JPH05500504A - 細胞付着阻止のための組成物及び使用方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 細胞付着阻止のための組成物及び使用方法これは１９８９年９月２９日に出願さ れた米国出願番号筒０７／４１３．３３２号の一部継続である。

発明の背景 発明の分野 本発明は血液・脳関門障壁を一時的に又、可逆的に分離する組成物に関する。よ り詳しくは、本発明は一般循環及び脳の間の生理的障壁を構成する編毛細血管内 皮細胞間の堅い結合を分離する組成物に関する。

関連技術の詳細な説明 血流から中枢神経系（ＣＮＳ）、即ち脳及びを髄への薬物の侵入は胴上細血管細 胞間の高抵抗性型結合の存在により、及びこれら内皮細胞を起える輸送の明白に 遅い速度により限定される（ベツ、エイ。

エル、等、アン、レグ。フィシオル、、４８：２４１（１９８６）；バートリッ ジ、ダブリユウ、エム１．アン、レヴ、ファルマコル　トキシコル７，２８・２ ５（１９８８））。

血液脳関門障壁（Ｂ　Ｂ　Ｂ）の堅い結合は脳毛細血管内皮細胞の囲りの分子及 びイオンの拡散を防ぐ。毛細血管の管腔コアから毛細血管を取り囲む管腔外（ａ ｂｌｕｍｉｎａｌ）組織へ容易に通ることができる物質のみが選択的輸送系が内 皮細胞系に存在するこれらの分子及び親油性（即ち疎水性）であるこれらの化合 物である。対照的に、親油性ではなく特異的キャリヤー蛋白類により輸送されな い薬物ペプチド及び他の分子は、脳への侵入から閉ざされ、又は侵入速度は非常 に遅くて役に立たず、これによりＣＮＳ疾患を薬理学的に処置する医師の能力に 厳しい制限を課する。

上で述べたキャリアー仲介転換細胞輸送（ｃａｒｒｉｅｒ−ｍｅｄｉａｔｅｄ　 ｔｒａｎｓｃｅｌｌｕｌａｒ　ｔｒａｎｓｐｏｒｔ）系はある状況下での治療様 式のための有効性を限定する。一般に、トランスシトティック（ｔｒａｎｓｅｙ ｔｏｔｉｃ）輸送は、第一に分子の内皮細胞の表面上の特異的キャリヤー蛋白へ の結合及び第二に内皮細胞を越えてのかかる分子の分配を含む。ＣＮＳ疾患の処 置のためのかかる系の有用性の制限は以下の考察に基づく。（１）生理的キャリ ヤー蛋白は、効果的に作用せず、或いは全く非生理的薬物と作用しない。（２） たとえ作用が起きても、治療剤の輸送の速度がキャリヤーの輸送の速度により制 限されるであろう。

（３）脳毛細血管内皮細胞のどの治療、巨大分子を輸送する全体の能力は明らか に非常に低いので脳中のある薬物の治療レベルに達することができない。及び（ ４）治療巨大分子がそれらの性質により内皮細胞に入ると、それらは広い種類の 加水分解酵素を含むリソシームを含む全ての数の小器官に分配されるかも知れな い。これらの理由から、超細胞増加（ｔｒａｎｓｃｙｔｏｓｉｓ）に依存しない 薬物分配系を創造することは明らかに有利であろう。

編毛細血管内皮細胞間の堅い結合はＢＢＢの主要部分を構成するので、これらの 結合を修飾することの可能性が考えられた。ＢＢＢの堅い結合を含む堅い結合が 動脈内に投与された高浸透圧溶液により分離できることが判った。例えば１９８ ９年６月１日に発行されたポリイ等、ＷＯ８９１０４６６３は、脳遺伝物質に導 入する手段としてマミドール、アラビノース又はグリセロールの浸透圧液の動派 内投与によりＢＢＢの内皮間構造の浸透圧分離を開示する。同様に尿素の高浸透 圧溶液もＢＢＢを変えるのに用いられた（ボウマン、ビー、ディー、等、ペディ アトリック・リサーチ、１６：３３５Ａ（１９８２））。

７−フルオロウラシル（マクドネル、エル、エイ、等、キャンサー・リサーチ、 ３８：２９３０（１，９７８））、膜酵素による退化（ヴインセント、ビー、エ イ、等、エクスベリメンタル・アンド、モレキュラー・パソロジイ、４８：４０ ３（１９８８）：ディーナー、エッチ、エム、等、ジャーナル・オブ・イムノロ シイ、１３５：５３７（１９８５））、アルミニウム塩（ジクラー・ゼット、ラ イ８等、・イルゲス・メト、サイ、　、１１．２：１０９５（１９８４）、ヒス タミン（メイリック、ビイ、等、エクスベリメンタル・ラング・リサーチ、６： ＩＨｌ、９８４）、トロンポン（シフリンガーービルンボイン・エイ、等、ミク ロヴアスクラー・リサーチ、３６：２１６（１９８８）、フォルボールエステル （シバ・ケイ、等、エクスベリメンタル・セル・リサーチ、１７８：２３３（１ ９８８））、及び管腔陰性電荷の中和（ハート、エム　エム、ジャーナル・オブ ・ニューロバソロシイ・アンド・エクスベリメンタル・ニューロロジイ、４６： １４１（１９８７）ｔ４む、他の化学試薬が静脈内に投与されたとき内皮又は上 皮細胞堅結合を分離することが報告されている。

上で表示した様相は堅い結合を分離しこれによりＢＢＢの浸透性を高めるけれど も、それらの使用に付随する問題がそれらを望ましくなくする。例えば高浸透圧 溶液による動脈内注入は外科手術を含み、通常の基礎で繰り返す、二とができな い。さらに濃厚糖溶液は、無害ではないかも知れず、望ましくない副作用が考え られる。加えて、前述の化学試薬は慢性神経疾患の処置に有用でなく、堅い結合 へのそれらの作用は常に可逆的で、それらは全てそれ自身強い薬物であるので、 患者の健康を傷つける危険が常にある。例えば７−フルオロワラシルはピリミジ ン合成、従って、動物細胞における核酸生合成の強い阻害剤である。

従って、投与された薬物が一般循環から脳に達することができ、患者においてそ れら自身の望ましくは副作用を有しないため、ＢＢＢの堅い結合を一時的に及び 可逆的に分離する手段の重要な必要性が依然として存在する。

「細胞付着分子（ＣＡＭ）Ｊと集合的に言われるかかる付着に関与する蛋白（類 ）を修飾することによる細胞−細胞付着を分離する試みがなされた。１クラスの ＣＡＭは「カドヘリン」と呼ばれる。「カドへリン」は、はとんどの種類の哺乳 動物組織に見られ、Ｃａ２＋−依存細胞−細胞付着に関与すると思われるグリコ プロティンの科に当てはめられる名である（タケイチ、エム１、デヴエロツプメ ント、１０２＋５３９（１，９８８））。カドヘリンの３つのサブクラスが確認 された。

即ち、Ｅ−カドヘリン（内皮組織から）、Ｐ−カドヘリン（胎盤組織から）及び Ｎ−カドヘリン（神経組織から）である（ヨシターノロ、シー、等、デヴエロッ プメンタル・バイオロジイ、１０１　：］、　９（１，９８４）：ノーズ、エイ 、等、ジャーナル・オブ・セル・バイオロシイ、１０３：２６４９（１９８６） ；バッタ、ケイ、等、ネイチャー、３２０：４４７（１９８６））。

異なるカドヘリンが明らかに異なる分布パターンに存在する（タケイチ、ニー、 （１９８８）止揚）。種々の組織の内皮細胞中に独占的に分配されることが判っ たＥ−カドヘリン（バッタ、ケイ　等、プロシーディンゲス・オブ・ナショナル ・アカデミイ・オブ・サイエンス（ニーニスエイ）、８２：２７８９（１９８５ ＞；タケイチ、１９８８、止揚）は、ウヴオモルリン（ヒアフィル、エフ、等、 セル、２１：９２７（１９８６））、ニワトリ肝細胞付着分子（Ｌ　−ＣＡＭ、 ガリン、ダブリユウ、ンエイ３等、プロシーディンゲス・オブ・ナショナル・ア カデミイ・オブ・サイエンス（ニーニスエイ）、８０：１０３８（１９８３）） 及び生化学性質の用語における（クニングハム、ビー、エイ、等、プロシーディ ンゲス・オブ・ナショナル・アカデミイ・オブ・サイエンス（ニーニスエイ）、 ８１：５７８７（１，９８４））細胞−ＣＡＭＩ２０／８０（ダムスキイ、シー 、エッチ、等、セル、３４：４５５（１９８３））、及び組織分布（シーシイ、 ジェイ、−ビイ。

等、デヴエロップメンタル・バイオロジイ、１０２：６１．（１９８４））に同 一のようである。

星細胞を含む種々の神経組織に発現するＮ−カドヘリン（）１ツタ、ケイ、等、 デヴエロップメンタル・バイオロジイ、１２０：２１５（１９８７）：マツネガ 、エム、等、ネイチャー、３３４：６２（１９８８）、トマセリ、ケイ、ジエイ １、ニューロン、１　：３３（１９８８））は、哺乳動物及びニワトリ相同物の 間の９２％アミノ酸配列相同を示し、同一種の上皮Ｅ・カドヘリン及び胎盤Ｐ− カドヘリンに４０から５０％類似を示すが、同−動物内で他のカドヘリンと免疫 的に交叉反応性がなかった（ミャタニ、ニス、サイエンス、２４５：６３Ｈ１９ ８９））。

胎盤Ｐ−カドヘリンは又、クローンされ、このグリコプロティンの推定アミノ酸 配列は、上皮Ｅ−カドヘリンと約５８％相同を示すことが判った（ノーズ、エイ 　等、エンポジャーナル・１２：３６５５（１９８７））。

親出願の１９８９年９月２７日出願に続いて、ヘイマーク等（ヘイマーク、アー ル　エル、等、ジャーナル・オブ・セル・バイオロジイ、１１０：１７４５（１ ９９０））は、大動脈内皮細胞内のＣａ”−依存細胞−細胞付着分子の同定につ いて報告した。

前に挙げたカドヘリンの各はユニークな免疫及び組織分布細目を示すけれども、 全ては共通の特性を有する。（１）細胞付着機能に対するＣａ２＋の要求、（２ ）蛋白分解切断からＣａ”による保護、（３）アミノ酸の類似の数、即ち約７２ ３から約８２２、（４）類似の大きさ、即ちグリコプロティン対し約１２４Ｋｄ ａ１．　、（５）それらが遺伝子家族を構成することを示唆している（ノーズ、 エイ、１９８７：ミイシスニ・ディ、等、１９８９）。蛋白の細胞質部分におい て、約５６％ないし９９％に増加している種間類似点を伴う本質的種間（５０％ −６０％）全体配列類似点、及び（６）作用の共通機構、即ち、一つの細胞への カドヘリンの隣接細胞への類似カドヘリンへの同種親和性結合。

Ｃａ２“と関係のないＣＡ、Ｍｓも、又、知られている。例えば、ウルシハラ等 の１２５グリコプロテイン（ウルシハラ、エッチ、等、セル、２０・３６３（１ ９８０））；Ｎ−ＣＡＭ（ルチシャウサー、ニー１、ネイチャー、ロンド、　、 ３１０：５４９（１９８４））：Ｎｇ−ＣＡＭ（グルネット、エム、等、プロシ ーディング・オブ・ナショナル・アカデミイ・オブ・サイエンス（ニーニスエイ ）、８１ニア９８９（１９８４））：Ｌｌ（ラスジエン、エフ、シイ、等　ジエ イ、　、３：１（１９８４））：Ｇ４（ラスジエン、エフ、シイ、等、ジャーナ ル・オブ・セル・バイオロジイ、１０４：３４３（ｉ９８７）及び血小板グリコ プロティンＰＥＣＡＭ−１（ＣＤ３１Ｘ二ニーマン、ビー、ジエイ９、サイエン ス、２４７：１２１９（１９９０））。Ｃａ”−独立ＣＡＭｓはＣａ２−依存Ｃ ＡＭｓのある性質を示すことが知られる。即ち、Ｎ−ＣＡＭ及びＮカドヘリンは 共に星細胞上にュゲバウアー、ケイ、エム、等、ジャーナル・オブ・セル・バイ オロジイ、１０７：１１７７（１９８５））及びシュワン細胞上（ビクスバイ、 ジエイ、エル、等、ジャーナル・オブ・セル・バイオロジイ、１０７：３５３（ １９８８））レチナール神経成長を促進する。

上皮Ｅ−型カドヘリン、例えばウヴオモルリンに対して作られたモノクローナル 抗体は、胚細胞、培養された奇形癌細胞、肝細胞及びＭＤＣＫ腎臓上皮細胞を含 む幾つかの細胞型の付着を分離することが知られる（オゴウ、ニス、−アイ、等 、ジャーナル・オブ・セル・バイオロジイ、９７：９４４（１９８３）：ヨシダ ーノロ、等、（１９８４）、止揚：シラヨシ、ライ１等、セル・ストラクト、フ ァンクト、　、１１：２８５（１９８６）；ガリン０等、（１９８３）、止揚： ヴエストウエバー、ディ、等、エンポ・ジャーナル、４：３３９３（１９８５） ；ジョンソン、エム、エッチ、等、ジャーナル・オブ・エンブロロジイ・アンド ・エクスペリメンタル・モルフオロジイ、９３：２３９（１９８６）；ガンビナ −、ビイ、等、ジャーナル・オブ・セル・バイオロジイ、１０２：４５７（１９ ８６））。

しかしながら、親出願に開示された本発見の前に、カドヘリンは胴上細血管又は 他の内皮細胞内に見出されなかった（タケイチ等、（１９８８）止揚参照）。さ らに微細血管内皮細胞のＣＡＭｓは確認されていないし、かかる分子が編毛細血 管内皮細胞に特異的に局在することも確認されていない。従って本発明まで、Ｂ ＢＨのそれらを含む、堅い結合形成及び維持に関与するかかる細胞のＣＡＭｓ− ”、の攻撃に基づいた、微細血管内皮細胞間の堅い結合を一時的に及び可逆的に 分離するための方法は知られていない。

カドヘリンが共通の細胞付着認識（ＣＡＲ）配列を含むことは仮定されて来た。

幾つかの細胞のＣＡＲ配列及び基層付着分子は知られている。マーチン、ジー、 アール、等、アン、レヴ、セル・パイオル、　、３：５７（１９８７）：ルオス ラーチ、イー、等、サイエンス、２３８：４９１（１９８７）。一般にＣＡＲ配 列は少なくとも３つのアミノ酸残基から構成される。最も厳格に研究されたＣＡ Ｒ配列は、ラミニン、フリプロネクチン及び細胞の基層への結合に関与する他の 基底膜成分中に見出されるＲＧＤである。

本出願の出願に続いて発行されるべき刊行物において、プラスチャック等は（プ ラスチャック、ポウ１等、ジャーナル・オブ・モレキュラー・バイオロジイ、投 稿中（１９９０））、肝臓ＣＡＭ、Ｅ−１Ｐ−及びＮ−カドヘリンの第一細胞外 部分における２つの潜在的カドヘリンＣＡＲ配列即ち、ＰＰＩ、ＣＡＤ及びＨＡ Ｖの存在を開示する。プラスチャック等（プラスチャック、オウ９等、デヴエロ ップメンタル・バイオロジイ、１３９：２２７（１９９０））は、又、最近、Ｈ ＡＶ配列を含んでいる合成ペプチドがカドヘリンにより仲介されることが知られ ている２つの生物学的方法（８−細胞一段階マウス胎児の圧縮及び星細胞上での 神経成長の速度）を阻害したことを開示した。これらのアッセーにおける有効な ペプチドはＬＲＡＨＡＶＤＶＮＧ及びＡＨＡＶＳＥである。ＰＰｌ−含有ペプチ ドは効果がなかった。しかしながら、プラスチャック等は、細胞−細胞付着に対 して重要であるＨＡ、Ｖトリペプチドの側面に位置する部分を測定するための手 引きを与えない。以下に詳細に述べる本発明のペプチドを分離するＢＢＢにおい て、我々は小さなカドヘリン誘導ペプチドにおけるＨＡＶ配列の単なる存在は細 胞−細胞付着を防止するのに有効な組成物に対して必須のものでないことを観察 した。実際、プラスチャック等も他のいかなる発表も、本発明者等がＨＡＶ又は Ｓ　ＨＡ　Ｖ　Ｓ配列を含むカドヘリン配列が堅い結合を開き又、転機細血管内 皮細胞においてＥ−カドヘリンにより形成された血液脳陳壁を貫通するのに有効 であることを示唆することを知らない。

発明の要約 カドヘリン細胞付着分子に同種で免疫的に関連する分子が脳及び非脳微細血管内 皮細胞に存在し、かかる内皮細胞間の結合が、かかる細胞への結合のためにかか る細胞付着分子と競合するポリペプチド及び抗体組成物の使用により治療薬物の 通過を許すよう可逆的に開かれることが発見された。

従って本発明の目的は、微細血管内皮細胞付着分子の同一性を提供することであ る。

本発明の他の目的は、全ての、又は微細血管内皮細胞付着分子の細胞結合部分の 発現をコードする、遺伝子及び同一物を含むプラスミドのＤＮＡ配列を提供する ことである。

本発明のさらに他の目的は、隣接する内皮細胞の堅い結合に関与する細胞付着分 子のこれらの配列を確認する方法を提供することである。

次の目的は細胞−細胞付着を可逆的に分離する細胞付着分子から誘導されるポリ ペプチドを含む治療組成物を提供することである。

本発明のさらに他の目的は、内皮細胞−細胞付着を可逆的に分離する、内皮細胞 付着分子に対して、又はその部に結合する細胞を表現するポリペプチドに対して 作られたポリクローナル又はモノクローナル或いはその断片を含む治療組成物を 提供することである。

本発明のもっと別の目的は、中枢神経系に入り血液−脳障害の分離を可能にする 本発明の血液−脳障害−分離組成物と接合した治療薬物を含む治療製剤を提供す ることである。

本発明のこれらの及び他の目的は、本発明の以下の記載及び添付の請求の範囲を 引用することにより明らかとなる。

図面の説明 図１は、ニワトリＮ−カドヘリンと同種のウシ内皮細胞付着分子に対する部分ｃ ＤＮＡ配列を示す。

図２は、マウスＰ−カドヘリンと同種のウシ内皮細胞付着分子に対する部分ｃＤ ＮＡ配列を示す。

図３は、マウスピーカドへリンと同種のＭＤＣＫ細胞付着分子に対するｃＤＮＡ 配列を示す。

図４は、ウシ内皮細胞Ｎ−（４−１ないし４−５）及びＰ−カドヘリンＣ４−６ ないし４−８）ｃＤＮＡ配列における、及びＭＤＣＫＥ−カドヘリン（４−９な いし４−１４）ｃＤＮＡ配列における制限部位を示す。

図５は、ＨＡＶ部分を含むＭＤＣＫ　Ｅ−カドヘリンのアミノ酸９−９６から誘 導される溶解蛋白に対して作られた抗体によるマウス脳博部分の染色を示す。

図６は、抗体が全体のＥ−カドヘリン分子に対して作られた場合を除き、図５の 実験の繰り返しである。

図７は、ＭＤＣＫ内皮細胞の堅い結合単層の抵抗上の１８−ｍｅｒＨＡＶ−含有 ポリペプチドの効果を示す。

図８は、堅い結合単層ＭＤＣＫ内皮細胞の抵抗上の１１−ｍｅｒ及び１８−ｍｅ ｒＨＡ　Ｖ−含有ポリペプチドの効果を示す。

図９は、転機細血管内皮細胞の堅−結合単層の抵抗上の１ト１ｅｒ及び１８−ｍ ｅｒＨＡＶ−含有ポリペプチドの効果を示す。

発明の詳細な説明 カドヘリンの特質を有する細胞付着分子が編毛細血管内皮細胞の及び非脳由来の 微細血管内皮細胞の表面に存在することが発見された。本発明は、内皮細胞付着 分子の細胞結合部分を含むポリペプチド組成物がかかる細胞への結合するためか かる分子に対して競合しうろこと、この方法によりかかる細胞間の結合が可逆的 に開き、これにより治療、試薬による通過が認められることの発見に基づく。

本発明は又、内皮細胞付着分子又はその細胞−結合部分に対して作られたポリク ローナル又はモノクローナル抗体（或いはその断片）が、又、内皮細胞表面結合 部位と競合し、この方法により、内皮細胞間の結合が可逆的に分離され、これに より治療試薬の中枢神経系への侵入が認められることを開示する。

微細血管内皮細胞間の堅い結合を分離するのに有効な組成物を得るために、かか る結合に関与する細胞付着分子が確認された。

ここに開示された内皮細胞カドヘリンは、Ｅ−１Ｐ−及びＮ−カドヘリンのいく つかの特質の−又はそれ以上を示し、細胞質、疎水性形質膜及び細胞外部分を伴 う膜内外細胞膜内蛋白、全分子に対し約５０％より大の棟内ＤＮＡ配列類似点、 非内皮細胞カドヘリンに対して作られた抗体との免疫交叉反応性、及び細胞−結 合ドメインを含む、特性を含む。「免疫的に関連する」はこれらのカドヘリン様 分子が非円皮細胞カドヘリンに対し作られた抗体と交叉反応することを意味する 。

Ｅ−カドヘリン様分子は免疫蛍光法により脳に局在した。マウス脳のクリオスタ ット部分はＥ−カドヘリンに対して作られたウサギ抗体で、次いでフルオレセイ ンインチオシアネート−接合ヤギ抗−ウサギ免疫グロブリンで標識した。免疫蛍 光性鏡検により示されるように脳部分において毛細管の明らかな標識がある。肝 臓及び腎臓における内皮細胞はこの方法により染まらなかった。

ウシ微細血管内皮細胞（ＢＭＥＣ）カドヘリンの発現をコードするｃＤＮＡｓは 以下に記載されるようにクローンされ、配列を決め、Ｎ−カドヘリン及びＰ−カ ドヘリンの部分配列は図１及び２にそれぞれ開示される。加えて、ＭＤＣＫイヌ 腎臓上皮細胞はＥ−カドヘリンを高抵抗堅結合を形成するのに使用することが知 られているので、又、本発明は胴上細管内皮細胞付着分子がＥ−型カドヘリンを 含むことを開示するので、このカドヘリンのＤＮＡも又、クローンした。

その完全なりＮＡ配列はここに（図３）開示される。

ここに記載されるＮ−１Ｐ−及びＥ−カドヘリン型クローンは、アメリカン・タ イプ・カルチャー・コレクションに１９８９年９月２６日に寄託され、以下の受 け入れ番号が付けられた。

クローン名称　受は入れ番号 Ｎ−カドヘリン型ツクロー ンＵｃ１９−ｂＮＣａｄ　ＩＯＡ　４０６６７ｐＵｃ１９−ｂＮＣａｄ　３９Ａ 　４０６６９Ｐ−カドヘリン型クローン ｐＵｃ１８−ｂＰＣａｄ　３Ｂ−１０４０６６８ｐＵｃ１９−ｂＰＣａｄ　９Ｂ 　４０６７０Ｅ−カドヘリン型クローン ｐＢ１ｕｅスクリプトＭＤＣＫＣａｄ　４５−３０Ｅ　４０６７１カドヘリンの クローニングは、今までのところ特徴づけられるカドヘリンが膜以外グリコプロ ティンであり、その細胞質内ドメインは高度に保存され、即ち高度に同種である という事実の利点を取ることにより成し遂げられた。

細胞内ドメインにおける４２−アミノ酸コード付は部分に隣接する２つの退歩オ リゴヌクレオチドが鋳型としてＢＭＥＣｃＤＮ、Ａ又はＭＤＣＫｅＤＮ、＝〜を 用いるポリメラーゼ鎖反応（ＤＣＲ）に刻するプライヤーとして役立つよう選択 された。ＰＣＲ反応は本質的にサイキ、アール、ケイ、等、サイエンス、２３９ ・４８７（１９８８）に従って実施した。これを引用して明細書記載の一部とす る。

各細胞型からのクローンされたＰＣＲ生成物は、本質的にサンガー、エフ、等、 プロシーデインダス・オブ・ナショナル・アカデミーイ・オブ・サイエンス（ニ ーニスエイ）、７４：５４６３（１９７７）の方法に従って配列が定められ、こ れを引用して明細書記載の一部とする。

ＢＭＥＣカドヘリンが２つの型である−一つはニワトリＮ−カドへリンにニーロ ン型、例えばバッタ、ケイ、等、ジャーナル・オブ・セル・バイオロジ付０６： ８７３（１９８８）参照）に同種で他は、マウスＰ−カドヘリン（胎盤型、例え ばノーズ、エイ、等、（１９８７）上掲）参照）に同種−ことが発見された。Ｍ ＤＣＫ細胞中細胞種のカドヘリンー一つはマウスＥ−カド入リン（例えばナガフ チ、エイ、等、ネイチャー、３２９：３４Ｈ１９８７）参照）に同種で他はマウ スＰ−カド／＼リン（ノース、等、（１９８７）、上掲に同種−があることも見 い出された。

ＰＣＲ生成物は次いて以下のようにＢＭＥＣ及びＭＤＣＫカドヘリンｃ　Ｉ）　 Ｎ　Ａを分離するためのプローブとして用いた。ＣＤＮＡライブラリィは、ＢＭ ＥＣ又はＭＤＣＫ細胞から分離されたポリ（Ａ）ＲＮＡを用い、本質的にグブラ ー等（グブラー、ニー、等、ジーン、２５：２６３（１９８３）、これを引用し て明細書記載の一部とする）に従って構成した。ｃＤＮＡは、ＥｃｏＲｌ、Ｉア ダプターによりｇｔｌＯ腕（ＢＭＥＣ）又はＺＡＰＲ（ストラタジン、インコー ホレーテッド、う・ジョラ、カリフォルニアからベクター腕（ＭＤＣＫ）に連結 された。５Ｘ１０５−１．．５Ｘ１０’独立ｃＤＮＡクローンを含んでいるＣＤ ＮＡライブラリィを放射標識ｐＣＲ生成物（ベントン、ダブリュ。

ディ　等、サイエンス、１９６：１８０（１９８７）、これを引用して明細書記 載の一部とする）を用いてスクリーン（、た。ノーザンプロット分析（マニウテ ィス、ティ　等、「モレキュラー・クローニングニア・ラボラトリイ・マニュア ル」、コールド・スプリング・ハーバ−・ラボラトリイ、コールド、スプリング ・ハーバ−、ニューヨーク、１９８２）は、クローンされた各ｃＤＮＡ種が１１ −ｍＲＮＡ種にハイブリッド形成するかどうか、及び各ｃＤＮＡ種の組織分布を 測定するのに用いうる。

各カドヘリンに対するｃＤＮＡクローンは、上掲のサンガー等（１９７７）の方 法により配列決定された。

それらの配列に基づく各ｃＤＮＡクローンに対する部分制限地図は、図４に示さ れる。これらの制限部位のいくらかは、Ｎ−カドヘリン・に対するＨｉｎｄＩＩ Ｉ、Ｐｓｔｌ、ＫｐｎＩＳＢｇｌｌＩ：Ｐ−カドヘリンに対するＰｖｕＩ［，５ ａｅＩ及びＰｓｔＩ；Ｅ−カドヘリンに対するＰｓｔＩ、Ｐｖｕｌｌ、ＢａｍＨ Ｉ及び５ａｃＩを含む制限酵素分解により確認した。

クローンされたＥ−カドヘリンｃＤＮＡが、カドヘリン作用に必要な全ての情報 を含むかどうか試験するため、適当なプロモーターに連結した全長Ｅ−カドヘリ ンｃＤＮＡを非常に小さな内皮カドヘリン活性（ナガフチ、等（１９８７）上記 ）を有するマウスＬ−細胞に導入される。導入されたｃＤＮＡから誘導される形 質移入体（ｔｒａｎｓｆｅｃｔａｎｔ）におけるＥ−カドヘリンの発現を試験す るため、移入されたＬ−細胞がＣａ”−依存集合活性について試験される。この 集合活性の捏度は発現されたＥ−カドヘリ二ノの量とよく相関すべきである（タ ケイチ、エム　（１９８８）上記）。この同一技術はバッタ等の方法（バッタ、 ケイ、等（１９８８）上記）に従ってウシ内皮Ｎ−及びＰ−カドヘリンをコード 化するｃＤＮＡｓを試験するのに用いうる。

例えば、ＭＤＣＫ　Ｅ型カドヘリン中、ドメインを結合する細胞を確認するため に、Ｌ−細胞が上記のように形質移入体のＣａ”仲介集合を起こすのに十分な大 きさのｃＤＮＡで移入されうる。細胞外ドメインの異なる部分を失っている先を 切り取ったｃＤＮＡ種を含んでいる一連の欠失変異体は、制限、酵素分解及び好 ましい末端充足又はエキソヌクレアーゼ分解により調製され、好ましいコードづ け枠内で欠失をなす。これらの欠失変異体は、次いでＬ−細胞において、Ｃａ２ °依存集合を起こしている蛋白を発現するそれらの能力について試験できる。特 別の断片の欠失で集合の喪失を相関することにより、結合している細胞にとって 重要な部分が測定されつる。

カドヘリンの結合部分に対応する種々のポリペプチドは、欠失されたｃＤＮＡの ヌクレオチド配列から由来するとして、自動ペプチドシンセサイザー、例えばア プライド・バイオシステムズ・インコーホレーテッド、フォスターンティ、カリ ホルニアのそれを用いて化学的に合成され、或いは組換えＤＮＡ法により発現さ れうる。有効なポリペプチドは、分離されている結合の性質及び存在する細胞付 着分子に依存して長さを変えうる。

カドヘリンの、ヌクレオチド及び対応するアミノ酸配列は、対応の部分を検出す るのに分析されうる５にの技術をウシ内皮細胞Ｎ−及びＰ−カドヘリンに、及び 上皮細胞Ｅ−カドヘリンに適用して、我々は、これらのカドヘリンの各々のアミ ノ酸８０部分において、トリブレットＨＡＶ［Ｈｉｓ−Ａｌａ−Ｖａｉ）部分が 存在することを測定した。我々はこのＨＡＶ部分が共通細胞付着認識（ＣＡ、Ｒ ）配列でありうることを推定する。

我々は、以下のポリペプチドを化学的に合成した。その各々はＨＡＶ配列を含む 。

６　ｍｅｒ（７８−８３）　ＮＬ２−３ＨＡＶＳＳ−ＣＯＮＨｚｌｌ−ｍｅｒ（ ７６−８６）　ＮＬ２−ＬＹＳＨＡＶＳＳＮＧＮ−ＣＯＮＩ（２１７−ｍｅｒ（ ７４−９０）　ＮＬ−ＹＩＬＹＳＨＡＶＳＳＮＧＮＡＶＥＤ−ＣＯＮＨ２１８ｍ ｅｒ（６９−８６）　Ｎｌ３２−ＥＱＩ＾ＫＹＩＬＹＳＩ（ＡＶＳＳＮＧＮ−Ｃ ＯＮＨ２２０−ｍａｒ（７１−９０）　ＮＬ２−ＩＡＫＹＩＬＹＳＦＩＡＩ７Ｓ ＳＮＧＮＡＶＥＤ−ＣＯＮＨ２そして、同時係属米国出願番号第０７／４１３． ２７４号に開示されるＢＢＢモデルにおける脳内皮細胞堅結合、モして又、腎臓 上皮細胞堅結合の解放効力について各々を試験した。

ウサギに作られたポリクローナル抗体及びハイブリドーマから誘導されたモノク ローナル抗体は、標準方法による化学的に合成されたポリペプチドの各々に対し て産生されうる。（バーロウ、イー等、「アンチボディーズ：ア・ラボラトリイ ・マニュアル」、コールド・スプリング・ハーバ−・ラボラトリイ・プレス、コ ールド・スフリング・ハーバ−、ニューヨーク、１９８８；ゴーディング、ジエ イ、ダブリュ、「モノクローナル・アンチボデイズ、プリンシプルズ・アンド・ プラクチス」、アカデミツク・プレス、ニューヨーク１．９８６）。加えて、組 換え抗体が調製されうる。抗体の断片、例えばＦ　ｃ、　Ｆ　ａｂ、　Ｆ　（ａ ｂ）’が標準方法により調製されつる。

我々はＨＡＶ部分を含むＭＤＣＫ　Ｅ−カドヘリンのアミノ酸９−９６から誘導 された融合蛋白をクローン化し、配列決定した。この融合蛋白に対して調製され たポリクローナル抗体はう・ソト（図５５）、マウス脳部分を染め、又、全Ｅ− カドヘリンに対して作られた抗体（図６）も染めた。アミノ酸９−３７から誘導 された融合蛋白に対して作られたポリクローナル抗体は脳部分を染めなかった。

これらの結果は、Ｅ−カドヘリンのキイ細胞−結合ドメインはアミノ酸３７−９ ６の部分にあることを示す。

堅い結合を分離するため、本発明の細胞−結合ドメインを含んでいるＣＡＭ誘導 ポリペプチド並びに対応ポリクローナル及びモノクローナル抗体の能力を、高抵 抗堅結合のインビトロ及びインビボモデルで、並びに動物モデルで試験しうる。

高抵抗堅結合を含むことが知られている（タンビナー、ビー、ジャーナル・オブ ・セル・バイオロシイ、１０２：４５７（１９８６））ＭＤＣＫイヌ腎臓上皮細 胞の単層は、かかる堅結合を分離するため本発明のポリペプチド及び対応抗体の 能力について試験するのに用いうる。

上記のように調製されたポリクローナル抗体は、又、組織抽出物における細胞付 着グリコプロティンを確認するためにウェスタンブロッティング（オールド、ア ール、ダブリュ１等、プリンシブルス・オブ・ジーン・マニブレイション、サー ド、エディジョン、ブラックウェル、オフスフオード、１９８５．１０頁）及び 種々の組織抽出物と共同して用いうる。

本発明の他の実施態様は、ドラッグ・デリバリイ・システムにある。厘毛細血管 内皮細胞における細胞付着分子作用に影響を及ぼす治療薬物と試薬の間の抱合体 は治療薬物をＣＮＳに伝えるのに用いうる。例えば、そのアミノ酸配列内に細胞 〜結合ド、メイン又はそれへの抗体を含む細胞付着分子から誘導されたポリペプ チドは、生物学的に活性形で治療様式に接合しつる。かかる１合は、ＢＢＢを開 くことと治療試薬をＢＢＢの胴側に分配することの二重の効果を有し２うる。治 療薬物のＣＮＳへの分配は、単独で又は、細胞−細胞付着を分離する試薬と接合 し、て、ＢＢＢの堅い結合を分離する本発明の試薬の投与と同時に、又は投与に 続いて患者にかかる薬物を投与することにより達成しうる。本発明の細胞付着分 離組成物により脳に分配されうる治療様式は、神経成長因子、抗パーキンソン症 候群薬物、スフィンゴリピド症、例えばティ・サック病をさけることが知られて いる脳酵素を含む。蛋白又はポリペプチドキャリヤーを、治療試薬の生物学的統 合性が危くされず、又、治療試薬が内皮細胞上又は内に存在する酵素（例えば、 アミダーゼ、エステラーゼ、ノスルフィド切断酵素）によりキャリヤーから容易 に切断される治療試薬昏こ化学的に接合する手段はこの分野においてよ（知られ る。、これらの治療抱合体が被膜に包まれた形で（例えばリポソームで）又は、 薬理学的賦形剤により安定化された微細＠濁として内皮細胞に分配されうるＪと も明らかである。多くの固体腫瘍が、高圧地帯及び崩壊した血管４含む、血液− 輸送（ｂｌｏｏｄ−ｂｏｒｎｅ）化学療法試薬が腫瘍の内側コアに達するのを困 難にする内部障壁を発達させることが知られる（−／アイン、アール　ケイ１、 ジャーナル・オブ・大ショナル・キャリヤー・インスチチュート、８に５７０（ １９８９）。障壁問題はヒト免疫系から得られる治療生成物、例えば化学療法試 薬、インターロイキン−２、インターフェロン及び活性キラーニーリンパ球と接 合したギノクローナル抗体でそれらの大きな形から特に面倒である。従って、本 発明の他の実施態様において、内皮細胞、特に細胞付着巨大分子の−又はそれ以 上の細胞−結合部分を含む比較的小さなペプチド間の結合を分離する組成物が、 減圧血流で薬物を腫瘍に分配するのを増強するのに用いうる。

癌細胞が溶解カドヘリンを色々に分泌することにより転移し、それらの運動をブ ロックする細胞において堅い結合を開き、かかる細胞へのそれらの結合を防止す るという学説が立てられた。我々は、本発明で開示されたカドヘリンの細胞外ド メインから誘導される、これらのカドヘリンに対して作られた抗体が、癌細胞転 移を阻害し又は防止する治療様式を提供するように考える。

他の実施態様において、本発明の組成物は、又、他のよく知ら第１た血液−組織 障壁、例えば血液−精巣及び血液−網Ｍ障壁の化学療法試薬に対する通過を与え るのに用いつる。後者の障壁は、例えば、一般循環から網膜への投与された抗生 物質の効果的輸送を防止することが知られる。従って、本発明の細胞付着分離組 成物は、網膜感染を処置するため抗生物質の投与と共同して用いつる。

以下の実施例は本発明の幾つかの実施態様をホすが、未発明は、請求の範囲に列 挙されたものに限ると解すべきで１：い１、実施例Ｉ ＭＤｃＫ上皮及びウシ内皮細胞の堅い結合上のＨＡ　Ｖ含有ポリペプチドの効果 同時係属米国出願第０７／４１３．３３２号のＢＢＢモデルを単層を横切って抵 抗測定により測定されるようにＭＤＣＫ上皮細胞及びウシ毛細血管内皮細胞の単 層の堅い結合上のＨＡＶ部分を含んでいるポリペプチド効果を試験するのに用い た。

以下の略図に示すように、ポリペプチドを頂点側（トップ）又は基底外側（底） のいずれかの細胞に加えた。

脇側　血液側 血液側　脇側 基底外側の 図７は、Ｍ　Ｄ　ＣＫ−に：皮細胞の抵抗に対し二種々の濃度の先に述べた１８ −ｍｅｒポリペプチドの効果を示す３、試験した最低濃度、０５１１ｇ／ｌｏｌ で、抵抗は顕著に下がった。ポリペプチドは１．基底外側から加えられたとき、 より有効であったが、高濃度では頂へ側から加えられたときでも非常に有効であ った。これらのデータは、１８−ｍｅｒが堅い結合を透過性にするのに有効であ ることを示す。２０−ｍｅｒは同様に有効であり、１７−ｍｅｒは有効でない。

図８は、単層の頂点側又は基底外側から与えた場合のＭＤＣＫ細胞抵抗への前述 の１１−ｍｅｒ及び１８−ｍｅｒの効果を示す。ポリペプチドの濃度は約１ｍｇ ／ｍｌであった。ｌ　ｌ　−ｍｅｒは（６−ｍａｒも同様、データ示さず）事実 上効果がなかった。］。８−ｍｅｒでは、抵抗は約６時間でほとんど全面的にな くなり、堅い結合の分離を示す。１８−ｍｅｒの効果が、可逆性であることは、 「決壊（ｗａｓｈ−ｏｕｔ）Ｊ実験により示される。１３−ｍｅｒかせ６時間で Ｍ　Ｄ　ＣＫ細胞を破壊した場合、抵抗は、次の２１時間にわたり実質的範囲に 回復した。この回復は、１８−ｍｅｒが単層の基底外側からもともと加えられた 場合、特にはっきりした。生成された２’Ｏｍｅｒは１８−ｍｅｒのそれらと類 似の結果になり、１７−ｍａｒは有効であったが幾らか少なかった。

図９は脳内皮細胞の高抵抗単層培養に対する１ｍｇ／ｍｌのｌｌ−ｍｅｒ及び１ ３−ｍｅｒの効果を示す（製造方法について同時係属米国出願番号第０７／４１ ３．３３２号参照）。ＭＤＣＫ細胞でｌ　ｌ　−ｍｅｒ（及び６−ｍｅｒ）は、 ４８時間の観察にわたり抵抗値を減じなかった。これに対し、１８−ｍｅｒ（同 様に２０−ｍｅｒ）は基底外側又は頂点側から加えた場合、抵抗値を顕著に減じ たが、ポリペプチドの効果は、それを基底外側から加えた場合、より速やかでよ りはっきりした。１７−ｍｅｒは効果はなかった。

これらの実験の結論は、Ｅ−カドヘリンのＨＡＶ部分を中心に囲む特殊なｄ、（ ｓｅｔ）のペプチド（全てのペプチドではない）は、脳内皮細胞血液−脳障の又 、かかる結合を形成する内皮細胞（ガツト障害」）の堅い結合を開くのに有効で あることである。ＨＡＶトリブレットに隣接するアミノ酸部分の長さと組成はか かる組成の効力において側段を演じているようである。

前述の実施態様は本発明の好ましい実施態様を示すものであるがこの分野の当業 者は、不適当な実験でな（、明細書に固有の概念及び精神から逸脱することなく 本発明の組成物及び方法の他の実施を工夫しつる。

ｌ〕 一〇 」〕 Ｃ’Ｊ °０ ｒｏ −〇 寸 寸 存 寸 寸 寸 寸 寸 口 寸 寸 Ｏ− 寸 寸 寸 寸 寸 〉 寸 寸 ＦＩＧ、５゜ ＦＩＧ、６゜ 抵抗（オーム） 抵抗（コントロールの％） 抵抗（オーム） ■ 国際調査報告 ｔ＋ｒＴ／Ｌ；５９ｎ１０５１ｎ５ Ｌｔｒａｒ：ｈｍｅｎｔ　ＴＩＩＰＣ”Ｉ！Ａ’ＺＩＯｎｂｓ＝ｒｖａｔｊＱｎ ｑ　Ｗｌｌｅｒ＃　Ｕｎｉｔ＞　０（ｒｎ％’ｅｎｅｉ１＋１　τｓ　Ｌａ＋： ｋｉｎｇＰ（Ｔ／τ８９０／Ｑ５ｔｎ５ Ａｔｔａｒｈｍｅｎｔ　ＴＩ＋　ＰＣＴ／ＩｓυＺｋＯｎａ＋、ｑｉｌｒａ＋Ｉ 　Ｒ＊ａ＋ｐ＋ｎｎｓ　Ｆｎｒ　Ｈ＋＋ＩＣ！ｉｎｇ　１４９；　ｎ［ｔ’ｎ１ ｔ）　０１　Ｔｎ〜ｑＯｔ４６ｎＨ

Claims (65)

【特許請求の範囲】
1. １．患者の微細血管内皮細胞間の堅い結合を開く組成物であって、それによりか かる結合により課せられた浸透性障壁を通過するために薬物に手段が供給される ものであり、それがなければ微細血管内皮細胞間の堅い結合形成を仲介する少な くとも一つの型の細胞結合細胞付着分子と反応しそれにより細胞−細胞付着が分 離される試薬を含む。
2. ２．該細胞付着分子が、Ｅ−カドヘリン、Ｎ−カドヘリン及びＰ−カドヘリンか らなる群から選ばれたカドヘリンと少なくとも約５０％配列類似性を示す請求項 １の組成物。
3. ３．該細胞付着分子がＥ−カドヘリン、Ｎ−カドヘリン及びＰ−カドヘリンから なる群の少なくとも一つと免疫的に関連する請求項１の組成物。
4. ４．微細血管内皮細胞が脳毛細血管内皮細胞である請求項１の組成物。
5. ５．該試薬が該細胞付着分子の細胞への結合の阻害剤を含む請求項２の組成物。
6. ６．該試薬が該細胞付着分子の細胞への結合の阻害剤を含む請求項３の組成物。
7. ７．該阻害剤試薬が該細胞付着分子の断片を含む請求項５の組成物。
8. ８．該細胞付着分子断片がそのアミノ酸配列内に細胞−結合ドメインを含む請求 項７の組成物。
9. ９．該細胞−結合ドメインがＨＡＶアミノ酸配列を含む請求項８の組成物。
10. １０．該アミノ酸配列が 【配列があります】 である請求項９の組成物。
11. １１．該アミノ酸配列が 【配列があります】 である請求項９の組成物。
12. １２．該アミノ酸配列が 【配列があります】 である請求項９の組成物。
13. １３．該アミノ酸配列がＥ−カドヘリンのアミノ酸９−９６を含む請求項９の組 成物。
14. １４．該阻害剤試薬が該細胞付着分子に対して作られたポリクローナル又はモノ クローナル抗体を含む請求項５の組成物。
15. １５．該阻害剤試薬が該細胞付着分子の断片に対して作られたポリクローナル又 はモノクローナル抗体を含む請求項５の組成物。
16. １６．該細胞付着分子断片がそのアミノ酸−結合ドメイン内に細胞−結合ドメイ ンを含む、請求項１５の組成物。
17. １７．該細胞−結合ドメインがＨＡＶアミノ酸配列を含む請求項１６の組成物。
18. １８．該アミノ酸配列が 【配列があります】 である請求項１７の組成物。
19. １９．該アミノ酸配列が 【配列があります】 である請求項１７の組成物。
20. ２０．該アミノ酸配列が 【配列があります】 である請求項１７の組成物。
21. ２１．該アミノ酸配列がＥ−カドヘリンのアミノ酸９−９６を含む請求項１７の 組成物。
22. ２２．製薬的に許容しうる伝播体内における請求項５又は６の組成物。
23. ２３．患者の微細血管内皮細胞間の堅い結合を開く方法であって、有効量、且つ 製薬的に許容しうる伝播体中、それがなければ微細血管内皮細胞間の堅い結合形 成を仲介する少なくとも一つの型の細胞−結合細胞付着分子を反応し、これによ り細胞−細胞付着が分離され、かかる堅い結合により課せられた浸透性障壁を通 過するために薬物に手段が供給される試薬を患者に投与する段階を含む。
24. ２４．該細胞付着分子がＥ−カドヘリン、Ｎ−カドヘリン及びＰ−カドヘリンか らなる群から選ばれたカドヘリンと少なくとも約５０％類似性を示す請求項２３ の方法。
25. ２５．該細胞付着分子がＥ−カドヘリン、Ｎ−カドヘリン及びＰ−カドヘリンか らなる群の少なくとも一つと免疫的に関連する請求項２３の方法。
26. ２６．微細血管内皮細胞が脳毛細血管内皮細胞である請求項２３の方法。
27. ２７．該試薬が該細胞付着分子の細胞への結合の阻害剤を含む請求項２３−２５ のいずれか一つの方法。
28. ２８．該阻害剤試薬が該細胞付着分子の断片を含む請求項２７の方法。
29. ２９．該細胞付着分子断片がそのアミノ酸配列内に細胞−結合ドメインを含む請 求項２８の方法。
30. ３０．該細胞−結合ドメインがＨＡＶアミノ酸配列を含む請求項２９の方法。
31. ３１．該アミノ酸配列が 【配列があります】 である請求項３０の組成物。
32. ３２．該アミノ酸配列が 【配列があります】 である請求項３０の組成物。
33. ３３．該アミノ酸配列が 【配列があります】 である請求項３０の方法。
34. ３４．該アミノ酸配列がＥ−カドヘリンのアミノ酸９−９６を含む請求項３０の 方法。
35. ３５．該阻害剤試薬が該細胞付着分子に対して作られたポリクローナル又はモノ クローナル抗体を含む請求項２７の方法。
36. ３６．該阻害剤試薬が該細胞付着分子に対して作られたポリクローナル又はモノ クローナル抗体を含む請求項２８の方法。
37. ３７．該細胞付着断片がそのアミノ酸配列内に細胞−結合ドメインを含む請求項 ３６の方法。
38. ３８．該細胞−結合ドメインがＨＡＶアミノ酸配列を含む請求項３７の方法。
39. ３９．該アミノ酸配列が 【配列があります】 である請求項３８の方法。
40. ４０．該アミノ酸配列が 【配列があります】 である請求項３８の組成物。
41. ４１．該アミノ酸配列が 【配列があります】 である請求項３８の方法。
42. ４２．該アミノ酸配列がＥ−カドヘリンのアミノ酸９−９６を含む請求項３８の 方法。
43. ４３．治療薬物と、それがなければ微細血管内皮細胞間の堅い結合形式を仲介す る少なくとも一つの型の細胞−結合細胞付着分子と反応し、細胞−細胞付着は該 試薬により分離され、それにより製薬上許容しうる伝播体内でかかる堅い結合に より課せられた浸透性障壁を通過するため該薬物に手段が供給される試薬との間 の結合体を含む薬物デリバリー組成物。
44. ４４．該細胞付着分子がＥ−カドヘリン、Ｎ−カドヘリン及びＰ−カドヘリンが 選ばれたカドヘリンと少なくとも約５０％類似性を示す請求項４３の薬物デリバ リー組成物。
45. ４５．該細胞付着分子のＥ−カドヘリン、Ｎ−カドヘリン及びＰ−カドヘリンよ りなる群の少なくとも一つと免疫的に関連する請求項４３の薬物デリバリー組成 物。
46. ４６．微細血管内皮細胞が脳毛細血管内皮細胞である請求項４３の薬物デリバリ ー組成物。
47. ４７．該試薬が該細胞付着分子の細胞への結合の阻害剤を含む請求項４３−４５ のいずれか一つの薬物デリバリー組成物。
48. ４８．該試薬が該細胞付着分子の断片を含む請求項４７の薬物デリバリー組成物 。
49. ４９．該細胞付着分子断片がそのアミノ酸配列内に細胞−結合ドメインを含む請 求項４８の薬物デリバリー組成物。
50. ５０．該細胞−結合ドメインがＨＡＶアミノ酸配列を含む請求項４９の薬物デリ バリー組成物。
51. ５１．該アミノ酸配列が 【配列があります】 である請求項５０の薬物デリバリー組成物。
52. ５２．該アミノ酸配列が 【配列があります】 である請求項５０の薬物デリバリー組成物。
53. ５３．該アミノ酸配列が 【配列があります】 である請求項５０の薬物デリバリー組成物。
54. ５４．該アミノ酸配列がＥ−カドヘリンのアミノ酸９−９６を含む請求項５０の 薬物デリバリー組成物。
55. ５５．該阻害剤試薬が該細胞付着分子に対して作られたポリクローナル又はモノ クローナル抗体を含む請求項４３の薬物デリバリー組成物。
56. ５６．該阻害剤試薬が該細胞付着分子の断片に対して作られたポリクローナル又 はモノクローナル抗体を含む請求項４３の薬物デリバリー組成物。
57. ５７．該細胞付着分子断片がそのアミノ酸配列内に細胞−結合ドメインを含む請 求項５６の薬物デリバリー組成物。
58. ５８．該細胞−結合ドメインがＨＡＶアミノ酸配列を取り囲む請求項５６の薬物 デリバリー組成物。
59. ５９．該アミノ酸配列が 【配列があります】 である請求項５８の薬物デリバリー組成物。
60. ６０．該アミノ酸配列が 【配列があります】 である請求項５８の薬物デリバリー組成物。
61. ６１．該アミノ酸配列が 【配列があります】 である請求項５８の薬物デリバリー組成物。
62. ６２．該アミノ酸配列がＥ−カドヘリンのアミノ酸９−９６を含む請求項５８の 薬物デリバリー組成物。
63. ６３．該結合体が生理的に切断しうる共有結合を含む請求項４３の薬物デリバリ ー組成物。
64. ６４．該結合体が生理的に適合しうる粒子内に包まれる請求項４３の薬物デリバ リー組成物。
65. ６５．該粒子がリボソームを含む請求項６４の薬物デリバリー組成物。