ES2296336T3 - Polipeptido modificado. - Google Patents

Polipeptido modificado. Download PDF

Info

Publication number
ES2296336T3
ES2296336T3 ES98928182T ES98928182T ES2296336T3 ES 2296336 T3 ES2296336 T3 ES 2296336T3 ES 98928182 T ES98928182 T ES 98928182T ES 98928182 T ES98928182 T ES 98928182T ES 2296336 T3 ES2296336 T3 ES 2296336T3
Authority
ES
Spain
Prior art keywords
polypeptide
baselineskip
hair
composition according
skin
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Expired - Lifetime
Application number
ES98928182T
Other languages
English (en)
Inventor
Arne Agerlin Olsen
Tine Muxoll Fatum
Heinz-Josef Deussen
Erwin Ludo Roggen
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Novozymes AS
Original Assignee
Novozymes AS
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Novozymes AS filed Critical Novozymes AS
Application granted granted Critical
Publication of ES2296336T3 publication Critical patent/ES2296336T3/es
Anticipated expiration legal-status Critical
Expired - Lifetime legal-status Critical Current

Links

Classifications

    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A21—BAKING; EDIBLE DOUGHS
    • A21D—TREATMENT OF FLOUR OR DOUGH FOR BAKING, e.g. BY ADDITION OF MATERIALS; BAKING; BAKERY PRODUCTS
    • A21D2/00—Treatment of flour or dough by adding materials thereto before or during baking
    • A21D2/08—Treatment of flour or dough by adding materials thereto before or during baking by adding organic substances
    • A21D2/24—Organic nitrogen compounds
    • A21D2/26—Proteins
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A21—BAKING; EDIBLE DOUGHS
    • A21D—TREATMENT OF FLOUR OR DOUGH FOR BAKING, e.g. BY ADDITION OF MATERIALS; BAKING; BAKERY PRODUCTS
    • A21D8/00—Methods for preparing or baking dough
    • A21D8/02—Methods for preparing dough; Treating dough prior to baking
    • A21D8/04—Methods for preparing dough; Treating dough prior to baking treating dough with microorganisms or enzymes
    • A21D8/042—Methods for preparing dough; Treating dough prior to baking treating dough with microorganisms or enzymes with enzymes
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A23—FOODS OR FOODSTUFFS; TREATMENT THEREOF, NOT COVERED BY OTHER CLASSES
    • A23B—PRESERVATION OF FOODS, FOODSTUFFS OR NON-ALCOHOLIC BEVERAGES; CHEMICAL RIPENING OF FRUIT OR VEGETABLES
    • A23B2/00—Preservation of foods or foodstuffs, in general
    • A23B2/70—Preservation of foods or foodstuffs, in general by treatment with chemicals
    • A23B2/725—Preservation of foods or foodstuffs, in general by treatment with chemicals in the form of liquids or solids
    • A23B2/729—Organic compounds; Microorganisms; Enzymes
    • A23B2/762—Organic compounds containing nitrogen
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A23—FOODS OR FOODSTUFFS; TREATMENT THEREOF, NOT COVERED BY OTHER CLASSES
    • A23B—PRESERVATION OF FOODS, FOODSTUFFS OR NON-ALCOHOLIC BEVERAGES; CHEMICAL RIPENING OF FRUIT OR VEGETABLES
    • A23B2/00—Preservation of foods or foodstuffs, in general
    • A23B2/70—Preservation of foods or foodstuffs, in general by treatment with chemicals
    • A23B2/725—Preservation of foods or foodstuffs, in general by treatment with chemicals in the form of liquids or solids
    • A23B2/729—Organic compounds; Microorganisms; Enzymes
    • A23B2/783—Microorganisms; Enzymes
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A23—FOODS OR FOODSTUFFS; TREATMENT THEREOF, NOT COVERED BY OTHER CLASSES
    • A23C—DAIRY PRODUCTS, e.g. MILK, BUTTER OR CHEESE; MILK OR CHEESE SUBSTITUTES; PREPARATION THEREOF
    • A23C9/00—Milk preparations; Milk powder or milk powder preparations
    • A23C9/12—Fermented milk preparations; Treatment using microorganisms or enzymes
    • A23C9/1203—Addition of, or treatment with, enzymes or microorganisms other than lactobacteriaceae
    • A23C9/1206—Lactose hydrolysing enzymes, e.g. lactase, beta-galactosidase
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A23—FOODS OR FOODSTUFFS; TREATMENT THEREOF, NOT COVERED BY OTHER CLASSES
    • A23K—FODDER
    • A23K20/00—Accessory food factors for animal feeding-stuffs
    • A23K20/10—Organic substances
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A23—FOODS OR FOODSTUFFS; TREATMENT THEREOF, NOT COVERED BY OTHER CLASSES
    • A23K—FODDER
    • A23K20/00—Accessory food factors for animal feeding-stuffs
    • A23K20/10—Organic substances
    • A23K20/142—Amino acids; Derivatives thereof
    • A23K20/147—Polymeric derivatives, e.g. peptides or proteins
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A23—FOODS OR FOODSTUFFS; TREATMENT THEREOF, NOT COVERED BY OTHER CLASSES
    • A23K—FODDER
    • A23K20/00—Accessory food factors for animal feeding-stuffs
    • A23K20/10—Organic substances
    • A23K20/163—Sugars; Polysaccharides
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A23—FOODS OR FOODSTUFFS; TREATMENT THEREOF, NOT COVERED BY OTHER CLASSES
    • A23K—FODDER
    • A23K20/00—Accessory food factors for animal feeding-stuffs
    • A23K20/10—Organic substances
    • A23K20/189—Enzymes
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A23—FOODS OR FOODSTUFFS; TREATMENT THEREOF, NOT COVERED BY OTHER CLASSES
    • A23L—FOODS, FOODSTUFFS OR NON-ALCOHOLIC BEVERAGES, NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; PREPARATION OR TREATMENT THEREOF
    • A23L29/00—Foods or foodstuffs containing additives; Preparation or treatment thereof
    • A23L29/06—Enzymes
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K8/00—Cosmetics or similar toiletry preparations
    • A61K8/18—Cosmetics or similar toiletry preparations characterised by the composition
    • A61K8/30—Cosmetics or similar toiletry preparations characterised by the composition containing organic compounds
    • A61K8/64—Proteins; Peptides; Derivatives or degradation products thereof
    • A61K8/66—Enzymes
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K8/00—Cosmetics or similar toiletry preparations
    • A61K8/18—Cosmetics or similar toiletry preparations characterised by the composition
    • A61K8/72—Cosmetics or similar toiletry preparations characterised by the composition containing organic macromolecular compounds
    • A61K8/84—Cosmetics or similar toiletry preparations characterised by the composition containing organic macromolecular compounds obtained by reactions otherwise than those involving only carbon-carbon unsaturated bonds
    • A61K8/86—Polyethers
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P17/00—Drugs for dermatological disorders
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61Q—SPECIFIC USE OF COSMETICS OR SIMILAR TOILETRY PREPARATIONS
    • A61Q19/00—Preparations for care of the skin
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61Q—SPECIFIC USE OF COSMETICS OR SIMILAR TOILETRY PREPARATIONS
    • A61Q19/00—Preparations for care of the skin
    • A61Q19/10—Washing or bathing preparations
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61Q—SPECIFIC USE OF COSMETICS OR SIMILAR TOILETRY PREPARATIONS
    • A61Q5/00—Preparations for care of the hair
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61Q—SPECIFIC USE OF COSMETICS OR SIMILAR TOILETRY PREPARATIONS
    • A61Q5/00—Preparations for care of the hair
    • A61Q5/02—Preparations for cleaning the hair
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61Q—SPECIFIC USE OF COSMETICS OR SIMILAR TOILETRY PREPARATIONS
    • A61Q5/00—Preparations for care of the hair
    • A61Q5/06—Preparations for styling the hair, e.g. by temporary shaping or colouring
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61Q—SPECIFIC USE OF COSMETICS OR SIMILAR TOILETRY PREPARATIONS
    • A61Q5/00—Preparations for care of the hair
    • A61Q5/10—Preparations for permanently dyeing the hair
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61Q—SPECIFIC USE OF COSMETICS OR SIMILAR TOILETRY PREPARATIONS
    • A61Q5/00—Preparations for care of the hair
    • A61Q5/12—Preparations containing hair conditioners
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C11—ANIMAL OR VEGETABLE OILS, FATS, FATTY SUBSTANCES OR WAXES; FATTY ACIDS THEREFROM; DETERGENTS; CANDLES
    • C11D—DETERGENT COMPOSITIONS; USE OF SINGLE SUBSTANCES AS DETERGENTS; SOAP OR SOAP-MAKING; RESIN SOAPS; RECOVERY OF GLYCEROL
    • C11D3/00—Other compounding ingredients of detergent compositions covered in group C11D1/00
    • C11D3/16—Organic compounds
    • C11D3/37—Polymers
    • C11D3/3703—Macromolecular compounds obtained otherwise than by reactions only involving carbon-to-carbon unsaturated bonds
    • C11D3/3719—Polyamides or polyimides
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C11—ANIMAL OR VEGETABLE OILS, FATS, FATTY SUBSTANCES OR WAXES; FATTY ACIDS THEREFROM; DETERGENTS; CANDLES
    • C11D—DETERGENT COMPOSITIONS; USE OF SINGLE SUBSTANCES AS DETERGENTS; SOAP OR SOAP-MAKING; RESIN SOAPS; RECOVERY OF GLYCEROL
    • C11D3/00—Other compounding ingredients of detergent compositions covered in group C11D1/00
    • C11D3/16—Organic compounds
    • C11D3/38—Products with no well-defined composition, e.g. natural products
    • C11D3/386—Preparations containing enzymes, e.g. protease or amylase
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C11—ANIMAL OR VEGETABLE OILS, FATS, FATTY SUBSTANCES OR WAXES; FATTY ACIDS THEREFROM; DETERGENTS; CANDLES
    • C11D—DETERGENT COMPOSITIONS; USE OF SINGLE SUBSTANCES AS DETERGENTS; SOAP OR SOAP-MAKING; RESIN SOAPS; RECOVERY OF GLYCEROL
    • C11D3/00—Other compounding ingredients of detergent compositions covered in group C11D1/00
    • C11D3/16—Organic compounds
    • C11D3/38—Products with no well-defined composition, e.g. natural products
    • C11D3/386—Preparations containing enzymes, e.g. protease or amylase
    • C11D3/38627—Preparations containing enzymes, e.g. protease or amylase containing lipase
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C11—ANIMAL OR VEGETABLE OILS, FATS, FATTY SUBSTANCES OR WAXES; FATTY ACIDS THEREFROM; DETERGENTS; CANDLES
    • C11D—DETERGENT COMPOSITIONS; USE OF SINGLE SUBSTANCES AS DETERGENTS; SOAP OR SOAP-MAKING; RESIN SOAPS; RECOVERY OF GLYCEROL
    • C11D3/00—Other compounding ingredients of detergent compositions covered in group C11D1/00
    • C11D3/16—Organic compounds
    • C11D3/38—Products with no well-defined composition, e.g. natural products
    • C11D3/386—Preparations containing enzymes, e.g. protease or amylase
    • C11D3/38654—Preparations containing enzymes, e.g. protease or amylase containing oxidase or reductase
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C11—ANIMAL OR VEGETABLE OILS, FATS, FATTY SUBSTANCES OR WAXES; FATTY ACIDS THEREFROM; DETERGENTS; CANDLES
    • C11D—DETERGENT COMPOSITIONS; USE OF SINGLE SUBSTANCES AS DETERGENTS; SOAP OR SOAP-MAKING; RESIN SOAPS; RECOVERY OF GLYCEROL
    • C11D3/00—Other compounding ingredients of detergent compositions covered in group C11D1/00
    • C11D3/16—Organic compounds
    • C11D3/38—Products with no well-defined composition, e.g. natural products
    • C11D3/386—Preparations containing enzymes, e.g. protease or amylase
    • C11D3/38681—Chemically modified or immobilised enzymes
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N11/00—Carrier-bound or immobilised enzymes; Carrier-bound or immobilised microbial cells; Preparation thereof
    • C12N11/02—Enzymes or microbial cells immobilised on or in an organic carrier
    • C12N11/08—Enzymes or microbial cells immobilised on or in an organic carrier the carrier being a synthetic polymer
    • C12N11/089—Enzymes or microbial cells immobilised on or in an organic carrier the carrier being a synthetic polymer obtained otherwise than by reactions only involving carbon-to-carbon unsaturated bonds
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/14—Hydrolases (3)
    • C12N9/48—Hydrolases (3) acting on peptide bonds (3.4)
    • C12N9/50—Proteinases, e.g. Endopeptidases (3.4.21-3.4.25)
    • C12N9/52—Proteinases, e.g. Endopeptidases (3.4.21-3.4.25) derived from bacteria or Archaea
    • C12N9/54—Proteinases, e.g. Endopeptidases (3.4.21-3.4.25) derived from bacteria or Archaea bacteria being Bacillus
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/96—Stabilising an enzyme by forming an adduct or a composition; Forming enzyme conjugates
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K2800/00—Properties of cosmetic compositions or active ingredients thereof or formulation aids used therein and process related aspects
    • A61K2800/40—Chemical, physico-chemical or functional or structural properties of particular ingredients
    • A61K2800/57—Compounds covalently linked to a(n inert) carrier molecule, e.g. conjugates, pro-fragrances
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K2800/00—Properties of cosmetic compositions or active ingredients thereof or formulation aids used therein and process related aspects
    • A61K2800/70—Biological properties of the composition as a whole
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61Q—SPECIFIC USE OF COSMETICS OR SIMILAR TOILETRY PREPARATIONS
    • A61Q9/00—Preparations for removing hair or for aiding hair removal
    • A61Q9/02—Shaving preparations
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C11—ANIMAL OR VEGETABLE OILS, FATS, FATTY SUBSTANCES OR WAXES; FATTY ACIDS THEREFROM; DETERGENTS; CANDLES
    • C11D—DETERGENT COMPOSITIONS; USE OF SINGLE SUBSTANCES AS DETERGENTS; SOAP OR SOAP-MAKING; RESIN SOAPS; RECOVERY OF GLYCEROL
    • C11D2111/00—Cleaning compositions characterised by the objects to be cleaned; Cleaning compositions characterised by non-standard cleaning or washing processes
    • C11D2111/10—Objects to be cleaned
    • C11D2111/14—Hard surfaces

Landscapes

  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Polymers & Plastics (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Food Science & Technology (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Oil, Petroleum & Natural Gas (AREA)
  • Animal Husbandry (AREA)
  • Dermatology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Birds (AREA)
  • Nutrition Science (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)
  • Cosmetics (AREA)
  • Medicinal Preparation (AREA)
  • Detergent Compositions (AREA)
  • Enzymes And Modification Thereof (AREA)

Abstract

Composición que no está destinada a ser introducida en el sistema circulatorio, que comprende un polipéptido modificado caracterizado por el hecho de que a) el polipéptido modificado ha sido modificado acoplando moléculas poliméricas con un peso molecular de 100 hasta 750 Da, de manera covalente al polipéptido progenitor que tiene un peso molecular de 5 a 100 kDa, y b) la alergenicidad respiratoria del polipéptido modificado en a) es reducida en comparación con el polipéptido progenitor cuando se mide por estimulación intratraqueal, y con la condición de que el polipéptido no sea insulina.

Description

Polipéptido modificado.
Campo de la invención
La presente invención se refiere a polipéptidos modificados con alergenicidad respiratoria reducida, a composiciones industriales comprendiendo polipéptidos modificados con alergenicidad respiratoria reducida, a productos para el cuidado de la piel, al uso de los polipéptidos modificados para reducir la alergenicidad de una composición y productos industriales y finalmente a un método para reducir la alergenicidad de los polipéptidos.
Antecedentes de la invención
Para aplicaciones médicas e industriales el uso de polipéptidos, incluyendo enzimas, es bien conocido en la técnica. Como los polipéptidos pueden causar de forma potencial una respuesta inmune indeseada - dependiendo del tipo de desafío - normalmente una respuesta de IgG y/o IgE, las técnicas para reducirla han sido desarrolladas durante estas tres últimas décadas.
Una técnica es la técnica "PEGilación" en la que varias moléculas poliméricas son acopladas al polipéptido en cuestión. Cuando se usa esta técnica el sistema inmunológico tiene dificultades para reconocer los epítopos en la superficie del polipéptido responsable de la formación de anticuerpos, reduciendo así la respuesta inmune.
Para los polipéptidos introducidos directamente en el sistema circulatorio del cuerpo humano para obtener un efecto fisiológico particular (es decir, los fármacos), la respuesta inmune potencial típica es una respuesta de IgG y/o IgM, mientras que los polipéptidos que son inhalados a través del sistema respiratorio (es decir, los polipéptidos industriales) de forma potencial pueden causar una respuesta de IgE (es decir, una respuesta alérgica).
Una de las teorías que explican la respuesta inmune reducida es que el(los) epítopo(s) de la(s) protección(es) de la(s) molécula(s) polimérica(s) en la superficie del polipéptido responsable de la respuesta inmune conduce a la formación de anticuerpos. Otra teoría o al menos un factor parcial es que cuanto más pesado es el conjugado, más reducida es la respuesta inmune obtenida.
La patente estadounidense n°. 9,179,337 se refiere a polipéptidos no inmunogénicos, tales como enzimas y hormonas peptídicas acopladas al polietilenglicol (PEG) o al polipropilenglicol (PPG). Al menos se conserva un 15% de la actividad fisiológica de los polipéptidos. El uso de PEG con un peso molecular en la gama de 750 Da a 6.000 Da está ejemplificado en la patente. Los polipéptidos no se usan para aplicaciones industriales.
WO 96/17929 (Novo Nordisk A/S) se refiere a conjugados de polipéptidos modificados acoplados a moléculas poliméricas tales como PEG. Las enzimas modificadas pueden ser usadas para varias aplicaciones industriales. Los pesos moleculares de las moléculas poliméricas acopladas a los polipéptidos en los ejemplos son 5.000, 15.000 y 35.000 Da, respectivamente.
Resumen de la invención
La presente invención se refiere a los polipéptidos con alergenicidad reducida y composiciones y productos para usos industriales comprendiendo el polipéptido modificado.
Generalmente se cree que el peso molecular y la longitud de las moléculas poliméricas no debería ser muy corto/ligero, ya que las moléculas poliméricas cortas/ligeras no pueden proteger suficientemente la superficie del polipéptido.
Este prejuicio ha sido probado incorrecto por los inventores para los polipéptidos, tales como las enzimas, usados para aplicaciones industriales, en las cuales el polipéptido no está destinado a introducirse en el sistema circulatorio.
Los presentes inventores han descubierto que cuando se usa el polipéptido en cuestión para la aplicación industrial, donde el riesgo potencial es una respuesta alérgica provocada por la inhalación del polipéptido, el polipéptido progenitor puede ser acoplado a moléculas poliméricas con un peso molecular en la gama de 100 Da hasta 5.000 Da, preferiblemente de 100 a 2.000 da, especialmente 100 a 1.000 Da sin perder la capacidad de reducir significativamente la respuesta respiratoria alergénica.
En el primer aspecto, la invención se refiere a polipéptidos acoplados a moléculas poliméricas con un peso molecular de 100 Da hasta por debajo de 750 Da, especialmente 100 a 500 Da, tal como alrededor de 300 Da.
En un segundo aspecto, la invención se refiere a composiciones para el uso en productos industriales que comprenden polipéptidos modificados acoplados a moléculas poliméricas con un peso molecular de 100 Da hasta 5.000 Da.
\global\parskip0.900000\baselineskip
Polipéptidos industriales
Los polipéptidos usados para aplicaciones industriales frecuentemente tienen una actividad enzimática y/o antimicrobiana. Los polipéptidos industriales no están destinados (a diferencia de los polipéptidos farmacéuticos) a ser introducidos en el sistema circulatorio del cuerpo.
En consecuencia, no es muy posible que los polipéptidos industriales, tales como las enzimas usadas como ingredientes activos en composiciones y/o productos industriales (definidos más abajo), tales como detergentes, incluyendo detergentes para el lavado de la ropa y para lavavajillas, aditivos para alimentos o piensos, incluyendo aditivos para panadería, composición para tratamiento textil, y productos de cuidado personal, incluidos los cosméticos, entran en contacto directo con el sistema circulatorio del cuerpo de los seres humanos o de los animales, puesto que tales polipéptidos (o productos comprendiendo tales polipéptidos) no son inyectados (o similares) en el flujo sanguíneo.
En consecuencia, en el caso del polipéptido industrial el riesgo potencial es la alergia respiratoria (es decir, la respuesta de IgE) como consecuencia de la inhalación de los polipéptidos a través del conducto respiratorio.
En el contexto de la presente invención, "polipéptidos industriales" se definen como polipéptidos, incluidos los péptidos, proteínas y/o enzimas, que no están destinados a ser introducidos en el sistema circulatorio del cuerpo de los seres humanos y/o animales.
Ejemplos de tales "polipéptidos industriales" incluyen polipéptidos con actividad enzimática tal y como se define más abajo.
La invención también se refiere a productos para el cuidado de la piel con alergenicidad reducida.
Además, la invención también se refiere al uso de polipéptidos modificados con un peso molecular de 100 Da hasta 5.000 Da, preferiblemente 100 a 2.000 Da, especialmente 100 hasta 1.000 Da para reducir la alergenicidad de los productos industriales.
Finalmente la invención se refiere a un método para reducir la alergenicidad de los polipéptidos acoplando el polipéptido a una molécula polimérica con un peso molecular de 100 Da hasta 5.000 Da.
Descripción detallada de la invención
El objetivo de la invención es el de proporcionar polipéptidos modificados con alergenicidad reducida y composiciones y productos para usos industriales comprendiendo el polipéptido modificado con alergenicidad reducida.
El término "alergenicidad reducida" significa en el contexto de la presente invención que la cantidad de IgE producida (en seres humanos, y moléculas con efectos comparables en animales específicos), que puede llevar a un estado alérgico, es disminuida inhalando un polipéptido modificado de la invención en comparación con el polipéptido progenitor correspondiente. El término "alergenicidad respiratoria" puede ser usado en su lugar.
Los presentes inventores han encontrado que cuando se usa un polipéptido para una aplicación industrial, cuando el riesgo principal potencial es una respuesta alérgica provocada por inhalación del polipéptido, el polipéptido progenitor puede ser acoplado a moléculas poliméricas con un peso molecular en la gama de 100 Da hasta 5.000 Da, preferiblemente 100 a 2.000 Da, especialmente de 100 a 1.000 Da, sin perder la capacidad de reducir significativamente la respuesta alergénica.
En una forma de realización de la invención, las moléculas poliméricas acopladas al polipéptido, en particular la enzima, tienen un peso molecular de 100 a 750 Da, tal como de 100 a 500 Da, tal como alrededor de 300 Da.
Es sorprendente que las moléculas poliméricas acopladas al polipéptido pueden ser tan pequeñas como ésta y demuestra un prejuicio existente incorrecto, es decir que el peso molecular y la longitud de las moléculas poliméricas acopladas al polipéptido no debería ser tan corta/ligera, puesto que las moléculas poliméricas cortas/ligeras no pueden proteger suficientemente la superficie del polipéptido.
En el primer aspecto, la invención se refiere a los polipéptidos modificados que tienen moléculas poliméricas acopladas con un peso molecular de 100 Da hasta 750 Da, especialmente 100 a 500 Da, tal como alrededor de 300 Da, de manera covalente al polipéptido progenitor que tiene 
\hbox{un peso
molecular entre 5 y 100 kDa, tal como de 15 a 60 kDa.}
Es ventajoso acoplar moléculas poliméricas cortas/ligeras al polipéptido en cuestión puesto que las moléculas poliméricas cortas/ligeras tienen menor tendencia a inhibir una actividad funcional del polipéptido. Por ejemplo, el centro activo de una enzima acoplada a las moléculas poliméricas con un peso molecular tal y como se define según la presente invención es más fácilmente accesible para el sustrato en comparación con la enzima correspondiente acoplada a moléculas poliméricas más grandes/más pesadas puesto que el estorbo espacial por las moléculas poliméricas es inferior. Además, un conjugado polipéptido-polímero con moléculas poliméricas más pequeñas/más ligeras tienen una estabilidad mejorada en comparación con un conjugado correspondiente con moléculas poliméricas más grandes/más pesadas acopladas al polipéptido, puesto que la deformación de la estructura del polipéptido es mínima debido al hecho de que un peso menor está empujando a la estructura del polipéptido en diferentes direcciones.
Otra ventaja del uso moléculas poliméricas pequeñas es que éstas son más económicas puesto que los polímeros se venden por kilos. Esto reduce el coste de producir un conjugado de la invención.
Valoración de la alergenicidad
La alergenicidad puede ser evaluada basándose en pruebas de inhalación, comparando el efecto del polipéptido progenitor administrado intratraquealmente (en la tráquea) con el polipéptido correspondiente modificado según la invención.
Existen varios modelos de animales in vivo para la valoración de la alergenicidad de los polipéptidos. Algunos de estos modelos proporcionan una base adecuada para valorar los riesgos en el hombre. Modelos adecuados incluyen un modelo de cobaya y un modelo de ratón. Estos modelos pretenden identificar alérgenos respiratorios como función de reacciones de respuesta inducidas en animales previamente sensibilizados. Según estos modelos los supuestos alérgenos son introducidos intratraquealmente en los animales.
Una cepa adecuada de los conejillos de Indias, la cepa Dunkin Hartley, no produce, como los seres humanos, anticuerpos IgE en relación con la respuesta alérgica. No obstante, producen otro tipo de anticuerpos el IgG1A y IgG1B (ver por ej. Prentø, ATLA; 19; p. 8-14, 1991), que son responsables de su respuesta alergénica a los polipéptidos inhalados incluidas las enzimas. En consecuencia, cuando se usa el modelo animal de Dunkin Hartley, la cantidad relativa de IgG1A y IgG1B es una medida del nivel de alergenicidad.
Una cepa de rata adecuada para la exposición intratraqueal a los polipéptidos, tales como las enzimas, es la cepa Brown Norway. Las ratas Brown Norway producen IgE como respuesta alérgica. Las ratas Brown Norway son usadas en los procesos descritos en el ejemplo 4 y 5 que ilustran la invención.
Más detalles sobre la evaluación de alérgenos respiratorios en conejillos de Indias y ratones están descritos por Kimber et al., (1996), Fundamental and Applied Toxicology; 33; p. 1-10.
Otros animales tales como p. ej. los conejos pueden también ser usados para estudios comparativos.
Molécula polimérica
Las moléculas poliméricas acopladas al polipéptido pueden ser cualquier molécula polimérica adecuada con un peso molecular tal y como se define según la invención, incluyendo los homopolímeros naturales y sintéticos, tales como los polioles (es decir poli-OH), poliaminas (es decir poli-NH_{2}) y ácidos policarboxílicos (es decir poli-COOH), y eteropolímeros adicionales es decir polímeros que comprenden uno o más grupos de acoplamiento diferentes p. ej. un grupo hidróxilo y grupos amino.
Ejemplos de moléculas poliméricas adecuadas incluyen moléculas poliméricas seleccionadas del grupo comprendiendo óxidos de polialquileno (PAO), tales como polialquilenglicoles (PAG), incluyendo politilenglicoles (PEG), metoxipolietilenglicoles (mPEG) y polipropilenglicoles, PEG-glicidil éteres (Epox-PEG), PEG oxicarbonilimidazol (CDI-PEG), PEGs ramificados, alcohol polivinílico (PVA), policaroboxilatos, poli-(vinilpirolidona), poli-D,L-aminoácidos, anhídrido del ácido polietileno-co-maléico, anhídrido del ácido poliestireno-co-málico, dextranos incluidos los carboximetil-dextranos, heparina, homólogo de albúmina, celulosas, incluida la metilcelulosa, carboximetilcelulosa, etilcellulosa, hidroxietilcelulosa, carboxietilcelulosa y la hidroxipropilcelulosa, hidrolizados de quitosano, almidones tales como hidroxietil almidones e hidroxi propil almidones, glicógeno, agarosas y derivados de los mismos, goma guar, pululano, inulina, goma de xantano, carragenina, pectina, hidrolizados de ácido algínico y biopolímeros.
Las moléculas poliméricas preferidas son moléculas poliméricas no tóxicas tal como el (m)polietilenglicol (mPEG) que además requiere una química relativamente simple para su acoplamiento covalente a los grupos de fijación en la superficie de la enzima.
Los óxidos de polialquileno (PAO) generalmente vistos, tales como óxidos de polietileno, tales como PEG y especialmente mPEG, son las moléculas preferidas poliméricas, puesto que estas moléculas poliméricas, en comparación con polisacáridos tales como dextrano, pululano y similares, tienen pocos grupos reactivos capaces de reticularse, lo cual es indeseable.
Aunque todas las moléculas poliméricas anteriormente mencionadas pueden ser usadas de acuerdo con la invención son preferidos los metoxipolietilenglicoles (mPEG) y bis-OH polietilenglicoles.
Activación de polímeros
Si las moléculas poliméricas para ser conjugadas con el polipéptido en cuestión no están activas deben ser activadas por el uso de una técnica adecuada. Se contempla igualmente según la invención el hecho de acoplar las moléculas poliméricas al polipéptido a través de un enlazador. Enlaces adecuados son bien conocidos por el experto en la materia.
Métodos y química para la activación de moléculas poliméricas al igual que para la conjugación de polipéptidos están intensivamente descritos en la bibliografía. Los métodos usados de forma común para la activación de polímeros insolubles incluyen la activación de los grupos funcionales con bromuro cianógeno, peryodato, glutaraldehido, biepóxidos, epiclorohidrina, divinilsulfona, carbodiimida, sulfonil haluros, triclorotriazina etc. (ver R.F. Taylor, (1991), "Protein immobilisation. Fundamental and applications", Marcel Dekker, N.Y.; S.S. Wong, (1992), "Chemistry of Protein Conjugation and Crosslinking", CRC Press, Boca Raton; G.T. Hermanson et al., (1993), "Immobilized Affinity Ligand Techniques", Academic Press, N.Y.). Algunos métodos conciernen la activación de los polímeros insolubles pero son también aplicables a la activación de polímeros solubles, por ej. peryodato, triclorotriazina, sulfonilhaluros, divinilsulfona, carbodiimida etc. Los grupos funcionales siendo amino, hidróxilo, tiol, carboxilo, aldehído o sulfhidrilo en el polímero y el grupo de fijación elegido en la proteína debe ser considerado a la hora de elegir la química de activación y de conjugación que normalmente consiste en i) activación del polímero, ii) conjugación, y iii) bloqueo de grupos residuales activos.
A continuación, se describirán brevemente varios métodos de activación del polímero adecuados. No obstante, debe entenderse que también otros métodos pueden ser usados.
El acoplamiento de las moléculas poliméricas a los grupos ácidos libres de los polipéptidos puede realizarse con la ayuda de diimida y por ejemplo amino-PEG o hidrazino-PEG (Pollak et al., (1976), J. Amr. Chem. Soc.; 98, 289-291) o diazoacetato/amida (Wong et al., (1992), "Chemistry of Protein Conjugation and Crosslinking", CRC Press).
El acoplamiento de las moléculas poliméricas a los grupos hidroxi es generalmente muy difícil puesto que se debe realizar en agua. Normalmente la hidrólisis predomina sobre la reacción con los grupos hidróxilo.
El acoplamiento de las moléculas poliméricas a los grupos sulfhidrilo libres puede alcanzarse con grupos especiales tales como el maleimido o el disulfuro de ortopiridilo. También la vinilsulfona (patente estadounidense n°. 5,414,135; (1995), Snow et al.) tiene una preferencia a los grupos sulfhidrilo pero no es tan selectiva como los demás mencionados.
Los residuos de arginina en la cadena polipeptídica pueden ser enfocados por los grupos que comprenden dos grupos carbonilo vecinos.
Las técnicas que implican el acoplamiento de los PEGs activados electrofílicamente a los grupos amino de las lisinas pueden también ser útiles. Muchos de los grupos salientes habituales para los alcoholes dan lugar a un enlace amina. Por ejemplo, se pueden usar sulfonatos de alquilo, tales como tresilatos (Nilsson et al., (1984), Methods in Enzymology vol. 104, Jacoby, W. B., Ed., Academic Press: Orlando, p. 56-66; Nilsson et al., (1987), Methods in Enzymology vol. 135; Mosbach, K., Ed.; Academic Press: Orlando, pp. 65-79; Scouten et al., (1987), Methods in Enzymology vol. 135, Mosbach, K., Ed., Academic Press: Orlando, 1987; pp 79-84; Crossland et al., (1971), J. Amr. Chem. Soc. 1971, 93; págs. 4217-4219), mesilatos (Harris, (1985), supra; Harris et al., (1984), J. Polym. Sci. Polym. Chem. Ed. 22, págs. 341-352), sulfonatos de arilo como los tosilatos, y para-nitrobenceno.
Los cloruros de sulfonilo orgánicos, p. ej. cloruro de tresilo, convierten eficazmente los grupos hidroxi en varios polímeros, p. ej. PEG, en buenos grupos salientes (sulfonatos) que, cuando reaccionan con nucleófilos tales como los grupos amino en los polipéptidos permiten la formación de enlaces estables entre el polímero y el polipéptido. Además de altos rendimientos de conjugación, las condiciones de reacción son en general suaves (pH neutro o ligeramente alcalino, para evitar la desnaturalización y poca o ninguna ruptura de la actividad), y satisfacen los requisitos no destructivos para el polipéptido.
El tosilato es más reactivo que el mesilato pero tiene una descomposición más inestable en PEG, dioxano, y ácido sulfónico (Zalipsky, (1995), Bioconjugate Chem., 6, 150-165). Los epóxidos pueden también ser usados para crear enlaces de amina pero son mucho menos reactivos que los grupos anteriormente mencionados.
La conversión de PEG en un cloroformato con fosgeno da lugar a enlaces del carbamato a lisinas. Este tema puede ser aplicado en muchas variantes de substitución de la clorina con N-hidroxi succinimida (patente estadounidense n°. 5,122,614; (1992); Zalipsky et al., (1992), Biotechnol. Appl. Biochem.; 15; p. 100-114; Monfardini et al., (1995), Bioconjugate Chem., 6, 62-69, con imidazol (Allen et al., (1991), Carbohydr. Res.; 213; págs 309-319), con paranitrofenol, DMAP (EP 632 082 Al; (1993), Looze, Y.) etc. los derivados son normalmente obtenidos al reaccionar el cloroformato con el grupo saliente deseado. Todos estos grupos dan lugar a enlaces del carbamato al péptido.
Además, los isocianatos e isotiocianatos pueden ser empleados produciendo ureas y tioureas, respectivamente.
Las amidas pueden ser obtenidas de ácidos de PEG usando los mismos grupos salientes que se ha mencionado anteriormente e imida tronas cíclicas (patente estadounidense n°. 5,349,001; (1994), Greenwald et al.). La reactividad de estos compuestos es muy alta pero puede realizar la hidrólisis muy rápido.
El PEG succinato obtenido a partir de la reacción con anhídrido succínico puede también ser usado. El grupo éster comprendido por la presente provoca que el conjugado sea mucho más susceptible a la hidrólisis (patente estadounidense n°. 5,122,614; (1992), Zalipsky). Este grupo puede ser activado con N-hidroxi succinimida.
Además, un enlazador especial puede ser introducido. El más antiguo siendo el cloruro cianúrico (Abuchowski et al., (1977), J. Biol. Chem.; 252, 3578-3581; patente estadounidense n°. 4,179,337; (1979), Davis et al.; Shafer et al., (1986), J. Polym. Sci. Polim. Chem. Ed.; 24, 375-378.
El acoplamiento del PEG a una amina aromática seguido de la diazotación produce una sal de diazonio reactiva que puede ser reaccionada in situ con un péptido. Un enlace amida puede también ser obtenido al reaccionar un derivado de azlactona de PEG (patente estadounidense n°. 5,321,095; (1994), Greenwald, R. B.) introduciendo así un enlace amida adicional.
Puesto que algunos péptidos no comprenden muchas lisinas puede ser ventajoso fijar más de un PEG a la misma lisina. Esto puede hacerse p. ej. usando 1,3-diamino-2-propanol.
Los PEGs pueden también ser fijados a los grupos amino de la enzima con enlaces carbamato (WO 95/11924, Greenwald et al.). Los residuos de lisina pueden también ser usados como esqueleto.
Posición de las moléculas poliméricas acopladas
Prácticamente todos los grupos ionizados, tales como el grupo amino de los residuos de lisina, están en la superficie de la molécula del polipéptido (ver por ejemplo Thomas E. Creighton, (1993), "Proteins", W.H. Freeman and Company, Nueva York). En consecuencia, el número de grupos de fijación fácilmente accesibles (es decir, los grupos amino) en la superficie del polipéptido iguala el número de residuos de lisina en la estructura primaria del polipéptido más el grupo amino del N-término.
Según la invención de 1 a 100 moléculas poliméricas, preferiblemente de 4 a 50 moléculas poliméricas; 5 a 35 moléculas poliméricas son acopladas al polipéptido progenitor.
Polipéptido progenitor
Los polipéptidos modificados de la invención pueden ser preparados basándose en polipéptidos progenitores, que normalmente tienen un peso molecular en la gama de 5 a 100 kDa, preferiblemente de 15 a 60 kDa, usando cualquier técnica adecuada conocida en la técnica.
El término polipéptido "progenitor" se destina a indicar cualquier polipéptido desacoplado (es decir un polipéptido que debe ser modificado). El polipéptido puede preferiblemente ser de origen microbiano, tal como, de origen bacteriano, de hongo filamentoso o de levadura. El polipéptido progenitor puede ser un polipéptido natural (o de tipo salvaje) o puede ser una variante del mismo.
Los polipéptidos preferidos son enzimas y polipéptidos con actividad antimicrobiana. En una forma de realización preferida, la enzima es una enzima adecuada para composiciones y productos para el cuidado de la piel que tienen una actividad sustancialmente enzimática en el margen de pH usado en el producto para el cuidado de la piel.
Al elegir un polipéptido progenitor es ventajoso usar un polipéptido con un gran número de grupos de fijación.
Además, en una forma de realización preferida de la invención las moléculas poliméricas son extendidas ampliamente sobre la superficie del polipéptido. Para las enzimas se prefiere que las moléculas no poliméricas estén acopladas en la región próxima al centro activo.
En este contexto "extendidas ampliamente" significa situadas de modo que las moléculas poliméricas acopladas a los grupos de fijación del polipéptido proteja distintas partes de la superficie del polipéptido, preferiblemente todo o casi todo el área de superficie para cerciorarse de que el(los) epítopo(s) pertinente(s) que es(son) reconocible(s) esté(n) protegido(s) y por este medio no reconocido(s) por los anticuerpos del sistema inmunológico. Se cree que el área de la superficie de interacción entre el polipéptido y un anticuerpo se extiende en la gama de aproximadamente 500 \ring{A}2 (26 X 19\ring{A}) (ver Sheriff et al. (1987), Proc. Natl. Acad. Sci. USA, vol. 84, p. 8075).
Dos o más grupos de fijación en el polipéptido preferiblemente no deberían estar cerca uno del otro puesto que probablemente dará como resultado que sólo se acople una molécula polimérica.
Para la enzima se prefiere asegurar una pérdida mínima de actividad enzimática, no acoplar moléculas poliméricas en una distancia próxima al centro activo. Generalmente se prefiere que ninguna molécula polimérica sea fijada en 5 \ring{A}, preferiblemente 10 \ring{A} del centro activo.
Además, los polipéptidos que tienen moléculas poliméricas acopladas al epítopo conocido reconocible por el sistema inmunológico o cerca de dicho epítopo también se consideran ventajosos de acuerdo con la invención. Si la posición del(los) epítopo(s) es desconocida es ventajoso acoplar otras tantas moléculas poliméricas a los grupos de fijación disponibles en la superficie del polipéptido. Se prefiere que dichos grupos de fijación se extiendan ampliamente sobre la superficie del polipéptido en una distancia adecuada desde el centro activo.
Los polipéptidos modificados que cumplen las reivindicaciones anteriores para la distribución de las moléculas poliméricas acopladas en la superficie del polipéptido son preferidos según la invención.
Para las enzimas especialmente las enzimas que no tienen o que tienen muy pocas moléculas poliméricas (es decir, 0 a 2) acopladas en una distancia de 0 a 5 \ring{A}, preferiblemente 0 a 10 \ring{A} del centro activo son preferidas.
\global\parskip1.000000\baselineskip
Actividad enzimática
La enzima progenitora puede tener cualquier actividad conocida que debe ser usada para el cuidado de la piel. Las enzimas contempladas incluyen las oxidorreductasas (E.C. 1, "Enzyme Nomenclature", (1992), Academic Press, Inc.), tal como lacasa y superóxido-dismutasa (SOD); hidrolasas E.C. 3, incluidas las proteasas, especialmente serina proteasas tales como subtilisinas, y enzimas lipolíticas; transferasas, (E.C. 2), tales como transglutaminasas (TGasas); isomerasas (E.C. 5), tales como las proteína disulfuro isomerasas (PDI).
Hidrolasas Enzimas proteolíticas
Las enzimas proteolíticas contempladas incluyen proteasas seleccionadas del grupo de proteasas aspárticas acidicas, cisteína proteasas, serina proteasas, tales como subtilisinas, o metalo proteasas, con las propiedades arriba indicadas (es decir, número de grupos de fijación, posición de los grupos de fijación etc.).
Los ejemplos específicos de proteasas progenitoras adecuadas que tienen un número adecuado de grupos de fijación están indicados en la tabla 1 siguiente:
TABLA 1
1
La subtilisina PD498 tiene un peso molecular de 29 kDa, y como se puede observar a partir de la SEC ID NO: 2, tiene 12 grupos de lisina para la fijación del polímero en la superficie de la enzima más un grupo amino N-terminal. Como se ha mencionado anteriormente las enzimas preferidas tienen lisinas extendidas ampliamente sobre la superficie. PD498 no tiene residuos de lisina en una distancia de 0-10 \ring{A} desde el centro activo lo que la hace especialmente adecuada en forma modificada. Además, los residuos de lisina están extendidos ampliamente en la superficie de la enzima (es decir fuera del centro activo).
La subtilisina enzimática DY tiene un peso molecular de 27 kDa y tiene 12 grupos amino (es decir residuos de lisina) en la superficie de la enzima y un grupo amino N-terminal (ver SEC ID NO: 3).
La proteasa progenitora Lion Y tiene un peso molecular de 46 kDa y tiene 14 grupos amino (es decir residuos de lisina) en la superficie de la enzima más un grupo amino N-terminal (ver SEC ID NO: 4).
La metalo proteasa neutra Termolisina tiene un peso molecular de aproximadamente 34 kDa y tiene 11 grupos amino (es decir residuos de lisina) en la superficie más un grupo amino N-terminal. (Ver SEC ID NO: 5).
Enzimas lipolíticas
Las enzimas lipolíticas contempladas incluyen lipasas de Humicola lanuginosa, p. ej. aquella descrita en EP 258 068 y EP 305 216, Humicola insolens, una lipasa de Rhizomucor miehei, p. ej. como se describe en EP 238 023, enzimas lipolíticas de Absidia sp. (WO 96/13578), una lipasa de Candida, tal como una lipasa de C. antarctica, p. ej. la lipasa A o B de C. antarctica descrita en EP 214 761, una lipasa de Pseudomonas tal como una lipasa de P. alcaligenes y P. pseudoalcaligenes, p. ej. como se describe en EP 218 272, una lipasa de P. cepacia, p. ej. como se describe en EP 331 376, una lipasa de Pseudomonas sp. como se describe en WO 95/14783, una lipasa de Bacillus, p. ej. una lipasa de B. subtilis (Dartois et al., (1993) Biochemica et Biophyisica Acta 1131, 253-260), una lipasa de B. stearothennophilus (JP 64/744992) y una lipasa de B. pumilus (WO 91/16422). Otros tipos de lipoliticos incluyen cutinasas, p. ej. derivadas de Humicola insolens o Pseudomonas mendocina (WO 88/09367), o una cutinasa derivada de Fusarium solani pisi (WO 90/09446).
Oxidorreductasas Lacasas
Las lacasas contempladas incluyen las lacasas descritas en WO 96/00290 y WO 95/33836 de Novo Nordisk. Otras oxidorreductasas incluyen catalasa, glucosa-oxidasa, peroxidasa, superóxido dismutasa y lipoxigenasa.
Transferasas Transglutaminasas
Las transferasas adecuadas incluyen cualquiera de las transglutaminasas descritas en WO 96/06931 (Novo Nordisk A/S) y WO 96/22366 (Novo Nordisk A/S).
Isomerasas Proteína disulfuro isomerasa
Sin limitarse a ello, las proteína disulfuro isomerasas adecuadas incluyen las PDIs descritas en WO 95/01425 (Novo Nordisk A/S).
Composición industrial
En otro aspecto la invención se refiere a una "composición industrial" que comprende un polipéptido modificado con alergenicidad reducida.
En el contexto de la presente invención, una "composición industrial" significa una composición que no está destinada a ser introducida en el sistema circulatorio. En otras palabras significa una composición que no está destinada a la administración por vía intradérmica, intravenosa o subcutánea.
Como se ha mencionado anteriormente, el problema principal para los polipéptidos, tales como las enzimas, para la aplicación industrial es el riesgo potencial de alergia respiratoria provocada por la inhalación a través del sistema respiratorio es decir por vía intratraqueal o por exposición intranasal.
Ejemplos de "composición industrial" son polipéptidos, especialmente enzimas y polipéptidos antimicrobianos, usados en composiciones o productos tales como los detergentes, incluidos los detergentes para el lavado de la ropa y de lavavajillas, productos de artículos para el hogar, productos agroquímicos, productos para el cuidado personal, tales como productos para el cuidado de la piel, incluidos los cosméticos y los productos de aseo, los fármacos orales y dérmicos, las composiciones usadas para tratar/procesar tejidos, composiciones para la limpieza de superficies duras, y composiciones usadas para fabricar alimentos y piensos, incluyendo alimentos o aditivos alimenticios, tales como los aditivos para la panificación o similares etc. Especialmente están contemplados por la invención los productos para el cuidado de la piel y los detergentes.
Productos para el cuidado de la piel
En el contexto de la presente invención "productos para el cuidado de la piel" cubre todos los productos de cuidado personal usados para limpiar, cuidar y/o embellecer la piel del cuerpo y otros productos adicionales, tales como productos para el cuidado del cabello, que durante el uso pueden entrar en contacto con la piel o el sistema respiratorio. También los productos correspondientes para animales están contemplados por la presente invención.
Ejemplos específicos de productos para el cuidado de la piel contemplados por la presente invención son jabón, cosméticos, cremas para la piel, geles para la piel, leche para la piel, loción para la piel, crema limpiadora, loción limpiadora, leche limpiadora, crema base, jabón en crema, base de maquillaje, loción láctea, máscara, loción de calamina, esencia para la zona T, crema de manos, esencia en polvo, polvo blanqueador, jabón en polvo, tarta de jabón, jabón transparente, crema de labios, lápiz de labios, esencia nutritiva, base cremosa, polvo para la cara, sombra de ojos en polvo, base en polvo, quitaesmalte, tónico para el pelo, líquido para el pelo, crema para el pelo, gel para el pelo, tratamiento para el pelo, preparaciones fijadoras para el pelo, tintes para el pelo, colorantes para el pelo, tratamiento del cuero cabelludo, champú, bálsamo, enjuague para el pelo, aceite solar en espray para el pelo, pantalla solar, espuma y gel de afeitar, crema de afeitar, aceite para bebés, productos antiacné, desodorantes, repelentes de insectos, desodorantes etc.
Actividades enzimáticas adecuadas para el cuidado de la piel
Las composiciones para el cuidado de la piel de la invención comprenden enzimas modificadas con alergenicidad reducida e ingredientes conocidos para ser usados en composiciones para el cuidado de la piel.
Varias actividades enzimáticas son conocidas para ser usadas en composiciones para el cuidado de la piel.
Proteasas
Las proteasas son ingredientes eficaces en productos para la limpieza de la piel. Las proteasas eliminan la capa superior de las células queratinosas muertas de la piel y de ese modo da un aspecto más brillante y más fresco para la piel. Además, las proteasas también mejoran la suavidad de la piel.
Las proteasas son usadas en productos de aseo, de baño y de ducha, incluyendo champús, acondicionadores, lociones, cremas, pastillas de jabón, jabones de aseo, y jabones líquidos.
Lipasas
Las lipasas pueden ser aplicadas para el uso cosmético como ingredientes activos en productos de limpieza para la piel y productos antiacné para eliminar el exceso de lípidos de la piel, y en productos de baño y de ducha tales como cremas y lociones como ingredientes activos para el cuidado de la piel.
Las lipasas pueden también ser usadas en productos para la limpieza del pelo (p. ej. champús) para la eliminación eficaz del sebo y otra materia grasa de la superficie de pelo.
Oxidorreductasas
La oxidorreductasa más común para los fines del cuidado personal es una oxidasa (normalmente glucosa-oxidasa) con sustrato (p. ej. glucosa) que asegura la producción de H_{2}O_{2}, que luego iniciará la oxidación de por ejemplo SCN^{-} o I^{-} en reactivos antimicrobianos (SCNO^{-} o I_{2}) por una peroxidasa (normalmente lactoperoxidasa). Este complejo enzimático es conocido en la naturaleza de p. ej. leche y saliva.
Se está utilizando comercialmente como sistema antimicrobiano en productos para el cuidado bucal (enjuague bucal, dentífrico, goma de mascar), en los que también puede ser combinado con una amiloglucosidasa para producir la glucosa. Estos sistemas son también conocidos en productos cosméticos para la conservación.
Otra aplicación de las oxidorreductasas es en el tinte para el pelo oxidante usando oxidasas, peroxidasas y lacasas (ver p. ej. WO 96/00290 o WO 95/33836 de Novo Nordisk).
Los radicales libres formados en la superficie de la piel (y el pelo) conocidos para ser asociados con el proceso de envejecimiento de la piel (deterioro del pelo).
Los radicales libres activan reacciones en cadena que conducen a la destrucción de membranas grasas, colágeno, y células.
\newpage
La aplicación de eliminadores de radicales libres tales como superóxido-dismutasa en cosméticos es bien conocida (R. L. Goldemberg, DCI, Nov. 93, p. 48-52).
Proteína disulfuro isomerasa (PDI) es también una oxidorreductasa. Puede ser utilizada para ondular el pelo (reducción y reoxidación de enlaces disulfuro en el pelo) y para la reparación del pelo estropeado (cuando el daño es principalmente la reducción de los enlaces disulfuro existente).
Transglutaminasa
Las composiciones para el cuidado de la piel para la aplicación a la piel humana, pelo o uñas comprenden (a) un ingrediente activo amino-funcional, (b) transglutaminasa para catalizar la reticulación del ingrediente activo a la piel, pelo o uñas, y (c) un portador es conocido a partir de la patente estadounidense n°. 5,490,980.
Una composición cosmética adecuada para la aplicación para la piel de mamífero, pelo o uñas que comprende: (a) al menos una proteína de revestimiento del corneocito en una cantidad suficiente para proporcionar una capa protectora en dicha piel, pelo o uñas; (b) una transglutaminasa en una cantidad suficiente para formar enlaces covalentes entre la proteína de revestimiento del corneocito y las proteínas del corneocito expuestas externamente presentes en el stratum corneum de dicha piel, pelo o uñas; (c) iones de calcio en una cantidad suficiente para activar la transglutaminasa; y (d) un vehículo cosméticamente aceptable, donde la composición comprende una emulsión que tiene dos fases y donde la proteína de revestimiento del corneocito está contenida en una de las fases y la transglutaminasa está contenida dentro de la otra fase (ver patente estadounidense n°. 5,525,336).
JP 3083908 describe un material cosmético para la piel que contiene una transglutaminasa modificada con una sustancia hidrosoluble. La sustancia modificadora es, p. ej., uno o varios polietilenglicoles, etilenglicoles, propilenglicoles, glicerinas, alcohol polivinílico, glucosa, sacarosa, ácido alginílico, carboximetilcelulosa, almidón, e hidroxipropilcelulosa. La modificación se hace, p. ej., introduciendo grupos reactivos y uniéndolos a la enzima. Para proveer un material suave para la piel, que produzca menos intervalos de tiempo de decoloración y de odorización, y que tenga buenos efectos para curar la piel áspera, retener la humedad, y acondicionar la piel con belleza.
Productos para el cuidado de la piel según la invención
En el tercer aspecto la invención se refiere a un producto para el cuidado de la piel que comprende una composición para el cuidado de la piel según la invención. El término "productos para el cuidado de la piel" están definidos más arriba.
Un producto para el cuidado de la piel según la invención puede comprender una cantidad eficaz de enzimas modificadas de la invención. Tales cantidades eficaces conocidas por el experto en la materia pueden frecuentemente estar comprendidas en la gama entre el 0 y el 5% del producto para el cuidado de la piel final.
Los productos para el cuidado de la piel contemplados de la invención incluyen los siguientes productos, sin estar limitados a los mismos: jabón, cosméticos, cremas para la piel, leche para la piel, loción para la piel, gel para la piel, crema limpiadora, loción limpiadora, leche limpiadora, crema base, jabón en crema, base de maquillaje, loción láctea, máscara, loción de calamina, esencia para la zona T, crema de manos, esencia en polvo, polvo blanqueador, jabón en polvo, tarta de jabón, jabón transparente, crema de labios lápiz de labios, esencia nutritiva, base cremosa, polvos para la cara, sombra de ojos en polvo, base en polvo, quitaesmalte, tónico para el pelo, líquido para el pelo, crema para el pelo, gel para el pelo, tratamiento para el pelo, preparaciones fijadoras para el pelo, tintes para el pelo, colorantes para el pelo, tratamiento del cuero cabelludo, champú, bálsamo, enjuague para el pelo, aceite solar en espray para el pelo, espuma de afeitar, crema de afeitar, aceite para bebés, productos antiacné, antitranspirantes, repelentes de insectos, desodorantes etc.
Formulaciones generales de productos para el cuidado de la piel
El término "ingredientes usados en productos para el cuidado de la piel" se entiende que cubre todos los ingredientes que son conocidos para ser usados en formulaciones de productos para el cuidado de la piel. Ejemplos de tales ingredientes pueden ser encontrados en "Cosmetics and Toiletries" editado por Wilfried Umbach y publicado por Ellis Horwood, Limited, Inglaterra, (1991), y "Surfactants in Consumer Products", editado por J. Falbe y publicado por Spring-Verlag, (1987).
A continuación una lista no exhaustiva de formulaciones guía están catalogadas. Éstas proporcionan una vista general de las formulaciones para productos para el cuidado de la piel importantes según la invención.
Jabón de aseo 
\vskip1.000000\baselineskip
100 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
Sindet (detergentes sintéticos) 
\vskip1.000000\baselineskip
101
Espuma de baño y ducha
102 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
Jabón de aseo
103 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
Crema para la piel (tipo agua-en-aceite y tipo aceite-en-agua)
104
105 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
Loción para el cuerpo (tipo aceite-en-agua) y loción para la piel para aplicación en pieles mojadas
106
107 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
Loción para la cara
108 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
Champú para el pelo
109
110 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
Enjuague para el pelo y acondicionador para el pelo
111
112 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
Tintes para el pelo 
\vskip1.000000\baselineskip
113
Crema de afeitar 
\vskip1.000000\baselineskip
114 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
Loción de afeitar 
\vskip1.000000\baselineskip
115
Crema para el pelo 
\vskip1.000000\baselineskip
116 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
Loción fijadora 
\vskip1.000000\baselineskip
117
En otro aspecto la invención se refiere al uso del polipéptido modificado de la invención para reducir la alergenicidad de composiciones y productos industriales tal y como se ha definido anteriormente.
En un aspecto final la invención se refiere a un método para reducir la alergenicidad respiratoria de los polipéptidos comprendiendo la fase de acoplamiento.
Descripción del detergente
Las composiciones de detergentes de la invención pueden ser formuladas, por ejemplo, como composiciones de detergentes para el lavado a mano y a máquina incluyendo composiciones de aditivos para el lavado y composiciones adecuadas para el uso en el pretratamiento de tejidos teñidos, composiciones de suavizante de tejidos añadidas al enjuague, y composiciones para el uso en operaciones de limpieza de superficies duras del hogar y operaciones de lavado de la vajilla.
La composición de detergente de la invención comprende el conjugado de la invención y un agente tensioactivo. Adicionalmente, puede opcionalmente comprender un constructor, otra enzima, un supresor de espuma, un agente suavizante, un agente inhibidor de la transferencia de colores y otros componentes usados de forma convencional en detergentes tales como agentes de suspensión de suciedad, agentes de liberación de suciedad, blanqueadores ópticos, abrasivos, bactericidas, inhibidores de la 
\hbox{decoloración,  agentes colorantes, y/o perfumes
encapsulados o no encapsulados.}
La composición de detergente según la invención puede ser en forma líquida, en pasta, en gel, en barra o granulosa. El pH (medido en solución acuosa en concentración al uso) normalmente será neutro o alcalino, p. ej. en la gama de 7-11. Las composiciones granulosas según la presente invención pueden también estar en "forma compacta", es decir éstas pueden tener una densidad relativamente más alta que los detergentes convencionales granulosos, es decir de 550 a 950 g/l. La enzima conjugada de la invención, u opcionalmente otra enzima incorporada en la composición de detergente, es normalmente incorporada en la composición de detergente a un nivel entre el 0,00001% y el 2% en peso de proteína enzimática de la composición, preferiblemente a un nivel entre el 0,0001% y el 1% en peso de proteína enzimática de la composición, más preferiblemente a un nivel entre el 0,001% y el 0,5% en peso de proteína enzimática de la composición, incluso más preferiblemente a un nivel entre el 0,01% y el 0,2% de proteína enzimática en peso de la composición.
Sistema tensioactivo
El sistema tensioactivo puede comprender agentes tensioactivos no iónicos, aniónicos, catiónicos, anfolíticos, y/o zwitteriónicos. El sistema tensioactivo preferiblemente consiste en un agente tensioactivo aniónico o una combinación de agente tensioactivo aniónico y no iónico, p. ej. 50-100% de agente tensioactivo aniónico y 0-50% de no iónico. Las composiciones de detergentes para el lavado de la ropa pueden también contener agentes tensioactivos catiónicos, anfolítico, zwitteriónicos, y semipolares, así como agentes tensioactivos no iónicos y/o aniónicos distintos de los que ya están descritos aquí. El agente tensioactivo está normalmente presente a un nivel entre el 0,1% y el 60% en peso. Algunos ejemplos de agentes tensioactivos están descritos más abajo.
Agente tensioactivo no iónico
El agente tensioactivo puede comprender condensados de óxido de polialquileno (p. ej. óxido de polietileno) de alquil-fenoles. El grupo alquilo puede contener de aproximadamente 6 a aproximadamente 14 átomos de carbono, en una cadena lineal o cadena ramificada. El óxido de etileno puede estar presente en una cantidad equivalente a aproximadamente 2 a aproximadamente 25 moles por mol de alquil fenol.
El agente tensioactivo puede también comprender productos de condensación de alcoholes alifáticos primarios y secundarios con aproximadamente 1 a aproximadamente 25 moles de óxido de etileno. La cadena de alquilo del alcohol alifático puede bien ser recta o ramificada, y generalmente contiene de aproximadamente 8 a aproximadamente 22 átomos de carbono.
Además, el agente tensioactivo no iónico puede comprender condensados de óxido de polietileno de alquil-fenoles, productos de condensación de alcoholes alifáticos primarios y secundarios con de aproximadamente 1 a aproximadamente 25 moles de óxido de etileno, alquilpolisacáridos, y mezclas de los mismos. Son más preferidos los etoxilatos de C8-C14 alquil fenol que tienen de 3 a 15 grupos etoxi y los etoxilatos de C8-C18 alcohol (preferiblemente un promedio de C10) que tienen de 2 a 10 grupos etoxi, y mezclas de los mismos.
Agentes tensioactivos aniónicos
Agentes tensioactivos adecuados aniónicos incluyen alquil sulfatos etoxilados que son sales hidrosolubles o ácidos de la fórmula RO(A)mSO3M donde R es un grupo C10-C-24 alquilo insustituido o hidroxialquilo que tiene un componente C10-C24 alquilo, preferiblemente un C12-C20 alquilo o hidroxialquilo, más preferiblemente C12-C18 alquilo o hidroxialquilo, A es una unidad etoxi o propoxi, m es mayor que cero, normalmente entre aproximadamente 0,5 y aproximadamente 6, más preferiblemente entre aproximadamente 0,5 y aproximadamente 3, y M es H o un catión que puede ser, por ejemplo, un catión metálico (p. ej., sodio, potasio, litio, calcio, magnesio, etc.), catión de amonio o de amonio sustituido. Los alquil sulfatos etoxilados al igual que los alquil sulfatos propoxilados están contemplados aquí. Ejemplos específicos de cationes de amonio sustituido incluyen cationes de metil-, dimetil, trimetil-amonio y cationes de amonio cuaternarios tales como cationes de tetrametil-amonio y de dimetil piperdinio y aquellos derivados de alquilaminas tales como etilamina, dietilamina, trietilamina, mezclas de las mismas, y similares.
Otros agentes tensioactivos adecuados aniónicos incluyen los agentes tensioactivos de alquil sulfato que son sales hidrosolubles o ácidos de la fórmula ROSO3M donde R preferiblemente es un C10-C24 hidrocarbilo, preferiblemente un alquilo o hidroxialquilo que tiene un componente C10-C20 alquilo, más preferiblemente un C12-C18 alquilo o hidroxialquilo, y M es H o un catión, p. ej., un catión de metal alcalino (p. ej. sodio, potasio, litio), o amonio o amonio sustituido.
Otros agentes tensioactivos aniónicos incluyen sales (incluyendo, por ejemplo, sodio, potasio, amonio, y sales de amonio sustituido tales como sales de mono-, di- y trietanolamina) de jabón, C8-C22 alcanosulfonatos primarios o secundarios, C8-C24 olefinsulfonatos, ácidos policarboxílicos sulfonatados preparados por sulfonación del producto pirolizado de citratos de metal alcalinotérreo. Los alquilbenceno sulfonatos son adecuados, especialmente los alquil benceno sulfonatos lineales (LAS) (cadena recta) donde el grupo alquilo preferiblemente contiene de 10 a 18 átomos de carbono.
Las composiciones de detergentes para el lavado de la ropa normalmente comprenden aproximadamente del 1% a aproximadamente el 40%, preferiblemente de aproximadamente el 3% a aproximadamente el 20% en peso de tales agentes tensioactivos aniónicos.
Sistema constructor
Las composiciones según la presente invención pueden además comprender un sistema constructor. Cualquier sistema constructor convencional es conveniente para el uso aquí incluso materiales de aluminosilicato, silicatos, policarboxilatos y ácidos grasos, materiales tales como tetraacetato de etilenodiamina (EDTA), secuestrantes de iones metálicos tales como aminopolifosfonatos. Los constructores de fosfatos también pueden ser usados aquí.
Constructores adecuados pueden ser un material de intercambio iónico inorgánico, comúnmente un material de aluminosilicato inorgánico hidratado, más particularmente una zeolita sintética hidratada tal como la zeolita hidratada A, X, B, HS o MAP.
Las sales de constructores para la detergencia están normalmente incluidas en cantidades del 5% al 80% en peso de la composición. Los niveles preferidos de constructores para detergentes líquidos son del 5% al 30%.
Otras actividades enzimáticas del detergente
La composición del detergente puede, además del conjugado de la invención con una actividad específica, comprender adicionalmente otras actividades enzimáticas p. ej. también en forma de una enzima conjugada como se describe según la presente invención, proporcionando rendimiento de limpieza y/o beneficios en el cuidado de los tejidos, p. ej. proteasas, lipasas, cutinasas, amilasas, celulasas, peroxidasas, oxidasas (p. ej. lacasas).
Ejemplos específicos de las enzimas contempladas están catalogados más arriba en la sección "Actividad enzimática".
Blanqueadores
La composición del detergente (especialmente en el caso de un detergente granuloso) puede también comprender blanqueadores, p. ej. un blanqueador de oxígeno o un blanqueador de halógeno. El blanqueador de oxígeno puede ser un agente de liberación de peróxido de hidrógeno tal como un perborato (p. ej. PB1 o PB4) o un percarbonato, o puede p. ej. ser un ácido percarboxílico. El tamaño de partícula puede ser 400-800 micras. Cuando están presentes, los compuestos blanqueadores de oxígeno normalmente presentarán niveles de aproximadamente el 1% a aproximadamente el 25%.
El agente de liberación de peróxido de hidrógeno puede ser usado en combinación con activadores del blanqueamiento tales como la tetra-acetiletilenodiamina (TAED), nonanoiloxibenzeno-sulfonato (NOBS); 3,5-trimetil-hassanoloxibenceno-sulfonato (ISONOBS) o pentaacetilglucosa (PAG).
El blanqueador de halógeno puede ser, p. ej. un blanqueador de hipohalita, por ejemplo, ácido tricloro isocianúrico y los dicloroisocianuratos de sodio y de potasio y las alcano sulfonamidas de N-cloro y N-bromo. Materiales de este tipo son añadidos normalmente en un 0,5-10% en peso del producto acabado, preferiblemente en un 1-5% en peso.
Aplicaciones textiles Proteasas
Las proteasas se usan para el desgomado y el lavado de arena de la seda.
Lipasas
Las lipasas se usan para la eliminación de la materia grasa conteniendo ésteres hidrofóbicos (p. ej. triglicéridos) durante el acabado de textiles (ver p. ej. WO 93/13256 de Novo Nordisk A/S).
Oxidorreductasas
En la limpieza por blanqueamiento de textiles, las catalasas pueden servir para eliminar el exceso de peróxido de hidrógeno.
Carbohidrasas
Las enzimas celulolíticas se utilizan mucho en el acabado de prendas de tela vaquera para proporcionar una variación localizada en la densidad de color del tejido (enzima denominada "stone wash").
También las enzimas celulolíticas encuentran uso en el proceso de "biopolishing". El biopolishing es un tratamiento específico de la superficie del hilo que mejora calidad del tejido con respecto a la manipulación y apariencia sin pérdida de la humectabilidad del tejido. El biopolishing puede ser obtenido aplicando el método descrito p. ej. en WO 93/20278.
Durante el tejido de los tejidos, los hilos son expuestos a una tensión mecánica considerable. Para prevenir la rotura, éstos son normalmente reforzados mediante el revestimiento (encolado) con una sustancia gelatinosa (cola). El agente de encolado más común es el almidón en forma nativa o modificada. Un acabado uniforme y duradero puede por lo tanto ser obtenido sólo después de la eliminación de la cola del tejido, el denominado desencolado. El desencolado de tejidos con un almidón conteniendo cola o un almidón modificado es preferiblemente facilitado usando enzimas amilolíticas.
Aplicaciones en alimentos y piensos
Las enzimas o polipéptidos conjugados de la invención pueden ventajosamente ser usados en la producción de alimentos y piensos.
Proteasas
El gluten en la harina de trigo es el ingrediente esencial responsable de la capacidad de la harina para usar en productos alimenticios horneados. Las enzimas proteolíticas son a veces necesarias para modificar la fase de gluten de la masa, p. ej. una harina de trigo dura puede ser ablandada con una proteasa.
La Neutrase® es una metaloproteasa neutra comercialmente disponible que puede utilizarse para asegurar una calidad de masa uniforme y la textura del pan, y para mejorar el sabor. Las proteínas del gluten son degradadas bien moderadamente o más extensivamente a péptidos, por ello es necesario un control exhaustivo para evitar un reblandecimiento excesivo de la masa.
Las poteasas son también usadas para modificar proteínas de la leche.
Para coagular la caseína en leche en la producción del queso se pueden usar proteasas tales como el cuajo o la quimosina.
En la industria de la fabricación de cerveza, las proteasas son usadas para la fabricación de cerveza con cereales no malteados y para controlar el contenido de nitrógeno.
En los productos de piensos para animales, las proteasas son usadas, por así decir, para expandir el sistema de digestión de los animales.
Lipasas
La aplicación de las lipasas en la industria del horneado es más bien nueva. La adición de lipasa resulta en propiedades mejoradas de la masa y una calidad mejorada de la panificación en cuanto a un volumen más grande, a una estructura mejorada de la miga y un color de la miga más blanco. El efecto observado puede ser explicado por un mecanismo en el que la lipasa cambia la interacción entre el gluten y algún fragmento de los lípidos durante la mezcla de la masa. Esto resulta en una red de gluten mejorada.
El desarrollo de sabor de los quesos azules (p. ej. Danablue), algunos tipos de quesos italianos y otros productos lácteos que contienen manteca son dependientes de la degradación de la grasa láctea en ácidos grasos libres. Las lipasas pueden ser usadas para desarrollar el sabor en estos productos.
En la industria de fabricación del aceite y de la grasa, las lipasas se usan p. ej. para minimizar la cantidad de subproductos indeseables, para modificar las grasas por interesterificación, y para la síntesis de ésteres.
Oxidorreductasas
Las oxidorreductasas adicionales con alergenicidad reducida según la invención pueden ventajosamente ser usadas para la producción de alimentos y piensos.
Diferentes oxidorreductasas son usadas para el horneado, glucosa- oxidasa, lipoxigenasa, peroxidasa, catalasa y combinaciones de las mismas. Generalmente, los panaderos refuerzan el gluten añadiendo ácido ascórbico y bromato de potasio. Algunas oxidorreductasas pueden utilizarse para reemplazar el bromato en sistemas de masa por oxidación de unidades de sulfhidrilo libres en proteínas de gluten. De este modo, se forman enlaces disulfuro dando como resultado, masas más elásticas y más fuertes con mayor resistencia.
Gluzyme® (Novo Nordisk A/S) es una preparación de glucosa-oxidasa con actividad catalasa que puede utilizarse para reemplazar el bromato. El fortalecimiento de la masa se mide como una mayor resistencia al impacto mecánico, mejor subida de la masa en el horno y un volumen de la rebanada más grande.
Carbohidrasas
La harina tiene un contenido variable de amilasas conduciendo a diferencias en la calidad del horneado. La adición de amilasas puede ser necesaria para estandarizar la harina. Las amilasas y pentosanasas generalmente proporcionan azúcar para la fermentación de la levadura, mejoran el volumen del pan, retrasan la retrogradación, y reducen el nivel de endurecimiento y la pegajosidad que resulta de las gomas de pentosano. Ejemplos de carbohidrasas están dados más abajo.
Algunas amilasas maltogénicas pueden ser usadas para prolongar el tiempo de conservación del pan durante dos o más días sin provocar gomosidad en el producto. Selectivamente modifican el almidón gelatinizado mediante el seccionamiento del extremo no reductor de las moléculas de almidón, azúcares de bajo peso molecular y dextrinas. El almidón es modificado de manera que sea menos probable que ocurra la retrogradación. Los azúcares de bajo peso molecular producidos mejoran la capacidad de retención de agua de los productos horneados sin crear dextrinas de longitud intermedia las cuales producen una gomosidad en el producto acabado. La enzima es inactivada durante el horneado del pan, de modo que puede ser considerada un adyuvante del tratamiento que no tiene que estar especificado en la etiqueta. Una sobredosis de Novamyl puede prácticamente ser excluida.
El volumen del pan puede ser mejorado por las \alpha-amilasas fúngicas que además proporcionan una estructura buena y uniforme de la miga del pan. Dichas \alpha-amilasas son endoenzimas que producen maltosa, dextrinas y glucosa. Las \alpha-amilasas de cereales y algunas bacterianas son inactivadas a temperaturas por encima de la temperatura de gelatinización del almidón, en consecuencia cuando se añaden a una masa de trigo resulta en un volumen del pan bajo y un interior del pan pegajoso. Fungamyl tiene la ventaja de ser termolábil y es inactivada justo debajo de la temperatura de gelatinización.
Las preparaciones enzimáticas que contienen varias actividades de pentosanasa y hemicelulasa pueden mejorar la manipulación y estabilidad de la masa, y mejora la frescura, la estructura de la miga y el volumen del pan.
Mediante la hidrolización de la fracción de pentosanas en harina, se perderá una gran cantidad de su capacidad higroscópica, y el agua luego estará disponible para el almidón y el gluten. El gluten se vuelve más plegable y extensible, y el almidón se gelatiniza más fácilmente. Las pentosanasas pueden ser usadas en combinación con o como una alternativa a los emulsionantes.
Carbohidrasas adicionales son usadas para producir jarabes de almidón, que son muy usados en refrescos, dulces, productos cárnicos, productos lácteos, productos de pan, helado, alimentos para bebés, mermelada etc.
La conversión del almidón normalmente se realiza en tres fases.
Primero el almidón es licuado, por el uso de las \alpha-amilasas. Se obtienen maltodextrinas, consistiendo primordialmente en oligosacáridos y dextrinas.
La mezcla es luego tratada con una amiloglucosidasa para hidrolizar los oligosacáridos y dextrinas en glucosa. De esta manera, se obtiene un producto más dulce. Si se desean jarabes de maltosa, se pueden usar \beta-amilasas solas o en combinación con una pululanasa (enzima desramificante).
La mezcla de glucosa puede hacerse incluso más dulce por isomerización a fructosa. Para ello se puede usar una glucosa isomerasa inmovilizada.
En la industria del azúcar, es una práctica común acelerar la descomposición del almidón presente en zumos de caña. De ese modo el contenido de almidón en el azúcar en estado crudo se reduce y la filtración en la refinería es simplificada.
Dextranasas adicionales se utilizan para descomponer el dextrano en zumos y jarabes de azúcar crudo.
En la industria del alcohol, las \alpha-amilasas se utilizan ventajosamente para la dilución del almidón en pastas de destilación.
En la industria cervecera, las \alpha-amilasas se usan como complemento de licuefacción.
En la industria lechera, las \beta-galactosidasas (lactasa) se usan para la producción de leche baja lactosa para personas que padecen de mala absorción de la lactosa.
Cuando las bebidas lácteas aromatizadas son producidas a partir de leche tratada con lactasa, la adición de azúcar puede ser reducida sin reducir el dulzor del producto.
En la producción de leche condensada, la cristalización de la lactosa puede ser evitada por el tratamiento de la lactasa, y el riesgo de espesamiento provocado por coagulación de caseína en cristales de lactosa es reducido de este modo.
En la producción de helados hechos de leche tratada con lactasa (o lactosuero) no se formará ningún cristal de lactosa ni se producirá el defecto de la arenosidad.
Otras xilanasas son conocidas para su uso en varias aplicaciones industriales para alimentos/piensos como se describe en WO 94/21785 (Novo Nordisk A/S).
Las \alpha-amilasas son usadas en la industria de los pienso para ser añadidas a los piensos con contenido en cereales para mejorar la digestibilidad del almidón.
Polipéptidos antimicrobianos
Algunas enzimas bacteriolíticas pueden ser usadas p. ej. para lavar carcasas en la industria del envasado de la carne (ver patente estadounidense n°. 5,354,681 de Novo Industri A/S).
Transferasas
Las transglutaminasas con alergenicidad reducida según la invención pueden ventajosamente ser usadas en la fabricación de alimentos y piensos.
Las transglutaminasas tienen la capacidad de reticular proteínas.
Esta propiedad puede ser usada para la gelificación de las fases acuosas que contienen proteínas. Ésta puede ser usada para la producción de productos para untar (WO 96/08156 de Novo Nordisk A/S).
Las transglutaminasas son usadas para la mejora de la calidad del horneado de la harina p. ej. mediante la modificación de harina de trigo que debe ser usada en la preparación de pasteles con propiedades mejoradas, tales como un sabor mejorado, mordido, sensación en la boca y un volumen más alto (ver JP 1-110147).
Además para la producción de materias alimentarias del tipo de la pasta p. ej. usadas como sustituto de la grasa en alimentos como helado, guarniciones, postres congelados, mayonesas y productos para untar bajos en grasa (ver WO 93/22930 de Novo Nordisk A/S).
Además para la preparación de geles para yogur, mousses, quesos, budines, zumos de naranja, productos lácteos y de tipo lácteo, y unión de productos de carne picada, para la mejora del sabor y la textura de proteínas alimentarias (ver WO 94/21120 y WO 94/21129 de Novo Nordisk A/S).
Fitasas
Las fitasas de la invención pueden ventajosamente ser usadas en la fabricación de alimentos, tales como cereales para el desayuno, pasteles, dulces, bebidas, pan o sopa etc., y piensos para animales.
Las fitasas pueden ser usadas para aprovechar el fósforo unido en el fitato/ácido fítico presente en fuentes de proteína vegetal o para aprovechar los minerales nutricionalmente importantes unidos en los complejos de ácido fítico.
La fitasa microbiana puede ser añadida a los productos alimenticios de animales monogástricos para evitar la suplementación del pienso con fósforo inorgánico (ver patente estadounidense n°. 3,297,548).
Otras fitasas pueden ser usadas en el tratamiento de la soja. Los alimentos de soja pueden contener niveles altos del factor antinutritivo del fitato que convierte a esta fuente proteica en inadecuada para la aplicación en alimentos para bebés y alimentos para peces, becerros y otros no rumiantes, puesto que el fitato produce la quelación de los minerales esenciales presentes en el mismo (ver EP 0 420 358).
También para fines del horneado, se pueden usar fitasas. Se puede preparar pan con mejor calidad mediante el horneado de trozos divididos de una masa conteniendo harina de trigo etc. y fitasa (ver JP-0-3076529-A).
Se conoce la utilización de un molde de koki con alta actividad fitasa para producir sake refinado (ver JP-0-6070749-A).
Material y métodos Materiales Enzimas
PD498: proteasa de tipo subtilisina mostrada en WO 93/24623. La secuencia de PD498 está mostrada en SEC ID NO: 1 y 2.
Subtilisina DY: proteasa de tipo subtilisina mostrada en la SEC ID NO: 3 aislada de la variante de Bacillus sp. (Betzel et al. (1993), Archives of Biophysics, Vol. 302, n°. 2, p. 499-502).
\vskip1.000000\baselineskip
Reactivos de ELISA
Ig anti-conejo de cerdo marcado con peroxidasa de rábano (Dako, DK, P217, dilución 1:1000).
IgE anti-ratón de rata (Serotec MCA419; dilución 1:100).
IgE anti-rata de ratón (Serotec MCA193; dilución 1:200).
Anticuerpo monoclonal IgG1 anti-rata de ratón marcado con biotina (Zymed 03-9140; dilución 1:1000)
Anticuerpo monoclonal IgG1 anti-ratón de rata marcado con biotina (Serotec MCA336B; dilución 1:2000)
Peroxidasa de rábano de estreptavidina (Kirkeg\ring{a}rd & Perry 14-30-00; dilución 1:1000).
\vskip1.000000\baselineskip
Tampones y soluciones
- PBS (pH 7.2 (1 litro))
NaCl 8,00 g
KCl 0,20 g
K2HPO4 1,04 g
KH2PO4 0,32 g
- Tampón de lavado PBS; 0,05% (v/v) Tween 20
- Tampón de bloqueo PBS; 2% (peso/v) leche desnatada en polvo
- Tampón de dilución PBS; 0,05% (v/v) Tween 20, 0,5% (peso/v) leche desnatada en polvo
- Tampón de citrato (0,1M, pH 5.0-5.2 (1 litro))
Citrato de Na 20,60 g
Ácido cítrico 6,30 g
- Solución de parada (Tampón DMG)
- Borato sódico, borax (Sigma)
- Ácido 3,3-Dimetil glutárico (Sigma)
- CaCl_{2} (Sigma)
- Tween 20: poli sorbitán de oxietileno mono laurato (Merck cat n°. 822184)
- N-Hidroxi succinimida (Fluka art. 56480)
- Fosgeno (Fluka art. 79380)
- Lactosa (Merck 7656)
- PMSF (fenil metil sulfonil fluoruro) de Sigma
- Succinil-alanina-alanina-prolina-fenilalanina-para-nitroanilida (Suc-AAPF-pNP) Sigma no. S-7388, PM 624,6 g/mol.
- mPEG (Fluka)
\vskip1.000000\baselineskip
Sustrato colorante
OPD: o-fenileno-diamina, (Kementec cat n°. 4260)
\vskip1.000000\baselineskip
Animales de experimentación
Ratas Brown Norway (de Charles River, DE)
\vskip1.000000\baselineskip
Equipamiento
XCEL II (Novex)
Lector Elisa (UVmax, Molecular Devices)
HPLC (Waters)
PFLC (Pharmacia)
Columna Superdex-75, Mono-Q, mono S de Pharmacia, SW.
SLT: Fotómetro de SLT Labinstruments
Cromatógrafo de exclusión por tamaño (Spherogel TSK-G2000 SW).
Cromatógrafo de exclusión por tamaño (Superdex 200, Pharmacia, SW)
Célula Amicon
\vskip1.000000\baselineskip
Métodos Estimulación Intratraqueal (IT) de ratas Brown Norway
Para la administración IT de moléculas, se usan jeringas desechables con una sonda metálica de 2½'' de largo. Esta sonda se implanta en la tráquea de las ratas aproximadamente 1 cm por debajo de la epiglotis, y se deposita 0,1 ml de una solución de las moléculas.
Los animales de experimentación son ratas Brown Norway (BN) en grupos de 10. El peso en el momento del inicio es superior a 200 gramos y al final es de aproximadamente 450 gramos.
\vskip1.000000\baselineskip
Procedimiento de ELISA para determinar concentraciones relativas de anticuerpos IgE en ratas Brown Norway
Se utiliza un sándwich ELISA de tres capas para determinar concentraciones relativas de anticuerpos de suero IgE específicos.
1) recubrir la placa de ELISA con 10 mg de Tampón 1 de IgE anti-rata de ratón (50 microL/pocillo). Incubar durante la noche a 4°C.
2) Vaciar las placas y bloquear con tampón de bloqueo durante al menos ½ hora a la temperatura ambiente (200 microL/pocillo). Agitar suavemente. Lavar las placas 3 veces con tampón de lavado.
3) Incubar con sueros de rata (50 microL/pocillo), empezando por aquellos no diluidos y continuar con diluciones en 2 veces. Mantener algunos pocillos libres para el tampón 4 sólo (en blanco). Incubar durante 30 minutos a la temperatura ambiente. Agitar suavemente. Lavar las placas 3 veces en tampón de lavado.
4) Diluir la enzima en un tampón de dilución hasta la concentración de proteína apropiada. Incubar 50 microL/pocillo durante 30 minutos a la temperatura ambiente. Agitar suavemente. Lavar las placas 3 veces en un tampón de lavado.
5) Diluir el suero de antisuero antienzima policlonal específico (plg) para detectar el anticuerpo unido en el tampón de dilución. Incubar 50 microL/pocillo durante 30 minutos a la temperatura ambiente. Agitar suavemente. Lavar las placas 3 veces en tampón de lavado.
6) Diluir anti-plg-anticuerpo conjugado con peroxidasa de rábano en tampón de dilución. Incubar 50 microL/pocillo a temperatura ambiente durante 30 minutos. Agitar suavemente. Lavar las placas 3 veces en tampón de lavado.
7) Mezclar 0,6 mg ODP/ml + 0,4 microL H2 O2/ml en tampón de sustrato. Hacer la solución justo antes del uso. Incubar durante 10 minutos. 50 microL/pocillo.
8) Para parar la reacción, añadir 50 microL de solución de parada/pocillo.
9) Leer las placas a 492 nm con 620 nm como referencia. Los datos se calculan y se presentan en Lotus.
\vskip1.000000\baselineskip
Determinación del peso molecular
La separación electroforética de proteínas fue realizada por métodos estándares usando geles de poliacrilamida SDS del 4-20% de gradiente (Novex). Las proteínas fueron detectadas por coloración de plata. El peso molecular fue medido con respecto a la movilidad de los pesos moleculares estándares de gama amplia Mark-12® de
Novex.
\vskip1.000000\baselineskip
Actividad de la proteasa Análisis con Suc-Ala-Ala-Pro-Phe-pNa
Las proteasas seccionan el enlace entre el péptido y la p-nitroanilina para dar un color amarillo visible absorbente a 405 nm.
Tampón: p. ej. Tampón Britton y Robinson pH 8.3 sustrato: 100 mg de Suc-AAPF-pNA es disuelto en 1 ml de dimetilsulfóxido (DMSO). 100 ml de éste se diluyen en 10 ml con tampón Britton y Robinson.
\vskip1.000000\baselineskip
Análisis
El sustrato y la solución de proteasa se mezclan y la absorbencia es vigilada a 405 nm como función de tiempo y ABS_{405\ nm}/min. La temperatura debería ser controlada (20-50°C dependiendo de la proteasa). Ésta es una medida de la actividad de la proteasa en la muestra.
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplos
Ejemplo 1
Activación de mPEG 350 con N-succinimidil carbonato
mPEG 350 fue disuelto en tolueno (4 ml/g de mPEG). Aproximadamente el 20% fue destilado a presión normal para secar los reactivos azeotrópicamente. La solución fue enfriada a 20°C y el fosgeno fue añadido en tolueno (1,93 M 1,5 mol/mol mPEG). La mezcla fue luego agitada a la temperatura ambiente durante la noche. La mezcla fue evaporada bajo presión reducida y el cloroformato intermedio se obtuvo como un aceite.
Después de la evaporación el diclorometano y tolueno (1:2, seco 4 ml/g mPEG) fue añadido para redisolver el aceite incoloro. N-Hidroxi succinimida (NHS) (1,5 mol/mol mPEG.) fue añadida como un sólido y luego trietilamina (1,1 mol/mol mPEG) a 0°C. La precipitación inmediata del hidrocloruro de trietilamina (Et_{3}N.HCl) pudo ser observada. La mezcla fue agitada durante toda la noche a la temperatura ambiente. La mezcla fue filtrada usando frita de vidrio (G5) para eliminar el Et_{3}N.HCl. El filtrado presión fue evaporado a sequedad bajo presión reducida para producir 98% (mol/mol) de un aceite. RMN indicando una activación del 85 - 95% y <10% (mol/mol) HNEt_{3}Cl. ^{1}H-RMN para mPEG 350 succinimidilcarbonato (CDCl_{3}) d 1,42 t (l=1,4 CH_{3} en HNEt_{3}Cl); 2,68 s (l=3,4 NHS no reaccionado); 2,84 s (1= 6,2 succinimida ); 3,10 dq (1= 1,0 CH_{2} en HNEt_{3}Cl); 3,38 s (1=5,8 CH_{3} en OMe); 3,64 bs (l=50 pico principal); 4,47 t (l=3,0; CH_{2} en PEG).
\newpage
Ejemplo 2
Conjugación de proteasa PD498 con mPEG 350 activado
62 mg de PD498 fueron incubados en 50 mM de borato sódico, pH 9.7, con 20 mg (\approx200 \mul) de mPEG activado 350 con N-succinimidil carbonato (preparado conforme al Ejemplo 1), en un volumen final de 6 ml. La reacción se efectuó a la temperatura ambiente usando agitación magnética. El tiempo de reacción fue de 2 horas. La reacción fue detenida añadiendo 0,5 M de ácido succínico a un pH final de 6.0. El peso molecular del derivado obtenido fue de aproximadamente 33 kDa, correspondiendo a aproximadamente 11 moles de mPEG unido por mol de
PD498.
En comparación con la enzima progenitora, la actividad residual fue próxima al 100% hacia el sustrato peptídico (succinil-Ala-Ala-Pro-Phe-p-Nitroanilida).
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo 3
Conjugación de proteasa subtilisina DY con mPEG 350 activado
Subtilisina DY fue conjugada con mPEG 350 con carbonato de N-succinimidil usando el mismo procedimiento que se describe en el ejemplo 2.
Como será evidente para los expertos en la materia, a la luz de la descripción precedente, muchas alteraciones y modificaciones son posibles en la práctica de esta invención sin salirse del espíritu u objetivo de la misma. Por consiguiente, el objetivo de la invención debe ser interpretado conforme a la sustancia definida por las reivindicaciones siguientes.
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo 4
Ensayos intratraqueales (IT) de ratas Brown Norway de conjugados PD498 de polímeros pequeños de mPEG
Las muestras de PD498 con concentración de proteínas conocida (medida por densidad óptica y análisis de secuencia de aminoácidos para derivados) fueron diluidas a 0,75 microG de proteína/ml.
Las muestras diluidas fueron alicuotadas en fracciones de 1,5 ml para inmunizaciones individuales. Estas fracciones fueron almacenadas bajo condiciones estables a -20°C hasta el uso. Los análisis fueron realizados al principio y al final del estudio. Para cada inmunización y para cada análisis se tomó una fracción nueva.
Los conjugados de enzimas fueron conjugados con carbonato N-succinimidilo mPEG 350, 550, 750 activado como se ha descrito en los ejemplos anteriores. Las enzimas correspondientes progenitoras fueron usadas como controles. Las muestras siguientes fueron evaluadas:
Grupo 1: PD498 (enzima progenitora no acoplada - control)
Grupo 2: PD498-SPEG 750
Grupo 3: PD498-SPEG 550
Grupo 4: PD498-SPEG 350
Las ratas fueron inmunizadas 15 veces por semana con 100 microL de una solución de Nacl al 0,9% (peso./vol) (grupo de control), o 100 microL de las diluciones de proteínas PD498 mencionadas arriba.
Cada grupo comprendía 10 ratas Brown Norway. Se recogieron muestras de sangre (2 ml) de los ojos una semana después de cada segunda inmunización, pero antes de la inmunización siguiente. El suero se obtuvo por coagulación sanguínea, y centrifugación.
Los niveles IgE específicos fueron determinados usando el ensayo de ELISA específico para IgE de rata anteriormente descrito. Los sueros fueron titulados a ½ dilución, empezando a partir de los no diluidos. La densidad óptica fue medida a 492/620 nm.
El resultado de los procesos IT están mostrados en la siguiente tabla que ilustra la densidad óptica total por 100 microL de suero al final del estudio, como se observa en ratas Brown Norway con los derivados de PD498 respectivos.
El resultado del los ensayos del conjugado de PD498 está mostrado en la tabla 1 abajo:
TABLA 1
2 
\vskip1.000000\baselineskip
Como se puede observar de la tabla 1 el nivel de respuesta de la IgE específica de las ratas expuestas intratraquealmente con el conjugado de PD498 con polímeros pequeños acoplados al mismo se ha reducido en comparación con las ratas que han sido expuestas intratraquealmente con las enzimas progenitoras no modificadas. De este modo, se ha reducido la alergenicidad.
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo 5
Los ensayos (IT) intraraqueales de ratas Brown Norway de un conjugado de subtilisina DY
El estudio IT de ratas Brown Norway descrito en el ejemplo 4 fue repetido comparando un conjugado de subtilisina DY-SPEG750 con la enzima Subtilisina DY progenitora correspondiente (ver SEC ID NO: 3).
El resultado del ensayo de Subtilisina DY-SPEG750 está mostrado en la tabla 2:
TABLA 2
3
118
De este modo, la alergenicidad es reducida.
\newpage
Ejemplo 6
Formulaciones para el cuidado de la piel que comprenden un conjugado PD498-SPEG
Las siguientes formulaciones para el cuidado de la piel comprendiendo los conjugados de la invención fueron preparadas:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
119
120 
\vskip1.000000\baselineskip
Referencias citadas en la descripción
Esta lista de referencias citada por el solicitante ha sido recopilada únicamente para la conveniencia lector. No forma parte del documento de patente europea. Aunque se ha tenido bastante cuidado al redactar las referencias, no se pueden excluir errores u omisiones y la OEP renuncia a toda responsabilidad en este sentido.
Patentes citadas en la descripción
US 9179337 B [0006]
WO 9617929 A [0007]
US 5414135 A, 1995 [0046]
US 5122614 A, 1992 [0051] [0054]
EP 632082 A1, Looze, Y, 1993 [0051]
US 5349001 A, Greenwald, 1994 [0053]
US 4179337 A, Davis, 1979 [0055]
US 5321095 A, Greenwald, R. B, 1994 [0056]
WO 9511924 A, Greenwald [0058]
WO 9324623 A [0074] [0183]
JP 04197182 A [0074]
EP 258068 A [0079]
EP 305216 A [0079]
EP 238023 A [0079]
WO 9613578 A [0079]
EP 214761 A [0079]
EP 218272 A [0079]
EP 331376 A [0079]
WO 9514783 A [0079]
JP 64744992 B [0079]
WO 9116422 A [0079]
WO 8809367 A [0079]
WO 9009446 A [0079]
WO 9600290 A [0080] [0097]
WO 9533836 A [0080] [0097]
WO 9606931 A [0081]
WO 9622366 A [0081]
WO 9501425 A [0082]
US 5490980 A [0102]
US 5525336 A [0103]
JP 3083908 B [0104]
WO 9313256 A [0132]
WO 9320278 A [0135]
WO 9421785 A [0168]
US 5354681 A [0170]
JP 1110147 A [0174]
WO 9322930 A [0175]
WO 9421120 A [0176]
WO 9421129 A [0176]
US 3297548 A [0179]
EP 0420358 A [0180]
JP 03076529 A [0181]
JP 06070749 A [0182]
Bibliografía distinta de patentes citada en la descripción
KIMBER et al. Fundamental and Applied Toxicology, 1996, vol. 33, 1-10 [0034]
R. F. TAYLOR Protein immobilisation. Fundamental and applications Marcel Dekker, 1991. [0042]
S. S. WONG Chemistry of Protein Conjugation and Crosslinking CRC Press, 1992. [0042]
G. T. HERMANSON et al. Immobilized Affinity Ligand Techniques Academic Press, 1993. [0042]
POLLAK et al. J. Amr. Chem. Soc, 1976, vol. 98, 289-291 [0044]
WONG et al. Chemistry of Protein Conjugation and Crosslinking CRC Press, 1992. [0044]
NILSSON et al. Methods in Enzymology Academic Press 1984. vol. 104, 56-66 [0048]
NILSSON et al. Methods in Enzymology Academic Press 1987. vol. 135, 65-79 [0048]
SCOUTEN et al. Methods in Enzymology Academic Press 1987. vol. 135, 79-84 [0048]
CROSSLAND et al. J. Amr. Chem. Soc, 1971, vol. 93, 4217-4219 [0048]
HARRIS et al. J. Polym. Sci. Polym. Chem. Ed, 1984, vol. 22, 341-352 [0048]
ZALIPSKY Bioconjugate Chem, 1995, vol. 6, 150-165 [0050]
ZALIPSKY et al. Biotechnol. Appl. Biochem., 1992, vol. 15, 100-114 [0051]
MONFARDINI et al. Bioconjugate Chem, 1995, vol. 6, 62-69 [0051]
ALLEN et al. Carbohydr. Res, 1991, vol. 213, 309-319 [0051]
ABUCHOWSKI et al. J. Biol. Chem., 1977, vol. 252, 3578-3581 [0055]
SHAFER et al. J. Polym. Sci. Polym. Chem. Ed, 1986, vol. 24, 375-378 [0055]
THOMAS E. CREIGHTON Proteins W. H. Freeman and Company 1993. [0059]
SHERIFF et al. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1987, vol. 84, 8075- [0066]
E. C. 1 Enzyme Nomenclature Academic Press, Inc 1992. [0072]
OSTEN et al. Journal of Biotechnology, 1993, vol. 28, 55- [0074]
GUNKEL et al. Eur. J. Biochem, 1989, vol. 179, 185-194 [0074]
SAMAL et al. Mol. Microbiol, 1990, vol. 4, 1789-1792 [0074]
SAMAL et al. Gene, 1989, vol. 85, 329-333 [0074]
BETZEL et al. Arch. Biophys, 1993, vol. 302, no. 2. 499-502 [0074]
TITANI et al. Nature New Biol, 1972, vol. 238, 35-37 [0074]
DARTOIS et al. Biochemica et Biophysica acta, 1993, vol. 1131, 253-260 [0079]
R. L. GOLDEMBERG DCI, vol. 93, 48-52 [0100]
Cosmetics and Toiletries 1991. [0108]
Surfactants in Consumer Products Spring-Verlag 1987. [0108]
BETZEL et al. Archives of Biophysics, 1993, vol. 302, no. 2. 499-502 [0183]
\global\parskip0.000000\baselineskip
(1) INFORMACIÓN GENERAL:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
SOLICITANTE:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
NOMBRE: Novo Nordisk A/S
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
CALLE: novo Alle
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
CIUDAD: Bagsveard
\vskip0.500000\baselineskip
(E)
PAÍS: Dinamarca
\vskip0.500000\baselineskip
(F)
CÓDIGO POSTAL (CÓDIGO ZIP): DK-2880
\vskip0.500000\baselineskip
(G)
TELÉFONO: +45 4444 8888
\vskip0.500000\baselineskip
(H)
TELEFAX: +45 4449 3256
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TÍTULO DE LA INVENCIÓN: enzima modificada para el cuidado de la piel
\vskip0.800000\baselineskip
(iii)
NÚMERO DE SECUENCIAS: 5
\vskip0.800000\baselineskip
(iv)
FORMA DE LECTURA INFORMÁTICA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
TIPO DE MEDIO: disquete
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
ORDENADOR: PC IBM compatible
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
SISTEMA OPERATIVO: PC-DOS/MS-DOS
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
SOFTWARE: Patent In Release #1.0, versión #1.30 (OEP)
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN DE LA SEC ID N°: 1:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA.
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 840 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
TIPO DE CADENA: único
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico)
\vskip0.800000\baselineskip
(vi)
FUENTE ORIGINAL:
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
CEPA: bacillus sp. PD498, NCIMB n°. 40484
\vskip0.800000\baselineskip
(ix)
CARACTERÍSTICA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
NOMBRE/CLAVE: CDS
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
UBICACIÓN:1..840
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID NO: 1:
4 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN DE LA SEC ID N°: 2:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 280 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: proteína
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID NO: 2:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
5 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN DE LA SEC ID N°: 3:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 274 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
TIPO DE CADENA: único
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: proteína
\vskip0.800000\baselineskip
(vi)
FUENTE ORIGINAL:
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
CEPA: variante de bacillus sp.
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID NO: 1:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
6 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN DE LA SEC ID N°: 4:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 433 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
TIPO DE CADENA:
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: proteína
\vskip0.800000\baselineskip
(vi)
FUENTE ORIGINAL:
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
CEPA: Bacillus sp. Y
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID NO: 1:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
7
8 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN DE LA SEC ID N°: 5:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 316 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
TIPO DE CADENA: único
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: proteína
\vskip0.800000\baselineskip
(vi)
FUENTE ORIGINAL:
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
CEPA: Bacillus Thermoproteolyticus 
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
descripción de la secuencia: SEC ID NO: 5:
9

Claims (15)

1. Composición que no está destinada a ser introducida en el sistema circulatorio, que comprende un polipéptido modificado caracterizado por el hecho de que
a) el polipéptido modificado ha sido modificado acoplando moléculas poliméricas con un peso molecular de 100 hasta 750 Da, de manera covalente al polipéptido progenitor que tiene un peso molecular de 5 a 100 kDa, y
b) la alergenicidad respiratoria del polipéptido modificado en a) es reducida en comparación con el polipéptido progenitor cuando se mide por estimulación intratraqueal, y con la condición de que el polipéptido no sea insulina.
2. Composición según la reivindicación 1, donde el polipéptido progenitor, en particular una enzima, tiene un peso molecular de 15 a 60 kDa.
3. Composición según cualquiera de las reivindicaciones 1 y 2, donde de 1 a 100 moléculas poliméricas, preferiblemente de 4 a 50, especialmente de 5 a 35 moléculas poliméricas, están acopladas de manera covalente a la enzima progenitora.
4. Composición según las reivindicaciones 1 a 3, donde la molécula polimérica está seleccionada del grupo comprendiendo homo y heteropolímeros naturales o sintéticos.
5. Composición según la reivindicación 4, donde la molécula polimérica está seleccionada del grupo comprendiendo moléculas sintéticas poliméricas incluyendo de PEGs ramificados, poli-vinil alcohol (PVA), ácidos poli-carboxilicos, poli (vinilpirolidona) y poli-D,L-aminoácidos.
6. Composición según la reivindicación 4, donde la molécula polimérica está seleccionada del grupo comprendiendo moléculas de origen natural polimérico incluyendo dextranos, incluyendo carboximetil-dextranos, y celulosas tales como metilcelulosa, carboximetilcelulosa, etilcelulosa, hidroxietilcelulosa, hidroxipropilcelulosa, e hidrolizados de quitosano, almidones, tales como hidroxietil-almidones, hidroxipropil-almidones, glicógeno, agarosa, goma guar, inulina, pululanos, gomas de xantano, carragenina, pectina y ácido algínico.
7. Composición según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, donde el polipéptido es de origen microbiano, tal como, de origen bacteriano, filamentoso, fúngico o de levadura.
8. Composición según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7, donde el polipéptido es una enzima del grupo de la hidrolasa, incluyendo proteasas, incluyendo serina proteasas, tales como subtilisinas y metaloproteasas, o lipasas, u oxidorreductasas, tales como una lacasa, o superóxido-dismutasa.
9. Composición según la reivindicación 8, donde la metaloproteasa es Termolisina mostrada en la SEC ID NO: 5.
10. Composición según la reivindicación 1 donde la composición comprende ingredientes conocidos para ser usados en composiciones de cuidado personal, especialmente en composiciones para el cuidado de la piel.
11. Producto para el cuidado de la piel que comprende una composición según la reivindicación 10, donde el producto es un producto del grupo del jabón, cosméticos, cremas para la piel, leche para la piel, loción para la piel, gel para la piel, crema limpiadora, loción limpiadora, leche limpiadora, crema base, jabón en crema, base de maquillaje, loción láctea, máscara, loción de calamina, esencia para la zona T, crema de manos, polvo de esencia, polvo blanqueador, jabón en polvo, tarta de jabón, jabón transparente, crema de labios, lápiz de labios, esencia nutritiva, base cremosa, polvos para la cara, sombra de ojos en polvo, base en polvo, quitaesmalte, tónico para el pelo, líquido para el pelo, crema para el pelo, gel para el pelo, tratamiento para el pelo, preparaciones fijadoras para el pelo, tintes para el pelo, colorantes para el pelo, tratamiento del cuero cabelludo, champú, bálsamo, enjuague para el pelo, aceite solar en espray para el pelo, pantalla solar, espuma de afeitar, crema de afeitar, aceite para bebés, productos antiacné, desodorantes, repelentes de insectos, desodorantes.
12. Composición según la reivindicación 1, siendo un detergente, tal como una composición de detergente para el lavado de la ropa, composición de lavavajillas, o composición para la limpieza de superficies duras.
13. Composición según la reivindicación 1, siendo una composición, tal como un aditivo para alimentos o para piensos, especialmente un aditivo para la panificación o similares.
14. Composición según la reivindicación 1, siendo una composición para tratar textiles.
15. Uso de un polipéptido modificado, donde el peso molecular de las moléculas poliméricas acopladas al polipéptido se encuentra en la gama entre 100 y 750 Da para reducir la alergenicidad respiratoria de las composiciones según la reivindicación 1.
ES98928182T 1997-06-25 1998-06-22 Polipeptido modificado. Expired - Lifetime ES2296336T3 (es)

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
DK75397 1997-06-25
DK753/97 1997-06-25

Publications (1)

Publication Number Publication Date
ES2296336T3 true ES2296336T3 (es) 2008-04-16

Family

ID=8097153

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
ES98928182T Expired - Lifetime ES2296336T3 (es) 1997-06-25 1998-06-22 Polipeptido modificado.

Country Status (11)

Country Link
US (1) US6303752B1 (es)
EP (1) EP1002064B1 (es)
JP (1) JP2002516615A (es)
CN (1) CN100335624C (es)
AT (1) ATE375387T1 (es)
AU (1) AU751880B2 (es)
CA (1) CA2294567A1 (es)
DE (1) DE69838551T2 (es)
DK (1) DK1002064T3 (es)
ES (1) ES2296336T3 (es)
WO (1) WO1999000489A1 (es)

Families Citing this family (46)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US6958148B1 (en) 1998-01-20 2005-10-25 Pericor Science, Inc. Linkage of agents to body tissue using microparticles and transglutaminase
US6919076B1 (en) 1998-01-20 2005-07-19 Pericor Science, Inc. Conjugates of agents and transglutaminase substrate linking molecules
AU2003203147B2 (en) 1998-03-23 2008-05-29 Novozymes A/S Phytase variants
WO1999049056A1 (en) 1998-03-26 1999-09-30 The Procter & Gamble Company Serine protease variants having amino acid substitutions
US6908757B1 (en) 1998-03-26 2005-06-21 The Procter & Gamble Company Serine protease variants having amino acid deletions and substitutions
US6495136B1 (en) 1998-03-26 2002-12-17 The Procter & Gamble Company Proteases having modified amino acid sequences conjugated to addition moieties
CA2376045A1 (en) 1999-07-22 2001-02-01 The Procter & Gamble Company Subtilisin protease variants having amino acid substitutions in defined epitope regions
CZ2002171A3 (cs) * 1999-07-22 2002-06-12 The Procter & Gamble Company Proteinázový konjugát, čistící prostředek a prostředek osobní péče
MXPA02000837A (es) * 1999-07-22 2002-07-30 Procter & Gamble Conjugados de proteasa que tienen regiones epitopes protegidas estericamente.
CA2379712A1 (en) 1999-07-22 2001-02-01 The Procter & Gamble Company Subtilisin protease variants having amino acid deletions and substitutions in defined epitope regions
AU2002345938A1 (en) 2001-06-28 2003-03-03 Mountain View Pharmaceuticals, Inc. Polymer stabilized proteinases
WO2003037915A1 (en) * 2001-10-31 2003-05-08 Biopolymed Inc. Biocompatible polymers including peptide spacer
FR2840215B1 (fr) * 2002-06-03 2004-08-27 Oreal Composition contenant un actif susceptible d'etre oxyde par un hydroperoxyde, une lipoxygenase et un substrat et procede mettant en oeuvre cette composition
DE602004027376D1 (de) 2003-06-19 2010-07-08 Novozymes As Proteasen
US20060236414A1 (en) 2003-06-19 2006-10-19 Novozymes A/S Proteases and methods for producing them
EP2308966A1 (en) 2003-10-10 2011-04-13 Novozymes A/S Protease variants
EP2258839B1 (en) 2004-06-21 2015-06-03 Novozymes A/S Proteases
DE102004041570A1 (de) * 2004-08-26 2006-03-02 Henkel Kgaa Mittel zur enzymatischen Vorbehandlung zu färbender keratinischer Fasern
WO2006032278A1 (en) * 2004-09-21 2006-03-30 Novozymes A/S Subtilases
WO2006032277A1 (en) * 2004-09-21 2006-03-30 Novozymes A/S Subtilases
AR050895A1 (es) 2004-10-04 2006-11-29 Novozymes As Polipeptidos que tienen actividad de fitasa y polinucleotidos que los codifican
EP1809747B1 (en) 2004-10-04 2016-12-14 Novozymes A/S Polypeptides having phytase activity and polynucleotides encoding same
EP1700904A1 (en) 2005-03-11 2006-09-13 Unilever N.V. Liquid detergent composition
EP1700907A1 (en) 2005-03-11 2006-09-13 Unilever N.V. Liquid bleaching composition
ES2403733T3 (es) 2005-10-05 2013-05-21 Commonwealth Scientific And Industrial Research Organisation Proteínas de seda
US7776339B2 (en) * 2006-01-11 2010-08-17 Active Organics, Lp Extract of R. miehei
WO2007107573A1 (en) 2006-03-22 2007-09-27 Novozymes A/S Use of polypeptides having antimicrobial activity
DK2365064T3 (en) 2006-04-04 2015-03-30 Novozymes As Phytasevarianter
CN101854960B (zh) 2006-12-15 2014-06-25 生命连结有限公司 明胶-转谷氨酰胺酶止血敷料和密封材料
RU2009128067A (ru) 2006-12-21 2011-01-27 Новозимс А/С (Dk) Варианты липаз для их применения в фармацевтике
US8221743B2 (en) 2006-12-22 2012-07-17 Novozymes A/S Use of polypeptides against diseases caused by protozoans
JP5643083B2 (ja) 2007-03-26 2014-12-17 ノボザイムス アクティーゼルスカブ ハフニア・フィターゼ
ES2330291B1 (es) * 2008-02-29 2010-10-18 Lipotec Sa Peptidos utiles en el tratamiento de la piel, mucosas y/o cuero cabelludo y su uso en composiciones cosmeticas o farmaceuticas.
WO2009153748A2 (en) * 2008-06-18 2009-12-23 Lifebond Ltd Methods and devices for use with sealants
EP2487206A3 (en) 2008-06-18 2012-11-28 Lifebond Ltd Cross-linkable gelatin-based compositions
WO2009153751A2 (en) * 2008-06-18 2009-12-23 Lifebond Ltd A method for enzymatic cross-linking of a protein
EP2933329B1 (en) 2008-09-26 2017-05-17 Novozymes A/S Hafnia phytase variants
US20100316764A1 (en) * 2009-06-10 2010-12-16 Engrain, LLC Flour supplement compositions and methods for preparing wheat flour
SG178870A1 (en) 2009-08-26 2012-04-27 Commw Scient Ind Res Org Processes for producing silk dope
US9066991B2 (en) 2009-12-22 2015-06-30 Lifebond Ltd. Modification of enzymatic crosslinkers for controlling properties of crosslinked matrices
DK2600910T3 (en) 2010-08-05 2016-04-04 Lifebond Ltd Wound dressings and adhesives COMPREHENSIVE DRYING FORMATIONS
JP6317258B2 (ja) 2011-11-16 2018-04-25 コモンウェルス サイエンティフィック アンド インダストリアル リサーチ オーガナイゼーション コラーゲン様絹遺伝子
CA2904749A1 (en) 2012-03-26 2013-10-03 Commonwealth Scientific And Industrial Research Organisation Silk polypeptides
CN108690841B (zh) * 2018-02-08 2021-10-01 河南科技学院 一种mPEG-Mal5000修饰β-淀粉酶的方法
US11998654B2 (en) 2018-07-12 2024-06-04 Bard Shannon Limited Securing implants and medical devices
CA3189083A1 (en) 2020-08-13 2022-02-17 Novozymes A/S Phytase variants and polynucleotides encoding same

Family Cites Families (12)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
DE2215539C2 (de) * 1972-03-30 1984-08-02 Bayer Ag, 5090 Leverkusen Neue wasserunlösliche Enzym-, insbesondere Penicillinacylase-oder Enzyminhibitor-Präparate
US4179337A (en) * 1973-07-20 1979-12-18 Davis Frank F Non-immunogenic polypeptides
US4640835A (en) * 1981-10-30 1987-02-03 Nippon Chemiphar Company, Ltd. Plasminogen activator derivatives
JP2521504B2 (ja) * 1985-12-27 1996-08-07 昭和電工株式会社 酵素の造粒法
US5216131A (en) * 1989-02-23 1993-06-01 Genentech, Inc. Lymphocyte homing receptors
US5122614A (en) * 1989-04-19 1992-06-16 Enzon, Inc. Active carbonates of polyalkylene oxides for modification of polypeptides
DE3929531A1 (de) * 1989-09-06 1991-03-07 Hoechst Ag Proteasegen aus bacillus thermoproteolyticus rokko, verfahren zu seiner gewinnung und seine verwendung
US5492821A (en) * 1990-11-14 1996-02-20 Cargill, Inc. Stabilized polyacrylic saccharide protein conjugates
CA2101361A1 (en) * 1992-08-27 1994-02-28 Robert A. Snow Low diol polyalkylene oxide biologically active proteinaceous substances
DE4231266A1 (de) * 1992-09-18 1994-03-24 Boehringer Mannheim Gmbh Dextran modifizierte Glutamat-Dehydrogenase
FI972443L (fi) * 1994-12-07 1997-06-09 Novo Nordisk As Polypeptidi, jonka allergeenisuus on vähentynyt
US5932462A (en) * 1995-01-10 1999-08-03 Shearwater Polymers, Inc. Multiarmed, monofunctional, polymer for coupling to molecules and surfaces

Also Published As

Publication number Publication date
DK1002064T3 (da) 2008-02-04
ATE375387T1 (de) 2007-10-15
CA2294567A1 (en) 1999-01-07
WO1999000489A1 (en) 1999-01-07
DE69838551T2 (de) 2008-07-24
DE69838551D1 (de) 2007-11-22
AU8012298A (en) 1999-01-19
JP2002516615A (ja) 2002-06-04
EP1002064B1 (en) 2007-10-10
CN100335624C (zh) 2007-09-05
EP1002064A1 (en) 2000-05-24
CN1265142A (zh) 2000-08-30
US6303752B1 (en) 2001-10-16
AU751880B2 (en) 2002-08-29

Similar Documents

Publication Publication Date Title
ES2296336T3 (es) Polipeptido modificado.
AU725287B2 (en) Conjugation of polypeptides
ES2220114T3 (es) Variantes de proteinas poco alergenicas.
AU736806B2 (en) A modified enzyme for skin care
AU697440B2 (en) Polypeptide with reduced allergenicity
ES2289824T3 (es) Proteinas glicosiladas con alergenicidad reducida.
US6106828A (en) Conjugation of polypeptides
WO1996040791A1 (en) Modification of polypeptides
EP1088059B1 (en) A polypeptide-polymer conjugate
US6416756B1 (en) Modified protease having 5 to 13 covalently coupled polymeric molecules for skin care
JP2002520049A (ja) 改良された洗浄性能を有するポリペプチド−ポリマー接合体
US6638526B1 (en) Polypeptides conjugated to copolymers of ethylene oxide and propylene oxide to reduce allergenicity
MXPA00001104A (es) Polipeptidos modificados con actividad alta y caracter alergenico reducido