ES2403733T3 - Proteínas de seda - Google Patents

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Abstract

Un polipéptido de seda recombinante y/o purificado, en el que al menos una porción del polipéptido tiene unaestructura en superhélice y en el que el polipéptido comprende una secuencia seleccionada de: i) una secuencia de aminoácidos como se proporciona en una cualquiera de las SEC ID N.º: 1, SEC ID N.º: 2, SECID N.º: 22, SEC ID N.º: 23, SEC ID N.º: 40, SEC ID N.º: 41, SEC ID N.º: 56, SEC ID N.º: 57; SEC ID N.º: 3, SEC IDN.º: 4, SEC ID N.º: 24, SEC ID N.º: 25, SEC ID N.º: 42, SEC ID N.º: 43, SEC ID N.º: 58, SEC ID N.º: 59, SEC ID N.º:5, SEC ID N.º: 6, SEC ID N.º: 26, SEC ID N.º: 27, SEC ID N.º: 44, SEC ID N.º: 45, SEC ID N.º: 60, SEC ID N.º: 61,SEC ID N.º: 7, SEC ID N.º: 8, SEC ID N.º: 28, SEC ID N.º: 29, SEC ID N.º: 46, SEC ID N.º: 47, SEC ID N.º: 62, SECID N.º: 63, SEC ID N.º: 72 o SEC ID N.º: 73; ii) una secuencia de aminoácidos que es al menos un 40 % idéntica a una cualquiera o más de las SEC ID N.º: 1,SEC ID N.º: 2, SEC ID N.º: 22, SEC ID N.º: 23, SEC ID N.º: 40, SEC ID N.º: 41, SEC ID N.º: 56, SEC ID N.º: 57; SECID N.º: 3, SEC ID N.º: 4, SEC ID N.º: 24, SEC ID N.º: 25, SEC ID N.º: 42, SEC ID N.º: 43, SEC ID N.º: 58, SEC IDN.º: 59, SEC ID N.º: 5, SEC ID N.º: 6, SEC ID N.º: 26, SEC ID N.º: 27, SEC ID N.º: 44, SEC ID N.º: 45, SEC ID N.º:60, SEC ID N.º: 61, SEC ID N.º: 7, SEC ID N.º: 8, SEC ID N.º: 28, SEC ID N.º: 29, SEC ID N.º: 46, SEC ID N.º: 47,SEC ID N.º: 62, SEC ID N.º: 63, SEC ID N.º: 72 o SEC ID N.º: 73; iii) un fragmento biológicamente activo de i) o ii).

Description

Proteínas de seda
5 Campo de la invención
La presente invención se refiere a proteínas de seda, así como a ácidos nucleicos que codifican dichas proteínas. La presente invención también se refiere a células recombinantes y/o a organismos que sintetizan proteínas de seda. Las proteínas de seda de la invención se pueden usar para varios propósitos, tal como en la producción de productos de atención personal, plásticos, telas y productos biomédicos.
Antecedentes de la invención
Las sedas son secreciones de proteína fibrosa que exhiben una resistencia y dureza excepcionales y como tales,
15 han sido el objetivo de extensos estudios. Las sedas son producidas por más de 30.000 especies de arañas y por muchos insectos. Muy pocas de estas sedas se han caracterizado, concentrándose la mayor parte de la investigación en la seda del capullo del gusano de seda domesticado Bombyx mori y en la seda de arrastre de la araña tejedora de su tela en espiral Nephila clavipes.
En los lepidópteros y las arañas, los genes de seda de fibroína codifican proteínas que generalmente son grandes con dominios terminales hidrófilos prominentes en cualquier extremo que abarcan una región extensa de bloques hidrófobos e hidrófilos alternos (Bini y cols., 2004). En general, estas proteínas comprenden diferentes combinaciones de matrices cristalinas de láminas ! asociadas de un modo laxo con láminas !, espirales !, hélices α y regiones amorfas (véase una revisión en Craig y Riekel, 2002).
25 Dado que las fibras de seda representan algunas de las fibras naturales más fuertes conocidas, han sido objeto de extensas investigaciones en un intento de reproducir su síntesis. No obstante, un problema recurrente con la expresión de los genes de fibroína de lepidópteros y de araña ha sido los bajos índices de expresión en varios sistemas de expresión recombinante debido a la combinación de los motivos nucleotídicos repetidos en el gen de la seda que conducen a acontecimientos de recombinación prejudiciales, el gran tamaño del gen y el pequeño número de codones usados para cada aminoácido en el gen, que conduce a la depleción de los conjuntos de ARNt en las células huésped. La expresión recombinante conduce a dificultades durante la traducción tales como pausas traduccionales como resultado de las preferencias de codones y las demandas de codones y los extensos índices de recombinación que dan lugar al truncamiento de los genes. Secuencias más cortas y menos repetitivas evitarían
35 muchos de los problemas asociados con la expresión de los genes de seda hasta la fecha.
En contraste con los extensos conocimientos que se han acumulado sobre los lepidópteros (en concreto, la seda del capullo de Bombyx mori) y las arañas (en particular, la seda de arrastre de Nephila clavipes) se sabe poco sobre la composición química y la organización molecular de otras sedas de insecto.
A principios de la década de 1960, mediante patrones de difracción en rayos X obtenidos de fibras de seda extraídas de la glándula salival de las larvas de abeja melífera (Rudall, 1962) se demostró que la seda del himenóptero aculeado tenía una estructura en alfa-hélice Además de demostrar que esta seda es helicoidal, los patrones obtenidos eran indicativos de un sistema de bobina enrollada de cadenas en alfa-hélice (Atkins, 1967). Se han
45 obtenido patrones de difracción de rayos X similares para sedas de capullo de otras especies de Aculeata, incluida la avispa Pseudopompilus humbolti (Rudall, 1962) y el abejorro, Bombus lucorum (Lucas y Rudall, 1967).
En contraste con la estructura en alfa-hélice descrita en las sedas de aculeados, las sedas caracterizadas de un clado relacionado con los aculeados, icneumónidos (Ichneumonoidea), tienen estructuras ! paralelas. Los diagramas de rayos X para cuatro ejemplos de esta estructura se han descrito en bracónidos (Braconidae) (Cotesia(=Apenteles) glomerate; Cotesia(=Apenteles) gonopterygis; Apenteles bignelli) y tres en icneumónidos (Ichneumonidae) (Dusona sp.; Phytodietris sp.; Branchus femoralis) (Lucas y Rudall, 1967). Además, se ha descrito la secuencia de la seda de un solo bracónido ((Cotesia glomerate) (base de datos Genbank, número de acceso AB188680; Yamada y cols., 2004). Esta secuencia proteica parcial consiste en una repetición de 28 X-asparagina
55 altamente conservada (en la que X es alanina o serina) y no se ha predicho que contenga héptadas repetitivas que forman una superhélice. Un análisis extenso de la composición de aminoácidos de las sedas de capullo de los bracónidos ha demostrado que las sedas de la subfamilia Microgastrinae son únicas en su contenido elevado de asparagina y serina (Lucas y cols., 1960; Quicke y cols., 2004). Las subfamilias relacionadas producen sedas con composiciones de aminoácidos significativamente diferentes, lo que sugiere que las sedas de Microgastrinae han evolucionado específicamente en esta subfamilia (Yamada y cols., 2004). El ADNc parcial de Cotesia glomerata se aisló usando cebadores para PCR diseñados a partir de la secuencia obtenida de péptidos internos derivados de proteínas de seda de capullo aisladas. La composición de aminoácidos predicha de esta secuencia parcial se asemeja mucho a la composición de aminoácidos de la seda ampliamente lavada de esta especie.
65 La estructura de muchas de las sedas dentro de otros apócritas no aculeados y dentro del resto de himenópteros (Symphata) son, con mayor frecuencia, láminas ! paralelas, con sedas de tipo colágeno y de poliglicina producidas por los tentredínidos (Lucas y Rudall, 1967).
Las proteínas de seda de abeja melífera se sintetizan en el medio del estadio final y se pueden ver como una mezcla de proteínas de seda despolimerizadas (Silva-Zacarin y cols., 2003). A medida que el estadio progresa, se elimina el
5 agua de la glándula y la deshidratación tiene como resultado la polimerización de la proteína de seda para formar tactoides marcados con filamentos de seda insolubles y bien organizados (Silva-Zacarin y cols., 2003). La deshidratación progresiva conduce a la reorganización posterior de los tactoides (Silva-Zacarin y cols., 2003) y posiblemente, a nuevos enlaces interfilamentosos entre filamentos (Rudall, 1962). Las imágenes de microscopio electrónico de fibrillas aisladas de la glándula de seda de abeja melífera muestra estructuras de un diámetro de aproximadamente 20–25 angstroms (Flower y Kenchington, 1967). Este valor es consistente con superhélices de tres, cuatro o cinco hebras.
Lucas y Rudall (1967) determinaron la composición de aminoácidos de las sedas de diversas especies de himenópteros aculeados y encontraron que contenían un contenido elevado de alanina, serina y los residuos ácidos
15 ácido aspártico y ácido glutámico y cantidades reducidas de glicina en comparación con las fibroínas clásicas. Se consideró que el contenido helicoidal de la seda de himenópteros aculeados era una consecuencia de un menor contenido en glicina y de un incremento del contenido en residuos ácidos (Rudall y Kenchington, 1971).
Se sabe poco sobre la seda de larvas de crisopas (Orden: neurópteros, Neuroptera). El capullo está compuesto por dos capas, una capa sólida interna y una capa fibrosa externa. Anteriormente se había descrito que el capullo estaba compuesto por una seda de cuticulina (Rudall y Kenchington, 1971), una descripción que solo está relacionada con la capa interna sólida. LaMunyon (1988) describió una sustancia excretada de los túbulos de malpigio que formaban las fibras externas. Tras el depósito de esta capa, la pared interna sólida se construyó a partir de secreciones de las células epiteliales en el lumen altamente velloso (LaMunyon, 1988).
25 También se sabe que las larvas de crisopa producen una sustancia proteinácea adhesiva procedente de los túbulos de malpigio a través de todos los estadios para pegar las larvas a los sustratos, para pegar artículos de camuflaje sobre el dorso de la larva o para atrapar una presa (Speilger, 1962). En el género Lomamyia (Bethothidae), las larvas producen la seda y la sustancia adhesiva al mismo tiempo y se ha postulado que estas dos sustancias pueden muy bien ser el mismo producto (Speilger, 1962). La secreción del adhesivo es muy soluble y también se piensa que está asociado con la defensa contra los depredadores (LaMunyon y Adams, 1987).
Considerando las propiedades únicas de las sedas producidas por insectos como himenópteros y neurópteros, existe la necesidad de identificar nuevos ácidos nucleicos que codifiquen proteínas de estos organismos.
35 Sumario de la invención
Los autores de la presente invención han identificado numerosas proteínas de seda de insectos. Estas proteínas de seda son, sorprendentemente, diferentes de otras proteínas de seda conocidas en su secuencia primaria, estructura secundaria y/o contenido de aminoácidos.
Por tanto, en un primer aspecto de la presente invención proporciona un polipéptido de seda recombinante y/o sustancialmente purificado en el que al menos una porción del polipéptido tiene una estructura de superhélice y en el que el polipéptido comprende una proteína seleccionada de:
45 i) una secuencia de aminoácidos como se proporciona en una cualquiera de las SEC ID N.º: 1, SEC ID N.º: 2, SEC ID N.º: 22, SEC ID N.º: 23, SEC ID N.º: 40, SEC ID N.º: 41, SEC ID N.º: 56, SEC ID N.º: 57; SEC ID N.º: 3, SEC ID N.º: 4, SEC ID N.º: 24, SEC ID N.º: 25, SEC ID N.º: 42, SEC ID N.º: 43, SEC ID N.º: 58, SEC ID N.º: 59, SEC ID N.º: 5, SEC ID N.º: 6, SEC ID N.º: 26, SEC ID N.º: 27, SEC ID N.º: 44, SEC ID N.º: 45, SEC ID N.º: 60, SEC ID N.º: 61, SEC ID N.º: 7, SEC ID N.º: 8, SEC ID N.º: 28, SEC ID N.º: 29, SEC ID N.º: 46, SEC ID N.º: 47, SEC ID N.º: 62, SEC ID N.º: 63, SEC ID N.º: 72 o SEC ID N.º: 73;
ii) una secuencia de aminoácidos que es al menos un 40 % idéntica a una cualquiera o más de las SEC ID N.º: 1, SEC ID N.º: 2, SEC ID N.º: 22, SEC ID N.º: 23, SEC ID N.º: 40, SEC ID N.º: 41, SEC ID N.º: 56, SEC ID N.º: 57; SEC
55 ID N.º: 3, SEC ID N.º: 4, SEC ID N.º: 24, SEC ID N.º: 25, SEC ID N.º: 42, SEC ID N.º: 43, SEC ID N.º: 58, SEC ID N.º: 59, SEC ID N.º: 5, SEC ID N.º: 6, SEC ID N.º: 26, SEC ID N.º: 27, SEC ID N.º: 44, SEC ID N.º: 45, SEC ID N.º: 60, SEC ID N.º: 61, SEC ID N.º: 7, SEC ID N.º: 8, SEC ID N.º: 28, SEC ID N.º: 29, SEC ID N.º: 46, SEC ID N.º: 47, SEC ID N.º: 62, SEC ID N.º: 63, SEC ID N.º: 72 o SEC ID N.º: 73;
iii) un fragmento biológicamente activo de i) o ii).
Como se sabe en la técnica, las estructuras de superhélice de los polipéptidos se caracterizan por héptadas repetitivas representadas por la secuencia consenso (abcdefg)n, con, generalmente, residuos hidrófobos en la posición a y d y generalmente, residuos polares en las posiciones que quedan. Sorprendentemente, las héptadas de
65 los polipéptidos de la presente invención tienen una composición nueva cuando se ven en conjunto, con una abundancia inusualmente alta de alanina en las posiciones “hidrófobas” de la héptada a y d. Adicionalmente hay niveles elevados de residuos polares pequeños en estas posiciones. Además, la posición e también tiene niveles elevados de alanina y de residuos hidrófobos pequeños.
De acuerdo con esto, en una realización particularmente preferida, la porción del polipéptido que tiene una 5 estructura en superhélice comprende al menos 10 copias de la secuencia de la héptada abcdefg y al menos un 25 % de los aminoácidos en las posiciones a y d son residuos de alanina.
En una realización adicional preferida, la porción del polipéptido que tiene una estructura en superhélice comprende al menos 10 copias de la secuencia de la héptada abcdefg y al menos un 25 % de los aminoácidos en las posiciones a, d y e son residuos de alanina.
En una realización adicional preferida, la porción del polipéptido que tiene una estructura en superhélice comprende al menos 10 copias de la secuencia de la héptada abcdefg y al menos un 25 % de los aminoácidos en la posición a son residuos de alanina.
15 En una realización adicional preferida, la porción del polipéptido que tiene una estructura en superhélice comprende al menos 10 copias de la secuencia de la héptada abcdefg y al menos un 25 % de los aminoácidos en la posición d son residuos de alanina.
En una realización adicional preferida, la porción del polipéptido que tiene una estructura en superhélice comprende al menos 10 copias de la secuencia de la héptada abcdefg y al menos un 25 % de los aminoácidos en la posición e son residuos de alanina.
En una realización particularmente preferida, las al menos 10 copias de la secuencia de la héptada son contiguos.
25 En una realización adicional preferida, la porción del polipéptido que tiene una estructura en superhélice comprende al menos 5 copias de la secuencia de la héptada abcdefg y al menos un 15 % de los aminoácidos en las posiciones a y d son residuos de alanina.
En una realización adicional preferida, la porción del polipéptido que tiene una estructura en superhélice comprende al menos 5 copias de la secuencia de la héptada abcdefg y al menos un 15 % de los aminoácidos en las posiciones a, d y e son residuos de alanina.
En una realización adicional preferida, la porción del polipéptido que tiene una estructura en superhélice comprende
35 al menos 5 copias de la secuencia de la héptada abcdefg y al menos un 15 % de los aminoácidos en la posición a son residuos de alanina.
En una realización adicional preferida, la porción del polipéptido que tiene una estructura en superhélice comprende al menos 5 copias de la secuencia de la héptada abcdefg y al menos un 15 % de los aminoácidos en la posición d son residuos de alanina.
En una realización adicional preferida, la porción del polipéptido que tiene una estructura en superhélice comprende al menos 5 copias de la secuencia de la héptada abcdefg y al menos un 15 % de los aminoácidos en la posición e son residuos de alanina.
45 En una realización particularmente preferida, las al menos 5 copias de la secuencia de la héptada son contiguos.
Se han identificado proteínas de seda que se asocian con proteínas del primer aspecto. Una de estas proteínas (SEC ID N.º: 10), mediante PROFsec se ha predicho que tiene una estructura secundaria del 41 % en alfa-hélice, 8 % en lámina beta y 50 % en bucle y por tanto, se clasifica como una proteína de estructura mixta. El análisis MARCOIL de esta proteína predijo solo una región corta de héptadas repetitivas características de proteínas con una estructura de superhélice.
De acuerdo con esto, en el presente documento se describe un polipéptido de seda recombinante y/o 55 sustancialmente purificado que comprende una secuencia seleccionada de:
i) una secuencia de aminoácidos como se proporciona en una cualquiera de las SEC ID N.º: 9, SEC ID N.º: 10 y SEC ID N.º: 30;
ii) una secuencia de aminoácidos que es al menos un 30 % idéntica a una cualquiera o más de las SEC ID N.º: 9, SEC ID N.º: 10 y SEC ID N.º: 30; y
iii) un fragmento biológicamente activo de i) o ii).
65 Sin desear quedar ligado a teoría alguna, parece que cuatro proteínas del primer aspecto se entrelazan para formar un haz con ejes helicoidales casi paralelos entre sí y este haz se extienden axialmente en una fibrilla. Además, se ha predicho que en al menos algunas especies como la abeja melífera y el abejorro, las proteínas del segundo aspecto actúan como un “pegamento” y ayudan a unir varios haces de proteínas en superhélice del primer aspecto juntas para formar un complejo de proteína fibrosa. No obstante, las fibras de seda y los copolímeros todavía se pueden formar sin un polipéptido del segundo aspecto.
5 En una realización preferida, un polipéptido de la invención se puede purificar de un polipéptido, o es un mutante del mismo, purificado de una especie de himenópteros o neurópteros. Preferentemente, la especie de himenópteros es Apis mellifera, Oecophylla smaragdina, Myrmecia foricata o Bombus terrestris. Preferentemente, la especie de neurópteros es Mallada signata.
En otro aspecto, la presente invención proporciona un polipéptido de la invención condensado con al menos otro polipéptido.
En una realización preferida, el al menos otro polipéptido se selecciona del grupo que consiste en: Un polipéptido
15 que potencia la estabilidad de un polipéptido de la presente invención, un polipéptido que ayuda a la purificación de la proteína de fusión y un polipéptido que ayuda a la secreción del polipéptido de la invención de una célula (por ejemplo, secretado de una célula vegetal).
En otro aspecto, la presente invención proporciona un polinucleótido aislado y/o exógeno que codifica un polipéptido de seda, en el que al menos una porción del polipéptido tiene una estructura de superhélice, en el que el polinucleótido comprende una secuencia seleccionada de:
i) una secuencia de nucleótidos proporcionada en una cualquiera de las SEC ID N.º: 11, SEC ID N.º: 12, SEC ID N.º: 31, SEC ID N.º: 32, SEC ID N.º: 48, SEC ID N.º: 49, SEC ID N.º: 64, SEC ID N.º: 65, SEC ID N.º: 13, SEC ID N.º: 14,
25 SEC ID N.º: 33, SEC ID N.º: 34, SEC ID N.º: 50, SEC ID N.º: 51, SEC ID N.º: 66, SEC ID N.º: 67, SEC ID N.º: 15, SEC ID N.º: 16, SEC ID N.º: 35, SEC ID N.º: 36, SEC ID N.º: 52, SEC ID N.º: 53, SEC ID N.º: 68, SEC ID N.º: 69, SEC ID N.º: 17, SEC ID N.º: 18, SEC ID N.º: 37, SEC ID N.º: 38, SEC ID N.º: 54, SEC ID N.º: 55, SEC ID N.º: 70, SEC ID N.º: 71, SEC ID N.º: 76, SEC ID N.º: 74 o SEC ID N.º: 75;
ii) una secuencia de nucleótidos que codifica un polipéptido como se ha definido en lo que antecede;
iii) una secuencia de nucleótidos que es al menos un 40 % idéntica a cualquiera o más de las SEC ID N.º: 11, SEC ID N.º: 12, SEC ID N.º: 31, SEC ID N.º: 32, SEC ID N.º: 48, SEC ID N.º: 49, SEC ID N.º: 64, SEC ID N.º: 65, SEC ID N.º: 13, SEC ID N.º: 14, SEC ID N.º: 33, SEC ID N.º: 34, SEC ID N.º: 50, SEC ID N.º: 51, SEC ID N.º: 66, SEC ID
35 N.º: 67, SEC ID N.º: 15, SEC ID N.º: 16, SEC ID N.º: 35, SEC ID N.º: 36, SEC ID N.º: 52, SEC ID N.º: 53, SEC ID N.º: 68, SEC ID N.º: 69, SEC ID N.º: 17, SEC ID N.º: 18, SEC ID N.º: 37, SEC ID N.º: 38, SEC ID N.º: 54, SEC ID N.º: 55, SEC ID N.º: 70, SEC ID N.º: 71, SEC ID N.º: 76, SEC ID N.º: 74 o SEC ID N.º: 75;
iv) una secuencia que hibrida con una cualquiera de i) a iii) en condiciones rigurosas.
También se describe un polinucleótido aislado y/o exógeno, en el que el polinucleótido comprende una secuencia seleccionada de:
i) una secuencia de nucleótidos como se proporciona en una cualquiera de las SEC ID N.º: 19, SEC ID N.º: 20, SEC 45 ID N.º: 21 y SEC ID N.º: 39;
ii) una secuencia de nucleótidos que codifica un polipéptido de la invención;
iii) una secuencia de nucleótidos que es al menos un 30 % idéntica a una cualquiera o más de las SEC ID N.º: 19, SEC ID N.º: 20, SEC ID N.º: 21 and SEC ID N.º: 39 y
iv) una secuencia que hibrida con una cualquiera de i) a iii) en condiciones rigurosas.
En una realización preferida, un polinucleótido se puede aislar de una especie de himenóptero o neuróptero o es un
55 mutante de un polinucleótido aislado de una especie de himenóptero o neuróptero. Preferentemente, la especie de himenóptero es Apis mellifera, Oecophylla smaragdina, Myrmecia foricata o Bombus terrestris. Preferentemente, la especie de neuróptero es Mallada signata.
En un aspecto adicional, la presente invención proporciona un vector que comprende al menos un polinucleótido de la invención.
Preferentemente, el vector es un vector de expresión.
En otro aspecto, la presente invención proporciona una célula huésped que comprende al menos un polinucleótido 65 exógeno de la invención y/o al menos un vector de la invención.
La célula huésped puede ser cualquier tipo de célula. Ejemplos incluyen, entre otras, células bacterianas, de levaduras o vegetales.
También se proporciona un procedimiento para preparar un polipéptido de acuerdo con la invención, comprendiendo 5 el procedimiento cultivar una célula huésped de la invención o un vector de la invención, en condiciones que permitan la expresión del polinucleótido que codifica el polipéptido y recuperar el polipéptido expresado.
También se proporciona un procedimiento para preparar un polipéptido según se define en el presente documento que comprende expresar en un sistema de expresión sin células un vector de la invención, en condiciones que permitan la expresión del polinucleótido que codifica el polipéptido y recuperar el polipéptido expresado.
Se prevé que las plantas transgénicas sean particularmente útiles para la producción de polipéptidos de la invención. Por tanto, en otro aspecto más, la presente invención proporciona una planta transgénica que comprende un polinucleótido exógeno, en el que el polinucleótido codifica al menos un polipéptido de la invención.
15 También se describe un animal no humano transgénico que comprende un polinucleótido exógeno, en el que el polinucleótido codifica al menos un polipéptido de la invención.
En otro aspecto más, la presente invención proporciona un anticuerpo que se une específicamente a un polipéptido de seda recombinante y/o purificado en el que al menos una porción del polipéptido tiene una estructura en superhélice y en el que el polipéptido consiste en una secuencia seleccionada de una secuencia de aminoácidos como se proporciona en una cualquiera de las SEC ID N.º: 1, SEC ID N.º: 2, SEC ID N.º: 22, SEC ID N.º: 23, SEC ID N.º: 40, SEC ID N.º: 41, SEC ID N.º: 56, SEC ID N.º: 57, SEC ID N.º: 3, SEC ID N.º: 4, SEC ID N.º: 24, SEC ID N.º: 25, SEC ID N.º: 42, SEC ID N.º: 43, SEC ID N.º: 58, SEC ID N.º: 59, SEC ID N.º: 5, SEC ID N.º: 6, SEC ID N.º: 26,
25 SEC ID N.º: 27, SEC ID N.º: 44, SEC ID N.º: 45, SEC ID N.º: 60, SEC ID N.º: 61, SEC ID N.º: 7, SEC ID N.º: 8, SEC ID N.º: 28, SEC ID N.º: 29, SEC ID N.º: 46, SEC ID N.º: 47, SEC ID N.º: 62, SEC ID N.º: 63, SEC ID N.º: 72 o SEC ID N.º: 73.
En un aspecto más, la presente invención proporciona una fibra de seda que comprende al menos un polipéptido en el que la fibra de seda no comprende un polipéptido de la invención, en el que la fibra de seda no comprende una proteína de jalea real producida por un insecto.
Preferentemente, el polipéptido es un polipéptido recombinante.
35 En una realización, al menos algunos de los polipéptidos están reticulados. En una realización, al menos algunos de los residuos lisina de los polipéptidos están reticulados.
En otro aspecto, la presente invención proporciona un copolímero que comprende al menos dos polipéptidos de la invención, en el que el copolímero no comprende una proteína de jalea real producida por un insecto.
Preferentemente, los polipéptidos son polipéptidos recombinantes.
En una realización, el copolímero comprende al menos cuatro polipéptidos diferentes del primer aspecto. En otra realización, el copolímero comprende además un polipéptido del segundo aspecto.
45 En una realización, al menos algunos de los polipéptidos están reticulados. En una realización, al menos algunos de los residuos lisina de los polipéptidos están reticulados.
Como el destinatario experto apreciará, los polipéptidos de la invención tienen una amplia variedad de uso como se conoce en la técnica para otros tipos de proteínas de seda. Por tanto, en un aspecto adicional, la presente invención proporciona un producto que comprende al menos un polipéptido de la invención, una fibra de seda de la invención y/o un copolímero de la invención en el que el producto no comprende una proteína de jalea real producida por un insecto.
55 Ejemplos de productos incluyen, entre otros, productos de cuidados personales, telas, plásticos y productos biomédicos.
En otro aspecto adicional, la presente invención proporciona una composición que comprende al menos un polipéptido de la invención, una fibra de seda de la invención y/o un copolímero de la invención y uno o más vehículos aceptables.
En una realización, la composición comprende además un fármaco.
En otra realización, la composición se usa como medicamento en un dispositivo médico o un cosmético.
65 En otro aspecto, la presente invención proporciona una composición que comprende al menos un polinucleótido de la invención y uno o más vehículos aceptables.
En la presente invención, una composición, fibra de seda, copolímero y/o producto de la invención no comprende una proteína de jalea real producida por un insecto.
5 También se describe un procedimiento de tratamiento o de prevención de una enfermedad, en el que el procedimiento comprende administrar una composición que comprende un fármaco para tratar o prevenir la enfermedad y un vehículo farmacéuticamente aceptable, en el que el vehículo farmacéuticamente se selecciona de al menos un polipéptido de la invención, una fibra de seda de la invención y/o un copolímero de la invención.
En otro aspecto más, la presente invención proporciona el uso de al menos un polipéptido de la invención, una fibra de seda de la invención y/o un copolímero de la invención y un fármaco, para la fabricación de un medicamento para tratar o prevenir una enfermedad.
15 En un aspecto adicional, la presente invención proporciona un kit que comprende al menos un polipéptido de la invención, al menos un polinucleótido de la invención, al menos un vector de la invención, al menos una fibra de seda de la invención y/o un copolímero de la invención.
Preferentemente, el kit además comprende información y/o instrucciones de uso del kit.
Como será evidente, rasgos y característicos preferidos de un aspecto de la invención son aplicables a otros muchos aspectos de la invención.
A lo largo de esta memoria descriptiva, se entenderá que el término “comprende” o variaciones tales como
25 “comprenden” o “que comprende” implica la inclusión de un elemento, número entero o etapa indicados, o grupo de elementos, números enteros o etapas, pero no la exclusión de cualquier otro elemento, número entero o etapa, o grupo de elementos, números enteros o etapas.
La invención se describirá a continuación en el presente documento mediante los siguientes ejemplos y haciendo referencia a las figuras adjuntas.
Breve descripción de los dibujos que se acompañan
Figura 1. Espectros de infrarrojos con transformada de Fourier de las regiones amida I y II de las sedas: 1) seda de
35 abeja melífera, 2) seda de abejorro, 3) seda de hormiga bulldog, 4) seda de la hormiga tejedora, 5) seda de larva de crisopa. Todas las sedas tienen los espectros previstos de las proteínas helicoidales. Las sedas de himenópteros (hormigas y abejas) tienen espectros máximos a 1645 -1646 cm-1 (marcados), desplazados aproximadamente 10 cm-1 por debajo de una señal de alfa-hélice clásica y ampliada, como es típico de las proteínas en superhélice (Heimburg y cols., 1999).
Figura 2. Comparación de la composición de aminoácidos de la seda del panal de cría de la abeja melífera lavada con SDS con la composición de aminoácidos de las proteínas de Xenospira (es decir, Xenospira1, Xenospira2, Xenospira3 y Xenospira4) (las cantidades equimolares totalizan un 65 %) y Xenosina (35 %).
45 Figura 3. Comparación de la composición de aminoácidos de la seda con la composición de aminoácidos prevista de las proteínas codificadas por genes de seda.
Figura 4. Predicción de regiones en superhélice en las proteínas de seda de la abeja melífera. COILS es un programa que compara una secuencia con una base de datos de superhélices bicatenarias paralelas conocidas y produce una puntuación de similitud. Comparando esta puntuación con la distribución de puntuaciones en proteínas globulares y en superhélice, el programa calcula la probabilidad de que la secuencia adopte una conformación en superhélice como se describe en Lupas y cols., (1991). Usando un tamaño de ventana de 28, este programa predice los siguientes números de residuos en cada proteína en los dominios en superhélice: Xenospira3: 77; Xenospira4: 35; Xenospiral: 28; Xenospira2: 80.
55 Figura 5. Alineación de las proteínas de seda de abeja melífera que muestra una predicción MARCOIL de héptadas mayoritarias que forman una estructura en superhélice. Las secuencias de las héptadas se muestran encima de los aminoácidos y los residuos alanina en las posiciones a y d están resaltados.
Figura 6. Alineación de las regiones en superhélice predichas por Marciol de proteínas de seda de himenópteros (abejas y hormigas) que muestran la asignación de la posición de la héptada. Amel, abeja melífera, BB, abejorro; BA, hormiga bulldog; WA, hormiga tejedora; F-14, fibroínas de seda 1-4. Las secuencias de la héptada se muestran encima de los aminoácidos y los residuos alanina en las posiciones a, d y e están resaltados.
65 Figura 7. El carácter de aminoácido de las posiciones de la héptada en las regiones en superhélice predichas de la proteína de seda de la larva de Mallada signata y los grupos ortólogos de las proteínas de seda de himenópteros.
Figura 8. Electroforesis en gel de SDS-poliacrilamida de proteínas tardías de la glándula de último estadio. Las proteínas se identificaron después de digestión con tripsina y se realizó un análisis de los datos de los espectros de masas usando el software Agilent's Spectrum Mill para relacionar los datos con las predicciones de las secuencias
5 proteicas de proteínas identificadas de secuencias de ADNc. El software generó puntuaciones de la calidad de cada coincidencia entre conjuntos observados experimentalmente de masas de fragmentos de péptidos y las predicciones de fragmentos que podrían generarse de acuerdo con las secuencias de proteínas en una base de datos proporcionada. Todas las correspondencias de secuencia mostradas en la presente invención recibieron puntuaciones superiores a 20 mediante el software Spectrum Mill, en la que una puntuación de 20 sería suficiente para una aceptación fiable automática de una correspondencia válida.
Figura 9. Análisis de parsimonia de la región en superhélice de las proteínas de seda. La relación de las cuatro proteínas en superhélice sugiere que los genes procedían de un ancestro común predice la divergencia del Euaculeado. El área unida por la línea discontinua indica la variación que se produjo antes de que las hormigas y las
15 avispas (Vespodea) divergieran de las abejas (Apoidea) a finales del periodo jurásico (155 millones de años; Grimaldi y Engel, 2005). Se muestran los números que indican valores de arranque de 1.000 repeticiones.
Figura 10. A) proteínas de seda de Apis mellifera identificadas mediante análisis de espectros de péptidos generados de la seda de abeja tras la digestión con tripsina. El sombreado indica péptidos identificados mediante el análisis de espectros de masas. Todas las correspondencias de secuencia mostradas en la presente invención recibieron puntuaciones superiores a 20 mediante el software Spectrum Mill, en la que una puntuación de 20 sería suficiente para una aceptación fiable automática de una correspondencia válida.
B) Secuencias amino de longitud completa de proteínas de seda de abejorro, de hormiga bulldog, de tejedora y de 25 crisopa.
Figura 11. Marcos de lectura abiertos que codifican las proteínas de seda de abejorro, de hormiga bulldog, de tejedora y de crisopa.
Figura 12. Secuencia del gen que codifica Xenosina. Secuencia de codificación completa proporcionada que es interrumpida por un solo intrón (resaltado).
Figura 13. Expresión de la proteína de seda en tabaco. Detección de proteínas marcadas con histidina tras análisis de transferencia de tipo western de proteínas de: 1. E. coli transformada con un vector de expresión vacío, 2. E. coli
35 transformada con vector de expresión que contiene la región de codificación AmelF4 (Xenospira4), 3. tabaco transformado con un vector de expresión vacío, 4. tabaco transformado con vector de expresión que contiene la región de codificación AmelF4.
Figura 14. Fibras fabricadas con proteínas de seda de abeja melífera recombinantes que muestran hebras birrefringentes. La birrefringencia indica que la estructura está presente en las hebras. En cada panel A-D se muestran diferentes hebras de abeja melífera recombinantes y en el panel E se muestra la hebra recombinante de crisopa.
Clave para el listado de secuencias
45 SEC ID N.º: 1 -Proteína de seda de abeja melífera denominada en el presente documento Xenospiral (también denominada en el presente documento AmelF1) (péptido señal menos).
SEC ID N.º: 2 -Proteína de seda de abeja melífera denominada en el presente documento Xenospira1.
SEC ID N.º: 3 -Proteína de seda de abeja melífera denominada en el presente documento Xenospira2 (también denominada en el presente documento AmelF2) (péptido señal menos).
SEC ID N.º: 4 -Proteína de seda de abeja melífera denominada en el presente documento Xenospira2.
55 SEC ID N.º: 5 -Proteína de seda de abeja melífera denominada en el presente documento Xenospira3 (también denominada en el presente documento AmelF3) (péptido señal menos).
SEC ID N.º: 6 -Proteína de seda de abeja melífera denominada en el presente documento Xenospira3.
SEC ID N.º: 7 -Proteína de seda de abeja melífera denominada en el presente documento Xenospira4 (también denominada en el presente documento AmelF4) (péptido señal menos).
SEC ID N.º: 8 -Proteína de seda de abeja melífera denominada en el presente documento Xenospira4.
65 SEC ID N.º: 9 -Proteína de seda de abeja melífera denominada en el presente documento Xenosina (también
denominada en el presente documento AmelSA1) (péptido señal menos). SEC ID N.º: 10 -Proteína de seda de abeja melífera denominada en el presente documento Xenosina.
5 SEC ID N.º: 11 -Secuencia de nucleótidos que codifica la proteína de seda de abeja melífera Xenospiral (región menos que codifica el péptido señal). SEC ID N.º: 12 -Secuencia de nucleótidos que codifica la proteína de seda de abeja melífera Xenospira1. SEC ID N.º: 13 -Secuencia de nucleótidos que codifica la proteína de seda de abeja melífera Xenospira2 (región
menos que codifica el péptido señal). SEC ID N.º: 14 -Secuencia de nucleótidos que codifica la proteína de seda de abeja melífera Xenospira2.
15 SEC ID N.º: 15 -Secuencia de nucleótidos que codifica la proteína de seda de abeja melífera Xenospira3 (región menos que codifica el péptido señal). SEC ID N.º: 16 -Secuencia de nucleótidos que codifica la proteína de seda de abeja melífera Xenospira3. SEC ID N.º: 17 -Secuencia de nucleótidos que codifica la proteína de seda de abeja melífera Xenospira4 (región
menos que codifica el péptido señal). SEC ID N.º: 18 -Secuencia de nucleótidos que codifica la proteína de seda de abeja melífera Xenospira4.
25 SEC ID N.º: 19 -Secuencia de nucleótidos que codifica la proteína de seda de abeja melífera Xenosina (región menos que codifica el péptido señal). SEC ID N.º: 20 -Secuencia de nucleótidos que codifica la proteína de seda de abeja melífera Xenosina. SEC ID N.º: 21 -Secuencia génica que codifica la proteína de seda de abeja melífera Xenosina. SEC ID N.º: 22 -Proteína de seda de abejorro denominada en el presente documento BBF1 (péptido señal menos). SEC ID N.º: 23 -Proteína de seda de abejorro denominada en el presente documento BBF1.
35 SEC ID N.º: 24 -Proteína de seda de abejorro denominada en el presente documento BBF2 (péptido señal menos). SEC ID N.º: 25 -Proteína de seda de abejorro denominada en el presente documento BBF2. SEC ID N.º: 26 -Proteína de seda de abejorro denominada en el presente documento BBF3 (péptido señal menos). SEC ID N.º: 27 -Proteína de seda de abejorro denominada en el presente documento BBF3. SEC ID N.º: 28 -Proteína de seda de abejorro denominada en el presente documento BBF4 (péptido señal menos). 45
SEC ID N.º: 29 -Proteína de seda de abejorro denominada en el presente documento BBF4. SEC ID N.º: 30 -Secuencia de aminoácidos parcial de la proteína de seda de abejorro denominada en el presente documento BBSA1.
SEC ID N.º: 31 -Secuencia de nucleótidos que codifica la proteína de seda de abejorro BBF1(región menos que codifica el péptido señal). SEC ID N.º: 320 -Secuencia de nucleótidos que codifica la proteína de seda de abejorro BBF1.
55 SEC ID N.º: 33 -Secuencia de nucleótidos que codifica la proteína de seda de abejorro BBF2(región menos que codifica el péptido señal).
SEC ID N.º: 34 -Secuencia de nucleótidos que codifica la proteína de seda de abejorro BBF2.
SEC ID N.º: 35 -Secuencia de nucleótidos que codifica la proteína de seda de abejorro BBF3 (región menos que codifica el péptido señal). SEC ID N.º: 36 -Secuencia de nucleótidos que codifica la proteína de seda de abejorro BBF3.
65 SEC ID N.º: 37 -Secuencia de nucleótidos que codifica la proteína de seda de abejorro BBF4 (región menos que codifica el péptido señal).
SEC ID N.º: 38 -Secuencia de nucleótidos que codifica la proteína de seda de abejorro BBF4.
5 SEC ID N.º: 39 -Secuencia de nucleótidos parcial que codifica la proteína de seda de abejorro BBSA1.
SEC ID N.º: 40 -Proteína de seda de hormiga bulldog denominada en el presente documento BAF1 (péptido señal menos).
SEC ID N.º: 42 -Proteína de seda de hormiga bulldog denominada en el presente documento BAF1.
SEC ID N.º: 42 -Proteína de seda de hormiga bulldog denominada en el presente documento BAF2 (péptido señal menos).
15 SEC ID N.º: 43 -Proteína de seda de hormiga bulldog denominada en el presente documento BAF2.
SEC ID N.º: 44 -Proteína de seda de hormiga bulldog denominada en el presente documento BAF3 (péptido señal menos). SEC ID N.º: 45 -Proteína de seda de hormiga bulldog denominada en el presente documento BAF3.
SEC ID N.º: 46 -Proteína de seda de hormiga bulldog denominada en el presente documento BAF4 (péptido señal menos). SEC ID N.º: 47 -Proteína de seda de hormiga bulldog denominada en el presente documento BAF4.
SEC ID N.º: 48 -Secuencia de nucleótidos que codifica la proteína de seda de hormiga bulldog BAF1 (región menos que codifica el péptido señal).
25 SEC ID N.º: 49 -Secuencia de nucleótidos que codifica la proteína de seda de hormiga bulldog BAF1.
SEC ID N.º: 50 -Secuencia de nucleótidos que codifica la proteína de seda de hormiga bulldog BAF2 (región menos que codifica el péptido señal).
SEC ID N.º: 51 -Secuencia de nucleótidos que codifica la proteína de seda de hormiga bulldog BAF2.
SEC ID N.º: 52 -Secuencia de nucleótidos que codifica la proteína de seda de hormiga bulldog BAF3 (región menos que codifica el péptido señal).
35 SEC ID N.º: 53 -Secuencia de nucleótidos que codifica la proteína de seda de hormiga bulldog BAF3.
SEC ID N.º: 54 -Secuencia de nucleótidos que codifica la proteína de seda de hormiga bulldog BAF4 (región menos que codifica el péptido señal).
SEC ID N.º: 55 -Secuencia de nucleótidos que codifica la proteína de seda de hormiga bulldog BAF4.
SEC ID N.º: 56 -Proteína de seda de hormiga tejedora denominada en el presente documento GAF1 (péptido señal menos).
45 SEC ID N.º: 57 -Proteína de seda de hormiga tejedora denominada en el presente documento GAF1.
SEC ID N.º: 58 -Proteína de seda de hormiga tejedora denominada en el presente documento GAF2 (péptido señal menos).
SEC ID N.º: 59 -Proteína de seda de hormiga tejedora denominada en el presente documento GAF2.
SEC ID N.º: 60 -Proteína de seda de hormiga tejedora denominada en el presente documento GAF3 (péptido señal menos).
55 SEC ID N.º: 61 -Proteína de seda de hormiga tejedora denominada en el presente documento GAF3.
SEC ID N.º: 62 -Proteína de seda de hormiga tejedora denominada en el presente documento GAF4 (péptido señal menos).
SEC ID N.º: 63 -Proteína de seda de hormiga tejedora denominada en el presente documento GAF4.
SEC ID N.º: 64 -Secuencia de nucleótidos que codifica la proteína de seda de hormiga tejedora GAF1 (región menos que codifica el péptido señal).
65 SEC ID N.º: 65 -Secuencia de nucleótidos que codifica la proteína de seda de hormiga tejedora GAF1.
SEC ID N.º: 66 -Secuencia de nucleótidos que codifica la proteína de seda de hormiga tejedora GAF2 (región menos que codifica el péptido señal).
5 SEC ID N.º: 67 -Secuencia de nucleótidos que codifica la proteína de seda de hormiga tejedora GAF2.
SEC ID N.º: 68 -Secuencia de nucleótidos que codifica la proteína de seda de hormiga tejedora GAF3 (región menos que codifica el péptido señal).
SEC ID N.º: 69 -Secuencia de nucleótidos que codifica la proteína de seda de hormiga tejedora GAF3.
SEC ID N.º: 70 -Secuencia de nucleótidos que codifica la proteína de seda de hormiga tejedora GAF4 (región menos que codifica el péptido señal).
15 SEC ID N.º: 71 -Secuencia de nucleótidos que codifica la proteína de seda de hormiga tejedora GAF4.
SEC ID N.º: 72 -Proteína de seda de crisopa denominada en el presente documento MalF1 (péptido señal menos).
SEC ID N.º: 73 -Proteína de seda de criso`pa denominada en el presente documento MalF1.
SEC ID N.º: 74 -Secuencia de nucleótidos que codifica la proteína de seda de crisopa MalF1 (región menos que codifica el péptido señal).
SEC ID N.º: 75 -Secuencia de nucleótidos que codifica la proteína de seda de crisopa MalF1.
25 SEC ID N.º: 76 -Secuencia de nucleótidos que codifica la proteína de seda de abeja melífera denominada en el presente documento Xenospira4 optimizada por codón para la expresión en plantas (antes de subclonar en pET14b y pVEC8):
SEC ID N.º: 77 -Marco de lectura abierto de la proteína de seda de abeja melífera (Xenospira4) optimizado para la expresión en plantas (sin fusión traduccional).
Descripción detallada de la invención
35 Definiciones y técnicas generales
A menos que se defina específicamente otra cosa, todos los términos técnicos y científicos usados en el presente documento se tomarán como que tienen el mismo significado que un experto en la técnica (p. ej., en cultivo celular, genética molecular, inmunología, inmunohistoquímica, química de las proteínas y bioquímica) entiende habitualmente.
A menos que se indique lo contrario, la proteína recombinante, el cultivo celular y las técnicas inmunológicas utilizadas en la presente invención son procedimientos convencionales, bien conocidos por los expertos. Dichas técnicas se describen y explican en la literatura en fuentes tales como J. Perbal, A Practical Guide to Molecular
45 Cloning, John Wiley and Sons (1984), J. Sambrook y cols., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbour Laboratory Press (1989), T.A. Brown (editor), Essential Molecular Biología: A Practical Approach, Volúmenes 1 y 2, IRL Press (1991), D.M. Glover and B.D. Hames (editors), DNA Cloning: A Practical Approach, Volúmenes 1-4, IRL Press (1995 and 1996) y F.M. Ausubel y cols., (editors), Current Protocols in Molecular Biology, Greene Pub. Associates and Wiley-Interscience (1988, incluidas todas las actualizaciones hasta el presente), Ed Harlow y David Lane (editores) Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbour Laboratory, (1988), and J.E. Coligan y cols., (editores) Current Protocols in Immunology, John Wiley & Sons (incluidas todas las actualizaciones hasta el presente).
Como se usa en el presente documento, las expresiones “proteína de seda” y “polipéptido de seda” hacen referencia
55 a una proteína/polipéptido fibroso que se puede usar para producir una fibra de seda y/o un complejo de proteína fibrosa. Las proteínas de seda naturales de la invención forman parte de la seda del panal de cría de insectos tales como abejas melíferas, aunque, como se describe en el presente documento, fácilmente se podrían producir variantes que realizarían la misma función si se expresa dentro de un insecto adecuado.
Como se usa en el presente documento, una “fibra de seda” se refiere a filamentos que comprenden proteínas de la invención que se pueden tejer y formar varios artículos tales como telas.
Como se usa en el presente documento, un “copolímero” es una composición que comprende dos o más proteínas de seda de la invención. Este término excluye copolímeros naturales tales como el panal de cría de insectos.
65 El término “planta” incluye plantas enteres, estructuras vegetativas (por ejemplo, hojas, tallos), raíces, órganos/estructuras florales, semillas (incluidos embriones, endospermo y cubierta de la semilla), tejido vegetal (por ejemplo, tejido vascular, tejido fundamental y similares), células y progenie de las mismas.
Una “planta transgénica” se refiere a una planta que contiene una construcción génica (“transgén”) que no se
5 encuentra en una planta silvestre de la misma especie, variedad o cultivo. Un “transgén”, como se hace referencia en el presente documento, tiene el mismo significado en la técnica de biotecnología e incluye una secuencia genética que se ha producido o alterado mediante tecnología de ADN o ARN recombinante y que se ha introducido en la célula vegetal. El transgén puede incluir secuencias genéticas derivadas de una célula vegetal. Normalmente, el transgén se ha introducido en la planta mediante manipulación genética tal como, por ejemplo, mediante transformación, pero se puede usar cualquier procedimiento que reconozca un experto en la técnica.
“Polinucleótido” se refiere a un oligonucleótido, molécula de ácido nucleico o cualquier fragmento de los mismos. Puede ser ADN o ARN de origen genómico o sintético, bicatenario o monocatenario y combinado con hidrato de carbono, lípidos, proteínas u otros materiales para realizar una actividad concreta definida en el presente
15 documento.
“Operablemente unido”, como se usa en el presente documento, se refiere a una relación funcional entre dos o más segmentos de ácido nucleico (p. ej., un ADN). Normalmente, se refiere a la relación funcional del elemento regulador de la transcripción con una secuencia transcrita. Por ejemplo, un promotor está unido operablemente a una secuencia de codificación, tal como un polinucleótido definido en el presente documento, si estimula o modula la transcripción de la secuencia de codificación en una célula huésped adecuada. Generalmente, los elementos reguladores de la transcripción promotores que están unidos operablemente a una secuencia transcrita están físicamente contiguos a la secuencia transcrita, es decir son de acción en cis. No obstante, algunos elementos reguladores de la transcripción, tales como los potenciadores, no tienen que estar físicamente contiguos o
25 localizados cerca de las secuencias de codificación cuya transcripción potencian.
La expresión “péptido señal” se refiere a un polipéptido amino terminal precedente a una proteína madura secretada. El péptido señal se escinde y por tanto, no está presente en la proteína madura. Los péptidos señal tienen la función de dirigir y localizar en trans las proteínas secretadas a través de las membranas celulares. El péptido señal también se denomina secuencia señal.
Como se usa en el presente documento, “transformación” es la adquisición de genes nuevos en una célula mediante la incorporación de un polinucleótido.
35 Como se usa en el presente documento, “´fármaco” hace referencia a cualquier compuesto que se pueda usar para tratar o prevenir una enfermedad concreta, ejemplos de fármacos que se pueden formular con una proteína de seda de la invención incluyen, entre otros, proteínas, ácidos nucleicos, agentes antitumorales, analgésicos, antibióticos, compuestos antiinflamatorios (tanto esteroideos como no esteroideos), hormonas, vacunas, sustancias marcadas y similares.
Polipéptidos
Por “polipéptido sustancialmente purificado” los autores de la invención quieren decir un polipéptido que generalmente se ha separado de los lípidos, ácidos nucleicos, otros polipéptidos y otras moléculas contaminantes,
45 tales como cera con la que se asocia en su estado nativo. Con la excepción de otras proteínas de la invención, se prefiere que el polipéptido sustancialmente purificado carecen de al menos un 60 %, más preferentemente de al menos un 75 % y más preferentemente de al menos un 90 % de otros componentes con los que se asocian de forma natural.
El término "recombinante” en el contexto de un polipéptido se refiere al polipéptido cuando es producido por una célula o en un sistema de expresión acelular, en una cantidad alterada o en un estado alterado en comparación con su estado nativo. En una realización, la célula es una célula que no produce de forma natural el polipéptido. No obstante, la célula puede ser una célula que comprende un gen no endógeno que hace que se produzca una cantidad alterada, preferentemente incrementada, del polipéptido. Un polipéptido recombinante de la invención
55 incluye polipéptidos que no se han separado de otros componentes de la célula transgénica (recombinante), o sistema de expresión acelular, en la que se produce y los polipéptidos producidos en dichas células o sistemas acelulares que después se purifican de al menos algunos otros componentes.
Los términos “polipéptido” y “proteína” se usan, generalmente, de forma intercambiable y hacen referencia a una única cadena polipeptídica que pueden o no modificarse mediante la adición de grupos no aminoacídicos. Los términos “proteínas” y “polipéptidos”, como se usan en el presente documento, también incluyen variantes, mutantes, modificaciones, análogos y/o derivados de los polipéptidos de la invención como se ha descrito en el presente documento.
65 El % de identidad de un polipéptido se determina mediante análisis GAP (Needleman y Wunsch, 1970) (programa GCG) con una penalización por creación de espacio= 5 y una penalización por extensión de espacio= 0.3. La secuencia problema tiene una longitud de al menos 15 aminoácidos y al análisis GAP alinea las dos secuencias sobre una región de al menos 15 aminoácidos. Más preferentemente, la secuencia problema tiene una longitud de al menos 50 aminoácidos y al análisis GAP alinea las dos secuencias sobre una región de al menos 50 aminoácidos. Más preferentemente, la secuencia problema tiene una longitud de al menos 100 aminoácidos y al análisis GAP
5 alinea las dos secuencias sobre una región de al menos 100 aminoácidos. Incluso más preferentemente, la secuencia problema tiene una longitud de al menos 250 aminoácidos y al análisis GAP alinea las dos secuencias sobre una región de al menos 250 aminoácidos. Incluso más preferentemente, el análisis GAP alinea las dos secuencias sobre la totalidad de su longitud.
Como se usa en el presente documento, un fragmento “biológicamente activo” es una porción de un polipéptido de la invención que mantiene una actividad definida del polipéptido de longitud completa, es decir la capacidad que se va a usar para producir seda. Los fragmentos biológicamente activos pueden ser de cualquier tamaño, siempre que mantengan la actividad definida.
15 Con respecto a un polipéptido definido, se apreciará que cifras de % de identidad mayores que las proporcionadas anteriormente abarcarán realizaciones preferidas. Por tanto, cuando sea aplicable, a la luz de las cifras mínimas de % de identidad, se prefiere que el polipéptido comprenda una secuencia de aminoácidos que se al menos un 40 %, más preferentemente al menos un 45 %, más preferentemente al menos un 50 %, más preferentemente al menos un 55 %, más preferentemente al menos un 60 %, más preferentemente al menos un 65 %, más preferentemente al menos un 70 %, más preferentemente al menos un 75 %, más preferentemente al menos un 80 %, más preferentemente al menos un 85 %, más preferentemente al menos un 90 %, más preferentemente al menos un 91 %, más preferentemente al menos un 92 %, más preferentemente al menos un 93 %, más preferentemente al menos un 94 %, más preferentemente al menos un 95 %, más preferentemente al menos un 96 %, más preferentemente al menos un 97 %, más preferentemente al menos un 98 %, más preferentemente al menos un 99
25 %, más preferentemente al menos un 99,1 %, más preferentemente al menos un 99,2 %, más preferentemente al menos un 99,3 %, más preferentemente al menos un 99,4 %, más preferentemente al menos un 99,5 %, más preferentemente al menos un 99,6 %, más preferentemente al menos un 99.7 %, más preferentemente al menos un 99,8 % e incluso más preferentemente al menos un 99,9 % idéntica a la SEC ID N.º: relevante citada.
Los mutantes de la secuencia de aminoácidos de los polipéptidos de la presente invención se pueden preparar introduciendo cambios nucleotídicos adecuados en el ácido nucleico de la presente invención o mediante síntesis in vitro del polipéptido deseado. Dichos mutantes incluyen, por ejemplo, deleciones, inserciones o sustituciones de residuos dentro de la secuencia de aminoácidos. Se puede realizar una combinación de deleción, inserción y sustitución para llegar a la construcción final, siempre que el producto polipeptídico final posea las características
35 deseadas.
Se pueden preparar polipéptidos mutantes (alterados) usando cualquier técnica conocida en la técnica. Por ejemplo, un polinucleótido de la invención se puede someter a mutagénesis in vitro. Dichas técnicas de mutagénesis in Vitro incluyen a subclonación del polinucleótido en un vector adecuado, transformar el vector en una cepa “mutadora” tal como la E. coli XL-1 red (Stratagene) y propagar las bacterias transformadas durante un número adecuado de generaciones. En otro ejemplo, los polinucleótidos de la invención se someten a técnicas de barajado de ADN como describen ampliamente Harayama (1998). Estas técnicas de barajado de ADN pueden incluir genes de la invención, posiblemente además de los genes relacionados con los de la presente invención, tales como genes de seda de especies de himenópteros o neurópteros aparte de las especies específicas caracterizadas en el presente
45 documento. Los productos derivados de ADN mutado/alterado pueden someterse fácilmente a detección selectiva usando técnicas descritas en el presente documento para determinar si se pueden usar como proteínas de seda.
Al diseñar mutantes de secuencias de aminoácidos, la localización del sitio de la mutación y la naturaleza de la mutación dependerán de las características que se van a modificar. Los sitios de la mutación se pueden modificar individualmente o en serie, por ejemplo (1) sustituyendo primero con elecciones de aminoácidos conservadores y después, como selecciones más radicales en función de los resultados conseguidos, (2) delecionando el residuo diana o (3) insertando otros residuos adyacentes al sitio localizado.
Generalmente, las deleciones en la secuencia de aminoácidos varían de aproximadamente 1 a 15 residuos, más
55 preferentemente de aproximadamente 1 a 10 residuos y normalmente de aproximadamente 1 a 5 residuos contiguos.
Los mutantes de sustitución tienen al menos un residuo de aminoácido en la molécula polipeptídica eliminada y un residuo diferente insertado en su lugar. Los sitios de mayor interés para mutagénesis sustitucional incluyen sitios identificados como importantes para la función.. Otros sitios de interés son aquellos en los que los residuos concretos obtenidos de varias cepas o especies son idénticos. Estas posiciones pueden ser importantes para la actividad biológica Estos sitios, especialmente los que entran dentro de una secuencia de al menos otros tres sitios conservados de forma idéntica, están sustituidos preferentemente de un modo relativamente conservador. Dichas sustituciones conservadoras se muestran en la Tabla 1, bajo el encabezado de “sustituciones de ejemplo”.
65 Como se ha indicado en lo que antecede, una porción de algunos de los polipéptidos de la invención tienen una estructura en superhélice. Las estructuras en superhélice de los polipéptidos se caracterizan por héptadas repetitivas representadas por la secuencia consenso (abcdefg)n. En una realización preferida, la porción del polipéptido que tiene una estructura en superhélice comprende al menos 10 copias de la héptada repetitiva abcdefg y al menos un 25 % de los aminoácidos en las posiciones a y d son residuos alanina.
Tabla 1. Sustituciones de ejemplo
Residuo original
Sustituciones de ejemplo
Ala (A)
Val; Leu; Ile; Gly; Cys; Ser; Thr
Arg (R)
Lys
Asn (N)
Gln; His
Asp (D)
Glu
Cys (C)
Ser; Thr; Ala; Gly; Val
Gln (Q)
Asn; His
Glu (E)
Asp
Gly (G)
Pro; Ala; Ser; Val; Thr
His (H)
Asn; Gln
Ile (I)
Leu; Val; Ala; Met
Leu (L)
Ile; Val; Met; Ala; Phe
Lys (K)
Arg
Met (M)
Leu; Phe
Phe (F)
Leu; Val; Ala
Pro (P)
Gly
Ser (S)
Thr; Ala; Gly; Val; Gln
Thr (T)
Ser; Gln; Ala
Trp (W)
Tyr
Tyr (Y)
Trp; Phe
Val (V)
Ile; Leu; Met; Phe; Ala; Ser; Thr
En una realización preferida, el polipéptido que tiene una estructura en superhélice comprende al menos 12 copias consecutivas, más preferentemente al menos 15 copias consecutivas e incluso más preferentemente al menos 18
10 copias consecutivas de la héptada. En realizaciones adicionales, el polipéptido que tiene una estructura en superhélice puede tener hasta al menos 28 copias de la héptada. Normalmente, las copias de la héptada se repetirán en tándem. No obstante, no necesariamente tienen que ser repeticiones en tándem perfectas, por ejemplo como se muestra en las Figuras 5 y 6, se pueden encontrar unos pocos aminoácidos entre dos héptadas o se pueden encontrar unas pocas héptadas truncadas (véase, por ejemplo, Xenospiral en la Figura 5).
15 En las Figuras 5 y 6, así como en las Tablas 6 a 10, se proporcionan guías sobre las sustituciones de aminoácidos que se pueden efectuar en los polipéptidos de la invención que tienen una estructura en superhélice. Cuando una sustitución de aminoácido útil predicha basada en los datos experimentales proporcionados en el presente documento está de algún modo en conflicto con las sustituciones de ejemplo proporcionadas en la Tabla 1, se
20 prefiere usar una sustitución basada en los datos experimentales.
Las estructura en superhélice de los polipéptidos de la invención tienen un contenido elevado de residuos alanina, en particular en las posiciones a, d y e de la héptada. No obstante, las posiciones b, c, f y g también tienen una frecuencia elevada de residuos de alanina. En una realización preferida, al menos el 15 % de los aminoácidos en las
25 posiciones a, d y/o e de las héptadas son residuos alanina, más preferentemente al menos el 25 %, más preferentemente al menos el 30 %, más preferentemente al menos el 40 % e incluso más preferentemente al menos el 50%. En una realización preferida adicional, al menos el 25 % de los aminoácidos en las dos posiciones a y d de las héptadas son residuos alanina, más preferentemente al menos el 30 %, más preferentemente al menos el 40 %, más preferentemente al menos el 50 %. Además, se prefiere que al menos el 15 % de los aminoácidos en las
30 posiciones b, c, f y g de las héptadas son residuos alanina, más preferentemente al menos el 20 % e incluso más preferentemente al menos el 25 %.
Normalmente, las héptadas no comprenderán ningún residuo prolina o hisitidina. Además, las héptadas comprenderán pocos (1 o 2), si alguno, residuos fenilalanina, metionina, tirosina, cisteína, glicina o triptófano. Aparte de la alanina, aminoácidos frecuentes (por ejemplo más del 5, más preferentemente más del 10 %) en las héptadas incluyen leucina (particularmente en las posiciones b y d), serina (particularmente en las posiciones b, e y f), ácido glutámico (particularmente en las posiciones c, e y f), lisina (particularmente en las posiciones b, c, d, f y g), así como arginina en la posición g.
5 Los polipéptidos (y polinucleótidos) de la invención se pueden purificar (aislar) de una amplia variedad de especies de himenópteros y neurópteros. Ejemplos de himenópteros incluyen, entre otros, cualquier especie del suborden Apocrita (abejas, hormigas y avispas), que incluyen las siguientes familias de insectos: Chrysididae (avispas cuco), Formicidae (hormigas), Mutillidae (hormigas terciopelo), Pompilidae (avispas araña), Scoliidae, Vespidae (avispas del papel, avispa alfarera, avispón), Agaonidae (avispas de los higos), Chalcididae (calcídidos), Eucharitidae (eucarítidos), Eupelmidae (eupélmidos), Pteromalidae (pteromálidos), Evaniidae (avispas insignia), Braconidae, Ichneumonidae (icneumónidos), Megachilidae, Apidae, Colletidae, Halictidae y Melittidae (abejas recolectoras de aceite). Ejemplos de neurópteros incluyen las especies de las siguientes familias de insectos: Mantispidae, Chrysopidae (crisopas), Myrmeleontidae (hormigas león) y Ascalaphidae (moscas del búho). Estos polipéptidos (y
15 polinucleótidos) adicionales se pueden caracterizar usando los mismos procedimientos descritos en el presente documento para las sedas de Bombus terrestris, Myrmecia forficata, Oecophylla smaragdina y Mallada signata.
Además, si se desea, se pueden introducir aminoácidos no naturales o análogos de aminoácidos químicos como una sustitución o adición en los polipéptidos de la presente invención. Dichos aminoácidos incluyen, entre otros, los isómeros D de los aminoácidos comunes ácido 2,4-diaminobutírico, ácido α-amino isobutírico, ácido 4-aminobutírico, ácido 2-aminobutírico, ácido 6-amino hexanoico, ácido 2-amino isobutírico, isobutírico 3-amino propiónico, ornitina, norleucina, norvalina, hidroxiprolina, sarcosina, citrulina, homocitrulina, ácido cisteico, t-butilglicina, t-butilalanina, fenilglicina, ciclohexilalanina, !-alanina, fluoro-aminoácidos, aminoácidos diseñados tales como !-etil aminoácidos, C-α-metilaminoácidos, N-α-metiaminoácidos y análogos de aminoácidos en general.
25 También se incluyen dentro del alcance de la invención polipéptidos de la presente invención que se modifican de forma diferencial durante o después de la síntesis, por ejemplo mediante biotinilación, bencilación, glicosilación, acetilación, fosforilación, amidación, derivatización mediante grupos protectores/de bloqueo conocidos, escisión proteolítica, unión a una molécula de anticuerpo u otro ligando celular etc. Estas modificaciones pueden servir para incrementar la estabilidad y/o la bioactividad del polipéptido de la invención.
Los polipéptidos de la presente invención se pueden producir de diversos modos, incluyendo producción y recuperación de polipéptidos naturales, producción y recuperación de polipéptidos recombinantes y síntesis química de los polipéptidos. En una realización, un polipéptido aislado de la presente invención se produce cultivando una
35 célula capaz de expresar el polipéptido en condiciones eficaces para producir el polipéptido y recuperar el polipéptido. Una célula preferida de cultivo es una célula recombinantes de la presente invención. Condiciones de cultivo eficaces incluyen, entre otras, medios eficaces, biorreactor, temperatura, pH y condiciones de oxígeno que permitan la producción del polipéptidos. Un medio eficaz se refiere a cualquier medio en el que una célula se cultiva para producir un polipéptido de la presente invención. Dicho medio normalmente comprende un medio acuoso que tiene fuentes de carbono, nitrógeno y fosfato asimilables y sales, minerales, metales y otros nutrientes como vitaminas adecuados. Las células de la presente invención se pueden cultivar en biorreactores de fermentación convencionales, matraces de agitación, tubos de ensayo, placas de microtitulación y placas petri. El cultivo se puede llevar a cabo a una temperatura, pH y contenido en oxígeno adecuados para una célula recombinante. Dichas condiciones de cultivo entran dentro de la experiencia de un experto en la técnica.
45 Polinucleótidos
Por un “polinucleótido aislado”, incluidos ADN, ARN o una combinación de estos, monocatenario o bicatenario, en orientación sentido o antisentido o una combinación de ambas, ARNds o de otro modo, los autores de la invención quieren decir un polinucleótido que está separado, al menos parcialmente, de las secuencias de polinucleótidos con las que se asocia o une en su estado nativo. Preferentemente, el polinucleótido aislado carece de al menos un 60 %, preferentemente de al menos un 75 % y más preferentemente de al menos un 90 %, de otros componentes con los que se asocian de forma natural. Además, El término “polinucleótido” se usa de forma intercambiable en el presente documento con la expresión “ácido nucleico”.
55 El término "exógeno” en el contexto de un polinucleótido se refiere al polinucleótido cuando está presente en una célula o en un sistema de expresión acelular, en una cantidad alterada en comparación con su estado nativo. En una realización, la célula es una célula que no comprende de forma natural el polinucleótido. No obstante, la célula puede ser una célula que comprende un polinucleótido no endógeno que tiene como resultado una cantidad alterada, preferentemente incrementada, de producción del polipéptido codificado. Un polinucleótido exógeno de la invención incluye polinucleótidos que no se han separado de otros componentes de la célula transgénica (recombinante), o sistema de expresión acelular, en la que está presente y los polinucleótidos producidos en dichas células o sistemas acelulares que después se purifican de al menos algunos otros componentes.
65 El % de identidad de un polinucleótido se determina mediante análisis GAP (Needleman and Wunsch, 1970) (programa GCG) con una penalización por creación de espacio= 5 y una penalización por extensión de espacio= 0.3. A menos que se indique lo contrario, la secuencia problema tiene una longitud de al menos 45 nucleótidos y al análisis GAP alinea las dos secuencias sobre una región de al menos 45 nucleótidos. Preferentemente, la secuencia problema tiene una longitud de al menos 150 nucleótidos y al análisis GAP alinea las dos secuencias sobre una región de al menos 150 nucleótidos. Más preferentemente, la secuencia problema tiene una longitud de al menos
5 300 nucleótidos y al análisis GAP alinea las dos secuencias sobre una región de al menos 300 nucleótidos. Incluso más preferentemente, el análisis GAP alinea las dos secuencias sobre la totalidad de su longitud.
Con respecto a los polinucleótidos definidos, se apreciará que cifras de % de identidad mayores que las proporcionadas anteriormente abarcarán realizaciones preferidas. Por tanto, cuando sea aplicable, a la luz de las cifras mínimas de % de identidad, se prefiere que un polinucleótido de la invención comprenda una secuencia que sea al menos un 40 %, más preferentemente al menos un 45 %, más preferentemente al menos un 50 %, más preferentemente al menos un 55 %, más preferentemente al menos un 60 %, más preferentemente al menos un 65 %, más preferentemente al menos un 70 %, más preferentemente al menos un 75 %, más preferentemente al menos un 80 %, más preferentemente al menos un 85 %, más preferentemente al menos un 90 %, más
15 preferentemente al menos un 91 %, más preferentemente al menos un 92 %, más preferentemente al menos un 93 %, más preferentemente al menos un 94 %, más preferentemente al menos un 95 %, más preferentemente al menos un 96 %, más preferentemente al menos un 97 %, más preferentemente al menos un 98 %, más preferentemente al menos un 99 %, más preferentemente al menos un 99,1 %, más preferentemente al menos un 99,2 %, más preferentemente al menos un 99,3 %, más preferentemente al menos un 99,4 %, más preferentemente al menos un 99,5 %, más preferentemente al menos un 99,6 %, más preferentemente al menos un 99.7 %, más preferentemente al menos un 99.8 % e incluso más preferentemente al menos un 99,9 % idéntica a la SEC ID N.º: relevante citada.
Los polinucleótidos de la presente invención pueden poseer, cuando se comparan con moléculas naturales, una o
25 más mutaciones que son deleciones, inserciones o sustituciones de residuos nucleotídicos. Los mutantes pueden ser naturales (es decir, aislados de una fuente natural) o sintéticos (por ejemplo, realizando mutagénesis dirigida a sitio sobre el ácido nucleico).
Los oligonucleótidos y/o polinucleótidos de la invención hibridan con un gen de seda de la presente invención o con una región flanqueante de dicho gen en condiciones rigurosas. La expresión “condiciones de hibridación rigurosas” y similares, como se usan en el presente documento, hace referencia a parámetros con los que la técnica está familiarizada, incluida la variación de la temperatura de hibridación con la longitud de un oligonucleótido. Los parámetros de hibridación de ácido nucleico se pueden encontrar en las referencias que recopilan dichos procedimientos, Sambrook y cols., (supra) y Ausubel y cols., (supra). Por ejemplo, las condiciones de hibridación
35 rigurosas, como se usan en el presente documento, pueden hacer referencia a hibridación a 65 ºC en tampón de hibridación (3,5 x SSC, 0,02 % Ficoll, 0,02 % de polivinil pirrolidona, 0,02 % seroalbúmina bovina (BSA), NaH2PO4 2,5 mM (pH 7), 0,5 % SDS, EDTA 2 mM), seguido de uno o más lavados en 0,2 x SSC, 0,01 % de BSA a 50°C. Como alternativa, el ácido nucleico y/o los oligonucleótidos (que también se pueden denominar ”cebadores” o “sondas”) hibridan con la región del genoma de un insecto de interés, tal como el genoma de una abeja melífera, en condiciones usadas en las técnicas de amplificación de ácido nucleico, tal como PCR.
Los oligonucleótidos de la presente invención pueden ser ARN, ADN o derivados de los mismos. Aunque los términos polinucleótido y oligonucleótido tienen un significado solapante, los oligonucleótidos normalmente son moléculas monocatenarias relativamente cortas. El tamaño mínimo de dichos oligonucleótidos es el tamaño
45 necesario para la formación de un híbrido estable entre un oligonucleótido y una secuencia complementaria sobre una molécula de ácido nucleico diana. Preferentemente, los oligonucleótidos tienen una longitud de al menos 15 nucleótidos, más preferentemente al menos 18 nucleótidos, más preferentemente al menos 19 nucleótidos, más preferentemente al menos 20 nucleótidos, incluso más preferentemente al menos 25 nucleótidos.
Normalmente, los monómeros de un polinucleótido u oligonucleótido están unidos por enlaces fosfodiéster o análogos de los mismos para formar oligonucleótidos de tamaño variable desde unidades monoméricas relativamente cortas, por ejemplo 12-18, a varios cientos de unidades monoméricas. Los análogos de enlaces fosfodiéster incluyen: fosforotioato, fosforoditioato, fosforoselenoato, fosforodiselenoato, fosforoanilotioato, fosforoanilidato, fosforoamidato.
55 La presente invención incluye oligonucleótidos que se pueden usar como, por ejemplo, sondas para identificar moléculas de ácido nucleico, o cebadores para producir moléculas de ácido nucleico. Los oligonucleótidos de la presente invención usados como sonda están normalmente conjugados con un marcador detectable, tal como un radioisótopo, una enzima, biotina, una molécula fluorescente o una molécula quimioluminiscente.
Vectores recombinantes
Una realización de la presente invención incluye un vector recombinante que comprende al menos una molécula de polinucleótido aislada de la presente invención, insertada en cualquier vector capaz de liberar la molécula de 65 polinucleótido en una célula huésped. Dicho vector contiene secuencias de polinucleótidos heterólogas, es decir secuencias de polinucleótidos que no se encuentran de forma natural adyacentes a de moléculas de polinucleótidos
de la presente invención y que, preferentemente, proceden de una especie distinta a la especie de la que deriva la(s) molécula(s) de polinucleótidos. El vector puede ser ADN o ADN, procariota o eucariota y normalmente es un transposón (tal como el descrito en el documento US 5.792.294), un virus o un plásmido.
5 Un tipo de vector recombinante comprende una molécula de polinucleótidos de la presente invención unida operablemente a un vector de expresión. La expresión ligado de forma operativa se refiere a la inserción de una molécula de polinucleótido en un vector de expresión de un modo tal que la molécula puede ser expresada cuando se transforma en una célula huésped. Como se usa en el presente documento, un vector de expresión es un vector de ADN o ARN que es capaz de transformar una célula huésped y de efectuar la expresión de una molécula de polinucleótido especificada. Preferentemente, el vector de expresión también es capaz de replicarse dentro de la célula huésped. Los vectores de expresión pueden ser procariotas o eucariotas y normalmente son virus o plásmidos. Los vectores de expresión de la presente invención incluyen cualquier vector que funciona (es decir, expresión directa del gen) en células recombinantes de la presente invención, incluyendo en células bacterianas, fúngicas, endoparásitos, artrópodos, animales y vegetales. Los vectores de expresión particularmente preferidos de
15 la presente invención pueden dirigir la expresión génica en células vegetales. Los vectores de la invención también se pueden usar para reducir el polipéptido en un sistema de expresión acelular, dichos sistemas son bien conocidos en la técnica.
En particular, los vectores de expresión de la presente invención contienen secuencias reguladoras, tales como secuencias de control de la transcripción, secuencias de control de la traducción, orígenes de replicación y otras secuencias reguladoras que son compatibles con la célula recombinante y que controlan la expresión de moléculas de polinucleótidos de la presente invención. En concreto, las moléculas recombinantes de la presente invención incluyen secuencias de control de la transcripción. Las secuencias del control de la transcripción son secuencias que controlan el inicio, la elongación y la terminación de la transcripción. Secuencias del control de la transcripción 25 particularmente importantes son aquellas que controlan el inicio de la transcripción, tales como las secuencias promotoras, potenciadoras, operadoras y represoras. Secuencias del control de la transcripción adecuadas incluyen cualquier secuencia del control de la transcripción que puede funcionar en al menos una de las células recombinantes de la presente invención. Los expertos en la técnica conocen diversas de estas secuencias del control de la transcripción. secuencias del control de la transcripción preferidas incluyen las que funcionan en células bacterianas, de levadura, de artrópodos, vegetales o de mamífero, tales como, entre otros, to, tac, lac, trp, trc, oxypro, omp/lpp, rrnB, bacteriófago lambda, bacteriófago T7, T7lac, bacteriófago T3, bacteriófago SP6, bacteriófago SP01, metalotioneína, factor alfa de apareamiento, alcohol oxidasa de Pichi , promotores subgenómicos de alfavirus (tales como los promotores subgenómicos del virus Sindbis), gen de la resistencia a antibiótico, baculovirus, virus del insecto Heliothis zea, virus vacunal, herpesvirus, virus de la viruela de mapache, otros virus de viruela, adenovirus,
35 citomegalovirus (tal como los promotores tempranos intermedios), virus 40 del simio, retrovirus, actina, repetición terminal larga retroviral, virus del sarcoma de Rous, shock térmico, secuencias de control de la transcripción de fosfato y nitrato así como otras secuencias capaces de controlar la expresión génica en células procariotas o eucariotas.
Secuencias del control de la transcripción particularmente preferidas son los promotores activos en la dirección de la transcripción en plantas, bien de forma constitutiva o específica de estadio y/o de tejido dependiendo del uso de la planta o partes de la misma. Estos promotores vegetales incluyen, entre otros, promotores que muestran expresión constitutiva, tales como el promotor 35S del virus del mosaico de la coliflor (CaMV), los de expresión específica de la hoja, tales como el promotor del gen de la subunidad pequeña de la ribulosa bifosfato carboxilasa, los de la
45 expresión específica de la raíz, tal como el promotor del gen de la glutamina sintasa, los de la expresión específica de la semilla, tal como el promotor de la cruciferina A de Brassica napus, los de la expresión específica del tubérculo, tal como el promotor de la patatina de clase I de la patata o los de la expresión específica del fruto, tal como el promotor de la poligalaturonasa (PG) del tomate.
Las moléculas recombinantes de la presente invención pueden también (a) contener señales secretoras (es decir secuencias de ácido nucleico del segmento señal) para permitir que se secrete un polipéptido expresado de la presente invención de la célula que produce el polipéptido y/o (b) contener secuencias de fusión que conducen a la expresión de moléculas de ácido nucleico de la presente invención como proteínas de fusión. Ejemplos de segmentos señal adecuados incluyen cualquier segmento señal capaz de dirigir la secreción de un polipéptido de la
55 presente invención. Segmentos señal preferidos incluyen, entre otros, el activador del plasminógeno tisular (t-PA), interferón, interleucina, hormona de crecimiento, segmentos señal de la glicoproteína de la cubierta viral, péptido señal de Nicotiana nectarin (documento US 5,939,288), señal de extensión del tabaco, la señal de la proteína de unión en el cuero del aceite oleosina de soja, péptido señal de chitinasa básica vacuolar de Arabidopsis thaliana, así como las secuencias señal nativas de un polipéptido de la invención. Además, la molécula de ácido nucleico de la presente invención se puede unir a un segmento de fusión que dirige el polipéptido codificado al proteosoma, tal como un segmento de fusión de ubiquitina. Las moléculas recombinantes pueden también incluir secuencias intermedias y/o no traducidas que rodean y/o que están dentro de las secuencias de ácido nucleico de la presente invención.
65 Células huésped Otra realización de la presente invención incluye una célula recombinante que comprende una célula huésped transformada con una o más moléculas recombinantes de la presente invención o células progenie de las mismas. La transformación de una molécula de polinucleótido en una célula puede conseguirse por cualquier procedimiento por el que se puede insertar una molécula de polinucleótido en la célula. Las técnicas de transformación incluyen,
5 entre otros, transfección, electroporación, microinyección, lipofección, adsorción y fusión de protoplastos. Una célula recombinante puede permanecer unicelular o puede crecer en un tejido, órgano u organismo multicelular. Las moléculas de polinucleótidos transformadas de la presente invención pueden permanecer extracromosómicas o pueden integrarse en uno o más sitios dentro de un cromosoma de la célula transformada (es decir, recombinante) de un modo tal que se conserve su capacidad para expresarse.
Entre las células huésped adecuadas para transformar se incluye cualquier célula que se puede transformar con un polinucleótido de la presente invención. Las células huésped de la presente invención pueden ser capaces endógenamente (es decir, naturalmente) de producir polipéptidos de la presente invención o pueden ser capaces de producir dichos polipéptidos tras ser transformadas con al menos una molécula de polinucleótido de la presente 15 invención. Las células huésped de la presente invención puede ser cualquier célula capaz de producir al menos una proteína de la presente invención e incluyen en células bacterianas, fúngicas (incluidas levaduras), parásitos, artrópodos, animales y vegetales. Ejemplos de células huésped incluyen células de Salmonella, Escherichia, Bacillus, Listeria, Saccharomyces, Spodoptera, Mycobacteria, Trichoplusia, BHK (de riñón de hámster chino), células MDCK, células CRFK, células CV-1, células COS (p.ej., COS-7) y células Vero. Otros ejemplos de células huésped son E. coli, incluyendo derivados de E. coli K-12; Salmonella typhi; Salmonella typhimurium, incluidas cepas atenuadas; Spodoptera-frugiperda; Trichoplusia ni; y células G8 de mioblasto de ratón no tumorigénicas (p.ej., ATCC CRL 1246). Células huésped de mamífero adecuadas adicionales incluyen otras líneas celulares de riñón, otras líneas celulares de fibroblastos (p. ej., líneas celulares humanas, murinas o de embrión de pollo), líneas celulares de mieloma, células de ovario de hámster chino, células NIH/3T3 de ratón, células LMTK y/o células HeLa. Células
25 huésped particularmente preferidas son células vegetales tales como las disponibles en Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH (Colección alemana de microorganismos y cultivos celulares).
Se pueden usar tecnologías de ADN recombinante para mejorar la expresión de una molécula de polinucleótidos transformada mediante manipulación de, por ejemplo, el número de copias de la molécula de polinucleótidos dentro de una célula huésped, la eficiencia con la que se transcriben dichas moléculas de polinucleótidos, la eficiencia con la que los transcritos resultantes se traducen y la eficiencia de las modificaciones postraduccionales. Las técnicas recombinantes útiles para incrementar la expresión de las moléculas de polinucleótidos de la presente invención incluyen, entre otras, la unión operativa de moléculas de polinucleótidos a plásmidos de un alto número de copias, integración de la molécula de polinucleótidos en uno o más cromosomas de las células huésped, la adición de
35 secuencias de estabilidad del vector a los plásmidos, sustituciones o modificaciones de las señales de control de la transcripción (p. ej., promotores, operadores, potenciadores), sustituciones o modificaciones de de las señales de control de la traducción (p. ej., sitios de unión al ribosoma, secuencias de Shine-Dalgarno), modificación de las moléculas de polinucleótidos de la presente invención para corresponder al uso de codones de la célula huésped y la deleción de secuencias que desestabilizan los transcritos.
Plantas transgénicas
El término “planta” se refiere a plantas enteras, órganos de plantas (p. ej., hojas, tallos, raíces, etc.), semillas, células vegetales y similares. Las plantas contempladas para usar en la práctica de la presente invención incluyen
45 monocotiledóneas y dicotiledóneas. Las plantas diana incluyen, entre otras, las siguientes: Cereales (trigo, cebada, centeno, avena, arroz, sorgo y cultivos relacionados); remolacha (remolacha azucarera y remolacha forrajera); patatas, frutas con hueso y frutas blandas (manzanas, peras, ciruelas, melocotones, almendras, cerezas, fresas, moras y frambuesas); plantas leguminosas (judías, lentejas, guisantes, soja); plantas oleosas (colza, mostaza, amapola, olivas, girasoles, coco, plantas de aceite de ricino, granos de cacao, cacahuetes; plantas de pepino (médula, pepinos, melones; plantas de fibra (algodón, lino, cáñamo, yute); frutos cítricos (naranjas, limones, uvas, mandarinas); hortalizas (espinaca, lechuga, espárrago, coles, zanahorias, cebollas, tomates, patatas, pimentón); lauráceas (aguacate, canela, alcanfor) o plantas tales como maíz, tabaco, nueces, café, caña de azúcar, té, vides, pastos, plátanos y plantas de caucho natural, así como plantas decorativas (flores, arbustos, árboles de hoja ancha y de hoja perenne, tales como coníferas).
55 Las plantas transgénicas según se definen en el contexto de la presente invención incluyen plantas (así como partes y células de dichas plantas) y su progenie que se han modificado genéticamente usando técnicas recombinantes para efectuar la producción de al menos un polipéptido de la presente invención en la planta u órgano de planta deseado. Las plantas transgénicas se pueden producir usando técnicas conocidas en la materia, tales como las que se describen en general en A. Slater y cols., Plant Biotechnology-The Genetic Manipulation of Plants, Oxford University Press (2003) y P. Christou and H. Klee, Handbook of Plant Biotechnology, John Wiley and Sons (2004).
Un polinucleótido de la presente invención se puede expresar de forma constitutiva en las plantas transgénicas durante todos los estadios de desarrollo. En función del uso de la planta o los órganos de planta, los polipéptidos se
65 pueden expresar de un modo específico del estadio. Además, los polinucleótidos se pueden expresar de un modo específico de tejido.
En la presente invención se pueden usar secuencias reguladoras que se sabe o se ha encontrado que causan la expresión de un gen que codifica un polipéptido de interés en plantas. La elección de las secuencias reguladoras usadas depende de la planta diana y/u órgano diana de interés. Dichas secuencias reguladoras se pueden obtener
5 de plantas o virus vegetales o se pueden sintetizar químicamente. Dichas secuencias reguladoras son bien conocidas para los expertos en la técnica.
Los promotores vegetales constitutivos son bien conocidos. Además de los promotores mencionados anteriormente, algunos otros promotores adecuados incluyen, entre otros, el promotor de la nopalina sintasa, el promotor de la octopina sintasa, el promotor 35S de CaMV, el promotor de la ribulosa-1,5-biosfato carboxilasa, Adhl-based pEmu, Actl, el promotor de la SAM sintasa y los promotores Ubi y el promotor de la proteína de unión a la clorofila a/b. Como alternativa, se puede desear que el o los transgén(es) se expresen de un modo regulado. La expresión regulada de los polipéptidos es posible colocando la secuencia de codificación de la proteína de seda sometida al control de los promotores que son específicos de tejido, específicos del desarrollo o inducibles. Se han notificado en
15 plantas varios genes y/o promotores regulados específicos de tejido. Estos incluyen genes que codifican las proteínas de almacenamiento de semillas (tales como napina, cruciferina, !-conglicinina, glicinina y faseolina), zeína
o proteínas corporales de aceite (tales como oleosina), o genes implicados en la biosíntesis de los ácidos grasos (incluida la proteína transportadora de acilo, la estearoil-ACP desaturasa y ácido graso desaturasas (fad 2- 1)) y otros genes expresados durante el desarrollo del embrión (tal como Bce4). Particularmente útil para la expresión específica de semilla es el promotor de la vicilina de guisante. Otros promotores útiles para expresión en hojas Madras son los que se cambian al inicio de la senescencia, tales como el promotor SAG de Arabidopsis). Una clase de promotores específicos del fruto expresados en o durante la antesis hasta el desarrollo del fruto, a menos hasta el comienzo de la maduración, se trata en el documento US 4.943.674. Otros ejemplos de promotores específicos de tejido incluyen los que dirigen la expresión en tubérculos (por ejemplo el promotor del gen de la patatina) y en
25 células de fibra (un ejemplo de una proteína de célula de fibra regulada por el desarrollo es la fibra E6).
Otras secuencias reguladoras tales como las secuencias de terminación y las señales de poliadenilación incluyen las secuencias que funcionan como tales en plantas, cuya elección sería obvia para el destinatario experto. La región de terminación usada en el casete de expresión se escogerá principalmente por comodidad, ya que las regiones de terminación parecen ser relativamente intercambiables. La región de terminación que se usa puede ser nativa con la región de inicio de la transcripción, puede ser nativa con la secuencia de polinucleótidos de interés o puede derivar de otra fuente. La región de terminación puede ser natural o completa o parcialmente sintética. Las regiones de terminación cómodas están disponibles del plásmido Ti de A. tumefaciens, tal como las regiones de terminación de la octopina sintasa y la nopalina sintasa o de los genes para !-faseolina, el gen lant inducible químicamente, pIN.
35 Se dispone de varias técnicas para la introducción de una construcción de expresión que contiene una secuencia de ácido nucleico que codifica un polipéptido de interés en las plantas diana. Dichas técnicas incluyen, entre otras, la transformación de protoplastos que usan el método de calcio/polietilenglicol, electroporación y microinyección o bombardeo de partículas (recubrimiento). Además de estos denominados procedimientos de transformación directa de ADN, los sistemas de transformación que implican vectores están ampliamente disponibles, tales como vectores virales y bacterias (p. ej., del género Agrobacterium). Tras la selección y/o detección selectiva, los protoplastos, células o partes de plantas que se han transformado se pueden regenerar en plantas enteras usando procedimientos conocidos en la técnica. La elección de las técnicas de transformación y/o de regeneración no es crucial para la presente invención.
45 Para confirmar la presencia de los transgenes en células y plantas transgénicas se puede realizar amplificación mediante reacción en cadena de la polimerasa (PCR) o análisis de transferencia de tipo Southern usando procedimientos conocidos para los expertos en la técnica. Los productos de expresión de los transgenes se pueden detectar en cualquiera de diversos modos, dependiendo de la naturaleza del producto e incluyen transferencia de tipo Western y ensayo enzimático. Un modo particularmente útil para cuantificar la expresión proteica y detectar la replicación en diferentes tejidos vegetales es usar un gen indicador, tal como GUS. Una vez que se han obtenido plantas transgénicas, se pueden cultivar para producir tejidos vegetales o partes de plantas que tienen el fenotipo deseado. El tejido vegetal o las partes de plantas se pueden recoger y/o sembrar. La semilla puede servir como fuente para el crecimiento de plantas adicionales con tejidos o partes que tienen las características deseadas.
55 Animales transgénicos no humanos
En la materia se conocen bien las técnicas para producir animales transgénicos. Un libro de texto general útil sobre esta materia es Houdebine, Transgenic animals -Generation and Use (Harwood Academic, 1997).
Se puede introducir ADN heterólogo, por ejemplo en ovarios de mamífero fertilizados. Por ejemplo, células madre totipotenciales o pluripotenciales se pueden transformar mediante microinyección, precipitación mediada por fosfato cálcico, fusión de liposomas, infección retroviral u otros medios, las células transformadas se introducen después en el embrión y a continuación, el embrión se desarrolla en un animal transgénico. En un procedimiento altamente
65 preferido, los embriones en desarrollo se infectan con un retrovirus que contiene el ADN deseado y los animales transgénicos producidos a partir del embrión infectado. No obstante, en un procedimiento más preferido, los ADN adecuados se inyectan conjuntamente en el pronúcleo o citoplasma del embrión, preferentemente en el estadio de célula única y se deja desarrollar el embrión en animales transgénicos maduros.
Otro procedimiento usado para producir un animal transgénico implica la microinyección de un ácido nucleico en 5 huevos en estado pronuclear mediante procedimientos estándar. Los huevos inyectados se cultivan después antes de la transferencia a los oviductos de receptores seudogestantes.
Los animales transgénicos también se pueden producir mediante tecnología de transferencia nuclear. Usando este procedimientos, los fibroblastos de animales donantes se transfectan de forma estable con un plásmido que incorpora las secuencias de codificación para un dominio de unión o pareja de unión de interés sometido al control de secuencias reguladoras. Después, los transfectantes estables se condensan con oocitos enucleados, se cultivan y se transfieren en receptores hembra.
Procedimientos de recuperación y producción de seda
15 Las proteínas de seda de la presente invención se pueden extraer y purificar de células recombinantes, tales como células vegetales, bacterianas o de levadura, produciendo dicha proteína mediante diversos procedimientos. En una realización, el procedimiento implica la eliminación de proteínas celulares nativas de células/tejidos/plantas homogeneizadas etc., disminuyendo el pH y calentando, seguido de fraccionamiento con sulfato amónico. Brevemente, las proteínas solubles totales se extraen homogeneizando las células/tejidos/plantas. Las proteínas nativas se eliminan mediante precipitación a pH 4,7 y después a 60ºC. El sobrenadante resultante se fracciona después con sulfato amónico a una saturación del 40 %. La proteína resultante tendrá una pureza del orden del 95 %. La purificación adicional se puede conseguir mediante cromatografía en gel o de afinidad convencional.
25 En otro ejemplo, los lisados celulares se tratan con concentraciones altas de ácido, por ejemplo HCl o ácido propiónico para reducir el pH a ∀ 1-2 durante 1 hora o más, que solubilizará las proteínas de seda pero precipitará otras proteínas.
Se formarán agregados fibrilares a partir de soluciones mediante autoensamblaje espontáneo de las proteínas de seda de la invención cuando la concentración proteica supera un valor crítico. Los agregados se pueden reunir y centrifugar mecánicamente en fibras macroscópicas de acuerdo con el método de O'Brien y cols., (I. O'Brien y cols., "Design, Synthesis and Fabrication of Novel Self-Assembling Fibrillar Proteins", en Silk Polymers: Materials Science and Biotechnology, páginas 104-117, Kaplan, Adams, Farmer y Viney, eds., c. 1994 por American Chemical Society, Washington, D.C.).
35 Por la naturaleza de la estructura secundaria en superhélice inherente, las proteínas tales como Xenospiral-4, BBF14, BAF1-4 y GAF1-4 se formarán espontáneamente la estructura secundaria en superhélice tras deshidratación. Como se describe más adelante, la fuerza de la superhélice se puede potenciar mediante reticulación enzimática o química de residuos de lisina muy cercanos.
Las fibras de seda y/o los copolímeros de la invención tienen un bajo requisito de procesamiento. Las proteínas de seda de la invención requieren un procesamiento mínimo, por ejemplo centrifugación para formar una fibra fuerte ya que forma de modo espontáneo superhélices fuertes que se pueden reforzar con reticulaciones tales como reticulaciones de lisina. Esto contrasta con los polipéptidos de seda recombinante de B. mori y de araña, que
45 requieren sofisticadas técnicas de centrifugación con el fin de obtener la estructura secundaria (lámina !) y la fuerza de la fibra.
No obstante, las fibras se pueden centrifugar en soluciones que tienen propiedades características de una fase de cristal líquido. La concentración de fibra a la que se puede producir la transición de fase depende de la composición de una proteína o combinación de proteínas presentes en la solución. No obstante, la transición de fase se puede detectar monitorizando la claridad y la birrefringencia de la solución. El inicio de una fase de cristal líquido se puede detectar cuando la solución adquiere un aspecto translúcido y registra birrefringencia cuando se ve a través de filtros de polarización cruzada.
55 En una técnica de formación de fibra, las fibras se pueden extrudir primero de la solución proteica a través de un orificio en metanol hasta que se produce una longitud suficiente para que sea captada por un medio mecánico. Después se puede extraer una fibra mediante dicho medio mecánico a través de una solución de metanol, recoger y secar. Los procedimientos para estirar fibras se consideran bien conocidos en la técnica.
Otros ejemplos de procedimientos que se pueden usar para producir fibras de seda y/o copolímeros de la presente invención se describen en los documentos US 2004/0170827 y US 2005/0054830.
En una realización preferida, las fibras de seda y/o copolímeros de la invención están reticulados, En una realización, las fibras de seda y/o copolímeros están reticulados a una superficie/artículo/producto etc. de interés
65 usando técnicas conocidas en la técnica. En otra realización (o en combinación con la realización anterior), al menos algunas proteínas de seda en las fibras de seda y/o copolímeros están reticulados entre sí. Preferentemente, las proteínas de seda están reticuladas mediante residuos lisina en las proteínas. Dicha reticulación se puede realizar usando técnicas químicas y/o enzimáticas conocidas en la materia. Por ejemplo, las reticulaciones enzimáticas se pueden catalizar mediante la lisil oxidasa, mientras que las reticulaciones no enzimáticas se pueden generar a partir de residuos lisina glicados (Reiser y cols., 1992).
5 Anticuerpos
La invención también proporciona anticuerpos monoclonales o policlonales frente a polipéptidos de la invención o fragmentos de los mismos. Por tanto, la presente invención también proporciona un procedimiento para la producción de anticuerpos monoclonales o policlonales frente a polipéptidos de la invención.
La expresión “se une específicamente” se refiere a la capacidad del anticuerpo para unirse a al menos un polipéptido de la presente invención pero no a otras proteínas de seda conocidas.
15 Como se usa en el presente documento, “epítopo” se refiere a una región de un polipéptido de la invención a la que se une el anticuerpo. Un epítopo se puede administrar a un animal para generar anticuerpos contra el epítopo, no obstante los anticuerpos de la presente invención se unen específicamente, preferentemente, a la región del epítopo en el contexto de todo el polipéptido.
Si se desean anticuerpos policlonales, un mamífero seleccionado (p. ej., ratón, conejo, cabra, caballo etc.) se inmuniza con un polipéptido inmunogénico de la invención. El suero del animal inmunizado se recoge y se trata de acuerdo con procedimientos conocidos. Si el suero que contiene anticuerpos policlonales contiene anticuerpos frente a otros antígenos, los anticuerpos policlonales se pueden purificar mediante cromatografía de inmunoafinidad. Las técnicas para producir y procesar el antisuero policlonal se conocen en la materia. Con el fin de producir dichos
25 anticuerpos, la invención también proporciona polipéptidos de la invención o fragmentos de los mismos haptenizados con otro polipéptido para uso como inmunógenos en animales.
Un experto en la técnica puede producir fácilmente anticuerpos monoclonales dirigidos contra los polipéptidos de la invención. La metodología general para fabricar anticuerpos monoclonales mediante hibridomas es bien conocida. Las líneas celulares productoras de anticuerpos inmortales se pueden crear mediante fusión celular y también mediante otras técnicas tales como transformación directa de linfocitos B con ADN oncogénico o transfección con el virus de Epstein-Barr. Paneles de anticuerpos monoclonales producidos se pueden someter a detección selectiva de varias propiedades, es decir por afinidad de isotipo y epítopo.
35 Una técnica alternativa implica la detección selectiva en bibliotecas de expresión en fagos en las que, por ejemplo, el fago expresa fragmentos scFv sobre la superficie de su recubrimiento con una gran variedad de regiones determinantes de la complementariedad (CDR). Esta técnica es bien conocida en la materia.
Para los fines de la presente invención, el término “anticuerpo”, a menos que se especifique lo contrario, incluye fragmentos de anticuerpos enteros que conservan su actividad de unión a un antígeno diana Dichos fragmentos incluyen fragmentos Fv, F(ab') y F(ab')2, así como anticuerpos monocatenarios (scFv). Además, los anticuerpos y fragmentos de los mismos pueden ser anticuerpos humanizados, por ejemplo como se describe en el documento EP-A-239400.
45 Los anticuerpos de la invención pueden unirse a un soporte sólido y/o empaquetarse en kits en un contenedor adecuado junto con reactivos adecuados, controles, instrucciones y similares.
Preferentemente, los anticuerpos de la presente invención se marcan de forma detectable. Ejemplos de marcadores detectables que permiten la medición directa de la unión del anticuerpo incluyen radiomarcadores, fluoróforos, pigmentos, perlas magnéticas, quimioluminiscentes, partículas coloidales y similares. Ejemplos de marcadores que permiten la medición indirecta de la unión incluyen enzimas en las que el sustrato puede proporcionar un producto coloreado o fluorescente. Ejemplos adicionales de marcadores detectables incluyen enzimas unidas covalentemente capaces de proporcionar una señal de producto detectable tras la adición de sustratos adecuados. Ejemplos de enzimas adecuadas para usar en conjugados incluyen peroxidada de rábano, fosfatasa alcalina, malato
55 deshidrogenasa y similares. Cuando no están disponibles comercialmente, dichos conjugados anticuerpo-enzima se producen fácilmente mediante técnicas conocidas para los expertos en la materia. Otros ejemplos de marcadores detectables incluyen biotina, que se une con una afinidad elevada a avidina o estreptavidina; fluorocromos (p. ej., ficobiliproteínas, ficoeritrina y aloficocianinas; fluoresceína y rojo Texas), que se pueden usar con un clasificador celular activado por fluorescencia; haptenos y similares. Preferentemente, el marcador detectable permite la medición directa en un luminómetro de placas, por ejemplo biotina. Dichos anticuerpos marcados se pueden usar en técnicas conocidas en la materia para detectar polipéptidos de la invención.
Composiciones
65 Las composiciones de la presente invención pueden incluir un “vehículo aceptable”. Ejemplos de dichos vehículos aceptables incluyen agua, solución salina, solución de Ringer, solución de dextrosa, solución de Hank y otras soluciones acuosas fisiológicamente equilibradas. También se pueden usar vehículos no acuosos, tales como aceites fijados, aceite de sésamo, oleato de etilo o triglicéridos.
En una realización, el “vehículo aceptable” es un “vehículo farmacéuticamente aceptable”. La expresión “vehículo
5 farmacéuticamente aceptable” se refiere a entidades moleculares y composiciones que no producen reacciones alérgicas, tóxicas o, de otro modo, adversas cuando se administran a un animal, particularmente a un mamífero y más particularmente a un ser humano. Ejemplos útiles de vehículos o diluyentes farmacéuticamente aceptables incluyen, entre otros, disolventes, medios de dispersión, recubrimientos, estabilizantes, coloides protectores, adhesivos, espesantes, agentes tixotrópidos, agentes de penetración, agentes secuestrantes y agentes isotónicos y retardantes de la absorción que no afectan a la actividad de los polipéptidos de la invención. Se puede mantener la fluidez apropiada, por ejemplo, por el uso de un recubrimiento tal como lecitina, por el mantenimiento del tamaño de partícula requerido en el caso de dispersión y por el uso de tensioactivos. Más generalmente, los polipéptidos de la invención se pueden combinar con cualquier aditivo líquido o sólido no tóxico correspondiente a las técnicas de formulación habituales.
15 Como se indica en el presente documento, en algunas realizaciones se usa un polipéptido, una fibra de seda y/o un copolímero de la invención como vehículo farmacéuticamente aceptable.
Otras composiciones adecuadas se describen más adelante con referencia específica a usos específicos de los polipéptidos de la invención.
Usos
Las proteínas de seda son útiles para la creación de nuevos biomateriales por su excepcional fuerza y rigidez. No
25 obstante, hasta la fecha, las proteínas fibrosas de arañas e insectos son proteínas grandes (de más de 100 kDa) y consisten en secuencias de aminoácidos altamente repetitivas. Estas proteínas están codificadas por genes grandes que contienen codones altamente sesgados haciéndoles particularmente difíciles de producir en sistemas recombinantes. Por comparación, las proteínas de seda de la invención son cortas y no repetitivas. Estas propiedades hacen de los genes que codifican estas proteínas particularmente atractivos para la producción recombinante de biomateriales nuevos.
Las proteínas de seda, las fibras de seda y/o los copolímeros de la invención se pueden usar para una amplia y diversa matriz de aplicaciones médicas, militares, industriales y comerciales. Las fibras se pueden usar en la fabricación de dispositivos médicos, tales como suturas, injertos cutáneos, matrices de crecimiento celular,
35 ligamentos de sustitución y mallas quirúrgicas y en una amplia gama de productos industriales y comerciales, tales como, por ejemplo, cable, cuerda, redes, cañas de pescar, telas para ropa, recubrimientos de chalecos antibalas, tela de contenedor, mochilas, alforjas, bolsas o asas de bolso, material de unión adhesivo, material de unión no adhesivo, material de correas, tela para tiendas, toldos, coberturas de piscinas, coberturas de vehículos, materiales para vallas, sellantes, material de construcción, material impermeable, material de partición flexible, equipamiento deportivo; y de hecho, en casi cualquier uso de fibra o tela para el que se deseen características de elasticidad y de resistencia a la tracción alta. Las proteínas de seda, fibras de seda y/o copolímeros de la presente invención también tienen aplicaciones en composiciones para productos de cuidados personales tales como cosméticos, cuidado de la piel, cuidado del cabello y tintes de cabello; y en recubrimiento de partículas tales como pigmentos.
45 Las proteínas de seda se pueden usar en su forma nativa o se pueden modificar para formar derivados, que proporcionan un efecto más beneficioso. Por ejemplo, la proteína de seda se puede modificar mediante conjugación con un polímero para reducir la alergenicidad como se describe en los documentos US 5.981.718 y US 5.856.451. Polímeros modificadores adecuados incluyen, entre otros, óxidos de polialqueno, alcohol polivinílico, policarboxilatos, poli(vinilpirrolidona) y dextranos. En otro ejemplo, las proteínas de seda se pueden modificar mediante digestión selectiva y corte y empalme de otros modificadores proteicos. Por ejemplo, las proteínas de seda se pueden escindir en unidades peptídicas más pequeñas mediante tratamiento con ácido a una temperatura elevada de aproximadamente 60 ºC. Los ácidos útiles incluyen, entre otros, diluir los ácidos clorhídrico, sulfúrico o fosfórico. Como alternativa, la digestión de las proteínas de seda se puede realizar mediante tratamiento con una base, tal como hidróxido sódico, o digestión enzimática usando una proteasa adecuada.
55 Las proteínas se pueden modificar además para proporcionar características de funcionamiento que son beneficiosas en aplicaciones específicas para productos de cuidados personales. La modificación de las proteínas para uso en productos de cuidados personales es bien conocida en la técnica. Por ejemplo, los procedimientos de uso habitual se describen en los documentos US 6.303.752, US 6.284.246 y US 6.358.501. Ejemplos de modificaciones incluyen, entre otras, etoxilación para estimular la potenciación de la emulsión agua-aceite, siloxilación para proporcionar compatibilidad lipófila y esterificación para ayudar a la compatibilidad con jabón y composiciones detergentes. Además, las proteínas de seda se pueden derivar con grupos funcionales incluidos, entre otros, aminas, oxiranos, cianatos, ésteres de ácido carboxílico, copolioles de silicona, ésteres de siloxano, alifáticos de amina cuaternizada, uretanos, poliacrilamidas, ésteres de ácido dicarboxílico y ésteres halogenados.
65 Las proteínas de seda también se pueden derivar mediante reacción con diiminas y mediante la formación de sales metálicas.
Consistente con las definiciones anteriores de “polipéptido” (y “proteína”), dichas moléculas derivadas y/o modificadas también se denominan en el presente documento en líneas generales "polipéptidos" y "proteínas”.
5 Las proteínas de seda de la invención se pueden hilar juntas y/o formas haces o trenzar con otros tipos de fibra. Ejemplos incluyen, entre otros, fibras poliméricas (p. ej., polipropileno, nailon, poliéster), fibras y sedas de otras fuentes vegetales y animales (p. ej., algodón, lana, seda de Bombyx mori o de araña) y fibras de vidrio. Una realización preferida es la fibra de seda trenzada con 10 % de fibra de polipropileno. La presente invención contempla que la producción de dichas combinaciones de fibras se puede practicar fácilmente para potenciar cualquier característica deseada, por ejemplo aspecto, suavidad, peso, durabilidad, propiedades repelentes del agua, mejores costes de fabricación, que en general se pueden buscar en la fabricación u producción de fibras para aplicaciones médicas, industriales y comerciales.
Productos para cuidados personales
15 Las composiciones cosméticas y para cuidados personales pueden ser composiciones anhidras que comprenden una cantidad eficaz de proteína de seda en un medio cosméticamente aceptable. Los usos de estas composiciones incluyen, entre otros, productos de cuidados personales, de limpieza de la piel, maquillaje y productos antiarrugas. Una cantidad eficaz de una proteína de seda para composiciones cosméticas y para cuidados personales se define en el presente documento como una proporción de aproximadamente 10-4 a aproximadamente 30 % en peso, pero, preferentemente, de aproximadamente 10-3 a 15 % en peso respecto al peso total de la composición. Esta proporción puede variar en función del tipo de composición cosmética o para cuidados de la piel. Composiciones adecuadas para un medio cosméticamente aceptable se describen en el documento US 6.280.747. Por ejemplo, el medio cosméticamente aceptable puede contener una sustancia grasa en una proporción de, generalmente,
25 aproximadamente 10 a aproximadamente 90 % en peso respecto al peso total de la composición, en la que la fase grasa contiene al menos una sustancia grasa líquida, sólida o semisólida. La sustancia grasa incluye, entre otras, aceites, ceras, gomas y las denominadas sustancias grasas pastosas. Como alternativa, las composiciones pueden estar en forma de una dispersión estable, tal como una emulsión de agua en aceite o de aceite en agua. Adicionalmente, las composiciones pueden contener uno o más aditivos o adyuvantes cosméticos o dermatológicos convencionales, incluidos, entre otros, antioxidantes, agentes conservantes, cargas, tensioactivos, protectores solares de UVA y/o UVB, fragancias, espesantes, agentes humectantes y polímeros aniónicos, no iónicos o anfotéricos y tintes o pigmentos.
Los cosméticos emulsionados y los cuasi fármacos que se pueden producir con el uso de materiales emulsionados
35 que comprenden al menos una proteína de seda de la presente invención incluyen, por ejemplo, cosméticos de limpieza (jabón de belleza, lavado facial, champú, aclarado y similares), productos para el cuidado del cabello (tintes, cosméticos y similares), cosméticos básicos (cremas generales, emulsión, crema de afeitado, acondicionador, colonia, loción de afeitado, aceite cosmético, mascarilla facial y similares), cosméticos de maquillaje (base, lápiz para las cejas, cremas para los ojos, sobre de ojos, rímel y similares), cosméticos aromáticos (perfumes y similares), cosméticos de bronceado y protección solar (cremas de bronceado y protectores solares, loción de bronceado y protectores solares, aceite de de bronceado y protectores solares y similares), cosméticos para las uñas (crema de uñas y similares), cosméticos de delineadores de ojos (delineador de ojos y similares), cosméticos para los labios (pintalabios, bálsamo labial y similares), productos de cuidados orales (pasta de dientes y similares), cosméticos para baño (productos para baños y similares) y similares.
45 La composición cosmética puede estar también en forma de productos para cuidados de uñas, tales como laca de uñas. Las lacas de uñas se definen en el presente documento como composiciones para el tratamiento y coloreado de las uñas, que comprenden una cantidad eficaz de proteína de seda en un medio cosméticamente aceptable. Una cantidad eficaz de una proteína de seda para usar en composiciones de lacas de uñas se define en el presente documento como una proporción de aproximadamente 10-4 a aproximadamente 30 % en peso, respecto al peso total de la laca. Componentes de un medio cosméticamente aceptable para lacas de uñas se describen en el documento US 6.280.747. Normalmente, la laca de uñas contiene un disolvente y una sustancia formadora de película, tal como derivados de celulosa, derivados de polivinilo, polímeros o copolímeros acrílicos, copolímeros de vinilo y polímeros de poliéster. La composición puede también contener un pigmento orgánico o inorgánico.
55 Las composiciones para el cuidado del cabello se definen en el presente documento como composiciones para el tratamiento del cabello, incluidos, entre otros, champú, acondicionadores, lociones, aerosoles, geles y espumas, que comprenden una cantidad eficaz de proteína de seda en un medio cosméticamente aceptable. Una cantidad eficaz de una proteína de seda para usar en composiciones para el cuidado del cabello se define en el presente documento como una proporción de aproximadamente 10-4 a aproximadamente 90 % en peso, respecto al peso total de la composición. Los componentes de un de un medio cosméticamente aceptable para las composiciones para el cuidado del cabello se describen en los documentos US 2004/0170590, US 6.280.747, US 6.139.851 y US
6.013.250. Por ejemplo, estas composiciones para el cuidado del cabello pueden ser soluciones acuosas, alcohólicas o acuosas-alcohólicas, siendo el alcohol, preferentemente, etanol o isopropanol en una proporción de
65 aproximadamente 1 a aproximadamente 75 % en peso respecto al peso total para las soluciones acuosasalcohólicas. Adicionalmente, las composiciones para el cuidado del cabello pueden contener uno o más aditivos o
adyuvantes cosméticos o dermatológicos convencionales, como se ha indicado anteriormente.
Las composiciones para colorear el cabello se definen en el presente documento como composiciones para el coloreado, teñido o blanqueo del cabello, que comprenden una cantidad eficaz de proteína de seda en un medio 5 cosméticamente aceptable. Una cantidad eficaz de una proteína de seda para usar en composiciones para el coloreado del cabello se define en el presente documento como una proporción de aproximadamente 10-4 a aproximadamente 60 % en peso, respecto al peso total de la composición. Los componentes de un medio cosméticamente aceptable para las composiciones para el coloreado del cabello se describen en los documentos US 2004/0170590, US 6.398.821 y US 6.129.770. Por ejemplo, estas composiciones para el coloreado del cabello generalmente contienen una mezcla de agente oxidante pigmento a base de peroxígeno inorgánico y un agente colorante oxidable. El agente oxidante pigmento a base de peroxígeno es con mayor frecuencia peróxido de hidrógeno. Los agentes oxidantes para el coloreado del cabello se forman mediante acoplamiento oxidativo de intermedios primarios (por ejemplo, p-fenilendiaminas, p-aminofenoles, p-diaminopiridinas, hidroxiindoles, aminoindoles, aminotimidinas o cianofenoles) con intermedios secundarios (por ejemplo, fenoles, resorcinoles, m
15 aminofenoles, m-fenilendiaminas, naftoles, pirazolonas, hidroxiindoles, catecoles o pirazoles). Adicionalmente, las composiciones para el coloreado del cabello pueden contener ácidos oxidantes, secuestrantes, estabilizantes, espesantes, tampones, vehículos, tensioactivos, disolventes, antioxidantes, polímeros, pigmentos no oxidativos y acondicionadores.
Las proteínas de seda también se pueden usar para recubrir pigmentos y partículas cosméticas con el fin de mejorar la dispersibilidad de las partículas para uso en composiciones cosméticas y de recubrimiento. Las partículas cosméticas se definen en el presente documento como materiales particulados tales como pigmentos o partículas inertes que se usan en composiciones cosméticas. Pigmentos y partículas cosméticas adecuadas incluyen, entre otras, pigmentos de color inorgánicos, pigmentos orgánicos y partículas inertes. Los de color inorgánicos incluyen,
25 entre otros, dióxido de titanio, óxido de cinc y óxidos de hierro, magnesio, cobalto y aluminio. Pigmentos orgánicos incluyen, entre otros, rojo D & C N.º: 36, naranja D&C N.º: 17, las lacas de calcio del rojo D&C N.º: 7, 11, 31 y 34, la laca de bario del rojo D&C N.º: 12, la laca de estroncio de rojo D&C N.º: 13, la laca de aluminio de amarillo FD&C N.º: 5 y partículas de negro de carbono. Las partículas inertes incluyen, entre otros, carbonato cálcico, silicato de aluminio, silicato de calcio, silicato de magnesio, mica, talco, sulfato de bario, sulfato de calcio, Nylon™ en polvo, alcanos perfluorados y otros plásticos inertes.
Las proteínas de seda también se pueden usar en hilos dentales (véase, por ejemplo, el documento US 2005/0161058). El hilo puede ser una hebra monofilamento o hebra multifilamento y las fibras pueden o no estar trenzadas. EL hilo dental puede empaquetarse como piezas individuales o en un rollo con una cuchilla para cortar
35 los trozos a la longitud deseada. El hilo dental se puede proporcionar en diversas formas aparte de filamentos, tales como, entre otros, tiras y láminas y similares. El hilo puede estar recubierto con materiales diferentes, tales como, entre otros, hebra de un filamento de cera, politetrafluoroetileno para el hilo.
Las proteínas de seda también se pueden usar en jabón (véase, por ejemplo, el documento US 2005/0130857).
Pigmento y recubrimiento de partículas cosméticas
La cantidad eficaz de una proteína de seda para usar en pigmentos y recubrimientos de partículas cosméticas se define en el presente documento como una proporción de aproximadamente 10-4 a aproximadamente 50 % en peso, 45 pero, preferentemente, de aproximadamente 0,25 a 15 % en peso respecto al peso seco de la partícula. La cantidad óptima de la proteína de seda a usar depende del tipo de pigmento o partícula cosmética que se va a recubrir. Por ejemplo, la cantidad de proteína de seda usada con pigmentos de color inorgánicos está, preferentemente entre aproximadamente 0,01 % y 20 % en peso. En el caso de los pigmentos orgánicos, la cantidad preferida de la proteína de seda está entre aproximadamente 1 % a aproximadamente 15 % en peso, mientras que para las partículas inertes, la cantidad preferida está entre aproximadamente 0,25 % y aproximadamente 3 % en peso. Los procedimientos para la preparación de pigmentos y partículas recubiertas se describen en el documento US
5.643.672. Estos procedimientos incluyen: Añadir una solución acuosa de la proteína de seda a las partículas al tiempo que se agita o mezcla, formando una pasta espesa de la proteína de seda y las partículas y secando, liofilizando una solución de la proteína de seda sobre las partículas o liofilizando una pasta espesa de la proteína de
55 seda y las partículas. Estos pigmentos y partículas cosméticas recubiertos se pueden usar en formulaciones cosméticas, pinturas, tintas y similares.
Productos biomédicos
Las proteínas de seda se pueden usar como recubrimiento de una venda para estimular la cicatrización de heridas. Para esta aplicación, el material de vendaje se recubre con una cantidad eficaz de la proteína de seda. Para el objeto del vendaje para cicatrización de heridas, una cantidad eficaz de proteína de seda se define en el presente documento como una proporción de aproximadamente 10-4 a aproximadamente 30 % en peso, respecto al peso del material de vendaje. El material que se va a recubrir puede ser cualquier paño o fibra suave, biológicamente inerte, 65 poroso. Ejemplos incluyen, entre otros, algodón, seda, rayón, acetato, acrílico, polietileno, poliéster y combinaciones de los mismos. El recubrimiento del paño o fibra se puede conseguir mediante una serie de procedimientos
conocidos en la técnica. Por ejemplo, el material que se va a recubrir se puede sumergir en una solución acuosa que contiene la proteína de seda. Como alternativa, la solución que contiene la proteína de seda se puede pulverizar sobre la superficie del material que se va a recubrir usando una pistola pulverizadora. Adicionalmente, la solución que contiene la proteína de seda se puede recubrir sobre la superficie usando un procedimiento de impresión de
5 recubrimiento con rodillo. El vendaje para heridas puede incluir otros aditivos, incluidos, entre otros, desinfectantes tales como yodo, yoduro de potasio, yoduro de povidona, acrinol, peróxido de hidrógeno, cloruro de benzalconio y clorohexidina; agentes acelerantes de la curación tales como alantoína, dibucaína clorhidrato y malato de clorofenilamina, agentes vasoconstrictores tales como nafazolina clorhidrato, agentes astringentes tales como óxido de cinc y agentes generadores de costras tales como ácido bórico.
Las proteínas de seda de la presente invención también se pueden usar en forma de una película como material de vendaje de heridas. El uso de proteínas de seda en forma de una película amorfa como material de vendaje de heridas se describe en el documento US 6.175.053. La película amorfa comprende una película densa y no porosa de una cristalinidad por debajo del 10 % que contiene una cantidad eficaz de proteína de seda. Para una película
15 para el cuidado de heridas, una cantidad eficaz de proteína de seda se define en el presente documento como entre aproximadamente 1 a 99 % en peso. La película también puede contener otros componentes, incluidos, entre otros, otras proteínas tales como sericina y desinfectantes, agentes acelerantes de la curación, agentes vasoconstrictores, agentes astringentes y agentes generadores de costras, como se ha descrito en lo que antecede. Otras proteínas, tales como sericina, pueden comprender de 1 a 99 % en peso de la composición. La cantidad de los demás ingredientes enumerados es, preferentemente, inferior a un total de aproximadamente 30 % en peso, más preferentemente entre aproximadamente 0,5 y 20 % en peso de la composición. La película para vendaje de heridas se puede preparar disolviendo los materiales mencionados anteriormente en una solución acuosa eliminando las sustancias insolubles mediante filtración o centrifugación y vertiendo la solución sobre una superficie sólida suave, tal como una placa acrílica, seguido de secado.
25 Las proteínas de seda de la presente invención también se pueden usar en suturas (véase, por ejemplo, el documento US 2005/0055051). Dichas suturas pueden presentarse como una chaqueta trenzada hecha de fibras de peso molecular ultraalto y fibras de seda. El polietileno proporciona fuerza. Las fibras de poliéster se pueden tejer con el polietileno de alto peso molecular para proporcionar mejores propiedades de sujeción. La seda se puede proporcionar en un color que contraste para proporcionar un rastro para mejorar el reconocimiento y la identificación de la sutura. La seda es también más distensible en el tejido que otras fibras, lo que permite cortar los extremos cerca del nudo sin preocupación por la interacción dañina entre los extremos de la sutura y el tejido adyacente. Las propiedades de manipulación de la sutura de alta fuerza también se pueden potenciar usando varios materiales para recubrir la sutura. La sutura tiene, ventajosamente, la fuerza de la sutura Ethibond N.º 5, aunque tiene el diámetro, el
35 tacto y la capacidad de sujeción de la sutura N.º 2. Como resultado, la sutura es ideal para la mayoría de los procedimientos ortopédicos, tales como la reparación del manguito rotador, la reparación del tendón de Aquiles, la reparación del tendón rotuliano, la reconstrucción del LCA/LCP, los procedimientos de reconstrucción de cadera y hombro y la sustitución por suturas usadas en o con sujecciones de sutura. La sutura puede estar sin recubrir, o recubierta con cera (cera de abeja, cera de petróleo, cera de polioxietileno u otras), silicona (fluido de silicona 202A de Dow Coming u otros), cauchos de silicona, PBA (ácido polibutilato), etilcelulosa (Filodel) u otros recubrimientos, para mejorar la lubricidad de la trenza, la seguridad del nudo o la resistencia a la abrasión, por ejemplo.
Las proteínas de seda de la presente invención también se pueden usar en endoprótesis (véase, por ejemplo, el documento US 2004/0199241). Por ejemplo, se proporciona un injerto de endoprótesis que incluye una endoprótesis 45 endoluminal y un injerto, en el que el injerto de endoprótesis incluye seda. La seda induce una respuesta en un huésped que recibe el injerto de endoprótesis, en el que la respuesta puede conducir a una mayor adhesión entre el injerto de endoprótesis de seda y el tejido del huésped que está adyacente a la seda del injerto de endoprótesis de seda. La seda se puede unir al injerto por cualquiera de diversos medios, por ejemplo entrelazando la seda en el injerto o adhiriendo la seda al injerto (p. ej., por medio de un adhesivo o por medio de sutura) La seda puede estar en forma de una hebra, una trenza, una lámina, polvo etc. En cuanto a la localización de la seda del injerto de endoprótesis, la seda se puede unir únicamente al exterior de la endoprótesis, y/o la seda se puede fijar a regiones distales del injerto de endoprótesis con el fin de ayudar a asegurar dichas regiones distantes al tejido próximo en el huésped. Se puede usar una amplia variedad de injertos de endoprótesis dentro del contexto de la presente invención, dependiendo del lugar y la naturaleza del tratamiento deseado. Los injertos de endoprótesis pueden ser,
55 por ejemplo, injertos bifurcados o en tubo, cilíndricos o con reducción progresiva en los extremos, autoexpandibles o expandibles con globo, de un solo cuerpo o modulares etc.
Además de la seda, el injerto de endoprótesis puede contener un recubrimiento sobre algo o toda la seda, en el que el recubrimiento se degrada tras la inserción del injerto de endoprótesis en un huésped, de modo que el recubrimiento retrasa el contacto entre la seda y el huésped. Recubrimientos adecuados incluyen, entre otros, gelatina, poliésteres degradables (p. ej., PLGA, PLA, MePEG-PLGA, PLGA-PEG-PLGA y copolímeros y mezclas de los mismos), celulosa y derivados de celulosa (p. ej., hidroxipropilcelulosa), polisacáridos (p. ej., ácido hialurónico, dextrano, dextrano sulfato, chitosano), lípidos, ácidos grasos, ésteres de azúcar, ésteres de ácido nucleico, polianhídridos, poliortoésteres y alcohol polivinílico (PVA). Los injertos de endoprótesis que contienen seda pueden 65 contener un agente biológicamente activo (fármaco), en los que el agente se libera del injerto de endoprótesis y después, induce una respuesta celular potenciada (p. ej., depósito en matriz celular o extracelular) y/o una respuesta
fibrótica en un huésped en el que se ha insertado el injerto de endoprótesis.
Las proteínas de seda de la presente invención también se pueden usar en una matriz para producir ligamentos y tendones ex vivo (véase, por ejemplo, el documento US 2005/0089552). Una matriz basada en fibra de seda se 5 puede sembrar con células pluripotenciales, tales como células estromales de médula ósea (CEMO). El ligamento o tendón sometido a bioingeniería se caracteriza de forma ventajosa por una orientación celular y/o un patrón de rizado en matriz en la dirección de las fuerzas mecánicas aplicadas y también, por la producción de marcadores específicos de ligamentos y tendones, incluidos colágeno de tipo I, colágeno de tipo III y proteínas de fibronectina a lo largo del eje de la carga mecánica producida por las fuerzas mecánicas o estimulación, si se aplican dichas fuerzas. En una realización preferida, el ligamento o tendón se caracteriza por la presencia de haces de fibras que se disponen en una organización helicoidal. Algunos ejemplos de ligamentos o tendones que se pueden producir incluyen el ligamento cruzado anterior, el ligamento cruzado posterior, los tendones del manguito rotador, el ligamento colateral medial del codo y la rodilla, los tendones flexores de la mano, los ligamentos laterales del tobillo y los tendones y ligamentos de la mandíbula o la articulación temporomandibular. Otros tejidos que se pueden
15 producir mediante los procedimientos de la presente invención incluyen cartílago (tanto articular como meniscal), hueso, músculo, piel y vasos sanguíneos.
Las proteínas de seda de la presente invención también se pueden usar en hidrogeles (véase, por ejemplo, el documento US 2005/0266992). Los hidrogeles de fibroína de seda se pueden caracterizar por una estructura de poro abierto que permite su uso como armazones de ingeniería tisular, sustrato para cultivo celular, vendajes para heridas, sustitutos de tejidos blandos, rellenos óseos y también, como soporte para compuestos farmacéuticos o biológicamente activos.
Las proteínas de seda también se pueden usar en composiciones dermatológicas (véase, por ejemplo, el documento
25 US 2005/0019297). Además, las proteínas de seda de la invención y derivados de las mismas también se pueden usar en composiciones de liberación sostenida (véase, por ejemplo, el documento US 2004/0005363).
Materiales textiles
Las proteínas de seda de la presente invención también se pueden aplicar a la superficie de fibras para su posterior uso en materiales textiles. Esto proporciona una monocapa de la película proteica sobre la fibra, lo que tiene como resultado un acabado suave. Los documentos US 6.416.558 y US 5.232.611 describen la adición de un recubrimiento de acabado a las fibras. Los procedimientos descritos en estas divulgaciones proporcionan ejemplos de versatilidad del acabado de la fibra para proporcionar un buen tacto una superficie suave. Para esta aplicación, la 35 fibra se recubre con una cantidad eficaz de la proteína de seda. Para el objeto del recubrimiento de la fibra para uso en materiales textiles, una cantidad eficaz de proteína de seda se define en el presente documento como una proporción de aproximadamente 1 a aproximadamente 99 % en peso, respecto al peso del material de fibra. Los materiales de fibra incluyen, Entre otros, fibras textiles de algodón, poliésteres tales como rayón y Lycra™, nailon, lana y otras fibras naturales, incluida la seda nativa. Las composiciones adecuadas para aplicar la proteína de seda sobre la fibra pueden incluir codisolventes tales como etanol, isopropanol, hexafluoranoles, isotiocianouranatos y otros disolventes polares que se pueden mezclar con agua para formar soluciones o microemulsiones. La solución que contiene la proteína de seda se puede rociar sobre la fibra o la fibra se puede sumergir en la solución. Aunque no es necesario se prefiere el secado rápido del material recubierto. Un protocolo alternativo es aplicar la composición de la proteína de seda sobre las fibras tejidas. Una realización ideal de esta aplicación es el uso de
45 proteínas de seda para recubrir redes elásticas tales como las usadas para las medias.
Materiales compuestos
Se pueden añadir fibras de seda a poliuretano, otras resinas o cargas termoplásticos para preparar tableros y otro material de construcción o como muebles moldeados y bancos que sustituyen madera y tableros. Los compuestos también se pueden usar en construcción de edificios y de automóviles, especialmente tejados y paneles para puertas. Las fibras de seda refuerzan la resina, haciendo el material mucho más fuerte y permitiendo la construcción con pesos más ligeros, que es de fuerza igual o superior a otros tableros de partículas y materiales compuestos. Las fibras de seda se pueden aislar y añadir a una resina formadora de compuesto sintético o usarse en combinación
55 con proteínas derivadas de plantas, almidón y aceites, para producir un material compuesto biológicamente basado. Los procedimientos para la producción de dichos materiales se describen en los documentos JP 2004284246, US 2005175825, US 4.515.737, JP 47020312 y WO 2005/017004.
Aditivos de papel
Las propiedades de fibra de la seda de la invención pueden añadir fuerza y textura de calidad a la fabricación de papel. Los papeles de seda se fabrican moteando las hebras de seda en pulpa de algodón para preparar papeles hechos a mano extrasuaves que se usan para envoltura de regalos, tapas de cuadernos, maletas. Los procedimientos para la producción de productos de papel que pueden incluir proteínas de seda de la invención se
65 describen, en general, en el documento JP 2000139755.
Materiales avanzados
Las sedas de la invención tienen una rigidez considerable y destacan entre otras sedas en cuanto a que mantienen estas propiedades cuando están húmedas (Hepburn y cols., 1979).
5 Áreas de un crecimiento sustancial en la industria textil de ropa son las textiles técnicas e inteligentes. Existe una creciente demanda de productos textiles saludables, de alto valor funcional, ecológicos y personalizados. Las fibras como las de la invención, cuyas propiedades no varían cuando están húmedas y en concreto, mantienen su resistencia y elasticidad, son útiles para ropajes funcionales para hacer deporte o para tiempo de ocio, así como ropas de trabajo y ropajes protectores.
Los desarrollos en las tecnologías de las armas y vigilancia urgen innovaciones en equipamientos de protección individual y sistemas y estructuras relacionadas con el campo de batalla. Además de los requisitos convencionales, tal como la durabilidad del material a la exposición prolongada, a un desgaste grande y la protección del ambiente
15 externo, los materiales textiles de seda de la invención se pueden procesar para que resistan proyectiles balísticos, fuego y sustancias químicas. Los procedimientos para la producción de dichos materiales se describen en los documentos WO 2005/045122 y US 2005268443.
Ejemplos
Ejemplo 1 -Preparación y análisis de ADNc de glándula salival de último estadio tardío
Las proteínas que se encuentran en sedas de euaculeados y neurópteros (Apis mellifera, Bombus terrestris, Myrmecia forficata, Oecophylla smaragdina, Mallada siginata) se identificaron relacionando los patrones de
25 fragmentación de los espectros de masas consecutivos en trampa iónica de los péptidos obtenidos mediante digestión con tripsina de la seda con los datos de los espectros de masas predichos de las proteínas codificadas por las ADNc aislados de la glándula salivar de las larvas en estadio final tardío. Para confirmar que mediante este análisis no se perdían proteínas para la abeja melífera, los datos de los espectros de masas del péptido también se compararon con las digestiones virtuales con tripsina de las proteínas de Apis mellifera predichas mediante el proyecto del genoma de la abeja y las traducciones de las secuencias genómicas de Amel3 de abeja melífera en los seis marcos de lectura.
Abeja melífera
35 Se obtuvieron larvas de Apis mellifera de colmenas domésticas. Anteriormente se ha mostrado que la producción de seda en Apis mellifera está confinada a la glándula salival durante la última mitad del estadio final (Silva-Zacarin y cols., 2003). Durante este periodo, el ARN es más abundante en el extremo posterior de la glándula (Flower y Kenchington, 1967). Las regiones celulares cúbicas de 50 glándulas salivales se diseccionaron de Apis mellifera en el quinto estadio final sumergidas en solución salina tamponada con fosfato. El extremo posterior de la glándula diseccionada se colocó inmediatamente en RNAlater® (Ambion, Austin, TX, EE.UU.), estabilizando el ARNm y después, se almacenó a 4 ºC.
El ARN total (35 #g) se aisló de glándulas salivales en último estadio tardío usando el kit RNAqueous for PCR de Ambion (Austin, TX, EE.UU.). El ARN mensajero se aisló del ARN total usando el kit de aislamiento de ARNm Micro
45 FastTrack™ 2.0 de Invitrogen (Calsbad, CA, EE.UU.) de acuerdo con las instrucciones del fabricante, eluyéndose el ARNm aislado en 10ul de agua sin RNAsa.
Se construyó una biblioteca de ADNc a partir del ARNm aislado de larvas de Apis mellifera usando el kit de construcción de bibliotecas de ADNc de Invitrogen (Calsbad, CA, EE.UU.) con las modificaciones siguientes del protocolo estándar: Para la síntesis de la primera hebra, a 10 #l de ARN se añadieron 0,5 #l del cebador BiotinaattB2-Oligo(dT) a 6 pmol. #l-1 y 0,5 #l de dNTP a cada uno. Tras la incubación a 65 ºC durante 5 minutos, después a 45 ºC durante 2 minutos, se añadieron 2 #l 5X tampón de la primera hebra, 1 #l de DTT 0,1M y 0,5 #l de SuperScript™ II RT a 200 U. #l-1. Para la síntesis de la segunda hebra, el volumen total de todos los reactivos se redujo a la mitad y tras la precipitación en etanol, se resuspendió el ADNC en 5 #l de agua tratada con DEPC. El
55 adaptador aatB1 (1 #l) se ligó en un volumen total de 10 #l a los 5 #l de ADN con 2 #l 5X de tampón adaptador, 1 #l de DTT 0.1M y 1 #l de de ADN ligasa de T4 (1 U. #l-1) A 16 ºC durante 48 horas con 0,5 #l de ADN ligasa de T4 adicionales (1 U. #l-1) se añadieron tras 16 horas. El ADNc se fraccionó por tamaño de acuerdo con las instrucciones de fabricación con las muestras que eluyeron a entre 300-500 #l precipitándose en etanol, se resuspendieron y transformaron en las células resistentes al fago T1 de E. coli DH10B™. La biblioteca de ADNc estaba compuesta por aproximadamente 1.200.000 unidades formadoras de colonas (ufc) con aproximadamente el 1 % del vector original. El tamaño medio de inserto fue de 1,3 ∃ 1,4 kbp.
Se seleccionaron al azar ochenta clones y se secuenciaron usando el kit de inicio GenomeLab™ DTCS Quick (BeckmanCoulter, Fullerton CA EE.UU.) y se pasaron por un secuenciador CEQ8000 Biorad. Estos se agruparon en 65 cincuenta y cuatro grupos (Tabla 2). La identificación de los ADNc que codifican las proteínas de seda se describe
más adelante.
Otras especies
5 Se aisló el ARN total de 4 abejorros (Bombus terrestris) (2 #g de ARN), 4 hormigas bulldog (Myrmecia forficata) (3 #g de ARN), aproximadamente 100 hormigas tejedoras (Oecophylla smaragdina) (0,4 #g de ARN) y aproximadamente 50 glándulas labiales de larva tardía, 50 glándulas labiales de larva tardía (Mallada signata) usando ARN acuoso para el kit RNAqueous for PCR kit de Ambion (Austin, TX, EE.UU.). El ARNm se aisló del ARN total usando el kit de aislamiento de ARNm de Micro-FastTrack™ 2.0 de Invitrogen (Calsbad, CA, EE.UU.) en un
10 volumen final de 10 #l de agua. Las bibliotecas de ADNc se construyeron a partir del ARNm usando el kit de ADNc CloneMiner™ de Invitrogen (Calsbad, CA, EE.UU.) con las modificaciones siguientes a partir del protocolo estándar: Para la síntesis de la primera hebra, a 10 #l de ARN se añadieron 3 pmol del cebador Biotina-attB2-Oligo(dT) y 1 nmol de cada dNTP. Tras 5 minutos a 65 ºC, seguido de 2 minutos a 45 ºC, se añadieron 2 #l 5X de tampón de primera hebra, 50 nmol de DTT y 100 U de SuperScript™ II RT.
15 Tabla 2. ADNc de la glándula salival en estadio final de A. mellifera y patrones de fragmentación con atrapamiento iónico EM de péptidos procedentes de la digestión con tripsina de seda de paneles de cría tratada con SDS.
Número de ADNc en clúster
Abundancia en la biblioteca de la glándula salival ( %) Sinónimos de proteína o gen Número de péptidos sometidos a tripsina identificados en la seda Puntuación de búsqueda de EM/EM sumada Cobertura de secuencias proteicas (% de proteína) Identificación de proteínas
Proteínas identificadas en la biblioteca de ADNc en la seda de abeja melífera
10
13 Xenosina; GB15233-PA 9 143,89 25 AC004701
8
11 Xenospiral; GB12184-PA 10 165,13 37 Sin coincidencias
6
7 Xenospira4; GB19585-PA 8 142,16 35 Sin coincidencias
6
7 Xenospira2; GB12348-PA 9 145,91 28 Sin coincidencias
5
6 Xenospira3; GB17818-PA 9 147,02 31 Sin coincidencias
Proteínas identificadas únicamente en la biblioteca de ADNc
4
4
GB14261-PA 0
2
2
Contig 2504 0
2
2
GB17108-PA 0
1
1
Contig 68 0
1
1
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Para la síntesis de la segunda hebra, el volumen total de todos los reactivos se redujo a la mitad a partir de las cantidades recomendadas por el fabricante y tras la precipitación en etanol, se resuspendió el ADNC en 5 #l de agua tratada con DEPC. El adaptador aatB1 (1#l) se ligó en un volumen total de 10 #l a 5 #l de ADNc con 2 #l 5X tampón
5 adaptador, 50 nmol de DTT y 1U de la ADN ligasa de T4 a 16 °C durante 12 horas. Las bibliotecas de ADNc compuestos por aproximadamente 2,4 x 107 (abejorro), 5,0 x 107) hormiga bulldog) y 6.000 (hormiga verde) unidades formadoras de colonias (ufc) con menos del 1 % del vector para el bulldog y el abejorro es superior y más del 80 % del vector original en la biblioteca de la hormiga verde. EL tamaño medio de inserto dentro de las bibliotecas fue de 1,3 kbp.
10 Los datos de secuencia se obtuvieron de más de 100 clones al azar de las bibliotecas de ADNc de abejorro y de hormiga bulldog, 82 clones de abejorro y 60 clones de crisopa. Las dificultades técnicas de la obtención de las glándulas salivales de las hormigas verdes diminutas (de una longitud de aproximadamente 1 mm) redujeron la eficiencia de la biblioteca de esta especie y como tal, solo se estudiaron 40 secuencias. En la Tabla 3 se presenta un
15 resumen de las proteínas de seda identificadas
Tabla 3. Identificación y propiedades de las proteínas de seda de euaculeados.
Especie
Nombre de la proteína Longitud de la proteína (aminoácidos) % Clones de biblioteca de ADNc Puntuación de búsqueda de EM/EM sumada % Estructura helicoidal** Longitud de la superhélice predicha por MARCOIL (aminoácidos)
Abeja melífera
AmelF1* 333 6 52 76 117
Abeja melífera
AmelF2* 290 7 51 88 175
Abeja melífera
AmelF3* 335 11 107 81 154
Abeja melífera
AmelF4* 342 7 88 76 174
Abeja melífera
AmelSA1* 578 13 40 41 45
Abejorro
BBF1 327 4 180 86 147
Abejorro
BBF2 313 14 100 84 199
Abejorro
BBF3 332 20 218 86 146
Abejorro
BBF4 357 32 137 80 188
Abejorro
BBSA1 >501 3 138 21 0
Hormiga bulldog
BAF1 422 16 99 69 121
Hormiga bulldog
BAF2 411 30 90 76 132
Hormiga bulldog
BAF3 394 26 88 79 131
Hormiga bulldog
BAF4 441 24 116 76 157
Hormiga tejedora
GAF1 391 35 228 74 177
Hormiga tejedora
GAF2 400 22 191 79 158
Hormiga tejedora
GAF3 395 13 156 72 103
Hormiga tejedora
GAF4 443 17 148 74 166
Crisopa
MalF1 596 23 45 89 151
*en el presente documento también se denomina Xenospiral-4 y Xenosina respectivamente, ** predicho mediante PROFsec, *** predicho mediante MARCOIL al umbral de 90 %
Ejemplo 2 -Preparación del análisis proteómico de la seda nativa
5 Panel de cría de abeja melífera tras la retirada de las larvas, capullos de abejorro tras la retirada de las larvas, capullos de hormigas bulldog la retirada de las larvas u hojas de seda de hormiga tejedora se lavaron exhaustivamente tres veces en agua caliente eliminando los contaminantes hidrosolubles y después, se lavan extensamente tres veces en cloroformo retirando la cera. El cloroformo se retiró enjuagando con agua destilada y un
10 subconjunto de esta seda se retuvo para análisis. Un subconjunto de las muestras de seda de himenópteros (hormigas y abejas) se lavó después llevando a ebullición durante 30 minutos en 0,05 % de carbonato sódico, un procedimiento estándar para el desgomado de la seda de gusano de seda, después se enjuagó en agua destilada. La seda de crisopa se enjuagó solo en agua destilada. Un subconjunto de las muestras de seda de crisopa se desgomó llevando a ebullición durante 30 minutos en solución al 0,05 % de carbonato sódico.
15 Un subconjunto del material de abeja melífera se empapó durante la noche en 2 % de SDA a 95 ºC. seguido de tres lavados en agua destilada. La extracción en solución de SDS caliente solubiliza la mayoría de las proteínas, pero, en este caso, las láminas de seda conservaron su conformación.
20 Las sedas limpias se analizaron mediante cromatografía de líquidos seguida de espectrometría de masas en tándem (CLEM) como se describe más adelante.
Piezas de seda limpia se introdujeron en un pocillo de una placa de microtitulación de 90 pocilllos que tienen un tapón de medio para cromatografía de fase inversa C18 mediante el fondo de cada pocillo al que se administraron 25 20 #l de carbonato cálcico 25 mM que contiene 160 mg de tripsina para secuenciación (Promega). Después, la bandeja se incubó durante la noche en una bolsa de plástico humidificada a 30 ºC.
El material C18 se humidificó mediante pipeteo de acetonitrilo (10 #l) sobre los laterales de cada pocillo e incubando la placa a 37 ºC durante 15 minutos. A cada pocillo se añadió solución de ácido fórmico (130 #l, 1 % v/v) y después 30 de 30 minutos los péptidos de las proteínas de abeja digeridos se capturaron en el material C-18 lentamente arrastrando las soluciones de cada pocillo a través de la base de la placa a vació reducido. El material C18 se lavó
dos veces con agua pasado a través de 100 #l de solución de ácido fórmico. Los péptidos se eluyeron con 6 #l de 1 % de ácido fórmico en 70 % de metanol pipeteado directamente sobre el material C18 y se centrifugaron a través del tapón de C18 a una bandeja de microtitulación subyacente. Esta bandea se colocó al vacío hasta que el volumen de cada pocillo se redujo aproximadamente 2 veces mediante evaporación. A cada pocillo se añadió la solución de
5 ácido fórmico (10 #l) y la bandeja se transfirió al muestreador de placas de pocillos de un sistema de cromatografía líquida capilar Agilent 1100.
Los péptidos (8 #l) del extracto de seda se unieron a una columna Agilent Zorbax SB-C18 5 #m 150 x 0,5 mm con un caudal de 0,1 % de ácido fórmico/5 % de acetonitrilo a 20 #l.min-1 durante un minuto, después se eluyeron con
10 gradientes de concentración creciente de acetonitrilo a 0,1 % de ácido fórmico/20 % de acetonitrilo durante un minuto a 5 #l.min-1, después gasa 0,1 % de ácido fórmico/50 % de acetonitrilo durante 28 minutos, después 0,1 % de ácido fórmico/95 % de acetonitrilo durante un minuto. La columna se lavó con 0,1 % de ácido fórmico/95 %-100 % de acetonitrilo en 5 minutos a 20 #l.min-1 y se reequilibró con 0,1 % de ácido fórmico/5 % de acetonitrilo durante 7 minutos antes de obtener las muestras de péptidos del siguiente pocillo.
15 El eluato de la columna se introdujo en un espectrómetro de masas con trampa iónica Agilent XCT a través de la fuente de electronebulización iónica del instrumento equipada con un micronebulizador. Brevemente, a medida que los péptidos eluían de la columna, la trampa iónica recogió barrios de iones positivos de espectro completo (1002200 m/z) seguido de dos barridos EM/EM de iones observados en el espectro completo evitando la selección de
20 iones que llevaba solo una única carga. Cuando se seleccionó un ion para el análisis EM/EM, todos los demás se excluyeron de la trampa iónica, el ion seleccionado se fragmentó de acuerdo con los parámetros para "SmartFrag" y "Peptide Scan" recomendados por el instrumento. Una vez recogidos dos espectros de fragmentación para cualquier valor m/z concreto, se excluyó de la selección para análisis durante 30 segundos adicionales evitando recoger datos redundantes.
25 Los conjuntos de datos de espectros de masas de todo el experimento se analizaron usando el software Spectrum Mill de Agilent relacionando los datos con predicciones de secuencias proteicas de las bibliotecas de ADNc. El software generó puntuaciones de la calidad de cada coincidencia entre conjuntos observados experimentalmente de masas de fragmentos de péptidos y las predicciones de fragmentos que podrían generarse de acuerdo con las
30 secuencias de proteínas en una base de datos proporcionada. Todas las correspondencias de secuencia indicadas aquí han recibido puntuaciones superiores a 20, el parámetro por defecto para la aceptación fiable automática de las correspondencias válidas.
Este análisis identificó que cinco proteínas expresadas a niveles elevados en la glándula labial correspondían a la
35 seda de cada una de las especies de abeja afines (mostradas en las Tablas 2 y 3) y cuatro proteínas expresadas a niveles altos en la glándula labial correspondían a la seda de cada una de las especies de hormiga afines (mostradas en la Tabla 3). La abundancia del ARN mensajero que codifica estas proteínas en la glándula labial de las larvas era consistente con las proteínas producidas en abundancia (la abundancia del mensaje se muestra en la Tabla 3).
40 Para garantizar que ninguna de las proteínas de seda de abeja melífera se perdía en este procedimiento de identificación, los autores de la invención también compararon los datos de espectro de masas del péptido tripsina de la seda de abeja melífera con un conjunto de secuencias proteicas predichas a disposición del público del proyecto genoma de la abeja melífera generados por un algoritmo informático que intenta reconocer los genes
45 transcritos en las secuencias de ADN genómico completas de la abeja. Adicionalmente, los autores de la invención generaron una base de datos de traducciones en los seis posibles marcos de lectura de cada secuencia de ADN genómico contiguo proporcionada por el proyecto genoma de la abeja (liberación de Amel3). Estas secuencias de ADN traducidas se presentaron al software Spectrum Mill como si fueran las secuencias de proteínas muy grandes. La correspondencia de los datos de péptidos de EN/EM identificó marcos de lectura abiertos dentro de las
50 secuencias genómicas que habían codificado partes de las proteínas de abeja aisladas sin la necesidad de predecir primero la organización de los genes. No se identificaron proteínas adicionales en la seda mediante este análisis.
Ejemplo 3 -Análisis estructural de la seda nativa
55 Se prepararon muestras de seda nativa como se describe en el ejemplo 2. Las muestras de seda nativa se analizaron usando un espectrómetro de infrarrojos con transformada de Fourier a Bruker Tensor 37 con un diamante Pike Miracle accesorio de reflexión total atenuada. El análisis de las regiones amida I y II de los espectros de las sedas de abeja melífera, de abejorro, de hormiga verde, de hormiga bulldog y la seda de larva de crisopa (Figura 1) muestra que todas estas sedas tienen principalmente una estructura secundaria en alfa-hélice. Las sedas de las
60 especies euaculeadas tienen picos dominantes en los espectros FT-IR a 1645-1646 cm-1, se desplazaron aproximadamente 10 cm-1 por debajo de una señal de α-hélice clásica y ampliada. Este desplazamiento en la de αhélice es típico de las proteínas en superhélice (Heimburg y cols., 1999). Los espectros de las muestras no cambiaron.
65 Ejemplo 4 -La composición de aminoácidos de las sedas nativas se asemeja estrechamente a la de las proteínas de
seda identificadas
La composición de aminoácidos de las sedas nativas se determinó tras 24 horas de hidrólisis en fase de gas a 110 ºC cuando la química de Waters AccQTag en la Australian Proteome Analysis Facility Ltd (Macquarie University, 5 Sydney).
La composición de aminoácidos medida de la seda lavada con SDS fue similar a la predicha en las secuencias de proteínas de seda identificadas (Figuras 2 y 3).
Ejemplo 5 -Análisis estructural de las proteínas de seda
Péptidos secretores predichos
Como cabe esperar de las proteínas de seda, el programa de predicción se señal SignalP 3.0 (Bendtsen y cols.,
15 2004), que usa dos modelos identificando los péptidos señal predijo que todos los genes de la seda identificados que codificaban proteínas que contenían los péptidos señal objetivo para la secreción en una célula (datos no mostrados). Los sitios de escisión predichos de los polipéptidos son los siguientes. Xenospira1 (AmelF1)-entre pos 19 y 20 (ASA-GL), Xenospira2 (AmeIF2)-entre pos 19 y 20 (AEG-RV), Xenospira3 (AmelF3)-entre pos 19 y 20 (VHA-GV),
25 Xenospira4 (AmelF4)-entre pos 19 y 20 (ASG-AR), Xenosina (AmelSA1)-entre pos 19 y 20 (VCA-GV), BBF1-entre pos 19 y 20 (ASA-GQ), BBF2-entre pos 20 y 21 (AEG-HV), BBF3-entre pos 19 y 20 (VHA-GS),
35 BBF4-entre pos 19 y 20 (ASA-GK), BAF1-entre pos 19 y 20 (ASA-SG), BAF2-entre pos 19 y 20 (ASG-RV), BAF3-entre pos 19 y 20 (ASG-NL), BAF4-entre pos 19 y 20 (VGA-SE),
45 GAF1-entre pos 19 y 20 (ADA-SK), GAF2-entre pos 19 y 20 (ASG-GV), GAF3-entre pos 19 y 20 (ASG-GV), GAF4-entre pos 19 y 20 (VGA-SE), MalF1-entre pos 26 y 27 (SST-AV).
55 Las cuatro proteínas de seda de hormiga y las cinco de abeja son helicoidales y forman superhélices
El modelo de proteína y los resultados de los algoritmos de reconocimiento del patrón confirmaron que la mayoría de las proteínas de seda de abeja melífera identificadas eran proteínas helicoidales que formaban superhélices. Se usaron los algoritmos PROFsec (Rost y Sander, 1993) y NNPredict (McClelland y Rumelhart, 1988; Kneller y
cols., 1990), investigando la estructura secundaria de los genes de seda identificados. Estos algoritmos identificaron Xenospira1 [GB12184-PA] (SEC ID N.º: 1), Xenospira2 [GB12348-PA] (SEC ID N.º: 3), Xenospira3 [GB17818-PA] (SEC ID N.º: 5) y Xenospria4 [GB19585-PA] (SEC ID N.º: 7), como proteínas altamente helicoidales, con una estructura helicoidal ente 76-85 % (Tabla 4). Xenosina [GB15233-PA] (SEC ID N.º: 10) tenía una estructura
65 significativamente menos helicoidal.
Tabla 4. La estructura secundaria de las proteínas de seda de Apis mellifera predicha por PROFsec (Rost and Sander, 1993) que muestra los porcentajes de las hélices, láminas extendidas y bucles.
Proteína
Helicoidal Extendida Bucle
PROFsec
NNPredict PROFsec NNPredict PROFsec NNPredict
Xenospira3
77 70 3 6 20 27
Xenospira4
85 82 2 6 14 16
Xenospira1
80 73 1 4 19 26
Xenospira2
77 69 2 5 21 29
Xenosina
41 41 8 9 51 50
Otros modelos de proteína y los resultados de los algoritmos de reconocimiento del patrón confirmaron que la
5 mayoría de las proteínas de seda identificadas eran proteínas helicoidales que formaban superhélices. Se usaron los algoritmos PredictProtein (Rost y cols., 2004) investigando la estructura secundaria de los genes de seda identificados. Estos algoritmos identificaron Xenospira1 (SEC ID N.º: 1), Xenospira2 (SEC ID N.º: 3), Xenospira3 (SEC ID N.º: 5), Xenospira4 (SEC ID N.º: 7), BBF1 (SEC ID N.º: 22), BBF2 (SEC ID N.º: 24), BBF3 (SEC ID N.º: 26), BBF4 (SEC ID N.º: 28), BAF1 (SEC ID N.º: 40), BAF2 (SEC ID N.º: 42), BAF3 (SEC ID N.º: 44), BAF4 (SEC ID N.º:
10 46), GAF1 (SEC ID N.º: 56), GAF2 (SEC ID N.º: 58), GAF3 (SEC ID N.º: 60), GAF4 (SEC ID N.º: 62) y MalF1 (SEC ID N.º: 72) como proteínas altamente helicoidales con una estructura helicoidal de entre 69-88 % (Tabla 3). AmelSA1 [GB15233-PA] (Xenosina) (SEC ID N.º: 10) y BBSA1 (SEC ID N.º: 30) tenían una estructura significativamente menos helicoidal.
15 El superenrollamiento de las proteínas helicoidales (superhélice) surge de una secuencia de héptada repetitiva característica indicada normalmente como (abcdefg)n con residuos hidrófobos generalmente en las posiciones a y d y generalmente los residuos cargados o polares en las posiciones que quedan. Los programas de reconocimiento de patrones (MARCOIL (Delorenzi y Speed, 2002), COILS (Lupas y cols., 1991)) identificaron numerosas héptadas repetitivas típicas de las superhélices en Xenospira1 [GB12184-PA] (SEC ID N.º: 1), Xenospira2 [GB12348-PA]
20 (SEC ID N.º: 3), Xenospira3 [GB17818-PA] (SEC ID N.º: 5) y Xenospria4 [GB19585-PA] (SEC ID N.º: 7) (MARCOIL: Tabla 5; COILS: Figura 4), así como BBF1 (SEC ID N.º: 22), BBF2 (SEC ID N.º: 24), BBF3 (SEC ID N.º: 26), BBF4 (SEC ID N.º: 28), BAF1 (SEC ID N.º: 40), BAF2 (SEC ID N.º: 42), BAF3 (SEC ID N.º: 44), BAF4 (SEC ID N.º: 46), GAF1 (SEC ID N.º: 56), GAF2 (SEC ID N.º: 58), GAF3 (SEC ID N.º: 60), GAF4 (SEC ID N.º: 62) y MalF1 (SEC ID N.º: 72) (MARCOIL: Tabla 3).
Identificación de una nueva secuencia en superhélice en las proteínas de seda de la abeja melífera.
Las héptadas repetitivas de los residuos de aminoácidos identificados en la secuencia de Xenospira1 [GB12184-PA], Xenospira2 [GB12348-PA], Xenospira3 [GB17818-PA], Xenospria4 [GB19585-PA], eran cada una muy indicativa de 30 una estructura secundaria en superhélice (Figura 5) (véase la Tabla 5 para los intervalos de confianza). El hecho de que las héptadas se encuentran consecutivamente y numerosamente sugiere que las proteínas adoptan una estructura muy regular. Las héptadas solapantes se identificaron en dos de las proteínas de abeja melífera: La región en superhélice principal de Xenospira1 contenía héptadas solapantes con un desplazamiento de 3 residuos, seguido de un espacio de 5 residuos y después, cuatro héptadas consecutivas; y toda la región en superhélice de
35 Xenospira2 tenía múltiples héptadas solapantes con un único desplazamiento y desplazamiento de 4 residuos (equivalente a un desplazamiento de 3 residuos). La composición de aminoácidos en las diversas posiciones de la héptada mayoritaria se muestra en la primera columna en la Tabla 6, con las posiciones de las héptadas solapantes indicadas en las columnas adyacentes.
40 Tabla 5. Porcentaje de residuos en las proteínas de seda identificadas predicho en forma de superhélice mediante el algoritmo de reconocimiento de patrones MARCOIL (Delorenzi y Speed, 2002).
Proteína
Longitud de la Porcentaje de proteínas que existe como superhélice
proteína madura(aminoácidos)
Umbral del 50 5 Umbral del 90 % Umbral del 99 %
Xenospira3
315 64 % (residuos 68 a 268) 34 % (residuos 128-223 y 235-246) 20 % (residuos 149 a-211)
Xenospira4
290 73 % (residuos 83 -293) 60 % (residuos 98-168 y 182-285) 27 % (residuos 113-154 y 212-247)
Xenospira1
316 69 % 49 % 18 %
(residuos 67 -282)
(residuos 103 -256) (residuos 113 -169)
Xenospira2
328 65 % (residuos 89-298) 54 % (residuos 110-283) 45 % (residuos 127-270)
Xenosina
350 26 % (residuos 32 -127) 9 % (residuos 42 -75) 2 % (residuos 59 -67)
Sorprendentemente, las héptadas mayoritarias tienen una nueva composición cuando se ven en conjunto, con una abundancia inusualmente alta de alanina en las posiciones de la héptada “hidrófoba” a y d (véase la Tabla 6 y la Figura 5). Adicionalmente, una proporción alta de héptadas tienen alanina en las posiciones a y d dentro de la misma héptada (33 % en Xenospira1 [GB12184-PA]; 36 % en Xenospira2 [GB12348-PA]; 27 % en Xenospira3 [GB17818-PA]; y 38 % en Xenospira4 [GB19585-PA]; véanse las Tablas 6 y 7).
Tabla 6. Resumen del número de cada residuo de aminoácidos en las diversas posiciones de la héptada en regiones en superhélice de las proteínas de seda de abeja melífera.
Xenospira4 A a 23 b 12 c 12 d 17 e 12 f 13 g 9
I 0 0 0 0 0 1 3 R 1 0 0 0 1 0 4 L 1 2 1 5 0 1 0 K 0 2 5 1 0 2 2 T 1 2 1 0 2 0 1 E 1 3 3 1 4 7 2 V 1 1 1 2 2 1 1 F 0 0 0 0 0 0 0 S 1 3 3 2 5 1 2 Q 0 1 1 1 2 1 0 N 0 1 1 0 1 2 1 D 0 1 0 0 0 0 2 G 0 1 1 0 0 0 2 M 0 0 0 0 0 0 0 Y 0 0 0 0 0 0 0 W 0 0 0 0 0 0 0 Total 29 29 29 29 29 29 29
Xenospira3 A a 19 b 8 c 13 d 13 e 8 f 7 g 9
I 0 0 0 3 0 0 0 R 0 0 1 0 0 2 5 L 1 5 0 2 2 3 2 K 0 1 3 2 2 4 3 T 4 2 2 0 2 2 0 E 2 2 2 2 4 4 1 V 0 0 3 2 0 0 2 F 0 0 0 0 0 0 0 S 1 5 1 4 7 4 5 Q 1 4 2 0 4 1 0 N 1 2 0 1 0 2 2 D 0 1 1 1 0 1 1 G 0 0 1 0 1 0 0 M 0 0 0 0 0 0 0 Y 1 0 0 0 0 0 0 W 0 0 1 0 0 0 0 Total 30 30 30 30 30 30 30
Xenospira2 A a 20 b 7 c 9 d 16 e 11 f 10 g 8
I 0 2 0 0 0 2 4 R 0 2 2 0 1 1 1 L 1 2 0 3 3 0 0 K 0 2 4 3 0 1 1 T 3 2 1 1 3 2 1 E 1 2 2 0 4 6 5 V 1 4 4 1 1 1 0 F 1 0 0 0 0 0 0 S 1 1 1 1 2 3 0 Q 0 1 3 2 2 1 2 N 0 3 2 0 0 1 4 D 0 0 0 1 1 0 0 G 0 0 0 0 0 0 1 M 0 0 1 0 0 0 1 Y 0 0 1 0 0 0 0 W 0 0 1 0 0 0 0 Total 28 28 28 28 28 28 28
Xenospira1 A a 13 b 7
I 3 1 R 0 1 L 1 1 K 2 6 T 0 0 E 1 2 V 1 1 F 0 0 S 2 3 Q 1 1 N 1 0 D 0 4 G 2 0 M 0 0 Y 0 0 W 0 0 Total 27 27
Proteína
Cantidad de estructura helicoidal ( %)1 Número de héptadas mayoritarias Cantidad de proteína en las héptadas mayoritarias ( %) Cantidad de Ala en las héptadas mayoritarias (%) Cantidad de Ala en posición a de las héptadas mayoritarias ( %) Cantidad de Ala en posición d de las héptadas mayoritarias ( %) Cantidad de Ala en posición a y d de las héptadas mayoritarias ( %)
Xenospira1
77 (70) 27 41 44 74 33
Xenospira2
85 (82) 28 37 71 57 36
Xenospira3
80 (73) 30 37 63 43 27
Xenospira4
77 (69) 29 48 79 58 38
Xenosina
41 (41) n/a n/a n/a n/a
c
8 1 1 2 1 1 1 7 2 0 1 1 0 1 0 0 0 27
d
18 0 0 2 1 2 1 0 2 1 0 0 0 0 0 0 27
e
11 1 2 1 1 2 3 2 0 4 0 0 0 0 0 0 0 27
f
7 0 3 0 2 1 3 3 0 7 0 1 0 0 0 0 0 27
g
13 0 0 3 3 0 2 1 0 3 1 0 0 0 1 0 0 27
Tabla 7. Resumen de residuos de alanina en las héptadas de las proteínas de seda de abeja melífera.
1Predicciones PROFsec con predicciones NNPredict mostradas entre paréntesis.
5 La composición de aminoácidos en las diversas posiciones de las héptadas en la región en superhélice de las sedas de himenópteros se resume en las Figuras 6 y 7. Como se ha indicado anteriormente, las posiciones dentro de las héptadas tienen una composición nueva, las posiciones de las héptadas "hidrófobas" a y d de las sedas de abeja y hormiga contienen niveles muy altos de alanina (media 58 %) y niveles altos de residuos polares pequeños (media 21 %) en comparación con otras superhélices. Adicionalmente, la posición e es inusualmente pequeña e hidrófoba
10 (Tabla 8, Figura 7). Topográficamente, esta posición se localiza adyacente a los residuos a dentro de las hélices. Su similitud en la composición con los residuos a y d sugiere que las sedas adoptan una estructura en superhélice con tres residuos centrales por α-hélice. Tres residuos centrales contribuyen a una interfaz hidrófoba más grande que dos residuos centrales (Deng y cols., 2006), una característica que ayudaría a la formación y estabilidad de la superhélice.
15 Además, cuando se ven en conjunto, las posiciones b, c, e, f y g dentro de la héptada son, en general, más hidrófobas, menos polares y menos cargadas que las regiones en superhélice de la proteína previamente caracterizada (véase la Figura 7 y las Tablas 8 y 9). Por tanto, aunque históricamente se consideraba que el contenido helicoidal de la seda de himenóptero aculeado era una consecuencia de un menor contenido en glicina y
20 un mayor contenido en residuos ácidos (Rudall and Kenchington, 1971), los autores han descubierto que no son los residuos de glicina/ácido los responsables de la nueva estructura de la seda sino la posición de los residuos de alanina dentro de las cadenas polipeptídicas.
Tabla 8. Tamaño medio e hidrofobicidad en cada posición de héptada de las proteínas de seda de himenóptero 25 ortólogas y de la proteína de seda de crisopa verde (MalF1) que muestra que las posiciones a, d y e (núcleo) son más pequeñas y más hidrófobas que otras posiciones. En algunos casos, la posición b (parcialmente sumergida) también es pequeña e hidrófoba.
Posición de la héptada
a
b c d e f g
Ortólogos Amel F1
Hidrofobicidad media de la cadena lateral del residuo
0,36 0,20 0,20 0,30 0,26 -0,16 0,03
Longitud media de la cadena lateral del residuo
1,7 2,5 2,5 2,1 2,3 3,0 2,6
Ortólogos Amel F2
Hidrofobicidad media de la cadena lateral del residuo
0,53 0,20 0,03 0,36 0,24 0,05 0,12
Longitud media de la cadena lateral del residuo
1,5 2,6 2,6 2,0 2,2 2,5 3,0
Ortólogos Amel F3
Hidrofobicidad media de la cadena lateral del residuo
0,44 0,36 0,06 0,41 0,27 -0,10 0,00
Longitud media de la cadena lateral del residuo
1,9 2,3 2,4 2,1 2,3 2,8 2,8
Ortólogos Amel F4
Hidrofobicidad media de la cadena lateral del residuo
0,46 0,17 -0,13 0,61 0,04 0,06 0,06
Longitud media de la cadena lateral del residuo
1,4 2,2 2,6 2,04 2,3 2,6 2,7
MalF1
Hidrofobicidad media de la cadena lateral del residuo
-0,05 0,14 -0,61 0,27 0,59 0,23 -0,22
Longitud media de la cadena lateral del residuo
2,1 1,7 2,5 1,4 1,5 1,7 3,5
Ejemplo 6 -Las proteínas de seda de abeja están, probablemente, reticuladas extensamente
Las proteínas de seda de abeja contienen todas una elevada proporción de lisina (6,5 %-16,3 %). Una comparación
5 entre la composición de aminoácidos medida de la seda de abeja y las secuencias de las proteínas de seda identificadas revela un error de apareamiento sustancial en el número de residuos de lisina, con mucha menos lisina detectada en la seda de lo previsto (Figuras 2 y 3). Esto sugiere que los residuos de lisina en la seda se han modificado, de modo que no son identificados por los análisis de aminoácidos convencionales. Se sabe que la lisina forma diversas reticulaciones: reticulaciones enzimáticas catalizadas por la lisil oxidasa o reticulaciones no
10 enzimáticas generas de residuos de lisina glicadas (Reiser y cols., 1992). La subrepresentación de lisina en el análisis de aminoácidos de la seda de abeja melífera y de abejorro es consistente con la presencia de reticulación de lisina.
Tabla 9. Número de residuos en cada clase de aminoácidos en varias posiciones de la héptada en regiones en 15 superhélice de las proteínas de seda.
Xenospira4 Apolar 25 16 15 24 14 16 15
Polar 2 7 6 3 10 4 4 Cargado 2 6 8 2 5 9 10 Pequeño 26 19 18 21 21 15 15 Medio 2 10 11 8 7 14 10 Grande 1 0 0 0 1 0 4 Posición de la héptada a b c d e f g
Xenospira3 Apolar 20 13 17 20 11 10 13
Polar 8 13 6 5 13 9 7 Cargado 2 4 7 5 6 11 10 Pequeño 24 15 20 19 18 13 16 Medio 5 15 8 11 12 15 9 Grande 1 0 2 0 0 2 5 a b c d e f g
Xenospira22 Apolar 23 15 13 20
Polar 4 7 7 4 Cargado 1 6 8 4 Pequeño 25 14 15 19 Medio 2 12 11 9 Grande 1 2 2 0 a b c d
15
7 6 17 10 1 e
13
7 8 16 11 1 f
14
7 7 10 17 1 g
Xenospira1
Apolar
Polar Cargado Pequeño Medio Grande
20
4 3 18 9 0 a
10
4 13 11 15 1 b
13
4 10 13 12 2 c
20
5 2 22 5 0 d
15
6 6 19 6 2 e
10
9 8 18 6 3 f
18
4 5 17 10 0 g
Se espera que las proteínas reticuladas covalentemente sometidas a electroforesis de gel de poliacrilamida-SDS (PAGE) migran de acuerdo con el peso molecular del complejo reticulado. Cuando se someten las proteínas tardías de la glándula labial de la abeja melífera a SDS-PAGE y se midió la migración de las proteínas de seda en relación
5 con los marcadores proteicos estándar. Se observaron bandas correspondientes a monómeros de cada una de las proteínas de seda identificadas, no obstante, también había presentes bandas de peso molecular más alto que contenían estas proteínas, como estaba previsto en un sistema reticulado (Figura 8).
Como se ha descrito anteriormente, la glándula labial de la abeja melífera contiene una mezcla de proteínas de seda
10 organizadas y desorganizadas. Probablemente, las proteínas reticuladas observadas corresponden a la población de proteínas de la región anterior de la glándula, en la que la seda se prepara por extrusión. Es razonable suponer que la seda de abeja melífera extracelular contiene una proporción sustancialmente mayor de proteínas reticuladas que se observa en una mezcla heterogénea de todos los estadios de las proteínas de seda de la glándula salivar. No es probable que los enlaces sean entre cisteínas, ya que la seda no se ve afectada por el tratamiento reductor y las
15 proteínas de seda identificadas contienen pocos o ningún residuo de cisteína.
Ejemplo 7 -Las proteínas de seda de euaculeados difieren significativamente de las otras proteínas de seda
La seda de eucaculeado es significativamente diferente de otros genes de seda descritos en relación con la
20 composición de aminoácidos (Tabla 10), el peso molecular de las proteínas implicadas, la estructura secundaria y las propiedades físicas (Tablas 11 y 12). Las sedas de lepidóptero están compuestas principalmente por los pequeños residuos de aminoácidos alanina, serina y glicina (por ejemplo, la seda de Bombyx mori, Tabla 10) y están dominadas por una estructura secundaria en lámina beta extendida. La proteína de seda de Cotesia glomerata es rica en asparagina y serina, siendo la abundancia de este último residuo característica de las sericinas (pegamentos)
25 de seda de lepidópteros (Tabla 10). El modelado de la proteína de seda de Cotesia glomerata no identifica las hélices o las superhélices en la estructura secundaria. En contraste con ello, las sedas de abeja, de hormiga y de crisopa son ricas en alanina (Tabla 10) y están compuestas por un nivele elevado de estructura secundaria helicoidal que forma superhélices.
30 Tabla 10. Composición de aminoácidos de la seda de varios insectos con los residuos más abundantes mostrados en negrita.
Abeja melífera
Seda de euaculeado Seda de Mallada Cotesia glomerata Bombyx mori
Alanina
22,6 27,5 26,9 12,5 29,3
Ácido glutámico Glutamina
+ 16,1 13,9 7,4 0,6 0,9
Ácido aspártico asparagina
+ 13,2 8,6 15,0 37,6 (Asn 33,7) 1,2
Serina
10,4 11,5 8,5 37,1 11,3
Leucina
9,0 7,2 5,9 0,4 0,4
Valina
6,6 4,8 4,1 0,3 2,1
Glicina
5,7 6,6 11,2 5,5 46,0
Isoleucina
5,6 4,0 3,9 0,4 0,6
Treonina
5,1 4,9 5,3 0,5 0,8
Lisina
3,7 3,7 3,2 0,1 0,3
Fenilalanina
2,0 1,0 0,5 0,5 0,6
Tirosina
0 0,9 0,5 3,1 5,3
Prolina
0 0 0 0,7 0,4
Histidina
0 0,5 0,5 0,4 0,2
Arginina
0 3,3 5,4 0,2 0,4
Metionina
0 1,0 1,6 0 0,1
Triptófano
0 No indicado No indicado No indicado 0,2
Cisteína
0 0,4 0,3 No indicado 0,1

Tabla 11. Diferencias entre sedas de insecto.
Seda de hormiga y de abeja
Seda de Mallada Cotesia sp. Lepidóptero Por ejemplo Bombyx mori
Aminoácidos más abundantes
Ala Ala Ser, Asn Gly, Ala
Tamaño de las proteínas de fibroína
25-35 kDa 57KDa Aprox. 500KDa >100KDa
Estructura secundaria
Superhélice Superhélice Muy probablemente láminas beta. Programas de predicción de la estructura secundaria PROFsec y MARCOIL no reconocen ninguna estructura helicoidal o regiones en superhélice. Láminas plegadas en beta asociadas de forma laxa con láminas beta, Espirales beta, alfa hélices y regiones amorfas
Tabla 12. Solubilidad de las sedas de insecto.
Disolvente
Seda de hormiga y de abeja Seda de Mallada Cotesia sp. Bombyx mori
20°C
95°C 20°C 95°C 20°C 95°C 20°C 95°C
LiBr 54 %
- - - - - parte - ✔
LiSCN saturado
- - - - - parte - ✔
Urea 8M
- - - - - - - parte
guanidina HCl 6M
- - - - - - - parte
NaOH 1M
- parte ? ? - parte parte ✔
HCl 6M
- parte parte ✔ - parte - ✔
HCl 3M / 50 % de ácido propanoico
- parte ? ? - parte parte ✔
5 Análisis cladístico de las regiones en superhélice de las proteínas de seca de las cuatro especies de himenópteros (Figura 9) sugiere que os genes habían evolucionado de un ancestro común que datan las divergencia del euaculeado de las avispas parásitas. Las secuencias de la seda han divergido extensamente y los autores de la invención solo pudieron alinear los 210 aminoácidos que comprenden la región en superhélice de cada proteína. La
10 identidad de la secuencia de aminoácidos entre las regiones en superhélice de cada una de las proteínas de seda proporcionadas en el presente documento se muestran en la Tabla 13 y la identidad de ADN en la correspondiente región se muestra en la Tabla 14. Mientras que las proteínas tienen contenidos de aminoácidos similares (especialmente niveles altos de alanina) y de estructura terciaria, la identidad de la secuencia de aminoácidos primaria es muy baja. De hecho, el gen que codifica la proteína de seda de Mallada ha evolucionado de forma
15 independiente y como tal, la secuencia de la proteína de seda no se puede alinear con las secuencias de himenópteros. Esto indica que se puede producir una considerable variación en la identidad de los aminoácidos sin afectar a la función biológica de las proteínas.
El análisis cladístico predice que la seda de las avispas euaculeadas está compuesta por proteínas relacionadas con 20 la seda de hormigas y abejas y que, aunque estas proteínas tendrán una composición y arquitectura similares a las de las proteínas descritas en el presente documento, tendrán secuencias primarias considerablemente divergentes.
Las secuencias de aminoácidos de las proteínas de seda proporcionadas en el presente documento (Figura 10) se sometieron a comparaciones con bases de datos de proteínas, aunque ninguna proteína de la técnica anterior se identificó con un nivel de identidad de secuencia razonable (por ejemplo, ninguna idéntica más del 30 % sobre la longitud de la secuencia de la proteína de seda).
Tabla 13. Porcentaje de identidad entre las secuencias proteicas de la región en superhélice de las proteínas de fibra en hormigas y abejas.
Abeja melífera
Abejorro Hormiga bulldog Hormiga verde
F1
F2 F3 F4 F1 F2 F3 F4 F1 F2 F3 F4 F1 F2 F3 F4
beeF1
100
beeF2
26,7 100
beeF3
23,3 31,4 100
beeF4
34,8 32,4 30,0 100
BBF1
65,7 28,1 24,8 35,7 100
BBF2
28,6 71,4 28,6 31,9 31,0 100
BBF3
25,2 31,0 65,7 27,6 27,1 29,5 100
BBF4
33,3 31,0 29,5 64,8 34,8 31,4 28,1 100
BAF1
37,1 20,0 20,0 32,4 39,5 21,4 21,4 29,1 100
BAF2
25,2 44,3 29,5 33,8 28,1 38,1 28,6 27,6 27,1 100
BAF3
23,8 26,2 36,7 28,1 24,8 25,2 36,7 28,1 21,0 27,6 100
BAF4
28,1 33,8 24,8 45,2 28,6 33,8 23,3 43,8 26,1 27,6 25,2 100
GAF1
33,8 20,0 23,8 32,9 36,2 22,9 23,8 29,1 66,7 28,1 25,2 28,6 100
GAF2
24,8 41,9 27,6 29,5 28,1 39,5 29,0 26,7 21,9 66,2 23,8 26,7 23,8 100
GAF3
26,9 28,8 40,1 31,6 25,5 28,3 38,2 30,2 24,0 28,3 62,7 27,4 27,4 26,4 100
GAF4
24,7 32,4 24,3 37,6 27,1 32,4 24,8 38,1 23,9 29,5 21,0 63,3 24,8 27,6 24,1 100
Tabla 14. Porcentaje de identidad entre las secuencias nucleotídicas que codifican la región en superhélice de las proteínas de fibra en hormigas y abejas.
Abeja melífera
Abejorro Hormiga bulldog Hormiga verde
F1
F2 F3 F4 F1 F2 F3 F4 F1 F2 F3 F4 F1 F2 F3 F4
beeF1
100
beeF2
39,4 100
beeF3
37,0 40,2 100
beeF4
45,1 44,8 410 100
BBF1
68,9 40,9 37,5 45,2 100
BBF2
42,5 72,9 42,5 44,9 42,2 100
BBF3
40,6 40,0 67,6 40,5 38,4 41,0 100
BBF4
45,4 41,0 41,7 66,0 45,9 43,6 40,0 100
BAF1
45,7 35,1 35,9 41,1 47,9 36,5 36,0 38,7 100
BAF2
38,1 49,8 41,4 44,6 38,7 47,3 40,0 41,0 40,6 100
BAF3
33,3 36,7 45,4 40,3 36,3 36,8 46,2 39,4 36,0 40,5 100
BAF4
39,5 43,3 41,4 46,8 43,0 47,6 39,8 49,4 42,5 41,7 40,3 100
GAF1
45,6 35,1 37,3 42,4 47,6 38,5 37,8 41,4 68,9 41,7 36,7 43,0 100
GAF2
38,5 47,8 38,4 43,2 38,1 46,5 41,4 40,0 37,5 69,7 38,9 40,6 39,4 100
GAF3
39,0 40,1 46,1 41,8 37,7 39,3 46,1 40,0 37,7 41,7 65,1 41,2 40,0 41,7 100
GAF4
38,9 42,4 38,1 44,9 38,9 43,8 38,4 44,3 37,3 42,7 36,7 67,8 38,2 40,3 37,7 100
Los marcos de lectura abierta que codifican las proteínas de seda (proporcionadas en la Figura 11) se sometieron a búsquedas similares en bases de datos como se ha descrito anteriormente. Las únicas moléculas relacionadas que se identificaron se han publicado como parte del proyecto del genoma de la abeja melífera
5 (www.ncbi.nlm.nih.gov/genome/guide/bee). Los marcos de lectura abiertos se han predicho mediante el proyecto del genoma de la abeja, no obstante, la función de las proteínas codificadas no se ha sugerido. Además, no hay pruebas de que un polinucleótido que comprende el marco lectura abierto del ARNm se hubiera producido alguna vez para cualquiera de estas moléculas.
10 Los genes que codifican Xenospira1, Xenospira2, Xenospira3 y Xenospira4 comprenden un exón que cubre todo el marco lectura abierto único, mientras que el gen que codifica Xenosina comprende al menos un intrón (véase la Figura 12).
Ejemplo 8 -Expresión de proteínas de seda en plantas transgénicas
15 Un vector de expresión en plantas que codifica una proteína de seda de la invención puede consistir en una molécula de ácido nucleico recombinante que codifica dicha proteína (por ejemplo, un polinucleótido proporcionado en una cualquiera de las SEC ID N.º: 11 A21, 31 A39, 48 A55, 64 A71, 74 o 75) cadena abajo del promotor 35S de CaMV en una estructura del vector binario que contiene un gen de resistencia a kanamicina (NptII).
20 Para los polinucleótidos que comprenden una cualquiera de las SEC ID N.º: 11, 13, 15, 17, 19, 31, 33, 35, 37, 48, 50, 52, 54; 64, 66, 68, 70 o 74, la construcción puede además comprender una región que codifica un péptido señal tal como el péptido señal de la quitinasa básica vacuolar de Arabidopsis thaliana, que se localiza dentro del marco y cadena arriba de la secuencia que codifica la proteína de seda.
25 La construcción portadora del polipéptido que codifica la proteína de seda se transforma por separado en Agrobacterium tumefaciens mediante electroporación antes de la transformación en Arabidopsis thaliana. El procedimiento de hipocótilo de transformación se puede usar transformando A. thaliana que se puede seleccionar según la supervivencia en medio selectivo que comprende medio con kanamicina. Una vez que se han formado
30 raíces en los regenerados, se transfieren a un sólido estableciendo plantas transgénicas primarias.
La verificación del proceso de transformación se puede conseguir mediante detección selectiva con PCR. La incorporación y expresión del polinucleótido se pueden medir usando PCR, análisis de transferencia de tipo Southern y/o CL/EM de las proteínas expresadas digeridas con tripsina.
35 Se pueden proporcionar dos o más construcciones que codifican proteínas de seda diferentes en el mismo vector o numerosos vectores diferentes se pueden transformar en la planta, cada uno codificando una proteína diferente.
Como ejemplo experimental de la expresión en plantas, una versión de AmelF4 (Xenospira4) optimizada por codón
40 (SEC ID N.º: 76) se clonó en pET14b (Novagen), generando pET14b-6xHis:F4op, formando una fusión traduccional dentro del marco con una cola de 6 histidinas en el extremo N de la proteína. La secuencia que codifica la proteína "6xHistidina:F4op" se clonó en pVEC8 (Wang y cols., 1992) sometida al control del promotor 35S de CaMV y el aparato regulador de la poliadenilación, generando pVEC8-35S-6xHis:F4op-ocs. pET14b-6xHis:F4op se transformó en E. coli y pVEC8-35S-6xHis:F4op químicamente competente en discos de hoja de tabaco mediante transformación
45 mediada por Agrobacterium. Las proteínas de E. coli resistente a antibiótico (expresión inducida) y hojas de tabaco se aislaron y sometieron a análisis de transferencia de tipo western usando el anticuerpo Tetra-Histidina (Qiagen, Karlsrule, Alemania) para detección. Los vectores vacíos pET14b y pVEC8-33S-ocs se usaron como controles negativos en sus respectivos huéspedes. Como se muestra en la Figura 13, estos experimentos tuvieron como resultado la producción en la planta de la proteína Xenospira4 (AmelF4).
50 Ejemplo 9 -Fermentación y purificación de proteínas de seda
Se construyeron construcciones de expresión después de amplificar mediante PCR las regiones de codificación de seda de los genes de la abeja melífera AmelF1-F4 (Xenospiral a 4 respectivamente) y de crisopa MalF1 y su
55 clonación en los vectores de expresión pET14b (Novagen, Madison, WI). Los plásmidos de expresión resultante se sometieron después a electroporación en células BL21 (DE3) Rosetta de E. coli y se cultivaron durante la noche en agar LB con ampicilina. Después se usó solo una colonia inoculando el caldo LB que contiene ampicilina, después se cultivó a 37 ºC durante la noche. Las células se recolectaron mediante centrifugación y se lisaron con detergente (Bugbuster, Novagen). Los cuerpos de inclusión se lavaron extensamente y se volvieron a solubilizar en guanidinio
60 6M.
Este procedimiento dio mezclas de proteínas con una pureza superior al 95 % de las proteínas de abeja melífera y una pureza superior al 50 % de la proteína MalF1 de crisopa. Regularmente se obtuvieron rendimientos de hasta un 50 % del peso húmedo del sedimento celular de E. coli, lo que indica que las proteínas son fáciles de expresar de este modo.
Las proteínas recombinantes de abeja melífera solubilizadas se aplicaron a una columna de resina Talon de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Después se eluyeron de la columna en Tris.HCL 100mM, imidazol 150mM, pH
5 8.
Ejemplo 10 -Procesamiento de las proteínas de seda en hebras
Las proteínas de seda de abeja melífera y de crisopa se han convertido fácilmente en hebras usando diversos procedimientos (véase la figura 14) usando el procedimiento siguiente.
El segmento anterior de la glándula salival de Apis mellifera en último estadio tardío se diseccionó en solución salina tamponada con fosfato y se llevó a una superficie plana en una gota de tampón. Se usaron pinzas agarrando cualquier extremo del segmento. Un extremo se elevó hacia fuera de la gota y alejado del otro en el equilibrio. Esto
15 permitió estirar una hebra fina que rápidamente se solidificó al aire.
Las proteínas de seda recombinantes de larva de abeja melífera y de crisopa formaron hebras o láminas tras la deshidratación o la concentración. Por ejemplo, introduciendo la proteína soluble en una solución de butanol o concentrando las proteínas en la columna de resina Talon.
Las hebras también se obtuvieron después de mezclar las proteínas de seda recombinantes de abeja melífera o de crisopa con un disolvente orgánico (tal como hexano) concentrándolas en la interfaz en la conformación correcta y después, añadiendo un reactivo excluyéndolas de la interfaz (tal como butanol). Las hebras formadas mediante este procedimiento tuvieron espectros FT-IR similares a los de la seda nativa, lo que indica que estaban compuestas por
25 la misma estructura en superhélice.
Las proteínas de seda de otras especies descritas en el presente documento también se pueden procesar mediante este procedimiento.
Los expertos en la técnica apreciarán que se puede realizar numerosas variaciones y/o modificaciones en la invención, como se muestra en las realizaciones específicas como se ha descrito extensamente. Por tanto, las presentes realizaciones se tienen que considerar en todos los aspectos como ilustrativos y no restrictivos.
Toda discusión de documentos, actos, materiales, dispositivos, artículos o similares incluidos en la presente
35 especificación se realiza exclusivamente con el fin de proporcionar un contexto para la presente invención. No se debe tomar como admisión de que cualquiera o todas estas materias forman parte de la base de la técnica anterior o eran conocimientos generales habituales en el campo relevante a la presente invención ya que existían antes de la fecha de prioridad de cada reivindicación de esta solicitud.
Referencias
Atkins E.D.T. (1967) J Mol Biol 24: 139-141. Bendtsen J.D., Nielsen H., von Heijne G. and Brunak S. (2004) J. Mol. Biol. 340: 783-795.
45 Bini E., Knight D.P. y Kaplan D.L. (2004) J. Mol. Biol. 335: 27-40. Craig C.L. and Riekel C. (2002) Comparative Biochemistry and Physiology Part B 133: 493-507. Delorenzi M. y Speed T. (2002) Bioinformatics 18: 617-625. Deng Y., Liu J., Zheng Q., Eliezer D., Kallenbach N.R. y Lu M. (2006) Structure 14:247-255. Flower N.E. y Kenchington W.R. (1967) Journal of the Royal Microscopical Society 86: 297.
55 Grimaldi D. y Engel M.S. (2005) Evolution of insects. Cambridge University Press, Nueva York. Harayama S. (1998) Trends Biotech., 16; 76-82. Heimburg T, Schunemann J., Weber K. y Geisler N. (1999) Biochemistry 38: 12727-12734. Hepburn H.R., Chandler H. D. and Davidoff M.R. (1979) Insect Biochem. 9: 66. Kneller D.G., Cohen F.E. and Langridge R. (1990) J. Mol. Biol. 214: 171-182. 65 LaMunyon C.W. (1988) Psyche 95: 203-209.
LaMunyon C.W. y Adams P.A. (1987) Annals of the Entomological Society of America 80: 804-808.
Lucas F. Shaw J.T.B. y Smith S.G. (1960) J. Mol. Biol. 2: 339-349.
5 Lucas F. y Rudall K.M. (1967) In Comprehensive Biochemistry (Ed. Florkin M and Stotz H) vol. 26B páginas 475-559 Elsevier Amsterdam.
Lupas A., Van Dyke M. y Stock J. (1991) Science 252: 1162-1164.
10 McClelland J.L. y Rumelhart D.E. (1988) Explorations in Parallel Distributed Processing vol. 13. páginas 318-362. MITPress, Cambridge MA.
Needleman, S.B. y Wunsch, C.D. (1970) J. Mol. Biol., 48; 443-453. 15 Quicke D.L.J., Shaw M.R., Takahashi M. y Yanechin B. (2004) Journal of Natural History 38: 2167-2181.
Reiser K., McCornick, Rucker R.B. (1992) The FASEB Journal 6: 2439-2449.
20 Rost B. y Sander C. (1993) J. Molecular Biology 232: 584-599.
Rost B., Yachdav G. y Liu J. (2004) Nucleic Acids Research 32(Web Server issue):W321-W326.
Rudall K.M. (1962) In Comparative Biochemistry (Ed. By Florkin M and Mason HS) vol. 4, páginas. 297-435. 25 Academic Press, Nueva York.
Rudall K.M. y Kenchington W. (1971) Annual Reviews in Entomology 16: 73-96.
Silva-Zacarin E.C.M., Silva De Moraes R.L.M. y Taboga S.R. (2003) J. Biosci. 6: 753-764. 30 Speilger P.E. (1962) Annals of the Entomological Society of America. 55: 69-77.
Wang M.B., Li Z.Y. y cols. (1998). Acta Hort. 461: 401-407.
35 Yamada H., Shigesada K., Igarashi Y., Takasu Y., Tsubouchi K. y Kato Y. (2004) Int. J. Wild Silkmoth y Silk 9: 61-66.
Listado de secuencias
<110> Commonwealth Scientific and Industrial Research Organisation 40 <120> Proteínas de seda
<130> 504791
<150> US 60/723.766
<151> 5-10-2.005
<160> 77 45 <170> PatentIn versión 3,3
<210> 1
<211> 314
<212> PRT 50 <213> Apis mellifera
<400> 1
<210> 2
<211> 333
<212> PRT
<213> Apis mellifera
<400> 2
<210> 3
<211> 290
<212> PRT
<213> Apis mellifera
<400> 3
<210> 4
<211> 309
<212> PRT
<213> Apis mellifera
<400> 4
<210> 5
<211> 316
<212> PRT
<213> Apis mellifera
<400> 5
<210> 6
<211> 335
<212> PRT
<213> Apis mellifera
<400> 6
<210> 7
<211> 323
<212> PRT
<213> Apis mellifera
<400> 7
<210> 8
<211> 342
<212> PRT
<213> Apis mellifera
<400> 8
<210> 9
<211> 353
<212> PRT
<213> Apis mellifera
<400> 9
<210> 10
<211> 372
<212> PRT
<213> Apis mellifera
<400> 10
<210> 11
<211> 942
<212> ADN
<213> Apis mellifera
<400> 11
<210> 12
<211> 999
<212> ADN
<213> Apis mellifera
<400> 12
10 <210> 13
<211> 870
<212> ADN
<213> Apis mellifera
<400> 13
<210> 14
<211> 927
<212> ADN
<213> Apis mellifera
<400> 14
<210> 15
<211> 949
<212> ADN
<213>
Apis mellifera 15 <400> 15
<210> 16
<211> 1006
<212> ADN
<213> Apis mellifera
<400> 16
<210> 17
<211> 969
<212> ADN
<213>
Apis mellifera 15 <400> 17
<210> 18
<211> 1026
<212> ADN
<213> Apis mellifera
<400> 18
<210> 19
<211> 1059
<212> ADN
<213> Apis mellifera
<400> 19
<210> 20
<211> 1116
<212> ADN
<213>
Apis mellifera 10 <400> 20
<210> 21
<211> 1660
<212> ADN
<213> Apis mellifera
<400> 21
<210> 22
<211> 308
<212> PRT
<213> Bombus terrestris
<400> 22
<210> 23
<211> 327 10 <212> PRT
<213> Bombus terrestris
<400> 23
<210> 24
<211> 293
<212> PRT
<213> Bombus terrestris
<400> 24
<210> 25
<211> 313
<212> PRT
<213> Bombus terrestris
<400> 25
<210> 26
<211> 313
<212> PRT
<213> Bombus terrestris
<400> 26
<210> 27
<211> 332
<212> PRT
<213> Bombus terrestris
<400> 27
<210> 28
<211> 338
<212> PRT
<213> Bombus terrestris
<400> 28
Arg Thr
<210> 29
<211> 357
<212> PRT
<213> Bombus terrestris
<400> 29
<210> 30
<211> 422
<212> PRT
<213> Bombus terrestris
<400> 30
<210> 31
<211> 927
<212> ADN
<213> Bombus terrestris
<400> 31
10 <210> 32
<211> 984
<212> ADN
<213> Bombus terrestris
<400> 32
<210> 33
<211> 882
<212>ADN
<213> Bombus terrestris
<400> 33
<210> 34
<211> 942
<212> ADN
<213>
Bombus terrestris 15 <400> 34
<210> 35
<211> 942
<212> ADN
<213> Bombus terrestris
<400> 35
<210> 36
<211> 999
<212> ADN
<213>
Bombus terrestris 15 <400> 36
<210> 37
<211> 1017
<212> ADN
<213> Bombus terrestris
<400> 37
<210> 38
<211> 1074
<212> ADN
<213> Bombus terrestris
<400> 38
<210> 39
<211> 1411
<212> ADN
<213> Bombus terrestris
<400> 39
<210> 40
<211> 403
<212> PRT
<213> Myrmecia forficata
<400> 40
<210> 41
<211> 422
<212> PRT
<213> Myrmecia forficata
<400> 41
<210> 42
<211> 392
<212> PRT
<213> Myrmecia forficata
<400> 42
<210> 43
<211> 411
<212> PRT
<213> Myrmecia forficata
<400> 43
<210> 44
<211> 375
<212> PRT
<213> Myrmecia forficata
<400> 44
<210> 45
<211> 394
<212> PRT
<213> Myrmecia forficata
<400> 45
<210> 46
<211> 422
<212> PRT
<213> Myrmecia forficata
<400> 46
<210> 47
<211> 441
<212> PRT
<213> Myrmecia forficata
<400> 47
<210> 48
<211> 1212
<212> ADN
<213> Myrmecia forficata
<400> 48
<210> 49
<211> 1269
<212> ADN
<213> Myrmecia forficata
<400> 49
<210> 50
<211> 1179
<212> ADN
<213>
Myrmecia forficata 15 <400> 50
<210> 51
<211> 1236
<212> ADN
<213> Myrmecia forficata
<400> 51
<210> 52
<211> 1128
<212> ADN
<213> Myrmecia forficata
<400> 52
<210> 53
<211> 1185
<212> ADN
<213> Myrmecia forficata
<400> 53
<210> 54
<211> 1269
<212> ADN
<213> Myrmecia forficata
<400> 54
<210> 55
<211> 1326
<212> ADN
<213> Myrmecia forficata
<400> 55
<210> 56
<211> 372
<212> PRT
<213> Oecophylla smaragdina
<400> 56
<210> 57
<211> 391
<212> PRT
<213> Oecophylla smaragdina
<400> 57
<210> 58
<211> 381
<212> PRT
<213> Oecophylla smaragdina
<400> 58
<210> 59
<211> 400
<212> PRT
<213> Oecophylla smaragdina
<400> 59
<210> 60
<211> 376
<212> PRT
<213> Oecophylla smaragdina
<400> 60
<210> 61
<211> 395
<212> PRT
<213> Oecophylla smaragdina
<400> 61
<210> 62
<211> 424
<212> PRT
<213> Oecophyna smaragdina
<400> 62
<210> 63
<211> 443
<212> PRT
<213> Oecophylla smaragdina
<400> 63
<210> 64
<211> 1119
<212> ADN
<213> Oecophylla smaragdina
<400> 64
<210> 65
<211> 1176
<212> ADN
<213> Oecophylla smaragdina
<400> 65
<210> 66
<211> 1146
<212> ADN
<213> Oecophylla smaragdina
<400> 66
<210> 67
<211> 1203
<212> ADN
<213>
Oecophylla smaragdina 10 <400> 67
<210> 68
<211> 1131
<212> ADN
<213> Oecophylla smaragdina
<400> 68
<210> 69
<211> 1188
<212> ADN
<213> Oecophylla smaragdina
<400> 69
<210> 70
<211> 1275
<212> ADN 10 <213> Oecophylla smaragdina
<400> 70
<210> 71
<211> 1332
<212> ADN
<213> Oecophylla smaragdina
<400> 71
<210> 72
<211> 562
<212> PRT
<213> Mallada signata
<400> 72
<210> 73
<211> 588
<212> PRT
<213> Mallada signata
<400> 73
<210> 74
<211> 1689
<212> ADN
<213> Mallada signata
<400> 74
<210> 75
<211> 1767
<212> ADN
<213> Mallada signata
<400> 75
<210> 76
<211> 975 5 <212> ADN
<213> Artificial
<220>
<223> Proteína de seda de abeja melífera (Xenospira4) codificada por el marco de lectura abierto optimizado para la
expresión en plantas (antes de subclonar en pET14b y pVEC8). 10 <400> 76
<210> 77
<211> 324
<212> PRT
<213> Artificial
<220>
<223> Proteína de seda de abeja melífera (Xenospira4) codificada por el marco de lectura abierto optimizado para la expresión en plantas (sin fusión traduccional).
<400> 77

Claims (21)

  1. REIVINDICACIONES
    1. Un polipéptido de seda recombinante y/o purificado, en el que al menos una porción del polipéptido tiene una estructura en superhélice y en el que el polipéptido comprende una secuencia seleccionada de:
    i) una secuencia de aminoácidos como se proporciona en una cualquiera de las SEC ID N.º: 1, SEC ID N.º: 2, SEC ID N.º: 22, SEC ID N.º: 23, SEC ID N.º: 40, SEC ID N.º: 41, SEC ID N.º: 56, SEC ID N.º: 57; SEC ID N.º: 3, SEC ID N.º: 4, SEC ID N.º: 24, SEC ID N.º: 25, SEC ID N.º: 42, SEC ID N.º: 43, SEC ID N.º: 58, SEC ID N.º: 59, SEC ID N.º: 5, SEC ID N.º: 6, SEC ID N.º: 26, SEC ID N.º: 27, SEC ID N.º: 44, SEC ID N.º: 45, SEC ID N.º: 60, SEC ID N.º: 61, SEC ID N.º: 7, SEC ID N.º: 8, SEC ID N.º: 28, SEC ID N.º: 29, SEC ID N.º: 46, SEC ID N.º: 47, SEC ID N.º: 62, SEC ID N.º: 63, SEC ID N.º: 72 o SEC ID N.º: 73;
    ii) una secuencia de aminoácidos que es al menos un 40 % idéntica a una cualquiera o más de las SEC ID N.º: 1, SEC ID N.º: 2, SEC ID N.º: 22, SEC ID N.º: 23, SEC ID N.º: 40, SEC ID N.º: 41, SEC ID N.º: 56, SEC ID N.º: 57; SEC ID N.º: 3, SEC ID N.º: 4, SEC ID N.º: 24, SEC ID N.º: 25, SEC ID N.º: 42, SEC ID N.º: 43, SEC ID N.º: 58, SEC ID N.º: 59, SEC ID N.º: 5, SEC ID N.º: 6, SEC ID N.º: 26, SEC ID N.º: 27, SEC ID N.º: 44, SEC ID N.º: 45, SEC ID N.º: 60, SEC ID N.º: 61, SEC ID N.º: 7, SEC ID N.º: 8, SEC ID N.º: 28, SEC ID N.º: 29, SEC ID N.º: 46, SEC ID N.º: 47, SEC ID N.º: 62, SEC ID N.º: 63, SEC ID N.º: 72 o SEC ID N.º: 73;
    iii) un fragmento biológicamente activo de i) o ii).
  2. 2.
    El polipéptido de acuerdo con la reivindicación 1, que comprende una secuencia de aminoácidos que es al menos un 80 % idéntica a una cualquiera o más de las SEC ID N.º: 1, SEC ID N.º: 2, SEC ID N.º: 22, SEC ID N.º: 23, SEC ID N.º: 40, SEC ID N.º: 41, SEC ID N.º: 56, SEC ID N.º: 57; SEC ID N.º: 3, SEC ID N.º: 4, SEC ID N.º: 24, SEC ID N.º: 25, SEC ID N.º: 42, SEC ID N.º: 43, SEC ID N.º: 58, SEC ID N.º: 59, SEC ID N.º: 5, SEC ID N.º: 6, SEC ID N.º: 26, SEC ID N.º: 27, SEC ID N.º: 44, SEC ID N.º: 45, SEC ID N.º: 60, SEC ID N.º: 61, SEC ID N.º: 7, SEC ID N.º: 8, SEC ID N.º: 28, SEC ID N.º: 29, SEC ID N.º: 46, SEC ID N.º: 47, SEC ID N.º: 62, SEC ID N.º: 63, SEC ID N.º: 72 o SEC ID N.º: 73.
  3. 3.
    El polipéptido de acuerdo con la reivindicación 1, que comprende una secuencia de aminoácidos que es al menos un 90 % idéntica a una cualquiera o más de las SEC ID N.º: 1, SEC ID N.º: 2, SEC ID N.º: 22, SEC ID N.º: 23, SEC ID N.º: 40, SEC ID N.º: 41, SEC ID N.º: 56, SEC ID N.º: 57; SEC ID N.º: 3, SEC ID N.º: 4, SEC ID N.º: 24, SEC ID N.º: 25, SEC ID N.º: 42, SEC ID N.º: 43, SEC ID N.º: 58, SEC ID N.º: 59, SEC ID N.º: 5, SEC ID N.º: 6, SEC ID N.º: 26, SEC ID N.º: 27, SEC ID N.º: 44, SEC ID N.º: 45, SEC ID N.º: 60, SEC ID N.º: 61, SEC ID N.º: 7, SEC ID N.º: 8, SEC ID N.º: 28, SEC ID N.º: 29, SEC ID N.º: 46, SEC ID N.º: 47, SEC ID N.º: 62, SEC ID N.º: 63, SEC ID N.º: 72 o SEC ID N.º: 73.
  4. 4.
    El polipéptido de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, que se condensa con al menos otro polipéptido.
  5. 5.
    Un polinucleótido aislado y/o exógeno que codifica un polipéptido de seda, en el que al menos una porción del polipéptido tiene una estructura en superhélice y en el que el polinucleótido comprende una secuencia seleccionada de:
    i) una secuencia de nucleótidos proporcionada en una cualquiera de las SEC ID N.º: 11, SEC ID N.º: 12, SEC ID N.º: 31, SEC ID N.º: 32, SEC ID N.º: 48, SEC ID N.º: 49, SEC ID N.º: 64, SEC ID N.º: 65, SEC ID N.º: 13, SEC ID N.º: 14, SEC ID N.º: 33, SEC ID N.º: 34, SEC ID N.º: 50, SEC ID N.º: 51, SEC ID N.º: 66, SEC ID N.º: 67, SEC ID N.º: 15, SEC ID N.º: 16, SEC ID N.º: 35, SEC ID N.º: 36, SEC ID N.º: 52, SEC ID N.º: 53, SEC ID N.º: 68, SEC ID N.º: 69, SEC ID N.º: 17, SEC ID N.º: 18, SEC ID N.º: 37, SEC ID N.º: 38, SEC ID N.º: 54, SEC ID N.º: 55, SEC ID N.º: 70, SEC ID N.º: 71, SEC ID N.º: 76, SEC ID N.º: 74 o SEC ID N.º: 75;
    ii) una secuencia de nucleótidos que codifican un polipéptido de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4;
    iii) una secuencia de nucleótidos que es al menos un 40 % idéntica a cualquiera o más de las SEC ID N.º: 11, SEC ID N.º: 12, SEC ID N.º: 31, SEC ID N.º: 32, SEC ID N.º: 48, SEC ID N.º: 49, SEC ID N.º: 64, SEC ID N.º: 65, SEC ID N.º: 13, SEC ID N.º: 14, SEC ID N.º: 33, SEC ID N.º: 34, SEC ID N.º: 50, SEC ID N.º: 51, SEC ID N.º: 66, SEC ID N.º: 67, SEC ID N.º: 15, SEC ID N.º: 16, SEC ID N.º: 35, SEC ID N.º: 36, SEC ID N.º: 52, SEC ID N.º: 53, SEC ID N.º: 68, SEC ID N.º: 69, SEC ID N.º: 17, SEC ID N.º: 18, SEC ID N.º: 37, SEC ID N.º: 38, SEC ID N.º: 54, SEC ID N.º: 55, SEC ID N.º: 70, SEC ID N.º: 71, SEC ID N.º: 76, SEC ID N.º: 74 o SEC ID N.º: 75;
    iv) una secuencia que hibrida con una cualquiera de i) a iii) en condiciones rigurosas.
  6. 6.
    El polinucleótido de la reivindicación 5, que comprende una secuencia de nucleótidos que es al menos un 80 % idéntica a cualquiera o más de las SEC ID N.º: 11, SEC ID N.º: 12, SEC ID N.º: 31, SEC ID N.º: 32, SEC ID N.º: 48, SEC ID N.º: 49, SEC ID N.º: 64, SEC ID N.º: 65, SEC ID N.º: 13, SEC ID N.º: 14, SEC ID N.º: 33, SEC ID N.º: 34,
    SEC ID N.º: 50, SEC ID N.º: 51, SEC ID N.º: 66, SEC ID N.º: 67, SEC ID N.º: 15, SEC ID N.º: 16, SEC ID N.º: 35, SEC ID N.º: 36, SEC ID N.º: 52, SEC ID N.º: 53, SEC ID N.º: 68, SEC ID N.º: 69, SEC ID N.º: 17, SEC ID N.º: 18, SEC ID N.º: 37, SEC ID N.º: 38, SEC ID N.º: 54, SEC ID N.º: 55, SEC ID N.º: 70, SEC ID N.º: 71, SEC ID N.º: 76, SEC ID N.º: 74 o SEC ID N.º: 75.
  7. 7.
    El polinucleótido de la reivindicación 5, que comprende una secuencia de nucleótidos que es al menos un 90 % idéntica a cualquiera o más de las SEC ID N.º: 11, SEC ID N.º: 12, SEC ID N.º: 31, SEC ID N.º: 32, SEC ID N.º: 48, SEC ID N.º: 49, SEC ID N.º: 64, SEC ID N.º: 65, SEC ID N.º: 13, SEC ID N.º: 14, SEC ID N.º: 33, SEC ID N.º: 34, SEC ID N.º: 50, SEC ID N.º: 51, SEC ID N.º: 66, SEC ID N.º: 67, SEC ID N.º: 15, SEC ID N.º: 16, SEC ID N.º: 35, SEC ID N.º: 36, SEC ID N.º: 52, SEC ID N.º: 53, SEC ID N.º: 68, SEC ID N.º: 69, SEC ID N.º: 17, SEC ID N.º: 18, SEC ID N.º: 37, SEC ID N.º: 38, SEC ID N.º: 54, SEC ID N.º: 55, SEC ID N.º: 70, SEC ID N.º: 71, SEC ID N.º: 76, SEC ID N.º: 74 o SEC ID N.º: 75.
  8. 8.
    Un vector que comprende al menos un polinucleótido de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 5 a 7.
  9. 9.
    Una célula huésped que comprende al menos un polinucleótido exógeno de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 5 a 7 y/o al menos un vector de la reivindicación 8.
  10. 10.
    Un procedimiento para preparar un polipéptido de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, comprendiendo el procedimiento cultivar una célula huésped de acuerdo con la reivindicación 9 en condiciones que permitan la expresión del polinucleótido que codifica el polipéptido y recuperar el polipéptido expresado.
  11. 11.
    Un procedimiento para preparar un polipéptido de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, comprendiendo el procedimiento expresar en un sistema de expresión acelular un vector de la reivindicación 8 que comprende un polinucleótido que codifica el polipéptido en condiciones que permitan la expresión del polinucleótido que codifica el polipéptido y recuperar el polipéptido expresado.
  12. 12.
    Una planta transgénica que comprende un polinucleótido exógeno, en el que el polinucleótido codifica al menos un polipéptido de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones a 1 a 4.
  13. 13.
    Un anticuerpo que se une específicamente a un polipéptido de seda recombinante y/o purificado en el que al menos una porción del polipéptido tiene una estructura en superhélice y en el que el polipéptido consiste en una secuencia seleccionada de una secuencia de aminoácidos como se proporciona en una cualquiera de las SEC ID N.º: 1, SEC ID N.º: 2, SEC ID N.º: 22, SEC ID N.º: 23, SEC ID N.º: 40, SEC ID N.º: 41, SEC ID N.º: 56, SEC ID N.º: 57, SEC ID N.º: 3, SEC ID N.º: 4, SEC ID N.º: 24, SEC ID N.º: 25, SEC ID N.º: 42, SEC ID N.º: 43, SEC ID N.º: 58, SEC ID N.º: 59, SEC ID N.º: 5, SEC ID N.º: 6, SEC ID N.º: 26, SEC ID N.º: 27, SEC ID N.º: 44, SEC ID N.º: 45, SEC ID N.º: 60, SEC ID N.º: 61, SEC ID N.º: 7, SEC ID N.º: 8, SEC ID N.º: 28, SEC ID N.º: 29, SEC ID N.º: 46, SEC ID N.º: 47, SEC ID N.º: 62, SEC ID N.º: 63, SEC ID N.º: 72 o SEC ID N.º: 73.
  14. 14.
    Una fibra de seda que comprende al menos un polipéptido de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones a 1 a 4, en la que la fibra de seda no comprende una proteína de jalea real producida por un insecto.
  15. 15.
    Un copolímero que comprende al menos dos polipéptidos purificados y/o recombinantes de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones a 1 a 4, en el que el copolímero no comprende una proteína de jalea real producida por un insecto.
  16. 16.
    Un producto que comprende al menos un polipéptido purificado y/o recombinante de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones a 1 a 4, la fibra de seda de la reivindicación 14 y/o el copolímero de la reivindicación 15, en el que el producto no comprende una proteína de jalea real producida por un insecto.
  17. 17.
    Una composición que comprende al menos un polipéptido purificado y/o recombinante de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones a 1 a 4, la fibra de seda de la reivindicación 14 y/o el copolímero de la reivindicación 15 y uno o más vehículos aceptables.
  18. 18.
    La composición de la reivindicación 17, que además comprende un fármaco.
  19. 19.
    Una composición que comprende al menos un polinucleótido aislado y/o exógeno de una cualquiera de las reivindicaciones 5 a 7 y uno o más vehículos aceptables.
  20. 20.
    Uso de al menos un polipéptido de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones a 1 a 4, la fibra de seda de la reivindicación 14 y/o el copolímero de la reivindicación 15 y un fármaco, para la fabricación de un medicamento para tratar o prevenir una enfermedad.
  21. 21.
    Un kit que comprende al menos un polipéptido de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, el polinucleótido de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 5 a 7, el vector de la reivindicación 8, la fibra de
    seda de la reivindicación 14 y/o el copolímero de la reivindicación 15.
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Families Citing this family (46)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JPS6358101A (ja) * 1986-08-29 1988-03-12 Hitachi Ltd 位置検出装置
BRPI0510975B8 (pt) 2004-05-14 2021-06-22 Ethicon Endo Surgery Llc sutura farpada
NZ567202A (en) * 2005-10-05 2012-02-24 Commw Scient Ind Res Org Silk proteins from Hyhemonptera species containing heptad repeats that form coiled coil tertiary structures
EP2101975A2 (en) * 2006-11-03 2009-09-23 Trustees of Tufts College Biopolymer sensor and method of manufacturing the same
WO2008127403A2 (en) 2006-11-03 2008-10-23 Trustees Of Tufts College Biopolymer optofluidic device and method of manufacturing the same
EP2650112B1 (en) 2006-11-03 2016-08-24 Trustees Of Tufts College Nanopatterned biopolymer optical device and method of manufacturing the same
US20080255612A1 (en) 2007-04-13 2008-10-16 Angiotech Pharmaceuticals, Inc. Self-retaining systems for surgical procedures
EP2188374A4 (en) * 2007-08-06 2012-05-16 Commw Scient Ind Res Org CROSS-BETA-SILK-GENE
US8777987B2 (en) 2007-09-27 2014-07-15 Ethicon, Inc. Self-retaining sutures including tissue retainers having improved strength
WO2009070233A1 (en) * 2007-11-26 2009-06-04 Waters Technologies Corporation Internal standards and methods for use in quantitatively measuring analytes in a sample
WO2009086172A2 (en) 2007-12-19 2009-07-09 Angiotech Pharmaceuticals, Inc. Self-retaining sutures with heat-contact mediated retainers
US8916077B1 (en) 2007-12-19 2014-12-23 Ethicon, Inc. Self-retaining sutures with retainers formed from molten material
US8118834B1 (en) 2007-12-20 2012-02-21 Angiotech Pharmaceuticals, Inc. Composite self-retaining sutures and method
US8875607B2 (en) 2008-01-30 2014-11-04 Ethicon, Inc. Apparatus and method for forming self-retaining sutures
EP3533399A3 (en) 2008-02-21 2019-10-23 Ethicon LLC Method for elevating retainers on self-retaining sutures
US8641732B1 (en) 2008-02-26 2014-02-04 Ethicon, Inc. Self-retaining suture with variable dimension filament and method
EP3530196A1 (en) 2008-04-15 2019-08-28 Ethicon, LLC Self-retaining sutures with bi-directional retainers or uni-directional retainers
MX381532B (es) 2008-11-03 2025-03-12 Ethicon Llc Longitud de sutura autorretenible y metodo y dispositivo para su uso.
CA2805403A1 (en) * 2009-07-10 2011-01-13 Trustees Of Tufts College Bioengineered silk protein-based nucleic acid delivery systems
US8674077B2 (en) * 2009-08-26 2014-03-18 Commonwealth Scientific And Industrial Research Organisation Processes for producing silk dope
EP3495381A1 (en) * 2009-12-08 2019-06-12 AMSilk GmbH Silk protein coatings
WO2011090628A2 (en) 2009-12-29 2011-07-28 Angiotech Pharmaceuticals, Inc. Bidirectional self-retaining sutures with laser-marked and/or non-laser marked indicia and methods
KR102045300B1 (ko) 2010-05-04 2019-11-18 에티컨, 엘엘씨 레이저 커팅된 리테이너를 갖는 자가-유지형 시스템
EP2579787B1 (en) 2010-06-11 2016-11-30 Ethicon, LLC Suture delivery tools for endoscopic and robot-assisted surgery
KR102236459B1 (ko) 2010-11-03 2021-04-07 에티컨, 엘엘씨 약물-용출 자가-유지형 봉합재 및 그 관련 방법
NZ704801A (en) 2010-11-09 2015-10-30 Ethicon Llc Emergency self-retaining sutures and packaging
BR112013024303B1 (pt) 2011-03-23 2020-12-15 Ethicon Llc Sistema de sutura de autorretenção e método para fabricar um sistema de sutura de autorretenção
US20130172931A1 (en) 2011-06-06 2013-07-04 Jeffrey M. Gross Methods and devices for soft palate tissue elevation procedures
EP2780459A4 (en) 2011-11-16 2015-05-20 Commw Scient Ind Res Org COLLAGEN SILKEN
CA2904749A1 (en) * 2012-03-26 2013-10-03 Commonwealth Scientific And Industrial Research Organisation Silk polypeptides
WO2016029034A1 (en) 2014-08-20 2016-02-25 Silk Technologies, Ltd. Fibroin-derived protein composition
US10870875B2 (en) * 2014-11-17 2020-12-22 Commonwealth Scientific And Industrial Research Organisation Metalloprotein compositions
PE20171791A1 (es) 2014-12-02 2017-12-28 Silk Therapeutics Inc Prendas de vestir de seda y productos de alto rendimiento y metodos para elaborarla
JP6956066B2 (ja) * 2015-07-14 2021-10-27 エボルブド バイ ネイチャー， インコーポレイテッド シルク性能衣服及び製品、並びにこれらを製造する方法
CN108348064B (zh) 2015-11-03 2020-08-04 高露洁-棕榄公司 刷毛和包括刷毛的牙刷
AU2017267370B2 (en) 2016-04-08 2021-07-08 Cornell University A method to enhance wound healing using silk-derived protein
KR102275012B1 (ko) 2016-08-12 2021-07-07 실크 테크놀로지스 리미티드 염증 치료용 실크 유래 단백질
HUE070615T2 (hu) 2016-10-17 2025-06-28 Pfizer Anti-EDB antitestek és antitest-gyógyszer konjugátumok
WO2019067745A1 (en) 2017-09-27 2019-04-04 Silk, Inc. SILK-COATED FABRICS, PRODUCTS AND PREPARATION METHODS THEREFOR
WO2019092073A1 (en) * 2017-11-10 2019-05-16 Amsilk Gmbh Silk alcohol formulations
CN112789063B (zh) * 2018-10-05 2022-10-25 国立大学法人广岛大学 半月板再生用材料
PH12021550468B1 (en) 2018-10-23 2023-05-19 Unilever Ip Holdings B V Cosmetic compositions comprising low molecular weight silk fibroin
CN110016438B (zh) * 2019-01-29 2021-04-13 西北大学 一种真菌菌株及其菌丝体的液体培养方法
US11976196B2 (en) * 2021-04-14 2024-05-07 Cambridge Crops, Inc. Silk packaging applications
WO2023076924A1 (en) 2021-10-26 2023-05-04 Rensselaer Polytechnic Institute Systems and methods for increased production of recombinant biopolymers via genome engineering and downregulation of basal expression
TR2021019717A2 (tr) 2021-12-13 2022-01-21 Atiye Degirmenci Ari i̇peği̇ni̇n medi̇kal ve kozmeti̇k amaçla kullanimi

Family Cites Families (52)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JPS4720312U (es) 1971-01-21 1972-11-07
DE3121241C2 (de) 1980-05-28 1984-07-19 Dainippon Ink And Chemicals, Inc., Tokio/Tokyo Verfahren zum Herstellen eines Verbundkunststoffrohres aus thermoplastischem Harz
US4943674A (en) 1987-05-26 1990-07-24 Calgene, Inc. Fruit specific transcriptional factors
GB8607679D0 (en) 1986-03-27 1986-04-30 Winter G P Recombinant dna product
JPH0723585B2 (ja) 1989-11-06 1995-03-15 信越化学工業株式会社 ウール処理剤
DE69131969T2 (de) * 1990-04-20 2000-06-15 The University Of Wyoming, Laramie Für Spinnenseideprotein kodierende DNS, DNS enthaltender Vektor, transformierte Zelle und Produkte davon
US5989894A (en) 1990-04-20 1999-11-23 University Of Wyoming Isolated DNA coding for spider silk protein, a replicable vector and a transformed cell containing the DNA
FR2695558B1 (fr) 1992-09-11 1994-10-21 Oreal Composition cosmétique contenant des particules solides revêtues avec un polymère amphotère.
EP0707645B1 (en) 1993-06-15 2003-11-05 E.I. Du Pont De Nemours And Company Novel, recombinantly produced spider silk analogs
FI972443A7 (fi) 1994-12-07 1997-06-09 Novozymes As Polypeptidi, jonka allergeenisuus on vähentynyt
US5939288A (en) 1995-06-07 1999-08-17 Iowa State University Research Foundation, Inc. Plant secretory signal peptides and nectarins
ATE261297T1 (de) 1995-06-26 2004-03-15 Hans Schwarzkopf & Henkel Gmbh Haarfärbemittel mit mindestens einem pflegestoff
US6013250A (en) 1995-06-28 2000-01-11 L'oreal S. A. Composition for treating hair against chemical and photo damage
EP0848754A1 (en) * 1995-08-22 1998-06-24 Richard M. Basel Cloning methods for high strength spider silk proteins
US5792294A (en) 1995-11-16 1998-08-11 Otis Elevator Company Method of replacing sheave liner
US6398821B1 (en) 1996-12-23 2002-06-04 The Procter & Gamble Company Hair coloring compositions
JP3545588B2 (ja) 1997-03-24 2004-07-21 株式会社資生堂 毛髪化粧料
KR100431659B1 (ko) 1997-06-18 2004-05-17 독립행정법인농업생물자원연구소 견 피브로인 및 견 세리신을 주성분으로 하는 창상피복재 및 그의 제조방법
ATE375387T1 (de) 1997-06-25 2007-10-15 Novozymes As Modifiziertes polypeptid
US6284246B1 (en) 1997-07-30 2001-09-04 The Procter & Gamble Co. Modified polypeptides with high activity and reduced allergenicity
FR2774588B1 (fr) 1998-02-11 2000-05-05 Oreal Composition cosmetique ou dermatologique contenant au moins une proteine de soie d'arachnides naturelle, recombinante ou un analogue
DE19848002A1 (de) 1998-10-17 2000-04-20 Goldschmidt Ag Th Polypeptid-Polysiloxan-Copolymere
JP2000139755A (ja) 1998-11-12 2000-05-23 Miki Tokushu Seishi Kk あぶらとり紙及びその製造方法
JP2000328460A (ja) 1999-05-24 2000-11-28 Dow Corning Toray Silicone Co Ltd 水系繊維処理剤および繊維の処理方法
EP1074617A3 (en) * 1999-07-29 2004-04-21 Research Association for Biotechnology Primers for synthesising full-length cDNA and their use
JP4570188B2 (ja) * 1999-11-24 2010-10-27 独立行政法人 日本原子力研究開発機構 絹繊維を微粉末化及び水溶化する方法
US6608242B1 (en) * 2000-05-25 2003-08-19 E. I. Du Pont De Nemours And Company Production of silk-like proteins in plants
GB0108181D0 (en) 2001-04-02 2001-05-23 Xiros Plc Silk-based fibre
AU2002312426A1 (en) 2001-06-06 2002-12-16 University Of Wyoming Expression of spider silk proteins in higher plants
EP1427742A1 (en) 2001-08-29 2004-06-16 University of Wyoming Spider silk protein encoding nucleic acids, polypeptides, antibodies and method of use thereof
ITVR20010098A1 (it) 2001-09-11 2003-03-11 Consorzio Per Gli Studi Uni Procedimento per l'ottenimento di idrogeli di fibroina di seta.
US20050055051A1 (en) 2001-09-13 2005-03-10 Grafton R. Donald High strength suture with silk trace
US6902932B2 (en) 2001-11-16 2005-06-07 Tissue Regeneration, Inc. Helically organized silk fibroin fiber bundles for matrices in tissue engineering
US7014807B2 (en) 2002-01-09 2006-03-21 E.I. Dupont De Nemours And Company Process of making polypeptide fibers
WO2003060099A2 (en) 2002-01-11 2003-07-24 Nexia Biotechnologies, Inc. Methods and apparatus for spinning spider silk protein
WO2003100065A1 (en) * 2002-05-23 2003-12-04 Japan As Represented By President Of Tokyo University Of Agriculture And Technology Process for the mass production of silk protein and genetically modified silk-like protein having function imparted thereto
US7516525B2 (en) 2002-06-13 2009-04-14 Texas Tech University Process for making chemical protective wipes and such wipes
JP3772207B2 (ja) 2002-06-19 2006-05-10 独立行政法人農業生物資源研究所 生分解性生体高分子材料、その製造方法、およびこの高分子材料からなる機能性素材
GB0218977D0 (en) 2002-08-15 2002-09-25 Univ York Polypeptide
US20040132978A1 (en) 2002-11-12 2004-07-08 Fahnestock Stephen R. Method for purifying and recovering silk proteins in soluble form and uses thereof
US20040199241A1 (en) 2002-12-30 2004-10-07 Angiotech International Ag Silk stent grafts
NO316350B1 (no) 2003-02-07 2004-01-12 Hiform As Laminat og framgangsmåte for framstilling av et fiberarmert laminert motstandselement
US7060260B2 (en) 2003-02-20 2006-06-13 E.I. Du Pont De Nemours And Company Water-soluble silk proteins in compositions for skin care, hair care or hair coloring
US7115388B2 (en) 2003-03-14 2006-10-03 National Institute Of Agrobiological Sciences Production of functional polypeptides originating from silk protein and use thereof
JP4357859B2 (ja) 2003-03-24 2009-11-04 トヨタ自動車株式会社 繊維複合樹脂品及びその製造方法
RU2236843C1 (ru) * 2003-08-05 2004-09-27 Злобин Виктор Сергеевич Лечебно-косметическое средство
DE10336509A1 (de) 2003-08-08 2005-03-03 Ledertech Gmbh Verbundmaterial für thermisch formbare Schuhkomponenten auf organischer Faserbasis
US20070082197A1 (en) 2003-11-04 2007-04-12 Ko Frank K Electrospun carbon nanotube reinforced silk fibers
US7314851B2 (en) 2003-12-11 2008-01-01 The Foundation for the Promotion of Supplementary Occupations and Related Techniques of her Majesty Queen Sirikit Silk soap comprising sericin protein
JP4815108B2 (ja) 2003-12-26 2011-11-16 イビデン株式会社 ハニカム構造体
US20050161058A1 (en) 2004-01-26 2005-07-28 Israel Yerushalmy Spider silk dental floss
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