ES2298229T3 - Medicamento para el tratamiento de enfermedades causadas por protozoos parasitos. - Google Patents
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Abstract
El uso de un inhibidor de CTP sintetasa, y una base de purina seleccionada a partir del grupo que consiste en adenina, guanina, citidina y/o hipoxantina y/o un nucleósido seleccionado a partir del grupo que consiste en adenosina, guanosina y/o inosina que suprime sus efectos tóxicos in vivo, en la fabricación de un medicamento para el tratamiento de una enfermedad causada por protozoos parásitos.
Description
Medicamento para el tratamiento de enfermedades
causadas por protozoos parásitos.
La presente invención se refiere a la
fabricación de un medicamento para el tratamiento de una enfermedad
causada por protozoos parásitos y a una composición farmacéutica
como tal.
Muchas enfermedades extendidas están causadas
por patógenos protozoarios, tales como la malaria, leishmaniasis y
tripanosomiasis. La última está causada por infecciones con especies
del género protozoario Tripanosoma. La tripanosomiasis americana, o
enfermedad de Chaga, están causadas por T. cruzi, que por lo
general es transmitido a los seres humanos por insectos triatominos
infectados, mientras que la tripanosomiasis africana, o la
enfermedad del sueño, está causada por infecciones de Trypanosoma
brucei rhodiense y T. b. gambiense. Más específicamente,
la enfermedad del sueño (para una revisión véase Brun, R. (1999)
Karger-Gazette 63, 5-7) es una
enfermedad devastadora que tiene su nombre por la condición comatosa
en la etapa final de la enfermedad. Sin tratamiento, el paciente
muere en un par de meses a varios años después de la infección. La
condición comatosa severa descrita ocurre cuando estos parásitos
principalmente estando difundidos en la corriente sanguínea invaden
después el sistema nervioso central.
T. brucei se extiende entre sus huéspedes
mamíferos por las moscas tsé-tsé. El parásito pasa a través de
muchas etapas diferentes del ciclo vital en el huésped mamífero así
como en la mosca (Vickerman, 1985). Cuando los tripanosomas entran
en un huésped mamífero por una picadura de mosca tsé-tsé, comienzan
a proliferar como formas delgadas alargadas de la corriente
sanguínea. Según la enfermedad progresa, cada vez más tripanosomas
son convertidos en formas cortas gruesas que son incapaces de
proliferar pero que, en contraste con las formas delgadas
alargadas, pueden ser transmitidas a una nueva mosca tsé-tsé. En la
mosca, los tripanosomas pasan a través de algunas otras etapas del
desarrollo antes de que sean pasados a un nuevo huésped
mamífero.
La mayor parte de los fármacos eficaces contra
T. brucei no cruzan la barrera sangre-cerebro
y son por lo tanto inútiles en cuanto los tripanosomas han invadido
el SNC. Actualmente, los únicos fármacos eficaces contra una
infección en la etapa tardía de T. brucei son la
difluorometilornitina (DFMO, por sus siglas en inglés) y compuestos
de arsénico, tales como el melarsoprol. Los compuestos de arsénico
tienen efectos secundarios severos y el paciente a menudo muere por
una encefalitis inducida por fármaco. La DFMO es menos tóxica, pero
muy cara para prepararla y es sólo eficaz contra T. b.
gambiense.
Para encontrar tratamientos alternativos, el
metabolismo de purina ha sido durante mucho tiempo un objeto
importante en el campo de los tripanosomas y organismos relacionados
(revisado en Hassan, H. F. y Coombs, G. H. (1988) FEMS
Microbiol. Rev. 54, 47-84). Se ha
establecido previamente que los tripanosomas carecen de la
capacidad de formar purinas de novo y que por lo tanto
necesitan hipoxantina, adenina o guanina que son recuperadas por
varias fosforribosiltransferasas. Cualquiera de estas tres bases es
fina ya que los tripanosomas, como la mayor parte de organismos,
tienen todas las enzimas necesarias para interconvertir IMP, AMP y
GMP. Los nucleósidos (adenosine, inosina y guanosina) también pueden
ser usados, pero por lo general son divididos en el azúcar y la
base antes de su recuperación (Pellé, R., Vern, L. S., Parkin, D. W.
(1998)
\hbox{ J. Biol. Chem . 273 ,
2118-2126 Proc. Am. Ass. Cancer Res .
22 , 352).}
Sin embargo, ha sido dirigida mucha menos
atención a la síntesis de pirimidinas en los tripanosomas (para una
revisión véase Hassan, H. F. y Coombs, G. H. (1988) FEMS
Microbiol. Rev. 54, 47-84). Se sabe que
T. brucei es capaz de hacer totalmente UTP de novo y
por la recuperación de uracilo. Ya que no hay ninguna información
de si T. brucei sintetiza CTP de novo o por la
recuperación de citidina o citosina, hasta ahora, no ha sido
posible desarrollar fármacos basados en el control de los niveles de
CTP.
De acuerdo con la presente invención, se ha
mostrado por primera vez que a diferencia de las células de
mamífero, los tripanosomas no tiene ningún ruta de recuperación
para la síntesis de CTP. En cambio, CTP sólo es sintetizado de
novo. Así, la invención se refiere al uso de un inhibidor de CTP
sintetasa y una purina descubierta seleccionada a partir del grupo
que consiste en adenina, guanina, citidina y/o hipoxantina y/o un
nucleósido seleccionado a partir del grupo que consiste en
adenosina, guanosina y/o inosina que suprime sus efectos tóxicos
in vivo en la fabricación de un medicamento para el
tratamiento de una enfermedad causada por cualesquiera protozoos
parásitos en los que CTP es sintetizado de novo por CTP
sintetasa. Preferiblemente, es usado un inhibidor de CTP sintetasa
en forma de un análogo de glutamina, donde el siguiente componente
puede ser usado para suprimir sus efectos tóxicos que pueden dañar
al paciente al que es administrado el medicamento. En consecuencia,
la presente invención proporciona por primera vez un medicamento no
tóxico y rentable.
La figura 1 muestra mezclas de NTP en T.
brucei en diferentes etapas del ciclo vital. En A), se muestran
todos los NTP mientras que en B), la región que muestra las mezclas
de CTP han sido ampliadas. Las muestras son de formas procíclicas
de la circulación sanguínea (PC), delgada alargada (DL), cortas
gruesas (CG) y cultivadas in vitro (C). La abreviatura para
cada etapa del ciclo vital (PC, DL, CG, C) es puesta más abajo en el
cuadro correspondiente en B) y el mismo orden de las muestras es
usado en A). Los valores son representados como relativo (en %)
respecto a la mezcla total de NTP (CTP+UTP+ATP+GTP).
La figura 2 muestra la incorporación del
marcador de tritio en CTP, UTP y ácidos nucleicos. En A), se muestra
la incorporación de tritio en UTP (triángulos) y CTP (cuadrados),
mientras que en B), se muestra la incorporación del marcador en
RNA+DNA (cuadrados) y sólo ADN (triángulos).
La figura 3 muestra las mezclas de CTP después
del tratamiento con varios inhibidores de CTP sintetasa durante 1
h. Se muestran muestras sin fármaco (control), con DON 25 y 100
\muM (DON25 y DON100, respectivamente), con acivicina 100 \muM
(Aci100) y con CPEC 25 \muM (CPEC25).
La figura 4 muestra el efecto de DON (A) y
acivicina (B) en la proliferación de tripanosomas. En A), los
tripanosomas fueron tratados sin fármaco (cuadrados), DON 1 \muM
(triángulos) o DON 5 \muM (diamantes). En B), los tripanosomas
fueron tratados sin fármaco (cuadrados rellenos), acivicina 1 \muM
(triángulos), acivicina 5 \muM (diamantes) o acivicina 25 \muM
(cuadrados vacíos).
La figura 5 muestra la liberación después de la
exposición a DON 5 \muM durante 1 h. Los tripanosomas fueron
tratados con DON durante 1 h y luego fueron recuperados y
resuspendidos en medio sin fármaco.
La figura 6 muestra la proliferación de
fibroblastos de ratón BALB/c con concentraciones de DON crecientes
en ausencia (cuadrados) o presencia de hipoxantina 10 \muM
(diamantes) y 160 \muM (triángulos). El índice de proliferación
en las ordenadas muestra la cantidad relativa de células comparado
con la muestra sin fármaco.
En un primer aspecto, la presente invención se
refiere al uso de un inhibidor de CTP sintetasa, especialmente un
análogo de glutamina y una purina descubierta seleccionada a partir
del grupo que consiste en adenina, guanina, citidina y/o
hipoxantina y/o un nucleósido seleccionado a partir del grupo que
consiste en adenosina, guanosina y/o inosina que suprime sus
efectos tóxicos in vivo en la fabricación de un medicamento
para el tratamiento de una enfermedad causada por protozoos
parásitos. Como aparecerá más abajo, el papel principal del análogo
de glutamina, según se considera, es inhibir ciertas etapas de la
biosíntesis de nucleótidos.
Como se menciona anteriormente, la presente
invención está basada en el hallazgo de que a diferencia de las
células de mamífero, los tripanosomas no tienen ningún ruta de
recuperación para la síntesis de CTP. En cambio, CTP es sintetizado
de novo. Se sabe que las células de mamífero son más
versátiles cuando participan en el metabolismo de nucleótidos y son
capaces de hacer bases de purina así como pirimidinas de
novo. Las rutas de recuperación incluyen
fosforribosiltransferasas (para adenina, hipoxantina, guanina y
uracilo) así como ribonucleósido quinasas (para adenosina,
guanosina, uridina y citidina). CTP pueden ambos ser obtenidos por
la recuperación de citidina y por la biosíntesis de novo a
partir de UTP. La última reacción está catalizada por la CTP
sintetasa.
Además, los presentes inventores han publicado
anteriormente (Hofer, A., Ekanem, J. T. y Thelander, L. (1998)
J. Biol. Chem. 273, 34098-34104) que
T. brucei de la corriente sanguínea cultivado tiene una
mezcla de CTP excepcionalmente pequeña comparado con las otras
mezclas de NTP y otros tipos de células. En el presente trabajo,
fueron estudiadas las dos etapas en el huésped mamífero y la forma
procíclica, que es la primera de las tres etapas en la mosca. Las
otras formas de insecto sólo pueden ser obtenidas por la disección
de la mosca tsé-tsé.
Así, de acuerdo con la presente invención, ahora
se ha confirmado que T. brucei también tiene una mezcla
excepcionalmente pequeña de CTP en tripanosomas delgados alargados y
cortos gruesos cultivados en ratones. También se muestra en este
documento por primera vez que CTP sólo puede ser formado de
novo y que es una síntesis lenta más bien que una degradación
excesiva que es responsable del bajo nivel de CTP. Todas estas
observaciones han conducido a los inventores hacia la CTP sintetasa
como un objetivo interesante en quimioterapia. Además, en el
contexto de Plasmodium falciparum, se ha demostrado que
carece de la respuesta de citidina y de la síntesis de purina de
novo, véase Hassan-HF y
Coombs-GH (1988): "Purine and pyrimidine
metabolism in parasitic protozoa". FEMS Microbiology
Reviews 54, 47-84.
Como se menciona anteriormente, el inhibidor de
CTP sintetasa es cualquier análogo funcional, derivado, producto de
sustitución, isómero u homólogo del aminoácido glutamina, que
conserva la propiedad de la glutamina de unirse a la CTP sintetasa.
Así, la expresión "análogo de glutamina" es requerido en este
documento para abarcar cualquiera de los antedichos. La preparación
de análogos de glutamina de acuerdo con la invención se preparan
por métodos convencionales conocidos por el experto en este campo,
véase, por ejemplo, las referencias mencionadas más abajo en el
contexto de las realizaciones específicas, o la literatura de
referencia estándar.
En una realización particularmente ventajosa, el
inhibidor de CTP sintetasa es un derivado de norleucina, tal como
6-diazo-5-oxo-L-norleucina
(DON). DON es un análogo de glutamina que inhibe un amplio rango de
reacciones que requieren glutamina aunque el efecto principal
parezca estar en la biosíntesis de novo de purina y CTP
sintetasa en células de mamífero (Lyons, S. D., Sant, M. E.,
Christopherson, R. I. (1990) J. Biol. Chem. 265,
11377-11381). Éste bloquea la proliferación y ha
sido examinado con extensos ensayos clínicos como un fármaco para
el cáncer (revisado en Catane, R., Von Hoff, D. D., Glaubiger, D. L.
y Muggia, F. M. (1979) Cancer Treat. Rep. 63,
1033-1038; y Ahluwalia, G. S., Grem, J. L., Hao, Z.,
y Cooney, D. A. (1990) Pharmacol. Ther. 46,
243-271). La patente de EE.UU Nº. 2.965.634 se
refiere a derivados de norleucina, tales como DON, y un
procedimiento para su producción. El uso ejemplificado en ese
documento está basado en sus propiedades fitotóxicas, por ejemplo,
como herbicidas o agentes para matar malas hierbas. No hay nada
mencionado que conduciría al experto en este campo a contemplar el
uso de derivados de norleucina en medicamentos. Así, la presente
invención describe por primera vez el uso de DON en el tratamiento
de condiciones clínicas causadas por patógenos protozoarios. Como
se muestra más abajo en la sección experimental, a 1 \muM, DON
bloqueó completamente la proliferación de tripanosomas y redujo
selectivamente el nivel de CTP en T. brucei sin afectar a los
niveles de UTP, ATP o GTP.
En una realización alternativa, el inhibidor de
CTP es acivicina. De modo similar a DON, se ha sugerido la
acivicina para uso como un componente activo en una composición
herbicida, véase, por ejemplo, la patente de EE.UU Nº.
5.489.562.
Como se menciona anteriormente, para
proporcionar un medicamento eficiente para el uso en esquemas de
tratamiento, los efectos tóxicos del inhibidor de CTP sintetasa
deben ser suprimidos por el uso de una nucleobase adecuada, tal
como una base de purina o un nucleósido. Como una ilustración, en
células de mamífero, se sabe que DON también afecta a la
biosíntesis de novo de purina, una ruta de la que carece en
tripanosomas. De acuerdo con la presente invención, este es el
objetivo principal del fármaco en fibroblastos de ratón de tejido
cultivado. Sin ninguna purina en el medio de cultivo, un bloque
total de proliferación ocurrió a 1-2 \muM. Sin
embargo, se muestra la adición de la base de purina hipoxantina en
la sección experimental más abajo para aumentar la concentración de
DON necesaria para un bloque de proliferación a más de 20 \muM. La
citidina no tuvo ningún tal efecto. En consecuencia, la mejor
realización de la presente invención parece ser una terapia
combinatoria de DON e hipoxantina.
En una realización ventajosa, la base de purina
se selecciona a partir del grupo que consiste en adenina, guanina
y/o hipoxantina. Sin embargo, ya que los nucleósidos son divididos
en el azúcar y la base de purina cuando se administran, en una
realización alternativa, se usa un nucleósido como el componente que
suprime los efectos secundarios tóxicos del análogo de glutamina
usado. Así, la base de purina entonces es proporcionada por el uso
de un nucleósido, por ejemplo, adenosina, guanosina o inosina, en la
presente fabricación. La preparación de purinas y nucleósidos es
conocida por los expertos en este campo y puede seguir cualquier
método convencional, véanse, por ejemplo, las patentes de EE.UU
N^{os}. 6.017.736, 5.792.868 y 5.688.947.
El presente uso preferiblemente es referido a un
medicamento para el tratamiento y/o la prevención de una enfermedad
seleccionada a partir del grupo que consiste en malaria,
leishmaniasis y tripanosomiasis, por ejemplo, la tripanosomiasis
americana (enfermedad de Chaga), o la tripanosomiasis africana
(enfermedad del sueño).
En un segundo aspecto, la presente invención se
refiere a una composición farmacéutica para el tratamiento y/o la
prevención de una enfermedad causada por protozoos parásitos, que
comprende un inhibidor de CTP sintetasa y una base de purina junto
con un vehículo farmacéuticamente aceptable y opcionalmente otros
excipientes.
En todo lo esencial, la presente composición
farmacéutica será fabricada como se describe anteriormente. Así, el
inhibidor de CTP sintetasa es un análogo de glutamina, tal como
6-diazo-5-oxo-L-norleucina
(DON) o acivicina, mientras que la base de purina ha sido
seleccionada a partir del grupo que consiste en adenina, guanina y/o
hipoxantina. En una realización específica, la base de purina es
proporcionada a la composición por el uso de un nucleósido, por
ejemplo, adenosina, guanosina e inosina, o cualquier equivalente
funcional o su derivado capaz de inhibir los efectos tóxicos de un
análogo de glutamina.
La composición farmacéutica de acuerdo con la
invención puede ser presentada como una composición individual, en
la que los componentes están presentes en una mezcla en dicho
vehículo. De forma alternativa, la composición se presenta en una
forma de kit, en el que los componentes están presentes como
entidades separadas para la administración esencialmente simultánea
al paciente. La opción de la forma será dependiente o actuará según
las circunstancias y motivos prácticos según el experto en este
campo.
Es posible administrar los ingredientes activos
de acuerdo con la invención solos en solución. Sin embargo, en la
realización preferida, el(los) ingrediente(s)
activo(s) se formula(n) en una composición
farmacéutica. La presente composición comprende al menos un
ingrediente activo (inhibidor de CTP sintetasa, una nucleobase, tal
como una purina o nucleósido), junto con uno o varios vehículos
farmacéuticamente aceptables y/u otros agentes terapéuticos. Según
se incluye en la amplitud de esta invención, "aceptable" es
definido como que es compatible con otros ingredientes de la
formulación y no perjudicial para el paciente o la célula huésped.
Estos vehículos incluyen los conocidos por los médicos en la técnica
tales como los adecuados para la administración oral, rectal,
nasal, tópica, bucal, sublingual, vaginal o parenteral (incluyendo
subcutánea, intramuscular, intravenosa e intradérmica), siendo
preferida la administración intervenosa u oral. Los vehículos
específicos adecuados para uso en la invención son conocidos por
los expertos en este campo y pueden ser como se menciona más
abajo.
La presente composición puede ser administrada
oralmente en forma líquida o de comprimido, y puede incluir uno o
varios de los siguientes: lactosa (hidrosa, flujo rápido), celulosa
microcristalina, dióxido de silicio coloidal, croscarmelosa de
sodio, estearato de magnesio, ácido esteárico y otros excipientes,
colorantes y vehículos farmacológicamente compatibles. Ya que la
presente composición es inestable en medio ácido, para permitir su
liberación en el intestino, el ambiente ácido en el estómago debe
ser compensado para cuando sean usadas formas de dosificación oral.
Así, la presente composición puede ser tomada junto con un tampón
adecuado, tal como bicarbonato. De forma alternativa, puede ser
revestido con un revestimiento entérico. Un aislamiento del
ingrediente activo de la acidez del revestimiento entérico también
puede ser incluido, tal como por el uso de una capa de aislamiento.
La preparación de revestimientos entéricos es conocida por los
expertos en esta técnica. Las composiciones para uso oral pueden
ser administradas en pacientes en estados de ayuno y de no
ayuno.
De ser formulada para administración parenteral,
la presente composición puede incluir soluciones de inyección
acuosas y no acuosas, isotónicas y estériles que pueden contener
antioxidantes, tampones, bacterioestatos y solutos que proporcionan
el(los) ingrediente(s) activo(s)
isotónico(s) con la sangre del receptor pretendido; y
suspensiones estériles acuosas y no acuosas que pueden incluir
agentes de suspensión y agentes de hinchamiento. Como se discute
anteriormente, la composición puede ser presentada en recipientes de
dosis unitaria o multidosis sellados, por ejemplo, ampollas y
viales, y puede ser almacenada en una condición liofilizada que
requiera sólo de la adición del vehículo líquido estéril, por
ejemplo, agua para inyecciones, inmediatamente antes de su uso. Las
soluciones de inyección extemporánea y las suspensiones pueden ser
preparadas a partir de polvos estériles, gránulos y comprimidos de
la clase antes descrita.
Las dosis tendrán que ser modificadas de acuerdo
con la condición clínica que se trate así como de la edad del
paciente, el peso corporal, etc. Dosis adecuadas son determinadas
para cada caso específico por el médico especialista
responsable.
La composición farmacéutica de acuerdo con la
invención se formula para uso en el tratamiento y/o la prevención
de una enfermedad seleccionada a partir del grupo que consiste en
malaria, leishmaniasis y tripanosomiasis, por ejemplo,
tripanosomiasis americana (enfermedad de Chaga) o tripanosomiasis
africana (enfermedad del sueño).
Se proporciona un sistema modelo, pero no
reivindicado, comprendiendo T. brucei recombinante, en el que
ha sido insertado un promotor inducible para controlar el gen de
CTP sintetasa, para estudios con lípidos, membranas y proteínas
marcadoras para varias etapas del ciclo vital de T. brucei.
Tales estudios son útiles, por ejemplo, para el futuro desarrollo
de fármacos, ya que aún no es exactamente conocido el mecanismo que
provoca que los tripanosomas sufran cambios radicales de la
morfología y el metabolismo cuando cambian entre varias etapas del
ciclo vital. Hay una gran necesidad de sintetizar lípidos durante
estos cambios. Los tripanosomas tienen un gran orgánulo del tipo
mitocondria llamado cinetoplasto, que sufre un aumento drástico del
tamaño y la cantidad de crestas cuando los tripanosomas se
desarrollan desde las formas de la circulación sanguínea a las
formas procíclicas de insecto (Vickerman, 1985). Los lípidos son
necesarios para este proceso así como para la reorganización
general de la membrana celular que acompaña al desarrollo de los
parásitos. En el presente trabajo, se muestra que el nivel de CTP
es muy bajo siempre que los tripanosomas estén en la corriente
sanguínea del mamífero (alrededor del 0,5% de la mezcla total de
NTP). Sin embargo, en la forma procíclica, que es la primera etapa
del desarrollo en la mosca, el nivel es mucho más alto (alrededor
del 4% de la mezcla total de NTP). Tal vez la síntesis de CTP es
restringida hasta acomodar a una demanda mayor de lípidos. En muchos
sistemas, se ha demostrado que CTP juega un papel clave en la
regulación de la síntesis de lípidos (Vance, D. E., Trip, E. M. y
Paddon, H. M. (1980) J. Biol. Chem. 255,
1064-1069; y López, G. C. y Wurtman, R. I. (1992)
J. Neurochem. 59, 338-343).
Los presentes inventores han demostrado
previamente (Hofer, A., Ekanem, J. T. y Thelander, L. (1998) J.
Biol. Chem. 273, 34098-34104) que las
bajas mezclas de CTP y CDP no condujeron a una mezcla de dCTP baja
en la forma de circulación sanguínea cultivada, implicando que la
ribonucleótido reductasa podría compensar las bajas mezclas de
nucleótidos de citidina. Sin embargo, en las formas delgadas
alargadas aisladas de ratones también la mezcla de dCTP es baja.
Las mezclas de CTP (y por lo visto de CDP) parecen estar por debajo
del nivel que la ribonucleótido reductasa puede compensar. Es menos
sorprendente que la mezcla de dCTP sea baja en la forma corta
gruesa ya que ésta no prolifera.
En consecuencia, hay una necesidad de saber cómo
los parásitos logran aumentar su nivel de CTP casi diez veces
cuando se transforman desde las formas de la corriente sanguínea a
insecto. La presente invención muestra que el único camino para los
tripanosomas, al menos para la forma de la corriente sanguínea
cultivada, para hacer CTP es por síntesis de novo y que la
regulación de la mezcla de CTP es por síntesis más bien que por
degradación de CTP. Todas estas pruebas señalan hacia la CTP
sintetasa como el elemento clave en la regulación del nivel de CTP.
El presente sistema modelo es proporcionado para poner la CTP
sintetasa bajo un promotor inducible en T. brucei para
observar qué pasa con lípidos, membranas y proteínas marcadoras
durante las diversas etapas del ciclo vital bajo la inducción.
La figura 1 muestra las mezclas de NTP en T.
brucei desde diferentes etapas de ciclo vital. En A) se muestran
todos los NTP, mientras que en B), la región que muestra las
mezclas de CTP ha sido ampliada. El pico de CTP está compuesto
tanto de CTP como dCTP. La parte que representa dCTP es indicada por
el color negro. Las muestras son de las formas procíclica (PC),
delgada alargada (DL), corta gruesa (CG) y de circulación sanguínea
cultivada in vitro (C). La abreviatura para cada etapa del
ciclo vital (PC, DL, CG, C) es puesta debajo del cuadro
correspondiente en B) y el mismo orden de las muestras es usado en
A). Todos los valores son promedios con las desviaciones típicas
indicadas por barras de error excepto el valor C que es un promedio
de 19 experimentos y los niveles de dCTP de las formas delgadas
alargadas y cortas gruesas que son medidas simples. Los valores son
representados como relativos (en %) respecto a la mezcla total de
NTP (CTP+UTP+ATP+GTP). Así, aun cuando parezca que las mezclas de
UTP, ATP y GTP son similares en todas las formas del parásito, la
mezcla de CTP (mejor visto en la figura 1B) en la forma procílica
(PC) es mucho más alta que las formas de mamífero (DL, CG, C). Los
tripanosomas cultivados en ratones (formas delgada alargada, DL y
corta gruesa, CG) tienen aún más bajas mezclas de CTP que las
formas de corriente sanguíneo cultivada (C).
La figura 2 muestra la incorporación del
marcador de tritio en CTP, UTP y ácidos nucleicos. 200 ml de
tripanosomas fueron recogidos por centrifugación y fueron
resuspendidos en 20 ml de medio. Después de una preincubación de 30
minutos en condiciones de crecimiento normal se les dieron uracilo
tritiado y fueron recogidos en varios puntos de tiempo. En A), se
muestra la incorporación de tritio en UTP (triángulos) y CTP
(cuadrados). Los valores son trazados como actividades específicas
(DPM/nmol de cada nucleótido). Parece que el tritio no sólo fue
incorporado en UTP, sino también la mezcla de CTP. En B), se muestra
la incorporación del marcador en RNA+DNA (cuadrados) y sólo ADN
(triángulos). En este caso, se muestran los valores absolutos
(DPM).
La figura 3 muestra las mezclas de CTP después
del tratamiento con varios inhibidores de CTP sintetasa durante 1
h. Se muestran muestras sin fármaco (control), con DON 25 y 100
\muM (DON25 y DON100, respectivamente), con acivicina 100 \muM
(Aci100) y con CPEC 25 \muM (CPEC25). La unidad de ordenadas es la
misma que en la figura 1. El control es un promedio de dos
experimentos mientras que los demás son medidas simples.
La figura 4 muestra el efecto de DON (A) y
acivicina (B) sobre la proliferación de tripanosomas. En A), los
tripanosomas fueron tratados sin fármaco (cuadrados), DON 1 \muM
(triángulos) o DON 5 \muM (diamantes). En (B), los tripanosomas
fueron tratados sin fármaco (cuadrados rellenos), acivicina 1 \muM
(triángulos), acivicina 5 \muM (diamantes) o acivicina 25 \muM
(cuadrados abiertos). El número de tripanosomas fue contado en
varios puntos de tiempo después de que la exposición del fármaco
hubo comenzado. Parece que DON y acivicina eran ambos muy
activos.
La figura 5 muestra la liberación después de la
exposición a DON 5 \muM durante 1 h. Los tripanosomas fueron
tratados con DON durante 1 h y luego fueron recuperados y
resuspendidos en medio sin fármaco. El número de tripanosomas fue
contado en varios puntos de tiempo después de que la liberación hubo
comenzado (triángulos). Un experimento de control fue realizado en
el que los tripanosomas no fueron expuestos a DON, pero fueron
tratados exactamente de la misma forma que los tripanosomas tratados
con fármaco (cuadrados). Cada punto es un promedio de dos
experimentos con la desviación típica indicada por barras de
error.
La figura 6 muestra la proliferación de
fibroblastos de BALB/c con concentraciones de DON crecientes en
ausencia (cuadrados) o presencia de hipoxantina 10 \muM
(diamantes) y 160 \muM (triángulos). Fueron sembrados los
fibroblastos a una densidad tan baja que no pudieron conseguir
confluencia hasta los tres días. Cuando se hubieron sedimentado las
placas, fueron expuestas a los fármacos y se dejaron reposar tres
días. En este punto, la cantidad de células fue contada
indirectamente por un método descrito en la sección "Materiales y
métodos" más abajo. El índice de proliferación en el ordenadas
muestra la cantidad relativa de células comparado con la muestra
sin fármaco.
A continuación, la presente invención será
ilustrada mediante ejemplos.
Las formas de corriente sanguínea del clon de la
variante pleomórfica de T. brucei brucei AnTat 1.1
(Van Meirvenne, N. Janssens, P. G. y Magnus, E. (1975) Ana. Soc.
Belge Med. Trop. 55, 1-23) fueron
cultivadas en ratones NMRI. Los tripanosomas delgados largos fueron
purificados el día 3 después de la inyección y los tripanosomas
cortos gruesos el día 5 después de la inyección de la sangre por
cromatografía de DEAE-celulosa (Lanham, S. M. y
Godfrey, D. G. (1970) Exp. Parasitol. 28,
521-534). Se confirmaron que los tripanosomas
tenían formas delgadas alargadas (33-35% estaba en
la fase S) y formas cortas gruesas (sólo 6-7% estaba
en la fase S) por citometría de flujo.
Las formas de insecto procíclicas de T.
brucei brucei AnTat 1.1 fueron cultivadas en medio
SDM-79 (Brun, R. y Schoenenberger, M. (1979)
Acta Trop. 36, 289-292) suplementado
con suero fetal bovino del 10% inactivo por calor a 27ºC. Las
formas de corriente sanguínea adaptadas para cultivo de la línea
celular de T. brucei brucei TC221 (Hirumi, H.,
Hirumi, K., Doyle, J. J. y Cruz, G. A. M. (1980) Parasitology
80, 371-382) fueron propagadas en
medio-9 de Iscove modificado de Hirumi (Hirumi, H. y
Hirumi, K. (1989) J. Parasitology 75,
985-989) suplementado con suero fetal bovino del 5%
a 37ºC en una atmósfera humedecida que contenía el 7% de CO_{2}.
Los parásitos cultivados fueron recuperados en la fase de
crecimiento logarítmico tardía.
Los fibroblastos de ratón Balb/c fueron
cultivados como monocapas en medio Eagle modificado de Dulbecco
(Sigma) suplementado con L-glutamina (0,584 g/l) y
suero de caballo inactivado con calor del 10% a 37ºC en una
atmósfera humedecida que contenía 7% de CO_{2}. La cantidad de
fibroblastos en cada placa fue determinada por un método en el que
las placas que contenían las células fueron lavadas con PBS pH 7,5,
las células fueron desintegradas por una 10 incubación de un minuto
con NaOH 0,2 M a 50ºC y luego fue medido
OD_{260-310} (Suttle, D. P. y Stark, G. R. (1979)
J. Biol. Chem. 254, 4602-4607). Las
células fueron recogidas antes de la confluencia.
Fueron recogidos 1-3 x 10^{8}
tripanosomas y posteriormente fueron desintegrados por 500 \mul de
ácido tricloroacético 0,6 M helado suplementado con MgCl_{2} 15
mM. El ácido tricloroacético fue eliminado mediante dos
extracciones con 720 \mul de
1,1,2-triclorotrifluoroetano (78%)/trioctilamina
(22%) y la fase acuosa fue recuperada. 1/5 de la muestra fue
evaporada hasta sequedad en un Speedvac (Savant), cargado en una
columna SAX de 4,6 x 125 mm de Partisphere y fue pasado por el HPLC
en fosfato de amonio 0,5 M, pH 3,4 que contenía acetonitrilo del
2,5% a 1,5 ml/min. El procedimiento además es explicado en un
trabajo anterior por los presentes inventores, véase Hofer, A.,
Ekanem, J. T. y Thelander, L. (1998) J. Biol. Chem.
273, 34098-34104. Una conexión del HPLC a un
analizador de centelleo de flujo (Radiomatic 150 TR, Packard) hizo
posible comprobar la radiactividad en los picos cromatográficos.
Para las medidas de radiactividad, la muestra entera por lo general
fue cargada en la columna. Los nucleótidos fueron cuantificados
midiendo las alturas de los picos y fueron comparados en una curva
estándar. Los desoxirribonucleótidos fueron separados de los
ribonucleótidos en una columna de boronato antes de que fueran
analizados por cromatografía SAX de Partisphere.
La muestra (200 \mul de medio de cultivo) fue
centrifugada mediante un filtro de 3K de Nanosep (Corporación Pall
Filtron) y varias cantidades de muestra fueron cargadas en una
columna de HPLC Discovery de 4,6 x 150 mm (Supelco) y fueron
pasadas por HPLC en fosfato de amonio 10 mM, pH 3,4 a 1 ml/minuto.
Los picos fueron identificados por su A260/A280 y por los tiempos
de retención de nucleósidos estándar y bases mezcladas con el medio
de cultivo. Los ribonucleósidos y las bases fueron cuantificados
midiendo las alturas de los picos y comparándolas en una curva
estándar.
200 ml de tripanosomas en fase de crecimiento
logarítmico (\sim0,5-1 x 10^{6} tripanosomas/ml)
fueron recogidos por centrifugación (2 minutos a 3000 rpm) y fueron
resuspendidos en 20 ml de medio de cultivo. Después de una
preincubación de 30 minutos a 37ºC y 7% de CO_{2}, se les
proporcionó una concentración final de 39 Ci/mmol de
[5,6-3H]-uracilo 0,13 \muM
(Moravek Biochemicals Inc.) y fueron incubados durante varias
cantidades de tiempo. Un experimento similar también fue intentado
con una concentración final de 14,7 Ci/mmol
[6,3-H]-citosina 0,34 \muM o 22,9
Ci/mmol [5-3H(N)]-citidina
0,22 \muM. La radiactividad en las mezclas de UTP, CTP, citidina
y uridina fue determinada por HPLC acoplado a un analizador de
centelleo de flujo (véase antes). El material precipitado por TCA
fue disuelto en NaOH 0,6 M y fueron incubados a 37ºC a lo largo de
la noche. El recuento de centelleo de este material reveló la
cantidad total de radiactividad en ácidos nucleicos (RNA+DNA). La
cantidad de radiactividad en ADN pudo ser recuperada por
precipitación TCA y la colección en filtros de vidrio como se
describe previamente (Nicander, B. y Reichard, P. (1985) J. Biol.
Chem. 260, 5376-5381).
6-diazo-5-oxo-L-norleucina
(DON), acivicina y azaserina fueron comprados en Sigma. Fueron
disueltos en agua y almacenados como soluciones 5 mM a -20ºC. La
ciclopentenil citosina fue obtenida por cortesía de Grant McClarty
del departamento de Microbiología Médica, Universidad de Manitoba,
730 William Ave, Winnipeg, Manitoba R3E OW3, Canadá. Fue almacenado
como una solución 50 mM en dimetil-sulfóxido (DMSO)
a 4ºC. La concentración final de DMSO en el medio de crecimiento de
los tripanosomas nunca se hizo mayor del 0,5% y esto no tuvo ningún
efecto sobre las mezclas de NTP o la proliferación de los
parásitos.
Se deseaba comprobar si el bajo nivel de CTP
antes mencionado por los presentes inventores para las formas de
corriente sanguínea cultivada (Hofer, A., Ekanem, J. T. y Thelander,
L. (1998) J. Biol, Chem. 273,
34098-34104) también se mantiene in vivo.
Por lo tanto, fueron comprobadas las mezclas de
NTP en tripanosomas largos delgados y cortos gruesos cultivados en
ratones. La forma procíclica, que es una de las etapas en la mosca
tsé-tsé, también fue incluida para ver si la concentración de CTP
es baja en todas las etapas del ciclo vital o si posiblemente está
implicada en el cambio entre las etapas del ciclo vital. Como se ve
en la figura 1A, las mezclas de UTP, ATP y GTP son similares en
todas las formas del parásito. Sin embargo, la mezcla de CTP (mejor
visto en la figura 1B) en la forma procílica (PC) es mucho más alta
que las formas de mamífero (DL, CG, C). Los tripanosomas cultivados
en ratones (formas delgadas alargadas, DL, y cortas gruesas, CG,)
tienen aún mezclas de CTP más bajas que las formas de corriente
sanguínea cultivadas (C). La mezcla de dCTP también fue comprobada y
fue notado que eran aproximadamente similares en la forma de
insecto y la forma de corriente sanguíneo cultivada mientras que
las dos formas purificadas de ratones también tenían bajas mezclas
de dCTP.
Se deseaba investigar por qué la mezcla de CTP
es tan baja en los tripanosomas. Esto podría ser o por la síntesis
deficiente o por la degradación excesiva de CTP. En otros sistemas
de CTP puede ser sintetizado de novo a partir de UTP o a
partir de la recuperación de citidina. En algunos organismos, tales
como Giardia lamblia, la citosina también puede ser
recuperada (Aldritt, S. M., Tien, P. y Wang, S. S. (1985) J. Exp.
Med. 161, 437-445). Cuando a los
tripanosomas les fue dado citidina 15 mM o citosina 1 mM y fueron
recuperados una hora más tarde, ningún cambio del tamaño de la
mezcla de CTP pudo ser detectado. De la misma manera, si los
tripanosomas fueron dados tritiados con citidina o citosina, ningún
marcador pudo ser detectado en la mezcla de CTP. La cromatografía
HPLC confirmó que la citidina añadida no fue degradada a uridina por
citidina desaminasa en el suero durante la incubación. Así, parece
que no hubo ninguna recuperación de citidina o citosina en T.
brucei. Entonces fue analizada la ruta de novo. A los
tripanosomas les fue dado uracilo tritiado y fueron recuperados en
varios tiempos de incubación. El tritio no sólo fue incorporado en
UTP, sino también la mezcla de CTP (figura 2A). Así, fue concluido
que los tripanosomas tienen una ruta de novo para la síntesis
de CTP. La acumulación del marcador en la mezcla de UTP fue rápida
y estaba casi saturada en 5 minutos, mientras que la mezcla de CTP
fue marcada una a velocidad mucho más lenta. Esto indicó que una
lenta síntesis de novo podría ser responsable del bajo nivel
de CTP. También se deseaba investigar si el tamaño de la mezcla de
CTP era controlado por la alta velocidad de degradación de CTP. Por
lo tanto, el marcador en dos productos de degradación del
catabolismo de CTP, citidina y uridina, fue comprobado por
cromatografía HPLC. Ninguna radiactividad en absoluto pudo ser
detectada en estos picos. Al contrario, el marcador fue incorporado
fácilmente en ácidos nucleicos (figura 2B). Considerando el límite
de detección de citidina marcado y uridina en el presente análisis,
puede ser concluido que al menos el 95% del CTP en los tripanosomas
es usado para la síntesis de ADN y ARN. Una degradación rápida no
es responsable así de la baja mezcla de CTP en T. brucei.
La dependencia absoluta de la síntesis de
novo para la producción de CTP podría ser explotada para fines
quimioterapéuticos ya que el huésped puede ser rescatado por
citidina. Hay dos clases principales de compuestos que inhiben a la
CTP sintetasa, análogos de nucleósido y análogos de glutamina. Un
análogo de nucleósido, la ciclopentenil-citosina
(CPEC), y dos análogos de glutamina,
6-diazo-5-oxo-L-norleucina
(DON) y acivicina, fueron analizados y fue observada cómo la mezcla
de CTP cambiaba durante un período de incubación de una hora
(figura 3). CPEC no tuvo ningún efecto mientras que DON y acivicina
ambos bajaron la mezcla de CTP. La acivicina era menos específica
que DON ya que también redujo la mezcla de GTP en un 50% (no
mostrado en la figura). Después, fue investigado el efecto de los
fármacos sobre el crecimiento de tripanosomas. DON y acivicina
fueron ambos muy activos (Figs. 4A y B, respectivamente),
especialmente DON que bloqueó completamente la proliferación ya a
una concentración de 1 \muM. Como se esperaba, CPEC (250 \muM)
no tuvo ningún efecto en este experimento tampoco (datos no
mostrados). La citidina (hasta 5 mM) o la citosina (1 mM) no
pudieron rescatar los tripanosomas del bloque de proliferación
asegurado por DON, un resultado lógico ya que se ha
\hbox{demostrado anteriormente que T. brucei no puede
recuperar citidina o citosina.}
DON no es estable en la corriente sanguínea y
tiene una semivida de sólo unas horas en los seres humanos (Kovach,
J. S., Eagan, R. T., Pawis, G., Refriegan, J., Creagan, E. T. y
Moertel. C. G. (1981) Cancer Treat. Rep. 65,
1031-1036; Rahman, A., Luc, V., Smith, F. P., Vrown,
J., Schein, P. S. y Woolley, P. V. (1981); y Sullivan, M. P.,
Nelson, J. A., Feldman, S. y Nguyen, B. V. (1988) Cancer
Chemother. Pharmac. 21, 78-84). Por lo
tanto, fue analizado durante cuánto tiempo el efecto de un pulso
corto de DON dura en la proliferación de tripanosomas. En la figura
5, los tripanosomas han sido tratados con DON 5 \muM durante 1 h.
Después de la incubación, los tripanosomas fueron recogidos por
centrifugación, el pelete fue lavado con medio que no contenía DON
y fue resuspendido en el mismo medio y los tripanosomas fueron
puestos de nuevo en la incubadora. La cantidad de tripanosomas fue
registrada continuamente durante la incubación. Los tripanosomas
control fueron tratados del mismo modo pero la incubación de un
hora fue sin DON. Como se ha visto a partir de la figura el efecto
de la incubación de 1 h con DON quedó durante aproximadamente 20 h
antes de que los tripanosomas comenzaran a proliferar de nuevo.
El efecto de DON sobre los tripanosomas y las
células de mamífero fue comparado como sigue. En la figura 6, se
muestra que DON tiene un profundo efecto en la proliferación de
células desde que ocurre la inhibición máxima a 1-2
\muM. En este punto, la cantidad de células después de 72 h es
aproximadamente la misma que antes de la incubación con DON
comenzado (datos no mostrados). Ninguna proliferación ha ocurrido
así durante los tres días de incubación. Una concentración de DON
aún más alta no baja más la cantidad de células. Sin embargo, las
células restantes parecen muy extrañas en morfología y están
obviamente enfermas. Así, tuvo que ser investigado si realmente el
efecto de antiproliferación sobre las células de mamífero podía ser
suprimido, manteniendo todavía la actividad tripanocidal. En
células de mamífero, DON es un inhibidor poderoso de la biosíntesis
de novo de purina. En la figura 6, dos experimentos son
incluidos en el que hipoxantina 10 y 160 \muM ha evitado el
bloqueo en la biosíntesis de novo de purina, respectivamente.
La hipoxantina es una base de purina que está naturalmente en la
corriente sanguínea de mamíferos. En presencia de hipoxantina 160
\muM, la concentración de DON necesitada para inhibir la
proliferación era alrededor de 20 veces más alta que sin
hipoxantina. Con hipoxantina 10 \muM, el efecto antiproliferativo
de DON era todavía alto y cuando el medio fue comprobado después de
la incubación fue encontrado que la hipoxantina era consumida
durante el experimento. Esto significa que la hipoxantina 10 \muM
tiene probablemente un efecto aún más alto que el indicado en la
figura. Los tripanosomas, que no tienen ninguna síntesis de
novo de purinas, son cultivados en presencia de hipoxantina 160
\muM en todos los presentes experimentos.
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo
1
Para determinar en qué intervalo DON es eficaz
contra Plasmodium falciparum, la causa de la malaria, el
instituto tropical suizo (Socinstrasse 57, P.O. Box, CH, 4002
Basilea, Suiza) realizó el presente experimento de acuerdo con sus
métodos estándar disponibles como un servicio comercial
proporcionado bajo secreto (para la descripción exacta del método,
se hace la referencia al instituto tropical suizo). Además, el
presente experimento permite una comparación entre el efecto de DON
tanto sobre Trypanosoma brucei rhodiense como sobre
Plasmodium falciparum.
Los resultados se muestran en la Tabla 1 más
abajo.
Como aparece de la Tabla 1, el efecto de DON
para el tratamiento de malaria está en el mismo intervalo ventajoso
que para el tratamiento de la enfermedad del sueño africana.
La dependencia absoluta en la ruta para la
síntesis de novo de CTP en T. brucei es prometedora en
el desarrollo de fármacos. Inhibidores de CTP sintetasa podrían ser
usados junto con citidina que sólo rescataría al huésped ya que no
es convertida a CTP por los tripanosomas. El inhibidor de CTP
sintetasa más específico conocido es la
ciclopentenil-citosina (CPEC). Lamentablemente, CPEC
no inhibió la síntesis de CTP en T. brucei. CPEC y otros
análogos de nucleósidos de pirimidina probablemente no son
metabolizados a la forma de trifosfato activa en T. brucei
ya que éste carece de actividades de uridina (Hammond, D. J. y
Gutteridge, W. E. (1982) Biochim. Biophys. Acta 718,
1-10) y citidina quinasa. Las células de mamífero
tienen citidina-uridina quinasa que, excepto para
citidina y uridina, fosforila un amplio rango de análogos de
nucleósido de pirimidina (Cihak, A. y Rada, B. (1976)
Neoplasma 23, 233-257).
La CTP sintetasa cataliza la transferencia de un
grupo amino de glutamina a UTP. Algunos análogos de glutamina,
tales como la
6-diazo-5-oxo-L-norleucina
(DON), acivicina y azaserina, forman enlaces covalentes con todas
las clases de glutamina aminotransferases. Entre éstas están las
proteínas implicadas en la biosíntesis de novo de purina
(dos etapas de la ruta que conduce hasta IMP y a GMP sintasa), la
biosíntesis de novo de pirimidina (fosfato de
carbamoíl-sintetasa II y CTP sintetasa), la
biosíntesis de NAD, la biosíntesis de glucosamina y el ciclo de
\gamma-glutamilo (para una revisión véase
Ahluwalia, G. S., Grem, J. L.. Hao, Z., y Cooney, D. A. (1990)
Pharmacol. Ther. 46, 243-271). Hay,
sin embargo, grandes diferencias en la especificidad entre varios
análogos de glutamina para las diversas aminotransferasas y DON
principalmente inhibe la CTP sintetasa y la biosíntesis de
novo de purina (hasta IMP) mientras que la acivicina inhibe la
CTP sintetasa y GMP sintetasa y la azaserina inhibe la biosíntesis
de novo de purina (IMP) en células de mamífero (Lyón, S. D.,
Sant, M. E., Christopherson, R. I. (1990) J. Biol. Chem.
265, 11377-11381). La especificidad de estos
análogos parece similar en los tripanosomas respecto a las células
de mamífero, a excepción del hecho de la carencia de tripanosomas
en la biosíntesis de novo de purina y por lo tanto son
insensibles a fármacos que afectan a esta ruta. La azaserina no tuvo
ningún efecto en la proliferación de tripanosomas (datos no
mostrados) y DON no cambió la mezclas de NTP de purina en los
tripanosomas.
Muchos hechos parecen que prometen para el uso
de DON contra la enfermedad del sueño. Los presentes inventores han
descubierto que el efecto de inhibición del crecimiento de
exposición de DON de 1 h dura aproximadamente 20 h antes de que los
tripanosomas comiencen a proliferar de nuevo. Esto es una gran
ventaja ya que los ensayos clínicos han mostrado que DON tiene una
semivida de sólo unas horas en la corriente sanguínea humana
(Kovach, J. S., Eagan, R. T., Pawis, G., Refriegan, J., Creagan, E.
T. y Moertel, C. G. (1981) Cancer Treat. Rep. 65,
1031-1036; Rahman, A., Luc, V., Smith, F. P., Vrown,
J., Schein, P. S. y Woolley, P. V. (1981); y Sullivan, M. P.,
Nelson, J. A., Feldman, S. y Nguyen, B. V. (1988) Cancer
Chemother. Pharmac. 21, 78-84). Además,
los presentes inventores podrían relevar el bloque de proliferación
en células de mamífero con hipoxantina. Se espera que una terapia
combinatoria de DON e hipoxantina pueda relevar algunos efectos
secundarios asociados a DON. Ya que la hipoxantina está
naturalmente en la corriente sanguínea, no se espera ningún efecto
severo tóxico de este compuesto. Se sabe que la hipoxantina cruza
la barrera sangre-cerebro (Cornford, E. M. y
Oldendorf, W. H. (1975) Biochim. Biophys. Acta 394,
211-219; y Spector, R. (1987) Neurochem. Res.
12, 791-796).
Claims (10)
1. El uso de un inhibidor de CTP sintetasa, y
una base de purina seleccionada a partir del grupo que consiste en
adenina, guanina, citidina y/o hipoxantina y/o un nucleósido
seleccionado a partir del grupo que consiste en adenosina,
guanosina y/o inosina que suprime sus efectos tóxicos in
vivo, en la fabricación de un medicamento para el tratamiento
de una enfermedad causada por protozoos parásitos.
2. El uso de acuerdo con la reivindicación 1, en
el que el inhibidor de CTP sintetasa in vivo en protozoos
parásitos es
6-diazo-5-oxo-L-norleucina
(DON).
3. El uso de acuerdo con la reivindicación 1, en
el que el inhibidor de CTP sintetasa in vivo en protozoos
parásitos es acivicina.
4. El uso de acuerdo con cualesquiera de las
reivindicaciones anteriores, en el que la enfermedad es seleccionada
a partir del grupo que consiste en malaria, leishmaniasis y
tripanosomiasis, por ejemplo, la tripanosomiasis americana
(enfermedad de Chaga) o la tripanosomiasis africana (enfermedad del
sueño).
5. Una composición farmacéutica para el
tratamiento y/o la prevención de una enfermedad causada por
protozoos parásitos, que comprende un inhibidor de CTP sintetasa
in vivo en protozoos parásitos y una base de purina
seleccionada a partir del grupo que consiste en adenina, guanina y/o
hipoxantina y/o un nucleósido seleccionado a partir del grupo que
consiste en adenosina, guanosina y/o inosina que suprime sus efectos
tóxicos, junto con un vehículo farmacéuticamente aceptable y
opcionalmente otros excipientes.
6. Una composición farmacéutica de acuerdo con
la reivindicación 5, en el que el inhibidor de CTP sintetasa in
vivo en protozoos parásitos es
6-diazo-5-oxo-L-norleucina
(DON).
7. Una composición farmacéutica de acuerdo con
la reivindicación 5, en el que el inhibidor de CTP sintetasa in
vivo en protozoos parásitos es acivicina.
8. Una composición farmacéutica de acuerdo con
cualesquiera de las reivindicaciones 5-7, en el que
los componentes están presentes como una unidad individual como una
mezcla en dicho vehículo.
9. Una composición farmacéutica de acuerdo con
cualesquiera de las reivindicaciones 5-8, en el que
los componentes están presentes como unidades separadas para la
administración esencialmente simultánea al paciente.
10. Una composición farmacéutica de acuerdo con
cualesquiera de las las reivindicaciones 5-9, en el
que la enfermedad es seleccionada a partir del grupo que consiste
en malaria, leishmaniasis y tripanosomiasis, por ejemplo, la
tripanosomiasis americana (enfermedad de Chaga) o la tripanosomiasis
africana (enfermedad del sueño).
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