ES2296341T3 - Nueva fitasa. - Google Patents

Abstract

Fitasa sustancialmente pura que tiene una secuencia de aminoácidos constituida por la SEC ID Nº: 2.

Description

Nueva fitasa.

Campo de la invención

Esta invención se refiere polinucleótidos recién identificados, polipéptidos codificados por dichos polinucleótidos, el uso de dichos polinucleótidos y polipéptidos así como a la producción y aislamiento de dichos polinucleótidos y polipéptidos. Más particularmente, los polipéptidos de la presente invención se han identificado como fitasas y en particular, enzimas que tienen actividad de fitasa.

Antecedentes

Los minerales son elementos esenciales para el crecimiento de todos los organismos. Para la producción ganadera de animales monogástricos (por ejemplo, cerdos, aves de corral) y de peces, el alimento se suplementa habitualmente con minerales. Las semillas vegetales son una fuente rica en minerales ya que contienen iones que forman complejos con los grupos fosfato del ácido fítico. Los rumiantes no necesitan fosfato inorgánico y minerales ya que los microorganismos en el rumen producen enzimas que catalizan la conversión del fitato (mio-inositol-hexafosfato) en inositol y fosfato inorgánico. En el proceso, se liberan los minerales que se complejan con el fitato.

El fitato se produce como una fuente de fósforo almacenado en todos los alimentos vegetales (Phytic Acid. Chemistry and Applications, E. Graf (Ed.). Pilatus Press: Minneapolis, MN. U.S.A.. 1986). El ácido fítico forma una parte normal de la semilla en cereales y leguminosas. Funciona uniéndose a minerales de la dieta que son esenciales para la nueva planta a medida que surge de la semilla. Cuando los grupos fosfato del ácido fítico son eliminados por la enzima fitasa de la semilla, la capacidad para unirse a los iones metálicos se pierde y los minerales quedan disponibles para la planta. En granos para alimento del ganado, los restos minerales unidos mediante el ácido fítico sólo están parcialmente disponibles para su absorción por animales monogástricos, que carecen de actividad fitasa. Aunque se produce una hidrólisis parcial del fitato en el colon, la mayor parte del fitato pasa a través del tracto gastrointestinal de los animales monogástricos y se excreta en las heces contribuyendo a problemas de contaminación por fosfatos fecales en áreas de intensa producción ganadera. El fósforo inorgánico liberado en el colon no tiene valor nutricional para el ganado ya que el fósforo inorgánico se absorbe solamente en el intestino delgado. Por lo tanto, una cantidad significativa de los minerales de la dieta nutricionalmente importantes no está potencialmente disponible para los animales monogástricos.

La conversión de fitato en inositol y en fósforo inorgánico puede catalizarse mediante enzimas microbianas denominadas ampliamente fitasas. Las fitasas tales como la fitasa Nº EC 3.1.3.8 son capaces de catalizar la hidrólisis del mio-inositol hexafosfato a D-mio-inositol 1,2,4,5,6-pentafosfato y ortofosfato. Ciertas fitasas de los hongos hidrolizan inositol pentafosfato a tetra-, tri- y a fosfatos inferiores. Por ejemplo, se sabe que las fitasas de A. ficuum producen mezclas de mio-inositol di- y mono-fosfato (Ullah, 1988). Los microorganismos que producen fitasa comprenden bacterias tales como Bacillus subtilis (V. K. Powar y V. J. Jagannathan, J. Bacteriol. 151: 1102-1108, 1982) y Pseudomonas (D. J. Cosgrove, Austral. J. Biol. Sci. 2: 1207-1220, 1970); levaduras tales como Saccharomyces cerevisiae (N. R. Nayini y P. Markakis, Lebensmittel Wissenschaft und Technologie 17: 24-26, 1984); y hongos tales como Aspergillus terreus (K. Yamada, et al., Agric. Biol Chem. 32: 1275-1282, 1968). El posible uso de microbios capaces de producir fitasa como un aditivo alimentario para los animales monogástricos se ha presentado previamente (Shien y Ware, Patente de Estados Unidos Nº 3.297.548; Nelson, T. S. et al., J. Nutrition 101: 1289-1294, 1971).

Se sabe que las fitasas microbianas también pueden ser útiles para producir alimento animal a partir de ciertos procesos industriales, por ejemplo con productos de desecho de trigo y maíz. El proceso de molienda húmeda del maíz produce gluten que se comercializa como alimento animal. Se sabe que la adición de fitasa puede mejorar el valor nutricional del producto alimentario. Las enzimas de fitasa fúngicas y las condiciones del proceso (t \sim 50ºC y pH \sim 5,5) se han presentado previamente en la Solicitud de Patente Europea 0 321 004. En el procesamiento de la harina de semilla de soja se sabe que la presencia de fitato convierte al alimento y a los residuos en inadecuados para alimentos usados en la cría de pescado, aves de corral y otros no rumiantes así como terneros lactantes. Se sabe que la fitasa es útil para mejorar el valor nutritivo y comercial de este material de soja alto en proteínas (véase, Finase Enzymes by Alko, Rajamaki, Finlandia). Se ha usado una combinación de fitasa y una forma de fosfatasa ácida a pH óptimo de 2,5 de A. niger por Alko Ltd. como un suplemento alimentario animal en su producto de degradación del ácido fítico Finas F y Finase S. Una fuente barata y eficaz de fitasa mejoraría enormemente el valor de las harinas soja como alimento animal (Shien et al., 1969).

La fitasa y las fosfatasas ácidas menos especificas son producidas por el hongo Aspergillus ficuum como enzimas extracelulares (Shieh et al., 1969). Se sabe que Ullah purificó una fitasa de A. ficuum de tipo silvestre que tenía un peso molecular aparente de 61,7 kDA (en SDS-PAGE; corregido para la glicosilación); pH óptimos a pH 2,5 y pH 5,5; una Km de aproximadamente 40 \muM y una actividad específica de aproximadamente 50 U/mg (Ullah, A., Preparative Biochem 18: 443-458, 1988); la solicitud de patente PCT WO 91/05053 también describe el aislamiento y la clonación molecular de una fitasa de Aspergillus ficuum con pH óptimos a pH 2,5 y pH 5,5, una Km de aproximadamente 250 \muM y una actividad específica de aproximadamente 104 U/mg de proteína.

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Las fosfatasas ácidas son enzimas que hidrolizan de forma catalítica una gran diversidad de ésteres de fosfato y normalmente muestran pH óptimos por debajo de 6,0 (Hollander, 1971); por ejemplo Nº EC 3.1.3.2 cataliza la hidrólisis de monoésteres ortofosfóricos a productos de ortofosfato. Se sabe que se ha purificado una fosfatasa ácida de A. ficuum. La forma desglicosilada de las fosfatasas ácidas tiene un peso molecular aparente de 32,6 kDa (Ullah et al., 1987).

El objeto de la presente invención proporciona una fitasa recombinante aislada a partir de Escherichia coli B que mejora la eficacia de liberación de fósforo a partir de fitato y de las sales de ácido fítico. Otro objeto de la presente invención proporciona una fuente de una enzima recombinante que es adecuada para uso comercial en alimentos y en procesos industriales con un procesamiento mínimo.

Sumario de la invención

La presente invención proporciona un polinucleótido y un polipéptido codificado por éste que se ha identificado como una enzima fitasa que tiene actividad fitasa. De acuerdo con un aspecto de la presente invención, se proporciona una nueva enzima recombinante, así como fragmentos activos, análogos y derivados de la misma.

De acuerdo con otro aspecto de la presente invención, se proporcionan moléculas de ácido nucleico aisladas que codifican la enzima de la presente invención incluyendo ARNm, ADN, ADNc, ADN genómico así como análogos y fragmentos activos de dicha enzima.

De acuerdo con otro aspecto más de la presente invención, se proporciona un proceso para producir dicho polipéptido mediante técnicas recombinantes que comprenden cultivar células hospedadoras procariotas y/o eucariotas recombinantes, que contienen una secuencia de ácido nucleico que codifica una enzima de la presente invención, en condiciones que promueven la expresión de dicha enzima y la posterior recuperación de dicha enzima.

De acuerdo con otro aspecto más de la presente invención, se proporciona un proceso para utilizar dicha enzima, o polinucleótido que codifica dicha enzima para su uso en procesos comerciales, tales como por ejemplo, procesos que liberan minerales a partir de fitatos en materiales vegetales in vitro es decir en procesos de tratamiento del alimento o in vivo es decir administrando la enzima a animales.

De acuerdo con otro aspecto más de la presente invención, se proporciona un proceso para utilizar dichas enzimas, o polinucleótidos que codifican dichas enzimas, para fines in vitro relacionados con la investigación científica, por ejemplo para generar sondas para identificar secuencias similares que podrían codificar enzimas similares en otros organismos.

Estos y otros aspectos de la presente invención serán evidentes para los especialistas en la técnica a partir de las enseñanzas de este documento.

Breve descripción de los dibujos

Los siguientes dibujos son ilustrativos de las realizaciones de la invención y no pretenden limitar el alcance de la invención de acuerdo con lo abarcado por las reivindicaciones.

La Figura 1 muestra las secuencias de nucleótidos y de aminoácidos deducidas de la enzima de la presente invención. La secuenciación se realizó usando un secuenciador de ADN automatizado 378 (Applied Biosystems, Inc.).

La Figura 2 muestra los datos de estabilidad y del perfil de pH y temperatura de la enzima fitasa de la presente invención. El ensayo utilizado para este análisis es el siguiente para la detección de la actividad fitasa. La actividad fitasa se mide incubando 150 \mul de la preparación de la enzima con 600 \mul de fitato sódico 2 mM en tampón Tris HCl 100 mM a pH 7,5, suplementado con CaCl_{2} 1 mM durante 30 minutos a 37ºC. Después de la incubación la reacción se detiene añadiendo 750 \mul de ácido tricloroacético al 5%. El fosfato liberado se midió frente al fosfato convencional mediante espectofotometría a 700 nm después de añadir 1500 \mul del reactivo de color (4 volúmenes de molibdato de amonio al 1,5% en ácido sulfúrico al 5,5% y un volumen de sulfato ferroso al 2,7%; Shimizu, M., 1992; Biosci. Biotech. Biochem., 56: 1266-1269). La DO a 700 nm se indica en el eje de las Y de las gráficas de la Figura 2. La temperatura o el pH se indican en el eje de las X de las gráficas.

Descripción detallada de la invención

El término "gen" significa el segmento de ADN implicado en la producción de una cadena polipeptídica; incluye regiones que preceden y que siguen a la región codificante (secuencia líder y trailer) así como secuencias intermedias (intrones) entre los fragmentos codificantes individuales (exones).

Una secuencia codificante está "unida de forma operativa a" otra secuencia codificante cuando la ARN polimerasa transcribirá las dos secuencias codificantes en un único ARNm, que después se traduce a un único polipéptido que tiene aminoácidos obtenidos de las dos secuencias codificantes. Las secuencias codificantes no necesitan ser contiguas entre sí siempre que las secuencias expresadas se procesen finalmente para producir la proteína deseada.

Enzimas "recombinantes" se refiere a enzimas producidas mediante técnicas de ADN recombinante, es decir, producidas a partir de células transformadas mediante una construcción de ADN exógena que codifica la enzima deseada. Enzimas "sintéticas" son aquellas que se preparan mediante síntesis química.

Una "secuencia codificante de" ADN de o "una secuencia de nucleótidos que codifica" una enzima en particular es una secuencia de ADN que se transcribe y se traduce en una enzima cuando se coloca bajo el control de las secuencias reguladoras apropiadas. Una "secuencia promotora" es una región reguladora del ADN capaz de unirse a la ARN polimerasa en una célula y de iniciar la transcripción de una secuencia codificante cadena abajo (dirección 3'). El promotor es parte de la secuencia de ADN. Esta región de la secuencia tiene un codón de inicio en su extremo 3'. La secuencia promotora incluye el número mínimo de bases cuyos elementos son necesarios para iniciar la transcripción a niveles detectables por encima del fondo. Sin embargo, después de que la ARN polimerasa se une a la secuencia y se inicia la transcripción en el codón de inicio (extremo 3' con un promotor), la transcripción continua cadena abajo en la dirección 3'. Dentro de la secuencia promotora se encontrará un sitio de inicio de la transcripción (definido adecuadamente mapeando con la nucleasa S1) así como dominios de unión a la proteína (secuencias consenso) responsables de la unión de la ARN polimerasa.

La presente invención proporciona una enzima recombinante purificada que cataliza la hidrólisis de fitato a inositol y fosfato libre con la liberación de minerales del complejo del ácido fítico. Una enzima purificada ejemplar en una fitasa obtenida de Escherichia coli B. Esta enzima ejemplar se muestra en la Figura 1, SEC ID Nº 2.

El polinucleótido que codifica la SEC ID Nº 2 se recuperó originalmente de ADN genómico aislado de Escherichia coli B como se describe a continuación. Contiene un marco de lectura abierto que codifica una proteína de 432 restos de aminoácidos.

En una realización, la enzima fitasa de la SEC ID Nº 2 de la presente invención tiene un peso molecular de aproximadamente 47.056 kilodalton según lo medido mediante electroforesis en gen SDS-PAGE y un peso molecular supuesto a partir de la secuencia de nucleótidos del gen. El pI es 6,70. Los datos de estabilidad y del perfil de pH y temperatura para esta enzima se presentan en la Figura 2. La enzima purificada puede usarse para catalizar la hidrólisis de fitato a inositol y fosfato libre donde se desee. La enzima fitasa de la presente invención tiene una gran estabilidad térmica.

De acuerdo con un aspecto de la presente invención, se proporcionan moléculas de ácido nucleico aislado (polinucleótidos) que codifican la enzima madura que tienen la secuencia de aminoácidos deducida de la Figura 1.

La invención puede usarse para aislar secuencias de ácido nucleico sustancialmente similares a la molécula de ácido nucleico aislada que codifica una enzima fitasa descrita en la Figura 1 (SEC ID Nº 1). Las secuencias de ácido nucleico aisladas son sustancialmente similares si: (i) son capaces de hibridar en condiciones rigurosas, descritas en lo sucesivo en este documento, con la SEC ID Nº 1; o (ii) codifican secuencias de ADN que son degeneradas de la SEC ID Nº 1. Secuencias de ADN degeneradas codifican la secuencia de aminoácidos de la SEC ID Nº 2, pero tienen modificaciones en las secuencias codificantes de nucleótidos. Como se usa en este documento, "sustancialmente similar" se refiere a las secuencias que tienen una identidad similar a las secuencias de la presente invención.

Las secuencias de nucleótidos que son sustancialmente similares pueden identificarse mediante hibridación o mediante comparación de secuencias. Las secuencias de enzimas que son sustancialmente similares pueden identificarse mediante uno o más de los siguientes métodos: digestión proteolítica, electroforesis en gel y/o microsecuenciación.

Un medio para aislar una molécula de ácido nucleico que codifica una enzima fitasa es sondear una biblioteca de genes genómica con una sonda natural o diseñada artificialmente usando un procedimiento reconocido (véase por ejemplo: Current Protocols in Molecular Biology, Ausubel F.M. et al. (EDS.) Green Publishing Company Assoc. y John Wiley Interscience, Nueva York, 1989, 1992). Es evidente para un especialista en la técnica que la SEC ID Nº 1, o fragmentos de la misma (que comprenden al menos 15 nucleótidos contiguos), es una sonda particularmente útil. Otras sondas particularmente útiles para este fin son fragmentos hibridables con la secuencia de la SEC ID Nº 1 (que comprenden al menos 10 nucleótidos contiguos y al menos el 70% de complementariedad con una secuencia
diana).

Con respecto a la secuencias de ácido nucleico que hibridan con secuencias de ácido nucleico específicas descritas en este documento, la hibridación puede realizarse en condiciones de rigurosidad reducida, rigurosidad media o incluso en condiciones rigurosas. Como ejemplo de hibridación de oligonucleótidos, una membrana polimérica que contiene ácido nucleico desnaturalizado inmovilizado se prehibrida en primer lugar durante 30 minutos a 45ºC en una solución constituida por NaCl 0,9 M, NaH_{2}PO_{4} 50 mM a pH 7,0, Na_{2}EDTA 5,0 mM, SDS al 0,5%, 10x solución de Denhardt y 0,5 mg/ml de ácido polirriboadenílico. Después se añaden a la solución aproximadamente 2 x 10^{7} cpm (actividad específica 4-9 x 10^{8} cpm/ug) de sonda de oligonucleótidos marcada en el extremo con ^{32}P. Después de 12-16 horas de incubación, la membrana se lava durante 30 minutos a temperatura ambiente en 1x SET (NaCl 150 mM, Tris clorhidrato 20 mM a pH 7,8, Na_{2}EDTA 1 mM) que contiene SDS al 0,5%, seguido de un lavado de 30 minutos en SET 1x recién preparado a Tm-10ºC para la sonda de oligonucleótidos. La membrana se expone después a una película auto-radiográfica para la detección de las señales de hibridación.

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Condiciones rigurosas significa que la hibridación se producirá solamente si existe al menos el 90% de identidad, preferiblemente al menos el 95% de identidad y más preferiblemente al menos 97% de identidad entre las secuencias. Véase J. Sambrook et al., Molecular Cloning, A. Laboratory Manual (2ª ed. 1989) (Cold Spring Harbor Laboratory).

"Identidad" como se usa el término en este documento, se refiere a una secuencia de polinucleótidos que comprende un porcentaje de las mismas bases que un polinucleótido de referencia (SEC ID Nº 1). Por ejemplo, un polinucleótido que es al menos el 90% idéntico a un polinucleótido de referencia, tiene bases del polinucleótido que son idénticas al 90% de las bases que forman el polinucleótido de referencia y tendrá bases diferentes en el 10% de las bases que comprende esa secuencia de polinucleótidos.

La presente invención también se refiere a polinucleótidos que difieren del polinucleótido de referencia de modo que estos cambios sean cambios silenciosos, por ejemplo los cambios no alteran la secuencia de aminoácidos codificada por el polinucleótido. La presente invención también se refiere a cambios de nucleótidos que dan como resultado sustituciones, adiciones, deleciones, fusiones y truncamientos de aminoácidos en la enzima codificada por el polinucleótido de referencia (SEC ID Nº 1). En un aspecto preferido de la invención estas enzimas conservan la misma acción biológica que la enzima codificada por el polinucleótido de referencia.

También se observa que dichas sondas pueden y preferiblemente se marcan con un reactivo analíticamente detectable para facilitar la identificación de la sonda. Los reactivos útiles incluyen aunque sin limitación, radioactividad, tintes fluorescentes o enzimas capaces de catalizar la formación de un producto detectable. Las sondas son por lo tanto útiles para aislar copias complementarias del ADN de otras fuentes animales o para seleccionar dichas fuentes para encontrar secuencias relacionadas.

La presente invención proporciona una enzima fitasa sustancialmente pura. La expresión "sustancialmente pura" se usa en este documento para describir una molécula, tal como un polipéptido (por ejemplo, un polipéptido de fitasa o un fragmento del mismo) que está sustancialmente libre de otras proteínas, lípidos, hidratos de carbono, ácidos nucleicos y otros materiales biológicos con los que se asocia de forma natural. Por ejemplo, una molécula sustancialmente pura, tal como un polipéptido, puede ser en al menos el 60% en peso seco, la molécula de interés. La pureza de los polipéptidos puede determinarse usando métodos convencionales incluyendo, electroforesis en gel de poliacrilamida (por ejemplo SDS-PAGE) cromatografía en columna (por ejemplo, cromatografía de líquidos de alta resolución (HPLC)) y el análisis amino terminal de la secuencia de aminoácidos.

El polipéptido de fitasa incluido en la invención puede tener las secuencias de aminoácidos de fitasa que se muestran en la Figura 1 (SEC ID Nº 2). Los polipéptidos de fitasa, tales como los aislados a partir de E. coli B, pueden caracterizarse por catalizar la hidrólisis de fitato a inositol y fosfato libre con la liberación de los minerales del complejo del ácido fítico.

También se incluyen en la invención polipéptidos que tienen secuencias que son "sustancialmente idénticas" a la secuencia de un polipéptido de fitasa tal como uno de la SEC ID Nº 2. Una secuencia de aminoácidos "sustancialmente idéntica" es una secuencia que difiere de una secuencia de referencia solamente en sustituciones conservativas de aminoácidos, por ejemplo, sustituciones de un aminoácido por otro del mismo tipo (por ejemplo, sustitución de un aminoácido hidrófobo, tal como isoleucina, valina, leucina o metionina por otro o sustitución de un aminoácido polar por otro, tal como sustitución de lisina por arginina, ácido aspártico por ácido glutámico o asparagina por glutamina).

Los fragmentos del polipéptido de fitasa de la presente invención pueden conservar al menos una actividad específica de fitasa o un epítopo. La actividad fitasa puede evaluarse examinando la catálisis de fitato a inositol y a fosfato libre. Por ejemplo, puede usarse un fragmento de polipéptido de fitasa que contiene por ejemplo al menos 8-10 aminoácidos como inmunógeno en la producción de anticuerpos específicos de fitasa. El fragmento puede contener por ejemplo una secuencia de aminoácidos que se conserva en las fitasas y esta secuencia de aminoácidos puede contener aminoácidos que se conservan en las fitasas. Dichos fragmentos pueden identificarse fácilmente comparando las secuencias de fitasas que se encuentran en la Figura 1. Además de su uso como inmunógenos peptídicos, los fragmentos de fitasa descritos anteriormente pueden usarse en inmunoensayos tales como ELISA, para detectar la presencia de anticuerpos específicos de fitasa en las muestras.

Otros polipéptidos de fitasa que se incluyen en la invención son polipéptidos que tienen secuencias de aminoácidos que son al menos el 50% idéntica a la secuencia de aminoácidos de un polipéptido de fitasa, tal como la SEC ID Nº 2. La longitud de comparación para determinar la homología de la secuencia de aminoácidos puede ser por ejemplo de al menos 15 aminoácidos, por ejemplo al menos 20, 25 ó 35 aminoácidos. La homología puede medirse usando software de análisis de secuencia convencional (por ejemplo, el paquete Sequence Análisis Software Package del grupo Genetics Computer Group, University of Wisconsin Biotechnology Center, 1710 University Avenue, Madison, WI 53705; también véase Ausubel, et al., supra). Dichos procedimientos y algoritmos incluyen por ejemplo un programa BLAST (Basic Local Alignment Search Tool at the National Center for Biological Information), ALIGN, AMAS (Analysis of Multiply Aligned Sequences), AMPS (Protein Multiple Sequence Alignment), ASSET (Aligned Segment Statistical Evaluation, Tool), BANDS, BESTSCOR, BIOSCAN (Biological Sequence Comparative Analysis Node). BLIMPS (BLocks IMProved Searcher). FASTA. Intervals & Points, BMB, CLUSTAL V. CLUSTAL W, CONSENSUS, LCONSENSUS. WCONSENSUS, algoritmo de Smith-Waterman. DARWIN, algoritmo de Las Vegas, FNAT (Forced Nucleotide Alignment Tool), Framealign, Framesearch, DYNAMIC. FILTER, FSAP (Fristensky Sequence Analysis Package), GAP (Global Alignment Program). GENAL, GIBBS, GenQuest, ISSC (Sensitive Sequence Comparison). LALIGN (Local Sequence Alignment). LCP (Local Content Program.). MACAW (Multiple Alignment Construction & Analysis Workbench), MAP (Multiple Alignment Program), MBLKP, MBLKN, PIMA (Pattern-Induced Multi-sequence Alignment), SAGA (Sequence Alignment by Genetic ALgorithm) y WHAT-IF.

El polipéptido de fitasa de la invención puede obtenerse usando cualquiera de varios métodos convencionales. Por ejemplo, los polipéptidos de fitasa pueden producirse en sistemas de expresión recombinante convencional (véase a continuación), pueden sintetizarse químicamente (este enfoque puede limitarse a pequeños fragmentos peptídicos de fitasa) o purificarse a partir de organismos en los que se expresan de forma natural.

La invención también proporciona moléculas de ácido nucleico aisladas que codifican el polipéptido de fitasa descrito anteriormente. Por ejemplo, los ácidos nucleicos que codifican la SEC ID Nº 2 se incluyen en la invención. Estos ácidos nucleicos pueden contener secuencias de nucleótidos de origen natural o secuencias que difieren de las de los ácidos nucleicos de origen natural que codifican las fitasas, pero que codifican los mismos aminoácidos, debido a la degeneración del código genético. Los ácidos nucleicos de la invención pueden contener nucleótidos de ADN o de ARN o combinaciones o modificaciones de los mismos. Los ácidos nucleicos ejemplares de la invención se muestran en la SEC ID Nº 1.

Por "ácido nucleico aislado" se entiende un ácido nucleico por ejemplo, una molécula de ADN o de ARN que no es inmediatamente contigua a las secuencias flanqueantes 5' y 3' con las que normalmente es inmediatamente contigua cuando está presente en el genoma de origen natural del organismo del que se obtiene. Por lo tanto la expresión describe por ejemplo un ácido nucleico que se incorpora en un vector, tal como un plásmido o vector viral, un ácido nucleico que se incorpora en el genoma de una célula heteróloga (o el genoma de una célula homóloga, pero en un sitio diferente a en el que estaría en forma natural); y un ácido nucleico que existe como molécula independiente, por ejemplo un fragmento de ADN producido mediante amplificación por PCR o digestión con enzimas de restricción o una molécula de ARN producida mediante transcripción in vitro, la expresión también describe un ácido nucleico recombinante que forma parte de un gen híbrido que codifica secuencias de polipéptidos adicionales que pueden usarse por ejemplo en la producción de una proteína de fusión.

Las moléculas de ácido nucleico de la invención pueden usarse como plantillas en métodos convencionales para la producción de productos génicos de fitasa (por ejemplo ARN de fitasa y polipéptidos de fitasa). Además, las moléculas de ácido nucleico que codifican polipéptidos de fitasa (y fragmentos de los mismos) y ácidos nucleicos relacionados tales como (I) ácidos nucleicos que contienen secuencias que son complementarias a o que hibridan con ácidos nucleicos que codifican polipéptidos de fitasa o fragmentos de los mismos (por ejemplo, fragmentos que contienen al menos 10, 12, 15, 20 ó 25 nucleótidos); y (2) ácidos nucleicos que contienen secuencias que hibridan con secuencias que son complementarias a ácidos nucleicos que codifican polipéptidos de fitasa o fragmentos de los mismos (por ejemplo, fragmentos que contienen al menos 10, 12, 15, 20 ó 25 nucleótidos); pueden usarse en métodos enfocados a sus propiedades de hibridación. Por ejemplo, como se describe con más detalle a continuación, dichas moléculas de ácido nucleico pueden usarse en los siguientes métodos: métodos de PCR para sintetizar ácidos nucleicos de fitasa, métodos para detectar la presencia de un ácido nucleico de fitasa en una muestra, métodos de exploración para identificar ácidos nucleicos que codifican nuevos miembros de la familia de la fitasa. Las sondas de oligonucleótidos útiles para los métodos de selección son por ejemplo de entre 10 y aproximadamente 150 nucleótidos de longitud. Además, dichas sondas son preferiblemente de entre 10 y aproximadamente 100 nucleótidos de longitud y más preferiblemente entre 10 y aproximadamente 50 nucleótidos de longitud.

La invención también incluye métodos para identificar moléculas de ácido nucleico que codifican miembros de la familia de polipéptidos de fitasa además de la SEC ID Nº 2. En estos métodos, una muestra por ejemplo una biblioteca de ácido nucleico, tal como una biblioteca de ADNc, que contiene un ácido nucleico que codifica un polipéptido de fitasa se explora con una sonda específica de fitasa, por ejemplo una sonda de ácido nucleico específica de fitasa. Las sondas de ácido nucleico específicas de fitasa son moléculas de ácido nucleico (por ejemplo, moléculas que contienen nucleótidos de ADN o de ARN, o combinaciones o modificaciones de los mismos) que hibridan específicamente con ácidos nucleicos que codifican polipéptidos de fitasa o con secuencias complementarias de los mismos. La expresión "sonda específica de fitasa", en el contexto de este método de la invención, se refiere a sondas que se unen a ácidos nucleicos que codifican polipéptidos de fitasa o a secuencias complementarias de los mismos, en un grado más detectable que a los ácidos nucleicos que codifican otras enzimas o a las secuencias complementarias de los mismos.

La invención facilita la producción de sondas de ácido nucleico específicas de fitasa. Los métodos para obtener dichas sondas pueden diseñarse en base a las secuencias de aminoácidos que se muestran en la Figura 1. Las sondas, que pueden contener al menos 10, por ejemplo, al menos 15, 25, 35, 50, 100 ó 150 nucleótidos pueden producirse usando cualquiera de varios métodos convencionales (por ejemplo, Ausubel et al., supra). Por ejemplo, y preferiblemente, las sondas se generan usando métodos de amplificación por PCR. En estos métodos, se diseñan cebadores que corresponden a las secuencias conservadas de fitasa (véase, Figura 1), que pueden incluir aminoácidos específicos de fitasa y el producto de PCR resultante se usa como sonda para explorar una biblioteca de ácido nucleico, tal como una biblioteca de ADNc.

Las secuencias codificantes de las enzimas de fitasa de la presente invención se identificaron preparando ADN genómico de E. coli B, por ejemplo y recuperando (mediante por ejemplo, amplificación por PCR) a partir del ADN genómico, ADN que codifica la actividad fitasa. Dichos métodos para la recuperación se conocen bien en la técnica. Un medio, por ejemplo, comprende diseñar cebadores de amplificación para recuperar la secuencia codificante, amplificar el gen a partir del ADN genómico, subclonar el ADN en un vector, transformar una cepa hospedadora con la construcción resultante y expresar la enzima fitasa para su evaluación. Dichos procedimientos se conocen bien en la técnica y se proporcionan métodos por ejemplo en el documento Maniatis, T., et al., Molecular Cloning, Cold Spring Harbor Press, Nueva York, 1982.

En una realización preferida, la enzima de la presente invención, se aisló a partir de un ADN genómico de E. coli B mediante la siguiente técnica:

El ADN genómico de E. coli B se obtuvo de Sigma (Nº de catálogo D-2001). St. Louis New Jersey.

Se usaron los siguientes cebadores para amplificar el gen directamente a partir del ADN genómico:

Cebador 5'

gtttctgaattcaaggaggaatttaaATGAAAGCGATCTTAATCCCATT

Cebador 3'

gtttctggatccTTACAAACTGCACGCCGGTAT

Se usó Pfu polimerasa de acuerdo con las instrucciones del fabricante (Stratagene Cloning Systems, Inc., La Jolla, CA). El producto de PCR y el vector pQE60 (Qiagen) se digirieron con endonucleasas de restricción EcoRI y BgIII (New England, Biolabs) de acuerdo con las instrucciones del fabricante. El ligamiento y la transformación en y la expresión en células hospedadoras M15 pREP4 (Qiagen) produce una proteína marcada con 6x-His en el extremo C.

Los fragmentos del gen de longitud completa de la presente invención pueden usarse como sonda de hibridación para un ADNc o una biblioteca genómica para aislar el ADN de longitud completa y para aislar otros ADN que tenga una alta similitud de secuencia con el gen o una actividad biológica similar: Las sondas de este tipo tienen al menos 10, preferiblemente al menos 15 y aún más preferiblemente al menos 30 bases y pueden contener por ejemplo al menos 50 o más bases. La sonda también puede usarse para identificar un clon de ADN correspondiente a un transcrito de longitud completa y un clon o clones genómicos que contienen el gen completo incluyendo las regiones reguladoras y promotoras, exones, e intrones.

Las secuencias de ácido nucleico aisladas y otras enzimas pueden medirse después para la conservación de las características de actividad biológica de la enzima de la presente invención, por ejemplo, en un ensayo para detectar la actividad fitasa enzimática. Dichas enzimas incluyen formas truncadas de fitasa y variantes tales como variantes de deleción e inserción.

Los ejemplos de dichos ensayos incluyen el siguiente ensayo para la detección de la actividad fitasa: la actividad fitasa puede mediarse incubando 150 \mul de la preparación de la enzima con 600 \mul de fitato sódico 2 mM en tampón Tris HCl 100 mM a pH 7,5, suplementado con CaCl_{2} 1 mM durante 30 minutos a 37ºC. Después de la incubación la reacción se detiene añadiendo 750 \mul de ácido tricloroacético al 5%. El fosfato liberado se midió frente al fosfato convencional mediante espectrofotometría a 700 nm después de añadir 1500 \mul del reactivo de color (4 volúmenes de molibdato de amonio al 1,5% en ácido sulfúrico al 5,5% y un volumen de sulfato ferroso al 2,7%; Shimizu M., 1992; Biosci. Biotech. Biochem. 56: 1266-1269). Una unidad de actividad enzimática se define como la cantidad de enzima necesaria para liberar un (mol de Pi por minuto en condiciones de ensayos. La actividad específica puede expresarse en unidades de actividad enzimática por miligramo de proteína.

La enzima de la presente invención tiene actividad enzimática con respecto a la hidrólisis de fitato a inositol y fosfato libre.

El polinucleótido de la presente invención puede estar en forma de ADN, ADN que incluye ADNc, ADN genómico y ADN sintético. El ADN puede ser de doble cadena o de cadena sencilla y si es de cadena sencilla puede ser la cadena codificante o la cadena no codificante (anti-sentido). La secuencia codificante que codifica la enzima madura puede ser idéntica a las secuencias codificantes que se muestran en la Figura 1 y/o a la del clon depositado (SEC ID Nº 1) o puede ser una secuencia codificante diferente, secuencia codificante que, como resultado de la redundancia o degeneración del código genético, codifica la misma enzima madura que el ADN de la Figura 1 (por ejemplo, la SEC ID Nº 1).

El polinucleótido que codifica la enzima madura de la Figura 1 (por ejemplo, SEC ID Nº 2) puede incluir, aunque sin limitación: solamente la secuencia codificante de la proteína madura; la secuencia codificante de la proteína madura y una secuencia codificante adicional tal como una secuencia líder o una secuencia proproteica; la secuencia codificante de la enzima madura (y opcionalmente una secuencia codificante adicional) y una secuencia no codificante, tal como intrones o una secuencia no codificante 5' y/o 3' con respecto a la secuencia codificante de la enzima madura.

Por lo tanto, la expresión "polinucleótido que codifica una enzima (proteína)" abarca un polinucleótido que incluye solamente la secuencia codificante de la enzima así como un polinucleótido que incluye secuencias codificantes y/o no codificantes adicionales.

La presente invención también se refiere a variantes de los polinucleótidos descritos anteriormente en este documento que codifican análogos y derivados de la enzima que tienen la secuencia de aminoácidos deducida de la Figura 1 (por ejemplo, la SEC ID Nº 2). La variante del polinucleótido puede ser una variante alélica de origen natural del polinucleótido o una variante de origen no natural del polinucleótido.

Por lo tanto, la presente invención incluye polinucleótidos que codifican la misma enzima madura que se muestra en la Figura 1 así como variantes de dichos polinucleótidos, variantes que codifican un derivado o análogo de la enzima de la Figura 1. Dichas variantes de nucleótidos incluyen variantes de deleción, variantes de sustitución y variantes de adición o de inserción.

Como se ha indicado anteriormente en este documento, el polinucleótido puede tener una secuencia codificante que sea una variante alélica de origen natural de la secuencia codificante que se muestra en la Figura 1. Como se conoce en la técnica, una variante alélica es una forma alternativa de una secuencia de polinucleótidos que puede tener una sustitución, deleción o adición de uno o más nucleótidos, que no altera sustancialmente la función de la enzima codificada.

La presente invención también incluye polinucleótidos, en los que la secuencia codificante de la enzima madura puede fusionarse en el mismo marco de lectura a una secuencia de polinucleótidos que ayuda a la expresión y la secreción de la enzima a partir de una célula hospedadora, por ejemplo una secuencia líder que funciona controlando el transporte de una enzima a partir de la célula. La enzima que tiene una secuencia líder es una preproteína y puede tener la secuencia líder escindida por la célula hospedadora para formar la forma madura de la enzima. Los polinucleótidos también pueden codificar una proproteína que es la proteína madura más restos de aminoácidos 5' adicionales. Una proteína madura que tiene una prosecuencia es una proproteína y es una forma inactiva de la proteína. Una vez que la prosecuencia se escinde, queda una proteína madura activa.

Por lo tanto, por ejemplo, el polinucleótido de la presente invención puede codificar una enzima madura o una enzima que tiene una prosecuencia o una enzima que tiene una prosecuencia y una presecuencia (secuencia líder).

La presente invención también se refiere a una enzima que tiene la secuencia de aminoácidos deducida de la Figura 1, así como análogos y derivados de dicha enzima.

Los términos "derivado" y "análogo" cuando se refieren a la enzima de la Figura 1 significan una enzima que conserva esencialmente la misma función o actividad biológica que dicha enzima. Por lo tanto, un análogo incluye una proproteína que puede activarse mediante escisión de la porción de la proproteína para producir una enzima madura activa.

La enzima de la presente invención puede ser una enzima recombinante, una enzima natural o una enzima sintética, preferiblemente una enzima recombinante.

El derivado o análogo de la enzima de la Figura 1 puede ser (i) uno en el que uno o más de los restos de aminoácidos se sustituyen con un resto de aminoácido que no está codificado por el código genético o (ii) uno en el que uno o más de los restos de aminoácidos incluyen un grupo sustituyente o (iii) uno en el que la enzima madura se fusiona con otro compuesto, tal como un compuesto que aumenta vida media de la enzima (por ejemplo, polietilenglicol) o (iv) uno en el que los aminoácidos adicionales se fusionan a la enzima madura, tal como una secuencia líder o secretora o una secuencia que se emplea para la purificación de la enzima madura o una secuencia de proproteína. Se considera que dichos derivados y análogos están dentro del alcance de los especialistas en la técnica a partir de las enseñanzas de este documento.

Las enzimas y polinucleótidos de la presente invención se proporcionan preferiblemente en forma aislada y preferiblemente se purifican hasta homogeneidad.

El término "aislado" significa que el material se extrae de su entorno original (por ejemplo, el entorno natural si es de origen natural). Por ejemplo, un polinucleótido o enzima de origen natural presente en un animal vivo no está aislado, pero el mismo polinucleótido o enzima, separado de todo o parte de sus materiales co-existentes en este sistema natural, está aislado. Dichos polinucleótidos pueden ser parte de un vector y/o dichos polinucleótidos o enzimas podrían ser parte de una composición, y seguir estando aislados siempre que dicho vector o composición no sea parte de su entorno natural.

Las enzimas de la presente invención incluyen una enzima de la Figura 1 (en particular la enzima madura) así como enzimas que tienen al menos el 70% de similitud (preferiblemente al menos el 70% de identidad) con una enzima de la Figura 1 y más preferiblemente al menos el 90% de similitud (más preferiblemente al menos el 90% de identidad) con una enzima de la Figura 1 y aún más preferiblemente al menos el 95% de similitud (aún más preferiblemente al menos el 95% de identidad) con una enzima de la Figura 1 y también incluyen porciones de dichas enzimas con dicha porción de la enzima conteniendo generalmente al menos 30 aminoácidos y más preferiblemente al menos 50 aminoácidos.

Como se conoce en la técnica, la "similitud" entre dos enzimas se determina comparando la secuencia de aminoácidos y sus sustitutos de aminoácidos conservados de una enzima con la secuencia de una segunda enzima. La similitud en secuencias de ácido nucleico y de aminoácidos puede determinarse mediante procedimientos y algoritmos que se conocen bien en la técnica. Dichos procedimientos y algoritmos incluyen por ejemplo un programa BLAST (Basic Local Alignment Search Tool at the National Center for Biological Information), ALIGN, AMAS (Analysis of Multiply Aligned Sequences), AMPS (Protein Multiple Sequence Alignment), ASSET (Aligned Segment Statistical Evaluation, Tool), BANDS, BESTSCOR, BIOSCAN (Biological Sequence Comparative Analysis Node). BLIMPS (BLocks IMProved Searcher). FASTA. Intervals & Points, BMB, CLUSTAL V. CLUSTAL W, CONSENSUS, LCONSENSUS. WCONSENSUS, algoritmo de Smith-Waterman. DARWIN, algoritmo de Las Vegas, FNAT (Forced Nucleotide Alignment Tool), Framealign, Framesearch, DYNAMIC. FILTER, FSAP (Fristensky Sequence Analysis Package), GAP (Global Alignment Program). GENAL, GIBBS, GenQuest, ISSC (Sensitive Sequence Comparison). LALIGN (Local Sequence Alignment). LCP (Local Content Program.). MACAW (Multiple Alignment Construction & Analysis Workbench), MAP (Multiple Alignment Program), MBLKP, MBLKN, PIMA (Pattern-Induced Multi-sequence Alignment), SAGA (Sequence Alignment by Genetic ALgorithm) y WHAT-IF.

Una variante, es decir una enzima "análoga" o "derivada" y una enzima de referencia pueden diferir en la secuencia de aminoácidos en una o más sustituciones, adiciones, deleciones, fusiones y truncamientos, que pueden estar presentes en cualquier combinación.

Entre las variantes preferidas están aquellas que varían de una referencia en sustituciones de aminoácidos conservativas. Dichas sustituciones son aquellas que sustituyen un aminoácido dado en un polipéptido por otro aminoácido de similares características. Las sustituciones que se consideran típicamente conservativas son los reemplazos, uno por otro, entre aminoácidos alifáticos Ala, Val, Leu e Ile; el intercambio de los restos hidroxilo Ser y Thr, el cambio de los restos ácidos Asp y Glu, la sustitución entre los restos amida Asn y Gln, el intercambio de los restos básicos Lys y Arg y reemplazos entre los restos aromáticos Phe, Tyr.

Las variantes más preferidas son las que conservan la misma función y actividad biológicas que el polipéptido de referencia a partir del que varían.

Los fragmentos o porciones de las enzimas de la presente invención pueden emplearse para producir la enzima de longitud completa correspondiente mediante síntesis peptídica; por lo tanto, los fragmentos pueden emplearse como intermedios para producir las enzimas de longitud completa. Los fragmentos o porciones de los polinucleótidos de la presente invención pueden usarse para sintetizar polinucleótidos de longitud completa de la presente invención.

La presente invención también se refiere a vectores que incluyen polinucleótidos de la presente invención, células hospedadoras que se manipulan genéticamente con vectores de la invención y la producción de enzimas de la invención mediante técnicas recombinantes.

Las células hospedadoras se manipulan genéticamente (se transducen o se transforman o se transfectan) con los vectores que contienen los polinucleótidos de esta invención. Dichos vectores pueden ser por ejemplo, un vector de clonación o un vector de expresión. El vector puede estar por ejemplo en forma de plásmido, de partícula viral, de fago, etc. Las células hospedadoras manipuladas pueden cultivarse en medios nutrientes convencionales modificados según sea apropiado para activar promotores, seleccionar transformantes o amplificar los genes de la presente invención. Las condiciones de cultivo, tales como temperatura, pH y similares son las que se han usado previamente con la célula hospedadora seleccionada para la expresión y serán evidentes para el especialista en la técnica.

Los polinucleótidos de la presente invención pueden emplearse para producir enzimas mediante técnicas recombinantes. De este modo, por ejemplo, el polinucleótido puede incluirse en cualquiera de diversos vectores de expresión para expresar una enzima. Dichos vectores incluyen secuencias cromosómicas, no cromosómicas y de ADN sintético por ejemplo, derivados de SV40; plásmidos bacterianos, ADN de fagos, baculovirus; plásmidos de levadura; vectores obtenidos de combinaciones de plásmidos y de ADN del fago, ADN viral tales como de virus vaccinia, adenovirus, virus de la viruela aviar y virus de la pseudorrabia. Sin embargo, puede usarse cualquier otro vector siempre que sea replicable y viable en el hospedador.

La secuencia de ADN apropiada puede insertarse en el vector mediante diversos procedimientos. En general, la secuencia de ADN se inserta en un(os) sitio(s) de endonucleasa de restricción apropiado mediante procedimientos conocidos en la técnica. Dichos procedimientos son diferentes y se supone que están dentro del alcance de los especialistas en la técnica.

La secuencia de ADN en el vector de expresión se une de forma operativa a una(s) secuencia(s) de control de la expresión apropiada(s) (promotor) para dirigir la síntesis del ARNm. Como ejemplos representativos de dichos promotores, pueden mencionarse: el promotor LTR o SV40, el promotor lac o trp de E. coli, el promotor P_{L} del fago lambda y otros promotores que se sabe controlan la expresión de genes en células procariotas o eucariotas o en sus virus. El vector de expresión también contiene un sitio de unión al ribosoma para el inicio de la traducción y un terminador de la transcripción. El vector también incluir secuencias apropiadas para amplificar la expresión.

Además, los vectores de expresión contienen preferiblemente uno o más genes marcadores seleccionables para proporcionar un rasgo fenotípico para la selección de células hospedadoras transformadas tales como resistencia a dihidrofolato reductasa o a neomicina para un cultivo de células eucariotas o tales como resistencia a tetraciclina o ampicilina en E. coli.

El vector que contiene la secuencia de ADN apropiada como se ha descrito anteriormente en este documento, así como un promotor o secuencia de control apropiada, puede emplearse para transformar un hospedador apropiado para permitir que el hospedador exprese la proteína.

Como ejemplos representativos de hospedadores apropiados, pueden mencionarse: células bacterianas, tales como E. coli, Streptomyces, Bacillus subtilis; células de hongos, tales como levaduras; células de insecto tales como S2 de Drosophila y Sf9 de Spodoptera; células animales tales como CHO, COS o melanoma de Bowes; adenovirus, células vegetales, etc. Se supone que la selección de un hospedador apropiado está dentro del alcance de los especialistas en la técnica a partir de las enseñanzas de este documento.

Más particularmente, la presente invención también incluye construcciones recombinantes que comprenden una o más de las secuencias que se han descrito ampliamente anteriormente. Las construcciones comprenden un vector, tal como un plásmido o un vector viral, en el que puede insertarse una secuencia de la invención, en una orientación directa o inversa. En un aspecto preferido de esta realización, la construcción comprende además secuencias reguladoras incluyendo por ejemplo un promotor, unido de forma operativa a la secuencia. Se conocen gran cantidad de vectores y promotores adecuados por los especialistas en la técnica, y están disponibles en el mercado. Los siguientes vectores se proporcionan como ejemplo; Bacterianos: pQE70, pQE60, pQE-9 (Qiagen), pBluescript II (Stratagene); pTRC99a, pKK223-3, pDR540, pRIT2T (Pharmacia); Eucariotas: pXT 1, pSG5 (Stratagene) pSVK3, pBPV, pMSG, pSVLSV40 (Pharmacia). Sin embargo, puede usarse cualquier otro plásmido o vector siempre que sean replicables y viables en el hospedador.

Las regiones promotoras pueden seleccionarse a partir de cualquier gen deseado usando vectores CAT (cloranfenicol transferasa) u otros vectores con marcadores seleccionables. Dos vectores apropiados son pKK232-8 y pCM7. Los promotores bacterianos particulares incluyen lacl, lacZ, T3, T7, gpt, lambda P_{R}, P_{I} y trp. Los promotores eucariotas incluyen el promotor inmediato temprano de CMV, timidina quinasa de HSV, el temprano y tardío de SV40, LTR de retrovirus, y metalotioneína-I de ratón. La selección del vector y promotor apropiado está dentro del alcance de un especialista en la técnica.

En una realización adicional, la presente invención se refiere a células hospedadoras que contienen las construcciones descritas anteriormente. La célula hospedadora puede ser una célula eucariota superior, tal como una célula de mamífero o una célula eucariota inferior, tal como una célula de levadura, o la célula hospedadora puede ser una célula procariota, tal como una célula bacteriana. La introducción de la construcción en la célula hospedadora puede realizarse mediante transfección con fosfato de calcio, transfección mediada por DEAE-Dextrano o el electroporación (Davis, L., Dibher. M., Battey, I., Basic Methods in Molecular Biology, (1986)).

Las construcciones en las células hospedadoras pueden usarse de manera convencional para producir el producto génico codificado por la secuencia recombinante. Como alternativa, las enzimas de la invención pueden producirse de forma sintética mediante sintetizadores peptídicos convencionales.

Las proteínas maduras pueden expresarse en células de mamífero, levaduras, bacterias u otras células bajo el control de productores apropiados. Los sistemas de traducción sin células también pueden emplearse para producir dichas proteínas usando ARN obtenidos a partir de las construcciones de ADN de la presente invención. Los vectores de clonación y de expresión apropiados para su uso con hospedadores eucariotas y procariotas se describen por Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Segunda Edición, Cold Spring Harbor, N.Y., (1989).

La transcripción del ADN que codifica las enzimas de la presente invención por eucariotas superiores aumenta insertando una secuencia potenciadora en el vector. Los potenciadores son elementos que actúan en cis del ADN, normalmente de aproximadamente 10 a aproximadamente 300 pb que actúan en un promotor para aumentar su transcripción. Los ejemplos incluyen el promotor de SV40 en el extremo tardío del origen de replicación pb 100 a 270, un potenciador del promotor temprano de citomegalovirus, el potenciador de polioma en el extremo tardío del origen de replicación y los potenciadores de adenovirus.

Generalmente, los vectores de expresión recombinantes incluirán orígenes de replicación y marcadores seleccionables que permiten la transformación de la célula hospedadora, por ejemplo, el gen de resistencia a ampicilina de E. coli y el gen TRP1 de S. cerevisiae y un promotor obtenido a partir de un gen altamente expresado para dirigir la transcripción de una secuencia estructural cadena abajo. Dichos promotores pueden obtenerse a partir de operones que codifican enzimas glicolíticas tales como 3-fosfoglicerato quinasa (PGK), factor \ring{A}, fosfatasa ácida o proteínas de choque térmico, entre otras. La secuencia estructural heteróloga se ensambla en una fase apropiada con las secuencias de inicio y de terminación de la traducción y preferiblemente, una secuencia líder capaz de dirigir la secreción de la enzima traducida. Opcionalmente, la secuencia heteróloga puede codificar una enzima de fusión que incluye un péptido de identificación N-terminal que otorga características deseadas por ejemplo, estabilización o purificación simplificada el producto recombinante expresado.

Los vectores de expresión útiles para uso bacteriano se construyen insertando una secuencia de ADN estructural que codifica una proteína deseada junto con señales de inicio y de terminación de la traducción en una fase de lectura que funciona con un promotor funcional. El vector comprenderá uno o más marcadores fenotípicos seleccionables y un origen de replicación para asegurar el mantenimiento del vector y para, si fuera deseable, posibilitar la amplificación dentro del hospedador. Los hospedadores procariotas adecuados para la transformación incluyen E. coli, Bacillus subtilis, Salmonella typhimurium y diversas especies dentro de los géneros Pseudomonas, Streptomyces y Staphylococcus, aunque también pueden emplearse otros como elección.

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Como ejemplo representativo aunque no limitante, los vectores de expresión útiles para su uso bacteriano pueden comprender un marcador seleccionable y un origen de replicación bacteriano obtenido a partir de plásmidos disponibles en el mercado que comprenden elementos genéticos del vector de clonación bien conocido pBR322 (ATCC 37017). Dichos vectores comerciales incluyen por ejemplo pKK223-3 (Pharmacia Fine Chemicals, Uppsala, Suecia) y GEM1 (Promega Bistec, Madison, WI, USA). Estas secciones de la "estructura" pBR322 se combinan con un promotor apropiado y la secuencia estructural a expresar.

Después de la transformación de una cepa hospedadora adecuada y el cultivo de la cepa hospedadora hasta una densidad celular apropiada, se induce al promotor seleccionado mediante medios apropiados (por ejemplo, cambio de temperatura o inducción química) y las células se cultivan durante un periodo adicional.

Las células se recogen típicamente mediante centrifugado, se rompen mediante medios físicos o químicos y el extracto en bruto resultante se conserva para la purificación adicional.

Las células microbianas empleadas en la expresión de proteínas pueden romperse mediante cualquier método convencional, incluyendo un ciclo de congelación-descongelación, sonicación, rotura mecánica o mediante el uso de agentes de lisis celular, dichos métodos los conocen bien los especialistas en la técnica.

También pueden emplearse diversos sistemas de cultivo celular de mamíferos para expresar la proteína recombinante. Los ejemplos de sistemas de expresión de mamífero incluyen las líneas COS-7 de fibroblastos de riñón de mono, descritas por Gluzman, Cell, 23: 175 (1981), y otras líneas celulares capaces de expresar un vector compatible, por ejemplo, las líneas celulares C127, 3T3, CHO, HeLa y BHK. Los vectores de expresión de mamíferos comprenderán un origen de replicación, un promotor y un potenciador adecuados y también cualquier sitio de unión al ribosoma necesario, sitio de poliadenilación, sitios donador y aceptor de corte y empalme, secuencias de terminación de la transcripción y secuencias no transcritas flanqueantes 5'. Las secuencias de ADN obtenidas del corte y empalme de SV40 y los sitios de poliadenilación pueden usarse para proporcionar los elementos genéticos no transcritos necesarios.

La enzima puede recuperarse y purificarse a partir de cultivos celulares recombinantes mediante métodos que incluyen precipitación con sulfato de amonio o etanol, extracción ácida, cromatografía de intercambio aniónico o catiónico, cromatografía de fosfocelulosa, cromatografía de interacción hidrófoba, cromatografía de afinidad, cromatografía en hidroxiapatita y cromatografía en lectina. Las etapas de repliegue de la proteína pueden usarse, según sea necesario, para completar la configuración de la proteína madura. Finalmente, puede emplearse la cromatografía de líquidos de alta resolución (HPLC) para las etapas finales de purificación.

Las enzimas de la presente invención pueden ser un producto purificado de forma natural o un producto de procedimientos de síntesis química, o pueden producirse mediante técnicas recombinantes a partir de un hospedador procariota o eucariota (por ejemplo, mediante células bacterianas, de levadura, vegetales superiores, de insecto y de mamífero en cultivo). Dependiendo del hospedador empleado en un procedimiento de producción recombinante, las enzimas de la presente invención pueden estar glicosiladas o pueden no estar glicosiladas. Las enzimas de la invención también pueden incluir o no un resto de aminoácido metionina inicial.

La enzima de esta invención puede emplearse para cualquier fin en el que dicha actividad enzimática sea necesaria o deseada. En una realización preferida, la enzima se emplea para catalizar la hidrólisis de fitato. La degradación de fitato puede usarse en alimentación animal.

En una realización preferida, la enzima de la presente invención es una enzima fitasa que es estable al calor y resistente al calor y cataliza la hidrólisis enzimática del fitato, es decir, la enzima es capaz de renaturalizarse y recuperar la actividad después de un periodo breve (es decir, de 5 a 30 segundos) o un periodo más largo, por ejemplo de minutos o de horas de exposición a temperaturas de 50ºC o mejor por encima de 50ºC.

Las enzimas, sus fragmentos u otros derivados o análogos de los mismos o células que los expresan pueden usarse como inmunógeno para producir anticuerpos contra éstas. Estos anticuerpos pueden ser por ejemplo policlonales o monoclonales. La presente invención también incluye anticuerpos quiméricos, de cadena sencilla y humanizados así como fragmentos Fab o la producción de una biblioteca de expresión de Fab. Pueden usarse diversos procedimientos conocidos en la técnica para la producción de dichos anticuerpos y fragmentos.

Los anticuerpos generados contra las enzimas que corresponden a una secuencia de la presente invención pueden obtenerse mediante inyección directa de las enzimas en un animal o administrando las enzimas a un animal, preferiblemente un animal no humano. El anticuerpo obtenido de este modo se unirá a las propias enzimas, de esta manera puede usarse incluso una secuencia que codifica solamente un fragmento de la enzima para generar anticuerpos que se unen a las enzimas nativas completas. Dichos anticuerpos pueden usarse después para aislar la enzima a partir de células que expresan esta enzima.

Para la preparación de anticuerpos monoclonales, puede usarse cualquier técnica que proporciona anticuerpos producidos mediante cultivos de líneas celulares continuas. Los ejemplos incluyen la técnica del hibridoma (Kohler y Milstein, 1975, Nature, 256: 495-497), la técnica del trioma, la técnica del hibridoma de células B humanas (Kozbor et al., 1983, Immunology Today 4: 72); y la técnica de EBV-hibridoma para producir anticuerpos monoclonales humanos (Cole, et al., 1985, en Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy, Alan R. Liss. Inc., págs. 77-96).

Las técnicas descritas para la producción de anticuerpos de cadena sencilla (Patente de Estados Unidos Nº
4.946.778) pueden adaptarse para producir anticuerpos de cadena sencilla para productos de enzima inmunogénicos de esta invención. Además, pueden usarse ratones transgénicos para expresar anticuerpos humanizados contra productos enzimáticos inmunogénicos de esta invención.

Los anticuerpos generados contra la enzima de la presente invención pueden usarse para seleccionar enzimas similares a partir de otros organismos y muestras. Dichas técnicas de selección se conocen en la técnica. También pueden emplearse anticuerpos como sonda para explorar bibliotecas génicas generadas a partir de estos u de otros organismos para identificar estas actividades o actividades cruzadas.

El aislamiento y la purificación de polipéptidos producidos en los sistemas descritos anteriormente puede realizarse usando métodos convencionales, apropiados para el sistema en particular. Por ejemplo, pueden usarse cromatografía y separaciones inmunológicas que emplean anticuerpos, tales como anticuerpos monoclonales o policlonales.

El término "anticuerpo", como se usa en este documento se refiere a moléculas de inmunoglobulina intactas, así como a fragmentos de moléculas de inmunoglobulinas tales como fragmentos Fab, Fab', (Fab')_{2}, Fv y SCA, que son capaces de unirse a un epítopo de un polipéptido de endoglucanasa. Estos fragmentos de anticuerpo, que conservan parte de su actividad para unirse de forma selectiva al antígeno (por ejemplo, un antígeno de endoglucanasa) del anticuerpo a partir del que se obtienen, pueden prepararse usando métodos bien conocidos en la técnica (véase por ejemplo Harlow y Lane, supra) y se describen adicionalmente, de la siguiente manera.

(1) Un fragmento Fab está constituido por un fragmento de unión al antígeno monovalente de una molécula de anticuerpo y puede producirse mediante la digestión de una molécula de anticuerpo completa con la enzima papaína, para producir un fragmento constituido por una cadena ligera intacta y una porción de una cadena pesada.

(2) Un fragmento Fab' de una molécula de anticuerpo puede obtenerse tratando toda la molécula de anticuerpo con pepsina, seguido de reducción, para dar una molécula constituida por una cadena ligera intacta y una porción de una cadena pesada. Se obtienen dos fragmentos Fab' por molécula de anticuerpo tratada de esta manera.

(3) Un fragmento (Fab')_{2} de un anticuerpo puede obtenerse tratando toda la molécula de anticuerpo con la enzima pepsina, sin la posterior reducción. Un fragmento (Fab')_{2} es un dímero de dos fragmentos Fab', que se mantienen juntos mediante dos puentes disulfuro.

(4) Un fragmento Fv se define como un fragmento manipulado genéticamente que contiene la región variable de una cadena ligera y la región variable de una cadena pesada expresadas en forma de dos cadenas.

(5) Un anticuerpo de cadena sencilla ("SCA") es una molécula de cadena sencilla manipulada genéticamente que contiene la región variable de una cadena ligera y la región variable de una cadena pesada, unidas mediante un enlazador polipeptídico flexible adecuado.

Como se usa en esta invención, el término "epítopo" se refiere a un determinante antigénico en un antígeno, tal como un polipéptido de fitasa, al que se une el parátopo de un anticuerpo, tal como un anticuerpo específico de fitasa. Los determinantes antigénicos están constituidos normalmente por agrupaciones de moléculas químicamente activas en la superficie, tales como aminoácidos o cadenas laterales de azúcares y pueden tener características estructurales tridimensionales específicas, así como características de carga específicas.

Como se ha mencionado anteriormente, los antígenos que pueden usarse para producir anticuerpos específicos de fitasa incluyen polipéptidos de fitasa, por ejemplo cualquiera de los fragmentos de fitasa que se muestran en la Figura 1. El polipéptido o péptido usado para inmunizar un animal puede obtenerse mediante síntesis química recombinante convencional o mediante métodos de purificación. Como se conoce en la técnica, para aumentar la inmunogenicidad, un antígeno puede conjugarse con una proteína transportadora. Los vehículos usados comúnmente incluyen hemocianina de lapa californiana (KLH), tiroglobulina, albúmina de suero bovino (BSA) y toxoide del tétanos. El péptido acoplado se usa después para inmunizar al animal (por ejemplo, un ratón, una rata o un conejo). Además de dichos vehículos, pueden administrarse adyuvantes bien conocidos con el antígeno para facilitar la inducción de una respuesta inmune fuerte.

Los anticuerpos policlonales y monoclonales específicos de fitasa pueden purificarse, por ejemplo, mediante unión a y elución de una matriz que contiene un polipéptido de fitasa, por ejemplo el polipéptido de fitasa (o el fragmento del mismo) contra el que se generaron los anticuerpos. Los métodos adicionales para la purificación y concentración de anticuerpos se conocen bien en la técnica y pueden ponerse en práctica con los anticuerpos específicos de fitasa de la invención (véase por ejemplo, C. oligan, et. al., Unit 9, Current Protocols in Immunology, Wiley Interscience. 1994).

Los anticuerpos anti-idiotipo correspondientes a los antígenos específicos de fitasa también se incluyen en la invención y pueden producirse usando métodos convencionales. Estos anticuerpos se generan contra antígenos específicos de fitasa e imitan por lo tanto a epítopos específicos de fitasa.

Los miembros de un par de moléculas (por ejemplo, un par anticuerpo-antígeno o un par de ácido nucleico) se dice que "se unen específicamente" entre sí, si se unen entre sí con más afinidad que con otras moléculas no específicas. Por ejemplo, un anticuerpo generado contra un antígeno con el que se une de forma más eficaz que con una proteína no específica puede describirse como unido de forma específica al antígeno (análogamente, una sonda de ácido nucleico puede describirse como de unión específica a un ácido nucleico diana si forma un dúplex específico con la diana mediante interacciones entre los pares de bases (véase anteriormente)).

La presente invención se describe adicionalmente en referencia a los siguientes ejemplos; sin embargo, debe entenderse que la presente invención no se limita a dichos ejemplos. Todas las partes o cantidades, a menos que se especifique otra cosa, son en peso.

En un aspecto de la invención, se proporciona un método para producir una enzima fitasa, tal como la que se muestra en la Figura 1. El método incluye cultivar una célula hospedadora que contiene un polinucleótido que codifica la enzima (por ejemplo, SEC ID Nº: 1), en condiciones que permiten la expresión del ácido nucleico, y aislar la enzima codificada por el ácido nucleico. Los métodos de cultivo de la célula hospedadora se describen en los Ejemplos y los conocen los especialistas en la técnica.

En otra realización, la invención proporciona un método para catalizar la hidrólisis de fitato a inositol y a fosfato libre con liberación de minerales a partir del complejo del ácido fítico. El método incluye poner en contacto el fitato con una cantidad eficaz para la degradación de una enzima de la invención, tal como la enzima que se muestra en la SEC ID Nº: 1. La expresión cantidad "eficaz para la degradación" se refiere a la cantidad de enzima que se necesita para degradar al menos el 50% del fitato, en comparación con el fitato que no se puso en contacto con la enzima. Preferiblemente, se degrada al menos el 80% del fitato.

En otra realización, la invención proporciona un método para hidrolizar enlaces fosfo-mono-éster en fosfato, incluyendo el método administrar una cantidad eficaz de una enzima de la invención (por ejemplo, SEC ID Nº: 1) para producir inositol y fosfato libre. Una cantidad "eficaz" se refiere a la cantidad de enzima que se necesita para hidrolizar al menos el 50% de los enlaces fosfo-mono-éster en comparación con fitato que no se puso en contacto con la enzima. Preferiblemente se hidroliza al menos el 80% de los enlaces.

Para facilitar la comprensión de los siguientes ejemplos se describirán algunos métodos y/o términos que aparecen frecuentemente.

"Plásmidos" se representan mediante una p minúscula precedida y/o seguida de letras mayúsculas y/o números. Los plásmidos de partida de este documento están disponibles en el mercado, disponibles al público en una base libre o pueden construirse a partir de plásmidos disponibles de acuerdo con procedimientos publicados. Además, en la técnica se conocen plásmidos equivalentes a los descritos y serán evidentes para los especialistas en la técnica.

"Digestión" de ADN se refiere a la escisión catalítica del ADN con una enzima de restricción que actúa solamente en algunas secuencias del ADN. Las diversas enzimas de restricción que se usan en este documento están disponibles en el mercado y sus condiciones de reacción, cofactores y otros requisitos se usaron como conocen los especialistas en la técnica. Para fines analíticos, típicamente se usa 1 \mug del plásmido o del fragmento de ADN con aproximadamente 2 unidades de enzima en aproximadamente 20 \mul de solución tampón. Para los fines de aislamiento de fragmentos de ADN para la construcción de plásmidos, típicamente se digieren de 5 a 50 \mug de ADN con de 20 a 250 unidades de enzima en un volumen mayor. Los tampones apropiados y las cantidades del sustrato para enzimas de restricción particulares las especifica el fabricante. Normalmente se usan periodos de incubación de 1 hora a 37ºC, pero estos pueden variar de acuerdo con las instrucciones del proveedor. Después de la digestión la reacción se somete a electroforesis en un gel de poliacrilamida para aislar el fragmento deseado.

La separación por tamaños de los fragmentos escindidos se realiza generalmente usando un gel de poliacrilamida al 8 por ciento descrito por Goeddel, D. et al., Nucleic Acids Res., 8: 4057 (1980), por ejemplo.

"Oligonucleótidos" se refiere a un polidesoxinucleótido de cadena sencilla o dos cadenas de polidesoxinucleótido complementarias que pueden sintetizarse químicamente. Dichos oligonucleótidos sintéticos pueden o no tener un fosfato 5'. Aquellos que no lo tienen no se ligarán con otro oligonucleótido sin la adición de un fosfato con un ATP en presencia de una quinasa. Un oligonucleótido sintético se ligará con un fragmento que no se haya desfosforilado.

"Ligamiento" se refiere al proceso de formar enlaces fosfodiéster entre dos fragmentos de ácido nucleico de cadena doble (Maniatis, T., et al., Id., p. 146). A menos que se indique otra cosa, el ligamiento puede realizarse usando tampones y condiciones conocidas con 10 unidades de ADN ligasa T4 ("ligasa") por 0,5 \mug de cantidades aproximadamente equimolares de los fragmentos de ADN a ligar.

A menos que se indique otra cosa, la transformación se realizó como se describe en el método de Sambrook, Fritsch y Maniatus, 1989. Los siguientes ejemplos pretenden ilustrar, aunque no limitar, la invención. Aunque los procedimientos descritos en los ejemplos son típicos de los que pueden usarse para realizar algunos aspectos de la invención, pueden usarse otros procedimientos conocidos por los especialistas en la técnica. Se usaron los siguientes materiales y métodos para realizar los experimentos descritos en los ejemplos.

Ejemplo 1 Aislamiento, Expresión Bacteriana y Purificación de Fitasa

Se obtuvo ADN genómico de E. coli B de Sigma (Nº de Catálogo D-2001), St. Louis, New Jersey.

Se usaron los siguientes cebadores para amplificar por PCR el gen directamente a partir del ADN genómico:

Cebador 5'

gtttctgaattcaaggaggaatttaaATGAAAGCGATCTTAATCCCATT

Cebador 3'

gtttctggatccTTACAAACTGCACGCCGGTAT

\vskip1.000000\baselineskip

Pfu polimerasa en la reacción de PCR, y la amplificación se realizó de acuerdo con el protocolo del fabricante (Stratagene Cloning Systems, Inc., La Jolla, CA).

El producto de PCR se purificó y el producto purificado y el vector pQE60 (Qiagen) se digirieron ambos con endonucleasas de restricción EcoRl y BgIII (New England Biolabs) de acuerdo con los protocolos del fabricante. Se realizaron ligamientos durante una noche usando protocolos convencionales para producir pQE60.

Las secuencias amplificadas se insertaron en marco con la secuencia que codifica la RBS. La mezcla de ligamiento se usó para transformar la cepa M15/pREP4 de E. coli (Qiagen, Inc.) mediante electroporación. La M15/pREP4 contiene múltiples copias del plásmido pREP4, que expresan el represor lacl y también otorga resistencia a kanamicina (Kan'). El ADN del plásmido se aisló y se confirmó mediante análisis de restricción. Los clones que contenían las construcciones deseadas se cultivaron durante una noche (O/N) en cultivo líquido en medios LB suplementados con Amp (100 ug/ml) y Kan (25 ug/ml). El cultivo O/N se usó para inocular un gran cultivo a una proporción de 1:100 a 1:250. Las células se cultivaron a una densidad óptica 600 (D.O^{600}) de entre 0,4 y 0,6. Después se añadió IPTG ("Isopropil-B-D-tiogalacto piranósido") hasta una concentración final de 1 mM. El IPTG induce la inactivación del represor lacI, eliminando el P/O lo que conduce a una expresión génica aumentada. Las células se cultivaron de 3 a 4 horas adicionales. Después se recogieron las células mediante centrifugado.

Las secuencias de cebador que se han mostrado anteriormente pueden usarse para aislar el gen diana a partir del material depositado mediante técnicas de hibridación descritas anteriormente.

Son posibles numerosas modificaciones y variaciones de la presente invención a la luz de las enseñanzas anteriores y por lo tanto, dentro del alcance de las reivindicaciones adjuntas, la invención puede realizarse de forma diferente a la que se describe particularmente. Debe entenderse que, aunque la invención se ha descrito en referencia a la descripción detallada anteriormente, la descripción anterior pretende ilustrar, aunque no limitar, el alcance de la invención. Otros aspectos, ventajas y modificaciones de la invención están dentro del alcance de las siguientes reivindicaciones.

<110> DIVERSA CORPORATION

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<120> NUEVA FITASA

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<130> 248-6

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<140> EP 98940861.2

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<141> 13-08-1998

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<150> US 08/910.798

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<151> 13-08-1997

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<160> 4

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<170> Microsoft Word para Windows Ver. 6.0

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<210> 1

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<211> 1323

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<212> ADN

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<213> Escherichia coli

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<220>

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<221> CDS

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<222> (1)...(1320)

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<221> misc_feature

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<222> (1)...(1323)

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<223> n = A, T, C o G

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<400> 1

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1

2

3

4

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<210> 2

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<211> 440

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<212> PRT

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<213> Escherichia coli

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<400> 2

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5

6

7

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<210> 3

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<211> 49

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<212> ADN

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<213> Secuencia Artificial

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<220>

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<223> Oligonucleótido

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<400> 3

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\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

gtttctgaat tcaaggagga atttaaatga aagcgatctt aatcccatt

\hfill

49

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<210> 4

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<211> 33

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<212> ADN

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<213> Secuencia Artificial

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<220>

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<223> Oligonucleótido

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<400> 4

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\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

gtttctggat ccttacaaac tgcacgccgg tat

\hfill

33

Claims (17)

1. Fitasa sustancialmente pura que tiene una secuencia de aminoácidos constituida por la SEC ID Nº: 2.

2. Una secuencia de polinucleótidos aislada que codifica una fitasa de la reivindicación 1.

3. Un polinucleótido aislado seleccionado entre el grupo constituido por:

a)

SEC ID Nº: 1;

b)

SEC ID Nº: 1, en la que T también puede ser U.

4. El polinucleótido de la reivindicación 2, en el que el polinucleótido se aísla a partir de un procariota.

5. Un vector de expresión que incluye el polinucleótido de la reivindicación 2.

6. El vector de la reivindicación 5, en el que el vector es un plásmido.

7. El vector de la reivindicación 5, en el que el vector se obtiene a partir de un virus.

8. Una célula hospedadora transformada con el vector de la reivindicación 5.

9. La célula hospedadora de la reivindicación 8, en la que la célula es procariota.

10. Anticuerpos que se unen al polipéptido de la reivindicación 1.

11. Los anticuerpos de la reivindicación 10, en los que los anticuerpos son policlonales.

12. Los anticuerpos de la reivindicación 10, en los que los anticuerpos son monoclonales.

13. Un método para producir una enzima que comprende cultivar una célula hospedadora de la reivindicación 8 en condiciones que permiten la expresión del ácido nucleico y el aislamiento de la enzima codificada por el ácido nucleico.

14. Un método para degradar fitato que comprende poner en contacto el fitato con una cantidad de la enzima de la reivindicación 1 necesaria para degradar al menos el 50% del fitato en comparación con el fitato que no se puso en contacto con la enzima.

15. Un método para hidrolizar el enlace fosfo-mono-éster en el fitato que comprende poner en contacto el fitato con una cantidad de la enzima de la reivindicación 1 necesaria para hidrolizar al menos el 50% de los enlaces fosfo-mono-éster en comparación con el fitato que no se puso en contacto con la enzima.

16. Una composición de alimento animal que comprende una fitasa que tiene una secuencia de aminoácidos como se muestra en la SEC ID Nº: 2.

17. El anticuerpo de la reivindicación 10, en el que el anticuerpo está marcado de forma detectable.