ES2296813T3 - Metodo para la reparacion y la regeneracion de cartilago y de colageno ex vivo e in vitro. - Google Patents
Metodo para la reparacion y la regeneracion de cartilago y de colageno ex vivo e in vitro. Download PDFInfo
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Abstract
Un método ex vivo o in vitro para la restauración de la función del cartílago degenerado, dañado o lesionado, en el que dicho método comprende la etapa de: (a) someter un cartílago degenerado, dañado o lesionado o un injerto de cartílago extirpado de una articulación, o condrocitos, ex vivo o in vitro, a una presión hidrostática aplicada de manera intermitente (IHP) de entre aproximadamente 0, 5 y aproximadamente 30 MPa durante aproximadamente 1 a aproximadamente 8 horas diarias; (b) retirar la IHP durante un periodo de recuperación de aproximadamente 16 a 22 horas; y (c) repetir las etapas (a) y (b) durante un periodo de aproximadamente 4 a aproximadamente 100 días o de tantos como sea necesario.
Description
Método para la reparación y la regeneración de
cartílago y de colágeno ex vivo e in vitro.
Esta invención se refiere a un método para la
reparación, la regeneración, la formación de novo y la
remodelación ex vivo e in vitro de células
mesenquimales o derivadas del mesénquima, cartílago, colágeno y
hueso dañadas y normales, y a los medicamentos para tales fines. En
particular, esta invención se refiere a la regeneración ex
vivo e in vitro de cartílago y de colágeno articular y a
la remodelación ósea mediante presión hidrostática aplicada de
manera intermitente. El método implica la aplicación de carga
externa a intervalos que consisten en periodos repetidos de presión
hidrostática aplicada seguidos de e interrumpidos por periodos de
recuperación. El método se refiere específicamente a la aplicación
de la presión hidrostática intermitente a niveles de
0,5-30 MPa durante un intervalo de
1-8 horas seguido de un periodo de recuperación de
hasta aproximadamente 16-23 horas, aplicándose
dicha presión a células cartilaginosas y óseas in vitro,
explantes de injerto cartilaginoso y óseo ex vivo y al
cartílago que queda intacto dentro del espacio articular de
articulaciones diartróticas. La carga a intervalos da como
resultado un aumento significativo de la expresión de proteínas que
proporcionan las propiedades fenotípicas únicas del cartílago y del
hueso y la inhibición selectiva de enzimas degradantes de la
matriz, citocinas proinflamatorias y quimiocinas que atraen células
inflamatorias hacia la cavidad articular y la disminución selectiva
de la expresión génica de factores de crecimiento que son
inhibidores de la reparación y regeneración de la matriz
extracelular.
La invención también se refiere a métodos ex
vivo e in vitro para el tratamiento de la regeneración,
restauración y transplante de cartílago y de colágeno articular.
Las enfermedades artríticas, particularmente la
osteoartritis, afectan a más gente que cualquier otra enfermedad.
La osteoartritis implica la pérdida de función del cartílago que
experimenta una degeneración lenta progresiva en muchas
articulaciones. Aunque la osteoartritis se considera una enfermedad
no inflamatoria, se produce cierto grado de inflamación. La
osteoartritis se distingue de la artritis reumatoide, que es una
enfermedad articular inflamatoria crónica.
La osteoartritis afecta a la mayoría de la gente
de mediana edad tardía. Las afecciones relacionadas con
osteoartritis disminuyen la productividad personal y la calidad de
vida y, en una sociedad cada vez más envejecida, aumentan la
morbidez y la mortalidad de hombres y mujeres aumentando la
incidencia de otras afecciones crónicas tales como, por ejemplo, la
osteoporosis. Actualmente, el único tratamiento con éxito para una
enfermedad articular en fase terminal requiere una cirugía mayor
que implica el reemplazo total de la articulación, que no está
libre de complicaciones asociadas tales como infección,
desprendimiento aséptico y dolor. Estas complicaciones pueden
conducir a la necesidad de una artoplastia de revisión. La reversión
de la aparición temprana de asteoartritis mediante técnicas
quirúrgicas novedosas que eliminarían la necesidad de reemplazo de
la articulación está ahora mismo en fases expe-
rimentales.
rimentales.
Se están desarrollando procedimientos
quirúrgicos intraarticulares que suponen la transferencia de células
cartilaginosas de regiones sanas de la articulación a superficies
dañadas para restaurar la función articular. En este contexto, se
colocan células cartilaginosas o pequeñas regiones de cartílago en
defectos parciales o del grosor completo de la superficie articular
usando un procedimiento quirúrgico abierto. Después, la construcción
celular se mantiene en su lugar mediante tejido perióstico que se
sutura en su sitio. En muchos casos, estos injertos se fibrilan y
se degradan rápidamente. En un procedimiento alternativo, la
mosaicoplastia implica trasladar múltiples pequeños injertos de
cartílago de un área de la superficie articular a otra para
favorecer que vuelva a soportar peso. Con cualquier tipo de
intercambio cartilaginoso, se favorecerá enormemente la eficacia de
reparación después de la restauración de una estructura de matriz
extracelular de cartílago normal antes de su uso.
Las enfermedades cartilaginosas, colagenosas y
óseas, por lo tanto, representan un problema médico de enorme
importancia, particularmente con una población cada vez más
envejecida que es más propensa a osteoartritis y otras enfermedades
regenerativas articulares y será importante, por lo tanto, tener
disponible un medio para la regeneración del cartílago y del
colágeno articulares y la remodelación ósea.
El cartílago articular recubre los extremos de
los huesos largos y es un tejido de soporte de carga que distribuye
las fuerzas por las superficies articulares, protegiendo, de este
modo, al hueso subyacente más rígido. También facilita una
articulación y flexión suaves de las articulaciones durante las
actividades normales de la vida diaria.
Continuamente se realiza intentos de regenerar
cartílago articular. La patente de Estados Unidos Nº 6.080.194, por
ejemplo, describe un molde de colágeno formado por combinación de
una esponja de colágeno porosa con una membrana de colágeno. La
patente Nº 5.786.217 describe métodos y composiciones para la
reparación de defectos del cartílago articular. La patente Nº
5.206.023 describe métodos y composiciones para el tratamiento y la
reparación de defectos o lesiones del cartílago. La patente Nº
5.041.138 se refiere a la neomorfogénesis de cartílago in
vivo a partir de un cultivo celular para el desarrollo e
implantación de estructuras cartilaginosas. Sin embargo, ninguna de
estas patentes describe un método que regeneraría el cartílago
dañado hasta un estado funcional y todavía se carece de dicho
método.
Los ensayos clínicos en seres humanos y los
estudios experimentales con modelos animales confirman que las
cargas mecánicas proporcionan un estímulo esencial para el
mantenimiento de una homeostasis normal del cartílago articular
(Proc. Soc. Exp. Biol. Med., 190: 275 (1989)).
Las alteraciones de la carga articular debidas a
inmovilización (Clin. Orthop. Rel. Res., 219: 28 (1987)),
laxitud ligamentosa (Ibídem, 213: 69 (1986)), impacto
excesivo (J. Biomechanics, 6: 51 (1973)) o rigidez ósea
subcondral aumentada (J. Biomechanics, 28: 357 (1995) dan
como resultado cambios patológicos en el cartílago característicos
de osteoartritis.
La capacidad del cartílago de cambiar de forma
rápidamente y de manera reversible es atribuible a una matriz
resistente y elástica con un alto contenido de proteoglicanos
altamente solubles que están atrapados en colágeno, una red de
fibras insolubles. Los proteoglicanos, el colágeno y otras moléculas
presentes en el tejido cartilaginoso se producen mediante células
cartilaginosas derivadas del mesénquima, los condrocitos.
Los estudios in vitro confirman que las
células cartilaginosas, los condrocitos articulares, responden a
condiciones de carga específicas a través de una reacción anabólica
o catabólica que puede atribuirse la carga y a la tensión que se
imparten a la célula mediante el estímulo físico (Biochem.
Biophys. Res. Commun., 240: 216 (1997); Spine, 22: 1085
(1997) y J. Orthop. Res., 15: 189 (1997)).
El reconocimiento del papel que la carga
mecánica desempeña en la regulación del metabolismo de los
condrocitos articulares se ha definido en parte mediante el
análisis matemático de la distribución de fuerzas por las
superficies articulares (J. Biomech., 22: 853 (1989)).
Los análisis biomecánicos descritos en J.
Exp. Physiol., 81: 535 (1996) confirman que los condrocitos del
cartílago de una articulación diartrótica experimentan niveles de
presión hidrostática del orden de 7 a 10 MPa que resultan de
actividades normales de la vida diaria. Los estudios que investigan
la influencia de fuerzas mecánicas sobre la diferenciación tisular
revelaron que se encuentra un grosor de cartílago aumentado en
regiones de la articulación diartrótica expuestas a una carga
hidrostática de compresión elevada intermitente. El cartílago más
fino coincide con regiones que experimentan una presión hidrostática
disminuida y que tienen fuerzas de tensión que se originan
tangencialmente a la superficie articular (Bone, 11: 127
(1990)).
Los estudios experimentales descritos en J.
Orthop. Res., 9: 1-10 (1991) confirmaron que la
presión hidrostática influye en el metabolismo de la matriz
cartilaginosa articular cuando se aplican in vitro y
establecieron que una presión hidrostática a niveles de
5-15 MPa modula los índices de incorporación de
^{35}SO_{4} y ^{3}H-prolina en el cartílago
articular bovino adulto in vitro.
Los experimentos de cultivo de órganos descritos
en J. Biol. Chem., 262: 15490 (1987) demostraron que los
sitios de producción de proteoglicanos coinciden con regiones de
presión hidrostática natural. Los niveles fisiológicos de presión
hidrostática potencian los niveles de señal de ARNm para agrecano y
colágeno de tipo II cuando se miden inmediatamente después de la
aplicación de carga, como se describe en J. Orthop. Res., 14:
53 (1996). En un estudio de compresión de carga controlada de
expresión de ARNm de agrecano en explantes de cartílago bovino se
observó una sobrerregulación transitoria después de una hora de
carga.
Aunque la investigación anterior describe y
reconoce la importancia de la presión hidrostática sobre la función
normal del cartílago y del colágeno de tipo II, tales conocimientos
eran sin embargo imposibles de aplicar clínicamente ya que la
aplicación continua de la presión hidrostática conduce al
agotamiento del potencial metabólico del cartílago y a su lesión,
mientras que la carga breve (<1 hora) con presión hidrostática
conduce a respuestas celulares modificadas que alteran el
metabolismo y la homeostasis de los condrocitos. Por ejemplo, un
breve periodo de aplicación de carga de presión hidrostática produce
una expresión aumentada de ARNm de colágeno de tipo II, mientras
que la carga aplicada de manera continua no mantiene dicha expresión
aumentada. Por otro lado, la expresión de señal de agrecano
continuó aumentando durante toda la duración de la carga.
Evidentemente, estos resultados alteran el equilibrio celular entre
el agrecano y el colágeno de tipo II. Las células cartilaginosas
responden a múltiples estímulos de maneras impredecibles y la
variabilidad de la respuesta depende del tiempo, de la magnitud y
de la frecuencia de la carga. Obviamente, esta impredecibilidad
impide el uso de periodos continuos largos o cortos de carga de
presión hidrostática indiscriminada para el tratamiento de
osteoartritis o la regeneración de cartílago dañado (J. Rehab.
Res. Dev., 37: 153-161 (2000)).
El documento WO 96/39992 se refiere a un aparato
y a un método para esterilizar, sembrar, cultivar, almacenar,
transportar y ensayar construcciones de tejido cartilaginoso de
reemplazo. El documento US 5.746.704 se refiere a un aparato de
terapia que tiene un dispositivo de movilidad pasiva para flexionar
un miembro corporal. El documento US 5.752.925 se refiere al
aumento de la resistencia a la fractura del hueso mediante la
aplicación repetida de fuerzas de baja magnitud simulando las
fuerzas del traumatismo.
\newpage
En vista de la gravedad y del efecto
incapacitante de la osteoartritis y de otras enfermedades
cartilaginosas, colagenosas u óseas, sería importante proporcionar
un método que permitiera una regeneración de cartílago o de colágeno
y una remodelación ósea.
Hasta hace poco se pensaba que el cartílago
articular no podía auto-repararse una vez que se
altera la distribución de las fibras de soporte. (Articular
Cartilage and Osteoarthritis, Workshop Conference
Hoechst-Werk, Kalle-Albert,
Wiesbaden, 12-16 de mayo de 1991, Eds. Kuettner
et al., Rosen Press, Nueva York).
Se ha descubierto ahora que tal regeneración es
posible con un régimen específico de presión hidrostática aplicada
de manera intermitente a células mesenquimales o derivadas del
mesénquima, tales como fibroblastos, fibrocondrocitos o condrocitos
y es, por lo tanto, un objetivo primario de la presente invención
proporcionar métodos para el tratamiento ex vivo e in
vitro de osteoartritis y de otras enfermedades cartilaginosas y
colagenosas mediante la estimulación de su regeneración, formación
de novo y remodelación ósea, proporcionando dichos métodos
un entorno de carga mecánica definido que regenera y repara células
cartilaginosas y óseas adultas.
La presente invención proporciona un método
ex vivo o in vitro para la restauración de la función
de una articulación degenerada, dañada o lesionada, caracterizado
porque dicho método comprende la etapa de:
(a) someter al cartílago degenerado, dañado o
lesionado o a un injerto de cartílago extirpado de la articulación,
o a condrocitos, ex vivo o in vitro a una presión
hidrostática aplicada de manera intermitente (IHP) de entre
aproximadamente 0,5 y aproximadamente 30 MPa durante de
aproximadamente 1 a aproximadamente 8 horas diarias;
(b) retirar la IHP durante un periodo de
recuperación de aproximadamente 16 a 22 horas; y
(c) repetir las etapas (a) y (b) durante un
periodo de aproximadamente 4 a aproximadamente 100 días o de tantos
como sea necesario.
La invención proporciona además el uso de
cartílago, colágeno, ligamentos, tendones, hueso, condrocitos o
injertos de cartílago obtenidos por un método de la invención en la
fabricación de un medicamento para la restauración de la función de
una articulación degenerada, dañada o lesionada.
Un aspecto de la presente invención es un método
in vitro o ex vivo para la reparación, regeneración y
formación de novo de cartílago, suministro de condrocitos, o
deposición de colágeno de tipo II y estimulación y remodelación
ósea.
Otro aspecto de la presente invención es un
método in vitro o ex vivo para el tratamiento de
enfermedades de cartílago, colágeno o hueso mediante la
estimulación de la regeneración de cartílago y de colágeno y de la
remodelación ósea usando un régimen de carga a intervalos que
consiste en periodos repetidos de presión hidrostática aplicada de
manera intermitente dentro de un intervalo de carga determinado
seguido de un periodo de recuperación.
Otro aspecto más de la presente invención es un
método ex vivo o in vitro para la reparación,
regeneración y formación de novo de cartílago, en el que la
regeneración se consigue mediante la aplicación de un régimen de
carga a intervalos que consiste en periodos repetidos de presión
hidrostática aplicada seguidos de periodos de recuperación a
cartílago o células cartilaginosas ex situ o a cartílago o
células cartilaginosas in vitro.
Otro aspecto más de la presente invención es un
método de reparación, regeneración, y formación de novo de
cartílago ex vivo que implica aplicar una presión
hidrostática al tejido cartilaginoso que necesita regenerarse,
extraído in situ o de condrocitos, fibroblastos o
fibrocondrocitos adheridos a una matriz y sometidos al régimen que
comprende aplicar la presión hidrostática de manera intermitente
durante aproximadamente 1-8 horas seguido de
aproximadamente 16-23 horas de periodo de
recuperación.
Otro aspecto más de la presente invención es el
uso de injertos de cartílago en la fabricación de un medicamento
para la regeneración de articulaciones dañadas para restaurar la
función normal de las articulaciones, en el que los injertos se han
sometido a la carga de presión hidrostática intermitentes de la
invención para restaurar una matriz sana que soporte carga.
Otro aspecto más de la presente invención es un
cartílago de soporte de carga sano funcional aislado y regenerado a
partir del cartílago dañado, en el que el cartílago dañado se somete
a una presión hidrostática intermitente seguida de periodos de
recuperación hasta que se recuperan las propiedades mecánicas y
bioquímicas normales.
El método ex vivo o in vitro de la
invención puede comprende además la detección de la funcionalidad
del cartílago mediante la determinación in vitro de los
niveles relativos, o de los niveles de expresión de, enzimas
degradantes de cartílago o de hueso, citocinas y sus inhibidores o
sustancias promotoras del crecimiento, factores de crecimiento y
hormonas, después de someter al cartílago o hueso dañado a una
presión hidrostática intermitente seguida de periodos de
recuperación.
En particular, el método puede comprender además
la determinación de la funcionalidad o de la extensión de la lesión
del cartílago o del colágeno, después del tratamiento de IHP de la
invención, mediante la determinación del nivel de expresión de ARNm
de colágeno, ARNm de agrecano, TGF, MMP-1,
MMP-2 o IL-6.
La Figura 1 es un esquema de un instrumento de
aplicación de carga servohidraúlica adecuado para la aplicación de
una presión hidrostática intermitente a condrocitos articulares.
La Figura 2 es un gráfico que ilustra los
efectos de una carga a intervalos con diferentes magnitudes de
presión hidrostática intermitente sobre la expresión de agrecano
(Figura 2A) y colágeno de tipo II (Figura 2B) en condrocitos
articulares humanos normales.
La Figura 3 es un gráfico que ilustra los
efectos de una carga a intervalos de 4 horas durante 4 días con 10
MPa de presión hidrostática intermitente sobre la expresión de señal
de ARNm de agrecano y de colágeno de tipo II en condrocitos
articulares osteoartríticos humanos.
La Figura 4 es un gráfico que muestra los
efectos de una carga a intervalos con diferentes magnitudes de
presión hidrostática intermitente sobre la liberación de
metaloproteinasa 2 de la matriz por condrocitos articulares humanos
normales usando ELISA (Figura 4A) y la actividad enzimática usando
zimografía de una preparación activada (+APMA) e inactivada (Figura
4B).
La Figura 5 es un gráfico que muestra los
efectos de una carga a intervalos con diferentes magnitudes de
presión hidrostática intermitente sobre la liberación de factor de
crecimiento transformante \beta (TGF-\beta) por
condrocitos articulares humanos normales.
La Figura 6 es un gráfico que muestra los
efectos de una carga a intervalos con diferentes magnitudes de
presión hidrostática intermitente sobre la liberación de proteína
quimioatrayente de macrófagos 1 (MCP-1) por
condrocitos articulares humanos normales.
La Figura 7 es un gráfico que demuestra la
ausencia de efecto de una carga a intervalos con diferentes
magnitudes de presión hidrostática intermitente sobre el factor de
crecimiento de fibroblastos 1 (FGF-1) por
condrocitos articulares humanos normales.
La Figura 8 es un gráfico que muestra los
niveles de señal de RT-PCR para la expresión de
colágeno de tipo II y de tipo I y de beta-actina en
células de control sin carga.
La Figura 9 muestra los niveles de señal para la
expresión de beta-actina en células expuestas a IHP
y en células de control sin carga.
La Figura 10 muestra los niveles de señal de
RT-PCR para agrecano después de la exposición de
cultivos en monocapa de alta densidad a IHP.
La Figura 11 muestra los niveles de señal de
RT-PCR para colágeno de tipo II después de la
exposición de cultivos en monocapa de alta densidad a IHP.
La Figura 12 muestra el análisis del transcurso
de tiempo para la liberación de TGF-\beta1 por
células MG-63 expuestas a una presión hidrostática
intermitente (10 MPa).
La Figura 13 describe los efectos en respuesta a
la dosis de una presión hidrostática intermitente sobre la
liberación de TGF-\beta1 por células
MG-63.
La Figura 14 muestra el análisis del transcurso
de tiempo para la liberación de MMP-2 por células
MG-63 expuestas a IHP.
Como se usan en este documento:
El término "esponjoso" se refiere a hueso
que tiene una estructura de tipo reticular o esponjosa.
Las expresiones "mesenquimal", "células
madre mesenquimales" o "célula derivada del mesénquima" se
refieren a las células que se localizan en el interior de y que
producen la matriz extracelular del cartílago (condrocitos), tejido
conectivo (fibroblastos), fibrocartílago (fibrocondrocitos),
tendones (tenocitos) y hueso (osteoblastos y osteocitos).
Las expresiones "carga" o "intervalo de
carga" se refieren a un periodo de carga de IHP aplicada, o a un
estímulo en un tejido, seguido de un periodo de recuperación en el
que no se aplica presión externa y en el que la presión vuelve a las
condiciones ambientales.
El término "intervalo" se refiere a una
combinación de periodos de carga y de recuperación repetidos tantas
veces como sea necesario.
La expresión "formación de novo" se
refiere a la producción de tejido conectivo cartilaginoso,
fibrocartílago, tendones y huesos como resultado de la adherencia
de condrocitos, fibroblastos, fibrocondrocitos, tenocitos y
osteoblastos dentro de una estructura de soporte (armazón o matriz
de colágeno) después de la exposición a un intervalo de carga.
El término "osteoblasto" se refiere a una
célula formadora de hueso que deriva del mesénquima (fibroblasto) y
que forma una matriz ósea en la que la se incluye como un
osteocito.
Los términos "fibroblasto" o
"fibrocito" se refieren a una célula estrellada o con forma de
huso con procesos citoplasmáticos presentes en el tejido conectivo
capaces de formar fibras de colágeno.
El término "agrecano" se refiere a un
proteoglicano agregante grande que desempeña un papel impartiendo
resistencia a la compresión al cartílago articular y permitiendo el
soporte de carga. El agrecano es un proteoglicano abundante que
representa aproximadamente el 85% de los proteoglicanos totales.
La expresión "colágeno de tipo II" se
refiere a una molécula homopolimérica de cadenas \alpha1 (11) que
es el producto de un único gen COL2A1. El colágeno de tipo II es el
más abundante de todos los demás tipos de colágeno y representa
aproximadamente el 95% del colágeno total.
Las expresiones "metaloproteinasa de la
matriz" o "MMP" se refieren a una proteasa que provoca y que
está asociada con la degeneración cartilaginosa en una articulación
dañada. La MMP puede diferenciarse además en MMP-1,
MMP-2, MMP-9, etc.
Las expresiones "proteína quimioatrayente de
macrófagos 1" o "MCP-1" se refieren a un
mediador proinflamatorio que influye en el estado inmune del
tejido. Su nivel aumentado se asocia con el comienzo o el aumento de
la destrucción tisular, y su nivel disminuido se asocia con una
disminución del daño tisular o cicatrización.
Las expresiones "factor de crecimiento
transformante \beta" o "TGF-\beta" se
refieren a un factor liberado por las células tras aplicar una
presión hidrostática intermitente e implican un cambio en el
metabolismo celular.
Las expresiones "factor de crecimiento de
fibroblastos 1" o "FGF-1" se refieren a un
factor de crecimiento que no se conoce que esté implicado en la
proliferación de condrocitos o de células de tipo osteoblástico.
El término "MPa" se refiere a MegaPascales.
Un MPa es igual a 145 psi.
El término "GAG" se refiere a
glicosaminoglicanos.
El término "IHP" se refiere a presión
hidrostática intermitente.
El término "GAPDH" se refiere a
gliceraldehído-3-fosfato
deshidrogenasa.
El término "APMA" se refiere a acetato de
4-aminofenilmercurio, un activador de la proenzima
latente a la enzima activa.
La invención descrita en este documento se
refiere a un descubrimiento de que presión hidrostática aplicada de
manera intermitente y repetidamente durante periodos de carga a
intervalos influye en la expresión génica de los condrocitos
articulares, provoca la expresión de colágeno de tipo II dependiente
de carga, disminuye una metaloproteinasa de la matriz, permite la
formación de novo de células mesenquimales o derivadas del
mesénquima dentro de una matriz y altera la remodelación ósea. El
descubrimiento es adecuado para la reparación y el tratamiento de
enfermedades articulares degenerativas tales como osteoartritis,
artrosis, lesiones del cartílago articular, enfermedad articular
degenerativa, reemplazo articular, reestructuración ósea y otras
enfermedades de cartílago, colágeno y hueso.
El método para la regeneración de cartílago y de
colágeno y la remodelación ósea para el tratamiento de las
enfermedades enumeradas anteriormente comprende, en su alcance más
general, la aplicación de un régimen de carga a intervalos de
acuerdo con la invención, a injertos de grosor completo
transplantables de cartílago o de hueso humano osteoartrítico o
dañado ex vivo o a las células aisladas de cartílago,
colágeno y hueso sano o dañado in vitro.
El régimen terapéutico consiste en la
estimulación de tejido tratado o de células aisladas con periodos
repetidos de presión hidrostática aplicada seguidos de periodos de
recuperación (intervalo de carga). La presión se aplica
preferiblemente de manera intermitente dentro de cada intervalo de
carga. Los parámetros del método, tales como, presión, frecuencia,
longitud de los intervalos, intermitencia y periodo de recuperación,
se seleccionan en base al método seleccionado para la regeneración,
es decir, ex vivo o in vitro, así como a la enfermedad
y a la gravedad de la degeneración cartilaginosa.
El régimen de carga adecuado para la reparación,
regeneración o formación de novo de cartílago intacto, hueso
intacto, injerto o células cartilaginosas y óseas, comprende
generalmente la aplicación de una presión hidrostática de entre 0,5
MPa y 30 MPa, preferiblemente de entre 1 MPa y 20 MPa, y más
preferiblemente de entre 5 MPa y 10 MPa en intervalos intermitentes
de 1 Hz de frecuencia.
Típicamente, no se usan ni se recomiendan
presiones mayores que aproximadamente 30 MPa, ya que pueden conducir
a daños celulares, mientras que presiones menores de 0,1 MPa pueden
no ser eficaces para la regeneración de células o tejido. Las
presiones de aproximadamente 5-10 MPa se
corresponden con los niveles fisiológicos normales que se encuentran
en el cartílago articular in vivo.
La duración de los intervalos de alta presión
generalmente oscila de unos minutos a 8 horas, y es preferiblemente
de entre aproximadamente 1 y 8 horas, más preferiblemente de
aproximadamente 4 horas.
Durante el periodo de recuperación, el tejido o
las células de interés están expuestos a presión constante
atmosférica o suficientemente baja. Los periodos de recuperación
pueden oscilar generalmente desde unos minutos hasta decenas de
horas, y son preferiblemente de entre aproximadamente 16 a
aproximadamente 23 horas, preferiblemente de aproximadamente 20
horas.
Dentro de cada intervalo de presión hidrostática
intermitente, la presión se aplica de manera intermitente con una
frecuencia de entre 0,1 Hz y 10 Hz, preferiblemente del orden de 1
Hz. En la realización preferida para células cartilaginosas, el
régimen de carga a intervalos se aplica durante al menos 4 días
consecutivos, típicamente durante aproximadamente 4 horas de carga
a 10 MPa aplicada a 1 Hz seguido de aproximadamente 20 horas de
recuperación a presión atmosférica constante.
La duración del tratamiento del cartílago
depende totalmente del grado y de la gravedad de la degeneración
cartilaginosa, de la extensión de la pérdida de colágeno, de la
gravedad de la enfermedad ósea o del grado y de la gravedad de la
lesión articular. Típicamente, la mejora en la funcionalidad del
cartílago y su regeneración se observan después de aproximadamente
4 tratamientos una carga de IHP, es decir, típicamente después de 4
días de tratamiento. En cartílago más degenerado, dañado o
lesionado, se continúa dicho tratamiento durante hasta 100 días sin
ninguna consecuencia negativa, y puede continuarse indefinidamente
cuando la función del cartílago y/o del colágeno está alterada de
manera crónica. El tratamiento preferible durará con éxito entre 7 y
30 días.
Para la formación de novo, la matriz de
colágeno se llena de células sanas o dañadas a tratar y el
tratamiento se continúa hasta que se forma el nuevo tejido.
La duración del tratamiento depende de la
rapidez de la recuperación funcional. La funcionalidad del cartílago
depende de la recuperación y/o de la reconstrucción y/o de la
formación de una matriz que soporte carga. La degeneración
cartilaginosa se produce como resultado de la deformación de las
células, por niveles inapropiados de carga de tensión de cizalla
sobre la matriz y degeneración debida a cambios metabólicos.
Estos cambios metabólicos afectan a la expresión
genética de la célula cartilaginosa con respecto al agrecano y al
colágeno, particularmente al colágeno de tipo II, y a cierto factor
de crecimiento como el TGF-\beta. Los cambios y
el metabolismo de los condrocitos también conducen a la expresión o
sobreexpresión de proteínas que no se expresan normalmente o que se
expresan en menor medida en condrocitos funcionales sanos, tales
como metaloproteinasas MMP-1, MMP-2,
MMP-9 y citocinas proinflamatorias, tales como
IL-1 e IL-6.
Por consiguiente, durante y particularmente
después del tratamiento de carga de IHP, se ensayan algunos o todos
los factores anteriores y se evalúa su presencia para determinar una
actividad aumentada. Actividades ausentes o disminuidas se
correlacionan con la regeneración de la integridad del cartílago y
de su función de soporte de carga.
\hskip0.3cmnd = no detectable o traza.
El ensayo de funcionalidad descrito en este
documento implica la determinación de los valores relativos de los
componentes de la matriz extracelular tales como agrecano y colágeno
de tipo II, proteasas tales como MMP-1,
MMP-2, MMP-9 y citocinas tales como
IL-6, IL-1 y MCP1. Estos valores son
distintos dependiendo de la preparación del tejido y del método
usado, pero la tendencia continúa siendo la misma, concretamente,
los niveles de proteínas de la matriz extracelular disminuyen y los
niveles de proteasas y citocinas aumentan en cartílago y colágeno
lesionados o degenerados. Durante la regeneración, los niveles
vuelven a sus intervalos fisiológicos normales.
Se descubrió que el régimen de carga aplicada de
acuerdo con la invención estimulaba la regeneración del tejido
cartilaginoso articular, del tejido de colágeno, del tejido óseo y/o
de sus células respectivas aisladas. También se descubrió que el
régimen de carga a intervalos aumentaba la expresión génica de las
proteínas que forman la matriz extracelular funcional del cartílago
articular. Después de la aplicación de un régimen de carga a
intervalos de la presente invención, la tinción de la matriz con
colorantes catiónicos confirmó la presencia aumentada de matriz
extracelular.
Además, se descubrió que el régimen de carga a
intervalos daba como resultado la inhibición selectiva de enzimas
degradantes de la matriz, citocinas proinflamatorias y quimiocinas
que atraen células inflamatorias hacia la cavidad articular.
Además, se descubrió que el régimen de carga a intervalos afecta a
la expresión de factor de crecimiento transformante \beta1
(TGF-\beta1), de metaloproteinasas de la matriz
tales como, por ejemplo, MMP-1,
MMP-2, MMP-9 y de inhibidor tisular
de metaloproteinasa (TIMP) en células de tipo osteoblástico humanas.
Éstos y otros factores pueden usarse de la manera conveniente para
evaluar la funcionalidad del cartílago y del hueso, como se muestra
en la Tabla 1.
Los métodos que se usan para la detección de los
parámetros para la determinación de la funcionalidad incluyen, pero
sin limitación, RT-PCR, zimografía, bioquímica,
tinción, ELISA, técnicas de matrices de genes y proteómica.
Para el tratamiento in vitro, se extirpa
el tejido cartilaginoso dañado de un paciente por medios
quirúrgicos. El régimen de carga a intervalos puede aplicarse al
tejido intacto, como a un injerto osteocondrocartilaginoso, para el
tratamiento ex vivo. Para el tratamiento in vitro, se degrada
la matriz cartilaginosa normal o dañada y se aplica el régimen de
carga a intervalos a las células cartilaginosas resultantes
cultivadas en suspensión dentro de un armazón o soporte o como
monocapas. Después de la aplicación del régimen de carga, el tejido
formado de novo resultante o la colección de células se
reimplantan en un paciente. Preferiblemente, pero no necesariamente,
el transplante es autólogo.
El procedimiento quirúrgico sigue generalmente
la técnica que se ha desarrollado y usado para la intervención
artroscópica usando injertos osteocondrales. En este procedimiento,
se extirpa una muestra de grosor completo de cartílago de las
regiones periféricas de la superficie articular y después se
transfiere a un defecto circular. El sitio hospedador tiene
típicamente una circunferencia que es menor que el material a
insertar, de tal modo que la unión entre el sitio hospedador y el
tejido de reemplazo es un ajuste resistente. En el material que se
produce en respuesta a la carga a intervalos, el material
cartilaginoso reimplantado se ajusta en tamaño para coincidir con
los contornos de la superficie articular. Éste es diferente del
procedimiento habitual para injertos osteocondrales, en los que se
deja un injerto de tamaño superior 2-3 mm por encima
de la superficie del cartílago circundante. La formación de una
matriz extracelular basada en colágeno de tipo II, que es capaz de
resistir cargas articulares normales, permite que los injertos
ajustados por presión coincidan con el grosor de la superficie
articular normal, que coincide con el grosor natural que corresponde
a la variación regional de la articulación normal.
El tratamiento in vitro de células,
monocapas de células o cultivos celulares se describe básicamente en
la sección II.
Para el tratamiento ex vivo, que es
particularmente adecuado para el tratamiento de lesiones del
cartílago articular, tales como rotura o desgarro de menisco, en
las que puede estar lesionado sólo una parte del cartílago y el
resto del cartílago está sano y funcional, el cartílago desgarrado o
roto se extirpa quirúrgicamente como un injerto de cartílago y se
somete a un régimen de carga de IHP. La funcionalidad del injerto de
cartílago se ensaya periódicamente hasta que los criterios alcanzan
los niveles normales del cartílago sano, como se muestra en la
Tabla 1. Después, el injerto, que conserva su forma y tamaño
originales, se reimplanta en la articulación. El tratamiento de IHP
ex vivo, el ensayo, la extirpación quirúrgica y la
reimplantación se realizan en condiciones estériles.
La ventaja del tratamiento ex vivo es que
el tejido es autólogo, solamente el tejido dañado se somete a
tratamiento y el tamaño y la forma del explante continúan siendo los
mismos, de tal modo que no se añade más ni menos tejido
cartilaginoso. Además, el tejido se retransplanta solamente si y
cuando está completamente regenerado. La desventaja de este
procedimiento es una doble cirugía. No obstante, en lesiones
articulares extensas de la articulación, este procedimiento es de
todas formas preferible al reemplazo de la articulación o a dejar la
articulación sin el cartílago o sin una parte del cartílago.
Los instrumentos y equipos para la regeneración
de matriz y/o de las células del cartílago articular en tratamientos
ex vivo e in vitro comprenden, básicamente, un
generador de presión hidrostática, un contador de frecuencia, un
temporizador y un dispositivo de control de temperatura.
Un equipo in vitro adecuado comprende una
cámara de presurización para contener el tejido, células de interés
o cultivos celulares, un instrumento de carga hidráulica
(dispositivo de presurización) en contacto fluido con la cámara de
presurización, para presurizar la cámara de presurización a
presiones predeterminadas de interés, y componentes electrónicos de
control para el control de frecuencia en contacto eléctrico con el
instrumento de carga, para controlar el instrumento de carga, para
aplicar un régimen de carga a intervalos predeterminado al tejido o
a las células de interés.
Se observa en la Figura 1 un instrumento
adecuado para la aplicación de una presión hidrostática intermitente
a condrocitos articulares aislados para el tratamiento in
vitro. El instrumento en particular que se observa en la Figura
1 es un recipiente de presión de acero inoxidable disponible en el
mercado conectado con un instrumento de carga servohidráulica. Este
diseño facilita la evacuación completa del aire del sistema, dando
como resultado la aplicación de simplemente presión
hidrostática.
El aparato que se observa en la Figura 1 es
solamente ejemplar y debe entenderse que se pretende que, cualquier
instrumento y equipo, independientemente de cómo de modificado, que
comprenda componentes similares y proporcione resultados similares,
se incluya dentro del alcance de esta invención. También se refiere
a un instrumento in vivo que comprende un dispositivo de
sujeción para sujetar una articulación o extremidad de un paciente
o medios de sujeción al tejido del paciente, un motor acoplado con
el dispositivo de sujeción para mover el dispositivo de sujeción a
lo largo de una trayectoria predeterminada, y componentes
electrónicos de control conectados eléctricamente al motor para
controlar el motor para mover la extremidad del paciente para
aplicar un régimen de carga a intervalos al tejido cartilaginoso de
interés.
La carga in vivo de la articulación se
realiza mediante un dispositivo que abarca la articulación
diartródica en cuestión. Por ejemplo, para la rodilla, el equipo
abarca la distancia desde la cadera hasta la punta del pie, con las
restricciones correspondientes para mantener la pierna en extensión.
El dispositivo incluye un mecanismo de contracción por el que el
cartílago condilar femoral puede yuxtaponerse sobre el cartílago de
la meseta tibial a través del menisco a una frecuencia de entre 0,1
y 10 Hz y generará presiones en el intervalo de 1 a 20 MPa para
intervalos prescritos de entre 1 y 8 horas, más aproximadamente de 4
horas por día a una actividad diaria normal.
El componente principal de cargas mecánicas a
las que están expuestos los condrocitos articulares en el interior
de la matriz extracelular del cartílago articular es la presión
hidrostática. La carga normal de las articulaciones durante
actividades diarias provoca que el cartílago articular esté expuesto
a altos niveles de presión hidrostática intermitente. Los estudios
descritos en esta sección demuestran que condrocitos osteoartríticos
mantenidos in vitro responden a una presión hidrostática
aplicada aumentando una actividad metabólica positiva y disminuyendo
la expresión de enzimas destructoras.
El efecto de una presión hidrostática
intermitente sobre la síntesis de proteínas de la matriz
cartilaginosa en condrocitos articulares humanos adultos aislados
se centró en la expresión de ARNm de colágeno de tipo II, agrecano y
otras proteínas degradantes y promotoras del crecimiento, tales como
MMP-2, TGF-\beta,
MCP-1 y FGF-1. Se observan
resultados de estos estudios en las Figuras 2-7.
En esta serie de estudios, la expresión de ARNm
de agrecano, colágeno de tipo II, MMP-2,
TGF-\beta, MCP-1 y
FGF-1 de condrocitos humanos normales sanos y
osteoartríticos estimulados con 1 MPa o 10 MPa de presión
hidrostática durante 5 minutos o 4 horas durante 4 días se comparó
con la expresión de ARNm en los controles. Cuando la carga se
realizó a modo de respuesta a una dosis que oscila entre 1, 5 y 10
MPa, cara a cara, la presión hidrostática limitada a 5 minutos
intermitentes o a 4 horas intermitentes por día a una presión de 1
MPa y 10 MPa, se observó que la señal de ARNm de agrecano aumentaba
con cargas de 1 MPa, 5 MPa y 10 MPa, como se observa en la Figura
2.
Los resultados que se observan en la Figura 2
confirman claramente que el régimen actual de carga a intervalos da
como resultado una expresión genética aumentada de agrecano y de
colágeno de tipo II. El agrecano es el proteoglicano agregante
grande y más abundante que desempeña un papel fundamental
impartiendo resistencia a la compresión al cartílago articular y
permitiendo que persista el soporte de carga. El colágeno de tipo
II proporciona al tejido resistencia a la tracción. El tratamiento
de la invención conduce, por lo tanto, a una resistencia aumentada
del cartílago y a la capacidad de soportar cargas mayores.
La Figura 3 muestra los efectos de una carga a
intervalos de 4 horas durante 4 días con 10 MPa de presión
hidrostática intermitente (IHP) sobre la expresión de señal de ARNm
de agrecano y colágeno de tipo II, expresados como una proporción
entre agrecano o colágeno de tipo II y proteína intracelular de
referencia \beta-actina en condrocitos articulares
humanos osteoartríticos.
Estos resultados confirman claramente que la
expresión tanto de agrecano como de colágeno de tipo II, las
proteínas macromoleculares fundamentales de la matriz extracelular
del cartílago, aumentó en las células cartilaginosas osteoartríticas
humanas dañadas después del tratamiento de IHP.
Como se observa en las Figuras 3A y 3B, la
aplicación de una presión hidrostática intermitente dio como
resultado una proporción aumentada de producción de señal de
agrecano respecto a \beta-actina de
aproximadamente 0,1 a aproximadamente 0,5, es decir, un aumento de
aproximadamente 5 veces. La proporción de señal de colágeno de tipo
II respecto a \beta-actina aumentó aún más, de
aproximadamente 0,01 a aproximadamente 0,12, como se observa en la
Figura 3B.
También se estudió el análisis
inmunohistoquímico del efecto de la presión hidrostática sobre los
condrocitos. La inmunohistoquímica proporciona un índice de la
respuesta a la matriz extracelular a cargas mecánicas. Con las
condiciones de carga descritas anteriormente, el análisis
inmunohistoquímico demostró que la aplicación de una presión
hidrostática aumentaba la deposición de proteoglicano y de colágeno
en la matriz extracelular (no se muestran los datos).
Para estudiar si la IHP puede tener también
efectos sobre la expresión de deleciones moleculares del cartílago,
se realizaron una serie de experimentos para evaluar la liberación y
la carga a intervalos eficaz de proteasas y factores de
crecimiento.
El efecto de una carga a intervalos con presión
hidrostática intermitente sobre la inhibición de la expresión de
ARNm de metaloproteinasa de la matriz se determinó ensayando los
efectos de la presión hidrostática en las mismas condiciones que se
describen en la Figura 2.
Los resultados se observan en la Figura 4, que
muestra los efectos de una carga a intervalos con diferentes
magnitudes de presión hidrostática intermitente sobre la liberación
de metaloproteinasa 2 de la matriz por condrocitos articulares
humanos normales.
La metaloproteinasa 2 de la matriz
(MMP-2) es una de varias enzimas que se sabe que
están asociadas con la degeneración cartilaginosa en una
articulación dañada. La reducción de los niveles de esta enzima
después de la aplicación de IHP a 10 MPa durante 4 horas durante 4
días muestra que se está produciendo la reparación y la
regeneración de la matriz extracelular. El análisis zimográfico, que
se observa en la Figura 4B, de la expresión de metaloproteinasa
neutra, demostró que la APMA sometida a una presión hidrostática
intermitente durante 4 horas seguida de 20 horas de recuperación
durante 4 días disminuyó los niveles de actividad
gelatinolítica.
El factor de crecimiento transformante \beta1
(TGF-\beta1) se sabe que está implicado en los
cambios metabólicos asociados con la resorción acelerada de la
matriz que se produce, por ejemplo, en la osteoartritis, en la que
están activadas las rutas tanto anabólicas como catabólicas del
metabolismo del agrecano. Por lo tanto, el
TGF-\beta1 afecta a la homeostasis del
cartílago.
El papel del TGF-\beta1 es más
pronunciado en células progenitoras, tales como, por ejemplo, la
región perióstica circundante del hueso. Los efectos directos del
TGF-\beta1 sobre células cartilaginosas aisladas
varían dependiendo del nivel de proteína producida, ya que presenta
acciones pleiotrópicas de células diferentes. La adición de
TGF-\beta1 a células cartilaginosas articulares en
cultivo disminuye la expresión de colágeno de tipo II que es
contraproducente para la producción de matriz.
La Figura 5 muestra los efectos de una carga a
intervalos con diferentes magnitudes de presión hidrostática
intermitente sobre la liberación de TGF-\beta1 por
condrocitos articulares humanos normales.
El efecto de una presión hidrostática
intermitente sobre la liberación de TGF-\beta que
se observa en la Figura 5 significa que el metabolismo celular está
modulado por el estímulo mecánico. La producción disminuida de este
factor de crecimiento está claramente acoplada a otros cambios del
metabolismo celular.
Como se observa en la Figura 5, la aplicación de
IHP durante 4 horas a 10 MPa da como resultado una disminución de
la liberación de TGF-\beta por condrocitos
normales demostrando que la síntesis proteica disminuye con una
presión mayor (10 MPa) aplicada de manera intermitente durante
periodos más prolongados. Estos resultados establecen que la
estimulación de IHP influencia de manera diferencial el estado
metabólico de los condrocitos de un modo dependiente del tiempo y
de la dosis. Como se observará a continuación, se observaron
resultados similares después de la estimulación de IHP de células de
tipo osteoblástico.
La Figura 6 muestra los efectos de una carga a
intervalos con diferentes magnitudes de presión hidrostática
intermitente sobre la liberación de proteína quimioatrayente de
macrófagos 1 (MCP-1) por condrocitos articulares
humanos normales.
La MCP-1 representa una de
varios mediadores por inflamatorios que influyen en el estado inmune
de los tejidos. Una disminución de MCP-1 en los
condrocitos es significativa como marcador de un cambio en el
metabolismo celular y en la finalización de los procesos
inflamatorios que acompañan a la degeneración o lesión del
cartílago. La liberación de MCP-1 se asocia
normalmente con el reclutamiento de monocitos y macrófagos, las
células del sistema inmune, que desempeñan un papel en la
destrucción tisular. Esta expresión disminuida señala una mejora de
la lesión del cartílago.
Como se observa en la Figura 6, la liberación de
MCP-1 por condrocitos articulados humanos normales
disminuye significativamente, aproximadamente 8 veces, después de la
aplicación de IHP a 10 MPa durante 4 horas.
La disminución observada en la liberación de
MCP-1 demuestra claramente que el mecanismo
antiinflamatorio o anti-lesión del cartílago está
menos activado, acarreando, por lo tanto, un menor grado de
degeneración y destrucción cartilaginosa.
Para determinar si la disminución de la
liberación de MMP-1, MMP-2 o
TGF-\beta después de IHP es selectiva para
aquellas proteínas implicadas en la degeneración cartilaginosa, se
realizaron estudios con factor de crecimiento de fibroblastos 1,
que no está implicado en tales procesos y que, por lo tanto, no
debería reaccionar a la IHP. Los resultados se observan en la Figura
7.
La Figura 7 demuestra la ausencia de un efecto
de la aplicación de carga a intervalos con diferentes magnitudes de
presión hidrostática intermitente sobre el factor de crecimiento de
fibroblastos 1 (FGF-1) por condrocitos articulares
humanos normales.
La Figura 7 demuestra que no todos los factores
de crecimiento responden a una presión hidrostática intermitente
sino solamente los factores que están implicados en la degeneración
o la regeneración cartilaginosa. La Figura 7 también demuestra que
los condrocitos no se están dañando por la IHP y que la liberación
disminuida de MMP-2, TGF-\beta y
MMP-1 se debía al cartílago dañado.
El objetivo de los estudios descritos en las
Figuras 2-7 era investigar si la aplicación de una
presión hidrostática intermitente sobre cartílago acarrea cambios
en la síntesis proteica de la matriz en condrocitos articulares
humanos adultos aislados.
Las Figuras 2-7 muestran de
manera acumulativa que una carga excesiva o insuficiente (5 minutos
a 10 MPa o 4 horas a 1 MPa) del cartílago articular no proporciona
un estímulo suficiente para la reparación y regeneración
cartilaginosa y, en algunos casos, puede incluso conducir a una
degeneración aumentada y a la pérdida de la función. Los resultados
que se observan en las Figuras 2-7 confirman que
existe una correlación entre la IHP y entre la aparición de cambios
beneficiosos en los procesos metabólicos de los condrocitos que
conducen a la regeneración cartilaginosa.
La rehabilitación de la función articular
depende de la reparación y de la regeneración del cartílago dañado.
Una diversidad de procedimientos experimentales descritos
anteriormente confirman que la carga mecánica influye en la
síntesis de componentes de la matriz extracelular de los condrocitos
articulares, es decir, de agrecano y de colágeno de tipo II. Sin
embargo, hasta ahora no se había demostrado que existiera una
conexión clara para la modulación inducida mecánicamente de la
expresión génica de la matriz cartilaginosa que establezca que la
estimulación de IHP mecánica sirve como impulso para la reparación y
la regeneración cartilaginosa. Los resultados descritos
anteriormente hacen posible la intervención terapéutica in
vitro y ex vivo.
Los estudios iniciales que condujeron a esta
invención han demostrado que la presión hidrostática aplicada de
manera continua no conduce a la reparación y regeneración
cartilaginosa, medida por el aumento o disminución de las
actividades metabólicas de la síntesis proteica pertinente. Dicha
presión, aplicada durante un corto periodo de tiempo, dio como
resultado una expresión aumentada de ARNm de colágeno de tipo II,
mientras que la carga aplicada de manera continua no mantuvo dicho
expresión aumentada. Por otro lado, la expresión de señal de
agrecano continuó aumentando durante toda la duración de la
carga.
Los estudios documentados en la sección II han
demostrado que existe una correlación entre la IHP y los procesos
metabólicos de los condrocitos.
Los estudios descritos en esta sección
investigaron los efectos dependientes del tiempo de la IHP sobre la
expresión de ARNm de colágeno de tipo II y de agrecano en
condrocitos articulares normales de bovinos adultos in
vitro.
El propósito de este estudio era ensayar si la
presión intermitente aplicada a condrocitos potencia los niveles de
ARNm de colágeno de tipo II y de agrecano sin estimular el ARNm de
colágeno de tipo I. El procedimiento experimental se basaba en el
uso de RT-PCR para la cuantificación relativa de los
niveles de ARNm de colágeno y de agrecano con respecto al ARNm de
beta-actina como señal de referencia interna.
Específicamente, este estudio examinó los
efectos de dos tipos de regímenes de carga de presión hidrostática
intermitente sobre la expresión de ARNm de colágeno de tipo II y de
agrecano en condrocitos articulares adultos normales. Los
condrocitos se aislaron de acuerdo con el Ejemplo 1. Un sistema para
la carga cuantitativa de condrocitos articulares adultos usaba un
cultivo en monocapa de alta densidad (1,75 x 10^{5}
células/cm^{2}) o grupos de células agregadas.
La carga de las células con presión hidrostática
intermitente se realizó en un patrón continuo durante un periodo de
24 horas o como una carga a intervalos, aplicándose la carga durante
cuatro horas por día de acuerdo con el Ejemplo 3. La respuesta
metabólica de los condrocitos articulares se determinó usando
ensayos semicuantitativos de reacción en cadena de la polimerasa
con trascripción inversa (RT-PCR) para determinar la
señal de ARNm de colágeno de tipo II, agrecano y
beta-actina. Los resultados se observan en las
Figuras 8-12.
La Figura 8 es un gráfico que muestra los
niveles de señal de RT-PCR para la expresión de
colágeno de tipo II y de tipo I y de beta-actina en
cultivos de condrocitos de alta actividad sin carga mantenidos
durante los periodos de ensayo señalados de 2-24
horas.
La Figura 9 muestra los niveles de señal para la
expresión de beta-actina en células expuestas a IHP
y en células de control sin carga.
La Figura 8 muestra los niveles de señal
determinados por RT-PCR para la expresión de
colágeno de tipo II y de \beta-actina en células
de control obtenidas sin estimulación a 2, 4, 8, 12 y 24 horas de
acuerdo con el Ejemplo 3. Las condiciones de RT-PCR
fueron las descritas en el Ejemplo 4.
La Figura 8 demuestra que los niveles de señal
de RT-PCR para la expresión de colágeno de tipo II y
de tipo I y de \beta-actina en células de control
sin carga son claramente detectables y no varían.
Los condrocitos articulares sembrados en placas
y mantenidos como cultivos en monocapa de alta densidad a presión
atmosférica (cultivos de control sin carga) no presentaron
variaciones significativas con respecto a los niveles de señal para
ARNm de colágeno de tipo II o ARNm de
\beta-actina. Estas observaciones continuaron
siendo ciertas durante un transcurso de tiempo de 2, 4, 8, 12 y 24
horas, como se observa en la Figura 8.
Para determinar una señal de ARNm de referencia
que no variara en respuesta a la IHP aplicada y, por lo tanto, que
proporcionara un punto de referencia para la comparación, se
seleccionó la \beta-actina debido a su abundancia
relativa de ARNm y por su localización.
La Figura 9 muestra los niveles de señal de
RT-PCR para la expresión de
\beta-actina en células expuestas a una presión
hidrostática intermitente y en células de control sin carga.
Como se observa en la Figura 9, la exposición de
condrocitos a presión hidrostática intermitente no alteró los
niveles de señal de ARNm de \beta-actina durante
un transcurso de tiempo de 2, 4, 8, 12 y 24 horas en comparación con
las células de control sin carga.
Por el contrario, la aplicación de IHP a
condrocitos normales en cultivo en monocapa o en cultivo agregado
demostró que la señal de ARNm de colágeno de tipo II no era muy
marcada a periodos de carga de 4 y 8 horas y disminuía a partir de
entonces. Por otro lado, el ARNm de agrecano, en las mismas
condiciones, ha demostrado un perfil diferente y continuaba
aumentando durante 24 horas.
Los resultados relativos a la expresión de
colágeno de tipo II provocaron el estudio de una aplicación de carga
a intervalos en el que se aplicaba IHP durante periodos de 4 horas
seguidos de un periodo de recuperación.
Los agregados de cultivo de condrocitos se
expusieron a una presión hidrostática intermitente usando una
aplicación de carga continua durante un periodo de veinticuatro
horas. Los resultados se observan en las Figuras 10 y 11.
La Figura 10 muestra los niveles de señal de
RT-PCR para agrecano después de la exposición de
cultivos en monocapa de alta densidad a una presión hidrostática
intermitente usando una carga a intervalos de 4 horas por día
seguidos de una recuperación de 20 horas durante 4 días.
La Figura 11 muestra los niveles de señal de
RT-PCR para colágeno de tipo II después de la
exposición de cultivos en monocapa de alta densidad a una presión
hidrostática intermitente usando una carga a intervalos de 4 horas
por día seguidos de una recuperación de 20 horas durante 4 días.
En estas condiciones de aplicación de carga, el
nivel de señal del ARNm de agrecano aumentó aproximadamente 4 veces
respecto a los controles sin carga (Figura 10). El cambio del
protocolo de carga acarreó un aumento de aproximadamente siete
veces en la señal de ARNm de colágeno de tipo II respecto a los
controles sin carga (Figura 11).
Los resultados de los estudios descritos
anteriormente e ilustrados en las Figuras 8-11
demostraron que los condrocitos respondían a un protocolo de carga
cambiado por un patrón que incluía la exposición a una presión
hidrostática intermitente durante 4 horas seguida de un periodo de
veinte horas de recuperación, y la señal de RT-PCR
atribuible al ARNm de tipo II aumentó significativamente respecto a
la señal que representaba el ARNm de \beta-actina.
La señal de ARNm de agrecano también aumentó.
Estos datos muestran que la carga de IHP
mecánica con un tipo apropiado de estímulo sirve para modular la
expresión de macromoléculas de la matriz de los condrocitos
articulares. Los resultados obtenidos confirman que la aplicación
de regímenes de carga específicos facilita la reparación y la
regeneración de cartílago articular y contribuye a la producción con
éxito de compuestos de injertos de cartílago transplantables.
Los efectos documentados de la presión
hidrostática sobre los condrocitos demuestran que los regímenes de
carga específicos proporcionan un estímulo eficaz para modular la
síntesis de macromoléculas de la matriz extracelular cartilaginosa
y para iniciar reacciones relacionadas con la reparación y la
regeneración de cartílago dañado y de colágeno de tipo II.
La carga mecánica generada durante las
actividades normales de soporte de peso contribuye a la estructura
y función óseas a través de un ciclo específico que implica
formación osteoblástica y resorción osteoblástica. El mantenimiento
de la homeostasis ósea normal en respuesta a una historia de carga
implica a varias hormonas, citocinas y factores de crecimiento.
Después de los descubrimientos descritos
anteriormente, este estudio investigaba si la presión hidrostática
intermitente (IHP) modula la expresión del factor de crecimiento
pleiotrópico, concretamente, del factor de crecimiento
transformante beta 1 (TGF-\beta1) en células
MG-63 y HOS TE85, y si funciona como una señal
mecánica para la modulación del metabolismo de células óseas. Con
este fin, se ensayó el efecto de IHP sobre la expresión
osteoblástica de TGF-\beta1, que se sabe que
influye en la proliferación de osteoblastos y en la expresión
fenotípica de proteínas específicas del hueso. Además, se estudió la
expresión de metaloproteinasa de la matriz
MMP-2.
Los resultados se observan en las Figuras
12-14. Las Figuras 12-14 ilustran el
efecto de IHP sobre la producción proteica de
TGF-\beta o la expresión de MMP-2
en células de tipo osteoblástico MG-63.
La Figura 12 muestra el análisis del transcurso
de tiempo para la liberación de TGF-\beta1 por
células MG-63 expuestas a IHP de 10 MPa. La Figura
13 muestra los efectos en respuesta a la dosis de IHP sobre la
liberación de TGF-\beta1 por células
MG-63. La barra y la línea vertical de las Figuras
12 y 13 representan las medias \pm DT, respectivamente (n = 3), p
< 0,05 en comparación con el control.
La concentración proteica de
TGF-\beta1 en el medio condicionado de
MG-63 se examinó por ELISA. Con células
MG-63, no se observó ningún cambio significativo en
la liberación de TGF-\beta1 después de una
exposición de 12 horas a IHP, como se muestra en la Figura 12. Sin
embargo, como también se observa en la Figura 12, la aplicación de
IHP durante 24 y 48 horas disminuyó la liberación de
TGF-\beta1 por las células MG-63
en un 65% (p < 0,05) y un 53% (p < 0,05), respectivamente,
respecto a las células sin carga. Se observaron resultados similares
para las células HOS TE85 (no se muestran los datos).
Una segunda serie de estudios que se observan en
la Figura 13 investigaron el efecto en respuesta a la dosis de IHP
sobre la expresión de TGF-\beta1 con células
MG-63. Una exposición de 12 horas a IHP a un nivel
de 1 y 10 MPa no alteró la liberación de
TGF-\beta1. Después de una aplicación de 24 horas
de IHP a 1 MPa o a 10 MPa, como se observa en la Figura 13, se
inhibió la liberación de TGF-\beta1 al medio en un
23% y en un 31%, respectivamente, en comparación con las células sin
carga.
La Figura 14 representa un análisis del
transcurso de tiempo para la liberación de MMP-2
(pg/ml) por células MG-63 expuestas a IHP,
cuantificada por ELISA.
La Figura 20 muestra la cuantificación de la
liberación de MMP-2 al medio condicionado usando
ELISA. Se observó un patrón similar en el análisis zimográfico (no
se muestran los datos). Como se observa en la Figura 20, después de
24 y de 48 horas de exposición a IHP, la liberación de
MMP-2 se inhibió significativamente, en un 46% y un
28%, respectivamente, respecto a los controles. La aplicación de IHP
en las mismas condiciones también disminuyó la liberación de
TIMP-1 al medio condicionado de las células de tipo
osteoblástico. Después de 24 y de 48 horas de exposición a IHP, la
liberación de TIMP-1 se inhibió significativamente
en un 63% y en un 29%, respectivamente, respecto a las células sin
carga. No se detectó MMP-1 ni MMP-9
en las muestras de medio de células expuestas a IHP o de células
sin carga en cualquier periodo de tiempo (no se muestran los
datos).
El análisis zimográfico ilustrado demostró que
MMP-2 era la metaloproteinasa de la matriz más
importante liberada por las MG-63. En presencia de
IHP, la zimografía demostró una inhibición de la liberación de la
forma latente de 72 kD de MMP-2 y de las dos formas
activadas, de 68 kD y de 62 kD, en muestras de medio de células
expuestas a IHP durante 24 y 48 horas, en comparación con muestras
de células sin carga.
El método terapéutico de la invención es útil en
los campos de la cirugía ortopédica, la reumatología, y la medicina
deportiva y de rehabilitación. El método de la invención permite la
formación de novo y la regeneración de cartílago dañado o
lesionado, en particular de cartílago articular. El método también
permite la regeneración ex vivo de cartílago o de injertos
de cartílago utilizables extirpados de la articulación dañada o
lesionada, la regeneración de dicho cartílago o injerto hasta un
grado en el que se restauran las propiedades tanto mecánicas como
bioquímicas del cartílago hasta sus niveles normales y la
reimplantación del injerto en la articulación una vez que se
restaura la matriz de colágeno cartilaginosa. Además, el método
permite el tratamiento in vitro de células cartilaginosas y
óseas y de cultivos celulares para dar tejido funcional adecuado
para transplante y la formación de novo y la producción de
cartílago sano que funcione normalmente y otras células derivadas
del mesénquima.
Este ejemplo describe el procedimiento usado
para el aislamiento de condrocitos.
Los condrocitos articulares de bovinos adultos
se aislaron a partir de cartílago de grosor completo extirpado de
las articulaciones radiocarpales recién obtenidas en un matadero
local.
Las células de cartílago se liberaron de la
matriz mediante incubación en 15 ml de medio de Eagle modificado
por Dulbecco (DMEM) que contenía gentamicina (50 \mug/ml) y una
mezcla de colagenasas bacterianas, de tipo II y de tipo IV,
(Worthington, Freehold, NJ) a una concentración final de 0,6 mg/ml
cada una en 15 ml de medio de Eagle modificado por Dulbecco/F12 de
Ham (DMEM/F12, Gibco BRL, Grand Island, NY) que contenía 25
\mug/ml de gentamicina (Sigma, St. Louis, MO). Las muestras de
cartílago se incubaron durante un total de 18 horas a 37ºC en
CO_{2} al 7,5% y humedad del 100% para asegurar una digestión
completa. Los condrocitos liberados de la matriz se filtraron a
través de un filtro de malla de nailon para aislar células
individuales. Las células se recogieron posteriormente mediante
centrifugación repetida a 600 x g, resuspendiéndose las células y
recogiéndose en solución salina tamponada con fosfato de Dulbecco (3
x 50 ml).
Se suspendió un sedimento celular final en el
medio DMEM/F12 sin suero y se contaron las células en un
hemocitómetro evaluando la viabilidad mediante exclusión de azul
tripán. La viabilidad normal obtenida para los condrocitos en estas
condiciones fue mayor del 95%.
Los condrocitos se sembraron después en placas
de tejido de 60 mm y los cultivos se mantuvieron a 37ºC en una
atmósfera humidificada de CO_{2} al 7,5% en aire. Para la adhesión
en condiciones sin suero, las placas individuales se pretrataron
durante una noche con poli-D-lisina
(Sigma, 0,1 mg/ml) y se lavaron dos veces con PBS sin calcio ni
magnesio. Las células se sembraron en placas a una densidad de 1 x
10^{5} células/cm^{2}.
Este ejemplo describe una composición de medio
que contiene suero o sin suero.
El medio de Eagle modificado por Dulbecco que
contiene suero (DMEM) contenía suero fetal bovino dializado
inactivado por calor a una concentración del 10% v/v. El medio sin
suero consistía en una mezcla 1:1 de F12 de Ham/DMEM suplementado
con selenio y liposomas. Los liposomas se prepararon disolviendo
lecitina, colesterol, esfingomielina y acetato de vitamina E en 1
ml de cloroformo/metanol 2:1 (vol/vol) que se seca en N_{2}. Se
añadió un ml de DMEM/F12 y después se sonicó la mezcla lipídica 3
veces durante intervalos de 3 minutos cada una, usando una
micropunta con un coeficiente de utilización del 70%. Esta solución
madre de liposomas se realizó a una concentración final de 1000 x,
se conservó en N_{2} y se almacenó a 4ºC. En algunos experimentos,
se añadió ascorbato al medio a una concentración de 50
\mug/ml.
Este ejemplo describe el protocolo de carga y
las condiciones para aplicar una presión hidrostática
intermitente.
Se aplicó de manera cíclica una presión
hidrostática a una dosis de carga de 10 MPa y a una frecuencia de 1
Hz. La presión hidrostática intermitente se aplicó retirando las
células a periodos de 2, 4, 8, 12 y 24 horas, o mediante un
protocolo de carga a intervalos retirando las células después de un
periodo de 4 días durante los que se aplicó una presión
hidrostática intermitente durante y limitada a 4 horas por día
seguidas de 20 horas de recuperación. Esto se repitió diariamente
durante 4 días o más. Cada punto temporal experimental se ensayó por
triplicado y cada experimento se realizó para un mínimo de tres
ensayos independientes.
La presión se generó con un recipiente de
presión de acero inoxidable disponible en el mercado conectado con
un instrumento de carga servohidráulica, que se observa en la Figura
1. El diseño facilitaba la evacuación completa del aire del sistema
de tal modo que la aplicación de presión era simplemente
hidrostática. Las placas de cultivo se cargaron en el interior de
bolsas estériles selladas por calor que contenían cuarenta y cinco
ml de medio de cultivo (DMEM/F12 1:1 con HEPES 30 mM ajustado a pH
7,4 para la estabilidad del pH en ausencia de dióxido de
carbono).
El control de la temperatura se consiguió
mediante la inmersión parcial del recipiente de carga hidrostática
en un baño de agua circulante y mantenida a 37ºC. No se produjo
ningún cambio medible en la temperatura durante periodos de carga
de hasta 96 horas. Los cultivos de control se mantuvieron en
condiciones idénticas en bolsas selladas por calor y se colocaron
en un recipiente idéntico colocado en el mismo baño de agua de
temperatura controlada que los cultivos cargados.
Este ejemplo describe el procedimiento usado
para el análisis de los niveles de señal de ARNm de agrecano y de
colágeno de tipo II por RT-PCR.
Para permitir ensayar múltiples muestras para
cada condición de carga, se usó un procedimiento experimental que
usa RT-PCR semicuantitativa para analizar los
niveles de señal de ARNm de agrecano y de colágeno de tipo II, como
se describe en J. Orthop. Res., 15: 94. El ARN total de las
células expuestas a una presión hidrostática intermitente y de las
células sin carga se extrajo de las células mediante el método del
isotiocianato de guanidina descrito en Biochemistry, 18:
5296 (1979) con un reactivo triple disponible en el mercado (Sigma,
St. Louis, MO). Un rendimiento típico de ARN celular por placa de 60
mm era de 5 microgramos.
Todas las preparaciones de ARN se examinaron de
manera rutinaria en geles de agarosa para determinar la integridad
del ARN ribosómico. Las concentraciones de ARN total se determinaron
por espectrofotometría y se ajustaron a 200 ng/ml para la
trascripción inversa usando cebadores de hexámeros aleatorios. La
muestra de ARNm se convirtió en ADNc de cadena sencilla usando
transcriptasa inversa m-MLV
(Gibco-BRL) en presencia de inhibidor de ARNasa
(5-Prime, 3-Prime, Inc., Boulder,
Co.) y en presencia de dNTP 500 \muM (Perkin Elmer Cetus, Norwalk,
CT). La reacción se realizó a 37ºC durante 15 minutos, 42ºC durante
10 minutos, 47ºC durante 10 minutos y finalmente se aumentó a 99ºC
para inactivar la transcriptasa inversa. La mezcla de reacción se
diluyó 10 x y se usó para PCR.
Las secuencias diana en las muestras de ADNc
transcritas inversamente se amplificaron por PCR, usando cebadores
de oligonucleótidos específicos de secuencia diseñados para producir
secuencias de aproximadamente 200 pb que abarcan diferentes exones
dentro de los genes del agrecano (Anal. Biochem., 225: 356
(1995)) y del colágeno de tipo II (Arch. Biochem. Biophys.,
314: 90 (1994)). Los conjuntos de cebadores para el agrecano y el
colágeno de tipo II se basaron en los datos de secuencia publicados
para estos genes.
Los análisis del tamaño del ADN y la
secuenciación de ADN de los productos específicos determinaron la
validez de los productos generados usando los conjuntos de
cebadores.
La PCR se realizó con 1,0 \mul de ADNc en un
tubo de reacción de 0,5 ml que contenía 1,5 \mul de mezcla madre
de PCR; la reacción se inició a 65ºC para evitar hibridaciones
inespecíficas. La mezcla madre de PCR contenía Tris HCl 125 mM,
amoniaco 50 mM, cada uno de los cebadores cadena abajo y cadena
arriba y ADN polimerasa Tf1 a 0,625 U/ml (Epicentre Technologies,
Madison, WI). Se añadió
^{32}P-\alpha-dCTP a 3.000
Ci/mmol (Amersham NEN-Corp.) a la mezcla madre para
obtener una concentración final de 0,1 mCi/ml para el radiomarcaje
aleatorio de los productos amplificados. El volumen de reacción
total al comienzo de la PCR era de 2,5 ml.
Para la comparación de la expresión relativa, se
añadieron 0,5 ml de una solución de cebadores que contenía 900 nM de
un conjunto de cebadores de oligonucleótidos para la amplificación
de la región 3' no traducida de la \beta-actina,
Tris HCl 50 mM, sulfato de amonio 20 mM y cloruro magnésico 1,5 mM
en el décimo ciclo y se amplificó en el mismo tubo de reacción. La
señal de ARNm de \beta-actina sirvió como un
control interno para controlar las variaciones entre tubos en las
condiciones de amplificación y las diferencias en la concentración
inicial o la carga del ADNc. El programa de termociclado incluía un
ciclo de 95ºC durante 3 minutos para el calentamiento inicial,
seguido de ciclos repetidos de 95ºC durante 1 minuto y 65ºC durante
1 minuto. La elongación final se realizó a 72ºC durante 5 minutos.
El número total de ciclos empleados en este estudio fue de 30 ciclos
para agrecano y colágeno de tipo II y de 26 ciclos para
\beta-actina.
Los productos amplificados por PCR se separaron
en geles de poliacrilamida al 5% y los geles se analizaron
directamente usando el PhosphoImager (Molecular Dynamics, Sunnyvale,
CA.). La expresión relativa del ARNm se expresó como niveles de
señal específicos y como una proporción de la señal del agrecano y
del tipo II respecto a la señal de
\beta-actina.
Este ejemplo describe los detalles de los
métodos estadísticos usados para la evaluación de los resultados
obtenidos en los Ejemplos 3 y 4.
La significación de las diferencias entre
muestras cargadas y sin carga se examinó usando el método lineal
general de una corrección para ensayos de comparación múltiple
((SAS, Gary, NC).
La determinación de los niveles de señal de ARNm
mediante técnicas de RT-PCR semicuantitativas
proporcionó suficientes diferencias entre muestras tratadas y no
tratadas de tal modo que se consiguió un nivel de potencia para
determinar la significación a p < 0,05 con cinco ensayos
independientes. En el caso de la cuantificación de ARNm, la
hipótesis que se ensayaba era que se producía un cambio en la
expresión génica de la matriz relativo a la expresión de
\beta-actina. Se determinó que la expresión de
\beta-actina no variaba en respuesta a una
presión hidrostática intermitente. Esto permitió usar un ensayo t
para muestras relacionadas para ensayar la significación de las
diferentes muestras de cultivo.
Este ejemplo describe el procedimiento usado
para preparar cultivos celulares de osteoblastos humanos.
Las células de tipo osteoblástico humanas,
MG-63 y HOS TE85, se adquirieron en la Colección
Americana de Cultivos Tipo (Manassas, Virginia).
Las células se cultivaron en placas de 60 mm con
medio esencial mínimo alfa (alfa-MEM) (Gibco, Gran
Island, NY) que contenía suero fetal bovino al 10% (Gibco) y
antibióticos y antimicóticos (Gibco; penicilina 100 U/ml,
estreptomicina 100 \mug/ml, anfotericina B 0,25 \mug/ml) a 37ºC
en una atmósfera de aire que contenía CO_{2} al 5%.
Se incubaron cultivos confluentes durante 24
horas adicionales en ausencia de suero para establecer una detención
del crecimiento. El medio de cultivo se retiró y cada placa de
cultivo se colocó en una bolsa sellada por calor que contenía 40 ml
de alfa-MEM sin suero suplementado con BSA al 0,1%,
HEPES 15 mM, ácido ascórbico (50 \mug/ml) y
Na-\beta-glicerolfosfato (10 mM).
Las bolsas selladas por calor se sumergieron en un recipiente de
alta presión relleno con agua y se aplicó IHP (1 ó 10 MPa a una
frecuencia de 1 Hz).
Se mantuvieron cultivos de control a presión
atmosférica. Tanto el recipiente de presión como los cultivos de
control sin carga se mantuvieron a presión atmosférica. Tanto el
recipiente de presión como los cultivos de control sin carga se
mantuvieron en el baño de agua durante el periodo de ensayo para
mantener la temperatura 37ºC. Las muestras de medio de cultivo se
recogieron a los periodos de tiempo especificados en las leyendas de
las Figuras 13-18 y se almacenaron a -20ºC hasta su
uso.
Para estudiar la estabilidad del ARNm, se
disolvió actinomicina D (2,5 mg/ml) en metanol y se aplicó a los
cultivos a una concentración final de 5 \muM.
Los condrocitos humanos se obtuvieron de la
misma forma pero se pretrataron con tripsina 0,1 mg/ml para eliminar
proteasas e inhibidores de colágeno.
Este ejemplo describe un método usado para la
medición del nivel proteico de TGF-\beta en el
medio.
Se adquirieron parejas combinadas de anticuerpos
contra TGF-\beta1 en R & D Systems
(Minneapolis, MN). Se activó el TGF-\beta1 latente
en el medio condicionado mediante HCl 1 N y las muestras de medio
condicionado se neutralizaron mediante la adición de NaOH 1,2
M/tampón HEPES 0,5 M. La TGF-\beta1 total se midió
usando ensayos inmunoabsorbentes ligados a enzimas (ELISA). Todas
las muestras se analizaron por triplicado. Las densidades ópticas se
determinaron en un lector de ELISA a 450 nM con corrección por señal
de fondo a 595 nM.
Este ejemplo describe las condiciones usadas
para el análisis de transferencia de Northern de
TGF-\beta.
Se extrajo el ARN total de las células.
Para una análisis de transferencia de Northern,
se desnaturalizaron 10 \mug de ARN total y se fraccionaron en un
gel de agarosa al 1% con formaldehído 1,1 M y se tiñó con bromuro de
etidio para determinar la integridad de las bandas 28S y 18S. Se
realizó la transferencia a una membrana de nailon mediante métodos
convencionales. Las membranas se hibridaron con sondas de ADNc
marcadas con ^{32}P para TGF-\beta1 (ATCC) y
GAPDH (ATCC).
Se analizó la radioactividad de cada sonda
hibridada usando un PhosphorImager (Molecular Dynamics, Sunnyvale,
CA)
Este ejemplo describe el método para el análisis
estadístico de los estudios descritos en los Ejemplos 7 y 8.
La significación entre grupos tratados y de
control se determinó usando ANOVA y ensayo t de Student para dos
muestras no relacionadas (de dos colas) usando la aproximación de
Bonferroni para comparaciones múltiples. Todos los valores se
proporcionan como las medias \pm DT. Los resultados de
transferencia de Northern se expresaron como una proporción de la
señal de ARNm diana (TGF-\beta1) sobre la señal
ARNm constitutiva (GAPDH): Las diferencias en las proporciones de
ARNm observadas con y sin tratamiento de IHP se evaluaron usando el
ensayo U de Mann-Whitney con una p < 0,05 que
representa la significación.
Este ejemplo describe las condiciones usadas
para zimografía.
Las muestras de medio se activaron mediante
incubación en acetato de 4-aminofenilmercurio 1,0 mM
(APMA) durante una hora a 37ºC. Las muestras se mezclaron
posteriormente con tampón de muestra y se corrieron en geles de
SDS-poliacrilamida al 10% impregnados con gelatina 1
mg/ml. Los geles se lavaron con agua y se empaparon durante una
hora con Triton X-100 al 2,5% en agua. Después de
una exposición de dieciséis horas a 37ºC en tampón de sustrato
(Tris-HCl 0,05 M, pH 8,0, CaCl_{2} 5 mM) los geles
se tiñeron con azul de Coomassie R-250 en etanol al
30% y ácido acético al 10%, y después se destiñeron en agua para
visualizar la actividad gelatinolítica.
Este ejemplo describe un método usado para la
determinación de la presencia de proteínas MMP-1,
MMP-2, MMP-9 y
TIMP-1 en el medio.
A la finalización de la aplicación de carga, se
recogieron las muestras de medio de cada bolsa y se midió la
concentración de proteínas MMP-1,
MMP-2, MMP-9 y
TIMP-1 usando kits de ensayo inmunoabsorbente ligado
a enzimas (ELISA) (Oncogene, Cambridge, MA) de acuerdo con las
instrucciones del fabricante.
Este ejemplo describe las condiciones para el
análisis de transferencia de Northern para MMP-2 y
TIMP-1.
Se extrajo el ARN total de las células mediante
el mismo método que se describe en el Ejemplo 8. Para un análisis de
transferencia de Northern, se desnaturalizaron 10 \mug de ARN
total y se fraccionaron en un gel de agarosa al 1% con formaldehído
1,1 M y se tiñeron con bromuro de etidio para determinar la
integridad de las bandas 28S y 18S. Se realizó la transferencia a
una membrana de nailon mediante métodos convencionales.
Las membranas se hibridaron con sondas de ADNc
marcadas con ^{32}P para MMP-2 y
TIMP-1 (ATCC, Manassas, VA). Se analizó la
radioactividad de cada sonda hibridada usando un PhosphorImager
(Molecular Dynamics, Sunnyvale, CA).
Este ejemplo describe un método usado para la
determinación de la estabilidad del ARNm.
La estabilidad del ARNm después de un periodo de
ensayo de carga mecánica de 24 horas se determinó mediante la
adición de actinomicina D a las células de acuerdo con el Ejemplo 6.
Se añadió actinomicina D a cuatro mililitros de medio de cultivo sin
suero. Las células se mantuvieron durante periodos de ensayo de 0,
1, 2 y 4 horas antes del aislamiento del ARN celular total. El
análisis de los niveles de señal de ARNm se realizó como se describe
en el Ejemplo 11 para la transferencia de Northern. Se determinó la
estabilidad del ARNm en los cultivos de control como se describe con
las células no expuestas a IHP.
Este ejemplo describe un método para el análisis
estadístico de los resultados obtenidos en los estudios descritos en
los Ejemplos 10-12.
La significación entre grupos tratados y de
control se determinó usando ANOVA y ensayo t de Student para dos
muestras no relacionadas (de dos colas), usando la aproximación de
Bonferroni para comparaciones múltiples. Todos los valores se
proporcionan como las medias \pm DT.
Claims (14)
1. Un método ex vivo o in vitro
para la restauración de la función del cartílago degenerado, dañado
o lesionado, en el que dicho método comprende la etapa de:
(a) someter un cartílago degenerado, dañado o
lesionado o un injerto de cartílago extirpado de una articulación, o
condrocitos, ex vivo o in vitro, a una presión
hidrostática aplicada de manera intermitente (IHP) de entre
aproximadamente 0,5 y aproximadamente 30 MPa durante aproximadamente
1 a aproximadamente 8 horas diarias;
(b) retirar la IHP durante un periodo de
recuperación de aproximadamente 16 a 22 horas; y
(c) repetir las etapas (a) y (b) durante un
periodo de aproximadamente 4 a aproximadamente 100 días o de tantos
como sea necesario.
2. El método de la reivindicación 1, en el que
la presión se aplica a una frecuencia de aproximadamente
0,1-10 Hz.
3. El método de acuerdo con la reivindicaciones
1 ó 2, en el que la presión es de entre aproximadamente 1 MPa y
aproximadamente 10 MPa, la presión que se aplica de manera
intermitente durante aproximadamente 4 horas y el periodo de
recuperación es de aproximadamente 20 horas.
4. El método de la reivindicación 3, en el que
la presión es de aproximadamente 5 MPa-10 MPa.
5. El método de una cualquiera de las
reivindicaciones precedentes, en el que el cartílago se somete a la
IHP ex vivo y, después de la regeneración, se formula en un
medicamento para devolverlo a una articulación tratada.
6. El método de una cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 4, en el que el método comprende además
formular una matriz que comprende condrocitos regenerados en un
medicamento para implantar en dicha articulación.
7. El método de una cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 4, en el que el cartílago se regenera in
vitro sometiendo los condrocitos a IHP.
8. El método de una cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 4, en el que el método es un método de
novo y comprende someter una matriz con una suspensión de
células mesenquimales o derivadas del mesénquima a dicha IHP.
9. El método de una cualquiera de las
reivindicaciones precedentes, que comprende además la determinación
de la funcionalidad o de la extensión de la lesión del cartílago o
del colágeno después del tratamiento de IHP ex vivo o in
vitro, mediante la determinación in vitro del nivel de
expresión de ARNm de colágeno, ARNm de agrecano, TGF,
MMP-1, MMP-2 o
IL-6.
10. Uso de cartílago, colágeno, ligamentos,
tendones, hueso, condrocitos o injerto de cartílago obtenido
mediante un método de acuerdo con una cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 8, en la fabricación de un medicamento para la
restauración de la función de una articulación degenerada, dañada o
lesionada.
11. El método de una cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 9 o el uso de la reivindicación 10, en el que
la enfermedad es osteoartritis y/o osteoartrosis.
12. El método de una cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 9 o el uso de la reivindicación 10, en el que
la degeneración es una enfermedad articular degenerativa.
13. El método de una cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 9 o el uso de la reivindicación 10, en el que
la enfermedad es una deficiencia de colágeno.
14. El método de una cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 9 o el uso de la reivindicación 10, en el que
la lesión articular es cartílago cargado o dañado.
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