónica de las cámaras izquierdas y
derechas del corazón. Con posterioridad, se inyectaron 4 cc de la
suspensión de micropartículas de pared gruesa (formulación B) en la
vena femoral del perro. Si bien se observó de nuevo la apariencia
del agente de contraste en la imagen ultrasónica del corazón, el
efecto de contraste disminuyó sustancialmente cuando se comparó con
la inyección de volumen equivalente de la formulación A. Posteriores
inyecciones de las diluciones realizadas a partir de la formulación
A demostraron una eficacia de la dosis mayor de cuatro veces de la
formulación A que tenía una frecuencia resonante casi igual a la
frecuencia central del sistema de diagnóstico ultrasónico en
comparación con la formulación B con una mayor frecuencia
resonante del pico.
resonante del pico.
Claims (52)
1. Una composición que comprende una pluralidad
de micropartículas, una mayoría de las cuales tienen diámetros en el
intervalo de 1 a 10 micras, cada una de las cuales comprende una
cubierta que engloba un núcleo hueco, donde dicha cubierta comprende
una capa externa que comprende un material anfífilo biológicamente
compatible entrecruzado y una capa interna que comprende un polímero
biodegradable soluble en disolventes orgánicos.
2. Una composición según la reivindicación 1,
donde cada micropartícula tiene un grosor total de la cubierta en el
intervalo de aproximadamente 25 a 750 nanómetros.
3. Una composición según la reivindicación 1,
donde dicho núcleo hueco contiene un gas.
4. Una composición según la reivindicación 3,
donde dicho gas es soluble en la sangre.
5. Una composición según la reivindicación 3,
donde dicho gas es insoluble en la sangre.
6. Una composición según la reivindicación 3,
donde dicho gas es nitrógeno.
7. Una composición según la reivindicación 1,
donde dicho núcleo hueco contiene un líquido.
8. Una composición según la reivindicación 1 o
3, donde dichas micropartículas comprenden adicionalmente un
fármaco.
9. Una composición según la reivindicación 8,
donde dicho fármaco está contenido en el interior de dicho núcleo
hueco.
10. Una composición según la reivindicación 8,
donde dicho fármaco está contenido en el interior de dicha capa
interna de dicha cubierta.
11. Una composición según la reivindicación 1,
donde dicho material anfífilo biológicamente compatible entrecruzado
es compatible con la sangre.
12. Una composición según la reivindicación 1,
donde dicho material anfífilo biológicamente compatible entrecruzado
comprende una proteína entrecruzada.
13. Una composición según la reivindicación 12,
donde dicha proteína entrecruzada se selecciona entre colágeno,
gelatina, albúmina, y globulina.
14. Una composición según la reivindicación 12,
donde dicha proteína entrecruzada es la albúmina.
15. Una composición según la reivindicación 12,
donde dicha proteína entrecruzada es la gelatina.
16. Una composición según la reivindicación 1,
donde dicho material anfífilo biológicamente compatible entrecruzado
se entrecruza con un agente de entrecruzamiento seleccionado entre
un glutaraldehído y una carbodiimida.
17. Una composición según la reivindicación 16,
donde dicho agente de entrecruzamiento es el glutaraladehído.
18. Una composición según la reivindicación 1,
donde dicho polímero biodegradable es un polímero biodegradable
sintético.
19. Una composición según la reivindicación 18,
donde dicho polímero biodegradable sintético se selecciona del grupo
que consiste en policaprolactona, poli(ácido láctico), copolímeros
de poli(ácido láctico)-poli(ácido glicólico),
copolímeros de lactidas y lactonas,
delta-valerolactona, polialquilcianoacrilatos,
poliamidas, polihidroxi-butiratos, polidioxanonas,
poli-beta-aminocetonas,
polianhídridos, poli-(orto)ésteres, poli(ácido poliglutámico) y
poli(ácido aspártico) y/o ésteres de poli(ácido glutámico) y
poli(ácido aspártico).
20. Una composición según la reivindicación 18,
donde dicho polímero biodegradable sintético comprende copolímeros
de caprolactona con ácido láctico o glicólico.
21. Una composición según la reivindicación 18,
donde dicho polímero biodegradable sintético es la polilactida.
22. Una composición según la reivindicación 18,
donde dicho polímero biodegradable sintético es la
policaprolactona.
23. Una composición según la reivindicación 1,
donde dicha capa externa comprende adicionalmente radicales de
búsqueda de superficie para unirse a tejidos seleccionados.
24. Una composición según la reivindicación 23,
donde dichos radicales de búsqueda se seleccionan del grupo que
consiste en anticuerpos, receptores celulares, lectinas, selectinas,
integrinas, dianas receptoras, análogos de receptores, y fragmentos
activos de los mismos.
25. Una composición según la reivindicación 1,
donde dicha capa externa comprende adicionalmente un polímero
hidrófilo conjugado de superficie.
26. Una composición según la reivindicación 25,
donde dicho polímero hidrófilo es el polietilenglicol.
27. Una composición según la reivindicación 1,
donde dicha capa externa comprende adicionalmente una superficie
externa cargada químicamente.
28. Una composición según la reivindicación 27,
donde dicha superficie externa cargada químicamente comprende una
gelatina de tipo A que tiene un punto isoeléctrico por encima del pH
fisiológico o una gelatina de tipo B que tiene un punto isoeléctrico
por debajo del pH fisiológico.
29. Una composición según la reivindicación 1,
donde dicha capa externa está modificada químicamente para aumentar
la biocompatibilidad.
30. Una composición según la reivindicación 29,
donde dicha capa externa está succinilada, PEGilada, y/o
amidada.
31. Una composición según la reivindicación 1,
que comprende adicionalmente un azúcar.
32. Una composición según la reivindicación 31,
donde dicho azúcar se selecciona entre dextrosa, manitol, sorbitol y
sacarosa.
33. Una composición según la reivindicación 1,
que comprende adicionalmente un polímero soluble en agua.
34. Una composición según la reivindicación 33,
donde dicho polímero soluble en agua se selecciona entre
polietilenglicoles y polivinilpirrolidonas.
35. Una composición según la reivindicación 1,
que comprende adicionalmente un tensioactivo.
36. Una composición según la reivindicación 35,
donde dicho tensioactivo es un poloxámero.
37. Una composición según la reivindicación 1,
donde el polímero biodegradable es la polilactida, el material
anfífilo biocompatible entrecruzado es la albúmina entrecruzada con
glutaraldehído, y el núcleo hueco contiene gas nitrógeno.
38. Una composición según la reivindicación 1 o
3, que comprende adicionalmente un tensioactivo, un polímero soluble
en agua sintético, y un azúcar.
39. Una composición según la reivindicación 38,
que comprende adicionalmente glicina.
40. Un procedimiento para elaborar una
composición que comprende micropartículas multicapa de núcleo hueco,
que comprende las etapas de:
- (a)
- emulsionar una solución acuosa que comprende un material anfífilo biológicamente compatible con una solución orgánica que comprende un polímero biodegradable, un disolvente polimérico inmiscible con agua relativamente volátil y un no disolvente inmiscible con agua relativamente no volátil, formándose de ese modo una emulsión de aceite en agua en la que la fase discontinua comprende gotitas de la solución orgánica;
- (b)
- eliminar dicho disolvente polimérico relativamente volátil de dichas gotitas de la fase discontinua para producir una suspensión de micropartículas; y
- (c)
- secar la suspensión de micropartículas para eliminar dicho no disolvente inmiscible con agua relativamente no volátil y el agua residual, produciéndose de ese modo dicha composición de micropartículas multicapa de núcleo hueco.
41. Un procedimiento según la reivindicación 40,
donde dicho polímero relativamente volátil se elimina mediante
evaporación.
42. Un procedimiento según la reivindicación 40,
donde dicho polímero relativamente volátil se elimina mediante
dilución.
\newpage
43. Un procedimiento según la reivindicación 40,
que comprende adicionalmente la etapa de entrecruzar dicho material
anfífilo biológicamente compatible después de la etapa (a) y antes
de la etapa (b).
44. Un procedimiento según la reivindicación 40,
donde dicha etapa de secado comprende la liofilización.
45. Un procedimiento según la reivindicación 40,
que comprende adicionalmente la etapa de cargar los núcleos de
dichas micropartículas multicapa de núcleo hueco con un gas.
46. Un procedimiento según la reivindicación 45,
donde dicho gas es distinto de aire.
47. Un procedimiento según la reivindicación 45,
donde dicho gas es el nitrógeno.
48. Un procedimiento según la reivindicación 40,
donde el material anfífilo biológicamente compatible es la
seralbúmina humana, el polímero biodegradable es la polilactida, el
disolvente polimérico inmiscible con agua relativamente volátil es
el acetato de isopropilo y el disolvente polimérico inmiscible con
agua, no volátil es el ciclooctano.
49. Un procedimiento según la reivindicación 48,
donde la emulsión formada en la etapa (a) se añade a una solución no
acuosa que comprende glutaraldehído y que tiene un pH en el
intervalo de 7 a 8 antes de llevar a cabo la etapa (b), y las
micropartículas producidas en la etapa (b) se recobran y se
suspenden en una solución excipiente.
50. Un procedimiento según la reivindicación 49,
que comprende adicionalmente la etapa de cargar los núcleos de las
micropartículas multicapa de núcleo hueco con nitrógeno.
51. Una composición de micropartículas preparada
mediante un procedimiento según una cualquiera de las
reivindicaciones 40 a 50.
52. El uso de una composición de micropartículas
según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 39 ó 51 para
generar una imagen mediante ultrasonidos, que comprende detectar la
radiación ultrasónica reflejada, transmitida, sometida a resonancia
y/o la frecuencia y/o la amplitud modulada por dichas
micropartículas y generar de allí una imagen.
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