ES2297189T3 - Derivados de epotilona. - Google Patents

Abstract

Un compuesto representado por medio de la fórmula I: (Ver fórmula)

Description

Derivados de epotilona.

Campo de la técnica

La invención se relaciona con agentes antitumorales. Más particularmente, la invención se relaciona con análogos de epotilona B, trans-12,13-ciclopropil epotilona B como agentes antitumorales.

Resumen

La invención está dirigida a análogos de epotilona B trans-12,13-ciclopropil epotilona B que tienen una potente actividad citotóxica contra una variedad de líneas celulares, incluidas las células tumorales resistentes al Taxol®. Los ejemplos de modalidades de la invención incluyen al compuesto 12, como el ilustrado en la Figura 1. Otro aspecto de la invención está dirigido al uso de tales compuestos como agentes citotóxicos.

Un aspecto de la invención está dirigido a un compuesto representado por la fórmula I:

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o una sal de un compuesto de fórmula I en donde está presente un grupo que forma la sal.

En donde la forma plural se utiliza para compuestos, sales, y similares, esto significa también un compuesto único, sal, o similar ("un" como artículo indefinido o como un numeral que significa "uno").

Las sales son principalmente las sales farmacéuticamente aceptables de compuestos de fórmula I.

Tales sales se forman, por ejemplo, como sales de adición ácida, preferiblemente con ácidos orgánicos o inorgánicos, a partir de compuestos de fórmula I con un átomo de nitrógeno básico, especialmente las sales farmacéuticamente aceptables. Los ácidos inorgánicos adecuados son, por ejemplo, hidrácidos de halógeno, tales como ácido clorhídrico, ácido sulfúrico, o ácido fosfórico. Los ácidos orgánicos adecuados son, por ejemplo, los ácidos carboxílico, fosfónico, sulfónico o sulfámico, por ejemplo ácido acético, ácido propiónico, ácido octanóico, ácido decanóico, ácido dodecanóico, ácido glicólico, ácido láctico, ácido 2-hidroxibutírico, ácido glucónico, ácido glucosamonocarboxílico, ácido fumárico, ácido succínico, ácido adípico, ácido pimélico, ácido subérico, ácido azeláico, ácido málico, ácido tartárico, ácido cítrico, ácido glucárico, ácido galactárico, aminoácidos, tales como el ácido glutámico, ácido aspártico, N-metilglicina, ácido acetilaminoacético, N-acetilasparagina o N-acetilcisteína, ácido pirúvico, ácido acetoacético, fosfoserina, 2 ó 3-glicerofosfórico, ácido maléico, ácido hidroximaléico, ácido metilmaléico, ácido ciclohexanocarboxílico, ácido benzóico, ácido salicílico, 1 ó 3-hidroxinaftil-2-carboxílico, 3,4,5-trimetoxibenzóico, ácido 2-fenoxibenzóico, ácido 2-acetoxibenzóico, ácido 4-aminosalicílico, ácido ftálico, ácido fenilacético, ácido glucurónico, ácido galacturónico, ácido metano o etanosulfónico, ácido 2-hidroxietanosulfónico, ácido etano-1,2-disulfónico, ácido bencenosulfónico, ácido 2-naftalenosulfónico, ácido 1,5-naftaleno-disulfónico, ácido N-ciclohexilsulfámico, ácido N-metil-, N-etil- o N-propilsulfámico, u otros ácidos protónicos orgánicos, tales como el ácido ascórbico.

Las sales de los compuestos de fórmula I con un grupo formador de sal se pueden preparar en una forma ya conocida. Las sales de adición ácida de compuestos de fórmula I pueden obtenerse por lo tanto por ejemplo por medio de tratamiento con un ácido o con un reactivo de intercambio aniónico adecuado.

Las sales pueden usualmente ser convertidas en compuestos libres, por ejemplo por medio de tratamiento con agentes básicos adecuados, por ejemplo con carbonatos de metal alcalino, -carbonatos ácidos, o -hidróxidos, típicamente carbonato de potasio o hidróxido de sodio.

Para propósitos de aislamiento o purificación también es posible utilizar sales farmacéuticamente inaceptables, por ejemplo picratos o percloratos. Únicamente las sales farmacéuticamente aceptables o los compuestos libres (si surge la ocasión, en la forma de preparaciones farmacéuticas) logran uso terapéutico, y estas son por lo tanto las preferidas.

En vista de la estrecha relación entre los nuevos compuestos en forma libre y en la forma de sus sales, incluidas aquellas sales que pueden ser utilizadas como intermediarias, por ejemplo en la purificación o identificación de los nuevos compuestos, antes y después cualquier referencia a los compuestos libres se debe entender que se refiere también a las sales correspondientes, según proceda y sea conveniente.

Otro aspecto de la invención es un proceso para sintetizar cualquiera de los compuestos descritos anteriormente o intermediarios de los mismos, como se describe en la descripción, en particular un proceso para la preparación de un compuesto de fórmula I, II, III, IV o V en donde un compuesto de la fórmula VI

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en donde X es CH_{2} y R es

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y PG es un grupo protector para una función hidroxi,

en una primera etapa se condensa por medio de una reacción de esterificación, opcionalmente en presencia de un catalizador,

y en una segunda etapa se separa el grupo protector proporcionando así una lactona de fórmula I.

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El término "grupos protectores para un grupo hidroxi" como se lo utiliza aquí se refiere a grupos protectores lábiles ácidos para un grupo hidroxi, cuyos grupos se conocen como tales. Una característica de los grupos protectores es que ellos se prestan por si mismos fácilmente, esto es, sin reacciones secundarias indeseadas, para remover, típicamente por solvólisis, reducción, fotólisis o también por actividad enzimática, por ejemplo bajo condiciones análogas a las condiciones fisiológicas, y que ellos no están presentes en los productos finales. Los especialistas saben, o pueden establecer fácilmente, que grupos protectores son adecuados con las reacciones mencionadas aquí antes y después.

La protección de los grupos hidroxi por medio de grupos de protección, los grupos protectores por si mismos, y sus reacciones de escisión se describen por ejemplo en trabajos estándar de referencia, tales como J. F. W. McOmie, "Protective Groups in Organic Chemistry", Plenum Press, Londres y New York 1973, en T. W. Greene, "Protective Groups in Organic Synthesis", Wiley, New York 1981, en "The Peptides"; Volumen 3 (editores: E. Gross y J. Meienhofer), Academic Press, Londres y New York 1981, en "Methoden der organischen Chemie" (Methods of organic chemistry), Houben Weyl, 4^{ta} edición, Volumen 15/l, Georg Thieme Verlag, Stuttgart 1974, en H.-D. Jakubke and H. Jescheit, "Aminosäuren, Peptide, Proteine" (Aminoácidos, péptidos, proteínas), Verlag Chemie, Weinheim, Deerfield Beach, y Basel 1982, y en Jochen Lehmann, "Chemie der Kohlenhydrate: Monosaccharide und Derivate" (Química de carbohidratos: monosacáridos y derivados), Georg Thieme Verlag, Stuttgart 1974.

Los grupos protectores preferidos son silil éteres que son inestables al ácido como el éter tert-butildimetil-sililo (TBS), el éter Trietilsililo (TES), éter triisopropilsililo (TIPS), éter dietilisopropilsililo (DEIPS), éter isopropildimetilsililo (IPDMS) o éter texildimetilsililo (TDS).

Breve descripción de los dibujos

La Figura 1 ilustra las estructuras de epotilonas naturales y diseñadas seleccionadas. Las cajas grises indican compuestos sintetizados en este estudio.

La Figura 4 ilustra un análisis retrosintético de los análogos de la trans-ciclopropil epotilona B 12.

La Figura 5 ilustra la construcción del aldehído 32.

La Figura 6 ilustra la construcción de yoduros de vinilo 20e.

La Figura 7 ilustra la síntesis de análogos de epotilona 12.

La Figura 8 ilustra una tabla que expone la citotoxicidad de las epotilonas 1, 2 y 12 y paclitaxel contra las células humanas de carcinoma de ovario 1A9 y las líneas celulares mutantes de \beta-tubulina seleccionadas con paclitaxel o epotilona A.

La Figura 9 ilustra una tabla que expone la potencia y citotoxicidad de la polimerización de tubulina de la epotilona 1-2 y 12, contra las líneas celulares humanas de cáncer epidermoide.

La Figura 10 ilustra una tabla que expone afinidades de enlazamiento de análogos de epotilona con los sitios taxoides de enlazamiento de microtúbulos.

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Otro aspecto de la invención está dirigido a una composición farmacéutica que contiene una dosis farmacéutica de un compuesto ya sea dentro de la fórmula I, II, II, IV o la fórmula V, representada anteriormente, para el tratamiento de una enfermedad proliferativa en un mamífero. En una modalidad preferida, el mamífero es un humano.

Descripción detallada

Se divulga la construcción de una serie de epotilonas de ciclopropano y de epóxido con diferentes cadenas laterales por medio de síntesis química y se las evalúa biológicamente. El diseño de la presente biblioteca enfocada en epotilona se basó en el conocimiento actual de las relaciones de actividad de la estructura (SAR), específicamente el hecho de que: (1) la epotilona B (2) es considerablemente más potente que la epotilona A (1), (2) un reemplazo de tiometilo por el grupo metilo sobre la fracción tiazol refuerza la potencia (Nicolaou, K. C.; y colaboradores, Angew. Chem. 1998, 110, 2120-2153; Angew. Chem. Int. Ed. 1998, 37, 2014-2045. Nicolaou, K. C.; y colaboradores, Tetrahedron 2002, 58, 6413-6432; Nicolaou, K. C.; y colaboradores, Angew. Chem. 1998, 110, 89-92; Angew. Chem. Int. Ed. 1998, 37, 84-87.); (3) un heterociclo tal como un reemplazo de piridina (Nicolaou, K. C.; y colaboradores, Chem. Biol. 2000, 7, 593-599) por el anillo de tiazol necesita mantener la posición adecuada para el nitrógeno para la actividad biológica; y (4) un anillo de ciclopropano puede reemplazar la fracción de epóxido sin perder actividad (Nicolaou, K. C.; y colaboradores, J. Am. Chem. Soc. 2001, 123, 9313-9323; Nicolaou, K. C.; y colaboradores, ChemBioChem. 2001, 2, 69-75; Johnson, J. A.; y colaboradores, Org. Lett. 2000, 2, 1537-1540). A partir de estas consideraciones, las epotilonas 12 (figura 1) fueron consideradas como candidatas principales para síntesis química y evaluación biológica. La evaluación biológica de estos compuestos condujo a la identificación de la cadena lateral de tiometiltiazol como un grupo farmacofórico deseable que mejora la actividad biológica de la epotilonas con relación a las propiedades de citotoxicidad y polimerización de la tubulina. La actividad mejorada fue confirmada por medio de tres ensayos biológicos distintos donde los efectos de los compuestos analizados se determinaron tanto en células como in vitro.

Diseño y síntesis química de análogos de epotilona

Como una incursión inicial, decidimos confirmar la mejora en potencia conferida sobre la construcción de la epotilona por el grupo metiltio comparado con el sustituyente metilo en la cadena de la epotilona B. Se sintetizó por lo tanto la metiltiotiazol epotilona B (3) por medio del acoplamiento de estanano de Stille 16 (Nicolaou, K. C.; y colaboradores, Bioorg. Med. Chem. 1999, 7, 665-697) con yoduro de vinilo 15 (Nicolaou, K. C.; y colaboradores, Chem. Eur. J. 2000, 6, 2783-2800) (rendimiento del 80%) como se observa en la Figura 3. La gran potencia observada del análogo 3 contra una serie de líneas de células tumorales (ver Tabla 1) nos alentó a proceder con el diseño y la síntesis de una familia completa de análogos de metiltio así como una cantidad de nuevas epotilonas que contienen piridina.

La Figura 4 esboza, en formato retrosintético, la ruta que fue seguida para la construcción de los análogos de la ciclopropil epotilona B. Con base en nuestra estrategia previamente reportada, la secuencia adoptada requirió de una reacción de ciclopropanación de Charette (Nicolaou, K, C.; y colaboradores, J. Am. Chem. Soc. 2001, 123, 9313-9323; Charette, A. B.; y colaboradores, J. Am. Chem. Soc. 1998, 120, 11943-11952) para establecer antes en la síntesis el sitio 12,13-ciclopropilo, una reacción aldol de acuerdo con nuestro procedimiento optimizado (Nicolaou, K. C.; y colaboradores, Chem. Eur. J. 2000, 6, 2783-2800) para construir el enlace C6-C7 con sus dos estereocentros, un acoplamiento Nozaki-Hiyama-Kishi (Nicolaou, K. C.; y colaboradores, J. Am. Chem. Soc. 2001, 123, 9313-9323; Takai, K.; y colaboradores, Tetrahedron Lett. 1983, 24, 5281-5284; Jin, H.; y colaboradores, J. Am. Chem. Soc. 1986, 108, 5644-5646) para introducir la cadena lateral, y una macrolactonización de Yamaguchi (Inanaga, J.; y colaboradores, Bull. Chem. Soc. Jpn. 1979, 52, 1989-1993; Mulzer, J.; y colaboradores, Synthesis 1992, 215-228; Nicolaou, K. C.; y colaboradores, J. Am. Chem. Soc. 1997, 119, 7974-7991) para completar la estructura macrocíclica. Los bloques clave de construcción 18 ó 69 y 19, y 20 se definieron por lo tanto como los puntos de partida para estas construcciones. La construcción de los análogos correspondientes de epotilona A se previó que se llevara a cabo en la misma forma en que la reportamos previamente nosotros (Nicolaou, K. C.; y colaboradores, J. Am. Chem. Soc. 2001, 123, 9313-9323).

La Figura 5 y la figura 14 esbozan la síntesis del aldehído requerido 32 ó 82 a partir del geraniol fácilmente disponible (18 ó 69). Por lo tanto, la ciclopropanación de Charette de 18 (Et_{2}Zn-CH_{2}l_{2}, en presencia del ligando quiral 21) (Charette, A. B,; y colaboradores, J. Am. Chem. Soc. 1998, 120, 11943-11952) proporcionó el alcohol ciclopropílico 22 con un rendimiento del 87% y del 93% ee ó 71 con un rendimiento del 80%, 95%ee. La protección del grupo hidroxi en 22 ó 71 (NaH-BnBr) (para las abreviaturas de reactivos y grupos de protección, ver las inscripciones en los esquemas) seguida por ozonólisis (O_{3}; NaBH_{4}) del doble enlace restante condujo al compuesto 23 ó 72 con un rendimiento total del 89% ó del 83% respectivamente. La conversión del alcohol 23 ó 72 al correspondiente yoduro (24, rendimiento del 95% ó 73, rendimiento del 91%) se logró por mesilación y posterior reacción con NaI. La alquilación de (-)-propionaldehído SAMP hidrazona (25) (Nicolaou, K. C.; y colaboradores, J. Am. Chem. Soc. 1997, 119, 7974-7991; Enders, D. Aymmetric Synth. 1984, 3, 275-339; Enders, D.; Klatt, M. Synthesis 1996, 1403-1418) con yoduro 24 ó 73 bajo la influencia de LDA produjo un compuesto 26 ó 75 (rendimiento del 84%, rendimiento del 87% respectivamente), cuya escisión (Mel; HCl_{ac.}) condujo al aldehído 17 con un rendimiento del 86% ó a 76 con un rendimiento del 91%. La proporción de los epímeros C-8 resultantes se determine que era aproximadamente de 97,3 por medio de un análisis de RMN ^{1}H de los ésteres MTPA derivados del aldehído 17 (Tsuda, M.; Endo, T.; Kobayashi, J. J. Org. Chem. 2000, 65, 1349-1352 y las referencias citadas allí). La condensación del aldol entre la cetona 19 y el aldehído 17 ó 76 bajo las condiciones previamente definidas [LDA (2,4 equiv.), cetona 19 (2,3 equiv.), -78 a -40ºC, 30 min; luego aldehído 17 ó 76, -78ºC, 5 min] (Nicolaou, K, C.; y colaboradores, Chem. Eur, J. 2000, 6, 2783-2800) produjo un producto aldol 27 ó 78 que fue aislado en una forma diasteroméricamente pura (rendimiento del 81%). La protección posterior del alcohol secundario en 27 ó 78 como un éter TBS (TBSOTf, 2,6-lutidina) seguida por escisión selectiva del grupo TBS primario (HF\bulletpy) produjo, un rendimiento total del 88%, de alcohol 28 o un rendimiento total del 86%, de alcohol 79. El compuesto fue oxidado por etapas hasta ácido carboxílico (DMP; luego NaClO_{2}) que luego fue protegido como el éster TMSE 29 u 80(TMSE-OH, EDC, 4-DMAP) con un rendimiento total del 75% o del 73%. La hidrogenólisis del éter bencílico en 29 ó 80 seguido por oxidación con DMP condujo al aldehído 30 u 82 (rendimiento del 84%, rendimiento del 87%) cuya homologación (NaHMDS-MeOCH_{2}PPh_{3}Cl; luego PPTS) hasta el aldehído superior ambicionado 32 u 83 procedió fácilmente, y a través del éter vinílico 31 (en una proporción aproximada de E:Z de 1:1), con un rendimiento total del 82%.

Las cadenas laterales (20e, Esquema 4) fueron sintetizadas a partir de los correspondientes haluros de arilo (33 (Ellingboe, J. W.; y colaboradores, J. Med. Chem. 1994, 37, 542-550), 37,) como se observa en el Esquema 4. La protección del bromuro de 4-hidroximetil-2-piridil 33 como un tritil éter (TrCl, 4-DMAP, 100%) seguida por el acoplamiento de Sonogashira (Arcadi, A.; y colaboradores, Tetrahedron 1994, 50, 437-452) del bromuro de arilo resultante 34 con propino [Pd(PPh_{3})_{2}Cl_{2}-CuI, 96%] condujo al compuesto acetilénico 35 que sirvió como un precursor para el yoduro de vinilo 20c (n-BuLi; luego (n-Bu_{3}Sn)_{2}, CuCN, MeOH; luego I_{2}, rendimiento del 80%). El intercambio del tritil por un grupo MOM dentro de 35 [HCl(g), CHCl_{3}; luego NaH, MOM-Cl, rendimiento total del 34%] (Betzer, J.-F.; y colaboradores, Tetrahedron Lett. 1997, 38, 2279-2282) permitió el acceso al yoduro de vinilo 20d (rendimiento del 67%) por medio de la exposición del intermediario resultante 36 con las mismas condiciones descritas anteriormente para la conversión de 35 a 20c. Se empleó una química similar para construir yoduro de vinilo 20e a partir de 37, respectivamente, como se observa en el Esquema 4.

Dos formaciones de enlace cruciales y dos desprotecciones acompañantes separaron los bloques claves de construcción 32 (preparados en este estudio para análogos de epotilona B), 40 (preparados como se describió previamente para los análogos de epotilona A) (Nicolaou, K. C.; y colaboradores, J. Am. Chem. Soc. 2001, 123, 9313-9323), y 20a-g (para cadenas laterales) a partir de los análogos de epotilona objetivo. La primera operación fue el acoplamiento de Nozaki-Hiyama-Kishi (Takai, K.; y colaboradores, Tetrahedron Lett. 1983, 24, 5281-5284; Jin, H.; y colaboradores, J. Am. Chem. Soc. 1986, 108, 5644-5646) de los aldehídos 32 y 40 con yoduros de vinilo 20e. Esta reacción formadora del enlace carbono-carbono funcionó admirablemente en este caso (CrCl_{2}, NiCl_{2}, 4-t-BuPy, DMSO), proporcionando, después de la generación del ácido carboxílico inducida por TBAF, productos de acoplamiento (41e,) en los rendimientos indicados en los Esquemas 5 (como por ejemplo mezclas 1:1 de diasterómeros C-15). Cada mezcla de diasterómeros de hidroxiácido (41e) fue sometida luego a macrociclización de Yamaguchi (cloruro de 2,4,6-triclorobenzoilo, 4-DMAP) (Inanaga, J.; y colaboradores, Bull. Chem, Soc. Jpn. 1979, 52, 1989-1993; Mulzer, J.; y colaboradores, Synthesis 1992, 215-228) para producir la lactona deseada 15(S) en los rendimientos indicados (no optimizados) junto con su 15(R) epímero. La separación de los dos epímeros en esta unión fue facilitada por sus valores de Rf drásticamente bastante diferentes sobre gel de sílice. La desprotección final de los derivados protegidos ya sea con TFA al 20% en CH_{2}Cl_{2} (43e), condujo a la epotilona 12 en los rendimientos indicados (no optimizados) (Esquemas 5). Se sometieron los compuestos puros a evaluaciones biológicas por medios cromatográficos y espectroscópicos como se describe más adelante.

Biología química

Las actividades biológicas de las epotilonas sintetizadas fueron evaluadas a través de citotoxicidad, polimerización de la tubulina in vitro, y ensayos de enlazamiento de la tubulina. La citotoxicidad fue evaluada primero en un conjunto de líneas celulares de carcinoma de ovario, incluida una línea celular parental (IA9) y tres líneas celulares resistentes a la droga, principalmente las cepas resistentes al paclitaxel (Giannakakou, P.; y colaboradores, J. Biol. Chem. 1997, 272, 17118-17125) IA9/PTX10 y IA9/PTX22 y la cepa resistente a la epotilona (Giannakakou, P.; y colaboradores, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 2000, 97, 2904-2909) 1A9/A8. Estas líneas celulares resistentes hospedan distintas mutaciones adquiridas de \beta-tubulina que afectan la interacción droga-tubulina y resultan en taxano deteriorado y en polimerización de la tubulina dirigida por epotilona. Los resultados de estas investigaciones biológicas se resumen en la Tabla 1 (Skehan, P.; y colaboradores, J. Natl. Cancer Inst. 1990, 82, 1107-1112). Se llevaron a cabo ensayos adicionales de citotoxicidad y de polimerización in vitro de la tubulina utilizando un conjunto de líneas celulares humanas de cáncer epidermoide, incluida una línea celular madre (KB-31) y una línea celular resistente al paclitaxel (debido a la sobreexpresión de Pgp) (KB-8511). Los resultados de estos estudios se resumen en la Tabla 2 (Nicolaou, K. C.; y colaboradores, Chem. Biol. 2000, 7, 593-599; Meyer, T.; y colaboradores, Int. J. Cancer 1989, 43, 851-856).

En general, existe una buena concordancia entre la potencia de polimerización de la tubulina in vitro y el perfil de citotoxicidad de los compuestos analizados tanto contra las células humanas de carcinoma de ovario 1A9 como las células humanas de carcinoma epidermoide KB-31. De acuerdo con las observaciones originales con las epotilonas A y B de ocurrencia natural, ninguno de los análogos de las epotilonas A o B analizadas aquí parece ser un buen sustrato para la bomba que suministra la droga P-glicoproteína (Pgp). Esto es evidente por la carencia de resistencia cruzada de cada uno de estos análogos con la línea celular KB-8511 que expresa Pgp, en contraste con paclitaxel - un sustrato conocido de Pgp - que es 214 veces menos activo contra las células KB-8511 (ver figura 9 y la figura 17). Es notable que todos los análogos de epotilona parezcan más activos contra los mutantes de \beta-tubulina comparados con la epotilona A (1) y la epotilona B (2) (ver figura 8 y figura 16, valores RR). Esta es más pronunciada con el compuesto 12 para el cual el rango de valores de resistencia relativa (RR) de 1,6-9,3 contra las células PTX10 (\beta270) y A8 (\beta274) comparado con los valores RR 9,4-24,9 para Epo A (1) y Epo b (2) (figura 8). Además, en el estudio actual, y de acuerdo con reportes previos (Nicolaou, K. C.; y colaboradores, ChemBioChem 2001, 2, 69-75; Giannakakou, P.; y colaboradores, J. Biol. Chem. 1997, 272, 17118-17125; Giannakakou, P.; y colaboradores, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 2000, 97,2904-2909), encontramos que el mutante seleccionado de paclitaxel PTX22 (\beta364) retiene casi toda la sensibilidad con las epotilonas, y con todos los análogos de epotilona analizados en este reporte (valores RR ae 3,3).

Existe un acuerdo general en la potencia relativa de los análogos sustituidos de epotilona B contra las células cancerosas epidermoides humanas KB-31 y de ovario humano 1A9. Colectivamente, los resultados de estos ensayos de citotoxicidad revelaron información interesante en términos de las relaciones de actividad con la estructura dentro de la familia de la epotilona. Primero, los compuestos 4 y 6 en los cuales la fracción epóxido C12-C13 es reemplazada por un anillo de ciclopropano son los dos compuestos más potentes entre todos los análogos de epotilona B presentados aquí. Este resultado reafirma que la fracción de epóxido C12-C13 no es necesaria para la actividad biológica como se observó previamente (Nicolaou, K. C.; y colaboradores, J. Am. Chem. Soc. 2001, 123, 9313-9323; Nicolaou, K. C.; y colaboradores, ChemBioChem. 2001, 2, 69-75; Johnson, J. A.; y colaboradores, Org. Lett. 2000, 2, 1537-1540). El compuesto 4 es 6 veces más activo que la epotilona B madre (2) contra las células humanas de carcinoma de humano 1A9 (Figura 8) confirmando además que el remplazo del grupo metilo sobre la cadena lateral de tiazol con un grupo tiometilo conduce a una mayor actividad. Este resultado está de acuerdo con datos previos sobre una sustitución similar en la epotilona B sin el reemplazo del epóxido C12-C13 (esto es, el compuesto 3) (Nicolaou, K.C.; y colaboradores, Tetrahedron 2002, 58, 6413-6432). Este compuesto (3) fue aproximadamente 2 veces más activo que la epotilona B madre, mientras que el compuesto 4 es 6 veces más potente que la epotilona B. Este resultado hace al compuesto 4, el análogo de epotilona B más activo contra la línea celular 1A9 sintetizada hasta la fecha y sugiere que el remplazo del epóxido por una fracción de ciclopropano junto con el reemplazo del sustituyente metilo sobre la fracción de tiazol con un grupo tiometilo actúa sinergísticamente, conduciendo a la mejora observada de la actividad biológica. En forma muy interesante, la sustitución del grupo metilo del anillo de tiazol con fracciones más grandes (compuesto 12) conduce a la disminución de la actividad biológica comparado con la epotilona B (Figuras 8 y 9).

Además de los ensayos biológicos anteriores, se midió la potencia relativa de cada análogo de epotilona por medio del ensayo de desplazamiento del taxoide fluorescente (Andreu, J. M.; Barasoain, I. Biochemistry 2001, 40, 11975-11984). El propósito de estos experimentos fue comparar las constantes de equilibrio con las cuales se enlazan los microtúbulos en su sitio de taxano a los análogos de epotilona investigados. La inhibición del enlazamiento del taxoide fluorescente bien caracterizado Flutax-2 (Souto, A. A.; y colaboradores, Angew. Chem. Int. Ed, Engl. 1995, 34, 2710-2712; Diaz, J. F.; y colaboradores, J. Biol. Chem. 2000, 275, 26265-26276: Abal, M.; y colaboradores, Cell. Motil. Cytoskeleton 2001, 49, 1-15) con los microtúbulos para cada uno de los análogos de epotilona se midió a 37ºC (Figura 10). Las constantes de equilibrio de disociación resultantes mostradas en la Tabla indican que la epotilona A (1) tiene la menor afinidad de enlazamiento entre los análogos de epotilona analizados (Kd = 34\ring{A}4). El ligando más poderoso entre aquellos medidos en este ensayo es el compuesto 3, con un valor de Kd de 0.64\ring{A}0.24 nM, seguido por el compuesto 12, con un valor similar de Kd n 1,8 nM. Las afinidades de enlazamiento de los análogos analizados reflejan sus respectivas actividades tanto en los ensayos de inhibición del crecimiento celular como de polimerización de la tubulina in vitro.

Colectivamente a partir de los tres ensayos biológicos empleados aquí, se pueden extraer una cantidad de conclusiones en términos de la relación de la actividad con la estructura dentro de la familia de la epotilona. Primero, la adición del grupo metilo C12 no mejora la actividad en la serie del trans-ciclopropilo (compuesto 5 vs. 6, 7 vs. 8, 9 vs. 10), contrario con el resultado en la serie del cis-epóxido, donde la epotilona B (2) es al menos 10 veces más activa que la epotilona A (1). Esto puede ser debido a la orientación diferente del grupo metilo C12 en los compuestos cis y trans o a todas las diferencias de conformación entre los compuestos cis y trans, aunque los detalles deben ser todavía elucidados. Segundo, la introducción de la cadena lateral de 2-tiometiltiazol mejora la actividad comparada con la cadena lateral natural de 2-metiltiazol (compuestos 2 vs. 3, 5 vs. 11, y 6 vs. 12). Este efecto fue previamente observado para los análogos de epotilona C y D (Nicolaou, K. C.; y colaboradores, Angew. Chem. 1997, 109, 2181-2187; Angew, Chem. Int. Ed. Engl. 1997, 36, 2097-2103; ver también: Sinha, S. C.; y colaboradores, ChemBioChem 2001, 2, 656-665). Tercero, el reemplazo del grupo metilo con un grupo tiometilo en la serie de la cadena lateral de piridina (compuestos 8 vs. 13) reduce la potencia, contrario a los resultados obtenidos para las cadenas laterales anteriores de tiazol. Esta conclusión se basó en la citotoxicidad de la célula y en los datos de la polimerización in vitro de la tubulina, mientras que en el ensayo de desplazamiento del taxoide fluorescente, el reemplazo del grupo metilo con una fracción de tiometilo en la cadena lateral de piridina es indiferente en términos de la afinidad de enlazamiento. Esta discrepancia puede simplemente reflejar diferencias en la incorporación en la célula y la permeabilidad de los compuestos analizados o en las diferencias en la sensibilidad de los dos ensayos de la tubulina. A pesar de esta discrepancia, es claro a partir de estos datos que la introducción de un grupo tiometilo en la cadena lateral de tiazol es una modificación más favorable que la introducción de un grupo tiometilo en la cadena lateral de piridina, lo cual puede ser debido a diferentes requerimientos estéricos por parte de las dos construcciones de cadena lateral. De acuerdo con los datos previos obtenidos con los análogos de epotilona de la piridina cis (Nicolaou, K. C.; y colaboradores, Chem. Biol. 2000, 7, 593-599), la reubicación del grupo tiometilo de la cadena lateral de piridina desde la posición 5 (compuesto 13) hasta la posición 6 (compuesto 14) resultó en una perdida significativa de actividad. Cuarto, se obtienen resultados mezclados con los compuestos 7 vs. 9 y 8 vs. 10 en los cuales la cadena lateral de 5-metilpiridina (compuestos 7 y 8) es sustituida por la cadena lateral de 5-hidroximetilpiridina (compuestos 9 y 10). Esta sustitución parece indiferente en los ensayos de citotoxicidad contra las células humanas de carcinoma de ovario 1A9 (Tabla 1) donde se obtuvieron valores IC_{50} muy similares para cada par (por ejemplo 0,6 y 0,7 nM para los compuestos 7 y 9, respectivamente; 1,7 nM para los compuestos 8 y 10). Por otro lado, en las células humanas de carcinoma epidermoide KB-31, el compuesto 10 es 2 veces más activo que su contraparte el compuesto 8 con IC_{50} en 0,44 vs. 0,9 nM, respectivamente. Dadas las pequeñas diferencias en la velocidad de crecimiento de las dos líneas de células cancerosas humanas que podrían explicar los resultados diferenciales, podríamos concluir que la introducción de la cadena lateral de 5-hidroximetilpiridina probablemente no mejore la actividad, al menos en los análogos de trans-12,13-ciclopropilo de la familia de la epotilona.

Debido a estas propiedades, los compuestos son adecuados para el tratamiento de enfermedades proliferativas, especialmente enfermedades tumorales, incluida la metástasis; por ejemplo tumores sólidos tales como tumores de pulmón, tumores de mama, tumores colorectales, tumores de próstata, melanomas, tumores de cerebro, tumores de páncreas, tumores de cuello, tumores de vesícula, neuroblastomas, tumores de garganta, pero también enfermedades proliferativas de células sanguíneas, tales como leucemia; también para el tratamiento de otras enfermedades que responden al tratamiento con inhibidores de despolimerización de microtúbulos, tal como la soriasis.

Se puede administrar un compuesto de fórmula I solo o en combinación con uno o más de otros agentes terapéuticos, posible terapia de combinación que toma la forma de combinaciones fijas o la administración de un compuesto de la invención y uno o más de otros agentes terapéuticos administrados escalonadamente o independientemente uno del otro, o la administración combinada de combinaciones fijas y uno o más de otros agentes terapéuticos. Un compuesto de fórmula 1 puede ser administrado también o adicionalmente para terapia tumoral en combinación con quimioterapia, radioterapia, inmunoterapia, una intervención quirúrgica, o una combinación de estas. La terapia de largo plazo es igualmente posible ya que es una terapia adyuvante en el contexto de otras estrategias de tratamiento, como se describió anteriormente. Otros tratamientos posibles son la terapia para mantener el estatus del paciente después de una regresión tumoral, o incluso una terapia quimiopreventiva, por ejemplo en pacientes con riesgo.

Los agentes terapéuticos para una posible combinación son especialmente uno o más compuestos antiproliferativos, citostáticos o citotóxicos, por ejemplo uno o más agente(s) quimioterapéutico(s) seleccionados del grupo que contiene a los agentes quimioterapéuticos clásicos, un inhibidor de la biosíntesis de poliamina, un inhibidor de la proteína quinasa, especialmente de la proteína serina/treonina quinasa, tal como la proteína quinasa C, o de la proteína tirosina quinasa, tal como el receptor del factor de crecimiento epidérmico de la proteína tirosina quinasa, una citoquina, un regulador negativo de crecimiento, tal como TGF-\beta o IFN-\beta, un inhibidor de aromatasa, y un citostático clásico.

Los compuestos de acuerdo con la invención son no solamente para el tratamiento (profiláctico y preferiblemente terapéutico) de humanos, sino también para el tratamiento de otros animales de sangre caliente, por ejemplo de animales comercialmente útiles, por ejemplo roedores, tal como ratones, conejos o ratas, o conejillos de indias. También pueden ser utilizados como una referencia estándar en los sistemas de análisis descritos anteriormente para permitir una comparación con otros compuestos.

También se puede utilizar un compuesto de fórmula I para propósitos de diagnóstico, por ejemplo con tumores que han sido obtenidos a partir de "huéspedes" animales de sangre caliente, especialmente humanos, e implantados en ratones para analizar en ellos la disminución en el crecimiento después del tratamiento con tal compuesto, con el propósito de investigar su sensibilidad con dicho compuesto y por lo tanto para mejorar la detección y determinación de posibles métodos terapéuticos para enfermedades neoplásicas en el huésped original.

Las mezclas estereoisómeras, por ejemplo mezclas de diasteroisómeros, se pueden separar en sus isómeros correspondientes en una forma ya conocida por medio de métodos adecuados de separación. Las mezclas diasteroisómeras pueden ser separadas por lo tanto en sus diasteroisómeros individuales por medio de cristalización fraccionada, cromatografía, distribución en un solvente, y procedimientos similares. Esta separación puede tener lugar ya sea en la tapa de uno de los compuestos de partida o en un compuesto de fórmula I por sí mismo. Los enantiómeros pueden ser separados a través de la formación de sales diasteroisómeras, por ejemplo por medio de la formación de una sal con un ácido quiral puro de enantiómero, o por medio de cromatografía, por ejemplo por HPLC, utilizando sustratos cromatográficos con ligandos quirales. (La separación de enantiómeros se efectúa normalmente en la etapa intermedia).

Preparaciones farmacéuticas, métodos, y usos

La presente invención se relaciona también con preparaciones farmacéuticas que contienen un compuesto de fórmula I como ingrediente activo y que pueden ser utilizadas especialmente en el tratamiento de las enfermedades mencionadas anteriormente. Las preparaciones para administración enteral, tal como administración nasal, bucal, rectal o, especialmente administración oral, y para administración parenteral, tal como administración intravenosa, intramuscular o subcutánea, para animales de sangre caliente, especialmente humanos, son especialmente preferidas. Las preparaciones contienen al ingrediente activo solo o, preferiblemente, junto con un excipiente farmacéuticamente aceptable. La dosis del ingrediente activo depende de la enfermedad que va a ser tratada y de la especie, su edad, peso, y condición individual, de los datos farmacocinéticos individuales, y de la forma de administración.

La dosis precisa de los compuestos de fórmula I que van a ser empleados para la inhibición de la enfermedad proliferativa, preferiblemente tumores, depende de varios factores incluido el huésped, la naturaleza y la severidad de la condición que está siendo tratada, la forma de administración y el compuesto particular empleado. Sin embargo, en general, la inhibición satisfactoria de tumores se logra cuando un compuesto de fórmula I se administra parenteralmente, por ejemplo, en forma intraperitoneal, intravenosa, intramuscular, subcutánea, intratumoral, o rectal, o en forma enteral, por ejemplo, en forma oral, preferiblemente en forma intravenosa u oral, más preferiblemente en forma intravenosa con una dosis única de 1-300 mg/kg de peso corporal por ciclo (ciclo = 3-6 semanas) o, para primates superiores, una dosis única de 50-5000 mg por ciclo de tratamiento. Una dosis única intravenosa preferida para un ciclo de tratamiento de 3-6 semanas es de 1-75 mg/kg de peso corporal o, para primates superiores, una dosis diaria de 50-1500 mg. Una dosis intravenosa típica es de 45 mg/kg, una vez cada tres semanas.

Usualmente, se administra inicialmente una dosis pequeña y se incrementa gradualmente la dosis hasta que se determina la dosis óptima para el huésped bajo tratamiento. El límite superior de la dosis es aquella impuesta por los efectos secundarios y se puede determinar por medio de ensayos para el huésped que está siendo tratado.

La invención se relaciona también con preparaciones farmacéuticas para ser usadas en un método para el tratamiento profiláctico o especialmente el tratamiento terapéutico del cuerpo humano o de una animal, con un proceso para la preparación de las mismas (especialmente en la forma de composiciones para el tratamiento de tumores)y con un método para tratar las enfermedades anteriormente mencionadas, principalmente enfermedades neoplásicas, especialmente aquellas mencionadas anteriormente.

La invención se relaciona también con procesos y con el uso de compuestos de fórmula I para la preparación de preparaciones farmacéuticas que contienen compuestos de fórmula I como componente activo (ingrediente activo).

Se da preferencia a una composición farmacéutica que es adecuada para la administración a un animal de sangre caliente, especialmente un humano o un mamífero comercialmente útil, que sufre de una enfermedad que es responsable por la inhibición de la despolimerización de microtúbulos, por ejemplo soriasis o especialmente una enfermedad neoplásica, que comprende una cantidad correspondientemente efectiva de un compuesto de fórmula I, o de una sal farmacéuticamente aceptable de la misma cuando están presentes los grupos formadores de sales, junto con al menos un excipiente farmacéuticamente aceptable.

Una composición farmacéutica para el tratamiento profiláctico o especialmente terapéutico de enfermedades neoplásicas y de otras enfermedades proliferativas de un animal de sangre caliente, especialmente un humano o un mamífero comercialmente útil que requiere de tal tratamiento, especialmente que sufre de una enfermedad así, comprende un compuesto nuevo de fórmula I, o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo, como ingrediente activo en una cantidad que es profilácticamente o especialmente terapéuticamente activa contra dichas enfermedades, es igualmente preferida.

Las preparaciones farmacéuticas contienen aproximadamente desde 0,000001% hasta 95% del ingrediente activo, por lo cual las formas de dosificación única tienen preferiblemente aproximadamente desde 0,00001 hasta 90% y las formas de administración de dosis múltiples tienen preferiblemente aproximadamente desde 0,0001 hasta 0,5% en el caso de preparaciones para administración parenteral ó 1% a 20% del ingrediente activo en el caso de preparaciones para administración enteral. Las formas de dosis unitarias son, por ejemplo, tabletas recubiertas y no recubiertas, ampolletas, viales, supositorios o cápsulas. Formas de dosificación adicionales son, por ejemplo, ungüentos, cremas, pastas, espumas, tinturas, labiales, gotas, nebulizadores, dispersiones, etc. Ejemplos son cápsulas que contienen aproximadamente desde 0,0002 g hasta aproximadamente 1,0 g de ingrediente activo.

Las preparaciones farmacéuticas de la presente invención se preparan en una forma ya conocida, por ejemplo por medio de procesos de mezcla convencional, granulación, recubrimiento, disolución o liofilización.

Las formulaciones adecuadas para administración parenteral son principalmente soluciones acuosas [por ejemplo en solución fisiológica salina, obtenible por medio de dilución de soluciones en polietilén glicol, tal como el polietilén glicol (PEG) 300 o PEG 400] de un ingrediente activo en una forma soluble en agua, por ejemplo una sal soluble en agua, o suspensiones acuosas inyectables que contienen agentes de viscosidad creciente, por ejemplo carboximetil celulosa sódica, sorbitol y/o dextrano, y estabilizadores cuando sea apropiado. El ingrediente activo, si se requiere que esté junto con los excipientes, puede estar también en la forma de un liofilizado y puede ser preparado en una solución antes de administración parenteral por medio de la adición de solventes adecuados.

Soluciones tales como aquellas utilizadas, por ejemplo, para administración parenteral pueden ser empleadas también como soluciones de infusión.

La invención se relaciona en forma similar con un proceso o un método para el tratamiento de una de las condiciones patológicas anteriormente mencionadas, especialmente una enfermedad que responde a una inhibición de despolimerización de microtúbulos, especialmente una enfermedad neoplásica correspondiente. Un compuesto de fórmula I puede ser administrado como tal o en la forma de composiciones farmacéuticas, profilácticamente o terapéuticamente, preferiblemente en una cantidad efectiva contra dichas enfermedades, a un animal de sangre caliente, por ejemplo un humano, que requiere de tal tratamiento, siendo los compuestos utilizados especialmente en la forma de composiciones farmacéuticas. En el caso de un individuo que tiene un peso corporal aproximadamente de 70 kg, la dosis administrada es aproximadamente de 0,1 mg hasta aproximadamente 1 g, preferiblemente aproximadamente desde 0,5 mg hasta aproximadamente 200 mg, de un compuesto de la presente invención. La administración se efectúa preferiblemente por ejemplo cada 1 a 4 semanas, por ejemplo semanalmente, cada dos semanas, cada tres semanas o cada 4 semanas.

La presente invención también se relaciona en particular con el uso de un compuesto de fórmula I, o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo, especialmente un compuesto de fórmula I denominado como un compuesto preferido, o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo, como tal o en la forma de una formulación farmacéutica que contiene al menos un excipiente farmacéuticamente empleable, para el tratamiento terapéutico y también profiláctico de una o más de las enfermedades anteriores.

La presente invención también se relaciona en particular con el uso de un compuesto de fórmula I, o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo, especialmente un compuesto de fórmula I denominado como un compuesto preferido, o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo, para la preparación de una formulación farmacéutica para el tratamiento terapéutico y también profiláctico de una o más de las anteriores enfermedades.

Parte experimental General

Todas las reacciones fueron realizadas bajo atmósfera de nitrógeno con solventes secos bajo condiciones anhidras, a menos que se diga otra cosa. Los solventes anhidros fueron obtenidos por medio del paso de ellos a través de columnas de alúmina activada comercialmente disponibles. Todos los reactivos fueron adquiridos con la calidad comercial más alta y utilizados sin purificación adicional. Las reacciones fueron generalmente monitoreadas por medio de cromatografía de capa delgada realizada sobre placas de gel de sílice de 0,25 mm de E. Merck (60F-254). El gel de sílice de E. Merck (60, tamaño de partícula 0,040-0,063 mm) fue utilizado para cromatografía flash en columna. Se llevaron a cabo separaciones por cromatografía preparativa en capa delgada (PTLC) sobre placas de gel de sílice de 0,25, 0,50 ó 1 mm de E. Merck (60F-254). Los puntos de fusión (pf) no están corregidos y fueron registrados sobre un aparato para punto de fusión por medio de capilar marca Thomas-Hoover Unimelt. Las rotaciones ópticas fueron registradas sobre un polarímetro marca Perkin-Elmer modelo 241. Los espectros de RMN fueron registrados sobre instrumentos marca Bruker DRX-600, DRX-500, AMX-400 o AC-250 y calibrados utilizando solventes residuales no deuterados como referencia interna. Todas las marcaciones de átomos de carbono, por ejemplo C15, se refieren a la numeración de la epotilona A (1) (ver Figura 1). Los espectros IR fueron registrados sobre un espectrómetro FT-IR serie 1600 de Perkin-Elmer. Los espectros de masas de alta resolución fueron registrados sobre un espectrómetro de masas IonSpec marca PerSeptive Biosystems Voyager^{TM} (MALDI-FTMS) o sobre un espectrómetro de masas API 100 marca Perkin-Elmer (ESI).

Síntesis de epotilona 3 Acoplamiento de Stille de yoduro de vinilo 15 con estanano 16

Una solución de Pd_{2}(dba)_{3}(CHCl_{3} (3,9 mg, 3,8 \mumol), AsPh_{3} (4,6 mg, 15 \mumol), y CuI (7,2 mg, 38 \mumol) en DMF (desgasificado, 0,5 mL) fue añadida a 25ºC a una solución de yoduro 15 (10 mg, 19 \mumol) (Nicolaou, K. C., y colaboradores,, Chem. Eur. J. 2000, 6, 2783-2800) y estanano 16 (11 mg, 38 Pmol) (Nicolaou, K. C., y colaboradores, Bioorg. Med. Chem. 1999, 7, 665-697) en DMF (desgasificado, 0,5 mL), y la solución resultante fue agitada durante 2 horas. Se añadió agua (10 mL), y se extrajo la mezcla con EtOAc (3 (10 mL). La fase orgánica combinada fue lavada con agua (30 mL), salmuera (30 mL), y secada (Na_{2}SO_{4}). Después de la evaporación de los volátiles, se purificó el residuo por medio de cromatografía en columna (sílice, hexanos:EtOAc 2:1 (1:1) para producir epotilona 3 como un sólido de color blanco (7,2 mg, 72%); TLC Rf = 0.29 (sílice, hexanos:EtOAc 1:1); [\alpha]_{D}22 -53 (c 0,51, CH_{2}Cl_{2}); IR (película) v_{max} 3472 (br), 2967, 2920, 1731, 1684, 1461, 1420, 1378, 1249, 1143, 1032, 973, 879, 732, 667 cm^{-1}; MALDI-FTMS m/z 562,2267 (MNa^{+}), calculado para C_{27}H_{41}NO_{6}S_{2}Na 562,2267.

Construcción del aldehído 32

Alcohol 23. A una solución de ciclopropil alcohol 22 (4,08 g, 24 mmol) (Charette, A. B.; y colaboradores, J. Am. Chem. Soc. 1998, 120, 11943-11952) en DMF (40 mL) se le añadió hidruro de sodio (1,45 g, 36 mmol, 60% en aceite mineral) en porciones con agitación a 0ºC. Después de agitar durante 0,5 h a 25ºC, se enfrió la mezcla a 0ºC, se añadió bromuro de bencilo (4,3 mL, 36 mmol) durante 2 min, y se continuó la agitación durante 12 h a 25ºC. La reacción fue terminada con NH_{4}Cl (saturado, 50 mL), se extrajo la mezcla con EtOAc (3 (50 mL) y se lavó el extracto combinado con salmuera (2 (100 mL), se lo secó con (Na_{2}SO_{4}) y se evaporó. Se disolvió el residuo en CH_{2}Cl_{2}:MeOH 4:1 (60 mL), y se ozonizó la solución (100 L/h, aproximadamente 5 g O_{3}/h) a -78ºC durante 21 min. (NOTA: Se deben evitar períodos de reacción más largos para prevenir oxidación del bencil éter hasta el benzoato correspondiente). Se removió el exceso de ozono por medio de un flujo copioso con N_{2} durante 1 min, y luego se añadió NaBH_{4} (2,75 g, 73 mmol) en pequeñas porciones (PRECAUCIÓN! Exotérmico!) seguido por metanol (20 mL). Se calentó la mezcla a 25ºC durante 1 hora, y se paró la reacción por medio de la adición de NH_{4}Cl (saturado, 20 mL). Se extrajo la mezcla con CH_{2}Cl_{2} (2 (50 mL), y se lavó el extracto combinado con salmuera (100 mL), se secó (Na2SO4) y evaporó. Se purificó el residuo por medio de cromatografía flash (sílice, hexanos:EtOAc 5:2) para producir 23 como un aceite de color amarillo (5,07 g, 89%). TLC Rf = 0,20 (sílice, hexanos:EtOAc 3:1); [\alpha]_{D}22 -7,5 (c 1,76, CHCl_{3}); IR (película) v_{max} 3390 (br), 2933, 2859, 1452, 1070, 739, 698 cm^{-1}; MALDI-FTMS m/z 257,1519 (MNa^{+}), calculado para C_{15}H_{22}O_{2}Na 257,1512.

Yoduro 24. A una solución de ciclopropil alcohol 23 (10,08 g, 43,0 mmol) en CH_{2}Cl_{2} seco (100 mL) a 0ºC se le añadió cloruro de metanosulfonilo (4,2 mL, 54 mmol) seguido por trietilamina (9,0 mL, 65 mmol) gota a gota. Empezó a formarse inmediatamente un precipitado blanco. Se agitó la mezcla a 25ºC durante 1 hora, luego se añadieron NH_{4}Cl (saturado, 50 mL) y agua (50 mL) y se separaron las fases. Se extrajo la fase acuosa con EtOAc (100 mL), y se lavó la fase orgánica combinada con salmuera, se la secó (Na_{2}SO_{4}) y evaporó. Se disolvió el residuo en acetona seca (200 mL), y s añadió yoduro de sodio (19,3 g, 129 mmol). Se sometió a reflujo a la solución inicialmente casi clara durante 40 min, durante los cuales se formó un precipitado blanco. Se añadió agua (100 mL) y se extrajo la mezcla con éter (500 + 250 mL). Se secó el extracto combinado y se lo evaporó, y se purificó el residuo por medio de cromatografía flash (sílice, hexanos:EtOAc 5:1) para producir 24 como un aceite incoloro (14,16 g, 95%). TLC Rf= 0,66 (sílice, hexanos:EtOAc 5:1); [\alpha]_{D}22 -16 (c 2,05, CHCl_{3}); IR (película) v_{max} 2916, 2848, 1453, 1217, 1098, 1073, 735, 697 cm^{-1}; ESI-MS m/z 367 (MNa^{+}), calculado para C_{15}H_{21}IONa 367.

Hidrazona 26. Se preparó una solución de LDA por medio de la adición de n-BuLi (13,1 mL, 21,0 mmol, 1,6 M en hexanos) a diisopropilamina (2,94 mL, 21,0 mmol) en THF (10 mL) a -78ºC, luego se calentó la solución a 0ºC, y se agitó durante 10 min. A esta solución de LDA se le añadió propionaldeído SAMP hidrazona 25 (3,32 g, 19,5 mmol) (Nicolaou, K. C., y colaboradores, J. Am. Chem. Soc. 1997, 119, 7974-7991; Enders, D. Aymmetric Synth. 1984, 3, 275-339; y Enders, D., y colaboradores, Synthesis 1996, 1403-1418), y se agitó la mezcla durante 6 h a 0ºC, durante las cuales se formó un precipitado de color blanco. Se enfrió la mezcla a -98ºC (baño de MeOH/N_{2}(I)) y se añadió una solución de yoduro 24 (5,16 g, 15,0 mmol) en THF (20 mL) durante 0,5 horas. Se le permitió a la mezcla de reacción calentarse hasta -10ºC durante 14 horas, y luego se detuvo la reacción con NH_{4}Cl (saturado, 10 mL). Se extrajo la mezcla con EtOAc (100 mL + 2 (50 mL), se secó el extracto combinado (Na2SO4) y se evaporó, y se purificó el residuo por medio de cromatografía flash (sílice, hexanos:EtOAc 6:1 (4:1) para producir hidrazona 26 como un aceite de color amarillo (4,88 g, 84%). TLC Rf = 0.38 (sílice, hexanos:EtOAc 5:1); [\alpha]_{D}22 -61 (c 1,45, CHCl_{3}); IR (película) V_{max} 2926, 1454, 1097, 736, 697 cm^{-1}; MALDI-FTMS m/z 387,3008 (MH^{+}), calculado para C_{24}H_{39}N_{2}O_{2} 387,3006.

Aldehído 17. Se calentó una solución de hidrazona 26 (3,82 g, 9,9 mmol) en yodometano (10 mL) a 60ºC (con condensador de reflujo) durante 3 horas, y luego se enfrió hasta 25ºC. Se evaporó el exceso de yodometano y se removieron las trazas con bomba de vacío de aceite. Se agitó vigorosamente el jarabe residual de color Amarillo con HCl 3 N (190 mL) y pentano (190 mL) durante 3 h a 25ºC, se separaron las fases, y se extrajo la fase acuosa con pentano (100 mL). Se secó la fase orgánica combinada (Na_{2}SO_{4}, NaHCO_{3}) y se la evaporó para producir aldehído 17 como un aceite de color amarillo (2,38 g, 88%), [\alpha]_{D}22 +2 (c 1,3, CHCl_{3}); IR (película) v_{max} 2931, 2856, 1724, 1454, 1095, 1074, 736, 698 cm^{-1}; MALDI-FTMS m/z 297,1830 (MNa^{+}), calculado para C_{18}H_{26}O_{2}Na 297,1825.

Debido a la inestabilidad de la configuración con C8 (numeración de la epotilona), se debe utilizar el aldehído inmediatamente en la siguiente etapa. Se estimó el dr con C8 de la siguiente manera: Se trató una muestra de 17 con un exceso de NaBH_{4} en metanol durante 10 min. Se detuvo la reacción con NH_{4}Cl (saturado), se extrajo la mezcla con EtOAc, y se secó el extracto (Na_{2}SO_{4}) y se evaporó. Se trató el residuo con (R)-(-)-MTPACI (2-3 equivalentes), un exceso de trietilamina y 4-DMAP en CH_{2}Cl_{2} durante 3 horas. La purificación por medio de TLC preparativa produjo una muestra del éster (S)-MTPA, que por medio de análisis de RMN ^{1}H mostró un dr = 97:3, con la estereoquímica absoluta correcta con C8 como el isómero principal (Tsuda, M., y colaboradores, J. Org. Chem. 2000, 65, 1349-1352). Se obtuvieron resultados análogos por medio del uso de (S)-(+)-MTPACI.

Producto de Aldol 27. Se preparó una solución de LDA por medio de la adición de n-BuLi (7,5 mL, 12 mmol, 1,6 M en hexanos) a diisopropilamina (1,68 mL, 12 mmol) en THF (12 mL) a -78ºC, luego se calentó brevemente la solución a 0ºC, y finalmente se enfrió nuevamente a -78ºC. Se añadió gota a gota una solución de cetona 19 (4,63 g, 11,5 mmol) (Nicolaou, K. C., y colaboradores, J. Am. Chem. Soc. 1997, 119, 7974-7991) en THF (12 mL) durante 2 min, y se agitó la mezcla durante 1 h a -78ºC y luego durante 0.5 h a -40ºC. Se enfrió nuevamente a -78ºC, y se añadió una solución de aldehído 17 (1,37 g, 5,0 mmol) en THF (25 mL), preenfriada a -78ºC, a través de una cánula durante 1 min, teniendo cuidado de garantizar un calentamiento mínimo durante la transferencia. Se agitó la mezcla durante 5 min, y se detuvo luego la reacción por medio de una inyección rápida de una solución de AcOH (1,4 mL) en THF (4,2 mL). Después de 5 min a -78ºC, se calentó la mezcla hasta 25ºC y se la repartió entre NH_{4}Cl (saturado, 50 mL) y éter (50 mL). Se extrajo la fase acuosa con éter (2 (50 mL), se secó el extracto combinado (Na_{2}SO_{4}) y se evaporó, y se purificó el residuo por medio de cromatografía flash (sílice, hexanos:éter 20:1 ( 6:1) para producir cetona recuperada 19 (1,71 g, 4,25 mmol) seguido por el producto de aldol 27 en forma diasteroméricamente pura (2,73 g, 81%). TLC Rf = 0.34 (sílice, hexanos:EtOAc 5:1); [\alpha]_{D}22 -40 (c 1,0, CHCl_{3}); IR (película) v_{max} 3502 (br), 2954, 2928, 2856, 1681, 1472, 1255, 1098, 836, 776 cm^{-1}; MALDI-FTMS m/z 699,4796 (MNa^{+}), calculado para C_{39}H_{72}O_{5}Si_{2}Na 699,4816.

Alcohol 28. Se enfrió una solución del producto de aldol 27 (2,71 g, 4,0 mmol) y 2,6-lutidina (1,40 mL, 12 mmol) en CH_{2}Cl_{2} (25 mL) hasta -20ºC y luego se añadió gota a gota TBSOTf (1,84 mL, 8,0 mmol). Se agitó la mezcla durante 1 h a -20ºC y se detuvo luego la reacción por medio de la adición de NH_{4}Cl (saturado, 25 mL). Se calentó la mezcla a 25ºC, se separaron las fases y se extrajo fase acuosa con CH_{2}Cl_{2} (25 mL) y éter (25 mL). Se secó la fase orgánica combinada (Na_{2}SO_{4}) y se evaporó, y se filtró el residuo a través de un tapón de sílice eluyendo con hexano:éter 10:1. Se evaporó el filtrado y se disolvió el éter crudo de sililo resultante (3,14 g, 4,0 mmol, 99%) en THF (40 mL). A éste se le añadió una solución fría (0ºC) del complejo HF-piridina (6,4 mL) y piridina (18 mL) en THF (32 mL) a 0ºC (esta solución fue preparada por medio de la adición lenta del complejo HF-piridina a una solución de piridina en THF a 0ºC; PRECAUCIÓN! HF-piridina es altamente corrosivo. La adición de HF-piridina a la solución de piridina-THF es altamente exotérmica, y debe ser hacha con agitación y enfriamiento en baño de hielo para prevenir salpicaduras), y se agitó la solución resultante a 25ºC durante 4 horas. Se diluyó la mezcla con EtOAc (100 mL), y se la colocó en un baño de hielo, y se la apagó por medio de la adición cuidadosa de NaHCO_{3} (saturado, 100 mL) y tanto NaHCO_{3} como sea necesario para garantizar la neutralización completa (PRECAUCIÓN! Forma espuma!). Se extrajo la mezcla con EtOAc (3 (100 mL), y se secó el extracto combinado (Na_{2}SO_{4}) y se lo evaporó, y se purificó el residuo por medio de cromatografía flash (sílice, hexanos:EtOAc 5:1) para producir 28 como un aceite incoloro (2,40 g, 89%). TLC Rf = 0.39 (sílice, hexanos:EtOAc 5:1); [\alpha]_{D}22 -26 (c 1,1, CHCl_{3}); IR (película) v_{max} 3458 (br), 2929, 2856, 1693, 1472, 1462, 1255, 1093, 986, 836, 775 cm^{-1}; MALDI-FTMS m/z 699.4807 (MNa^{+}), calculado para C_{39}H_{72}O_{5}Si_{2}Na 699,4816.

Éster 29. Se mezclaron el alcohol 28 (2,40 g, 3,5 mmol), periodinano de Dess-Martin (3,75 g, 8,8 mmol), NaHCO_{3} (0,74 g, 8,8 mmol) y agua (76 \muL, 4,2 mmol) en CH_{2}Cl_{2} (80 mL), y se agitó la suspensión resultante durante 1 hora. Se diluyó la mezcla con éter (200 mL), agua (100 mL) y NaHCO_{3} (saturado, 100 mL), y luego se filtró. Se separaron las fases y se extrajo la fase acuosa con éter (2 (100 mL). Se secó el extracto combinado (Na_{2}SO_{4}) y se evaporó, y se filtró el residuo a través de un tapón de sílice eluyendo con hexanos:EtOAc 6:1. Se evaporó el filtrado y se disolvió el aldehído crudo resultante (2,15 g, 3,2 mmol, 90%) en una mezcla de THF (80 mL), t-BuOH (145 mL) y 2-metil-2-buteno (25 mL). A esta solución se le añadió una solución de NaH_{2}PO_{4} (0,95 g, 6,7 mmol) y NaClO_{2} (1,14 g, 10 mmol) en agua (31 mL), y se agitó la mezcla resultante vigorosamente durante 1 hora. Se removieron los volátiles por medio de evaporación, y se repartió el residuo entre EtOAc (100 mL) y salmuera (100 mL). Se separaron las fases y se extrajo la fase acuosa con EtOAc (3 (100 mL). Se secó el extracto combinado (Na_{2}SO_{4}) y se evaporó, y se disolvió el residuo en DMF (5 mL) y se evaporó nuevamente para remover trazas de t-BuOH. El ácido crudo así obtenido (2,4 g, aproximadamente 3,2 mmol >100%,) fue nuevamente disuelto en DMF (10 mL), al cual se le añadieron 2-(trimetilsilil)etanol (1,83 mL, 12,7 mmol), EDC (0,92 g, 4,8 mmol), y 4-DMAP (40 mg, 0,33 mmol). Se agitó la suspensión resultante durante 14 horas, después de las cuales se obtuvo una solución clara. Se añadió agua (10 mL) y se extrajo la mezcla con éter (3 (50 mL). Se lavó el extracto combinado con una mezcla de agua-salmuera (100 + 100 mL), se secó (Na_{2}SO_{4}) y se evaporó. Se purificó el residuo por medio de cromatografía flash (sílice, hexanos:EtOAc 10:1) para producir el éster 29 como un aceite viscoso, de color amarillo pálido (2,08 g, 74%). TLC Rf= 0.57 (sílice, hexanos:EtOAc 10:1); [\alpha]_{D}22 -33 (c 1,2, CHCl_{3}); IR (película) v_{max} 2954, 2930, 2856, 1735, 1695, 1472, 1385, 1252, 1090, 988, 836, 776 cm^{-1}; MALDI-FTMS m/z 813-5315 (MNa^{+}), calculado para C_{44}H_{82}O_{6}Si_{3}Na 813,5311.

Aldehído 30. A una solución de bencil éter 29 (2,08 g, 2,63 mmol) en EtOH:EtOAc 1:1 (50 mL) se le añadió Pd(OH)_{2} al 20% sobre carbón (2,1 g, 60% de humedad), y se hidrogenó la mezcla durante 1 hora. Se filtró entonces a través de Celite para remover el catalizador, se evaporó el filtrado, y se evaporó el residuo conjuntamente con benceno para remover las trazas de EtOH. Se disolvió el alcohol crudo resultante (1,89 g, aproximadamente 2,6 mmol, >100%) en CH_{2}Cl_{2} (60 mL), se añadieron periodinano de Dess-Martin (2,76 g, 6,5 mmol), NaHCO_{3} (0,55 g, 6,5 mmol) y agua (56 \muL, 3,1 mmol), y se agitó la suspensión resultante durante 1 hora. Se diluyó la mezcla con éter (150 mL), agua (75 mL) y NaHCO_{3} (saturado, 75 mL), y se filtró después. Se separaron las fases y se extrajo la fase acuosa con éter (2 (75 mL). Se secó el extracto combinado (Na_{2}SO_{4}) y se evaporó, y se purificó el residuo por medio de cromatografía flash (sílice, hexanos:EtOAc 95:1) para producir aldehído 30 como un aceite viscoso (1,55 g, 84%). TLC Rf= 0.24 (sílice, hexanos:EtOAc 15:1); [\alpha]_{D}22 - 47 (c 1,3, CHCl_{3}); IR (película) v_{max} 2954, 2856, 1734, 1703, 1251, 1173, 1084, 988, 837, 776 cm^{-1}; MALDIFTMS m/z 721.4671 (MNa^{+}), calculado para C_{37}H_{74}O_{6}Si_{3}Na 721,4685.

Enol éter 31. A una suspensión de MeOCH_{2}PPh_{3}Cl (3,09 g, 9,0 mmol) en THF (20 mL) a 0ºC se le añadió NaHMDS (8,5 mL, 8,5 mmol, 1 M en THF) gota a gota. Se desarrolló un color rojo. Se agitó la mezcla a 0ºC durante 0,5 h y luego se la enfrió hasta -40ºC. Se añadió una solución de aldehído 30 (2,12 g, 3,0 mmol) en THF (7 mL), y se le permitió a la mezcla calentarse hasta -10ºC durante 2 horas. Se detuvo la reacción con NH_{4}Cl (saturado, 15 mL), se separaron las fases, y se extrajo la fase acuosa con EtOAc (2 (75 mL). Se secó el extracto combinado (Na_{2}SO_{4}) y se evaporó, y se purificó el residuo por medio de cromatografía flash (sílice, hexanos:EtOAc 30:1) para producir enol éter 31 como un aceite viscoso incoloro (1,85 g, 84%, olefina cis:trans aproximadamente 1:1 por medio de RMN ^{1}H). TLC Rf = 0.23 (sílice, hexanos:EtOAc 30:1); [\alpha]_{D}22 -36 (c 1,2, CHCl_{3}); IR (película) v_{max} 2954, 2930, 2856, 1735, 1695, 1251, 1171, 1105, 988, 836, 776 cm^{-1}; MALDI-FTMS m/z 749.4996 (MNa^{+}), calculado para C_{39}H_{78}O_{6}Si_{3}Na 749,4998.

Aldehído 32. A una solución de enol éter 31 (847 mg, 1,16 mmol) en dioxano:agua 9:1 (12 mL) se le añadió piridinio para-toluensulfonato (2,34 g, 9,31 mmol) y se agitó la mezcla a 70ºC hasta que TLC indicó que se completó la reacción (6-10 h). Se detuvo luego la reacción con NaHCO_{3} (saturado, 15 mL), y se extrajo luego la mezcla con EtOAc (3 (50 mL). Se secó el extracto combinado (Na_{2}SO_{4}) y se evaporó, y se purificó el residuo por medio de cromatografía flash (sílice, hexanos:EtOAc 15:1) para producir 32 como un aceite viscoso incoloro (681 mg, 82%). TLC Rf = 0-29 (sílice, hexanos:EtOAc 15:1); [\alpha]_{D}22 -34 (c 1,0, CHCl_{3}); IR (película) V_{max} 2954, 2856, 1731, 1695, 1251, 1086, 988, 836, 776 cm^{-1}; MALDI-FTMS m/z 735,4823 (MNa^{+}), calculado para C_{38}H_{76}O_{6}Si_{3}Na 735,4842.

Construcción de yoduros de vinilo 20e Acoplamiento de Sonogashira de bromuros de arilo (38) con propino (procedimiento general)

A una solución brevemente desoxigenada (burbujeo de Ar) del bromuro de arilo 38 (3,5 mmol) en DMF (3 mL) y diisopropil amina (2.5 mL) se le añadieron Pd(PPh_{3})_{2}Cl_{2} (25 mg, 36 \mumol) y CuI (13 mg, 70 \mumol) bajo atmósfera de Ar(g), y luego se reemplazó la atmósfera inerte por propino (1 atm, en una redoma). Se agitó la mezcla a 25ºC durante 3 horas. Durante este tiempo, se formó un precipitado, y la mezcla de reacción se tornó de color marrón oscuro. Se añadió agua (15 mL), se extrajo la mezcla con EtOAc, y se secó el extracto combinado (Na_{2}SO_{4}) y se lo evaporó. Se obtuvo 1-arilpropino puro por medio de cromatografía flash (sílice, mezclas de hexano:EtOAc).

Producto del acoplamiento de Sonogashira a partir de 38. Aceite color marrón (97%); TLC Rf = 0,21 (sílice, hexanos:EtOAc 5:1); IR (película) v_{max} 2908, 2226, 1567, 1531, 1461, 1431, 1361, 1108, 1008, 832 cm^{-1}; MALDI-FTMS m/z 164.0527 (MH^{+}), calculado para C_{9}H_{10}NS 164,0528.

Hidroestanilación-yodación (procedimiento general). Esta es una adaptación del procedimiento previamente reportado (Betzer, J.-F., y colaboradores, Tetrahedron Lett. 1997, 38, 2279-2282). A una solución de hexabutilditina (10.1 mL, 20 mmol) en THF seco (40 mL) a -78ºC se le añadió n-BuLi (12,9 mL, 20 mmol, 1,55 M en hexanos), y se agitó la solución clara resultante a -40ºC durante 30 min. Se la trasfirió luego a través de una cánula a una suspensión de CuCN (0,90 g, 10 mmol) en THF (2 mL) a -78ºC. Se formó una solución color amarillo claro, y se la agitó durante 5 min a -40ºC antes de enfriarla nuevamente hasta -78ºC. Luego se añadió metanol seco (23 mL, 0,57 mol) para producir una solución de color rojo, que fue agitada a -40ºC durante 15 min, después de lo cual se añadió una solución del arilpropino (5,0 mmol) en THF (5 mL). La solución de color rojo-naranja fue agitada a -10ºC durante la noche (algunas de las sales de Cu y/o de Cu^{2+} precipitaron), luego se la enfrió hasta -20ºC, seguido por la adición de metanol (10 mL). Después de 15 min a -20ºC, se añadió agua (10 mL), y se continuó la agitación durante otros 15 min, mientras se calentaba hasta 25ºC. Se extrajo la mezcla con éter, y se lavó la fase orgánica con salmuera, se secó (Na_{2}SO_{4}) y se evaporó. La cromatográfica flash (sílice, mezclas de hexanos:EtOAc) produjo el vinilestanano intermedio, que se disolvió en CH_{2}Cl_{2} (5 mL). Se añadió entonces gota a gota una solución de yodo (1,05 equivalentes) en CH_{2}Cl_{2} (40 mL por g de I_{2}) a esta solución a 0ºC. Después de las últimas gotas, persistió el color del I_{2}, y se permitió que la reacción continuara durante otros 5 min a 0ºC. Luego se evaporó el solvente y se disolvió el residuo en éter. Se añadieron KF (solución en agua 1 M, 3 equivalentes) y Na_{2}S_{2}O_{3} (saturado, 10 mL por mmol de sustrato), y se agitó la mezcla durante 15 min a 25ºC durante los cuales se formó un precipitado de color blanco. Se filtró la mezcla a través de Celite, y se secó la fase orgánica (Na_{2}SO_{4}) y se evaporó. Se purificó el residuo por medio de cromatografía flash (sílice, mezclas de hexanos:EtOAc) para producir el yoduro de vinilo deseado.

Yoduro de vinilo 20e. El vinil estanano intermedio es fácilmente protodesestanilado; por lo tanto, la cromatografía flash de este intermedio debe ser realizado utilizando hexanos:EtOAc:Et_{3}N 50:1:1 como eluyente, y el vinilestanano obtenido contenía otros compuestos de butil estaño. Siguiendo el procedimiento general, se trató la mezcla con suficiente I_{2} hasta que persistió el color marrón al final de la adición (aproximadamente 2 equivalentes de I_{2}). Después de la cromatografía flash (hexanos:EtOAc 50:1), se obtuvo yoduro de vinilo 20e como un aceite de color amarillo (74%). TLC Rf= 0,41 (sílice, hexanos:EtOAc 50:1); IR (película) v_{max} 3102, 2923, 1620, 1423, 1300, 1065, 1035, 964, 863, 723, 562 cm^{-1}; MALDI-FTMS m/z 297,9215 (MH^{+}), calculado para C_{7}H_{9}INS_{2} 297,9216.

Síntesis de análogos de epotilona 8-144

Acoplamiento de Nozaki-Hiyama-Kishi de aldehídos (34, 40) con vinil estananos (20a-g) (procedimiento general). A una solución de aldehído 32 brevemente desgasificada al vacío (107 mg, 0.15 mmol), al yoduro de vinilo requerido 20 (0,45 mmol), y a la 4-tert-butilpiridina (665 \muL, 4,5 mmol) en DMSO (3 mL) se les añadió CrCl_{2} anhidro (184 mg, 1,5 mmol) y NiCl_{2} anhidro (4 mg, 0,03 mmol). Se agitó la mezcla a 25ºC durante 3 horas, después de lo cual se añadió otra porción de yoduro de vinilo (0,45 mmol), y se continuó la agitación durante 3 horas más. Esto fue repetido una vez más, después de lo cual se continuó la agitación durante la noche. Se detuvo entonces la reacción con agua (5 mL), se añadió piridina (1 mL) para evitar que los complejos del producto con Cr fueran extraídos en la fase acuosa, y se extrajo la mezcla con EtOAc (3 (25 mL). Se lavó el extracto combinado con salmuera (2 (100 mL), se secó (Na_{2}SO_{4}) y se evaporó. La cromatografía flash (sílice, mezclas de hexanos:EtOAc) produjo el producto de acoplamiento, en la mayoría de los casos en forma inseparable del exceso de 4-tert-butilpiridina.

Producto a partir de 20e y 32. Vidrio amarillo (78%, aproximadamente mezcla 1:1 de epímeros C15). TLC Rf =
0,40 (sílice, hexanos:EtOAc 5:1); [\alpha]_{D}22 -28 (c 2,0, CHCl_{3}); IR (película) V_{max} 3416 (br), 2929, 2856, 1732, 1694, 1472, 1251, 1037, 988, 836, 776 cm^{-1}; MALDI-FTMS m/z 906,5021 (MH^{+}), calculado para C_{45}H_{85}NO_{6}S_{2}Si_{3}Na 906,5018.

Desprotección de TBAF (procedimiento general). El producto de la mezcla del acoplamiento de Nozaki-Hiyama-Kishi se disolvió en THF (1,5 mL), y se añadió TBAF (1 M en THF, 0,30 mL, 0,30 mmol) a 0ºC. Después de 1 h a 0ºC, se añadió otra porción de TBAF (0,30 mL, 0,30 mmol), y se agitó la mezcla a 25ºC durante 1 hora. Se detuvo la reacción con NH_{4}Cl (saturado, 5 mL), y se extrajo la mezcla con EtOAc (4 (20 mL). Se secó el extracto combinado (Na_{2}SO_{4}) y se evaporó, y se purificó el residuo por medio de cromatografía flash (sílice, mezclas de hexanos:EtOAc) para producir el hidroxi ácido deseado como una mezcla aproximadamente 1:1 de epímeros C15 (inseparable en esta etapa).

Hidroxi ácido 41e. Sólido de color amarillo (79%, mezcla aproximadamente 1:1 de epímeros C15). TLC Rf= 0,37 (sílice, hexanos:EtOAc 2:1); [\alpha]_{D}22 -23 (c 2,3, CHCl_{3}); IR (película) v_{max} 3356 (br), 2929, 2856, 1712, 1472, 1253, 1085, 1038, 988, 836, 776 cm^{-1}; MALDI-FTMS m/z 806,4282 (MNa^{+}), calculado para C_{40}H_{73}NO_{6}S_{2}Si_{2}Na 806,4315.

Macrolactonización de Yamaguchi (procedimiento general). A una solución del hidroxi ácido (95 \mumol) en THF seco (8 ml) a 0ºC se le añadió trietilamina (79 \mul, 0.57 mmol) y cloruro de 2,4,6-triclorobenzoilo (40 \mul, 0,23 mmol). Después de agitar a 0ºC durante 1 hora, se añadió la solución resultante durante 2 h a una solución de 4-DMAP (26 mg, 0,21 mmol) en tolueno (20 mL) a 75ºC utilizando una bomba tipo jeringa. Se continuo la agitación a 75ºC durante otra hora después de lo cual se evaporó el tolueno a presión reducida. El residuo fue sometido directamente a cromatografía flash (sílice, mezclas de hexanos:EtOAc) para producir la macrolactona y su epímero (15R), fácilmente separable. En todos los casos el epímero (15S) deseado eluyó después del epímero (15R) menos polar.

Macrolactona 43e. Este producto se aisló como una mezcla cruda que fue directamente sometida a condiciones de desililación global (véase más abajo) sin purificación adicional.

Desililación global (procedimiento general). Se disolvió la macrolactona en TFA al 20% v/v en CH_{2}Cl_{2}, y se mantuvo la solución a 25ºC durante 3 horas, después de lo cual se evaporaron los volátiles sin calentamiento. Se disolvió el residuo en EtOAc, y se lavó la solución con NaHCO_{3} (saturado), se secó (Na_{2}SO_{4}) y se evaporó. La cromatográfica flash (sílice, mezclas de hexanos:EtOAc) produjo la epotilona pura.

Epotilona 12. Aceite viscoso (17% a partir de 41e); TLC Rf = 0,38 (sílice, hexanos:EtOAc 2:1); [\alpha]_{D}22 -52 (c 0,50, CHCl_{3}); IR (película) v_{max} 3490 (br), 2933, 1732, 1686, 1255, 1038, 756 cm^{-1}; MALDI-FTMS m/z 538,2666 (MH^{+}), calculado para C_{28}H_{44}NO_{5}S_{2} 538,2655.

Ejemplo Cápsulas blandas

5.000 cápsulas blandas de gelatina, cada una conteniendo como ingrediente activo 0,05 g de uno de los compuestos de fórmula I mencionado en los ejemplos anteriores, se preparan de la siguiente manera:

Composición
ingrediente activo		250 g
Lauroglicol		2 litros

Proceso de preparación: Se suspende el ingrediente activo pulverizado en Lauroglykol® (laurato de propilen glicol, Gattefossé S.A., Saint Priest, Francia) y se muele en un pulverizador húmedo hasta un tamaño de grano aproximadamente de 1 a 3 \mum. Se introducen porciones cada una conteniendo 0,419 g de la mezcla en cápsulas blandas de gelatina por medio de una máquina llenadora de cápsulas.

Descripción detallada de las figuras

La Figura 1 muestra las estructuras de epotilonas seleccionadas naturales y diseñadas. Los cajones de color gris indican los compuestos sintetizados en este estudio.

La Figura 4 muestra el análisis retrosintético del análogo de trans-ciclopropil epotilona B (12).

La Figura 5 muestra la construcción del aldehído 32. Reactivos y condiciones: (a) Ver Nicolaou, K. C., y colaboradores, ChemBioChem 2001, 2, 69-75; Charette, A. B.; y colaboradores, J. Am. Chem. Soc. 1998, 120, 11943-11952; (b) NaH (1,5 equivalentes), BnBr (1,5 equivalentes), DMF, 0 \rightarrow 25ºC, 12 h; (c) O_{3}, CH_{2}Cl_{2}:MeOH 4:1, -78ºC, 21 min; luego NaBH_{4} (3,0 equivalentes), -78 \rightarrow 25ºC, 1 h, 89% para 2 etapas; (d) MsCl (1,3 equivalentes), Et_{3}N (1,5 equivalentes), CH_{2}Cl_{2}, 25ºC , 1 h; (e) NaI (3,0 equivalentes), acetona, reflujo, 40 min, 95% para 2 etapas; (f) LDA (1,4 equivalentes), 25 (1,3 equivalentes), THF, 0ºC, 6 h; luego 24, -98 \rightarrow -10ºC, 14 h, 84%; (g) MeI, 60ºC, 3 h; (h) HCl 3 N:pentano 1:1, 25ºC, 3 h, 88% para 2 etapas; (i) LDA (2,4 equivalentes), 19 (2,3 equivalentes), THF, -78ºC, 1 h; luego -40ºC, 0,5 h; luego 17 a -78ºC, 5 min, 81%; (j) TBSOTf (2,0 equivalentes), 2,6-lutidina (3,0 equivalentes), PH_{2}Cl_{2}, -20ºC, 1 h; (k) HF-py, piridina, THF, 25ºC, 4 h, 89% para 2 etapas; (I) DMP (2,5 equivalentes), NaHCO_{3} (2,5 equivalentes), H_{2}O, CH_{2}Cl_{2}, 25ºC, 1 h; (m) NaClO_{2} (3,1 equivalentes), NaH_{2}PO_{4} (2,1 equivalentes), 2-metil-2-buteno (74 equivalentes), t-BuOH, THF, H_{2}O, 25ºC, 1 h; (n) 2-(trimetilsilil)etanol (4,0 equivalentes), EDC (1,5 equivalentes), 4-DMAP (0,1 equivalentes), DMF, 25ºC, 14 h, 74% para 3 etapas; (o) 20% Pd(OH)_{2}/C, H_{2} (1 atm), EtOH:EtOAc 1:1, 25ºC, 1 h; (p) DMP (2,5 equivalentes), NaHCO_{3} (2,5 equivalentes), H_{2}O, CH_{2}Cl_{2}, 25ºC, 1 h, 84% para 2 etapas; (q) MeOCH_{2}PPh_{3}Cl (3,0 equivalentes), NaHMDS (2,8 equivalentes), THF, -40 \rightarrow -10ºC, 2 h, 84%; (r) PPTS (8,0 equivalentes), dioxano:H_{2}O 9:1, 70ºC, 6 h, 82%, 4-DMAP = 4-(dimetilamino)piridina; DME = 1,2-dimetoxi-etano; DMP = Periodinano de Dess-Martin; EDC = clorhidrato de 1-(3-dimetilaminopropil)-3-etilcarbodiimida; HF-py = complejo de fluoruro de hidrógeno-piridina; NaHMDS = hexametildisilazida sódica; PPTS = piridinio para-toluensulfonato; TMSE = 2-trimetilsililetilo.

La Figura 6 muestra la construcción de yoduros de vinilo 20e, Reactivos y condiciones: (b) Pd(PPh_{3})_{2}Cl_{2} (0,01 equivalentes), CuI (0,02 equivalentes), HCéCCH_{3} (1 atm), DMF, i-Pr_{2}NEt, 25ºC, 3 h, 35: 96%; (c) (i) n-BuLi (4,0 equivalentes), (n-Bu_{3}Sn)_{2} (4,0 equivalentes), CuCN (2,0 equivalentes), MeOH, THF, -10ºC, 12 h; (ii) I_{2} (1,05 equivalentes), CH_{2}Cl_{2}, 0ºC, 5 min, 20e: 37% a partir de 37; TrCl = cloruro de trifenilmetilo; 4-DMAP = 4-(dimetilamino)piridina; MOMCI = clorometil metil éter,

La Figura 7 es la síntesis de análogos de epotilona 12, Reactivos y condiciones: (a) CrCl_{2} (10 equivalentes), NiCl_{2} (0,2 equivalentes), 4-t-butilpiridina (30 equivalentes), 20 (3,0 equivalentes), DMSO, 25ºC, durante la noche; (b) TBAF (4,0 equivalentes), THF, 0ºC, 1 h; luego 25ºC, 1 h; (c) Et_{3}N (6,0 equivalentes), 2,4,6-triclorobenzoilcloruro (2,4 equivalentes), 41 ó 42, THF, 0ºC, 1 h; luego 4-DMAP (2,2 equivalentes), tolueno, 75ºC, 3 h; (d) TFA al 20% v/v en CH_{2}Cl_{2}, 25ºC, 3 h (excepto 43d); (e) Estimado por medio de RMN ^{1}H; (f) Desprotección de 43d: TMSBr (10 equivalentes), 4\ring{A} MS, CH_{2}Cl_{2}, -30ºC, 1 h; luego TFA al 20% v/v en CH_{2}Cl_{2}, 25ºC, 3 h, TBAF = fluoruro de tetrabutilamonio; 4-DMAP = 4-(dimetilamino)piridina; TFA = ácido trifluoroacético; TMSBr = bromuro de trimetilsililo; MS = tamices moleculares.

La Figura 8 ilustra una tabla que divulga la citotoxicidad de las epotilonas 1 a 14 y el paclitaxel contra las células humanas de carcinoma de ovario 1A9 y las líneas de células mutantes de \beta-tubulina seleccionadas con paclitaxel o epotilona A. Los efectos antiproliferativos de los compuestos analizados contra los clones madre 1A9 y los clones resistentes a la droga seleccionada entre paclitaxel y epotilona (PTX10, PTX22 y A8, respectivamente) fueron evaluados en un ensayo de inhibición de crecimiento de 72 h utilizando el ensayo SRB (sulforhodamina-B) (Skehan, P.; y colaboradores, J. Natl. Cancer Inst. 1990, 82, 1107-1112). Los valores de IC_{50} para cada compuesto se dan en nM y representan el promedio de 3-9 experimentos independientes con el error estándar del promedio. La resistencia relativa (RR) se calcula como un valor de IC_{50} para cada sublínea resistente dividida por aquel para la línea celular madre (1A9). CP = ciclopropilo; py = cadena lateral de 5-metilpiridina; pyOH = cadena lateral de 5-hidroximetilpiridina; 5tmpy = cadena lateral de 5-tiometilpiridina; 6tmpy = cadena lateral de 6-tiometilpiridina; tmt = cadena lateral de 2-tiometil tiazol.

La Figura 9 ilustra una tabla que divulga la potencia y la citotoxicidad de la polimerización de la tubulina de las epotilonas 1-8, 10-14, y del paclitaxel contra líneas celulares humanas de cáncer epidermoide. (a) El grado de polimerización de la tubulina de porcino (TP) por parte de 4 \muM de un compuesto se cuantificó con relación al efecto de 25 \muM de epotilona B (que se definió como el 100%) como se describió (Nicolaou, K. C.; y colaboradores, Chem. Biol. 2000, 7, 593-599). (b) La concentración de la droga requerida para máxima inhibición del crecimiento celular (los valores de IC_{50} se dan en nM) se evaluó después de un período de exposición a la droga de 96 horas por medio de la cuantificación de la masa celular utilizando un método de coloración de la proteína como se describió (Meyer, T.; y colaboradores, Int. J. Cancer 1989, 43, 851-856), KB-31: células epidermoides sensibles al Taxol®, KB-8511: células epidermoides resistentes al Taxol® (debido a la sobreexpresión de Pgp). La resistencia relativa (RR) se calculó por medio de la división del valor de IC_{50} para la línea celular resistente por aquel de la línea celular sensible. (c) Los datos de la ref. 3 (los valores del % de TP para Taxol®, Epo A y Epo B fueron 49, 69 y 90, respectivamente). CP = ciclopropilo; py = cadena lateral de 5-metilpiridina; pyOH = cadena lateral de 5-hidroximetilpiridina; 5tmpy = cadena lateral de 5-tiometilpiridina; 6tmpy = cadena lateral de 6-tiometilpiridina; tmt = cadena lateral de 2-tiometil tiazol.

La Figura 10 ilustra una tabla que divulga las afinidades de enlazamiento de los análogos de epotilona con el sitio de enlazamiento taxoide de los microtúbulos. (a) El enlazamiento de los diferentes ligandos con el sitio taxoides de los microtúbulos se midió por medio del desplazamiento de un derivado fluorescente de Taxol® (Flutax-2) a partir de su sitio de enlazamiento (Figura 2) (Diaz, J. F.; y colaboradores, J. Biol. Chem. 2000, 275, 26265-26276). La isoterma de desplazamiento del Flutax-2 de cada ligando se midió al menos dos veces con un lector de fluorescencia de microplacas de polarización en un procedimiento modificado a partir del reporte previo (Andreu, J. M.; Barasoain, I. Biochemistry 2001, 40, 11975-11984). Se emplearon los microtúbulos entrelazados estabilizados que habían sido almacenados en nitrógeno líquido. La constante de enlazamiento del ligando de referencia Flutax-2 se midió por medio de centrifugación y anisotropía de fluorescencia, a cada temperatura (Diaz, J. F.; y colaboradores, J. Biol. Chem. 2000, 275, 26265-26276). El valor de referencia resultante fue de 2,2 (10^{7} M^{-1} a 37ºC. (b) Las constantes de equilibrio de disociación (Kd) se dan en nM. (c) Los cambios de energía libre de enlazamiento estándar (DG^{0}_{app}) se dan en kJ mol^{-1}.

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Referencias citadas en la descripción

Este listado de referencias citado por el solicitante es únicamente para conveniencia del lector. No forma parte del documento europeo de la patente. Aunque se ha tenido gran cuidado en la recopilación, no se pueden excluir los errores o las omisiones y la OEP rechaza toda responsabilidad en este sentido.

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Claims (4)

1. Un compuesto representado por medio de la fórmula I:

4

2. Una composición farmacéutica que contiene un excipiente farmacéuticamente aceptable o diluyente y un compuesto de acuerdo a la reivindicación 1, o un ácido farmacéuticamente aceptable o una sal de adición básica del mismo, cuando sea posible.

3. El uso de un compuesto de acuerdo a la reivindicación 1 para la preparación de un medicamento para el tratamiento de una enfermedad proliferativa.

4. Un proceso para la preparación de un compuesto de acuerdo a la reivindicación 1,

en donde un compuesto de la fórmula VI

5

en donde X es CH_{2} y R es

6

y PG es un grupo de protección para la función hidroxi,

en una primera etapa se condensa por medio de una reacción de esterificación, opcionalmente en presencia de un catalizador,

y en una segunda etapa se desprende el grupo de protección suministrando de este modo una lactona de fórmula I.