ES2297233T3 - Uso de brimonidina en el tratamiento de demencia y enfermedad de parkinson. - Google Patents

Abstract

Uso de brimonidina o una sal farmacéuticamente efectiva de la misma para la preparación de un medicamento para el tratamiento de un estado neurodegenerativo del cerebro de un mamífero.

Description

Uso de brimonidina en el tratamiento de demencia y enfermedad de Parkinson.

Campo de la invención

La presente invención se refiere al uso de brimonidina o una sal farmacéuticamente aceptable de la misma para la preparación de un medicamento para la protección de células nerviosas, particularmente aquellas del sistema nervioso central de mamíferos, de lesión debido a agresión perjudicial, que incluye toxicidad del glutamato y apoptosis. El uso de la presente invención emplea el agonista del receptor adrenérgico alfa 2 brimonidina para evitar la lesión y muerte de células nerviosas, tal como la observada en la enfermedad de Parkinson y enfermedad de Alzheimer.

Antecedentes de la invención

La presente invención se refiere a composiciones farmacéuticas, y particularmente composiciones farmacéuticas que incorporan compuestos que pueden afectar los receptores adrenérgicos alfa 2. La presente invención también se refiere al uso de brimonidina o una sal farmacéuticamente aceptable de la misma para la preparación de un medicamento para tratar una amplia variedad de estados y trastornos, y particularmente estados y trastornos asociados con disfunción del sistema nervioso central.

Los receptores adrenérgicos humanos son proteínas de membrana íntegra que se han clasificado en dos amplias clases, los receptores adrenérgicos alfa y los beta. Ambos tipos median en la acción del sistema nervioso simpático periférico con la unión de catecolaminas, norepinefrina y epinefrina.

La norepinefrina se produce por terminaciones nerviosas adrenérgicas, mientras que la epinefrina se produce por la médula adrenal. La afinidad de unión de receptores adrenérgicos por estos compuestos forma una base de la clasificación: los receptores alfa tienden a unirse a norepinefrina más fuertemente que a epinefrina y mucho más fuertemente de lo que ellos se unen al compuesto sintético isoproterenol. La afinidad de unión preferida de estas hormonas se invierte para los receptores beta. En muchos tejidos, las respuestas funcionales, tales como contracción de músculo liso, inducidas por la activación de receptores alfa se oponen a las respuestas inducidas por la unión al receptor beta.

Posteriormente se puso de relieve y se perfeccionó adicionalmente la distinción funcional entre receptores alfa y beta por la caracterización farmacológica de estos receptores de diversas fuentes de animales y tejidos. Como resultado, los receptores adrenérgicos alfa y beta se subdividieron adicionalmente en subtipos alfa 1, alfa 2, beta 1 y beta 2.

Además, desde entonces se ha reconocido que cada uno de estos receptores tiene varios subtipos; por tanto, el receptor alfa 2 humano puede descomponerse adicionalmente en los subtipos de receptores alfa 2A, alfa 2B y alfa 2C.

Se han reconocido diferencias funcionales entre receptores alfa 1 y alfa 2 y se han descrito compuestos que presentan unión selectiva entre estos dos subtipos.

Por tanto, en el documento WO92/00073 se informó de la capacidad del enantiómero R(+) de terazosina para unirse selectivamente a receptores adrenérgicos del subtipo alfa 1. La selectividad de alfa 1/alfa 2 de este compuesto se describió como significativa porque se dijo que la estimulación de agonistas de los receptores alfa 2 inhibía la secreción de epinefrina y norepinefrina, mientras que se dijo que el antagonismo del receptor alfa 2 aumentaba la secreción de estas hormonas. Por tanto, se dijo que el uso de bloqueantes adrenérgicos alfa no selectivos, tales como fenoxibenzamina y fentolamina, era limitado por su inducción mediada por receptores adrenérgicos \alpha_{2} del aumento de la concentración de catecolamina en plasma y las secuelas fisiológicas asociadas (aumento de frecuencia cardiaca y contracción de músculo liso). Es significativo que la selectividad de compuestos denominados "alfa 1 selectivos" o "alfa 2 selectivos" se ha basado tradicionalmente en datos de K_{D}, que es limitado en comparación con afinidades de unión a receptores y no compara las actividades biológicas actuales en los receptores comparados.

A diferencia, un procedimiento para medir la selectividad de antagonistas de los receptores alfa comprende el ensayo de RSAT (tecnología de selección y amplificación de receptores) como se informa en Messier y col., High Throughput Assays of Cloned Adrenergic, Muscarinic, Neurokinin And Neurotrophin Receptores In Living Mammalian Cells, Pharmacol. Toxicol. 76:308-11 (1995) y se ha adaptado para uso con receptores alfa 2. El ensayo mide una pérdida mediada por receptor de la inhibición de contacto que da como resultado la proliferación selectiva de células que contienen receptor en una población mixta de células confluentes. El aumento en el número de células se evalúa con un gen marcador transfectado apropiado tal como b-galactosidasa, cuya actividad puede medirse fácilmente en un formato de 96 pocillos. Los receptores que activan la proteína G, Gq, provocan esta respuesta. Los receptores alfa_{2}, que normalmente se acoplan a G_{i}, activan la respuesta de RSAT cuando se coexpresan con una proteína Gq híbrida que tiene un dominio de reconocimiento del receptor G_{i}, llamado G_{q}/i5^{2}. Véase Conklin y col., Substitution of Three Amino Acids Switches Receptor Especificity of Gqa To That Of Gia, Nature 363:274-6. (1993).

Se ha informado de diversos agonistas de los receptores adrenérgicos alfa como útiles para tratar una amplia variedad de estados y trastornos. Por tanto, los agonistas de los receptores adrenérgicos alfa tales como clonidina se han descrito y usado como agentes sistémicos e hipotensores oculares, como agentes útiles en el tratamiento de privación de comportamientos adictivos como el fumar y la toxicomanía y como agentes antidismenorréicos. Otro agonista del receptor adrenérgico alfa, tizanidina, se ha usado para el tratamiento de síntomas de espasticidad en pacientes con esclerosis múltiple disminuyendo el tono muscular. También se ha informado de que estos agentes tienen ciertas actividades analgésicas.

Estos agentes, cuando son útiles, han sido perseguidos algunas veces por efectos secundarios graves, que incluyen sedación, efectos cardiovasculares tales como hipotensión y disminución de la frecuencia cardiaca, y mareo, que han limitado su aplicabilidad para ciertas indicaciones. En particular, estos agentes tienden a tener curvas de respuesta a dosis terapéuticas y de sedación que se superponen, de forma que la actividad sedante empieza a ser evidente a las mismas dosis que la aparición de actividad terapéutica (por ejemplo, hipotensora o analgésica) in vivo.

Compuestos tales como, sin limitación, clonidina, tizanidina y dexmedetomidina se han caracterizado en la bibliografía como "agonistas de los receptores adrenérgicos alfa 2" basándose en gran parte estudios de unión. Véase también Hieble y col., J. Med Chem. 38:3415 (1 de septiembre de 1995); Ruffolo y col., J. Med. Chem. 38:3681 (15 de septiembre de 1995). Aunque es verdad que estos agentes son agonistas de los receptores alfa 2, generalmente no se aprecia que estos agentes también contienen cantidades significativas de actividad de los agonistas de los receptores alfa 1. Generalmente tampoco se conoce o se ha apreciado el efecto de tal actividad de los receptores alfa 1 en la actividad de alfa 2.

Por el contrario, el compuesto brimonidina y sus derivados de 2-imidazolin-2-ilimino funcionalmente similares (como se describe más adelante) son agonistas alfa 2 que presentan una actividad agonista notablemente mayor hacia los receptores alfa 2 que hacia los subtipos de receptores alfa 1.

Los trastornos del SNC son un tipo de trastorno neurológico. Varios trastornos del SNC pueden atribuirse a una deficiencia colinérgica, una deficiencia dopaminérgica, una deficiencia adrenérgica y/o una deficiencia serotonérgica. Los trastornos del SNC de aparición relativamente común incluyen demencia presenil (enfermedad de Alzheimer de aparición temprana), demencia senil (demencia del tipo de Alzheimer) y parkinsonismo, incluyendo enfermedad de Parkinson.

La base de la comprensión actual de la enfermedad de Alzheimer se basa en la observación de que ciertas regiones del cerebro de personas afectadas, tales como el hipocampo y la corteza cerebral, mostraron indicios de una pérdida de células nerviosas. Debido a que los investigadores de los 70 han mostrado que algunas de estas neuronas agonizantes son colinérgicas - es decir, se comunican usando el neurotransmisor acetilcolina, que finalmente se descompone por una enzima llamada acetilcolinesterasa. Véase Jones y col., Intern. J. Neurosci. 50:147 (1990); Perry, Br. Med. Bull. 42:63 (1986); y Sitaram y col., Science 201:274 (1978).

Los fármacos que estuvieron disponibles en la pasada década, tales como tacrina y donepezil, son inhibidores de la acetilcolinesterasa. Estos compuestos retrasan el desarrollo de las fases tempranas de la enfermedad de Alzheimer evitando la descomposición de acetilcolina. Sin embargo, una vez que las neuronas colinérgicas degeneran completamente y ya no pueden producir el neurotransmisor acetilcolina, estos fármacos son inútiles.

Además de notarse la pérdida de células nerviosas, los cerebros de pacientes que padecen enfermedad de Alzheimer contienen característicamente conglomerados de proteínas. Estas acumulaciones se producen en dos formas: aquellas encontradas dentro de las neuronas y aquellas encontradas en el espacio intercelular. Los conglomerados intracelulares se llaman ovillos neurofibrilares y aparecen como pares de fibras enrolladas una alrededor de la otra en una hélice. Los análisis han mostrado que los ovillos están constituidos por proteína tau. Tau es significativa porque se une a tubulina, que es responsable de la formación de microtúbulos. El número de ovillos neurofibrilares parece que guarda relación con la gravedad de la enfermedad.

Los conglomerados de proteínas intercelulares o placas están compuestos por depósitos de proteína \beta-amiloide. Las neuronas cercanas parecen frecuentemente hinchadas y deformadas y las placas amiloides van normalmente acompañadas de microglia inflamatoria. La microglia, que es parte del sistema inmunitario del cerebro, puede estar presente en un intento por degradar y eliminar las neuronas dañadas o quizás las propias placas.

No está claro si las neuronas en o cerca de estas placas funcionan normalmente debido a que la densidad de placas sólo guarda una débil relación con la gravedad de la demencia. Además, tales placas presentes en la mayoría de las personas mayores, tengan o no enfermedad de Alzheimer. Sin embargo, su amplia presencia en el hipocampo y la corteza cerebral es específica a los pacientes con Alzheimer y aparecen mucho tiempo antes que lo hagan los ovillos neurofibrilares.

Las placas \beta-amiloides contienen un fragmento de 42 aminoácidos de una proteína de membrana íntegra denominada proteína precursora de \beta-amiloide (BAPP). Este fragmento se genera mediante una escisión en dos etapas de la proteína BAPP, primero por una proteasa denominada \beta secretasa y luego por gamma secretasa. El producto de escisión normal de \beta secretasa y gamma secretasa es un péptido de 40 aminoácidos que, a diferencia del derivado de 42 aminoácidos, no parece que participe en la iniciación o progresión de la enfermedad de Alzheimer.

La enfermedad de Parkinson (EP) es una enfermedad neurodegenerativa debilitante, actualmente de etiología desconocida, caracterizada por temblores y rigidez muscular. Una característica de la enfermedad parece implicar la degeneración de neuronas dopaminérgicas (es decir, que secretan dopamina), particularmente en la sustancia nigra y las regiones tegmentarias ventrales del mesencéfalo. Véase Rinne y col., Brain Res. 54:167 (1991) y Clark y col., Br. J. Pharm. 85:827 (1985). La sustancia nigra participa en la coordinación de señales neurales para los movimientos y la postura. El área tegmentaria ventral (ATV) del mesencéfalo contiene neuronas que se proyectan hacia sitios que incluyen la corteza prefrontal, el área del cerebro asociada con las mayores funciones cognitivas.

Se han hecho ciertos intentos para tratar EP. Un tratamiento propuesto para EP es SINEMET®, que es un comprimido de liberación sostenida que contiene una mezcla de carbidopa y levodopa, disponible de The DuPont Merck Pharmaceutical Co. Otro tratamiento propuesto para EP es ELDEPRYL®, que es un comprimido que contiene clorhidrato de selegilina, disponible de Somerset Pharmaceuticals, Inc. Otro tratamiento propuesto para EP es PARLODEL®, que es un comprimido que contiene mesilato de bromocriptina, disponible de Sandoz Pharmaceuticals Corporation. Otro procedimiento para tratar EP y una variedad de otras enfermedades neurodegenerativas mediante tratamiento con melanina se ha propuesto en la patente de los EE.UU. nº 5.210.076 a Berliner y col. Sin embargo, ninguno de estos tratamientos parece proteger las neuronas de muerte celular.

Breve descripción de la invención

Aunque se ha sabido que la brimonidina y sus derivados pueden proporcionar actividad neuroprotectora a células ópticas o retinianas y las células nerviosas de la columna vertebral cuando se aplica tópicamente o se inyecta en el sitio de la lesión nerviosa, hasta ahora no se ha pensado que tales agentes serían agentes eficaces para el tratamiento de estados neurodegenerativos del cerebro, tales como enfermedad de Alzheimer y enfermedad de Parkinson, en parte debido a la barrera hematoencefálica y en parte debido a la significativa actividad sedante que acompaña a la administración de otros agonistas conocidos de los receptores adrenérgicos alfa 2 tales como clonidina, tizanidina y dexmetatomidina. Por tanto, tal actividad sedante en la administración sistémica de tales agentes en dosis terapéuticas ha limitado gravemente su utilidad como una sustancia práctica como agente no tópico o sistémico.

Los presentes solicitantes han descubierto sorprendentemente que la brimonidina y sus derivados pueden proporcionar, cuando se administran sistémicamente, neuroprotección a las células nerviosas del cerebro. La brimonidina y sus derivados tienen un margen terapéutico espectacularmente más amplio entre su actividad neuroprotectora y su actividad sedante que la mayoría de los agonistas adrenérgicos alfa previamente caracterizados.

La brimonidina y su valor terapéutico se describieron en Danielewicz y col. en las patentes de los EE.UU. nº 3.890.319 y 4.029.792. Estas patentes describen brimonidina como un regulador del sistema cardiovascular que tiene la siguiente formula:

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en la que el grupo 2-imidazolin-2-ilamino puede estar en cualquiera de las posiciones 5, 6, 7 u 8 del núcleo de quinoxalina; x, y y z puede estar en cualquiera de las posiciones 5, 6, 7 u 8 restantes y pueden seleccionarse de hidrógeno, halógeno, alquilo C_{1}-_{5}, alcoxi C_{1}-_{5} o trifluorometilo; y R es un sustituyente opcional en cualquiera de las posiciones 2 ó 3 del núcleo de quinoxalina y puede ser hidrógeno, alquilo C_{1}-_{5} o alcoxi C_{1}-_{5}. Los compuestos actualmente útiles pueden prepararse según los procedimientos descritos en las patentes nº 3.890.319 y 4.029.792, incorporadas en este documento como referencia.

En Ocular Effects of a Relatively Selective Alpha-2 Agonist (UK-14.304-18) in Cats, Rabbits and Monkeys, J. A. Burke y col., Current Eye Rsrch., 5, (9), páginas 665-676 (1986) se mostró que el derivado de quinoxalina mostrado más adelante y que tiene el nombre genérico brimonidina era eficaz en la reducción de presión intraocular en conejos, gatos y monos. Los compuestos en este estudio se administraron tópicamente a las córneas de los animales en
estudio.

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También se sabe que el agonista de los receptores alfa 2 brimonidina puede proteger las células neurales retinianas, que incluyen fotoreceptores y células del ganglio retiniano, de lesión en estados tales como glaucoma, retinitis pigmentosa y degeneración macular senil cuando se administra tópicamente o sistémicamente. Véase la patente de los EE.UU. 6.194.415.

En un primer aspecto, la presente invención se refiere al uso de brimonidina o una sal farmacéuticamente aceptable de la misma en la preparación de un medicamento para tratar un estado neurodegenerativo del cerebro que comprende administrar al cerebro de un mamífero en necesidad del mismo una cantidad terapéuticamente eficaz de brimonidina.

La brimonidina tiene menos actividad del receptor alfa 1 que los otros agonistas muy conocidos de los receptores alfa 2. Aunque estos agonistas se entienden normalmente como agonistas "selectivos" de alfa 2, de hecho todos estos compuestos tienen mayor actividad en el receptor alfa 1A que en al menos un subtipo de receptor alfa 2. Por el contrario, la brimonidina tiene una actividad al menos 5,5 veces mayor en cada subtipo de receptor alfa 2 que en el receptor alfa 1A. Los datos presentados a continuación se recogieron usando el ensayo de RSAT descrito anteriormente.

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Los presentes inventores también han notado que la brimonidina también tiene un margen terapéutico más amplio - es decir, una mayor diferencia en la concentración necesaria para proporcionar un efecto terapéutico mediado por el receptor alfa 2, cuando se compara con el necesario para producir sedación, que otros compuestos que tienen mayor actividad del receptor alfa 1.

Por tanto, tanto los efectos terapéuticos como los sedantes de la tizanidina y clonidina se ven empezando a concentraciones de aproximadamente 100 microgramos/kg cuando se aplica i.p. Por el contrario, aunque los efectos terapéuticos de brimonidina pueden empezar a medirse a 10 microgramos/kg, el efecto sedante de brimonidina se hace primero evidente a aproximadamente 30 microgramos/kg. Por tanto, la brimonidina puede usarse sistémicamente para proporcionar actividad neuroprotectora con menos preocupación de sedar excesivamente al paciente.

La eficacia de un receptor o subtipo de receptor dado según la presente invención se determina usando el procedimiento de ensayo de RSAT descrito anteriormente.

Aunque los solicitantes no desean limitarse a ninguna teoría, se cree que disminuir la estimulación del (de los) receptor(es) alfa 1 sirve para producir una disminución de la CE_{50} de brimonidina (que conduce a un efecto terapéutico a una concentración menor de fármaco) respecto a compuestos similares que tienen una mayor cantidad de actividad del receptor alfa 1 sin cambio en la curva dosis de sedación-respuesta.

En otro aspecto, la presente invención se refiere al uso de brimonidina como una sal farmacéuticamente aceptable de la misma para la preparación de un medicamento para prevenir muerte o degeneración de células neurales que se proyectan hacia o desde una región del cerebro que incluye el locus cerúleo que comprende administrar una cantidad terapéutica de brimonidina a dichas células.

Este nuevo uso es particularmente eficaz cuando se administra como un tratamiento profiláctico, es decir, antes de que haya tenido lugar la lesión al nervio, o antes de que haya tenido lugar la progresión a largo plazo del estado de enfermedad, tal como enfermedad de Alzheimer o de Parkinson. Sin desear estar sujeto a una teoría particular con respecto al papel que pueden desempeñar los compuestos de la presente invención en la neuroprotección, los solicitantes plantean como hipótesis que la brimonidina, cuando se usa según el uso descrito en este documento, puede estimular la producción de ciertos factores de la familia bcl-2; el aumento de expresión de tales factores se ha medido por el aumento de expresión de ARNm que codifica su producción; estos factores (bcl-2 y bcl-XL pueden suprimir el programa apoptósico. Estos factores pueden compensar la presencia o inducción de factores de apoptosis bcl-2 tales como bad y bax que puede producirse como resultado de provocaciones perjudiciales para las células nerviosas. Por tanto, también se contempla que los compuestos de la presente invención que proporcionan señales de supervivencia celular a los nervios pueden usarse ventajosamente en combinación con compuestos que inhiben la muerte celular. Tales compuestos que inhiben la muerte celular incluyen antagonistas de NMDA, especialmente memantina, que bloquea efectos excitotóxicos de exceso de glutamato; inhibidores de la óxido nítrico sintetasa; antioxidantes y antagonistas del calcio.

Puede usarse cualquier procedimiento adecuado para la administración de brimonidina al cerebro del mamífero que va a tratarse. En todos los procedimientos, el mamífero preferido es un ser humano. El procedimiento particular de administración elegido es preferentemente uno que permite que la brimonidina tenga el efecto terapéutico deseado de un modo eficaz, por ejemplo, baja concentración eficaz y baja incidencia de efectos secundarios.

La administración de brimonidina de un modo consecuente con los procedimientos de esta invención puede incluir, pero no se limita a, oral, parenteral, intravenosa, subcutánea y otros modos de administración sistémica. Los compuestos se administran en una cantidad terapéuticamente eficaz solos o en combinación con un vehículo o excipiente adecuado farmacéuticamente aceptable.

Dependiendo del modo de administración previsto, una cantidad terapéutica de brimonidina puede incorporarse en cualquier forma farmacéutica farmacéuticamente aceptable, tal como por ejemplo, comprimidos, supositorios, píldoras, cápsulas, polvos, líquidos, disoluciones, infusiones, suspensiones, emulsiones, aerosoles o similares, preferentemente formas farmacéuticas adecuadas para administración única de dosificaciones exactas, o formas farmacéuticas de liberación sostenida para administración controlada continua. Preferentemente, la forma farmacéutica incluirá un excipiente farmacéuticamente aceptable y el compuesto o compuestos actualmente útiles pueden contener además otros fármacos, agentes farmacéuticos, vehículos, adyuvantes, etc.

Para formas farmacéuticas sólidas, los vehículos sólidos no tóxicos incluyen, pero no se limitan a, calidades farmacéuticas de manitol, lactosa, almidón, estearato de magnesio, sacarina sódica, los polialquilenglicoles, talco, celulosa, glucosa, sacarosa y carbonato de magnesio. Un ejemplo de una forma farmacéutica sólida para llevar a cabo la invención es un supositorio que contiene propilenglicol como vehículo.

Las formas farmacéuticas farmacéuticamente administrable líquidas pueden comprender, por ejemplo, una disolución o suspensión de uno o más de los compuestos actualmente útiles y adyuvantes farmacéuticos opcionales en un vehículo, tal como por ejemplo agua, solución salina, dextrosa acuosa, glicerina, etanol y similares, para así formar una disolución o suspensión. Si se desea, la composición farmacéutica que va a administrarse también puede contener cantidades menores de sustancias auxiliares no tóxicas tales como agentes humectantes o emulsionantes, agentes de tamponamiento de pH y similares. Ejemplos típicos de tales agentes auxiliares son acetato sódico, monolaurato de sorbitano, trietanolamina, acetato sódico, oleato de trietanolamina, etc. Se conocen procedimientos actuales para preparar tales formas farmacéuticas, o serán aparentes, para aquellos expertos en esta materia; por ejemplo, véase Remington's Phamaceutical Sciences, Mack Publishing Company, Easton, Pa., 16ª edición, 1980, incorporado en este documento como referencia. En cualquier caso, la composición de formulación que va a administrarse contiene una cantidad de uno o más de los compuestos actualmente útiles en una cantidad eficaz para proporcionar el efecto terapéutico deseado.

La administración parenteral se caracteriza generalmente por inyección, bien subcutánea, intramuscular o intravenosamente. Los inyectables pueden prepararse en formas convencionales, bien como disoluciones o suspensiones líquidas, formas sólidas adecuadas para disolución o suspensión en líquido antes de la inyección, o como emulsiones o infusiones. Excipientes adecuados son, por ejemplo, agua, solución salina, dextrosa, glicerina, etanol y similares. Además, si se desea, las composiciones farmacéuticas inyectables o infusibles que van a administrarse también pueden contener cantidades menores de sustancias auxiliares no tóxicas tales como agentes humectantes o emulsionantes, agentes de tamponamiento de pH y similares.

Por supuesto, la cantidad de brimonidina administrada depende del efecto o efectos terapéuticos exactos deseados, del mamífero específico que va a tratarse, de la gravedad y naturaleza del estado del mamífero, del modo de administración, de la potencia y la farmacodinámica del compuesto o compuestos particulares empleados y de la opinión del médico prescriptor. Generalmente, la dosificación terapéuticamente eficaz está preferentemente en el intervalo de aproximadamente 0,5 o de aproximadamente 1 a aproximadamente 100 mg/kg/día.

Descripción detallada de la invención

En un aspecto, la presente invención se refiere al uso de brimonidina o una sal farmacéuticamente aceptable de la misma para la preparación de un medicamento para tratar un estado neurodegenerativo del cerebro que comprende administrar al cerebro de un mamífero en necesidad del mismo una cantidad terapéuticamente eficaz de brimonidina o una sal farmacéuticamente activa de la misma.

A propósito de esto, los solicitantes han descubierto que la brimonidina tiene una eficacia inesperadamente elevada en la protección de células neurales del cerebro contra lesión y muerte, incluyendo apoptosis, frente a compuestos que tienen actividad de los agonistas de los receptores alfa 1. Aunque no se desee limitarse a ninguna teoría, los solicitantes creen que la estimulación del receptor adrenérgico alfa 1 da como resultado la interferencia con la actividad neuroprotectora proporcionada por la actividad de los agonistas de los receptores alfa 2 de forma que cualquier efecto sedante que puedan tener tales agentes, como clonidina o tizanidina, tiene una CE_{50} similar, o en aproximadamente un intervalo de tres veces la actividad neuroprotectora para tal compuesto. Por tanto, cualquier actividad neuroprotectora proporcionada por agentes no selectivos tales como clonidina, tizanidina y dexmetatomidina se ve a concentraciones que tenderán a sedar o ser tóxicas para el paciente.

Los agentes adrenérgicos alfa no se han usado generalmente, en parte por esta razón, como agentes neuroprotectores en el pasado, excepto en aplicaciones tópicas o locales (tales como aplicaciones oftálmicas) en las que el agente no se administra generalmente sistémicamente.

Aunque no se desee limitarse a ninguna teoría, los presentes solicitantes creen que la mayoría o toda la eficacia neuroprotectora de la brimonidina se proporciona por la estimulación de los receptores alfa 2B y/o alfa 2C. Generalmente no se ha pensado que el cerebro fuera rico en receptores alfa 2B o 2C. Sin embargo, los solicitantes han encontrado que el uso de brimonidina o una sal farmacéuticamente aceptable de la misma para la preparación de un medicamento según la presente invención puede proporcionar efectos neuroprotectores a neuronas que se proyectan desde o hacia el locus cerúleo, sitio de la lesión generalizada inicial anotada en la enfermedad de Alzheimer. Por tanto, el uso de brimonidina de un modo consecuente con la presente descripción será útil en el tratamiento de lesión neural en estados tales como enfermedad de Alzheimer y enfermedad de Parkinson.

El vínculo entre glaucoma y enfermedad de Alzheimer

Aunque no se desee limitarse a ninguna teoría, los solicitantes ofrecen lo siguiente como una hipótesis de porqué la brimonidina es un neuroprotector eficaz en estados neurodegenerativos del cerebro tales como enfermedad de Alzheimer y de Parkinson.

Estudios recientes han sugerido la pérdida glaucomatosa de células del ganglio retiniano (RGC) y sus axones en la enfermedad de Alzheimer (EA). Los péptidos \beta amiloides y la proteína tau fosforilada han participado en la pérdida neuronal regional selectiva y acumulaciones de proteínas características de EA. Las acumulaciones de proteínas similares no están presentes en RGC glaucomatosas. Las neuronas mueren tanto en EA como en glaucoma por apoptosis, aunque las rutas de señalización para la degradación neuronal parecen ser diferentes en las dos enfermedades. La EA muestra una pérdida de neuronas noradrenérgicas de locus cerúleo, que envían terminaciones axónicas a las regiones del cerebro que experimentan apoptosis neuronal y da como resultado reducciones regionales en los niveles de noradrenalina (NA) y de receptores adrenérgicos \alpha2 neuronales. La activación de receptores adrenérgicos \alpha2 reduce la apoptosis neuronal mediante una ruta de señalización dependiente de proteína kinasa B (Akt). La pérdida de innervación de NA puede facilitar la apoptosis neuronal tanto en EA como en glaucoma. Los agonistas de los receptores adrenérgicos \alpha2 ofrecen el potencial de retrasar la pérdida neuronal en ambas enfermedades compensando la pérdida de innervación de NA.

Las enfermedades neurodegenerativas incapacitan más frecuentemente en vez de matar a sus víctimas. La naturaleza progresiva y la prolongada evolución temporal de la neurodegeneración impone una carga económica notable a nuestra sociedad, debido en gran parte a la cantidad de cuidadores necesarios para ayudar a las personas afectadas. El glaucoma cumple los criterios de una enfermedad neurodegenerativa típica. Las células del ganglio retiniano (RGC) mueren gradualmente y progresivamente en la enfermedad, frecuentemente en asociación con presión intraocular elevada (IOP). La muerte neuronal glaucomatosa no puede limitarse a la retina ya que parece que se pierden neuronas en el núcleo geniculado lateral, e incluso la corteza visual. La patogénesis de neurodegeneración glaucomatosa no se entiende con toda seguridad. Una variedad de pruebas apuntan hacia un transporte alterado de la proteína axonal de RGC debido a la compresión inducida por IOP de los axones del nervio óptico en la lámina cribosa. Los factores tróficos, como factor neurotrófico derivado del cerebro (BDNF), se transportan de forma retrógrada desde las terminaciones axónicas de RGC hasta los pericariones de las neuronas y ese transporte de factores tróficos es esencial para la supervivencia de RGC. La compresión o el aplastamiento de axones de RGC puede reducir los niveles de factores tróficos, produciendo la muerte de RGC por insuficiencia trófica. Otra prueba ha implicado isquemia-hipoxia local, sobreactivación de receptores de glutamato, generación excesiva de radicales oxidantes por óxido nítrico o activación de receptores relacionados con el sistema inmunitario como posibles contribuyentes a pérdida neuronal glaucomatosa.

Una relación entre glaucoma y enfermedad de Alzheimer (EA)

Similar al glaucoma, la insuficiencia trófica, la lesión por radicales oxidantes, hipoxia y mecanismos relacionados con el sistema inmunológico se han citado como posibles contribuyentes a la pérdida neuronal en la enfermedad de Alzheimer (EA). Las neuronas corticales, del hipocampo, septales, talámicas y del tronco encefálico se pierden principalmente en EA, pero también pueden perderse RGC. Los exámenes histológicos de retinas de cadáveres y nervios ópticos han sugerido que las RGC y sus axones se atrofian y mueren en la EA. En varios estudios, la pérdida axonal de nervios ópticos fue importante ya que los números promedio de axones en nervios ópticos de EA (68/1000 \mum^{2}) fueron menos que la mitad de aquellos encontrados en controles de la misma edad (116/1000 \mum^{2}). Las distribuciones de tamaño de axones de nervios ópticos sugirieron que se perdieron preferentemente axones grandes en AE, similar a lo informado para glaucoma idiopático. Otros estudios de nervio óptico de EA de cadáver han fracasado en encontrar pruebas de degeneración axonal de RGC. Los diferentes hallazgos de los estudios de cadáveres son difíciles de evaluar debido a que se examinaron pequeños números de pacientes con EA y controles de la misma edad (n = 7 a 10) en cada uno de los estudios; la fase de la progresión de EA no se controló bien y probablemente varío entre estudios; y los procedimientos histológicos y de recuento fueron distintos de un estudio a otro. Las mediciones del espesor de capa de la fibra del nervio retiniano, la palidez y excavación de la papila óptica, etc. usando técnicas in vivo en pacientes con EA también han sido muy distintas en diferentes estudios. Han variado desde no encontrar pruebas de cambios glaucomatosos hasta encontrar cambios glaucomatosos bien definidos, cuya importancia parecía que guardaba relación con el nivel de empeoramiento cognitivo en cada uno de los pacientes. La prueba más convincente para una asociación entre EA y glaucoma ha sido proporcionada por el amplio estudio de Bayer y col. Mostraron que aproximadamente el 26% de pacientes con EA (n = 112) tiene cambios glaucomatosos retinianos, particularmente pérdida del campo de visión y excavación del nervio óptico, mientras que solo el 5% de los controles de la misma edad (n = 116) tenían cambios glaucomatosos.

Los ovillos neurofibrilares (NFT) y las placas amiloides son los distintivos patológicos de neurodegeneración en EA. La proteína precursora amiloide (APP) es una proteína de membrana que puede escindirse para dar APP secretada (sAPP\alpha) o alternativamente para dar péptido A\beta1-40 (A\beta1-40) mediante enzima de escisión de \alpha-secretasa y \beta-amiloide (BACE) respectivamente. sAPP\alpha es el derivado de APP predominante en la mayoría de los tipos de células. Una forma mayor del péptido A\beta, A\beta1-42, se agrega rápidamente y es el componente principal del núcleo de las placas amiloides. El procesamiento o degradación de APP defectuosa puede ser responsable de altos niveles de péptido A\beta1-42 en EA. El péptido A\beta1-42 es tóxico para células cultivadas y puede ser responsable de la pérdida neuronal de EA. Los estudios genéticos han identificado mutaciones en APP como posibles desencadenantes de la patogénesis de EA. Otros genes tales como aquellos para presenilina 1 y 2 (PS1/2) y apolipoproteína E (APOE) pueden contribuir a EA aumentando los niveles A\beta.

Los NFT están compuestos principalmente por tau, una proteína asociada a microtúbulos. En EA, tau está altamente fosforilada y se agrega a filamentos en pericariones neuronales. Parece que tau fosforilada tiene una capacidad reducida para unirse a microtúbulos y agregados con proteínas del neurofilamento para formar NFT. La tau fosforilada desempeña probablemente un papel crítico en la toxicidad de A\beta y el péptido A\beta1-42 puede promover la agregación y hiperfosforilación de tau por la proteína tau kinasa II. Por tanto, las dos proteínas, el péptido A\beta1-42 y la tau fosforilada pueden facilitar las conformaciones de las otras que promueven la toxicidad neuronal de EA.

En la capa de RGC se ha informado de algunos aumentos en la reacción inmunológica de tau, APP y el péptido A\beta y el epitelio del pigmento de retina humana anciana, además de retina de personas con retinitis pigmentosa y degeneración macular senil. Aquellos aumentos en los niveles de reacción inmunológica no estuvieron acompañados por NFT o placas amiloides. Similarmente se han notificado aumentos en la reacción inmunológica del péptido A\beta en RGC para un modelo de hipertensión ocular en ratas usando inmunocitoquímica. Las inmunotransferencias retinianas completas para el mismo modelo de hipertensión han sugerido que el aumento de la reacción inmunológica del péptido A\beta va acompañado por disminuciones en la APP de longitud total y aumentos en los fragmentos que contienen A\beta. Se ha planteado como hipótesis que la compresión de axones de RGC en glaucoma puede facilitar la anomalía de la proteína del neurofilamento y la lesión neuronal inducida por el péptido A\beta. A pesar de la pruebas de las anomalías de APP, el péptido A\beta y tau en el modelo de glaucoma en ratas y en varios estados retinianos no glaucomatosos, no se ha informado de que la pérdida axonal de nervios ópticos y la degeneración de RGC en EA incluya o NFT o placas amiloides. Por consiguiente, no se está seguro de si la degeneración de RGC de EA resulta de las anomalías de APP y tau que se cree subyacen la pérdida neuronal del sistema nervioso central (SNC) en EA.

Las neuronas pueden morir en glaucoma y EA por apoptosis

Un proceso de muerte llamado apoptosis parece contribuir a la pérdida neuronal tanto en glaucoma como en EA. La apoptosis incluye un proceso de degradación celular gradual que muestra encogimiento nuclear y celular combinado con escisión de ácidos nucleicos y proteínas del citoesqueleto mediante endonucleasas y proteasas. Aunque la mayoría de las investigaciones han sostenido un papel de la apoptosis en la pérdida neuronal encontrada en glaucoma o EA, otras han cuestionado la participación de apoptosis en las enfermedades. Las distintas opiniones se han basado en buena parte en los criterios morfológicos considerados necesarios para definir apoptosis y/o la interpretación de pruebas para la escisión de ADN nuclear obtenido usando marcado del extremo libre de deoxiuridina trifosfato mediado por deoxinucleotidil transferasa terminal (TUNEL). La degradación nuclear apoptósica puede ser difícil de detectar en el examen neuropatológico debido al encogimiento, degradación y fagocitosis de neuronas afectadas. El proceso de degradación tiene una vida aparente inferior a 24 horas en cultivo y es cuestión de días en tejido nervioso intacto. Por consiguiente, en cualquier momento único de examen sólo puede esperarse que un pequeño porcentaje de neuronas muestre pruebas de degradación apoptósica en enfermedades con una evolución temporal de años.

La electroforesis en gel de ADN o electroforesis de campo pulsado pueden usarse para detectar la escisión de ADN nuclear como un marcador de degradación apoptósica. Los procedimientos examinan ADN tomado de homogeneizados de tejido. Requieren que los homogeneizados incluyan 10^{5} o más células, que están en la fase de degradación apoptósica, antes de que pueda detectarse la escisión de ADN nuclear. Dado la evolución temporal prolongada de EA o glaucoma, se espera que sólo un pequeño número de neuronas experimenten degradación nuclear durante el desarrollo de cualquier día con el resultado de que en los homogeneizados de un cerebro de EA o una retina glaucomatosa está presente ADN fragmentado insuficiente. El marcaje de extremos de ADN cortados en 3' con d-UTP unidos a un fluorocromo se ha usado para revelar la escisión de ADN nuclear in situ en secciones de tejido o cantidades completas de cerebro de EA o retinas glaucomatosas de cadáver. Se han encontrado núcleos de RGC positivas por TUNEL en retinas glaucomatosas humanas y en las retinas de modelos animales con glaucoma. La pequeña proporción de núcleos de RGC positivas por TUNEL parece apropiada para la pérdida gradual de RGC en glaucoma. El hallazgo de neuronas positivas por TUNEL ha variado en EA ya que algunos estudios han encontrado números elevados de neuronas positivas por TUNEL en regiones del cerebro afectadas por la enfermedad, mientras que otros han fracasado en detectar cualquier aumento en neuronas positivas por TUNEL en cerebro de EA en comparación con aquellos de controles de la misma edad. Además, varios estudios encontraron recuentos inapropiadamente altos de neuronas positivas por TUNEL en cerebro de EA, por ejemplo, se informó de que el 25% de neuronas eran positivas por TUNEL en algunas regiones corticales.

La variación en los hallazgos por TUNEL en EA resulta probablemente de dificultades metodológicas que se sabe afectan la técnica de marcado, particularmente cuando se usa en tejido nervioso de cadáver 1) la lesión de especies de oxígeno reactivas al ADN, independientemente de la escisión de ADN por endonucleasas, puede detectarse por TUNEL; 2) la fijación retrasada de tejido, sobrefijación o fijación prolongada puede inducir marcado por TUNEL; 3) las células que entran en mitosis pueden marcarse por TUNEL; 4) diferentes endonucleasas pueden cortar ADN de manera diferente, que puede afectar espectacularmente la eficiencia del marcado por TUNEL; y 5) las variaciones en concentraciones de cationes divalentes, como Mg^{2+} o Co^{2+}, afectan notablemente el marcado por TUNEL. Por consiguiente, si se usa marcado por TUNEL por sí mismo para establecer la degradación apoptósica, los resultados deberían interpretarse con prudencia tanto si son positivos como negativos. El marcado por TUNEL puede ser valioso para distinguir la degradación apoptósica si se usa conjuntamente con otros marcadores de la degeneración, particularmente colorantes de unión de ADN que revelan la condensación de cromatina o inmunocitoquímica para la degradación de proteínas de señalización.

Señalización de la degradación apoptósica en glaucoma y EA

Puede considerarse que los procesos de señalización apoptósica implican tres fases: 1) una fase premitocondrial; 2) una fase mitocondrial y 3) una fase posmitocondrial o de degradación. Además de la escisión de ADN nuclear, la degradación apoptósica que implica el núcleo puede incluir: 1) la separación de histonas y laminas de ADN nuclear; 2) la condensación o compactación del ADN fragmentado; y 3) formación de cuerpos subnucleares envueltos por membrana que contienen ADN fragmentado y condensado. El grado, patrón y evolución temporal de la degradación nuclear apoptósica ha mostrado que es distinto para diferentes fenotipos celulares y para diferentes agresiones a las células. Se ha mostrado variación en los patrones de cambios apoptósicos nucleares usando marcadores de degradación múltiple en RGC en ojos glaucomatosos de cadáver o en modelos animales de glaucoma; neuronas de la sustancia nigra murina expuestas a MPTP, neuronas hipóxicas en el hipocampo porcino y neuronas que contienen neuromelanina de la sustancia nigra en el cerebro de cadáveres de EP. Por consiguiente, puede ser confuso marcar una forma de degradación nuclear como apoptósica y otras como no apoptósicas basándose en la morfología nuclear.

Se sabe ahora que la degradación celular apoptósica depende de varias rutas de señalización interactuantes. Diferentes agresiones y/o fenotipos celulares pueden activar diferente señalización de degradación, que puede reflejarse en diferencias en la morfología de cambios nucleares, particularmente aquellos para la condensación de cromatina y/o fragmentación de ADN. La familia caspasa de proteasas desempeña papeles fundamentales en muchas rutas de señalización de apoptosis. Ahora se han caracterizado más de una docena de caspasas en mamíferos. Las caspasas se expresan como proenzimas inactivas, que se activan proteolíticamente y puede escindir otras caspasas, proteínas del citoesqueleto, proteínas nucleares o proteínas de señalización antiapoptósica. Se conocen cuatro rutas de señalización diferentes que contribuyen a la condensación de cromatina nuclear y fragmentación de ADN. Dos de las rutas dependen de caspasas: 1) la ruta del citocromo C, el factor 1 activador de la proteasa apoptósica (Apaf-1) y la procaspasa 9; y 2) la ruta del segundo activador de caspasa derivado de mitocondria (SMAC)/proteína de unión directa a IAP (Diablo). Las otras dos rutas son independientes de caspasas: 1) la ruta del factor de iniciación de apoptosis (AIF) y 2) la ruta de la endonucleasa G.

Primero se descubrió que el citocromo C liberado de mitocondrias interacciona con Apaf-1 y dATP para convertir procaspasa 9 en caspasa 9 activada. La caspasa 9 activada también se libera de mitocondrias. La caspasa 9 activada realiza la etapa clave en varias formas de degradación apoptósica convirtiendo la procaspasa 3 en la caspasa 3 activada. La caspasa 3 activada escinde el inhibidor de ADNsa activada por caspasa (ICAD) en ADNsa activada por caspasa (CAD), que fragmenta el ADN nuclear. La caspasa 3 activada también puede señalizar otros aspectos de degradación celular apoptósica que incluyen condensación de cromatina nuclear mediante la activación por proteasa de ácino, digestión citoesquelética de actina por la proteasa gelosina y escisión de lamina nuclear por caspasa 6.

Se ha informado de la activación de caspasa 3 en RGC glaucomatosas. Aunque varios estudios encontraron activación de caspasa 3 neuronal en EA, otros fracasaron en encontrar pruebas de participación de una ruta del citocromo C - caspasa 3 - CAD en la fragmentación de ADN neuronal en EA. Las caspasas, como la caspasa 3, pueden inhibirse por uno o más miembros de una familia de proteínas esencialmente activas, los inhibidores de apoptosis (IAP). Los IAP se unen a e inactivan las caspasas y así pueden evitar o reducir la degradación nuclear por la ruta del citocromo C - caspasa 3 - CAD. A su vez, SMAC/Diablo, liberada de mitocondrias, puede unirse e inactivar los IAP, permitiendo así que las caspasas 9, 3 y 6 señalicen la degradación apoptósica. Aunque los IAP han participado en la neurodegeneración similar a EA en síndrome de Down y en RGC de rata después de axotomía, no se sabe si IAP o SMAC/Diablo afecta a la ruta de degradación de caspasa 3 en EA o glaucoma.

En algunas formas de apoptosis se libera una flavoproteína soluble, AIF, del espacio intermembrana de mitocondrias y se transloca a núcleos en los que induce la fragmentación ADN y también contribuye a la condensación de cromatina. AIF puede liberarse de mitocondrias independientemente de citocromo C y procaspasa 9. No se conoce la base para la liberación selectiva de AIF de mitocondrias. La microinyección de células con AIF recombinante sólo produce la condensación de cromatina en la parte externa del núcleo, mientras que la microinyección con caspasa 3 activada o su diana hacia 3' CAD produce la condensación de toda la cromatina nuclear. En algunas otras formas de apoptosis, AIF induce la liberación de citocromo C de mitocondrias. De ahí que la escisión de ADN nuclear y la condensación de cromatina puedan inducirse con diferentes distribuciones subnucleares mediante caspasa 3 sola, AIF sola y/o mediante AIF seguida por caspasa 3. En algunas formas de apoptosis también puede liberarse una ADNsa mitocondrial de mitocondrias, endonucleasa G, que normalmente actúa para escindir ADN mitocondrial, y sirve para inducir directamente la fragmentación de ADN nuclear. La fragmentación de ADN nuclear producida por endonucleasa G es independiente de la actividad de caspasa o CAD. La endonucleasa G puede liberarse de mitocondrias mediante BID y es una característica de apoptosis inducida por ligando de FAS (véase más adelante). Se sabe poco del patrón subnuclear de la fragmentación de ADN inducida por endonucleasa G, pero probablemente añade otra permutación a los posibles patrones de degradación nuclear apoptósica en los que participa caspasa 3 y/o AIF.

Dada nuestra comprensión cada vez mayor de las rutas de señalización para la degradación en apoptosis, no es sorprendente que se hayan observado varias formas morfológicas diferentes de degradación nuclear. Basándose en nuestra información actual, parece que la degradación apoptósica de RGC glaucomatosas implica, al menos en parte, una ruta de señalización de caspasa 3, mientras que la degradación apoptósica de EA puede ser o dependiente de caspasa o independiente de caspasa y, por tanto, posiblemente refleja la señalización de AIF y/o endonucleasa G, además de la activación de caspasa 3.

Señalización de apoptosis mitocondrial en glaucoma y EA

¿Cómo deciden las neuronas activar las rutas de señalización para la degradación apoptósica? Los cambios en la permeabilidad de la membrana mitocondrial con la liberación de factores que señalizan la degradación apoptósica constituyen una etapa de decisión crítica en muchas rutas de señalización de apoptosis. Uno o más de los factores de señalización para la degradación apoptósica (citocromo C, procaspasa 9, AIF, SMAC/Diablo o endonucleasa G) se liberan en el espacio intermembrana que separa las membranas mitocondriales internas y externas o se liberan de la matriz mitocondrial. Se han sugerido dos mecanismos para producir un aumento de la permeabilidad de la membrana externa: 1) la formación de poros o la abertura de poros existentes en la membrana externa (revisado en este documento); y 2) abertura de un megaporo de múltiples proteínas, el complejo de poros de transición de la permeabilidad (PTPC), que engloba las membranas mitocondriales internas y externas.

Como se esquematiza en la figura 1, BAX, en asociación con su pariente BAK proapoptósico, puede contribuir a la abertura de PTPC o a la permeabilización de la membrana externa, aunque no se entiende bien la base de cambios inducidos por BAX en la permeabilidad de la membrana mitocondrial externa. Los oligómeros BAX pueden insertarse en membranas bicapa fosfolipoides planas y promover la disolución de las membranas. En algunos modelos de apoptosis, BID puede inducir la oligomerización de BAX que puede inducir la liberación de citocromo C o SMAC/Diablo de liposomas o mitocondrias. BID puede inducir la inserción BAX en la membrana mitocondrial externa o producir que BAX se una a PTPC. En otras formas de apoptosis, BID puede no requerirse para la acumulación de BAX en mitocondrias.

La abertura del PTPC puede producir desplazamientos osmóticos a lo largo de la membrana mitocondrial interna con posterior hinchamiento de la matriz mitocondrial y rotura de la membrana mitocondrial externa, que puede permitir la liberación de los factores de degradación apoptósica de mitocondrias. Agentes como ciclosporina A, que promueve el cierre de PTPC, reducen la liberación de citocromo C y apoptosis en algunas formas de apoptosis. Se ha mostrado que BAX se une o bien al translocador del nucleótido adenina (ANT) o al canal aniónico dependiente de voltaje (VDAC) del PTPC. La unión de BAX a ANT o VDAC aumenta notablemente la conductancia de membranas aisladas. La acumulación de datos sugiere que o ANT o VDAC pueden aumentar la permeabilidad mitocondrial interna en diferentes formas de apoptosis. Citocromo C puede almacenarse en crestas mitocondriales formadas a partir de la membrana interna, que se fusiona con la membrana externa y permite la liberación de citocromo C mediante el PTPC. Por consiguiente, la abertura del PTPC junto con la formación de poros de membranas externas puede ser responsable de la liberación de citocromo C.

La inmunocitoquímica de retinas glaucomatosas de cadáver ha mostrado un aumento de BAX en una pequeña proporción de RGC, que parece similar a la encontrada en un modelo de hipertensión ocular en ratas. Los aumentos en la permeabilidad de la membrana mitocondrial interna inducidos por BAX dan como resultado disminuciones en el potencial de la membrana mitocondrial y se ha mostrado que el potencial de la membrana mitocondrial disminuye en RGC en un modelo de hipertensión ocular en ratas. Estudios de cerebro de EA de cadáver han o mostrado un aumento de BAX en una proporción de neuronas o ninguna diferencia en los niveles de BAX neuronal con respecto a aquellos en cerebros de control. Un estudio informó de un aumento en BAK sin un aumento en BAX. Por consiguiente, no se está seguro de si los aumentos dependientes de BAX en la permeabilidad de la membrana mitocondrial contribuyen a apoptosis en EA. Puede haber varias formas de EA - una que implica el aumento de BAX y caspasa 3 activada (véase anteriormente) y una segunda que es independiente de los aumentos en la permeabilidad de la membrana mitocondrial.

Señalización de apoptosis premitocondrial en glaucoma y EA

La figura 1 presenta un esquema de la posible señalización de apoptosis premitocondrial y mitocondrial que contribuye a pérdida neuronal en glaucoma y EA. Se han propuesto dos rutas diferentes mostradas en la figura 1 como contribuyentes a la pérdida glaucomatosa de RGC: 1) una ruta de p53-gliceraldehído-3-fosfato deshidrogenasa (GAPDH) - BAX; y 2) una ruta del receptor de FAS o TNF - FADD - caspasa 8 - BAX. Similarmente, tanto la señalización de p53 como de Fas o de TNF participan en EA.

La proteína supresora de tumores, p53, participa en numerosas formas de apoptosis y puede señalizar apoptosis mediante mecanismos de transcripción o postraducción. p53 induce aumentos transcripcionalmene mediados en GAPDH y BAX en algunas formas de apoptosis. GAPDH es una proteína multifuncional que es muy conocida como una enzima glicolítica, pero también funciona como una proteína de señalización de apoptosis. Los estudios con oligonucleótidos antisentido mostraron que GAPDH puede ser esencial para la progresión de apódosis iniciada por una variedad de agresiones diferentes a células neuronales. GAPDH parece que disminuye la transcripción de las proteínas antiapoptósicas BCL-2 y BCL-X_{L}. BCL-2 y BCL-X_{L} se oponen al aumento de la permeabilidad de la membrana mitocondrial y la liberación del factor de degradación apoptósica inducida por BAX y así puede reducir la degradación apoptósica.

La superfamilia del receptor del factor de necrosis tumoral (TNF), que incluye el receptor de TNF y el receptor de FAS, produce apoptosis mediante rutas dependientes de caspasa que no implican cambios en la transcripción. Los receptores se ligan a proteínas adaptadoras como FADD que activan caspasas, particularmente caspasa 8, que, como se ilustra en la figura 1, puede activar aumentos dependientes de BAX en la permeabilidad de la membrana mitocondrial o puede eludir las mitocondrias e inducir directamente degradación apoptósica. La apoptosis inducida por FAS, y posiblemente por TNF, puede estar ligada a apoptosis inducida por p53 mediante la activación de kinasa aminoterminal junn (JNK) (mostrada esquemáticamente en la figura 1). También se ha mostrado que el receptor de FAS puede regularse por incremento por p53 después de alguna lesión celular, particularmente aquella inducida por agentes que lesionan el ADN. La regulación por incremento inducida por p53 puede inducir apoptosis mediante una ruta dependiente del ligando de FAS/FAS y rutas de p53 y del sistema inmunológico/citocina.

Noradrenalina en EA y apoptosis neuronal glaucomatosa

Las neuronas noradrenérgicas en el locus cerúleo (LC) se pierden pronto y extensamente en EA y muestran formación de NFT típica de la enfermedad. Los axones salientes cefálicos de neuronas del LC forman densas arborizaciones de terminaciones en las regiones del prosencéfalo que experimentan una importante pérdida neuronal en EA, que incluye la corteza, septo, hipocampo y tálamo. De acuerdo con la pérdida de neuronas del LC que contienen noradrenalina (NA), aquellas regiones experimentan reducciones importantes en las concentraciones de NA en EA. Las terminaciones del LC contienen tirosina hidroxilasa (TH), que cataliza la conversión de tirosina en dopa y dopamina-\beta-hidroxilasa (DBH), que convierte la dopamina en NA. La inmutocitoquímica ha mostrado importantes aumentos en terminaciones inmunopositivas de TH y DBH en regiones degenerativas similares a la corteza y al hipocampo en EA. Inicialmente se propuso que el efecto principal de la pérdida de terminaciones del LC noradrenérgicas en EA resultó de la pérdida de activación de NA de receptores adrenérgicos. Las terminaciones del LC inervan los microvasos y capilares del cerebro mediante los receptores adrenérgicos \alpha y aumentan su selectividad con una posible disminución en la circulación sanguínea regional.

Ahora se sabe que los terminaciones noradrenérgicas también pueden terminar en o cerca de neuronas y liberar noradrenalina, que activa los receptores adrenérgicos \alpha o adrenérgicos \alpha en las neuronas. Los receptores adrenérgicos \alpha2 se han demostrado en una amplia variedad de diferentes neuronas y/o sus terminaciones, que incluyen neuronas de los ganglios simpáticos, espinales, del tronco encefálico, septales, del hipocampo y corticales. Los receptores adrenérgicos \alpha están ampliamente distribuidos, pero de modo no uniforme en el cerebro. Son abundantes en la corteza cerebral, hipocampo y diversos núcleos hipotalámicos, pero están ausentes en gran parte de los núcleos talámicos (excepto en los núcleos geniculados laterales y medios) y septales.

Los receptores adrenérgicos \alpha2 pueden ser particularmente relevantes para EA. La unión de los receptores adrenérgicos \alpha2 disminuye en la corteza y el hipocampo de cerebro de cadáver de EA; la pérdida de neuronas del LC y sus terminaciones noradrenérgicas va probablemente acompañada de reducciones en algunos receptores adrenérgicos \alpha2 en las neuronas que inervan o esas neuronas se pierden en EA con estos receptores adrenérgicos \alpha2. Se ha encontrado que la activación farmacológica de receptores adrenérgicos \alpha2 mejora la cognición humana y reduce la pérdida neuronal central después de exposición a agresiones como isquemia.

Los receptores adrenérgicos \alpha2 pueden mediar en varias acciones intracelulares diferentes mediante las rutas de señalización dependientes de proteína G o mecanismos de señalización que son independientes de proteína G. En relación con la apoptosis, la activación de los receptores puede inducir la fosforilación de proteína kinasa B (Akt) mediante una ruta que depende de fosfatidilinositol-3-kinasa (PI3-kinasa). La Akt fosforilada media en la antiapoptosis mediante varias rutas de señalización dependientes de la transcripción y postraducción. Una acción principal de Akt fosforilada está en evitar o reducir los aumentos en la permeabilidad de la membrana mitocondrial, que son responsables de algunas formas de degradación apoptósica. Por ejemplo, la Akt fosforilada mantiene o aumenta la síntesis de BCL-2 y BCL-X_{L} y evita que BAD inactive aquellas proteínas mediante la formación de heterodímeros de BCL-2/BAD o BCL-X_{L}/BAD. BCL-2 y BCL-X_{L} se oponen al aumento de la permeabilidad de la membrana mitocondrial producido por las acciones de BAX, BAK y BID y así se evita o reduce la liberación de factores mitocondriales que señalizan la degradación apoptósica. Por tanto, se cree que la noradrenalina, agonistas de los receptores adrenérgicos 2 y BDNF pueden reducir por esto la apoptosis en neuronas que expresan receptores adrenérgicos \alpha2 o receptores de Trk B (los receptores neurotróficos de BDNF) y proteger las neuronas en EA de apoptosis. También podría exponerse que una reducción de la liberación de NA debida a la pérdida de neuronas del LC en EA puede aumentar la vulnerabilidad de las neuronas en la corteza; septo, hipocampo y tálamo a apoptosis producida por mecanismos del péptido A y/o tau fosforilada considerados que contribuyen a la patogénesis de EA.

Aunque no se desee limitarse a ninguna teoría, se plantea adicionalmente como hipótesis que una pérdida o reducción similar de antiapoptosis mediada por NA de RGC puede explicar la pérdida de RGC en EA y la alta incidencia de glaucoma en la enfermedad. Los agonistas de los receptores adrenérgicos \alpha como B-HT920 o UK14304 (brimonidina) o antagonistas \alpha1 como betaxolol, metropolol o timolol se han usado para reducir IOP en glaucoma disminuyendo la producción o aumento el flujo de humor acuoso, al menos en parte, actuando en el epitelio ciliar. Aparte de los receptores adrenérgicos en el epitelio ciliar, se ha encontrado que el tejido retiniano contiene receptores adrenérgicos \beta2, \alpha1 y \alpha2.

Los agonistas de los receptores adrenérgicos \alpha2, como brimonidina o clonidina, han reducido la pérdida de RGC después de isquemia retiniana, aplastamiento del nervio óptico o aumento de IOP. Similarmente se ha informado de que el antagonista \alpha1, betaxolol, reduce la pérdida de RGC después de isquemia retiniana o exposición a excitotoxinas. Estudios recientes en el cultivo retiniano han mostrado similarmente que la brimonidina y el betaxolol reducen la pérdida de RGC producida por excitotoxinas. Por consiguiente, la activación de receptores adrenérgicos \alpha2, pero no el bloqueo de receptores adrenérgicos \alpha, puede reducir la muerte de RGC. La investigación en nuestros laboratorios ha mostrado que los agonistas de los receptores adrenérgicos \alpha2 pueden reducir la apoptosis en células similares a neuronas cultivadas o en cultivos neuronales primarios producidos por retirada trófica, inhibidores de kinasas, toxinas mitocondriales y excitotoxinas y que la antiapoptosis puede bloquearse competitivamente por antagonistas de los receptores adrenérgicos \alpha2. La antiapoptosis depende del mantenimiento de la impermeabilidad de la membrana mitocondrial en asociación con el aumento de niveles de BCL-2 y Akt fosforilada.

¿Cómo pueden compartir las neuronas centrales y RGC mecanismos apoptósicos comunes en EA? Aunque ha sido polémico el papel de NA en la retina, la inmutocitoquímica de DBH ha proporcionado pruebas de axones que contienen NA en la plexiforme interna y capas de células de ganglios de retina de bovino, mono y ser humano, sugiriendo que las fibras de NA terminan en o cerca de pericariones o dendritas de RGC. Se ha demostrado NA en la plexiforme interna y capas nucleares internas en la retina de bovino. La unión del receptor adrenérgico \alpha2 se ha demostrado en retina disociada de bovino o de mono. Estos hallazgos juntos indican que la retina interna contiene terminaciones noradrenérgicas que liberan NA en la región de receptores adrenérgicos \alpha2 en RGC. Queda sin saber la fuente de terminaciones axónicas que contienen NA en la retina interna. No se han encontrado pericariones que contienen NA en la retina, que sugiere que las neuronas extraretinianas envían axones noradrenérgicos a la retina. Cabe la posibilidad de que los axones que contienen NA alcancen la retina en la superficie de vasos sanguíneos o por medio del nervio óptico. Se han demostrado axones inmunorreactivos de DBH en el nervio óptico de bovino sugiriendo que los axones que contienen NA pueden alcanzar la retina por medio del nervio óptico. Será importante para determinar si las neuronas que contienen NA en el LC, el hipotálamo o los ganglios simpáticos envían los axones que contienen NA a la retina, particularmente debido a que las neuronas del LC y sus axones que contienen NA se pierden en EA y también pueden inervar la retina. Una pérdida común de innervación noradrenérgica de RGC y neuronas centrales en EA podría explicar la pérdida glaucomatosa de RGC en EA. Además, el tratamiento sistémico de pacientes con EA con agonistas de los receptores adrenérgicos \alpha2 puede retrasar tanto la apoptosis de RGC como la neural central en EA mediante la actuación en los receptores adrenérgicos \alpha2 que son retenidos por neuronas supervivientes.

Ejemplo 1

Procedimientos Prueba de campo abierto

Cada animal se coloca en una caja de campo abierto de plástico transparente con dos filas de haces de luz montados a los lados para distinguir entre movimientos horizontales (es decir, distancia desplazada) y verticales (es decir, "levanta la cabeza"). Las condiciones ambiente son bajo ruido e iluminación tenue. Los movimientos de los animales dentro de la caja se miden durante 5 minutos y se calculan a partir de registros del número y tipo de "cortes del haz" o cruces del haz de luz. En la última prueba de campo abierto sólo se cuentan levantamientos de cabeza y se clasifican o como "apoyados" o "sin apoyar". Los levantamientos de cabeza apoyados son cuando un animal pone al menos una extremidad delantera en la pared lateral de la caja cuando se registra un levantamiento de cabeza. En un levantamiento de cabeza sin apoyar, el ratón se apoya solamente por las extremidades traseras. Estos levantamientos de cabeza se diferencian mediante grabación en vídeo. El número de levantamientos de cabeza sin apoyar es la medida más fidedigna de la pérdida de neuronas de dopamina en esta prueba.

Prueba de colgar por la cola

Cada ratón se cuelga por su cola 3 veces durante aproximadamente 10 segundos cada vez. Cada ratón se cuelga por la base de su cola aproximadamente 30 cm por encima de la superficie de una mesa hasta que el ratón se gira a la izquierda o la derecha. A un giro a la izquierda se le da una puntuación de 0 y a un giro a la derecha se le da una puntuación de 1.

La colocación de las extremidades delanteras también se anota al colgar por la cola. A la colocación de las extremidades se le da una puntuación en una escala de 4 puntos. A las extremidades extendidas, o aquellas colocadas por encima de la cabeza, se les da una puntuación de 0. A las extremidades que están apretadas o se mantienen contra el cuerpo se les da una puntuación de 3. Las puntuaciones de 1 ó 2 se asignan a fases relativas entre los dos extremos. La colocación de las extremidades traseras también se puntúa como más adelante.

Construcción de nido

4 ratones del mismo sexo de un grupo se colocan en una bañera de plástico. Se colocan ocho tiras de toalla de papel en una pila ordenada en la parte delantera de la bañera. Los nidos construidos a partir de la toalla de papel se puntúan a 24 horas, 48 horas, 72 horas y 96 horas tras el tratamiento. Las puntuaciones se asignan del siguiente modo: 0 = papel cortado en tiras y formado en un nido completo con cubierta superior; 1 = papel cortado en tiras y formado en un nido completo sin cubierta superior; 2 = papel ligeramente cortado en tiras o masticado y libremente acumulado en un área; 3 = papel ligeramente masticado sin acumulación aparente; y 4 = sin acumulación aparente.

Recuento de neuronas

Entre 55 y 60 días después de la inyección de MPTP, los ratones se sacrifican usando nembutol de sodio. Los cerebros de ratones se prefunden con solución salina tamponada con fosfato seguido por fijador de Lana (paraformaldehído y ácido pícrico). Los cerebros se extraen y se colocan en fijador de Lana durante de 7 a 10 días. Entonces, los cerebros se seccionan coronalmente a 50 micrómetros usando un vibratomo y las secciones se tiñen con un anticuerpo para tirosina hidroxilasa, la enzima limitante de la velocidad en la síntesis de dopamina. Entonces, la sección se examinó con microscopio a aumento 100X. Las rodajas de tejido (-2,9 mm y -3,6 mm por detrás de Bregma) se seleccionaron para el recuento celular en SN y ATV. Estas secciones están en el punto medio de la mitad superior y el punto medio de la mitad inferior de SN, respectivamente. Cada célula marcada con TH que es claramente visible que tiene entre 2 y 6 neuritas se considera una neurona. Para cada animal se calcula un recuento promedio global a partir de cuatro secciones (superior e inferior, derecha e izquierda). Se obtiene un promedio para las cuatro secciones. Los análisis separados se realizan en los recuentos de neuronas de SN y ATV. Estos recuentos se analizan usando una ANOVA de medidas repetidas, seguida por pruebas del efecto entre los grupos usando un método HSD de Fisher.

Procedimiento experimental

Los ratones que reciben inyecciones sistémicas de la toxina de piridina 1-metil-4-fenil-1,2,3,6-tetrahidropiridina (MPTP) pierden selectivamente grandes cantidades de neuronas dopaminérgicas en la sustancia nigra (SN) y el área tegmentaria ventral (ATV). La pérdida de células de dopamina en la SN imita el estado clínico visto en la enfermedad de Parkinson. La pérdida de tales células en el ATV puede contribuir al deterioro cognitivo visto en la enfermedad de Parkinson y de Alzheimer, debido a estas proyecciones de neuronas en la corteza frontal.

Ratones del tipo 30 C57B1/B6 (8-12 semanas de edad) se dejan aclimatar durante 12-14 días antes del uso experimental. Entonces, los ratones se asignan aleatoriamente a los siguientes grupos: MPTP más vehículo DMSO; vehículo solo y MPTP más brimonidina (3 mg/kg/día).

En los ensayos ahora descritos, cada ratón se somete luego a una prueba de campo abierto inicial y una prueba de colgar por la cola. La prueba de campo abierto es el ensayo de comportamiento más frecuentemente usado de ratones tratados con MPTP y parece ser sensible a la pérdida de aporte dopaminérgico de la sustancia nigra. La prueba de colgar por la cola es sensible a lesión estriatal directa; la prueba de construcción de nido es sensible a la pérdida de aporte estriatal de la corteza frontal.

Dos de los 3 grupos de ratones reciben una infusión de un compuesto de prueba (o de vehículo que no contiene compuesto). Estas infusiones se administran mediante minibomba osmótica implantada por vía subcutánea durante un periodo de 14 días a un caudal de 0,25 microlitros/hora. Tres días tras la implantación de las bombas, los ratones se someten a las pruebas de campo abierto y de colgar por la cola, junto con el grupo de ratones de control, a los que no se les implanta minibombas. Inmediatamente tras las pruebas, a los ratones que contienen bombas se les administra subcutánemente una inyección de 40 mg/kg de MPTP. Entonces, todos los grupos se someten a las pruebas de campo abierto y de colgar por la cola a los 10-12 días y 30-40 días tras el tratamiento con MPTP. Las pruebas de campo abierto y de colgar por la cola se realizan a los 50-55 días después del tratamiento con MPTP.

Para todas las pruebas de comportamiento, los resultados se analizan primero usando una ANOVA de medidas repetidas, seguida por pruebas del efecto entre grupos usando el método HSD de Fisher.

Resultados Prueba de campo abierto

Antes del tratamiento con MPTP no hay diferencia significativa entre los 3 grupos en la distancia desplazada o el número de levantamientos de cabeza.

El grupo de vehículo es significativamente más activo que los controles 10 y 30 días después del tratamiento con MPTP. Los ratones tratados con brimonidina no muestran alteración en este aumento de actividad; por tanto, no hay diferencia significativa entre este grupo y el grupo de vehículo.

El tratamiento con MPTP parece producir una reducción en el número total de levantamientos de cabeza 10 días después de MPTP. A los 30 días no hay efecto de MPTP en el levantamiento total de cabeza (cuando se compara con el grupo de vehículo), y sólo una ligera reducción en el levantamiento de cabeza frente al grupo de control.

El grupo de vehículo hace menos levantamientos de cabeza sin apoyar que los ratones normales. Ho hay efecto de o MPTP o los compuestos en el levantamiento de cabeza apoyado.

Prueba de colgar por la cola

No se observan diferencias de grupo significativas en la prueba de colgar por la cola antes del tratamiento con MPTP, y no se ve ninguna después de MPTP en las extremidades traseras. MPTPO afectó significativamente las extensiones de las extremidades delanteras en todos los momentos de tiempo después de la lesión. Por tanto, este defecto no se invierte con el tiempo. La brimonidina no reduce este defecto durante el periodo en el que se administra el compuesto. Sin embargo, la brimonidina no tiende a reducir el defecto cuando se mide después de la dosificación (es decir, 14 días después de la administración del compuesto).

Recuento de neuronas

En la sustancia nigra, los animales tratados con MPTP tienen 58% menos de neuronas que los animales sin tratar. Sin embargo, aquellos que reciben brimonidina tienen significativamente menos pérdida de neuronas.

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En el área tegmentaria ventral se encontró que MPTP da como resultado una disminución promedio del 28% menos de neuronas que en el grupo de control. La brimonidina redujo esta pérdida en un promedio de aproximadamente el 10%.

Los ejemplos anteriores ilustran una realización preferida de la invención y no pretenden restringir el alcance de la misma. La invención se define por las reivindicaciones que finalizan esta memoria descriptiva.

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Referencias citadas en la descripción

Esta lista de referencias citada por el solicitante sólo es para conveniencia del lector. No forma parte del documento de patente europea. Aunque se ha puesto mucho cuidado en recabar las referencias, no pueden excluirse errores u omisiones y la OEP niega cualquier al respecto.

Documentos de patente citados en la descripción

\bullet WO 9200073 A [0008]

\bullet US 4029792 A [0025]

\bullet US 5210076 A, Berliner [0022]

\bullet GB 1430418 A [0026]

\bullet US 3890319 A, Danielewicz [0025]

\bullet US 6194415 B [0027].

Bibliografía no perteneciente a patentes citada en la descripción

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\bulletRemington's Pharmaceutical Sciences. Mack Publishing Company, 1980 [0040].

Claims (5)

1. Uso de brimonidina o una sal farmacéuticamente efectiva de la misma para la preparación de un medicamento para el tratamiento de un estado neurodegenerativo del cerebro de un mamífero.

2. Uso según la reivindicación 1, en el que dicha composición va a administrarse al cerebro de dicho mamífero por administración sistémica.

3. El uso según la reivindicación 2, en el que la administración de dicha composición es efectiva para prevenir la muerte o degeneración de neuronas que se proyectan hacia o desde un área del cerebro de dicho mamífero seleccionada del grupo que está constituido por el área tegmentaria ventral, el locus cerúleo y la sustancia nigra.

4. El uso según la reivindicación 1, en el que dicho estado neurodegenerativo es enfermedad de Parkinson.

5. El uso según la reivindicación 1, en el que dicho estado neurodegenerativo es enfermedad de Alzheimer.