ES2297861T3

ES2297861T3 - Compuestos y metodos para modular la adhesion celular.

Info

Publication number: ES2297861T3
Application number: ES97929070T
Authority: ES
Inventors: Orest W. Blaschuk; Barbara Joan Gour
Original assignee: McGill University
Current assignee: McGill University
Priority date: 1996-07-12
Filing date: 1997-07-11
Publication date: 2008-05-01
Anticipated expiration: 2017-07-11
Also published as: DE69738326D1; US6031072A; US6914044B2; US20020151475A1; EP0937103A2; JP2001500475A; WO1998002452A3; CA2259966A1; US6326352B1; DE69738326T2; EP0937103B1; AU722985B2; AU3332297A; WO1998002452A2

Abstract

PEPTIDOS CICLICOS Y COMPOSICIONES QUE COMPRENDEN DICHOS PEPTIDOS CICLICOS. LOS PEPTIDOS CICLICOS COMPRENDEN UNA SECUENCIA DE RECONOCIMIENTO CAD (CADHERIN CELL ADHESION) DE TIPO HAV (HIS - ALA - VAL). PROCEDIMIENTOS DE USO DE DICHOS PEPTIDOS Y COMPUESTOS PARA LA MODULACION DE LA ADHERENCIA CELULAR POR CAD EN VARIOS CONTEXTOS.

Description

Compuestos y métodos para modular la adhesión celular.

Campo técnico

La presente invención se refiere, en general, a métodos para modular la adhesión celular y, más en particular, a péptidos cíclicos que comprenden una secuencia de reconocimiento de la adhesión celular de cadherina, y al uso de dichos péptidos cíclicos para inhibir o potenciar la adhesión celular mediada por cadherina.

Antecedentes de la invención

La adhesión celular es un proceso complejo, que es de importancia para mantener la integridad celular y generar barreras físicas y de permeabilidad en el organismo. Todos los tejidos están divididos en compartimentos discretos, cada uno de los cuales está compuesto por un tipo de célula específico, que se adhiere a tipos de células similares. Esta adhesión desencadena la formación de uniones intercelulares (es decir, sitios de contacto fáciles de definir en las superficies de células adyacentes que se adhieren entre sí), también conocidas como uniones estrechas, uniones gap y desmosomas en cinturón. La formación de estas uniones da lugar a barreras físicas y de permeabilidad que limitan el paso libre de células y otras sustancias biológicas desde un compartimento tisular a otro. Por ejemplo, los vasos sanguíneos de todos los tejidos están compuestos por células endoteliales. Con el fin de que los componentes de la sangre entren en un determinado componente tisular, deben pasar, en primer lugar, desde la luz de un vaso sanguíneo, a través de la barrera formada por las células endoteliales de ese vaso. De manera similar, con el fin de que determinadas sustancias entren en el organismo a través del intestino, las sustancias deben pasar, en primer lugar, a través de una barrera formada por las células epiteliales de ese tejido. Para penetrar en la sangre a través de la piel, es necesario atravesar capas de células tanto epiteliales como endoteliales.

La adhesión celular está mediada por moléculas de adhesión a la superficie celular (CAMs) específicas. Existen muchas familias diferentes de CAMs, incluidas las superfamilias de inmunoglobulinas, integrinas, selectinas y cadherinas, y cada tipo de célula expresa una combinación única de estas moléculas. Las cadherinas constituyen una familia en rápida expansión de CAMs dependientes del calcio (Munro et al., en: Cell Adhesion and Invasion in Cancer Metastasis, P. Brodt, ed., págs. 17-34, RG Landes Co. (Austin TX, 1996). Las cadherinas clásicas (abreviadas como CADs) son glicoproteínas integrales de membrana que estimulan, en general, la adhesión celular a través de interacciones homófilas (una CAD en la superficie de una célula se une a una CAD idéntica situada en la superficie de otra célula), si bien las CADs parecen ser capaces, también, de formar complejos heterotípicos entre sí bajo determinadas circunstancias y con una afinidad menor. Se ha demostrado que las cadherinas regulan la adhesión de células epiteliales, endoteliales, nerviosas y cancerosas, con expresiones de CAD diferentes en los distintos tipos de células. La N-cadherina (nerviosa) es expresada, predominantemente, por células nerviosas, células endoteliales y una variedad de células de tipo canceroso. La E-cadherina (epitelial) es expresada, predominantemente, por las células epiteliales. Otras CADs son la P-cadherina (placentaria), que se encuentra en la piel humana, y la R-cadherina (retiniana). En la obra de Munro SB et al., 1996, en: Cell Adhesion and Invasion in Cancer Metastasis, P. Brodt, ed., págs. 17-34, RG Landes Co. (Austin TX) se ofrece una detallada discusión de las cadherinas clásicas.

Por lo general, las estructuras de las CADs son similares. Tal como se muestra en la Figura 1, las CADs están compuestas por cinco dominios extracelulares (EC1-EC5), un dominio hidrófobo (TM) único que atraviesa la membrana plasmática (PM), y dos dominios citoplasmáticos (CP1 y CP2). Los restos que fijan calcio DXNDN (SEQ ID NO:41), DXD y LDRE (SEQ ID NO:40) se encuentran dispersos entre los dominios extracelulares. El primer dominio extracelular (EC1) contiene la secuencia clásica de reconocimiento de adhesión celular de cadherina (CAR), HAV (His-Ala-Val), junto con secuencias laterales a cada lado de la secuencia CAR, que pueden desempeñar algún papel en la asignación de especificidad. Se ha demostrado que péptidos sintéticos que contienen la secuencia CAR y anticuerpos dirigidos contra la secuencia CAR inhiben los procesos dependientes de CAD (Munro et al., véase antes; Blaschuk et al., J. Mol. Biol. 211:679-82, 1990; Blaschuk et al., Develop. Biol. 139:227-29, 1990; Alexander et al., J. Cell Physiol. 156:610-18, 1993). Se han determinado la solución tridimensional y las estructuras cristalinas del dominio EC1 (Overduin et al., Science 267:386-389, 1995; Shapiro et al., Nature 374:327-337, 1995).

Aun cuando la adhesión celular es necesaria para determinadas funciones fisiológicas normales, hay situaciones en las que el nivel de adhesión celular resulta indeseable. Por ejemplo, muchas patologías (tales como enfermedades autoinmunes, cánceres y enfermedades inflamatorias) implican una adhesión celular anormal. La adhesión celular puede desempeñar también alguna función en el rechazo de injertos. En tales circunstancias, puede resultar deseable la modulación de la adhesión celular.

Adicionalmente, las barreras de permeabilidad que surgen de la adhesión celular generan dificultades para el suministro de medicamentos a tejidos específicos y tumores en el organismo. Por ejemplo, los parches cutáneos representan un instrumento cómodo para administrar medicamentos a través de la piel. Sin embargo, el uso de parches cutáneos ha estado limitado a pequeñas moléculas hidrófobas a causa de las barreras de células epiteliales y endoteliales. De forma similar, las células endoteliales determinan que los capilares sanguíneos sean fundamentalmente impermeables a los medicamentos, y la barrera hemoencefálica ha impedido desarrollar medicamentos dirigidos al sistema nervioso central. Además, numerosos tumores sólidos desarrollan barreras internas que limitan el suministro de medicamentos antitumorales y anticuerpos a células internas.

Los intentos de facilitar el paso de medicamentos a través de dichas barreras recurren, por lo general, a receptores o proteínas portadoras específicas que transportan moléculas a través de las barreras in vivo. No obstante, estos métodos son a menudo ineficaces debido a la baja velocidad de transporte endógeno o al mal funcionamiento de una proteína portadora con los medicamentos. En tanto que se ha logrado mejorar la eficacia usando una variedad de agentes químicos capaces de romper la adhesión celular, estos agentes se encuentran asociados típicamente con efectos secundarios indeseables, pueden requerir procedimientos invasivos para su administración, y pueden dar lugar a efectos irreversibles. Se ha señalado la posibilidad de utilizar péptidos sintéticos lineales, que contienen una secuencia CAR de cadherina, para el transporte de medicamentos (documento WO 91/04745), pero estos péptidos son, con frecuencia, inestables metabólicamente y se considera, por lo general, que son agentes terapéuticos insuficientes.

En consecuencia, existe la necesidad en la técnica de compuestos que modulen la adhesión celular y mejoren el suministro de medicamentos a través de barreras de permeabilidad sin los citados inconvenientes. La presente invención satisface esta necesidad y ofrece, adicionalmente, otras ventajas.

Blaschuk et al., Developmental Biology, vol. 139, Nº 1, 1990, págs. 227-229, hace referencia a la identificación de una secuencia de reconocimiento de adhesión celular de cadherina.

Resumen de la invención

La presente invención proporciona péptidos cíclicos según las reivindicaciones, y péptidos para ser utilizados en métodos destinados a modular la adhesión celular mediada por cadherinas. En un aspecto, la presente invención proporciona péptidos cíclicos que comprenden la secuencia His-Ala-Val, en donde los péptidos cíclicos modulan la adhesión celular mediada por cadherinas. El péptido cíclico tiene la fórmula:

1

en donde X_{1} y X_{2} son opcionales y, si están presentes, se seleccionan independientemente del grupo consistente en residuos de aminoácidos y sus combinaciones, en donde los residuos están unidos por enlaces peptídicos, y en donde X_{1} y X_{2}, independientemente, tienen un tamaño en el intervalo de 0 a 10 residuos, de modo que la suma de residuos contenidos en X_{1} y X_{2} se encuentra dentro del intervalo de 1 a 12;

en donde Y_{1} e Y_{2} se seleccionan, independientemente, del grupo consistente en residuos de aminoácidos, y en donde se forma un enlace covalente entre los residuos Y_{1} e Y_{2}; y

en donde Z_{1} y Z_{2} son opcionales y, si están presentes, se seleccionan independientemente del grupo consistente en residuos de aminoácidos y sus combinaciones, en donde los residuos están unidos por enlaces peptídicos. Estos péptidos cíclicos pueden comprender modificaciones tales como un grupo N-acetilo o N-alcoxibencilo y/o un grupo amida o éster C-terminal. Los péptidos cíclicos pueden estar ciclados, por ejemplo, a través de un enlace disulfuro; un enlace amida entre grupos funcionales terminales, entre cadenas laterales de residuos, o entre un grupo funcional terminal y una cadena lateral de residuo; un enlace tioéter o \delta_{1}\delta_{1}-ditriptófano, o un derivado del mismo. Los péptidos cíclicos pueden estar unidos, adicionalmente, por un agente de acceso ("targeting agent"), un medicamento, un soporte sólido y/o una marca detectable.

En otro aspecto, la presente invención proporciona composiciones farmacéuticas que comprenden uno o múltiples péptidos cíclicos, según la descripción anterior, en combinación con un vehículo farmacéuticamente aceptable. Estas composiciones pueden comprender, adicionalmente, un medicamento.

En otros aspectos adicionales, los péptidos son para ser utilizados en métodos para modular la adhesión celular, haciendo contactar una célula que expresa una cadherina con un péptido cíclico, según la descripción anterior.

Dentro de otro aspecto adicional, se proporcionan péptidos para reducir las adhesiones celulares no deseadas en un mamífero, mediante la administración a un mamífero de un péptido cíclico, según la descripción anterior.

En otro aspecto, la presente invención proporciona péptidos para potenciar el suministro de un medicamento a través de la piel de un mamífero, haciendo entrar en contacto las células epiteliales de un mamífero con un péptido cíclico, según la descripción anterior, y un medicamento, bajo unas condiciones y durante un período de tiempo suficientes para permitir el paso del medicamento a través de las células epiteliales.

En un aspecto adicional, se proporcionan péptidos para potenciar el suministro de un medicamento a un tumor en un mamífero, mediante la administración a un mamífero de una composición farmacéutica que comprende un péptido cíclico, según la descripción anterior, y un medicamento.

Dentro de aspectos relacionados, se proporcionan péptidos para tratar el cáncer y/o inhibir metástasis de células tumorales en un mamífero, mediante la administración a un mamífero afecto de cáncer de un péptido cíclico, según la descripción anterior.

En un aspecto adicional, se proporcionan péptidos para inducir la apoptosis en una célula que expresa una cadherina, haciendo contactar una célula que expresa una cadherina con un péptido cíclico, según la descripción anterior.

La presente invención proporciona, igualmente, dentro de aspectos adicionales, péptidos para inhibir la angiogénesis en un mamífero, mediante la administración a un mamífero de un péptido cíclico, según la descripción anterior.

En una forma de realización adicional, la presente invención proporciona péptidos para potenciar el suministro de un medicamento al cerebro de un mamífero, mediante la administración a un mamífero de un péptido cíclico, según la descripción anterior.

En aspectos todavía adicionales, se proporcionan péptidos para potenciar la adhesión celular. Dentro de uno de estos aspectos, se proporcionan péptidos para potenciar la cicatrización de heridas en un mamífero, haciendo contactar una herida de un mamífero con un péptido cíclico, según la descripción anterior.

Dentro de un aspecto relacionado, la presente invención proporciona péptidos para potenciar la adhesión de tejidos extraños implantados en un mamífero, haciendo contactar un lugar de implantación de tejidos extraños en un mamífero con un péptido cíclico, según la descripción anterior.

La presente invención proporciona, asimismo, en aspectos adicionales, péptidos para potenciar la extensión de axones, haciendo contactar una neurona con un péptido cíclico, según la descripción anterior.

En un aspecto relacionado, se proporcionan péptidos para tratar lesiones de la médula espinal en un mamífero, mediante la administración a un mamífero de un péptido cíclico, según la descripción anterior.

En un aspecto relacionado adicional, la presente invención proporciona péptidos para tratar una enfermedad neurológica desmielinizante en un mamífero, administrando a un mamífero un péptido cíclico, según la descripción anterior.

La presente invención proporciona, asimismo, péptidos para modular el sistema inmune de un mamífero, mediante la administración a un mamífero de un péptido cíclico, según la descripción anterior.

En todavía otro aspecto, se proporcionan péptidos para prevenir el embarazo en un mamífero, mediante la administración a un mamífero de una composición, según la descripción anterior.

En un aspecto adicional, se proporcionan péptidos para incrementar la permeabilidad vascular en un mamífero, mediante la administración a un mamífero de un péptido cíclico, según la descripción anterior.

La presente invención proporciona, igualmente, métodos para identificar un péptido cíclico capaz de modular la adhesión celular mediada por cadherinas. Uno de tales métodos comprende: (a) cultivar neuronas en una monocapa de células que expresan N-cadherina, en presencia y en ausencia de un péptido cíclico candidato, bajo las condiciones y durante el período de tiempo suficientes para permitir la extensión de axones; (b) determinar una longitud media de axón para las neuronas; y (c) comparar la longitud media del axón para las neuronas cultivadas en presencia de un péptido cíclico candidato con la longitud del axón en neuronas cultivadas en ausencia de un péptido cíclico
candidato.

Dentro de otra forma de realización, el método comprende: (a) cultivar células que expresan una cadherina, en presencia y en ausencia de un péptido cíclico candidato, bajo las condiciones y durante el período de tiempo suficientes para permitir la adhesión celular; y (b) evaluar visualmente el grado de adhesión celular entre las células.

En todavía otra forma de realización, el método comprende: (a) cultivar células NRK en presencia y en ausencia de un péptido cíclico candidato, bajo las condiciones y durante el período de tiempo suficientes para permitir la adhesión celular; y (b) comparar el nivel de E-cadherina en la superficie celular en las células cultivadas en presencia del péptido cíclico candidato con el nivel en las células cultivadas en ausencia del péptido cíclico candidato.

En una forma de realización adicional, el método comprende: comparar la cantidad de marca experimental que pasa a través del epitelio de la piel, en contacto con la marca experimental, en presencia de un péptido cíclico candidato, con la cantidad que atraviesa la piel en ausencia de un péptido cíclico candidato.

Dentro de otra forma de realización, el método in vitro comprende: comparar el grado de angiogénesis observada en un vaso sanguíneo puesto en contacto con un péptido cíclico candidato, hasta un grado predeterminado de angiogénesis observado para un vaso sanguíneo en ausencia de un péptido cíclico candidato y, a partir de aquí, identificar un péptido cíclico capaz de modular la adhesión celular.

La presente invención proporciona también, dentro de un aspecto adicional, un kit para administrar un medicamento a través de la piel de un mamífero, que comprende: (a) un parche dérmico; y (b) un péptido cíclico según la descripción anterior.

Dentro de aspectos todavía adicionales, la presente invención proporciona métodos in vitro para modular la adhesión celular, que comprenden poner en contacto una célula que expresa cadherina con un anticuerpo que se une a un péptido cíclico, según la descripción anterior. En uno de estos aspectos, se proporciona un método para hacer acceder un medicamento a una célula que expresa cadherina en un mamífero, que comprende administrar a un mamífero un anticuerpo que se une a un péptido cíclico, según la descripción anterior, en donde el anticuerpo se encuentra unido a un medicamento.

La presente invención proporciona, igualmente, métodos para detectar la presencia de células que expresan cadherina en una muestra, que comprenden: (a) poner en contacto una muestra con un anticuerpo que se une a un péptido cíclico, según la descripción anterior, bajo las condiciones y durante el período de tiempo suficientes para permitir la formación de un complejo de anticuerpo-cadherina; y (b) detectar el nivel de complejo de anticuerpo-cadherina.

Dentro de otro aspecto, la presente invención proporciona kits para detectar la presencia de células que expresan cadherina en una muestra, que comprenden:

(a): un anticuerpo que se une a un péptido cíclico, según la descripción anterior; y

(b): un reactivo de detección.

Estos y otros aspectos adicionales de la invención resultarán evidentes cuando se haga referencia a la siguiente descripción detallada y a los dibujos anexos.

Breve descripción de los dibujos

Figura 1 es un diagrama que representa la estructura de CADs clásicas. Los cinco dominios extracelulares se designan EC1-EC5, el dominio hidrófobo que atraviesa la membrana plasmática (PM) está representado por TM, y los dos dominios citoplasmáticos están representados por CP1 y CP2. Los restos que fijan calcio se muestran mediante DXNDN (SEQ ID NO:41), DXD y LDRE (SEQ ID NO:40). La secuencia CAR, HAV, se muestra dentro de EC1. También se muestran las proteínas citoplasmáticas \beta-catenina (\beta), \alpha-catenina (\alpha) y \alpha-actinina (ACT), que median la interacción entre CADs y los microfilamentos (MF).

Figura 2 ofrece las secuencias de aminoácidos de los dominios EC1 clásicos de cadherina en mamíferos: N-cadherina humana (SEQ ID NO:1), N-cadherina de ratón (SEQ ID NO:2), N-cadherina bovina (SEQ ID NO:3), P-cadherina humana (SEQ ID NO:4), P-cadherina de ratón (SEQ ID NO:5), E-cadherina humana (SEQ ID NO:6), y E-cadherina de ratón (SEQ ID NO:7).

Figura 3 muestra las estructuras de péptidos cíclicos representativos de la presente invención (estructuras a la izquierda), junto con estructuras similares, pero inactivas (a la derecha).

Figura 4 es un histograma que muestra la longitud axonal media, en micrómetros, para neuronas cultivadas en una monocapa de células 3T3 no transfectadas (primera columna), o células 3T3 transfectadas con ADNc que codifica N-cadherina (columnas 2-4). En la tercera columna, se muestra la longitud axonal media en presencia del péptido cíclico representativo N-Ac-CHAVC-NH_{2} (SEQ ID NO:8). La columna 4 muestra la longitud axonal media en presencia del péptido de control N-Ac-CHGVC-NH_{2} (SEQ ID NO:9).

Figura 5 es un gráfico que muestra una curva de respuesta a la dosis para el péptido cíclico representativo N-Ac-CHAVC-NH_{2} (SEQ ID NO:8) sobre células 3T3 de control (círculos abiertos) y sobre células 3T3 que expresan N-cadherina (círculos macizos).

Figura 6 es un histograma que muestra la longitud axonal media, en micrómetros, en neuronas cultivadas en presencia (barras macizas) o ausencia (barras sombreadas) de 500 \mug/ml del péptido cíclico representativo N-Ac-CHAVC-NH_{2} (SEQ ID NO:8). En el primer par de barras, las neuronas se cultivaron en una monocapa de células 3T3 no transfectadas. En las restantes columnas, se muestra la longitud axonal media en neuronas cultivadas sobre células 3T3 transfectadas con ADNc que codifica N-CAM (segundo par de barras), L1 (tercer par de barras), o N-cadherina (cuarto par de barras).

Figuras 7A-C son fotografías que muestran cultivos monocapa de células endoteliales bovinas en presencia (Figura 7A) y ausencia (Figura 7C) de un péptido cíclico representativo, o en presencia de un péptido de control inactivo (Figura 7B). La Figura 7A muestra las células 30 minutos después de la exposición a 500 \mug/ml de N-Ac-CHAVC-NH_{2} (SEQ ID NO:8). La Figura 7B muestra las células 30 minutos después de la exposición al péptido de control N-Ac-CHGVC-NH_{2} (SEQ ID NO:9). La Figura 7C muestra las células en ausencia de péptido cíclico. Obsérvese que las células endoteliales están retraídas entre sí en presencia de N-Ac-CHAVC-NH_{2} (SEQ ID NO:8).

Figuras 8A-C son fotografías que muestran cultivos monocapa de células endoteliales bovinas en presencia (Figura 8A) y ausencia (Figura 8C) de un péptido cíclico representativo, o en presencia de un péptido de control inactivo (Figura 8B). La Figura 8A muestra las células 30 minutos después de la exposición a 500 \mug/ml de N-Ac-
CAHAVDIC-NH_{2} (SEQ ID NO:10). La Figura 8B muestra las células 30 minutos después de la exposición al péptido de control N-Ac-CAHGVDIC-NH_{2} (SEQ ID NO:11). La Figura 8C muestra las células en ausencia de péptido cíclico. En este caso, ninguno de los péptidos cíclicos exhibe actividad.

Figuras 9A-C son fotografías que muestran cultivos monocapa de células endoteliales bovinas en presencia (Figura 9A) y ausencia (Figura 9C) de un péptido cíclico representativo, o en presencia de un péptido de control inactivo (Figura 9B). La Figura 9A muestra las células 30 minutos después de la exposición a 500 \mug/ml de N-Ac-CAHAVDC-NH_{2} (SEQ ID NO:16). La Figura 9B muestra las células 30 minutos después de la exposición al péptido de control N-Ac-CAHGVDC-NH_{2} (SEQ ID NO:17). La Figura 9C muestra las células en ausencia de péptido cíclico. Obsérvese que las células endoteliales están retraídas entre sí en presencia de N-Ac-CAHAVDC-NH_{2} (SEQ ID NO:16).

Figuras 10A-C son fotografías que muestran cultivos monocapa de células endoteliales bovinas en presencia (Figura 10A) y ausencia (Figura 10C) de un péptido cíclico representativo, o en presencia de un péptido de control inactivo (Figura 10B). La Figura 10A muestra las células 30 minutos después de la exposición a 500 \mug/ml de N-Ac-
CSHAVSSC-NH_{2} (SEQ ID NO:18). La Figura 10B muestra las células 30 minutos después de la exposición al péptido de control N-Ac-CSHGVSSC-NH_{2} (SEQ ID NO:19). La Figura 10C muestra las células en ausencia de péptido cíclico. Obsérvese que las células endoteliales están retraídas entre sí y se reúnen en presencia de N-Ac-CSHAVSSC-NH_{2} (SEQ ID NO:18).

Figuras 11A-F son fotografías que muestran cultivos monocapa de células cancerosas de ovario humano (SKOV3), en presencia (Figuras 11A y D-F) y ausencia (Figura 11C) de un péptido cíclico representativo, o en presencia de un péptido de control inactivo (Figura 11B). La Figura 11A muestra las células 24 horas después de haberlas cultivado en presencia de 500 \mug/ml de N-Ac-CHAVC-NH_{2} (ampliación 10x). La Figura 11B muestra las células (ampliación 10x) 24 horas después de haberlas cultivado en presencia del péptido de control N-Ac-CHGVC-NH_{2} (SEQ ID NO:9). La Figura 11C muestra las células (ampliación 10x) en ausencia de péptido cíclico. Las Figuras 11D-F muestran las células (ampliación 20x) 48 horas después de la exposición a N-Ac-CHAVC-NH_{2} (SEQ ID NO:8) a concentraciones de 1 mg/ml, 100 \mug/ml y 10 \mug/ml, respectivamente. Obsérvese que las células SKOV3 se retraen entre sí y se reúnen cuando se les cultiva en presencia de 0,5 ó 1 mg/ml de N-Ac-CHAVC-NH_{2} (SEQ ID NO:8).

Figuras 12A y 12B son fotografías que muestran cultivos monocapa de células cancerosas de ovario humano (SKOV3), 24 horas después de la exposición a 500 \mug/ml del péptido cíclico representativo N-Ac-CHAVC-NH_{2} (SEQ ID NO:8) (Figura 12A), o del péptido de control N-Ac-CHGVC-NH_{2} (Figura 12B). Obsérvese que las células SKOV3 se reúnen cuando son cultivadas en presencia de 0,5 mg/ml de N-Ac-CHAVC-NH_{2} (SEQ ID NO:8).

Figuras 13A-D son fotografías de cultivos monocapa de células renales de rata normales (NRK), no tratadas (Figura 13A), o después de 48 horas de exposición a 1 mg/ml de H-CHAVSC-OH (SEQ ID NO:14) (Figura 13B), del péptido de control N-Ac-CHGVC-NH_{2} (SEQ ID NO:9) (Figura 13C), o del péptido cíclico representativo N-Ac-CHAVC-NH_{2} (SEQ ID NO:8) (Figura 13D). Obsérvese que las células NRK se retraen entre sí cuando son cultivadas en presencia de N-Ac-CHAVC-NH_{2} (SEQ ID NO:8). Adicionalmente, las células NRK no forman monocapas tipo empedrado cuando son expuestas a este péptido.

Figuras 14A-D son fotografías de inmunofluorescencia de los cultivos monocapa de células renales de rata normales (NRK) que se muestran en las Figuras 13A-D, inmunomarcados para E-cadherina. La Figura 14A muestra células no tratadas, y las Figuras 14B-D muestran las células 48 horas después de la exposición a 1 mg/ml de H-CHAVSC-OH (SEQ ID NO:14) (Figura 14B), del péptido de control N-Ac-CHGVC-NH_{2} (SEQ ID NO:9) (Figura 14C), o del péptido cíclico representativo N-Ac-CHAVC-NH_{2} (SEQ ID NO:8) (Figura 14D). Obsérvese que la expresión de E-cadherina se halla fuertemente reducida en las células tratadas con N-Ac-CHAVC-NH_{2} (SEQ ID NO:8), en comparación con los niveles de E-cadherina expresados por células no tratadas y células tratadas con los otros dos péptidos cíclicos.

Figuras 15A-C son fotografías que muestran cultivos monocapa de células cancerosas de ovario humano (OVCAR3) en presencia de diversas concentraciones de un péptido cíclico representativo. La Figura 15A muestra las células 24 horas después de haber sido cultivadas en presencia de 1 mg/ml de H-CHAVSC-OH (SEQ ID NO:14). La Figura 15B muestra las células 24 horas después de haber sido cultivadas en presencia de 100 \mug/ml de H-CHAVSC-OH (SEQ ID NO:14). La Figura 15C muestra las células 24 horas después de haber sido cultivadas en presencia de 10 \mug/ml de H-CHAVSC-OH (SEQ ID NO:14). Obsérvese que las células se retraen entre sí en presencia de 100 \mug/ml de H-CHAVSC-OH (SEQ ID NO:14), en tanto que se reúnen en presencia de 1 mg/ml de este péptido.

Figuras 16A y B son fotografías que muestran cultivos de células ME115 de melanoma humano en presencia (Figura 16B) y ausencia (Figura 16A) de un péptido cíclico representativo. Las células han sido inmunomarcadas para cadherina. La Figura 16B muestra las células 48 horas después de haber sido cultivadas en presencia de 500 \mug/ml de N-Ac-CHAVC-NH_{2} (SEQ ID NO:8). La Figura 16A muestra cultivos no tratados de células ME115 de melanoma humano. Obsérvese que cadherina está localizada en vesículas intracelulares en las células tratadas con el péptido, mientras que está presente en la superficie en las células no tratadas.

Figuras 17A y B son fotografías que muestran cultivos monocapa de células epiteliales de mama humana A1N4 en presencia (Figura 17B) y ausencia (Figura 17A) de un péptido cíclico representativo. Las células han sido inmunomarcadas para E-cadherina. La Figura 17B muestra las células 48 horas después de haber sido cultivadas en presencia de 500 \mug/ml de N-Ac-CHAVC-NH_{2} (SEQ ID NO:8). La Figura 17A muestra cultivos monocapa no tratados de células epiteliales de mama humana A1N4. Obsérvese que la distribución de E-cadherina es no contigua en las células tratadas con el péptido cíclico. Adicionalmente, han aparecido separaciones en la monocapa de células tratadas con el péptido.

Descripción detallada de la invención

Tal como se ha señalado anteriormente, la presente invención proporciona, de acuerdo con sus reivindicaciones, péptidos cíclicos capaces de modular la adhesión celular modulada por cadherina. Determinados péptidos cíclicos descritos en este documento inhiben la adhesión celular. Estos péptidos cíclicos se pueden utilizar, por lo general, por ejemplo, para tratar enfermedades u otros trastornos que se distinguen por una adhesión celular no deseada, o para facilitar el suministro de medicamentos a un tejido específico o a un tumor. De manera alternativa, se puede utilizar un péptido cíclico, tal como cuando está unido a una matriz o a otro péptido cíclico a través de un conector ("linker"), para potenciar la adhesión celular. Estos conjugados de péptido cíclico-matriz se pueden usar, por ejemplo, para mejorar la adhesión celular (por ejemplo, para suplementar o sustituir a los puntos de sutura o para facilitar la cicatrización de heridas), o para potenciar o dirigir el crecimiento de axones.

Péptidos cíclicos

La expresión "péptidos cíclicos", tal como se usa en este documento, se refiere a un péptido o sal del mismo que comprende (1) un enlace covalente intramolecular entre dos residuos no adyacentes, y (2) al menos una secuencia de reconocimiento de adhesión celular por cadherina (CAR). El enlace intramolecular puede ser un enlace de esqueleto a esqueleto, cadena lateral a esqueleto, o cadena lateral a cadena lateral (es decir, los grupos funcionales terminales de un péptido lineal y/o los grupos funcionales de la cadena lateral de un residuo terminal o interior pueden estar unidos para alcanzar la ciclación). Enlaces intramoleculares preferidos incluyen, pero no están limitados a ellos, enlaces disulfuro, amida y tioéter. Al menos una secuencia CAR comprende, por lo general, HAV (His-Ala-Val). Los péptidos cíclicos pueden contener solamente una secuencia CAR o, adicionalmente, pueden contener uno o múltiples sitios de unión para moléculas de adhesión, que pueden ser o no CARs. Estas secuencias adicionales pueden estar separadas por un conector (es decir, uno o múltiples péptidos no derivados de una secuencia CAR u otro sitio de unión de moléculas de adhesión). En una de estas formas de realización, el péptido cíclico contiene 2 secuencias HAV. En otra forma de realización, el péptido cíclico contiene una secuencia HAV y una secuencia CAR, reconocida por una CAM diferente. En una forma de realización preferida, la segunda secuencia CAR deriva de fibronectina y es reconocida por una integrina (es decir, Arg-Gly-Asp; véase Cardarelli et al., J. Biol. Chem. 267:23159-23164, 1992).

Además de la(s) secuencia(s) CAR, los péptidos cíclicos comprenden, por lo general, al menos un residuo adicional, de manera que el tamaño del anillo de péptido cíclico se encuentra dentro del intervalo de 4 a aprox. 15 residuos, preferentemente 5 a 10 residuos. Este(os) residuo(s) adicional(es) puede(n) estar presente(s) en la extremo N-terminal y/o C-terminal de una secuencia CAR, y puede(n) derivar de secuencias que flanquean la secuencia HAV en una o múltiples cadherinas de origen natural (por ejemplo, N-cadherina, E-cadherina, P-cadherina, R-cadherina u otras cadherinas que contienen la secuencia HAV), con o sin sustituyentes de aminoácidos y/u otras modificaciones. En la Figura 2 y en las SEQ ID Nos:1 a 7 se muestran las secuencias de flanqueo para las cadherinas N, E, P y R endógenas. Los números de acceso a las bases de datos para las cadherinas de origen natural son los siguientes: N-cadherina humana, M34064, N-cadherina de ratón, M31131 y M22556, N-cadherina bovina X53615, P-cadherina humana, X63629, P-cadherina de ratón, X06340, E-cadherina humana, Z13009, E-cadherina de ratón, X06115. De manera alternativa, residuos adicionales presentes en uno o ambos extremos de la(s) secuencia(s) CAR pueden no estar relacionados con una secuencia endógena (por ejemplo, residuos que facilitan la ciclación).

Tal como se discutirá más adelante, en determinadas formas de realización preferidas, se prefieren péptidos cíclicos relativamente pequeños, que no contienen secuencias importantes que flanquean la secuencia HAV, para modular la adhesión celular mediada por N-cadherina y E-cadherina. Estos péptidos pueden contener un grupo N-acetilo y un grupo C-amida (por ejemplo, el anillo de 5 residuos N-Ac-CHAVC-NH_{2} (SEQ ID NO:8) o N-Ac-KHAVC-NH_{2} (SEQ ID NO:20)). El hallazgo, dentro de la presente invención, de que estos péptidos cíclicos relativamente pequeños pueden ser inhibidores eficaces y multivalentes de la adhesión celular representa un descubrimiento inesperado. Estos péptidos cíclicos pueden ser considerados "llaves maestras" que encajan en los sitios de unión peptídica de cada una de las distintas cadherinas clásicas, y son capaces de romper la adhesión celular de neuronas, células endoteliales, células epiteliales y/o ciertas células cancerosas. En general, se pueden utilizar pequeños péptidos cíclicos para modular de manera específica la adhesión celular de neuronas y/u otros tipos de células por medio de la administración tópica o administración sistémica, con o sin la adición de un agente de acceso al péptido, tal como se analiza más adelante.

En otras formas de realización preferidas, un péptido cíclico puede contener secuencias que flanquean la secuencia HAV en uno o ambos lados, y que han sido diseñadas para conferir especificidad para la adhesión celular mediada por una o múltiples cadherinas específicas, y que dan como resultado especificidad tisular y/o por tipo de célula. Secuencias de flanqueo adecuadas para conferir especificidad incluyen, sin estar limitadas a ellas, secuencias endógenas presentes en una o múltiples cadherinas de origen natural, y los péptidos cíclicos que poseen especificidad se pueden identificar usando los sistemas de rastreo representativos que se ofrecen en este documento. Por ejemplo, se ha encontrado, dentro del contexto de la presente invención, que los péptidos cíclicos que contienen residuos adicionales, derivados de la secuencia nativa de E-cadherina, en el extremo C-terminal de la secuencia CAR, son específicos para células epiteliales (es decir, estos péptidos rompen la adhesión celular mediada por E-cadherina en mayor grado que la expresión de N-cadherina). La adición de secuencias endógenas apropiadas puede dar como resultado, igualmente, péptidos que rompan la adhesión celular mediada por N-cadherina.

Para facilitar la preparación de péptidos cíclicos con una especificidad deseada, pueden usarse técnicas de resonancia magnética nuclear (RMN) e informáticas para determinar la conformación de un péptido que confiere una especificidad conocida. La RMN se utiliza extensamente en el análisis estructural de moléculas. Las intensidades máximas cruzadas en los espectros del efecto nuclear de Overhauser (NOE), las constantes de acoplamiento, y los desplazamientos químicos dependen de la conformación de un compuesto. Los datos NOE proporcionan la distancia entre protones n el espacio y a través del anillo del péptido cíclico. Esta información se puede utilizar para facilitar el cálculo de la conformación de energía mínima para la secuencia HAV. A continuación, la conformación se puede correlacionar con la especificidad tisular, para permitir la identificación de péptidos que tengan una especificidad tisular similar, o tengan una especificidad tisular reforzada.

Los péptidos cíclicos tal como se describen en este documento pueden comprender residuos de L-aminoácidos, D-aminoácidos, o cualquier combinación de los mismos. Los aminoácidos pueden proceder de fuentes naturales o no naturales, con la condición de que la molécula contenga al menos un grupo amino y al menos un grupo carboxilo; generalmente, se prefieren \alpha-aminoácidos y \beta-aminoácidos. Los 20 L-aminoácidos normalmente presentes en las proteínas se identifican en este documento por medio de las abreviaturas convencionales de tres o una letra, que aparecen en la Tabla 1, y los D-aminoácidos correspondientes se designan por medio de un símbolo de una letra minúscula. Asimismo, un péptido cíclico puede contener uno o múltiples aminoácidos raros (tales como 4-hidroxiprolina o hidroxilisina), ácidos o amidas orgánicos y/o derivados de aminoácidos comunes, tales como aminoácidos que tienen el carboxilato C-terminal esterificado (por ejemplo, ésteres bencilo, metilo o etilo) o amidado, y/o que tienen modificaciones del grupo amino N-terminal (por ejemplo, acetilación o alcoxicarbonilación), con o sin cualquiera de una extensa variedad de modificaciones de las cadenas laterales y/o sustituciones (por ejemplo, metilación, bencilación, t-butilación, tosilación, alcoxicarbonilación, y similares). Derivados preferidos incluyen aminoácidos que tienen un grupo N-acetilo (de manera que el grupo amino que representa el extremo N del péptido lineal anterior a la ciclación resultado acetilado) y/o un grupo amida C-terminal (es decir, el extremo carboxi del péptido lineal antes de la ciclación resulta amidado). Residuos diferentes de los aminoácidos comunes que pueden estar presentes con un péptido cíclico incluyen, pero sin estar limitados a ellos, penicilamina, \beta,\beta-tetrametilencisteína, \beta,\beta-pentametilen-cisteína, ácido \beta-mercaptopropiónico, ácido \beta,\beta-pentametilen-\beta-mercaptopropiónico, 2-mercapobenceno, 2-mercaptoanilina, 2-mercaptoprolina, ornitina, ácido diaminobutírico, ácido \alpha-aminoadípico, ácido m-aminometilbenzoico, y ácido \alpha,\beta-diaminopropiónico.

TABLA 1 Abreviaturas de una y tres letras de aminoácidos

\vskip1.000000\baselineskip

2

Los péptidos cíclicos según la presente descripción se pueden sintetizar por métodos bien conocidos en la técnica, incluidos métodos de ADN recombinante y síntesis química. La síntesis química se puede llevar a cabo, por lo general, usando técnicas de síntesis de péptidos de fase de solución o de fase sólida convencionales, en los que se produce un enlace peptídico a través de la condensación directa del grupo \alpha-amino de un aminoácido con el grupo \alpha-carboxi del otro aminoácido, con la eliminación de una molécula de agua. La síntesis de enlaces peptídicos por condensación directa, tal como se ha formulado anteriormente, requiere la supresión del carácter reactivo del grupo amino del primer aminoácido, y del grupo carboxilo del segundo. Los sustituyentes de enmascaramiento deben permitir su separación sencilla, sin inducir la degradación de la molécula peptídica lábil.

En la síntesis de fase de solución, puede utilizarse una amplia variedad de métodos de acoplamiento y grupos protectores (véase Gross y Meienhofer, eds., "The Peptides: Analysis, Synthesis, Biology", Vol. 1-4 (Academic Press, 1979); Bodansky y Bodansky, "The Practice of Peptide Synthesis", 2ª edición (Springer Verlag, 1994)). Adicionalmente, resultan posibles la purificación intermedia y la ampliación ("scale-up"). Los expertos en la técnica podrán apreciar que la síntesis en solución requiere tener en consideración los grupos protectores de la cadena principal y de la cadena lateral, y el método de activación. Además, es necesaria una cuidadosa selección del segmento para minimizar la racemización durante la condensación de segmentos. Asimismo, se han de tener en cuenta las consideraciones de solubilidad.

La síntesis de péptidos en fase sólida utiliza un polímero insoluble como soporte durante la síntesis orgánica. La cadena peptídica soportada por el polímero permite usar etapas simples de lavado y filtración en lugar de laboriosas purificaciones en las etapas intermedias. La síntesis de péptidos en fase sólida puede llevarse a cabo, por lo general, de acuerdo con el método de Merrifield et al., J. Am. Chem. Soc. 85:2149, 1963, que implica ensamblar una cadena peptídica lineal sobre un soporte de resina, utilizando aminoácidos protegidos. La síntesis de péptidos en fase sólida usa, típicamente, la estrategia Boc o Fmoc. La estrategia Boc utiliza una resina de poliestireno reticulada al 1%. El grupo protector estándar para las funciones \alpha-amino es el grupo terc-butoxicarbonilo (Boc). Este grupo se puede separar con soluciones diluidas de ácidos fuertes tales como ácido trifluoroacético (TFA) al 25%. El siguiente Boc-aminoácido se acopla, típicamente, a la resina de aminoacilo usando diciclohexilcarbodiimida (DCC). Después de finalizar el ensamblaje, el complejo de péptido-resina se trata con HF anhidro para escindir el enlace éster bencílico y libera el péptido libre. Los grupos funcionales de la cadena lateral están habitualmente bloqueados durante la síntesis por grupos de bloqueo derivados de bencilo, que también son escindidos por HF. A continuación, se extrae el péptido libre de la resina con un disolvente apropiado, se purifica y caracteriza. Péptidos recientemente sintetizados pueden ser purificados, por ejemplo, por filtración sobre gel, HPLC, cromatografía de partición y/o cromatografía de intercambio iónico, y puede ser caracterizado, por ejemplo, por espectrometría de masa o análisis de secuencia de aminoácidos. En la estrategia Boc, pueden obtenerse péptidos amidados en el extremo C-terminal usando resinas de benzilhidrilamina o metilbenzilhidrilamina, que rinden amidas peptídicas directamente tras la escisión
con HF.

En los procedimientos anteriormente discutidos, la selectividad de los grupos de bloqueo de la cadena lateral y de la unión péptido-resina depende de las diferencias de velocidad de escisión acidolítica. Se han introducido sistemas Orthoganol, en los que los grupos de bloqueo de la cadena lateral y la unión péptido-resina son completamente estables frente al reactivo utilizado para separar el grupo \alpha-protector en cada etapa de la síntesis. El más frecuente de estos métodos comprende el procedimiento de 9-fluorenilmetiloxicarbonilo (Fmoc). En este método, los grupos protectores de la cadena lateral y la unión péptido-resina son completamente estables frente a las aminas secundarias utilizadas para escindir el grupo N-\alpha-Fmoc. La protección de la cadena lateral y la unión péptido-resina se escinden por acidólisis suave. El contacto repetido con una base hace que la resina de Merrifield no resulte adecuada para el método Fmoc, y se utilizan, por lo general, ésteres de p-alcoxibencilo. La desprotección y la escisión se llevan a cabo, normalmente, usando TFA.

Los expertos en la técnica reconocerán que, en la síntesis en fase sólida, las reacciones de desprotección y de acoplamiento deben ir dirigidas a la compleción, y que los grupos protectores de la cadena lateral deben ser estables durante la totalidad de la síntesis. Adicionalmente, la síntesis en fase sólida es, por lo general, la más apropiada cuando los péptidos se deben producir a pequeña escala.

La acetilación del extremo N-terminal se debe llevar a cabo haciendo reaccionar el péptido final con anhídrido acético antes de la escisión de la resina. La C-amidación se efectúa usando una resina apropiada tal como la resina metilbenzilhidrilamina, utilizando la tecnología Boc.

Después de la síntesis de un péptido lineal, con o sin N-acetilación y/o C-amidación, se puede realizar la ciclación por cualquiera de diversos métodos bien conocidos en la técnica. En una forma de realización, se puede generar un enlace entre cadenas laterales reactivas de aminoácidos. Por ejemplo, se puede formar un enlace disulfuro desde un péptido lineal que comprende dos residuos que comprenden tiol, por la oxidación del péptido usando cualquiera de diversos métodos. En uno de esos métodos, la oxidación con aire de los tioles puede generar enlaces disulfuro durante un período de varios días, utilizando medios acuosos tanto básicos como neutros. El péptido se utiliza en una elevada dilución para minimizar la agregación y las reacciones secundarias intermoleculares. Este método adolece del inconveniente de ser lento, pero muestra la ventaja se producir únicamente H_{2}O como producto secundario. Alternativamente, pueden usarse agentes oxidantes fuertes tales como I_{2} y K_{3}Fe(CN)_{6} para formar enlaces disulfuro. Los expertos en la técnica reconocerán que se debe actuar con precaución para no oxidar las cadenas laterales sensibles de Met, Tyr, Trp o His. Los péptidos cíclicos producidos por este método requieren purificación por medio de diversas técnicas, pero esta oxidación es aplicable a pH ácidos. A modo de ejemplo, se pueden utilizar agentes oxidantes fuertes para llevar a cabo la ciclación que se muestra más adelante (SEQ ID Nos:33 y 34), en la que se cicla la porción
subrayada:

\vskip1.000000\baselineskip

3

\newpage

Los agentes oxidantes permiten también la desprotección/oxidación simultánea de precursores lineales protegidos con S, para evitar una oxidación prematura e inespecífica de la cisteína libre, tal como se muestra a continuación (SEQ ID Nos: 35 y 36), en donde X e Y = S-Trt o S-Acm:

\vskip1.000000\baselineskip

4

\vskip1.000000\baselineskip

DMSO, a diferencia de I_{2} y K_{3}Fe(CN)_{6}, es un agente oxidante suave que no produce reacciones secundarias oxidativas de los aminoácidos nucleófilos mencionados más arriba. DMSO es miscible con H_{2}O a cualquier concentración, y las oxidaciones se pueden llevar a cabo a pH ácido hasta neutro, con productos secundarios inocuos. De forma alternativa, se puede utilizar metiltriclorosilano-difenilsulfóxido como agente oxidante, para la desprotección/oxidación simultánea de S-Acm, S-Tacm o S-t-Bu de cisteína, sin afectar a otros aminoácidos nucleófilos. No se generan productos polímeros como resultado de la formación de enlaces disulfuro. En el ejemplo siguiente (SEQ ID Nos:37 y 38), X es Acm, Tacm o t-Bu:

\vskip1.000000\baselineskip

5

\vskip1.000000\baselineskip

Residuos que contienen tiol, adecuados para ser utilizados en estos métodos de oxidación, incluyen, pero sin estar limitados a ellos, cisteína, \beta,\beta-dimetil cisteína (penicilamina o Pen), \beta,\beta-tetrametilen cisteína (Tmc), \beta,\beta-pentametilen cisteína (Pmc), ácido \beta-mercaptopropiónico (Mpr), ácido\beta,\beta-pentametilen-\beta-mercaptopropiónico (Pmp), 2-mercaptobenceno, 2-mercaptoanilina y 2-mercaptoprolina. Las siguientes fórmulas representativas ilustran péptidos que contienen tales residuos, en los que la porción subrayada está ciclada, los grupos N-acetilo están indicados por N-Ac, y los grupos amina C-terminales se representan con -NH_{2}:

\vskip1.000000\baselineskip

6

\vskip1.000000\baselineskip

7

\vskip1.000000\baselineskip

8

\vskip1.000000\baselineskip

Para los expertos en la técnica, resultará fácilmente evidente que, dentro de cada una de estas fórmulas representativas, se puede emplear cualquiera de los residuos que contienen tiol en lugar de uno o ambos residuos que contienen tiol mencionados.

En una forma de realización adicional, se puede obtener la ciclación por formación de enlaces amida. Por ejemplo, se puede formar un enlace peptídico entre grupos funcionales terminales (es decir, los extremos amino y carboxi de un péptido lineal, antes de la ciclación). Dos de estos péptidos son AHAVDI (SEQ ID NO:44) y SHAVSS (SEQ ID NO:45), con o sin un grupo acetilo N-terminal y/o una amida C-terminal. En otra de estas formas de realización, el péptido lineal comprende un D-aminoácido (por ejemplo, HAVsS). Alternativamente, la ciclación se puede lograr enlazando un extremo terminal y una cadena lateral del residuo, o utilizando dos cadenas laterales, tal como en KHAVD (SEQ ID NO:20) o KSHAVSSD (SEQ ID NO:46), con o sin un grupo acetilo N-terminal y/o una amida C-terminal. Residuos capaces de formar un enlace lactámico incluyen lisina, ornitina (Orn), ácido \alpha-amino adípico, ácido m-aminometilbenzoico, ácido \alpha,\beta-diaminopropiónico, glutamato o aspartato.

Los métodos para formar enlaces amida son bien conocidos en la técnica, y se basan en principios suficientemente establecidos de reactividad química. En uno de tales métodos, la formación de lactama mediada por carbodiimida se puede alcanzar por la reacción de un ácido carboxílico con DCC, DIC, EDAC o DCCI, dando como resultado la formación de una O-acilurea que se puede hacer reaccionar de inmediato con el grupo amino libre para completar la ciclación. La formación de la N-acilurea inactiva, consecuencia de la migración O \rightarrow N, se puede obviar mediante la conversión de la O-acilurea en un éster activo por medio de la reacción con un N-hidroxicompuesto tal como 1-hidroxibenzotriazol, 1-hidroxisuccinimida, 1-hidroxinorborneno carboxamida, o 2-hidroxiiino-2-cianoacetato etílico. Además, para minimizar la migración O \rightarrow N, estos aditivos actúan también como catalizadores durante la ciclación y contribuyen a reducir la racemización. De manera alternativa, la ciclación se puede llevar a cabo usando el método de azida, en el cual se genera una azida reactiva intermedia a partir de un éster alquílico a través de una hidrazida. La hidrazinólisis del éster terminal requiere del uso de un grupo t-butilo para la protección de las funciones carboxilo de la cadena lateral en el componente de acilación. Esta limitación se puede superar mediante el uso de ácido difenilfosforílico (DPPA), que proporciona una azida directamente tras la reacción con un grupo carboxilo. La lenta reactividad de las azidas y la formación de isocianatos por su desproporcionación restringen la utilidad de este método. El método de anhídrido mixto de formación de lactama se utiliza extensamente debido a la sencilla separación de los productos secundarios de la reacción. El anhídrido se forma tras la reacción del anión carboxilato con un cloroformiato alquílico o cloruro de pivaloílo. El ataque del componente amino se conduce, entonces, al carbono carbonilo del componente de acilación por medio del efecto de donación de electrón del grupo alcoxi o por la masa estérica del grupo cloruro t-butilo de pivaloílo, que obstruye el ataque sobre el grupo carbonilo equivocado. También se han utilizado con éxito anhídridos mixtos con derivados del ácido fosfórico. De modo alternativo, la ciclación se puede conseguir usando ésteres activados. La presencia de sustituyentes que retiran electrones en el carbono alcoxi de ésteres aumenta su susceptibilidad a la aminólisis. La elevada reactividad de los ésteres de p-nitrofenol, los N-hidroxicompuestos y de los fenoles polihalogenados ha hecho que estos "ésteres activos" sean útiles de la síntesis de enlaces amino. En los últimos años, se ha asistido al desarrollo del hexafluorofosfonato de benzotriazoliloxi-tris-(dimetilamino)-fosfonio (BOP) y sus congéneres como reactivos de acoplamiento convenientes. Su rendimiento es, por lo general, superior al de otras reacciones de formación de enlaces de carbodiimida amida bien
establecidas.

En una forma de realización adicional, es posible formar un enlace tioéter entre la cadena lateral de un residuo que contiene tiol y un \alpha-aminoácido adecuadamente derivatizado. A modo de ejemplo, se puede acoplar una cadena lateral de lisina al ácido bromoacético a través del método de acoplamiento de carbodiimida (DCC, EDAC) y, a continuación, hacerla reaccionar con la cadena lateral de cualquiera de los residuos que contienen tiol, mencionados anteriormente, para formar un enlace tioéter. Con el fin de formar ditioéteres, se pueden hacer reaccionar dos cadenas laterales cualquiera que contengan tiol con dibromometano y diisopropilamina en DMF. A continuación, se muestran ejemplos de enlaces que contienen tiol:

\vskip1.000000\baselineskip

9

\vskip1.000000\baselineskip

10

\newpage

La ciclación se puede conseguir también usando \delta_{1},\delta_{1}-ditriptófano (es decir, Ac-Trp-Gly-Gly-Trp-OMe) (SEQ ID NO:39), tal como se muestra a continuación:

11

En la Figura 3 se ofrecen estructuras representativas de péptidos cíclicos. En la Figura 3, determinados péptidos cíclicos que tienen la capacidad para modular la adhesión celular (que se muestran a la izquierda), se acoplan con estructuras similares inactivas (a la derecha). Las estructuras y fórmulas mencionadas en la misma se ofrecen exclusivamente con fines de ilustración, y en ningún caso pretenden limitar el alcance de los péptidos cíclicos descritos en este documento.

Evaluación de la actividad de los péptidos cíclicos

Tal como se ha señalado anteriormente, los péptidos cíclicos como los descritos en este documento son capaces de modular (es decir, potenciar o inhibir) la adhesión celular mediada por cadherina. En general, la capacidad de un péptido para modular la adhesión celular se puede evaluar in vitro, analizando el efecto del péptido cíclico sobre uno o múltiples de los siguientes factores: (1) crecimiento axonal; (2) adhesión entre células endoteliales, (3) adhesión entre células epiteliales (por ejemplo, células renales normales de rata y/o de la piel humana), y/o (4) adhesión entre células cancerosas. A los efectos de estos ensayos, se evalúan por lo general péptidos que no están unidos a un material de soporte o a otro compuesto (tal como se describe más adelante). En general, se considera que un péptido cíclico es un modulador de la adhesión celular si, dentro de uno o múltiples de estos ensayos, el contacto de las células de ensayo con el péptido da como resultado una disrupción discernible de la adhesión celular.

En un ensayo representativo del crecimiento axonal, se pueden cultivar neuronas en una monocapa celular (por ejemplo, 3T3) que expresan N-cadherina. Las neuronas cultivadas sobre tales células (bajo las condiciones adecuadas y durante un período de tiempo suficiente) desarrollan axones de mayor longitud que las neuronas cultivadas sobre células que no expresan N-cadherina. Un péptido cíclico que module la adhesión celular mediada por cadherina puede inhibir este crecimiento axonal. Las condiciones apropiadas de crecimiento para neuronas cerebelares incluyen crecimiento durante aproximadamente 18 horas en medio SATO/SBF (suero bovino fetal) al 2%. Bajo tales condiciones, la presencia de 500 \mug/ml de péptido cíclico es suficiente para romper la adhesión celular entre neuronas, según se determina por un descenso de la longitud media del axón de al menos 50%, en relación con la longitud en ausencia del péptido cíclico, o en presencia de un péptido de control negativo.

En un ensayo representativo de adhesión celular, la adición de un péptido cíclico a células que expresan una cadherina tiene como resultado la disrupción de la adhesión celular. Una "célula que expresa cadherina", según se utiliza en este documento, puede ser cualquier tipo de célula que expresa al menos una cadherina en la superficie celular a un nivel detectable, utilizando técnicas convencionales tales como protocolos inmunoquímicos (Blaschuk y Farookhim, Dev. Biol. 136:564-567, 1989). Células que expresan cadherina incluyen células endoteliales (por ejemplo, células endoteliales de la arteria pulmonar bovina), células epiteliales y/o cancerosas (por ejemplo, la línea de células cancerosas del ovario humano SKOV3 (ATCC nº HTB-77)). Por ejemplo, estas células se pueden cultivar en placa bajo condiciones convencionales que permiten la adhesión celular, en presencia y en ausencia del péptido cíclico (por ejemplo, 500 \mug/ml). La disrupción de la adhesión celular se puede determinar visualmente en el plazo de 24 horas, observando la retracción de las células entre sí.

En otro ensayo de este tipo, es posible evaluar el efecto de un péptido cíclico sobre las células renales de rata normales (NRK-52E; ATCC nº 1571-CRL). En ausencia del péptido cíclico, las células NRK desarrollan monocapas estrechamente adherentes características, con morfología de empedrado, en las que las células exhiben un aspecto poligonal. Las células NRK tratadas con un péptido cíclico adoptan, típicamente, una morfología no poligonal y alargada (es decir, un aspecto similar al del fibroblasto) dentro de las 48 horas siguientes al tratamiento con 1 mg/ml de péptido. En los cultivos confluentes de estas células aparecen separaciones. Adicionalmente, 1 mg/ml de dicho péptido induce, de manera reproducible, una reducción rápidamente manifiesta de la tinción en la superficie celular de E-cadherina, según se evalúa por microscopia de inmunofluorescencia (Laird et al., J. Cell Biol. 131:1193-1203, 1995) de al menos 75% en 48 horas.

Un tercer ensayo de adhesión celular comprende evaluar el efecto de un péptido cíclico sobre la permeabilidad de capas de células epiteliales y/o endoteliales adherentes. Por ejemplo, se puede evaluar el efecto de la permeabilidad sobre la piel humana. La piel puede ser derivada de fuentes naturales o puede ser sintética. La piel de abdomen humano usada en estos ensayos puede obtenerse, por lo general, de autopsias dentro de las 24 horas siguientes a la muerte. En pocas palabras, pueden disolverse un péptido cíclico y una marca de ensayo (por ejemplo, las marcas fluorescentes Oregon Green® y Rhodamine Green®, Dextran) en un tampón estéril, y la capacidad de la marca para penetrar a través de la piel y en el líquido receptor puede ser medida usando un dispositivo Franz Cell (Franz, Curr. Prob. Dermatol. 7:58-68, 1978; Franz, J. Invest. Dermatol. 64:190-195, 1975). En general, un péptido cíclico que potencia la permeabilidad de la piel humana da como resultado un incremento estadísticamente significativo de la cantidad de marca en el compartimento receptor después de 6-48 horas, en presencia de 500 \mug/ml de péptido.

Modificación y formulaciones de péptidos cíclicos

Un péptido cíclico, de acuerdo con la presente descripción, puede, pero no necesita, estar unido a una o múltiples moléculas adicionales. Por ejemplo, dos o más péptidos cíclicos pueden unirse entre sí utilizando técnicas bien conocidas, como se discute más adelante. En ciertas formas de realización, los péptidos cíclicos unidos pueden contener secuencias HAV y pueden estar reunidos por un conector, que puede ser una secuencia peptídica y/o no peptídica. Preferentemente, el conector genera una distancia de separación entre los sitios de reconocimiento de 50-200\mu. Un conector que se puede utilizar con tales fines es H_{2}N(CH_{2})_{n}CO_{2}H, o derivados del mismo, en donde n se encuentra en el intervalo de 1-10. Para los expertos en la técnica resultarán evidentes otros conectores que se pueden utilizar. Los péptidos cíclicos unidos de este modo se pueden utilizar, por lo general, en métodos en los que se desea potenciar la adhesión celular mediada por cadherina.

De manera alternativa, un péptido cíclico según la presente descripción se puede unir a una molécula que comprende una secuencia de reconocimiento de adhesión celular para una molécula de adhesión diferente (incluidas, pero no limitadas a CAMs), separadas preferentemente por un conector. Tal como se usa en este documento, una "molécula de adhesión" es cualquier molécula que media la adhesión celular a través de un receptor en la superficie de la célula. Moléculas de adhesión incluyen proteínas de adhesión celular (tales como integrinas y miembros de la superfamilia génica de las inmunoglobulinas, tales como N-CAM, así como la proteína de la matriz extracelular), tales como laminina, fibronectina, colágenos, vitronectina y tenascina. Secuencias de reconocimiento de adhesión celular preferidas para unirse a un péptido cíclico incluyen Arg-Gly-Asp, que está fijada por integrinas, y Tyr-Ile-Gly-Ser-Arg (SEQ ID NO:47), que está fijada por lamininas. Los péptidos cíclicos unidos a estas moléculas (que pueden ser, asimismo, cíclicas) se pueden utilizar en métodos en los que resulta deseable romper la adhesión celular mediada por múltiples moléculas de adhesión.

Adicionalmente, tal como se analiza más adelante, para determinadas aplicaciones puede ser beneficioso unir uno o múltiples péptidos cíclicos a un gel o a un material de soporte sólido, tal como una matriz polímera (que puede estar formulada como una membrana o microestructura tal como una película ultrafina), una superficie contenedora (por ejemplo, la superficie de una placa de cultivo tisular o la superficie interior de un biorreactor), o una perla u otra partícula que se puede preparar a partir de una variedad de materiales, incluidos vidrio, plástico o cerámica. Para ciertas aplicaciones, se prefieren materiales de soporte biodegradables tales como celulosa y sus derivados, colágeno o cualquiera de una variedad de poliésteres (por ejemplo, los derivados de hidroxiácidos y/o lactonas), seda de araña o suturas (véase la Patente de EE.UU. Nº 5.245.012). Los métodos adecuados para unir un péptido cíclico a un material de soporte dependerán de la composición del soporte y del uso previsto, y resultarán evidentes para los expertos en la técnica. Por lo general, el enlace se consigue por asociación no covalente tal como adsorción o afinidad o, preferentemente, a través de un enlace covalente (que puede ser un enlace directo entre un péptido cíclico y grupos funcionales del soporte, o puede ser un enlace por medio de un agente de reticulación). El enlace de un péptido cíclico por adsorción puede alcanzarse por contacto, en un tampón apropiado, con un soporte sólido durante un período de tiempo adecuado. El tiempo de contacto varía con la temperatura, pero generalmente es de aproximadamente 5 segundos a 1 día y, típicamente, está comprendido entre aproximadamente 10 segundos y 1 hora.

El enlace covalente de un péptido cíclico a un soporte sólido se puede lograr, por lo general, haciendo reaccionar, en primer lugar, el soporte con un conector o un reactivo bifuncional que reaccione tanto con el soporte como con un grupo funcional, tal como un grupo hidroxilo o amino, en el péptido cíclico. Por ejemplo, se puede unir un péptido cíclico a un soporte o recubrimiento polímero apropiado usando benzoquinona, por condensación de un grupo aldehído sobre el soporte con una amina y un hidrógeno activo en el péptido cíclico, o por condensación de un grupo amino en el soporte con un ácido carboxílico en el péptido cíclico. Un método preferido para generar un enlace es a través de los grupos amino, utilizando glutaraldehído. Un péptido cíclico puede unirse a la celulosa a través de enlaces éster. De forma similar, los enlaces éster pueden ser adecuados para otros materiales de soporte tal como hemocianina del tipo "keyhole limpet".

Aun cuando los péptidos cíclicos según la presente descripción pueden unirse, preferentemente, a tejidos o células específicas y, de este modo, pueden ser suficientes para acceder a un sitio deseado in vivo, para determinadas aplicaciones puede resultar deseable incluir un agente de acceso adicional. En consecuencia, un agente de acceso puede estar unido también, o alternativamente, a un péptido cíclico para facilitar el acceso a uno o múltiples tejidos específicos. Tal como se usa en este documento, un "agente de acceso" ("targeting agent") puede ser cualquier sustancia (tal como un compuesto o una célula) que, cuando se une a un péptido, potencia el transporte del péptido a un tejido diana, aumentando, de esta forma, la concentración local del péptido cíclico. Los agentes de acceso incluyen anticuerpos o fragmentos de los mismos, receptores, ligandos y otras moléculas que se fijan a las células del, o próximas al tejido diana. Agentes de acceso conocidos incluyen hormonas, anticuerpos contra antígenos de la superficie celular, lectinas, moléculas de adhesión, ligandos que se fijan a la superficie de células tumorales, esteroides, colesterol, linfoquinas, enzimas fibrinolíticas y otros medicamentos y proteínas que se unen a un sitio diana deseado. Entre los numerosos anticuerpos monoclonales que pueden servir como agentes de acceso se encuentran los anti-TAC, u otros anticuerpos contra el receptor de interleuquina-2; 9.2.27 y NR-ML-05, reactivos con el proteoglicano de 250 kilodalton asociado al melanoma humano; y NR-LU-10, reactivo con una glicoproteína pancarcinoma. El anticuerpo usado en la presente invención puede ser una molécula intacta (completa), un fragmento de la misma, o un equivalente funcional de ella. Ejemplos de fragmentos de anticuerpos son los fragmentos F(ab')2, -Fab y F[v], que se pueden fabricar con métodos convencionales, o por ingeniería genética o de proteínas. El enlace se puede efectuar a través de cualquier enlace covalente, usando métodos estándares bien conocidos en la técnica. Este enlace es, generalmente, covalente y se puede lograr, por ejemplo, por condensación directa u otras reacciones, o mediante conectores bi- o multifuncionales.

Para ciertas formas de realización, puede ser beneficioso enlazar también, o alternativamente, un medicamento a un péptido cíclico. Tal como se usa en este documento, "medicamento" hace referencia a cualquier agente bioactivo previsto para ser administrado a un mamífero para prevenir o tratar una enfermedad u otro estado no deseado. Los medicamentos incluyen hormonas, factores de crecimiento, proteínas, péptidos y otros compuestos. Más adelante, se analiza el uso de determinados medicamentos específicos en el contexto de la presente invención.

En ciertos aspectos de la presente invención, uno o múltiples péptidos cíclicos, según la presente descripción, pueden estar presentes en una composición farmacéutica. Una composición farmacéutica comprende uno o múltiples péptidos cíclicos en combinación con uno o múltiples vehículos, diluyentes o excipientes farmacéutica o fisiológicamente aceptables. Tales composiciones pueden incluir tampones (por ejemplo, solución salina tamponada neutra o solución salina con tampón fosfato), hidratos de carbono (por ejemplo, glucosa, manosa, sacarosa o dextranos), manitol, proteínas, polipéptidos o aminoácidos tales como glicina, antioxidantes, agentes quelantes tales como EDTA o glutatión, coadyuvantes (por ejemplo, hidróxido de aluminio) y/o conservantes. Dentro de todavía otras formas de realización, las composiciones según la presente invención pueden estar formuladas en forma de liofilizados. Un péptido cíclico (solo o en combinación con un agente de acceso y/o medicamento) puede, pero no necesita estar encapsulado con liposomas, usando una tecnología bien conocida. Las composiciones de la presente invención pueden ser formuladas para cualquier forma apropiada de administración, incluida, por ejemplo, la administración tópica, oral, nasal, intravenosa, intracraneal, intraperitoneal, subcutánea o intramuscular. Para determinadas aplicaciones tópicas, se prefiere la formulación en forma de crema o loción, utilizando componentes bien conocidos.

Asimismo, una composición farmacéutica puede contener uno o múltiples medicamentos, que pueden estar unidos a un péptido cíclico o pueden estar libres dentro de la composición. Prácticamente, se puede administrar cualquier medicamento en combinación con un péptido cíclico según la presente descripción, para una variedad de propósitos, según se describe más adelante. Ejemplos de tipos de medicamentos que pueden ser administrados con un péptido cíclico incluyen analgésicos, anestésicos, antianginosos, antifúngicos, antibióticos, medicamentos anticancerosos (por ejemplo, taxol o mitomicina C), antiinflamatorios (por ejemplo, ibuprofeno e indometacina), antihelmínticos, antidepresivos, antídotos, antieméticos, antihistamínicos, antihipertensivos, productos contra la malaria, agentes anti-microtúbulos (por ejemplo, colchicina o alcaloides de vinca), agentes antimigrañosos, antimicrobianos, antipsicóticos, antipiréticos, antisépticos, agentes anti-señalización (por ejemplo, inhibidores de la protein quinasa C o inhibidores de la movilización intracelular de calcio), antiartríticos, agentes antitrombina, antituberculosos, antitusivos, antivirales, inhibidores del apetito, medicamentos cardioactivos, medicamentos contra dependencias químicas, catárticos, agentes quimioterapéuticos, vasodilatadores coronarios, cerebrales o periféricos, anticonceptivos, depresores, diuréticos, expectorantes, factores de crecimiento, agentes hormonales, hipnóticos, inmunosupresores, antagonistas de narcóticos, parasimpatomiméticos, sedantes, estimulantes, simpatomiméticos, toxinas (por ejemplo, toxina del cólera), tranquilizantes, y antiinfecciosos urinarios.

Para la obtención de imágenes, se puede incorporar cualquiera de una variedad de agentes diagnósticos en una composición farmacéutica, ya sea unido a un péptido cíclico o libre dentro de la composición. Agentes diagnósticos incluyen cualquier sustancia administrada para destacar una función fisiológica en el interior de un paciente, sin afectar simultáneamente, por lo general, a otras funciones fisiológicas. Los agentes diagnósticos incluyen metales, isótopos radiactivos y agentes radio-opacos (por ejemplo, galio, tecnecio, indio, estroncio, yodo, bario, bromo y compuestos que contienen fósforo), agentes radiolucentes, agentes de contraste, tinciones (por ejemplo, tinciones fluorescentes y cromóforos), y enzimas que catalizan una reacción colorimétrica o fluorométrica. En general, estos agentes se pueden unir usando diversas técnicas, según se ha descrito anteriormente, y pueden estar presentes en cualquier
orientación.

Las composiciones descritas en este documento se pueden administrar como parte de una formulación de liberación sostenida (es decir, una formulación tal como una cápsula o esponja que lleva a cabo una liberación lenta del péptido cíclico tras su administración). Estas formulaciones se pueden preparar, generalmente, usando una tecnología bien conocida, y se pueden administrar, por ejemplo, por vía oral, rectal o implante subcutáneo, o por implante en el sitio diana deseado. Las formulaciones de liberación sostenida pueden contener un péptido cíclico disperso en una matriz portadora y/o estar contenidos en un depósito rodeado por una membrana que controla la velocidad (véase, por ejemplo, la Solicitud de Patente Europea 710.491 A). Los vehículos utilizados con tales formulaciones son biocompatibles y pueden ser, también biodegradables; preferentemente, la formulación proporciona un nivel relativamente constante de liberación del péptido cíclico. La cantidad de péptido cíclico contenido en una formulación de liberación sostenida depende del sitio de implante, de la velocidad y de la duración esperada de liberación, así como de la naturaleza del trastorno que se debe tratar o prevenir.

Las composiciones farmacéuticas de la presente invención se pueden administrar de una manera apropiada para la enfermedad que se debe tratar (o prevenir). Las dosificaciones apropiadas y la duración y frecuencia de administración estarán determinadas por factores tales como el estado del paciente, el tipo y gravedad de la enfermedad del paciente, y del método de administración. En general, una dosificación y un régimen de tratamiento apropiados aporta el (los) péptidos cíclicos en cantidad suficiente para proporcionar un beneficios terapéutico y/o profiláctico. En formas de realización especialmente preferidas de la invención, se puede administrar un péptido cíclico o composición farmacéutica según la presente descripción, a una dosificación dentro del intervalo de 0,001 a 50 mg/kg de peso corporal, preferentemente de 0,1 a 20 mg/kg, en un régimen de dosis diarias única o múltiples. Para la administración tópica, una crema comprende, típicamente, una cantidad de péptido cíclico dentro del intervalo de 0,00001% a 1%, preferentemente 0,0001% a 0,002%. Las composiciones líquidas contienen, típicamente, alrededor de 10 ng/ml a 5 mg/ml, preferentemente desde alrededor de 10 \mug hasta 2 mg/ml de péptido cíclico. Las dosificaciones apropiadas pueden determinarse, por lo general, usando modelos experimentales y/o ensayos clínicos. En general, se prefiere utilizar la dosificación mínima que resulta suficiente para proporcionar una terapia eficaz. Por lo general, se puede monitorizar la eficacia terapéutica en los pacientes utilizando ensayos apropiados para el trastorno que se está tratando o previniendo, que resultarán familiares para los expertos en la técnica.

Métodos de uso de los péptidos cíclicos

En general, los péptidos cíclicos y las composiciones que se describen en este documento se pueden utilizar para modular la adhesión de células que expresan cadherina (es decir, células que expresan una o múltiples de E-cadherina, N-cadherina, P-cadherina, R-cadherina y/u otra(s) cadherina(s) que contiene(n) la secuencia HAV, incluidas cadherinas aún no descubiertas), in vitro y/o in vivo. En general, los métodos descritos en este documento presentan una ventaja con respecto a técnicas anteriores, en el sentido de que permiten el paso de moléculas de gran tamaño y/o cargadas a través de barreras de células que expresan cadherina. Tal como se analiza más detalladamente más adelante, los péptidos cíclicos según la presente descripción, se pueden utilizar también para romper o potenciar la adhesión celular en una variedad de otros contextos adicionales. Dentro de los métodos descritos en este documento, se puede administrar uno o múltiples péptidos cíclicos, solos o en una composición farmacéutica. En cada método específico descrito en este documento, tal como se ha señalado anteriormente, puede utilizarse un agente de acceso para aumentar la concentración local del péptido cíclico en el sitio diana.

En uno de tales aspectos, la presente invención proporciona péptidos para reducir una adhesión celular indeseada, mediante la administración de un péptido cíclico según esta descripción. La adhesión celular indeseada puede producirse entre células tumorales, entre células tumorales y células normales, o entre células normales, como resultado de una cirugía, lesión, quimioterapia, enfermedad, inflamación u otro trastorno que ponga en peligro la viabilidad o función celular. Péptidos cíclicos preferidos para ser utilizados en estos métodos incluyen N-Ac-CHAVC-NH_{2} (SEQ ID NO:8), N-Ac-CHAVSC-NH_{2} (SEQ ID NO:14), N-Ac-CAHAVDC-NH_{2} (SEQ ID NO:16), N-Ac-CSHAVSSC-NH_{2} (SEQ ID NO:18), y N-Ac-KHAVD-NH_{2} (SEQ ID NO:20). En general, se prefiere la administración tópica del (los) péptido(s) cíclico(s), pero también pueden emplearse otras vías. Preferentemente, una composición líquida para la administración tópica (que comprende, por ejemplo, solución salina fisiológica) comprende una cantidad de péptido cíclico según se ha descrito anteriormente y, más preferentemente, una cantidad en el intervalo de 10 \mug/ml y 1 mg/ml. Por lo general, se pueden formular cremas según se ha descrito anteriormente. La administración tópica en el campo quirúrgico se puede efectuar en una sola oportunidad, al final de la intervención, por irrigación de la herida, como una irrigación intermitente o continua con el uso de drenajes quirúrgicos en el postoperatorio, o utilizando drenajes insertados específicamente en la zona de la inflamación, lesión o enfermedad, en aquellos casos en que no se requiere llevar a cabo una operación quirúrgica. De manera alternativa, se puede emplear la administración parenteral o transcutánea para alcanzar resultados similares.

En un aspecto adicional, se proporcionan péptidos para potenciar el suministro de un medicamento a través de la piel de un mamífero. El suministro transdérmico de medicamentos representa un método conveniente y no invasivo que se puede utilizar para mantener niveles relativamente constantes en sangre de un medicamento. En general, para facilitar el suministro del medicamento a través de la piel, es necesario alterar la adhesión entre las células epiteliales (queratinocitos) y las células endoteliales de la red microvascular. Con el uso de técnicas disponibles en la actualidad, sólo es posible suministrar, in vivo, a través de la piel moléculas pequeñas y exentas de carga. Los métodos descritos en este documento no se encuentran sometidos al mismo grado de limitación. En consecuencia, resulta posible transportar una extensa variedad de medicamentos a través de las capas de células epiteliales y endoteliales de la piel, para la administración sistémica o tópica. Estos medicamentos se pueden suministrar a melanomas, o pueden penetrar en el torrente sanguíneo del mamífero para distribuirse a otros sitios del organismo.

Para potenciar el suministro de un medicamento a través de la piel, se hacen contactar un péptido cíclico, según la presente descripción, y un medicamento con la superficie cutánea. Péptidos cíclicos preferidos para ser usados en dichos métodos comprenden un grupo N-acetilo, según se ha descrito anteriormente, tal como N-Ac-CHAVC-NH_{2} (SEQ ID NO:8). El contacto se puede lograr por la aplicación directa del péptido cíclico, generalmente dentro de una composición formulada como crema o gel, o utilizando uno cualquiera de los diversos dispositivos de contacto cutáneo para la administración transdérmica (tales como los descritos en la Solicitud de Patente Europea Nº 566.816 A; patente de EE.UU. Nº 5.613.958; Patente de EE.UU. Nº 5.505.956). Un parche cutáneo representa un método conveniente de administración (en especial, para formulaciones de liberación lenta). Estos parches pueden contener un depósito de péptido cíclico y medicamento, separado de la piel por una membrana a través de la cual difunde el medicamento. En otros diseños de parches, el péptido cíclico y el medicamento pueden estar disueltos o suspendidos en un polímero o matriz adhesiva que, a continuación, se pone en contacto directo con la piel del paciente. El péptido cíclico y el medicamento pueden difundir, entonces, desde la matriz hacia la piel. El o los péptidos cíclicos y el o los medicamentos pueden estar contenidos en la misma composición o parche cutáneo, o se pueden administrar por separado, si bien se prefiere la administración simultánea y en el mismo sitio. En general, la cantidad de péptido cíclico administrado a través de la piel varía en función de la naturaleza del trastorno que se debe tratar o prevenir, pero puede variar de la forma anteriormente descrita. Estos niveles se pueden alcanzar mediante los ajustes apropiados del dispositivo utilizado, o aplicando una crema formulada del modo descrito más arriba. La transferencia del medicamento a través de la piel y hacia el tejido diana se puede predecir sobre la base de estudios in vitro, utilizando, por ejemplo, un aparato Franz Cell, y evaluarla in vivo por medios apropiados, que resultarán familiares para los expertos en la técnica. Por ejemplo, la monitorización del nivel en suero del medicamento administrado en el tiempo proporciona una medida conveniente de la transferencia del medicamento a través de la piel.

El suministro transdérmico de medicamentos, como se describe en este documento, resulta particularmente útil en situaciones en las que se desea mantener una velocidad constante de suministro de medicamento, para evitar la fluctuación de los niveles en sangre del mismo. Por ejemplo, la morfina es un analgésico que se utiliza con frecuencia inmediatamente después de una intervención quirúrgica. Cuando se la administra de manera intermitente en forma parenteral (intramuscular, intravenosa), el paciente se siente habitualmente somnoliento durante la primera hora, se encuentra bien durante las 2 horas siguientes, y experimenta dolor durante la última hora, porque el nivel en sangre sube rápidamente después de la inyección, y disminuye por debajo del nivel deseable antes de alcanzar el intervalo de 4 horas prescrito para la siguiente inyección. La administración transdérmica, según la presente descripción, permite el mantenimiento de niveles constantes durante períodos prolongados de tiempo (por ejemplo, días), lo que permite un control adecuado del dolor y, al mismo tiempo, conserva la alerta mental del paciente. La insulina ofrece otro ejemplo de este tipo. Muchos pacientes diabéticos necesitan mantener un nivel basal constante de insulina, que es diferente de sus necesidades a las horas de las comidas. El nivel basal se puede mantener usando una administración transdérmica de insulina, como se describe en este documento. También es posible administrar antibióticos a un ritmo constante, manteniendo niveles bactericidas adecuados en sangre, y evitando, simultáneamente, los niveles altos que son, a menudo, responsables de la toxicidad (por ejemplo, los niveles excesivamente altos de gentamicina provocan, generalmente, toxicidad renal).

El suministro de medicamentos por los métodos de la presente descripción ofrece, igualmente, un método más conveniente de administración de un medicamento. Por ejemplo, a menudo resulta especialmente difícil administrar medicamentos parenterales a recién nacidos y niños, debido a la dificultad asociada con la detección de venas de calibre adecuado para llevar a cabo el cateterismo. Sin embargo, los recién nacidos y los bebés tienen a menudo una gran superficie cutánea, en comparación con el adulto. El suministro transdérmico de medicamentos permite tratar a estos pacientes de forma más sencilla y hace posible que ciertos tipos de cuidados que, en la actualidad, sólo se puede llevar a cabo en el hospital, se realicen en casa. Otros pacientes que, típicamente, presentan dificultades similares con el cateterismo venoso son los que están sometidos a quimioterapia o bajo diálisis. Además, para los pacientes sometidos a tratamientos prolongados, la administración transdérmica, según la presente descripción, resulta más conveniente que la administración parenteral.

La administración transdérmica, según esta descripción, permite también evitar el tracto gastrointestinal en situaciones en las que el uso parenteral no resulta práctico. Existe, por ejemplo, una creciente necesidad de métodos adecuados para la administración de pequeños péptidos y proteínas terapéuticos, que son típicamente digeridos en el tracto gastrointestinal. Los métodos descritos en este documento permiten la administración de dichos compuestos y posibilitan una sencilla administración durante períodos prolongados de tiempo. Los pacientes que tienen problemas con la absorción a través de su tracto gastrointestinal debido a un íleo prolongado o enfermedades gastrointestinales específicas que limitan la absorción del medicamento pueden beneficiarse también de medicamentos formulados para aplicaciones transdérmicas como las que se describen en este documento.

Existen, adicionalmente, numerosas situaciones clínicas en las que resulta difícil mantener la cooperación (del paciente) ("compliance"). Por ejemplo, los pacientes con problemas mentales (por ejemplo, pacientes con la enfermedad de Alzheimer o psicosis) se pueden tratar de manera más sencilla si se garantiza un ritmo constante de suministro de un medicamento, sin tener que recurrir a su capacidad para recordar tomarlo a determinadas horas del día. Asimismo, resulta menos probable que los pacientes que simplemente olvidan tomar sus medicamentos de la forma prescrita lo hagan si sólo deben ponerse periódicamente un parche (por ejemplo, cada 3 días). Los pacientes con enfermedades que no presentan síntomas, tales como la hipertensión, tienen un riesgo especial de olvidar la toma de sus medicamentos de la forma prescrita.

Para pacientes que deben tomar múltiples medicamentos, se pueden formular dispositivos para la administración transdérmica, tales como parches cutáneos, con combinaciones de medicamentos que, con frecuencia, se utilizan conjuntamente. Por ejemplo, muchos pacientes con insuficiencia cardíaca reciben digoxina en combinación con furosemida. La combinación de ambos medicamentos en un solo parche cutáneo facilita la administración, reduce el riesgo de errores (para los ancianos resulta, a menudo, complicado tomar las pastillas correctas a las horas indicadas), reduce la presión psicológica de tener que" tomar tantas pastillas", reduce la omisión de tomas debido a actividades irregulares, y mejora la cooperación del paciente.

Los métodos descritos en este documento son especialmente aplicables al ser humano, si bien también tienen diversas aplicaciones en veterinaria, tales como la administración de factores de crecimiento u hormonas (por ejemplo, para el control de la fertilidad) a un animal.

Tal como se señalado anteriormente, de acuerdo con los métodos ofrecidos en este documento es posible administrar una extensa variedad de medicamentos. Algunos ejemplos de categorías de medicamentos que se pueden administrar por vía transdérmica incluyen fármacos antiinflamatorios (por ejemplo, en artritis y otras afecciones) tales como AINEs, indometacina, prednisona, etc.; analgésicos (en especial, cuando no es posible la absorción oral tal como tras una cirugía, y cuando la administración parenteral no resulta conveniente o deseable), incluidas morfina, codeína, petidina, acetaminofen y combinaciones de éstos (por ejemplo, codeína más acetaminofen); antibióticos tales como vancomicina (que no se absorbe por vía GI y se administra a menudo por vía intravenosa), o una combinación de INH y rifampicina (por ejemplo, para la tuberculosis); anticoagulantes tales como heparina (que no se absorbe bien en el tracto GI y se administra generalmente por vía parenteral, dando lugar a fluctuaciones de los niveles en sangre, con un incremento del riesgo de hemorragias a niveles altos, y riesgos de ineficacia a niveles bajos), y warfarina (que se absorbe en el tracto GI, pero no se puede administrar inmediatamente después de una intervención abdominal, debido al íleo normal que sigue al procedimiento); antidepresivos (por ejemplo, en situaciones en que la cooperación es problemática como en la enfermedad de Alzheimer, o cuando el mantenimiento de niveles estables en sangre da como resultado una reducción importante de los efectos secundarios anticolinérgicos, y una mejor tolerancia por parte de los pacientes), tales como amitriptilina, imipramina, prozac, etc.; antihipertensivos (por ejemplo, para mejorar la cooperación y reducir los efectos secundarios asociados con niveles en sangre fluctuantes), tales como diuréticos y beta-bloqueadores (que se pueden administrar en el mismo parche; por ejemplo, furosemida y propranolol); antipsicóticos (por ejemplo, para facilitar la cooperación y simplificar que los cuidadores y familiares se aseguren de que el enfermo toma el medicamento), tales como haloperidol y clorpromazina; y ansiolíticos o sedantes (por ejemplo, para evitar el descenso del estado de alerta relacionado con niveles elevados en sangre tras la administración oral, y permitir que el paciente reciba un beneficio continuo durante todo el día al mantener constantes los niveles terapéuticos).

Otros muchos medicamentos pueden ser administrados de la forma descrita en este documento, incluidas hormonas de, factores de crecimiento, proteínas y péptidos origen natural y sintético. Por ejemplo, insulina y la hormona del crecimiento humano, factores de crecimiento tales como eritropoyetina, interleuquinas e interferones pueden ser suministradas a través de la piel.

La presente invención proporciona, asimismo, kits para administrar un medicamento a través de la piel de un mamífero. Estos kits comprenden, por lo general, un dispositivo para la aplicación transdérmica (es decir, un parche cutáneo) en combinación con, o impregnado en uno o múltiples péptidos cíclicos. Adicionalmente, se puede incluir un medicamento en tales kits.

En una forma de realización relacionada, el uso de péptidos cíclicos tales como los descritos en este documento para aumentar la permeabilidad cutánea, puede facilitar también la toma de muestras del compartimento sanguíneo por difusión pasiva, permitiendo la detección y/o la medición de los niveles de moléculas específicas que circulan en la sangre. Por ejemplo, la aplicación de uno o múltiples péptidos cíclicos a la piel, a través de un parche cutáneo según la presente descripción, permite que el parche actúe como una esponja para acumular una pequeña cantidad de líquido que contiene una muestra representativa del suero. A continuación, se retira el parche después de un período de tiempo determinado, y por técnicas apropiadas se analiza el compuesto de interés (por ejemplo, una medicación, hormona, factor de crecimiento, metabolito o marca). De forma alternativa, se puede impregnar un parche con reactivos que permiten el cambio de color si se detecta una sustancia específica (por ejemplo, una enzima). Sustancias que pueden ser detectadas de esta forma incluyen, pero sin estar limitadas a ellas, drogas ilegales tales como cocaína, enzimas VIH, glucosa y PSA. Esta tecnología es especialmente beneficiosa para kits de ensayos domésticos.

En un aspecto adicional, se proporcionan péptidos para potenciar el suministro de un medicamento a un tumor en un mamífero, a través de la administración de un péptido cíclico en combinación con un medicamento, a un mamífero portador de un tumor. Péptidos cíclicos para utilizar en estos métodos incluyen los designados para romper la adhesión celular mediada por E-cadherina y/o N-cadherina, e incluyen N-Ac-CHAVC-NH_{2} (SEQ ID NO:8), N-Ac-CHAVSC-NH_{2} (SEQ ID NO:14), N-Ac-CAHAVDC-NH_{2} (SEQ ID NO:16), N-Ac-CSHAVSSC-NH_{2} (SEQ ID NO:18), y N-Ac-KHAVD-NH_{2} (SEQ ID NO:20). Preferentemente, el péptido cíclico y el medicamento están formulados en la misma composición o dispositivo de suministro de medicamentos antes de la administración. En general, un péptido cíclico puede potenciar el suministro de un medicamento a cualquier tumor, y el método de administración se puede seleccionar sobre la base del tipo de tumor diana. Por ejemplo, puede ser preferible la inyección o la administración tópica, según las descripciones anteriores, para melanomas y otros tumores accesibles (por ejemplo, las metástasis de tumores primarios de ovario se pueden tratar lavando la cavidad peritoneal con la composición). Otros tumores (por ejemplo, tumores de vejiga) pueden ser tratados por inyección del péptido cíclico y el medicamento (tal como mitomicina C) en el lugar del tumor. En otros casos, la composición se puede administrar de forma sistémica, y dirigirla hacia el tumor usando uno cualquiera de una variedad de agentes de acceso específicos. Los expertos en la técnica podrán identificar medicamentos adecuados, basándose en el tipo de cáncer que se debe tratar (por ejemplo, mitomicina C para el cáncer de vejiga). En general, la cantidad de péptido cíclico administrado varía en función del método de administración y la naturaleza del tumor, dentro de los intervalos indicados más arriba, preferentemente dentro del intervalo de aproximadamente 1 \mug/ml hasta aproximadamente 2 mg/ml y, de forma más preferida, desde aproximadamente 10 \mug/ml a 100 \mug/ml. La transferencia del medicamento al tumor diana se puede evaluar por medios apropiados, que resultarán evidentes para el experto en la técnica, tales como la reducción de tamaño del tumor. Los medicamentos pueden estar también marcados (por ejemplo, usando radionúclidos) para permitir la observación directa de la transferencia al tumor diana, utilizando técnicas convencionales de obtención de
imágenes.

Dentro de un aspecto relacionado, la presente invención proporciona péptidos para tratar el cáncer y/o inhibir metástasis en un mamífero. Los tumores cancerosos son masas sólidas de células, que crecen sin control, que requieren de nutrición a través de vasos sanguíneos. La formación de nuevos capilares es un requisito previo para el crecimiento tumoral y la aparición de metástasis. La administración de péptidos cíclicos, según la descripción anterior, puede romper el crecimiento de estos vasos sanguíneos, aportando de esta forma una terapia eficaz para el cáncer y/o inhibir las metástasis. Los péptidos cíclicos se pueden utilizar también para tratar leucemias. Péptidos cíclicos preferidos para ser usados en estos métodos incluyen los que rompen la adhesión celular mediada por N-cadherina, tales como N-Ac-CHAVC-NH_{2} (SEQ ID NO:8), N-Ac-CHAVSC-NH_{2} (SEQ ID NO:14), N-Ac-CAHAVDC-NH_{2} (SEQ ID NO:16), N-Ac-CSHAVSSC-NH_{2} (SEQ ID NO:18), y N-Ac-KHAVD-NH_{2} (SEQ ID NO:20). Se puede administrar un péptido cíclico solo (por ejemplo, a través de la piel), o en una composición farmacéutica. Para los melanomas y determinados tumores accesibles adicionales, puede ser preferible la inyección o la administración tópica, según la descripción anterior. En el cáncer de ovario, el lavado de la cavidad peritoneal con una composición que comprende uno o múltiples péptidos cíclicos, puede prevenir las metástasis de células tumorales del ovario. Otros tumores (por ejemplo, tumores de vejiga, bronquiales o traqueales) se pueden tratar por inyección del péptido cíclico en la cavidad. En otros casos, la composición se puede administrar de forma sistémica, dirigiéndola hacia el tumor mediante una variedad de agentes de acceso, tal como se ha descrito más arriba. En general, la cantidad de péptido cíclico administrado varía en función del método de administración y de la naturaleza del cáncer, pero puede hacerlo dentro de los intervalos anteriormente identificados. La eficacia del tratamiento del cáncer o de la inhibición de metástasis se puede evaluar usando observaciones clínicas bien conocidas tales como el nivel de marcadores séricos (por ejemplo, CEA o PSA).

En un aspecto relacionado adicional, se puede utilizar un péptido cíclico para inhibir la angiogénesis (es decir, el crecimiento de vasos sanguíneos a partir de vasos sanguíneos preexistentes) en un mamífero. En general, la inhibición de la angiogénesis puede ser beneficiosa en pacientes afectados por enfermedades tales como cáncer o artritis. Péptidos cíclicos preferidos para la inhibición de la angiogénesis incluyen N-Ac-CHAVC-NH_{2} (SEQ ID NO:8) y N-Ac-CHAVSC-NH_{2} (SEQ ID NO:14). El efecto de un determinado péptido cíclico sobre la angiogénesis se puede determinar, en general, evaluando el efecto del péptido sobre la formación de vasos sanguíneos. En general, esta determinación se puede llevar a cabo usando, por ejemplo, un ensayo de membrana corioalantoica de pollo (Iruela-Arispe et al., Molecular Biology of the Cell 6:327-343, 1995). En pocas palabras, se puede incluir un péptido cíclico en una malla compuesta por vitrógeno a una o múltiples concentraciones (por ejemplo, en el intervalo de aproximadamente 1 a 100 \mug/malla). La o las mallas se pueden aplicar, seguidamente, a membranas corioalantoicas de pollo. Después de 24 horas, se puede determinar el efecto del péptido usando un análisis morfométrico computadorizado. Un péptido cíclico deberá inhibir la angiogénesis en al menos 25% a una concentración de 33 \mug/malla.

La adición de un agente de acceso puede resultar beneficiosa, especialmente cuando la administración es sistémica. Las formas de administración adecuadas y la dosificación dependen del trastorno que se debe prevenir o tratar, pero, en general, la administración por inyección es apropiada. Las dosificaciones pueden estar dentro de los intervalos descritos anteriormente. La eficacia de la inhibición se puede evaluar grosso modo valorando la incapacidad del tumor para mantener el crecimiento y, por microscopia, por una ausencia de nervios en la periferia del tumor.

En todavía otro aspecto relacionado, la presente invención proporciona péptidos para inducir la apoptosis en una célula que expresa cadherina. En general, los pacientes afectos por cáncer pueden beneficiarse de este tratamiento. Péptidos cíclicos preferidos para ser utilizados en estos métodos incluyen N-Ac-CHAVC-NH_{2} (SEQ ID NO:8), N-Ac-CHAVSC-NH_{2} (SEQ ID NO:14), N-Ac-CAHAVDC-NH_{2} (SEQ ID NO:16), N-Ac-CSHAVSSC-NH_{2} (SEQ ID NO:18), y N-Ac-KHAVD-NH_{2} (SEQ ID NO:20). Se prefieren también los péptidos cíclicos unidos a una molécula que comprende un sitio de unión para una segunda molécula de adhesión (tal como Arg-Gly-Asp) a través de un conector. La administración puede ser tópica, por inyección o por otro medio, y la adición de un agente de acceso puede ser beneficiosa, especialmente cuando la administración es sistémica. Los modos de administración y las dosificaciones adecuadas dependen de la localización y naturaleza de las células cuya apoptosis se desea, pero, en general, las dosificaciones pueden variar dentro del intervalo descrito anteriormente. Se puede llevar a cabo una biopsia para evaluar el nivel de inducción de apoptosis.

La presente invención proporciona también péptidos para potenciar el suministro de un medicamento al sistema nervioso central de un mamífero. La barrera hemoencefálica es básicamente impermeable a la mayor parte de agentes neuroactivos, y el suministro de medicamentos al cerebro de un mamífero requiere, a menudo, procedimientos invasivos. Con el uso de un péptido cíclico según la presente descripción, sin embargo, el suministro se puede llevar a efecto, por ejemplo, por la administración sistémica de una combinación de péptido cíclico-medicamento-agente de acceso, la inyección de un péptido cíclico (solo o combinado con un medicamento y/o un agente de acceso) en la arteria carótida, o la aplicación de un parche cutáneo que comprende un péptido cíclico en la cabeza del paciente. Ciertos péptidos cíclicos preferidos para ser utilizados con tales métodos son relativamente pequeños (por ejemplo, un tamaño de anillo de 4-10 residuos; preferentemente, 5-7 residuos), e incluyen péptidos que comprenden un anillo de 5 residuos tales como N-Ac-CHAVC-NH_{2} (SEQ ID NO:8) y N-Ac-KHAVD-NH_{2} (SEQ ID NO:20). En general, la cantidad de péptido cíclico administrado varía en función del método de administración y de la naturaleza del trastorno que se debe tratar o prevenir, pero varía típicamente dentro del intervalo descrito más arriba. La transferencia del medicamento al sistema nervioso central se puede evaluar por medios adecuados, que resultarán evidentes para el experto en la técnica, tales como imágenes generadas por resonancia magnética (MRI) o escáner PET (tomografía de emisión de protones).

En aspectos todavía adicionales, la presente invención proporciona péptidos para potenciar la adhesión de células que expresan cadherina. En estas formas de realización, un péptido cíclico se encuentra generalmente unido a un soporte sólido, tal como se ha descrito anteriormente. La matriz resultante, que comprende múltiples péptidos cíclicos unidos, puede ser usada como un "adhesivo biológico" para unir múltiples células que expresan cadherina en una diversidad de contextos.

En una forma de realización, los péptidos cíclicos unidos a una matriz se pueden utilizar para potenciar la cicatrización de heridas y/o reducir el tejido cicatricial en un mamífero. Péptidos cíclicos preferidos para ser utilizados en estos métodos incluyen N-Ac-CHAVC-NH_{2} (SEQ ID NO:8) y N-Ac-KHAVD-NH_{2} (SEQ ID NO:20), siendo especialmente preferidos los péptidos cíclicos que están unidos a una matriz biocompatible y biodegradable tal como celulosa o colágeno. Para utilizar en estos métodos, un péptido cíclico deberá tener un grupo amino o hidroxilo libre. Los péptidos se administran, por lo general, por vía tópica a la herida, en donde pueden facilitar el cierre de la misma y aumentar la acción, o incluso sustituir a los puntos de sutura. De manera similar, la administración de péptidos cíclicos unidos a una matriz puede facilitar la adhesión celular en injertos cutáneos e implantes protésicos, pudiendo prolongar la duración y utilidad de la inyección de colágeno. En general, la cantidad de péptidos cíclicos unidos a una matriz que se administran a una herida, injerto o sitio de implante varía con su gravedad y/o la naturaleza de la herida, injerto o implante, pero puede estar dentro del intervalo citado anteriormente.

En una forma de realización adicional, uno o múltiples péptidos cíclicos pueden estar unidos a la superficie interior de una placa de cultivo de tejidos u otro soporte de cultivo celular, tal como para ser usado en un biorreactor. Esta unión se puede llevar a cabo por cualquier técnica adecuada, tal como se ha descrito anteriormente. Los péptidos cíclicos unidos de esta forma se pueden usar, en general, para inmovilizar células que expresan cadherina. Por ejemplo, se pueden utilizar placas recubiertas con uno o múltiples péptidos cíclicos para inmovilizar células que expresan cadherina en una variedad de ensayos y pruebas de rastreo. Dentro de biorreactores (es decir, sistemas para la producción a mayor escala de células u organoides), se pueden usar péptidos cíclicos, en general, para mejorar la fijación celular y estabilizar el crecimiento celular. Se pueden utilizar también péptidos cíclicos dentro de biorreactores para contribuir a la formación y función de organoides altamente diferenciados derivados, por ejemplo, de poblaciones dispersas de células fetales de mamífero. También se pueden usar biorreactores que contienen biomatrices de péptidos cíclicos para facilitar la producción de proteínas específicas.

Los péptidos cíclicos según la presente descripción se pueden utilizar con una diversidad de configuraciones de biorreactores. En general, un biorreactor se diseña con un área de superficie interior suficiente para servir como soporte a un número elevado de células adherentes. Esta superficie se puede proporcionar usando membranas, tubos, pocillos de microtitulación, columnas, fibras huecas, frascos rotatorios, placas, bandejas, perlas o una combinación de estos elementos. Un biorreactor puede estar dividido en compartimentos. El material de soporte dentro de un biorreactor puede ser cualquier material apropiado conocido en la técnica; preferentemente, el material de soporte no se disuelve ni se hincha en agua. Materiales de soporte preferidos incluyen, pero no están limitados a ellos, polímeros sintéticos tales como acrílicos, vinilos, polietileno, polipropileno, politetrafluoroetileno, nailon, poliuretanos, poliamidas, polisulfonas y poli(tereftalatos de etileno); cerámicas; vidrio y sílice.

Dentro de otros aspectos adicionales de la presente invención, los péptidos cíclicos se pueden utilizar para potenciar y/o dirigir el crecimiento neurológico. En un aspecto, el crecimiento axonal se puede potenciar y/o dirigir haciendo contactar una neurona con uno o múltiples péptidos cíclicos. Los péptidos cíclicos preferidos para ser utilizados en estos métodos están unidos a una matriz polímera u otro soporte, e incluyen los péptidos que carecen sustancialmente de secuencias de flanqueo, tal como se ha descrito anteriormente. En formas de realización especialmente preferidas, el péptido cíclico es N-Ac-CHAVC-NH_{2} (SEQ ID NO:8), o N-Ac-KHAVD-NH_{2} (SEQ ID NO:20). En otras formas de realización preferidas, un péptido cíclico está unido a una molécula que comprende una secuencia de reconocimiento celular de integrina (Arg-Gly-Asp), tal como se ha descrito más arriba. El método de lograr el contacto y la cantidad de péptido cíclico usado dependerán de la localización de la neurona y del grado y naturaleza del crecimiento deseado. Por ejemplo, una neurona se puede poner en contacto (por ejemplo, por implantación) con péptido(s) cíclico(s) unido(s)
a un material de soporte, tal como una sutura, una guía de fibra nerviosa u otro dispositivo protésico, de modo que el crecimiento axonal se dirige a lo largo del material de soporte. De manera alternativa, se puede emplear una guía de fibra nerviosa, en la cual la luz de dicha guía contiene una composición que comprende el o los péptidos cíclicos. In vivo, estas guías nerviosas u otros péptidos cíclicos soportados de alguna otra forma pueden ser implantados usando técnicas bien conocidas para, por ejemplo, facilitar el crecimiento de conexiones neuronales seccionadas y/o tratar lesiones de la médula espinal. Para el experto en la técnica resultará evidente que la estructura y composición del soporte deben ser las apropiadas para la lesión particular que se debe tratar. In vitro, puede utilizarse, de manera similar, una matriz polímera para dirigir el crecimiento de neuronas sobre superficies adecuadamente diseñadas, tal como se describe, por ejemplo, en la Patente de EE.UU. Nº 5.510.628.

Dentro de otro más de estos aspectos, puede usarse uno o múltiples péptidos cíclicos en la terapia de una enfermedad neurológica desmielinizante en un mamífero. Se ha encontrado, en el contexto de la presente invención, que la migración de células de Schwann sobre los astrocitos resulta inhibida por N-cadherina. En una serie de enfermedades neurológicas, tal como la esclerosis múltiple, se produce la muerte de los oligodendrocitos. En teoría, se podrían utilizar células de Schwann del sistema nervioso periférico para sustituir los oligodendrocitos dañados del SNC. Sin embargo, intentos previos de llevar a cabo esta sustitución han fracasado, porque las células de Schwann implantadas en el cerebro no han migrado sobre astrocitos o remielinizado las neuronas afectadas. Los péptidos cíclicos tales como los descritos en este documento, cuando son inyectados con células de Schwann en el cerebro, pueden facilitar la migración de las células de Schwann y permitir la práctica de esta terapia.

Los pacientes con esclerosis múltiple adecuados para el tratamiento pueden ser identificados por criterios que establecen un diagnóstico de EM clínicamente definitivo o clínicamente probable (véase Poser et al., Ann. Neurol. 13:227, 1983). Los pacientes candidatos para la terapia profiláctica se pueden identificar por la presencia de factores genéticos tales como los alelos HLA-DR2a y DR2b, o por la presencia de signos precoces de la enfermedad de tipo remitente recidivante.

Los injertos de células de Schwann se pueden implantar directamente en el cerebro, junto con el o los péptidos cíclicos, usando técnicas convencionales. Los péptidos cíclicos preferidos para ser usados en estos métodos incluyen N-Ac-CHAVC-NH_{2} (SEQ ID NO:8), y N-Ac-KHAVD-NH_{2} (SEQ ID NO:20). Las cantidades adecuadas de péptido cíclico se encuentran, por lo general, en el intervalo descrito anteriormente, preferentemente desde aproximadamente 10 \mug/ml hasta aproximadamente 1 mg/ml.

De manera alternativa, se puede administrar un péptido cíclico solo o en una composición farmacéutica. La duración y frecuencia de administración estarán determinadas por factores tales como el estado del paciente y el tipo y gravedad de la enfermedad del paciente. En formas de realización especialmente preferidas de la invención, el péptido cíclico o la composición farmacéutica se puede administrar en una dosificación en el intervalo de 0,1 mg/kg hasta 20 mg/kg, si bien las dosificaciones apropiadas se pueden determinar mediante ensayos clínicos. Los métodos de administración incluyen inyección, por vía intravenosa o intratecal (es decir, directamente en el líquido cefalorraquídeo).

El tratamiento eficaz de la esclerosis múltiple se puede poner de manifiesto por cualquiera de los siguientes criterios: EDSS (siglas en inglés de Escala Extendida de Estado de Incapacidad), aparición de exacerbaciones o MRI (imágenes obtenidas por resonancia magnética). La EDSS es un medio de clasificar la alteración clínica debida a EM (Kurtzke, Neurology 33:1444, 1983), y el descenso de una etapa completa define un tratamiento eficaz en el contexto de la presente invención (Kurtzke, Ann. Neurol. 36:573-79, 1994). Las exacerbaciones se definen como la aparición de un nuevo síntoma atribuible a EM, y que va acompañado por una nueva anomalía neurológica apropiada (Sipe et al., Neurology 34:1368, 1984). Se considera que una terapia es eficaz si se produce una diferencia estadísticamente significativa en la tasa o proporción de pacientes libres de exacerbaciones entre el grupo tratado y el grupo de placebo, o una diferencia estadísticamente significativa en el tiempo transcurrido hasta la primera exacerbación o la duración y gravedad en el grupo tratado, en comparación con el grupo de control. Se puede usar MRI para medir las lesiones activas usando la obtención de imágenes reforzada por gadolinio-DTPA (McDonald et al., Ann. Neurol. 36:14, 1994), o la localización y grado de las lesiones usando técnicas T_{2} ponderadas. Los radiólogos pueden determinar la presencia, localización y extensión de las lesiones EM usando técnicas convencionales. La mejoría debida a terapia se establece cuando se produce una mejoría estadísticamente significativa en un paciente individual, en comparación con el nivel basal o, en un grupo tratado, frente a un grupo de placebo.

La eficacia del péptido cíclico en el contexto de la prevención se puede evaluar sobre la base de mediciones clínicas tales como tasa de recidiva y EDSS. Otros criterios incluyen una variación del área y volumen de las imágenes T2 en MRI, y el número y volumen de lesiones determinadas por imágenes potenciadas por gadolinio.

En otro aspecto, los procedimientos según la presente descripción se pueden utilizar para modular el sistema inmune de un mamífero en cualquiera de múltiples formas. Las cadherinas se expresan en células B y T (timocitos y pre-células B de la médula ósea) inmaduras, así como en subconjuntos específicos de linfocitos B y T activados, y en algunos tumores malignos hematológicos (véanse Lee et al., Immunol. 152:5653-5659, 1994; Munro et al., Cellular Immunol. 169:309-312, 1996; Tsutsui et al., Biochem. 120:1034-1039, 1996; Cepek et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93:6567-6571, 1996). En general, los péptidos cíclicos se pueden utilizar para modular etapas específicas de las interacciones celulares durante una respuesta inmune o durante la diseminación de linfocitos malignos.

Por ejemplo, se puede utilizar un péptido cíclico según la descripción de este documento para tratar enfermedades asociadas con una generación excesiva de células T que, por lo demás, son normales. Sin pretender atenerse a ninguna teoría, se cree que la interacción de cadherinas sobre células T y subconjuntos de células B en proceso de maduración contribuye a la protección de estas células contra la muerte celular programada. Un péptido cíclico puede reducir dichas interacciones, dando lugar a la inducción de la muerte celular programada. En consecuencia, se pueden utilizar péptidos cíclicos para tratar ciertos tipos de diabetes y artritis reumatoide, en especial en niños pequeños, en los que la expresión de cadherinas en pre-células T tímicas es máxima.

Asimismo, es posible administrar péptidos cíclicos a pacientes afectos de ciertos trastornos cutáneos (tales como linfomas cutáneos), leucemia aguda de células B, y reacciones inmunes excesivas que implican al sistema inmune humoral y la generación de inmunoglobulinas, tales como respuestas alérgicas y el rechazo de injertos mediado por anticuerpos. Adicionalmente, los pacientes con células malignas circulantes, positivas para cadherina (por ejemplo, durante regímenes en los que la quimioterapia o la radioterapia está eliminando una parte importante de las células malignas de la médula ósea y otros tejidos linfoides) pueden beneficiarse del tratamiento con un péptido cíclico. Un tratamiento de este tipo puede ser beneficioso, también, en pacientes sometidos a trasplante de células madre de sangre periférica.

Péptidos cíclicos preferidos para ser utilizados en tales métodos incluyen aquellos que rompen la adhesión celular mediada por E-cadherina y/o N-cadherina, tales como N-Ac-CHAVC-NH_{2} (SEQ ID NO:8), N-Ac-CHAVSC-NH_{2} (SEQ ID NO:14), N-Ac-CSHAVSSC-NH_{2} (SEQ ID NO:18), y N-Ac-KHAVD-NH_{2} (SEQ ID NO:20). Dentro de los métodos mencionados anteriormente, el o los péptidos cíclicos se administran, preferentemente, de forma sistémica (habitualmente, por inyección) o tópica. Un péptido cíclico puede estar unido a un agente de acceso. Por ejemplo, el acceso a la médula ósea puede ser beneficioso. Una dosificación adecuada es suficiente para provocar una reducción estadísticamente significativa de la población de células B y/o T que expresan cadherina, y/o una mejoría de las manifestaciones clínicas de la enfermedad bajo tratamiento. Las dosificaciones típicas se encuentran dentro de los intervalos descritos más arriba.

En aspectos adicionales, la presente invención proporciona péptidos y kits para la prevención del embarazo en un mamífero. En general, la disrupción de la función de la E-cadherina previene la adhesión de trofoblastos y su subsiguiente fusión para formar sincitio-trofoblastos. En una forma de realización, uno o múltiples péptidos cíclicos, según la presente descripción, pueden ser incorporados en diversos dispositivos anticonceptivos bien conocidos, tales como esponjas aptas para la inserción intravaginal (véase, por ejemplo, la Patente de EE.UU. Nº 5.417.224), o cápsulas de implantación subcutánea. Sin embargo, son posibles otras formas de administración, incluida la transdérmica, para péptidos cíclicos unidos a un agente de acceso apropiado. Péptidos cíclicos preferidos para ser utilizados en tales métodos incluyen N-Ac-CHAVC-NH_{2} (SEQ ID NO:8), N-Ac-CHAVSC-NH_{2} (SEQ ID NO:14), N-Ac-CSHAVSSC-NH_{2} (SEQ ID NO:18), y N-Ac-KHAVD-NH_{2} (SEQ ID NO:20). Los métodos adecuados para la incorporación en dichos dispositivos dependen del tipo de dispositivo, y son bien conocidos en la técnica. Estos dispositivos facilitan la administración del o de los péptidos cíclicos a la región uterina y pueden proporcionar una liberación sostenida del o de los péptidos cíclicos. En general, el o los péptidos cíclicos pueden ser administrados, a través de dichos dispositivos anticonceptivos, en una dosificación en el intervalo de 0,1 a 20 mg/kg, aunque las dosificaciones apropiadas se pueden determinar por la monitorización de los niveles de hCG en orina. La hCG es producida por la placenta, y los niveles de esta hormona aumentan en la orina de la mujer gestante. Los niveles urinarios de hCG se pueden evaluar por radio-inmunoensayos usando técnicas bien conocidas. Los kits para la prevención de la gestación comprenden, por lo general, un dispositivo anticonceptivo impregnado con uno o múltiples péptidos cíclicos.

De manera alternativa, se puede implantar una formulación de liberación sostenida de uno o múltiples péptidos cíclicos, típicamente por vía subcutánea, en un mamífero para prevenir la gestación. Este implante se puede llevar a cabo usando técnicas bien conocidas. Preferentemente, la formulación implantada proporciona una dosificación como la descrita más arriba, aun cuando los expertos en la técnica pueden determinar la dosificación eficaz mínima usando, por ejemplo, una evaluación de los niveles de hCG en la orina de la mujer.

La presente invención proporciona, igualmente, péptidos para aumentar la permeabilidad vascular en un mamífero, mediante la administración de uno o múltiples péptidos cíclicos o composiciones farmacéuticas. En el interior de los vasos sanguíneos, la adhesión de las células endoteliales (mediada por N-cadherina) tiene como consecuencia una permeabilidad vascular disminuida. En consecuencia, se pueden utilizar péptidos cíclicos según la presente descripción para aumentar la permeabilidad vascular. En ciertas formas de realización, los péptidos cíclicos preferidos para ser utilizados con tales métodos incluyen péptidos capaces de reducir la adhesión de células tanto endoteliales como tumorales. Estos péptidos se pueden usar para facilitar la penetración de agentes terapéuticos o diagnósticos antitumorales (por ejemplo, anticuerpos monoclonales) a través de las barreras a la permeabilidad de células endoteliales y barreras tumorales. Péptidos especialmente preferidos incluyen N-Ac-CHAVC-NH_{2} (SEQ ID NO:8) y N-Ac-KHAVD-NH_{2} (SEQ ID NO:20).

El tratamiento con un péptido cíclico puede ser apropiado, por ejemplo, antes de la administración de un agente terapéutico o diagnóstico antitumoral (por ejemplo, un anticuerpo monoclonal u otra macromolécula), un agente antimicrobiano, o un antiinflamatorio, con el fin de incrementar la concentración de tales agentes en la proximidad del tumor, organismo o inflamación diana, sin aumentar la dosis general que recibe el paciente. Los péptidos cíclicos para ser utilizados con tales métodos pueden estar unidos a un agente de acceso para aumentar, de manera adicional, la concentración local del péptido cíclico, aunque la administración sistémica de un agente vasoactivo, incluso en ausencia de un agente de acceso, aumenta la perfusión de ciertos tumores en relación con otros tejidos. Agentes de acceso adecuados incluyen anticuerpos y otras moléculas que se unen específicamente a células tumorales o a componentes de vasos sanguíneos estructuralmente anómalos. Por ejemplo, un agente de acceso puede ser un anticuerpo que se fija a un producto de degradación de la fibrina o a una enzima celular tal como la peroxidasa liberada por los granulocitos u otras células en tejidos necróticos o inflamados.

En general, se prefiere la administración a través de una inyección intravenosa o la administración transdérmica. Las dosificaciones eficaces suelen ser suficientes para aumentar la localización de un agente diagnóstico o terapéutico administrado de forma subsiguiente, en un grado que mejora la eficacia clínica de la terapia, o la precisión del diagnóstico, de manera estadísticamente significativa. Se pueden establecer comparaciones entre animales hospedadores de tumores, tratados y no tratados, a los que se administran dosis equivalentes del agente diagnóstico o terapéutico. En general, las dosificaciones se encuentran dentro del intervalo descrito anteriormente.

Otros aspectos de la presente invención proporcionan métodos que aprovechan las propiedades inmunogénicas de los péptidos cíclicos. Por ejemplo, se pueden desarrollar anticuerpos policlonales y monoclonales contra un péptido cíclico, usando técnicas convencionales. Estos anticuerpos se pueden preparar por cualquiera de las diversas técnicas conocidas por los expertos. Véase, por ejemplo, Harlow y Lane, Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, 1988. En una de dichas técnicas, se inyecta un inmunógeno que comprende el péptido cíclico en uno de una extensa variedad de mamíferos (por ejemplo, ratón, rata, conejo, oveja o cabra). Debido a su escaso tamaño, el péptido cíclico debe estar unido a una proteína portadora tal como albúmina de suero bovino o hemocianina "keyhole limpet". Después de una o múltiples inyecciones, los animales se someten a sangrados periódicos. A continuación, es posible purificar anticuerpos monoclonales específicos para el péptido cíclico a partir de estos antisueros mediante, por ejemplo, cromatografía de afinidad, usando un polipéptido acoplado a un soporte sólido apropiado.

Resulta posible preparar anticuerpos monoclonales específicos para el péptido cíclico de interés mediante, por ejemplo, el uso de la técnica de Kohler y Milstein, Eur. J. Immunol. 6:511-519, 1976, y las mejoras aportadas. En pocas palabras, estos métodos comprenden la preparación de líneas celulares inmortales capaces de producir anticuerpos que poseen la especificidad deseada, a partir de células esplénicas obtenidas de un animal que ha sido inmunizado de la forma descrita anteriormente. Las células esplénicas se inmortalizan, por ejemplo, por su fusión con un miembro de fusión celular del mieloma, preferentemente alguno que sea singeneico con el animal inmunizado. Se seleccionan colonias aisladas y se analiza en los sobrenadantes de sus cultivos su actividad de unión contra el polipéptido. Se prefieren hibridomas con elevadas reactividad y especificidad.

Los anticuerpos monoclonales se pueden aislar de los sobrenadantes de colonias de hibridomas en crecimiento, con o sin el uso de diversas técnicas conocidas para aumentar el rendimiento. Los contaminantes se pueden separar de los anticuerpos por técnicas convencionales tales como cromatografía, filtración sobre gel, precipitación, y extracción. En general, los anticuerpos que poseen la actividad deseada se pueden identificar usando análisis de inmunofluorescencia de cortes de tejidos, células u otras muestras donde se halla localizada la cadherina diana.

Estos anticuerpos se pueden usar in vitro o in vivo para modular la adhesión celular. En determinadas formas de realización, se pueden usar anticuerpos con métodos en los que se desea una adhesión celular potenciada, tal como se ha descrito anteriormente. Por ejemplo, se pueden usar anticuerpos con los citados métodos para potenciar y/o dirigir el crecimiento de axones in vitro o in vivo. Los anticuerpos pueden ser utilizados en la luz de una guía nerviosa tubular o pueden estar unidos a la misma, a una sutura o a otro soporte sólido, usándolos del modo descrito anteriormente para los péptidos cíclicos. Las dosificaciones de anticuerpos son suficientes para potenciar o dirigir el crecimiento axonal, y variarán en función del método de administración y de la enfermedad a tratar.

Los anticuerpos pueden ser usados también como "adhesivos biológicos", tal como se ha descrito anteriormente, para unir múltiples células que expresan cadherina dentro de una variedad de contextos, tales como potenciar la cicatrización de heridas y/o reducir el tejido cicatricial, y/o facilitar la adhesión celular en los injertos cutáneos o implantes protésicos. En general, la cantidad de anticuerpo unido a una matriz que se administra a una herida, injerto o implante varía en función de la gravedad de la herida y/o la naturaleza de la herida, injerto o implante, pero puede hacerlo dentro del intervalo descrito más arriba. Los anticuerpos se pueden unir, asimismo, a diversos materiales de soporte para ser usados en el cultivo de tejidos o biorreactores.

En determinadas formas de realización, se pueden usar anticuerpos (o, preferentemente, fragmentos de los mismos que fijan antígenos) en situaciones en que se desea inhibir la adhesión celular. Estos anticuerpos o fragmentos se pueden usar, por ejemplo, para el tratamiento de enfermedades desmielinizantes tales como EM, o para inhibir interacciones entre células tumorales, tal como se ha descrito anteriormente. En general, se prefiere el uso de fragmentos Fab.

Los péptidos cíclicos se pueden utilizar también para generar anticuerpos monoclonales, tal como se ha descrito más arriba, que son específicos para cadherinas particulares (por ejemplo, anticuerpos que se unen a E-cadherina, pero no lo hacen de manera importante a N-cadherina, o viceversa). En general, estos anticuerpos pueden ser usados con fines terapéuticos, diagnósticos y experimentales. Por ejemplo, estos anticuerpos pueden estar unidos a un medicamento y ser administrados a un mamífero para permitir el acceso del medicamento a una célula particular que expresa cadherina tal como una célula leucémica en la sangre.

Los ensayos implican utilizar, típicamente, el anticuerpo para detectar la presencia o ausencia de una cadherina (libre o en la superficie de una célula), o un fragmento proteolítico que contiene el dominio EC1 en una muestra biológica apropiada, tal como un tumor o biopsias de tejidos normales, muestras de sangre, ganglio linfático, suero u orina, o de otros tejidos, homogenatos, o extractos de los mismos, obtenidos de un paciente.

El experto en la técnica conoce una variedad de formatos experimentales que utilizan un anticuerpo para detectar una molécula diana en una muestra. Véase, por ejemplo, Harlow y Lane, Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, 1988. Por ejemplo, el ensayo se puede llevar a cabo en un formato de transferencia de western, en el que una preparación de proteína de la muestra biológica se somete a electroforesis de gel, se transfiere a una membrana apropiada y se le deja reaccionar con el anticuerpo. La presencia del anticuerpo en la membrana se puede detectar, entonces, usando un reactivo de detección adecuado, como se describe más adelante.

En otra forma de realización, el ensayo comprende el uso de un anticuerpo inmovilizado sobre un soporte sólido para unirse a la cadherina diana, o de un fragmento proteolítico que contiene el dominio EC1, y separarlo del resto de la muestra. A continuación, la cadherina fijada puede ser detectada usando un segundo anticuerpo o reactivo que contiene un grupo informador. Alternativamente, se puede usar un ensayo competitivo, en el que la cadherina se marca con un grupo informador y se le deja unirse al anticuerpo inmovilizado tras la incubación del anticuerpo con la muestra. El grado en que los componentes de la muestra inhiben la unión de la cadherina marcada al anticuerpo es indicativo de la reactividad de la muestra con el anticuerpo inmovilizado y, como consecuencia, indicativo del nivel de cadherina en la muestra.

El soporte sólido puede ser cualquier material, conocido por el experto en la técnica, al que puede unirse el anticuerpo, tal como un pocillo de ensayo en una placa de microtitulación, un filtro de nitrocelulosa u otra membrana adecuada. De forma alternativa, el soporte puede ser una perla o disco, tal como vidrio, fibra de vidrio, látex o plástico tal como poliestireno o cloruro de polivinilo. El anticuerpo puede inmovilizarse sobre el soporte sólido usando una variedad de técnicas conocidas por el experto, que aparecen extensamente descritas en la bibliografía de patentes y científica.

En determinadas formas de realización, el ensayo para la detección de una cadherina en una muestra es un ensayo en emparedado de dos anticuerpos. Este ensayo se puede llevar a cabo haciendo contactar, en primer lugar, un anticuerpo que ha sido inmovilizado sobre un soporte sólido, habitualmente el pocillo de una placa de microtitulación, con la muestra biológica, de forma que la cadherina presente en la muestra se fija al anticuerpo inmovilizado (generalmente, es suficiente con una incubación de 30 minutos a temperatura ambiente). Se retira, entonces, la muestra no fijada de los complejos inmovilizados de cadherina-anticuerpo, y se agrega un segundo anticuerpo (que contiene un grupo informador tal como una enzima, tinción, radionúclido, grupo luminiscente, grupo fluorescente o biotina), capaz de unirse a un sitio diferente de la cadherina. Se determina, a continuación, la cantidad de este segundo anticuerpo que se mantiene unida al soporte sólido, usando un método apropiado para el grupo informador específico. El método empleado para detectar el grupo informador depende de la naturaleza de este último. Para los grupos radiactivos, resultan normalmente adecuados el recuento por escintilación o los métodos de autorradiografía. Se pueden utilizar métodos espectroscópicos para detectar tinciones, grupos luminiscentes y grupos fluorescentes. La biotina puede ser detectada usando avidina, acoplada con un grupo informador diferente (habitualmente, un grupo radiactivo o fluorescente, o una enzima). Los grupos informadores enzimáticos se pueden detectar, por lo general, mediante la adición de un sustrato (normalmente, durante un período específico de tiempo), seguida de análisis espectroscópico u otros análisis de los productos de reacción. Para la determinación del nivel de cadherina en una muestra, pueden usarse estándares y adiciones estándares, con técnicas bien conocidas.

La presente invención proporciona, igualmente, kits para ser usados en estos inmunoensayos. Dichos kits comprenden, por lo general, uno o múltiples anticuerpos, tal como se ha descrito anteriormente. Además, uno o múltiples compartimentos o recipientes del kit comprenden generalmente elementos, tales como reactivos, tampones y/o soluciones de lavado, que se utilizan en el inmunoensayo.

Dentro de aspectos adicionales, pueden usarse péptidos cíclicos o anticuerpos contra ellos para facilitar la identificación y la clasificación de células in vitro, o la obtención de imágenes in vivo, lo que permite seleccionar células que expresan diferentes cadherinas (o diferentes niveles de cadherina). Preferentemente, el o los péptidos cíclicos o anticuerpos que se usan en estos métodos están unidos a una marca detectable. Marcas adecuadas son bien conocidas en la técnica, e incluyen radionúclidos, grupos luminiscentes, grupos fluorescentes, enzimas, tinciones, dominios de inmunoglobulinas constantes, y biotina. En una forma de realización preferida, se hace contactar un péptido cíclico o anticuerpo unido a una marca fluorescente, tal como fluoresceína, con las células que, entonces, son analizadas por clasificación celular activada por fluorescencia (FACS, en sus siglas en inglés).

Los siguientes ejemplos se ofrecen a modo de ilustración, y en ningún caso, como limitación.

Ejemplo 1 Preparación de péptidos cíclicos representativos

Este Ejemplo ilustra la síntesis en fase sólida de péptidos cíclicos representativos.

Los péptidos fueron ensamblados sobre resina de metilbenzilhidrilamina (resina MBHA) para los péptidos con amida C-terminal. Se utilizaron las resinas tradicionales de Merrifield para cualquier péptido ácido C-terminal. Se rellenaron bolsas de un material de malla de polipropileno con la resina, y se empaparon en diclorometano. Los paquetes de resina fueron lavados tres veces con diisopropiletilamina al 5% en diclorometano y, a continuación, fueron lavadas con diclorometano. Luego, los paquetes se clasificaron y colocaron en un frasco Nalgene que contenía una solución del aminoácido de interés en diclorometano. Se agregó una cantidad similar de diisopropilcarbodiimida (DIC) en diclorometano para activar la reacción de acoplamiento. El frasco se agitó durante una hora para garantizar la compleción de la reacción. Se descartó la mezcla de reacción, y los paquetes se lavaron con DMF. Se separó el N-\alpha-Boc por acidólisis, usando TFA al 55% en diclorometano durante 30 minutos, dejando la sal de TFA del grupo \alpha-amino. Se lavaron las bolsas y se completó la síntesis repitiendo el mismo procedimiento mientras se sustituyó el aminoácido correspondiente en la etapa de acoplamiento. Se llevó a cabo la acetilación del extremo N-terminal haciendo reaccionar las resinas del péptido con una solución de anhídrido acético en diclorometano, en presencia de diisopropiletilamina. Seguidamente, se desprotegió la cadena lateral del péptido y se escindió de la resina a 0ºC con HF líquido, en presencia de anisol como eliminador del carbocatión.

Los péptidos brutos se purificaron por cromatografía líquida de alto rendimiento de fase inversa. Los precursores lineales purificados de los péptidos cíclicos se solubilizaron en ácido acético al 75%, a una concentración de 2-10 mg/ml. Se agregó, gota a gota, una solución al 10% de yodo en metanol, hasta obtener una coloración persistente. Se agregó a la mezcla, entonces, una solución al 5% de ácido ascórbico en agua hasta su decoloración. Los compuestos que contienen el puente de disulfuro se purificaron, seguidamente, por HPLC y se caracterizaron por HPLC analítica y por análisis espectral de masas.

Ejemplo 2 Disrupción de la capacidad de las neuronas cerebelares de ratón para extender axones

Tres moléculas de adhesión celular, N-cadherina, N-CAM y L1, son capaces de regular el crecimiento de axones (Doherty y Walsh, Curr. Op. Neurobiol. 4:49-55, 1994; Williams et al., Neuron 13:583-594, 1994; Hall et al., Cell Adhesion and Commun. 3:441-450, 1996; Doherty y Walsh, Mol. Cell. Neurosci. 8:99-111, 1994; Safell et al., Neuron 18:231-242, 1997). Las neuronas cultivadas en monocapas de células 3T3, que han sido transfectadas con ADNc que codifican N-cadherina, N-CAM o L1 extienden axones de mayor longitud que las neuronas cultivadas en células 3T3 que no expresan estas moléculas de adhesión celular. Este Ejemplo ilustra el uso de un péptido cíclico representativo para inhibir el crecimiento axonal.

Se cultivaron neuronas en monocapas de células 3T3 transfectadas con ADNc que codifica N-cadherina, básicamente de la forma descrita por Doherty y Walsh, Curr. Op. Neurobiol. 4:49-55, 1994; Williams et al., Neuron 13:583-594, 1994; Hall et al., Cell Adhesion and Commun. 3:441-450, 1996; Doherty y Walsh, Mol. Cell. Neurosci. 8:99-111, 1994; Safell et al., Neuron 18:231-242, 1997. En pocas palabras, se establecieron monocapas de fibroblastos 3T3 de control y fibroblastos 3T3 que expresan N-cadherina mediante el cultivo durante la noche de 80.000 células en pocillos individuales de una lámina de cultivo celular de pocillos con 8 cámaras. Se cultivaron durante 18 horas 3.000 neuronas cerebelares aisladas de cerebros de ratón post-natales, de 3 días de edad sobre las diversas monocapas en medio de control (SATO/SBF al 2%), o en medio suplementado con diversas concentraciones del péptido cíclico N-Ac-CHAVC-NH_{2} o un péptido de control, sin la secuencia HAV (N-Ac-CHGVC-NH_{2}). A continuación, los cultivos se fijaron y tiñeron para GAP43, que se fija específicamente a las neuronas y a sus axones. Se midió, entonces, la longitud del axón más largo en cada neurona positiva para GAP43 mediante morfometría computa-
dorizada.

Tal como se muestra en la Figura 4, el cultivo durante 18 horas con N-Ac-CHAVC-NH_{2} a una concentración de 500 \mug/ml inhibió el crecimiento axonal en células 3T3 que expresan N-cadherina, en tanto que el péptido cíclico N-Ac-CHGVC-NH_{2} (también a una concentración de 500 \mug/ml) careció de efecto sobre este proceso. Adicionalmente, el péptido cíclico N-Ac-CHAVC-NH_{2} (usado a una concentración de 500 \mug/ml) no inhibió el crecimiento del axón en células 3T3 que no expresan N-cadherina, N-CAM ni L1 (células de control), indicando, de esta forma, que el péptido no es tóxico y carece de efectos inespecíficos sobre el crecimiento axonal (Figura 4, compárense las columnas 3 y 1). Estos datos indican, asimismo, que el péptido no afecta a la función de la integrina.

Un estudio de respuesta a la dosis demostró que N-Ac-CHAVC-NH_{2} inhibió de manera significativa el crecimiento del axón en células 3T3 que expresan N-cadherina a una concentración de 50 \mug/ml, y lo inhibió por completo en estas células a una concentración de 500 \mug/ml (Figura 5). Por último, N-Ac-CHAVC-NH_{2} (utilizado a una concentración de 500 \mug/ml) no inhibió el crecimiento axonal en células 3T3 que expresan N-CAM o L1 (Figura 6). Estos resultados indican que el péptido N-Ac-CHAVC-NH_{2} inhibe, de modo específico, la función sobre N-cadherina. En su conjunto, los resultados obtenidos de estos estudios demuestran que N-Ac-CHAVC-NH_{2} es un inhibidor eficaz del crecimiento axonal en virtud de su capacidad para romper la función de la N-cadherina.

\vskip1.000000\baselineskip

Ejemplo 3 Disrupción de la adhesión de células endoteliales bovinas

Este Ejemplo ilustra el uso de péptidos cíclicos representativos para romper la adhesión de células endoteliales que expresan N-cadherina.

Se cosecharon células endoteliales de la arteria pulmonar bovina por ablación estéril y digestión en colagenasa al 0,1% (tipo II; Worthington Enzymes, Freehold, NJ). Las células se mantuvieron en medio esencial mínimo de Dulbecco (Clonetics, San Diego, CA) suplementado con suero bovino fetal al 10% (Atlantic Biologicals, Nor Cross, GA) y antibiótico-antimicótico al 1%, a 37ºC en aire con CO_{2} al 7%. Los cultivos se sometieron a pasajes semanales en tripsina-EDTA (Gibco, Grand Island, NY) y se sembraron en plástico de cultivo tisular a 20.000 células/cm^{2} para todos los experimentos. Los cultivos endoteliales se usaron a la semana 1 de cultivo, que es aproximadamente 3 días después del establecimiento de la confluencia de cultivos. Las células utilizadas en todos los protocolos estuvieron entre el pasaje 4º y el pasaje 10º. Las células fueron sembradas sobre cubreobjetos y tratadas durante 30 minutos con N-Ac-CHAVC-NH_{2} o N-Ac-CHGVC-NH_{2} a 500 \mug/ml y, a continuación, fueron fijadas con paraformaldehído al 1%.

El péptido N-Ac-CHAVC-NH_{2} rompió la monocapa de células endoteliales dentro de los 30 minutos siguientes a su adición al medio de cultivo, en tanto que N-Ac-CHGVC-NH_{2} no tuvo efecto alguno sobre las células (Figura 7). La morfología de las células endoteliales se vio fuertemente afectada por N-Ac-CHAVC-NH_{2}, y las células se retrajeron entre sí, haciéndose no adherentes. Estos datos demuestran que N-Ac-CHAVC-NH_{2} es capaz de inhibir la adhesión de células endoteliales.

Bajo las mismas condiciones, los péptidos cíclicos N-Ac-CHAVC-NH_{2}, N-Ac-CAHAVDIC-NH_{2} (Figura 8) y N-Ac-CHAVSC-NH_{2} carecieron de efecto sobre la morfología de las células endoteliales, lo que indica que no todos los péptidos cíclicos que contienen HAV son capaces de romper la adhesión de células endoteliales a una concentración de 500 \mug/ml. No es inesperado que varíen las potencias de péptidos cíclicos individuales. El péptido cíclico N-Ac-
CAHAVDC-NH_{2} (Figura 9) tuvo un ligero efecto, en tanto que N-Ac-CSHAVSSC-NH_{2} (Figura 10) rompió la monocapa de células endoteliales y provocó la retracción de las células entre sí.

\vskip1.000000\baselineskip

Ejemplo 4 Disrupción de la adhesión de células cancerosas del ovario humano

Este Ejemplo ilustra el uso de un péptido cíclico representativo para romper la adhesión de células cancerosas de ovario humano.

La línea de células cancerosas del ovario humano SKOV3 (ATCC nº HTB-77) expresa N-cadherina. Se cultivaron células SKOV3 en un medio modificado, basado en MEM, que contuvo SBF al 10%. Las células se cultivaron en frascos de cultivo T-250 y se mantuvieron mediante subcultivo periódico. Los péptidos cíclicos se ensayaron sobre células cultivadas en pocillos individuales de placas de cultivo de 96 pocillos (superficie de cada pocillo, 0,32 cm^{2}). Las células se cosecharon de los frascos y se sembraron a una densidad de 50.000 células por pocillo en 0,1 ml de medio que contuvo el péptido cíclico a concentraciones de 1, 0,1 ó 0,01 mg/ml, o en ausencia de péptido cíclico. Asimismo, se establecieron pocillos de control con el medio. Los cultivos fueron evaluados periódicamente por análisis microscópico tanto en campo brillante como bajo contraste de fase. Los cultivos se mantuvieron durante 48 horas.

Tal como se muestra en la Figura 11A (compárese con la Figura 11C) y 12A, el péptido N-Ac-CHAVC-NH_{2} (concentración final de 1 mg/ml de medio) rompió la adhesión de las células SKOV3 en un plazo de 24 horas, en tanto que el péptido de control N-Ac-CHGVC-NH_{2} careció de efecto sobre la adhesión celular (Figuras 11B y 12B). El efecto de diferentes cantidades de N-Ac-CHAVC-NH_{2} después de 48 horas se muestra en las Figuras 11D-F. En presencia de N-Ac-CHGVC-NH_{2} (Figuras 11B y 12B), las células SKOV3 formaron monocapas fuertemente adherentes. Por el contrario, las células SKOV3 no se diseminaron a los sustratos ni formaron monocapas fuertemente adherentes en presencia de N-Ac-CHAVC-NH_{2} (Figuras 11A, D y 12A). Estos datos demuestran que N-Ac-CHAVC-NH_{2} es capaz de inhibir la función de la N-cadherina humana.

Los péptidos cíclicos N-Ac-CAHAVDIC-NH_{2}, y N-Ac-CAHAVDC-NH_{2} y N-Ac-KHAVC-NH_{2} fueron inactivos en las células SKOV3, indicando, de este modo, que no todos los péptidos que contienen la secuencia HAV son capaces de romper la adhesión de células endoteliales a concentraciones de 0,01-1 mg/ml. No resulta inesperado que varíen las potencias de los péptidos cíclicos.

\vskip1.000000\baselineskip

Ejemplo 5 Disrupción de la angiogénesis

Los vasos sanguíneos están compuestos por células endoteliales adherentes. Este Ejemplo ilustra el uso de un péptido cíclico representativo para bloquear la angiogénesis (crecimiento de vasos sanguíneos a partir de vasos sanguíneos preexistentes).

Se utilizó el ensayo de membrana corioalantoica de pollo para evaluar los efectos de los péptidos cíclicos sobre la angiogénesis (Iruela-Arispe et al., Molecular Biology of the Cell 6:327-343, 1995). Se incluyeron péptidos cíclicos en una malla compuesta por vitrógeno a concentraciones de 3, 17 y 33 \mug/malla. A continuación, las mallas se aplicaron a membranas corioalantoicas embrionarias de pollo de 12 días de edad. Después de 24 horas, se evaluaron los efectos de los péptidos sobre la angiogénesis mediante análisis morfométrico computadorizado. El péptido cíclico H-CHAVC-NH_{2}, al que se había retirado el grupo bloqueador N-terminal, inhibió la angiogénesis en 27%, 34% y 35% a concentraciones de 3, 17 y 33 \mug/malla, respectivamente. El péptido cíclico N-Ac-CHAVSC-NH_{2} demostró ser inactivo en este ensayo.

\vskip1.000000\baselineskip

Ejemplo 6 Disrupción de la adhesión de células normales de riñón de rata (NRK)

Las células NRK expresan E-cadherina, y los cultivos monocapa de estas células exhiben una morfología de empedrado. El presente Ejemplo ilustra la capacidad de un péptido cíclico representativo para romper la adhesión de células NRK.

Se sembraron células NRK (ATCC nº 1571-CRL) a razón de 10-20.000 células por frascos de cultivo de tejidos de 35 mm que contuvieron DMEM con SBF al 10%, con subcultivos periódicos (Laird et al., J. Cell Biol. 131:1193-1203, 1995). Las células se cosecharon y repusieron en frascos de cultivos de tejidos de 35 mm que contuvieron cubreobjetos de 1 mm y se incubaron hasta una confluencia de 50-65% (24-36 horas). En ese momento, se transfirieron los cubreobjetos a una placa de 24 pocillos, se lavaron una vez con DMEM recién preparado y fueron expuestos a soluciones de péptidos cíclicos (N-Ac-CHAVC-NH_{2} y N-Ac-CHGVC-NH_{2}), a una concentración de 1 mg/ml durante 24 horas. A continuación, se agregaron soluciones recientes de péptidos y se dejaron las células en cultivo durante 24 horas adicionales. Las células fueron fijadas con metanol al 100% durante 10 minutos y, entonces, fueron lavadas tres veces con PBS. Los cubreobjetos se bloquearon durante 1 hora en BSA al 2%/PBS y se incubaron durante 1 hora adicional, en presencia de anticuerpo anti-E-cadherina de ratón (Transduction Labs, Lexington, KY; dilución 1:250). Anticuerpos primarios y secundarios fueron diluidos en BSA al 2%/PBS. Tras la incubación en los anticuerpos primarios, los cubreobjetos se lavaron tres veces durante 5 minutos cada vez en PBS y se incubaron durante 1 hora con anticuerpo anti-ratón de asno conjugado con fluoresceína (Jackson Immuno Research, West Grove, PA; dilución 1:200). Después de un lavado adicional en PBS (3 x 5 min), se montaron y analizaron los cubreobjetos por microscopia confocal.

El péptido N-Ac-CHAVC-NH_{2} rompió la adhesión de células NRK (Figura 13D, compárese con 13A), en tanto que N-Ac-CHGVC-NH_{2} no tuvo ningún efecto sobre la adhesión celular (Figura 13C). En presencia de N-Ac-CHGVC-NH_{2}, las células NRK formaron monocapas fuertemente adherentes con morfología de empedrado. También expresaron E-cadherina, tal como se desprende de los protocolos de tinción inmunofluorescente (Laird et al., J. Cell Biol. 131:1193-1203, 1995) (Figura 14C). Por el contrario, las células NRK tratadas con N-Ac-CHAVC-NH_{2} no mostraron adhesión entre sí y no formaron monocapas contiguas (Figura 13D). Adicionalmente, estas células expresaron niveles muy reducidos de E-cadherina (Figura 14D). Estos datos demuestran que N-Ac-CHAVC-NH_{2} es capaz de romper la adhesión de células NRK.

\vskip1.000000\baselineskip

Ejemplo 7 Potenciación de la permeabilidad de la piel humana

Las células epiteliales de la piel (conocidas como queratinocitos) expresan E-cadherina. Este Ejemplo ilustra el uso de un péptido cíclico representativo para potenciar la permeabilidad de la piel humana.

En estos ensayos, se utilizó piel del abdomen humano obtenida en la autopsia dentro de las 24 horas siguientes al fallecimiento. Utilizando un dispositivo Franz Cell (Franz, Curr. Prob. Dermatol. 7:58-68, 1978; Franz, J. Invest. Dermatol. 64:190-195, 1975) se evaluó, entonces, el efecto de N-Ac-CHAVC-NH_{2} y N-Ac-CHGVC-NH_{2} (usados a una concentración de 500 \mug/ml) sobre la penetración de dos marcas fluorescentes, Oregon Green (carga, -1,PM 386 dalton) y Rhodamine Green Dextran (sin carga, PM 3000 dalton) a través de la piel humana. Los péptidos y las marcas se disolvieron en tampón fosfato estéril, pH 7,2, y se utilizó tampón fosfato como líquido receptor. La penetración de las marcas a través de la piel se evaluó 6, 12, 24, 36 y 48 horas después del inicio del experimento. Para cada combinación de péptido y marca, el experimento se llevó a cabo por triplicado.

N-Ac-CHAVC-NH_{2} (muestra nº 1) incrementó ligeramente la penetración de Oregon Green a través de la piel, en comparación con el efecto de N-Ac-CHgVC-NH_{2} (muestra nº 3) sobre la penetración de esta marca (Tabla 2). La penetración de Rhodamine Green a través de la piel resultó significativamente aumentada en presencia de N-Ac-CHAVC-NH_{2}, comparada con N-Ac-CHgVC-NH_{2} (Tabla 3).

\vskip1.000000\baselineskip

TABLA 2

12

TABLA 3

13

\vskip1.000000\baselineskip

Ejemplo 8 Disrupción de la adhesión de células cancerosas del ovario humano

Este Ejemplo ilustra, de manera adicional, la capacidad de péptidos cíclicos representativos para romper la adhesión entre células cancerosas de ovario humano.

En estos experimentos se utilizó la línea celular del cáncer de ovario humano OVCAR-3, que expresa E-cadherina. Las células se cultivaron en RPMI suplementado con insulina, con un contenido de SBF al 20%. Las células fueron cultivadas en frascos de cultivo T-250 y fueron mantenidas por subcultivos periódicos. Se cosecharon las células del frasco y se sembraron en pocillos individuales de placas de cultivo de 96 pocillos (superficie de cada pocillo, 0,32 cm^{2}), con una densidad de 50.000 células por pocillo en 0,1 ml de medio que contuvo los péptidos cíclicos (a concentraciones de 1, 0,1 ó 0,01 mg/ml). Se establecieron, igualmente, pocillos de control con medio. Los cultivos se evaluaron periódicamente por examen microscópico, bajo condiciones tanto de campo brillante como de contraste de fase, y se mantuvieron durante 48 horas. Se demostró que N-Ac-CHAVC-NH_{2} fue inactivo en este ensayo a las citadas concentraciones. No obstante, el péptido cíclico N-Ac-CHAVSC-NH_{2} rompió la adhesión de OVCAR-3 (Figuras 15A-C). Estos datos demuestran que N-Ac-CHAVSC-NH_{2} actúa de forma específica sobre células que expresan E-cadherina.

\vskip1.000000\baselineskip

Ejemplo 9 Disrupción de la adhesión de células de melanoma

Este Ejemplo ilustra la capacidad de un péptido cíclico representativo para romper la adhesión de células de melanoma.

Se sembraron sobre cubreobjetos de vidrio células ME115 de melanoma (cedidas amablemente por Meenhard Herlyn, Wistar Institute, Filadelfia, PA), y se cultivaron durante 24 horas en medio de cultivo de queratinocitos al 50% (Clonetics, San Diego, CA) y 50% de L15. Se agregó, entonces, medio reciente que contuvo los péptidos cíclicos (concentración final 500 \mug/ml de medio) N-Ac-CHAVC-NH_{2} o N-Ac-CHGVC-NH_{2}. Después de 24 horas de cultivo en presencia de los péptidos, se separó el medio y se agregó medio reciente que contuvo los péptidos. Las células se fijaron 24 horas más tarde con metanol frío y se conservaron en solución salina con tampón fosfato (PBS).

Los cubreobjetos fueron bloqueados durante 1 hora en ovalbúmina al 3%/PBS, y se incubaron durante 1 hora adicional en presencia de un anticuerpo de conejo contra pan-cadherina (Sigma Chemical Co., St. Louis, MO), diluido a 1:500. Los anticuerpos primario y secundario se diluyeron en PBS que contuvo suero de cabra normal al 6%. Tras la incubación en el anticuerpo primario, los cubreobjetos se lavaron 3 veces durante 5 minutos cada vez en PBS, y se incubaron durante 1 hora en inmunoglobulina G anti-conejo de cabra, conjugada con fluoresceína (Kiekegard y Perry, San Francisco Sur, CA), diluido a 1:100. Después de un lavado adicional en PBS (3 x 5 minutos), los cubreobjetos se montaron en Vectashield (Vector Labs, Burlingame, CA) y se analizaron con un microscopio Zeiss corregido para infinito.

Las fotografías que se muestran en la Figura 16 demuestran la ausencia de tinción de la membrana celular y la aparición de tinciones vesiculares brillantes intracelulares en las células tratadas con N-Ac-CHAVC-NH_{2}. Por el contrario, las células expuestas a N-Ac-CHGVC-NH_{2} mostraron tinción de cadherina sobre la totalidad de la membrana celular. Ocasionalmente, la tinción se concentró en puntos del contacto entre células. Estos resultados indican que el péptido cíclico representativo N-Ac-CHAVC-NH_{2} rompe la adhesión entre células de melanoma.

\vskip1.000000\baselineskip

Ejemplo 10 Disrupción de la adhesión de células del cáncer de mama

Este Ejemplo ilustra la capacidad de un péptido cíclico representativo para romper la adhesión de células epiteliales del cáncer de mama humano.

Células epiteliales de cáncer de mama humano A1N4 (amablemente cedidas por Martha Stampfer, Lawrence Berkeley Laboratory, Berkeley, CA) se sembraron sobre cubreobjetos de vidrio, cultivándolas en F12/DME con SBF al 0,5% y 10 ng/ml de EGF, durante 24 horas. Se agregó, entonces, medio reciente que contuvo los péptidos cíclicos (concentración final 500 \mug/ml de medio) N-Ac-CHAVC-NH_{2} o N-Ac-CHGVC-NH_{2}. Después de 24 horas de cultivo en presencia de los péptidos, se separó el medio y se agregó medio reciente que contuvo los péptidos. Las células fueron fijadas 24 horas más tarde con metanol frío y se conservaron en solución salina con tampón fosfato (PBS).

Los cubreobjetos fueron bloqueados durante 1 hora en ovalbúmina al 3%/PBS, incubándolos durante 1 hora adicional en presencia de 1 \mug/ml de anticuerpo anti-E-cadherina de ratón (Zymed, Gaithersburg, MD). Los anticuerpos primario y secundario se diluyeron en PBS que contuvo suero de cabra normal al 6%. Tras la incubación en el anticuerpo primario, se lavaron los cubreobjetos durante sendos 5 minutos en PBS, y se les incubó durante 1 hora con anti-ratón de cabra conjugado con fluoresceína (Kiekegard y Perry, San Francisco Sur, CA), diluido a 1:100. Después de un lavado adicional en PBS (3 x 5 minutos), los cubreobjetos se montaron en Vectashield (Vecta Labs, Burlingame, CA), analizándolos con un microscopio Zeiss corregido para infinito.

Las fotografías que aparecen en las Figuras 17A y B demuestra una tinción de E-cadherina disminuida, con aspecto entrecortado en las células tratadas con N-Ac-CHAVC-NH_{2}. Adicionalmente, en la monocapa se aprecian perforaciones, en los puntos donde las células se han retraído entre sí. Por el contrario, las células expuestas a N-Ac-CHGVC-NH_{2} mostraron tinción de E-cadherina concentrada en los puntos de contacto entre células, y formaron una monocapa fuertemente adherente.

\vskip1.000000\baselineskip

Ejemplo 11 Estudios de toxicidad y proliferación celular

Este Ejemplo ilustra el trabajo inicial para evaluar los efectos citotóxicos de péptidos cíclicos representativos.

Se evaluaron los posibles efectos citotóxicos de N-Ac-CHAVC-NH_{2} y del péptido de control N-Ac-CHGVC-NH_{2} en células endoteliales microvasculares humanas (HMVEC; Clonetics), células endoteliales de la vena umbilical humana (HUVEC; ATCC nº CRL-1730), IAFp2 (línea celular de fibroblastos humanos; Instituto Armand-Frapier, Montreal, Quebec), WI-38 (línea celular de fibroblastos humanos; ATCC nº CCL-75), MDA-MB231 (línea celular de cáncer de mama humano; ATCC nº HTB-26), y PC-3 (línea celular de cáncer de próstata humano; ATCC nº CRL-1435), utilizando el ensayo MTT (Plumb et al., Cancer Res. 49:4435-4440, 1989). Ninguno de los péptidos fue citotóxico a concentraciones de hasta 100 \muM, incluida esta última. Del mismo modo, ninguno de los péptidos fue capaz de inhibir la proliferación de las líneas celulares anteriores a concentraciones de hasta 100 \muM, tal como se determina por los ensayos de incorporación de ^{3}H-timidina.

Adicionalmente, se evaluaron los posibles efectos citotóxicos de N-Ac-CHAVC-NH_{2} y N-Ac-CHAVSC-NH_{2}, así como sus correspondientes péptidos de control N-Ac-CHGVC-NH_{2} y N-Ac-CHGVSC-NH_{2}, sobre las líneas celulares anteriormente citadas, usando el ensayo MTT. Ninguno de los péptidos fue citotóxico a concentraciones de hasta 100 \muM. Sin embargo, N-Ac-CHAVSC-NH_{2} y N-Ac-CHGVSC-NH_{2} inhibieron la proliferación de HUVEC a concentraciones (valores de CT_{50}) de 57 \muM y 42 \muM, respectivamente, tal como se deduce de los ensayos de incorporación de ^{3}H-timidina. N-Ac-CHAVSC-NH_{2} inhibió también la proliferación de células MDA-MB231 a una concentración de 52 \muM (Tablas 4 y 5).

14

TABLA 5

15

Sobre la base de todo lo anterior, resultará evidente que, aunque en este documento se han descrito formas de realización específicas de la invención con el fin de ilustrarla, es posible llevar a cabo diversas modificaciones sin desviarse de la invención.

(1) INFORMACIÓN GENERAL:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): SOLICITANTE: McGill University

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TÍTULO DE LA INVENCIÓN: COMPUESTOS Y MÉTODOS PARA MODULAR LA ADHESIÓN CELULAR

\vskip0.800000\baselineskip

(iii): NÚMERO DE SECUENCIAS: 47

\vskip0.800000\baselineskip

(iv): DIRECCIÓN PARA LA CORRESPONDENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): DESTINATARIO: SEED y BERRY LLP

\vskip0.500000\baselineskip

(B): CALLE: 6300 Columbia Center, 701 5ª Avenida

\vskip0.500000\baselineskip

(C): CIUDAD: Seattle

\vskip0.500000\baselineskip

(D): ESTADO: Washington

\vskip0.500000\baselineskip

(E): PAÍS: Estados Unidos de América

\vskip0.500000\baselineskip

(F): CÓDIGO POSTAL: 98104

\vskip0.800000\baselineskip

(v): FORMA DE LECTURA DIGITAL:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): TIPO DE MEDIO: Disquete

\vskip0.500000\baselineskip

(B): ORDENADOR: PC compatible con IBM

\vskip0.500000\baselineskip

(C): SISTEMA OPERATIVO: PC-DOS/MS-DOS

\vskip0.500000\baselineskip

(D): SOFTWARE: PatentIn Release nº 1.0, Versión nº 1.30

\vskip0.800000\baselineskip

(vi): FECHA ACTUAL DE SOLICITUD:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): NÚMERO DE SOLICITUD: US

\vskip0.500000\baselineskip

(B): FECHA DE PRESENTACIÓN: 11-JUL-1997

\vskip0.500000\baselineskip

(C): CLASIFICACIÓN:

\vskip0.800000\baselineskip

(viii): INFORMACIÓN SOBRE EL ABOGADO/AGENTE:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): NOMBRE: Maki, David J.

\vskip0.500000\baselineskip

(B): NÚMERO DE REGISTRO: 31.392

\vskip0.500000\baselineskip

(C): NÚMERO DE REFERENCIA/CERTIFICADO: 100086.401PC

\vskip0.800000\baselineskip

(ix): INFORMACIÓN SOBRE TELECOMUNICACIONES:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): TELÉFONO: (206) 622-4900

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TELEFAX: (206) 682-6031

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO:1:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 108 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(C): NÚMERO DE CADENAS:

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE SECUENCIA: SEQ ID NO:1:

16

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO:2:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 108 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(C): NÚMERO DE CADENAS:

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE SECUENCIA: SEQ ID NO:2:

\vskip1.000000\baselineskip

17

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO:3:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 108 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(C): NÚMERO DE CADENAS:

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE SECUENCIA: SEQ ID NO:3:

\vskip1.000000\baselineskip

18

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO:4:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 108 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(C): NÚMERO DE CADENAS:

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE SECUENCIA: SEQ ID NO:4:

19

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO:5:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 108 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(C): NÚMERO DE CADENAS:

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE SECUENCIA: SEQ ID NO:5:

\vskip1.000000\baselineskip

20

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO:6:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 108 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(C): NÚMERO DE CADENAS:

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE SECUENCIA: SEQ ID NO:6:

\vskip1.000000\baselineskip

21

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO:7:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 108 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(C): NÚMERO DE CADENAS:

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE SECUENCIA: SEQ ID NO:7:

22

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO:8:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 5 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(C): NÚMERO DE CADENAS:

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: circular

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: péptido

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE SECUENCIA: SEQ ID NO:8:

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{Cys His Ala Val Cys}

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO:9:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 5 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(C): NÚMERO DE CADENAS:

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: circular

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: péptido

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE SECUENCIA: SEQ ID NO:9:

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{Cys His Gly Val Cys}

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO:10:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 8 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(C): NÚMERO DE CADENAS:

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: circular

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: péptido

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE SECUENCIA: SEQ ID NO:10:

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{Cys Ala His Ala Val Asp Ile Cys}

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO:11:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 8 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(C): NÚMERO DE CADENAS:

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: circular

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: péptido

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE SECUENCIA: SEQ ID NO:11:

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{Cys Ala His Gly Val Asp Ile Cys}

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO:12:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 6 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(C): NÚMERO DE CADENAS:

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: circular

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: péptido

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE SECUENCIA: SEQ ID NO:12:

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{Cys Ser His Ala Val Cys}

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO:13:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 6 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(C): NÚMERO DE CADENAS:

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: circular

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: péptido

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE SECUENCIA: SEQ ID NO:13:

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{Cys Ser His Gly Val Cys}

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO:14:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 6 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(C): NÚMERO DE CADENAS:

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: circular

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: péptido

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE SECUENCIA: SEQ ID NO:14:

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{Cys His Ala Val Ser Cys}

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO:15:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 6 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(C): NÚMERO DE CADENAS:

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: circular

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: péptido

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE SECUENCIA: SEQ ID NO:15:

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{Cys His Gly Val Ser Cys}

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO:16:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 7 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(C): NÚMERO DE CADENAS:

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: circular

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: péptido

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE SECUENCIA: SEQ ID NO:16:

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{Cys Ala His Ala Val Asp Cys}

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO:17:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 7 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(C): NÚMERO DE CADENAS:

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: circular

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: péptido

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE SECUENCIA: SEQ ID NO:17:

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{Cys Ala His Gly Val Asp Cys}

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO:18:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 8 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(C): NÚMERO DE CADENAS:

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: circular

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: péptido

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE SECUENCIA: SEQ ID NO:18:

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{Cys Ser His Ala Val Ser Ser Cys}

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO:19:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 8 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(C): NÚMERO DE CADENAS:

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: circular

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: péptido

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE SECUENCIA: SEQ ID NO:19:

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{Cys Ser His Gly Val Ser Ser Cys}

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO:20:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 5 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(C): NÚMERO DE CADENAS:

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: circular

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: péptido

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE SECUENCIA: SEQ ID NO:20:

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{Lys His Ala Val Asp}

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO:21:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 5 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(C): NÚMERO DE CADENAS:

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: circular

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: péptido

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE SECUENCIA: SEQ ID NO:21:

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{Lys His Gly Val Asp}

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO:22:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 8 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(C): NÚMERO DE CADENAS:

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: circular

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: péptido

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE SECUENCIA: SEQ ID NO:22:

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{Cys Ala His Ala Val Asp Ile Pro}

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO:23:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 8 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(C): NÚMERO DE CADENAS:

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: circular

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: péptido

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE SECUENCIA: SEQ ID NO:23:

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{Cys Ala His Gly Val Asp Ile Pro}

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO:24:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 6 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(C): NÚMERO DE CADENAS:

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: circular

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: péptido

\vskip0.800000\baselineskip

(ix): CARACTERÍSTICA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): NOMBRE/CLAVE: Sitio modificado

\vskip0.500000\baselineskip

(B): LOCALIZACIÓN: 1

\vskip0.500000\baselineskip

(D): INFORMACIÓN ADICIONAL: /producto = "Dbu"/

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE SECUENCIA: SEQ ID NO:24:

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{Xaa His Ala Val Ser Gly}

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO:25:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 5 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(C): NÚMERO DE CADENAS:

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: circular

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: péptido

\vskip0.800000\baselineskip

(ix): CARACTERÍSTICA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): NOMBRE/CLAVE: Sitio modificado

\vskip0.500000\baselineskip

(B): LOCALIZACIÓN: 1

\vskip0.500000\baselineskip

(D): INFORMACIÓN ADICIONAL: /producto = "Om"/

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE SECUENCIA: SEQ ID NO:25:

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{Xaa His Ala Val Ser}

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO:26:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 7 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(C): NÚMERO DE CADENAS:

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: circular

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: péptido

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE SECUENCIA: SEQ ID NO:26:

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{Leu Ala His Ala Val Asp Ile}

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO:27:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 7 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(C): NÚMERO DE CADENAS:

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: circular

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: péptido

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE SECUENCIA: SEQ ID NO:27:

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{Leu Ala His Gly Val Asp Ile}

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO:28:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 5 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(C): NÚMERO DE CADENAS:

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: circular

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: péptido

\vskip0.800000\baselineskip

(ix): CARACTERÍSTICA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): NOMBRE/CLAVE: Sitio modificado

\vskip0.500000\baselineskip

(B): LOCALIZACIÓN: 5

\vskip0.500000\baselineskip

(D): INFORMACIÓN ADICIONAL: /producto = "OTRO"/observación = "El residuo es beta, beta-dimetil cisteína"

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE SECUENCIA: SEQ ID NO:28:

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{Cys His Ala Val Xaa}

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO:29:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 9 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(C): NÚMERO DE CADENAS:

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: circular

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: péptido

\vskip0.800000\baselineskip

(ix): CARACTERÍSTICA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): NOMBRE/CLAVE: Sitio modificado

\vskip0.500000\baselineskip

(B): LOCALIZACIÓN: 2

\vskip0.500000\baselineskip

(D): INFORMACIÓN ADICIONAL: /producto = "OTRO"/observación = "El residuo es beta, beta-tetrametilen cisteína"

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE SECUENCIA: SEQ ID NO:29:

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{Ile Xaa Tyr Ser His Ala Val Ser Cys}

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO:30:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 10 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(C): NÚMERO DE CADENAS:

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: circular

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: péptido

\vskip0.800000\baselineskip

(ix): CARACTERÍSTICA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): NOMBRE/CLAVE: Sitio modificado

\vskip0.500000\baselineskip

(B): LOCALIZACIÓN: 2

\vskip0.500000\baselineskip

(D): INFORMACIÓN ADICIONAL: /producto = "OTRO"/observación = "El residuo es beta, beta-pentametilen cisteína"

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE SECUENCIA: SEQ ID NO:30:

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{Ile Xaa Tyr Ser His Ala Val Ser Ser Cys}

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO:31:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 9 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(C): NÚMERO DE CADENAS:

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: circular

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: péptido

\vskip0.800000\baselineskip

(ix): CARACTERÍSTICA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): NOMBRE/CLAVE: Sitio modificado

\vskip0.500000\baselineskip

(B): LOCALIZACIÓN: 1

\vskip0.500000\baselineskip

(D): INFORMACIÓN ADICIONAL: /producto = "OTRO"/observación = "El residuo es ácido beta-mercaptopropiónico"

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE SECUENCIA: SEQ ID NO:31:

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{Xaa Tyr Ser His Ala Val Ser Ser Cys}

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO:32:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 9 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(C): NÚMERO DE CADENAS:

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: circular

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: péptido

\vskip0.800000\baselineskip

(ix): CARACTERÍSTICA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): NOMBRE/CLAVE: Sitio modificado

\vskip0.500000\baselineskip

(B): LOCALIZACIÓN: 1

\vskip0.500000\baselineskip

(D): INFORMACIÓN ADICIONAL: /producto = "OTRO"/observación = "El residuo es ácido beta, beta-pentametilen-beta-mercaptopropiónico"

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE SECUENCIA: SEQ ID NO:32:

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{Xaa Tyr Ser His Ala Val Ser Ser Cys}

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO:33:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 10 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(C): NÚMERO DE CADENAS:

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE SECUENCIA: SEQ ID NO:33:

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{Cys Asp Gly Tyr Pro Lys asp Cys Lys Gly}

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO:34:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 10 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(C): NÚMERO DE CADENAS:

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: circular

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE SECUENCIA: SEQ ID NO:34:

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{Cys Asp Gly Tyr Pro Lys Asp Cys Lys Gly}

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO:35:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 10 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(C): NÚMERO DE CADENAS:

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE SECUENCIA: SEQ ID NO:35:

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{Cys Gly Asn Leu Ser Thr Cys Met Leu Gly}

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO:36:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 10 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(C): NÚMERO DE CADENAS:

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: circular

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE SECUENCIA: SEQ ID NO:36:

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{Cys Gly Asn Leu Ser Thr Cys Met Leu Gly}

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO:37:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 9 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(C): NÚMERO DE CADENAS:

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE SECUENCIA: SEQ ID NO:37:

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{Cys Tyr Ile Gln Asn Cys Pro Leu Gly}

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO:38:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 9 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(C): NÚMERO DE CADENAS:

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: circular

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE SECUENCIA: SEQ ID NO:38:

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{Cys Tyr Ile Gln Asn Cys Pro Leu Gly}

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO:39:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 4 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(C): NÚMERO DE CADENAS:

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: circular

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE SECUENCIA: SEQ ID NO:39:

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{Trp Gly Gly Trp}

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO:40:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 4 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(C): NÚMERO DE CADENAS:

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE SECUENCIA: SEQ ID NO:40:

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{Leu Asp Arg Glu}

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO:41:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 5 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(C): NÚMERO DE CADENAS:

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE SECUENCIA: SEQ ID NO:41:

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{Asp Xaa Asn Asp Asn}

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO:42:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 4 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(C): NÚMERO DE CADENAS:

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE SECUENCIA: SEQ ID NO:42:

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{Xaa Asp Xaa Glu}

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO:43:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 4 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(C): NÚMERO DE CADENAS:

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE SECUENCIA: SEQ ID NO:43:

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{Asp Val Asn Glu}

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO:44:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 6 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(C): NÚMERO DE CADENAS:

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: circular

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE SECUENCIA: SEQ ID NO:44:

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{Ala His Ala Val Asp Ile}

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO:45:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 6 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(C): NÚMERO DE CADENAS:

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: circular

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE SECUENCIA: SEQ ID NO:45:

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{Ser His Ala Val Ser Ser}

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO:46:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 8 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(C): NÚMERO DE CADENAS:

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: circular

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE SECUENCIA: SEQ ID NO:46:

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{Lys Ser His Ala Val Ser Ser Asp}

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO:47:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 5 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(C): NÚMERO DE CADENAS:

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE SECUENCIA: SEQ ID NO:47:

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{Tyr Ile Gly Ser Arg}

Claims

1. Un péptido cíclico que tiene la fórmula (Z1)-(Y1)-(X1)-His-Ala-Val-(X2)-(Y2)-(Z2), en donde X_{1} y X_{2} son opcionales y, si están presentes, se seleccionan, independientemente, del grupo consistente en residuos aminoácidos y sus combinaciones, en donde los residuos están unidos por enlaces peptídicos, y en donde X_{1} y X_{2} tienen, independientemente, un tamaño dentro del intervalo de 0 a 10 residuos, de forma que la suma de residuos contenidos en X_{1} y X_{2} se encuentra dentro del intervalo de 1 a 12; Y_{1} e Y_{2} se seleccionan, independientemente, del grupo consistente en residuos aminoácidos, y en donde se forma un enlace covalente entre los residuos Y_{1} e Y_{2}; y en donde Z_{1} y Z_{2} son opcionales y, si están presentes, se seleccionan, independientemente, del grupo consistente en residuos aminoácidos y sus combinaciones, en donde los residuos están unidos por enlaces peptídicos, en donde dicho péptido cíclico modula la adhesión celular mediada por cadherina.

2. Un péptido cíclico según la reivindicación 1, en donde Z_{1} no está presente, e Y_{1} comprende un grupo N-acetilo, o en donde Z_{2} no está presente, e Y_{2} comprende un grupo amida C-terminal, o en donde Y_{1} e Y_{2} están unidos covalentemente entre sí a través de un enlace disulfuro, o en donde Y_{1} e Y_{2} están unidos covalentemente por un enlace amida, o en donde Y_{1} e Y_{2} están unidos covalentemente por un enlace tioéter.

3. Un péptido cíclico según la reivindicación 2, en donde Y_{1} e Y_{2} están unidos covalentemente por un enlace disulfuro, y en donde Y_{1} e Y_{2} se seleccionan, cada uno de forma independiente, del grupo consistente en penicilamina, \beta,\beta-tetrametilen cisteína, \beta,\beta-pentametilen cisteína, ácido \beta-mercaptopropiónico, ácido \beta,\beta-pentametilen-\beta-mercaptopropiónico, y 2-mercaptobenceno, 2-mercaptoanilina, 2-mercaptoprolina.

4. Un péptido cíclico según la reivindicación 2, en donde Y_{1} e Y_{2} están unidos covalentemente a través de un enlace disulfuro, y en donde Y_{1} e Y_{2} son residuos cisteína.

5. Un péptido cíclico según la reivindicación 4, en donde dicho péptido cíclico comprende la secuencia Cys-His-Ala-Val-Cys (SEQ ID NO:8).

6. Un péptido cíclico según la reivindicación 5, que comprende, adicionalmente, un grupo N-acetilo o un grupo amida C-terminal.

7. Un péptido cíclico según la reivindicación 4, en donde dicho péptido cíclico comprende una secuencia seleccionada del grupo consistente en Cys-Ala-His-Ala-Val-Asp-Ile-Cys (SEQ ID NO:10), Cys-Ser-His-Ala-Val-Cys (SEQ ID NO:12), Cys-His-Ala-Val-Ser-Cys (SEQ ID NO:14), Cys-Ala-His-Ala-Val-Asp-Cys (SEQ ID NO:16), y Cys-Ser-His-Ala-Val-Ser-Ser-Cys (SEQ ID NO:18).

8. Un péptido cíclico según la reivindicación 2, en donde Y_{1} e Y_{2} están unidos covalentemente a través de un enlace amida, y en donde dicho enlace amida se forma entre grupos funcionales terminales, o en donde dicho enlace amida se forma entre cadenas laterales de residuos, o en donde dicho enlace amida se forma entre un grupo funcional terminal y una cadena lateral del residuo.

9. Un péptido cíclico según la reivindicación 2, en donde Y_{1} e Y_{2} están unidos covalentemente a través de un enlace amida, y en donde:

(a): Y_{1} se selecciona del grupo consistente en lisina y ornitina, e Y_{2} se selecciona del grupo consistente en aspartato y glutamato;

(b): Y_{2} se selecciona del grupo consistente en lisina y ornitina, e Y_{1} se selecciona del grupo consistente en aspartato y glutamato.

10. Un péptido cíclico según la reivindicación 2, en donde Y_{1} e Y_{2} están unidos covalentemente a través de un enlace amida, y en donde dicho péptido cíclico comprende la secuencia Lys-His-Ala-Val-Asp (SEQ ID NO:20), o Ala-His-Ala-Val-Asp-Ile (SEQ ID NO:44).

11. Un péptido cíclico según la reivindicación 1, en donde Y_{1} e Y_{2} son, cada uno, triptófano, de modo que dicho enlace covalente genera un \delta_{1}\delta_{1}-ditriptófano.

12. Un péptido cíclico según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 11, unido a un agente de acceso ("targeting agent") o un medicamento, o un soporte sólido, o una marca detectable.

13. Un péptido cíclico según la reivindicación 12, en donde dicho soporte sólido es una matriz polímera.

14. Un péptido cíclico según la reivindicación 13, en donde dicho soporte sólido se selecciona del grupo consistente en placas plásticas, tubos plásticos, suturas, membranas, películas ultrafinas, biorreactores y micropartículas.

15. Un péptido cíclico según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 11, unido a una molécula que comprende un sitio de unión para una molécula de adhesión, en donde dicha molécula de adhesión no es una cadherina clásica.

16. Una composición farmacéutica que comprende un péptido cíclico según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 11, en combinación con un vehículo farmacéuticamente aceptable.

17. Una composición según la reivindicación 16, que comprende, adicionalmente, un medicamento.

18. Una composición según la reivindicación 17, en la que dicho medicamento está unido a dicho péptido cíclico.

19. Una composición según la reivindicación 16, en la que dicho péptido cíclico se encuentra presente en una formulación de liberación sostenida.

20. Un método in vitro para modular la adhesión celular, que comprende hacer contactar una célula que expresa cadherina con un péptido cíclico según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 11.

21. Un método según la reivindicación 20, en donde dicha cadherina se selecciona del grupo consistente en E-cadherina o N-cadherina, o en el que dicha cadherina se selecciona del grupo consistente en P-cadherina, R-cadherina y otras cadherinas que comprenden la secuencia de reconocimiento de adhesión celular HAV.

22. Un método según la reivindicación 20, en el que dicha célula se selecciona del grupo consistente en células epiteliales, células endoteliales, células nerviosas, células tumorales, y linfocitos.

23. Un método según la reivindicación 20, en el que dicho péptido cíclico inhibe la adhesión celular.

24. Un péptido cíclico según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 11, para ser usado en un método dirigido a reducir las adhesiones celulares no deseadas en un mamífero, que comprende administrar dicho péptido a un ma-
mífero.

25. Un péptido cíclico según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 11, para ser utilizado en un método dirigido a potenciar el suministro de un medicamento a través de la piel de un mamífero, que comprende hacer contactar las células epiteliales de un mamífero con dicho péptido y un medicamento, bajo las condiciones y durante el período de tiempo suficientes para permitir el paso de dicho medicamento a través de dichas células epiteliales.

26. Un péptido según la reivindicación 25, en el que dicho péptido cíclico pasa al torrente circulatorio de dicho mamífero.

27. Una composición según la reivindicación 16, para ser usada en un método dirigido a potenciar el suministro de un medicamento a un tumor en un mamífero, que comprende administrar dicha composición a un mamífero.

28. Una composición según la reivindicación 27, en la que dicha composición se administra a dicho tumor.

29. Una composición según la reivindicación 27, en la que el tumor se selecciona del grupo consistente en tumores de vejiga, tumores ováricos, y melanomas.

30. Una composición según la reivindicación 27, en la que dicha composición se administra por inyección, o por vía tópica, o por vía sistémica.

31. Una composición según la reivindicación 16, para ser usada en el tratamiento del cáncer en un mamífero, que comprende administrar dicha composición a un mamífero afecto de cáncer.

32. Una composición según la reivindicación 31, en la que dicho cáncer se selecciona del grupo consistente en carcinomas, leucemia, y melanomas.

33. Una composición según la reivindicación 16, para ser utilizada en un método dirigido a inhibir las metástasis de células tumorales en un mamífero, que comprende administrar dicha composición a un mamífero.

34. Una composición según la reivindicación 16, para ser utilizada en un método dirigido a inhibir la angiogénesis en un mamífero, que comprende administrar dicha composición a un mamífero.

35. Una composición según la reivindicación 16, para ser utilizada en un método dirigido a potenciar el suministro de un medicamento al cerebro de un mamífero, que comprende administrar dicha composición a un mamífero.

36. Una composición según la reivindicación 35, en la que dicha composición se administra por inyección.

37. Un método según la reivindicación 20, en el que dicho péptido cíclico potencia la adhesión celular.

38. Un péptido cíclico según la reivindicación 13, para ser usado en un método dirigido a potenciar la cicatrización de heridas en un mamífero, que comprende hacer contactar una herida en un mamífero con dicho péptido.

\newpage

39. Un péptido cíclico según la reivindicación 13, para ser usado en un método dirigido a potenciar la adhesión de un tejido extraño implantado en un mamífero, que comprende hacer contactar un sitio de implante en un mamífero con dicho péptido.

40. Un péptido según la reivindicación 39, en el que dicho tejido extraño es un injerto cutáneo o un implante de órgano.

41. Un método in vitro para inducir la apoptosis en una célula que expresa cadherina, que comprende hacer contactar una célula que expresa cadherina con un péptido cíclico, según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a
11.

42. Un método in vitro para potenciar y/o dirigir el crecimiento axonal, que comprende hacer contactar una neurona con un péptido cíclico según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 11.

43. Una composición según la reivindicación 16, para ser usada en un método dirigido a tratar lesiones de la médula espinal en un mamífero, que comprende administrar dicha composición a un mamífero.

44. Un péptido cíclico según la reivindicación 13, para ser usado en un método dirigido a tratar lesiones de la médula espinal en un mamífero, que comprende administrar dicho péptido a un mamífero.

45. Una composición según la reivindicación 16, para ser usada en un método dirigido a tratar una enfermedad neurológica desmielinizante en un mamífero, que comprende administrar dicha composición a un mamífero.

46. Una composición según la reivindicación 45, en la que dicha enfermedad es esclerosis múltiple.

47. Una composición según la reivindicación 16, para ser usada en un método dirigido a modular el sistema inmune de un mamífero, que comprende administrar dicha composición a un mamífero.

48. Una composición según la reivindicación 19, para ser usada en un método dirigido a prevenir la gestación en un mamífero, que comprende administrar dicha composición a un mamífero.

49. Una composición según la reivindicación 48, en la que la administración se lleva a cabo por vía intravaginal o intrauterina.

50. Una composición según la reivindicación 16, para ser usada en un método dirigido a aumentar la permeabilidad vascular en un mamífero, que comprende administrar dicha composición a un mamífero.

51. Un método para identificar un péptido cíclico capaz de modular la adhesión celular mediada por cadherina, que comprende:

(a): cultivar neuronas en una monocapa de células que expresan N-cadherina, en presencia y en ausencia de un péptido cíclico candidato, bajo las condiciones y durante el período de tiempo suficientes para permitir el crecimiento axonal;

(b): determinar la longitud media del axón para dichas neurona; y

(c): comparar la longitud media del axón en las neuronas cultivadas en presencia del péptido cíclico candidato, con la longitud media del axón de las neuronas cultivadas en ausencia del péptido cíclico candidato y, a partir de estos datos, identificar un péptido cíclico capaz de modular la adhesión celular.

52. Un método para identificar un péptido cíclico capaz de modular la adhesión celular mediada por cadherina, que comprende:

(a): cultivar células que expresan una cadherina, en presencia y en ausencia de un péptido cíclico candidato, bajo las condiciones y durante el período de tiempo suficientes para permitir la adhesión celular;

(b): evaluar visualmente el grado de adhesión entre dichas células; y a partir de estos datos, identificar un péptido cíclico capaz de modular la adhesión celular.

53. Un método según la reivindicación 52, en el que dichas células se seleccionan del grupo consistente en células endoteliales, epiteliales, y cancerosas.

54. Un método para identificar un péptido cíclico capaz de modular la adhesión celular mediada por cadherina, que comprende:

(a): cultivar células NRK en presencia y en ausencia de un péptido cíclico candidato, bajo las condiciones y durante el período de tiempo suficientes para permitir la adhesión celular;

(b): comparar el nivel de E-cadherina en la superficie celular en las células cultivadas en presencia del péptido cíclico candidato con el nivel en células cultivadas en ausencia del péptido cíclico candidato y, a partir de estos datos, identificar un péptido cíclico capaz de modular la adhesión celular.

55. Un método para identificar un péptido cíclico capaz de modular la adhesión celular modulada por cadherina, que comprende:

(a): hacer contactar una superficie epitelial de piel con una marca experimental, en presencia y en ausencia de un péptido cíclico candidato, y

(b): comparar la cantidad de marca experimental que atraviesa dicha piel en presencia del péptido cíclico candidato con la cantidad que la atraviesa en ausencia del péptido cíclico candidato y, a partir de estos datos, identificar un péptido cíclico capaz de modular la adhesión celular.

56. Un método según la reivindicación 55, en el que dicha piel es piel humana.

57. Un método in vitro para identificar un péptido cíclico capaz de modular la adhesión celular mediada por cadherina, que comprende:

(a): hacer contactar un vaso sanguíneo con un péptido cíclico candidato; y

(b): comparar el grado de angiogénesis de dicho vaso sanguíneo con un nivel predeterminado de angiogénesis observado en un vaso sanguíneo en ausencia del péptido cíclico candidato y, a partir de estos datos, identificar un péptido cíclico capaz de modular la adhesión celular.

58. Un kit para administrar un medicamento a través de la piel de un mamífero, que comprende:

(a): un parche cutáneo; y

(b): un péptido cíclico según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 11.

59. Un kit según la reivindicación 58, en el que dicho parche cutáneo está impregnado con dicho péptido cíclico.

60. Un kit según la reivindicación 59, que comprende, adicionalmente, un medicamento.

61. Un método in vitro para modular la adhesión celular, que comprende hacer contactar una célula que expresa cadherina con un anticuerpo que se une específicamente a un péptido cíclico según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 11.

62. Un método in vitro para dirigir el acceso de un medicamento a una célula que expresa cadherina en un mamífero, que comprende administrar a un mamífero un anticuerpo que se une específicamente a un péptido cíclico según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 11, en donde dicho anticuerpo está unido a un medicamento.

63. Un método para detectar la presencia en una muestra de células que expresan cadherina, que comprende:

(a): hacer contactar una muestra con un anticuerpo que se une específicamente a un péptido cíclico según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 11, bajo las condiciones y el período de tiempo suficientes para permitir la formación de un complejo de anticuerpo-cadherina; y

(b): detectar el nivel de complejo de anticuerpo-cadherina y, a partir de éste, detectar la presencia en una muestra de células que expresan cadherina.

64. Un método según la reivindicación 63, en el que dicho anticuerpo está unido a un material de soporte.

65. Un método según la reivindicación 63, en el que dicho anticuerpo está unido a una marca detectable.

66. Un método según la reivindicación 65, en el que dicha marca detectable es una marca fluorescente, y en el que la etapa de detección se lleva a cabo usando la clasificación de células activada por fluorescencia.

67. Un kit para detectar la presencia en una muestra de células que expresan cadherina, que comprende:

(a): un anticuerpo que se une específicamente a un péptido cíclico, según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 11; y

(b): un reactivo de detección.

68. Un péptido cíclico según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 11, para ser usado en un método dirigido a modular la adhesión celular, que comprende hacer contactar una célula que expresa cadherina con dicho péptido.

69. Un péptido según la reivindicación 68, en el que dicha cadherina se selecciona del grupo consistente en E-cadherina y N-cadherina, o en el que dicha cadherina se selecciona del grupo consistente en P-cadherina, R-cadherina, y otras cadherinas que comprenden la secuencia de reconocimiento de adhesión celular HAV.

70. Un péptido según la reivindicación 68, en el que dicha célula se selecciona del grupo consistente en células epiteliales, células endoteliales, células nerviosas, células tumorales, y linfocitos.

71. Un péptido según la reivindicación 68, en el que dicho péptido cíclico inhibe la adhesión celular.

72. Un péptido según la reivindicación 68, en el que dicho péptido cíclico potencia la adhesión celular.

73. Un péptido cíclico según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 11, para ser usado en un método dirigido a inducir la apoptosis en una célula que expresa cadherina, que comprende hacer contactar una célula que expresa cadherina con dicho péptido.

74. Un péptido cíclico según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 11, para ser utilizado en un método para potenciar y/o dirigir el crecimiento axonal, que comprende hacer contactar una neurona con dicho péptido.

75. Un anticuerpo que se une específicamente a un péptido cíclico según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 11, para ser usado en un método dirigido a modular la adhesión celular, que comprende hacer contactar una célula que expresa cadherina con dicho anticuerpo.

76. Un anticuerpo que se une específicamente a un péptido cíclico según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 11, para ser usado en un método para dirigir el acceso de un medicamento a una célula que expresa cadherina en un mamífero, que comprende administrar dicho anticuerpo a un mamífero, en donde dicho anticuerpo está unido a un medicamento.