ES2298497T3

ES2298497T3 - Inhibidores de quinasa rho.

Info

Publication number: ES2298497T3
Application number: ES03705859T
Authority: ES
Inventors: Dhanapalan Nagarathnam; Jacques Dumas; Holia Hatoum-Mokdad; Stephen Boyer; Hans Pluempe
Original assignee: Bayer Pharmaceuticals Corp
Current assignee: Bayer Pharmaceuticals Corp
Priority date: 2002-01-23
Filing date: 2003-01-23
Publication date: 2008-05-16
Anticipated expiration: 2023-01-23
Also published as: US20120302587A1; ATE381557T1; JP4423043B2; DE60318177T2; MXPA04007196A; US20040002507A1; EP1470122A1; US20050209261A1; CA2473910C; US6943172B2; DE60318177D1; JP2005523894A; WO2003062227A1; CA2473910A1; EP1470122B1

Abstract

Un compuesto de la fórmula (Ver fórmula)

Description

Inhibidores de quinasa Rho.

Campo de la invención

La presente invención se refiere a compuestos y derivados de los mismos, su síntesis, y su uso como inhibidores de la quinasa Rho. Estos compuestos de la presente invención son útiles para inhibir el crecimiento tumoral, tratar la disfunción eréctil, y tratar otras indicaciones mediadas por la quinasa Rho, por ejemplo, enfermedades cardíacas coronarias.

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Antecedentes

La patología de una serie de enfermedades humanas y animales incluyendo la hipertensión, la disfunción eréctil, los deterioros circulatorios cerebrales coronarios, los trastornos neurodegenerativos y el cáncer pueden ser vinculados directamente a cambios en el citoesqueleto de la actina. Estas enfermedades plantean una grave necesidad médica no satisfecha. El citoesqueleto de la actina está compuesto de una malla de filamentos de actina y de proteínas que se unen a la actina encontradas en todas las células eucarióticas. En las células de la musculatura lisa el ensamblaje y desensamblaje del citoesqueleto de la actina es la fuerza motora principal responsable de la contracción y la relajación de la musculatura lisa. En las células no musculares, las transposiciones dinámicas del citoesqueleto de la actina son responsables de la regulación de la morfología celular, la motilidad celular, la formación de las fibras de tracción de actina, la adherencia celular y las funciones celulares especializadas tales como la retracción de la neurita, la fagocitosis o la citocinesis (Van Aelst, y col., Genes Dev 1997, 11, 2295).

El citoesqueleto de la actina está controlado por una familia de proteínas que son un subconjunto de la superfamilia Ras de las GTPasas. Este subconjunto está constituido en la actualidad por RhoA a E y RhoG (referidas colectivamente como Rho), Rac 1 y 2, Cdc42Hs y las isoformas G25K y TC10 (Mackay, y col., J. Biol. Chem. 1998, 273, 20685). Estas proteínas son proteínas que se unen a GTP (trifosfato de nucleótido de guanina) con actividad GTPasa intrínseca. Actúan como interruptores y ciclos moleculares entre los estados unidos a GDP (difosfato de nucleótido de guanina) inactivo y unidos a GTP activo. Utilizando manipulaciones bioquímicas y genéticas, ha sido posible asignar funciones a cada miembro de la familia. Tras la activación las proteínas Rho controlan la formación de las fibras de tracción de actina, haces gruesos de filamentos de actina, y la agrupación de integrinas en complejos de adherencia focales. Cuando se activan las proteínas Rac controlan la formación de lamelipodios u ondas de membrana en la superficie celular y Cdc42 controla la formación de filopodios. En conjunto esta familia de proteínas desempeña una parte crítica en el control de funciones celulares clave incluyendo el movimiento celular, la guía axónica, la citocinesis, y cambios en la morfología, forma y polaridad celular.

Dependiendo del tipo de célula y del receptor que se active, las proteínas Rho pueden controlar diferentes respuestas biológicas. En las células de la musculatura lisa, las proteínas Rho son responsables de la sensibilización al calcio durante la contracción de la musculatura lisa. En células que no son de la musculatura lisa las GTPasas Rho son responsables de las respuestas celulares a agonistas tales como el ácido lisofosfatídico (LPA), la trombina y el tromboxano A_{2} (Fukata, y col. Trends Pharcol Sci 2001, 22, 32). La respuesta al agonista está acoplada a través de las proteínas G heterotriméricas G_{alfa12} ó G_{alfa13} (Goetzl, y col. Cancer Res 1999, 59, 4732; Buhl, y col. J. Biol. Chem. 1995, 270, 24631) aunque pueden estar implicados otros receptores. Tras la activación las GTPasas Rho activan algunos efectores cadena abajo incluyendo la quinasa PIP5, la Rhotequina, la Rhofilina, PKN y las isoformas de la quinasa Rho ROCK-1/ROKbeta y ROCK-1/ROKalfa (Mackay y Hall J. Biol. Chem. 1988, 273, 20685; Aspenstrom Curr Opin Cell Biol 1999, 11, 95; Amano y col. Exp. Cell Res 2000, 261, 44).

La quinasa Rho fue identificada como una proteína que interacciona con RhoA aislada del cerebro bovino (Matsui, y col. Embo J 1996, 15, 2208). Es un miembro de la familia de la distrofia miotónica de proteínas quinasa y contiene un dominio quinasa serina/treonina en el extremo amino, un dominio enrollado en espiral en la región central y un dominio de interacción con Rho en el extremo carboxi (Amano y col. Exp. Cell Res 2000, 261, 44). Su actividad quinasa es aumentada tras la unión a RhoA unido a GTP y cuando se introduce en las células, puede reproducir muchas de las actividades de RhoA activada. En las células de la musculatura lisa la quinasa Rho media la sensibilización al calcio y la contracción de la musculatura lisa y la inhibición de la quinasa Rho bloquea la contracción muscular inducida por agonistas de 5-HT y fenilefrina. Cuando se introduce en células que no son de la musculatura lisa, la quinasa Rho induce la formación de fibras de tracción y es requerida para la transformación celular mediada por RhoA (Sahai, y col. Curr Biol 1999, 9, 136). La quinasa Rho regula una serie de proteínas cadena abajo a través de la fosforilación, incluyendo la cadena ligera de la miosina (Somlyo, y col. J Physiol (Lond) 2000, 522 Pt 2, 177), la subunidad que se une a la fosfatasa de la cadena ligera de la miosina (Fukata, y col. J. Cell Biol 1998, 141, 409) y la quinasa 2 LIM (Sumi, y col., J. Bio Chem 2001, 276, 670).

La inhibición de la actividad de la quinasa Rho en modelos animales ha demostrado una serie de beneficios de los inhibidores de la quinasa Rho para el tratamiento de enfermedades humanas. Han aparecido varias patentes reivindicando compuestos monohidrato de diclorhidrato de (+)-trans-4-(1-aminoetil)-1-(piridin-4-ilaminocarbonil) ciclohexano (documentos WO-00078351, WO-00057913) y de isoquinolinosulfonilo sustituido (documento EP-00187371) como inhibidores de la quinasa Rho con actividad en modelos animales. Entre estos se incluyen modelos de enfermedades cardiovasculares tales como la hipertensión (Uehata, y col. Nature 1997, 389, 990), la aterosclerosis (Retzer, y col. FEBS Lett. 2000, 466, 70), la restenosis (Eto, y col. Am J. Physiol Heart Circ Physiol 2000, 278, H1744; Negoro, y col. Biochem Biophys Res Commun 1999, 262, 211), la isquemia cerebral (Uehata, y col. Nature 1997, 389, 990: Seasholtz y col., Circ Res 1999, 84, 1186; Hitomi, y col. Life Sci 2000, 67, 1929; Yamamoto, y col. J Cardiovasc Pharmacol 2000, 35, 203), el vasoespasmo cerebral (Sato, y col, Circ Res 2000, 87, 195; Kim, y col. Neurosurgery 2000, 46, 440), la disfunción eréctil peniana (Chitaley, y col. Nat Med 2001, 7, 119), los trastornos del sistema nervioso central tales como la degeneración neuronal y la lesión de la médula espinal (Hara, y col. J Neurosurg 2000, 93, 94; Toshima, y col. Stroke 2000, 31, 2245) y en las neoplasias donde se ha demostrado que la inhibición de la quinasa Rho inhibe el crecimiento de las células tumorales y la metástasis (Itoh, y col. Nat Med 1999, 5, 221; Somlyo, y col. Biochem Biophys Res Commun 2000, 269, 652), la angiogénesis (Uchida, y col., Biochem Biophys Res Commun 2000, 269, 633; Gingras, y col. Biochem J 2000, 348 Pt 2, 273), los trastornos trombóticos arteriales tales como la agregación de plaquetas (Klages, y col. J. Cell Biol 1999, 144, 745; Retzer y col. Cell Signal 2000, 12, 645) y la agregación de leucocitos (Kawaguchi, y col., Eur J Pharmacol 2000, 403, 203; Sánchez-Madrid, y col., Embo J 1999, 18, 501), el asma (Setoguchi, y col. Br J Pharmacol 2001, 132, 111; Nakahara, y col. Eur J Pharmacol 2000, 389, 103), la regulación de la presión intraocular (Honjo, y col. Invest Ophthalmol Vis Sci 2001, 42, 137) y la resorción de hueso (Chellaiah, y col. J Biol Chem 2000, 275, 11993; Zhang, y col. J Cell Sci 1995, 108,
2285).

La inhibición de la actividad de la quinasa Rho en pacientes tiene beneficios para controlar los vasoespasmos cerebrales y la isquemia que siguen a la hemorragia subaracnoidea (Pharma Japan 1995, 1470, 16).

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Sumario de la invención

Los compuestos y sus derivados presentados en esta invención son útiles como inhibidores de la quinasa Rho y por tanto tienen utilidades en el tratamiento de la hipertensión, la aterosclerosis, la restenosis, la isquemia cerebral, el vasoespasmo cerebral, la degeneración neuronal, la lesión de la médula espinal, los cánceres de mama, colon, próstata, ovarios, cerebro y pulmón y sus metástasis, los trastornos trombóticos, el asma, el glaucoma y la osteoporosis.

Además, los compuestos de la invención son útiles para tratar la disfunción eréctil, esto es, la disfunción eréctil mediada por la quinasa Rho. La disfunción eréctil puede ser definida como una incapacidad para obtener o mantener una erección adecuada para el coito, documentos WO 94/28902, U.S.P. 6.103.765 y U.S.P. 6.124.461.

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La invención implica compuestos de las estructuras siguientes:

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2

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Los compuestos de la Fórmula I se pueden elaborar de acuerdo con procedimientos químicos convencionales, rutinarios, y/o como se describe más abajo, a partir de materiales de partida que están o bien disponibles en el mercado o bien producibles de acuerdo con procedimientos químicos convencionales, rutinarios. Los procedimientos para la preparación de los compuestos se dan más abajo en los Ejemplos.

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En los siguientes ejemplos, todas las temperaturas se exponen sin corregir en grados Celsius; y, a menos que se indique otra cosa, todas las partes y porcentajes son en peso.

La descripción completa de todas las solicitudes, patentes y publicaciones, citadas anteriormente o a continuación, y la Solicitud Provisional Nº 60/349.986, presentada el 23 de enero de 2002, se incorporan en el presente documento por referencia.

Abreviaturas y acrónimos

Cuando se utilizan las siguientes abreviaturas en la presente memoria descriptiva, tienen el siguiente significado:

Ac_{2}O: anhídrido acético

anhi: anhidro

n-BuOH: n-butanol

t-BuOH: t-butanol

CD_{3}OD: metanol-d_{4}

Celite®: agente de filtración de tierra de diatomeas, ® Celite Corp.

CH_{2}Cl_{2}: cloruro de metileno

CI-MS: espectroscopia de masas de ionización química

conc: concentrado

desc: descomposición

DME: dimetoxietano

DMF: N,N-dimetilformamida

DMSO: dimetilsulfóxido

ELSD: detector evaporativo de dispersión de luz

EtOAc: acetato de etilo

EtOH: etanol (100%)

Et_{2}O: éter dietílico

Et_{3}N: trietilamina

HPLC ES-MS: cromatografía líquida de alta resolución-espectroscopia de masas de electropulverización

NMM: 4-metilmorfolina

Ph_{3}P: trifenilfosfina

Pd(dppf)Cl_{2}: [1,1'-bis(difenilfosfino)ferroceno]-dicloropaladio(II)

Pd(PPh_{3})_{4}: tetrakis(trifenilfosfina)paladio(0)

Pd(OA_{c})_{2}: acetato de paladio

P(O)Cl3: oxicloruro de fósforo

RT: tiempo de retención (HPLC)

rt: temperatura ambiente

THF: tetrahidrofurano

TFA: ácido trifluoroacético

TCL: cromatografía en capa fina

Ejemplos experimentales

Todas las reacciones se realizaron en vidrio secado con llama o secado en horno bajo una presión positiva de argón seco, y se agitaron magnéticamente a no ser que se indique otra cosa. Los líquidos y soluciones sensibles se transfirieron a través de una jeringa o cánula, y se introdujeron en los vasos de la reacción a través de septos de goma. Los reactivos y disolventes de grado comerciales se usaron sin purificación adicional. La cromatografía en capa fina (TLC) se realizó en placas de 250 \mum precubiertas con gel de sílice 60 A F-254 reforzadas con vidrio de Analtech UNIPLATE^{TM}. La cromatografía en columna (cromatografía ultra-rápida) se realizó en un sistema Biotage usando cartuchos pre-envasados de gel de sílice, 60 A, de 32 - 63 micrómetros. La resonancia magnética nuclear de protón (^{1}H) (RMN) se midió con un espectrómetro Varian (300 MHz) con disolvente protonado residual (CHCl_{3} \delta 7,26; MeOH \delta 3,30; DMSO \delta 2,49) como patrón. Los espectros de masas de baja resolución (EM) se obtuvieron o bien como espectros de masas por impacto electrónico (IE) o bien como espectros de masas por bombardeo atómico rápido (BAR).

La designación IUPAC se obtuvo usando el servicio Web ACD/ILab.

A. Preparación de intermedios de cloropirimidina

Intermedio A1

Preparación de 2-amino-4-cloro-5,6-dimetil-pirimidina

15

Etapa 1

Preparación de 2-amino-5,6-dimetil-pirimidinona

16

A una solución de 2-acetoacetato de etilo (6,0 g, 41,6 mmol) y carbonato de guanidina (5,6 g, 31,2 mmol) en EtOH (32 ml) se añadió HCl 12 N (350 \mul). La mezcla se mantuvo a reflujo durante 16 horas. Después, la reacción se enfrió a temperatura ambiente, el sólido se recogió por filtración y se lavó con EtOH. Una solución del sólido se mantuvo a reflujo en NaOH 1 N durante 3 horas. Después, la reacción se enfrió a temperatura ambiente, la mezcla acuosa se ajustó a pH = 5 con ácido acético concentrado. El precipitado resultante se recogió por filtración, se lavó con agua y después con hexanos, y se secó a vacío. El compuesto deseado (6,34 g, 45,6 mmol; rendimiento al 100%); ^{1}H RMN (D_{2}O; NaOD) \delta 1,47 (s, 3H), 1,29 - 1,30 (m, 2H), 1,22 (s, 3H); ES MS [M+H]^{+} = 140.

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Etapa 2

Preparación de 2-amino-4-cloro-5,6-dimetil-pirimidina

17

El producto de la etapa anterior (2,0 g, 14,4 mmol) y oxicloruro de fósforo (6 ml, 57,5 mmol), se mantuvo a reflujo durante 4 horas. La reacción se enfrió a rt y se vertió sobre hielo. La mezcla se separó y la fase acuosa se extrajo con cloroformo (3 x 75 ml). La mezcla acuosa se ajustó a pH = 9 con hidróxido de amonio concentrado. El producto sólido resultante se recogió por filtración, se lavó con agua, y se secó en vacío. El compuesto deseado (963 mg, 6,1 mmol; rendimiento al 43%); mp = 212 - 220ºC; ES MS [M+H]^{+} = 158; TLC (CH_{2}Cl_{2} - MeOH, 90:10); R_{f}= 0,72.

Intermedio A2

Preparación de 2-amino-4-cloro-6-(4-piridil)pirimidina

18

Etapa 1

Preparación de 2-amino-4-hidroxi-6-(4-piridil)pirimidina

19

Una solución de carbonato de guanidina (7,1 g, 39 mmol, 1,5 eq), isonicotinoil acetato de etilo (10 g, 51,76 mmol), y ácido clorhídrico (0,75 ml, 9,0 mmol) en etanol absoluto (80 ml) se mantuvo a reflujo bajo argón durante toda la noche. El precipitado formado se filtró, se lavó con etanol y se secó. Después el sólido se disolvió en NaOH 1 N (100 ml) y se mantuvo a reflujo durante 2 horas. La mezcla de la reacción se enfrió después a temperatura ambiente, se acidificó con ácido acético glacial, y el sólido formado se filtró y se secó para proporcionar el producto deseado en forma de un sólido blanco (5,45 g, 56%). ^{1}H RMN (DMSO-\delta_{6}) \delta 6,24 (s, 1H), 6,79 (sa, 2H), 7,85 (d, J=5,1 Hz, 2H), 8,62 (d, J=5,3 Hz, 2H), 11,22 (sa, 1H).

Etapa 2

Preparación de 2-amino-4-cloro-6-(4-piridil)pirimidina

20

Una solución de 2-amino-4-hidroxi-6-(4-piridil)pirimidina (5,45 g, 29 mmol) en POCl_{3} (12 ml) se mantuvo a reflujo bajo argón durante 5 horas. La mezcla de la reacción se enfrió a temperatura amiente, se vertió sobre hielo, y se dejó agitar a temperatura ambiente durante 2 horas para asegurar la interrupción de POCl_{3}. En ese momento, la mezcla se hizo básica tras la adición de NaOH 1 N y el sólido pardo se filtró para proporcionar 4,52 g de producto bruto, que se usó sin purificación adicional (el análisis RMN mostró 1:1 producto / material de partida). El filtrado formó más sólido tras permanecer a temperatura ambiente (1 g, el análisis RMN mostró 2:1 producto / material de partida). ^{1}H RMN (DMSO-\delta_{6}) \delta 7,34 (sa, 2H), 7,38 (s, 1H), 7,99 (d, J=4,2 Hz, 2H), 8,72 (d, J=4,6 Hz, 2H).

Intermedio A3

Preparación de 2-amino-4-cloro-6-(2-tienil)pirimidina

21

Etapa 1

Preparación de etil-2-(tiofeno-2-oil)acetato

22

Una solución de ácido tiofeno-2-carboxílico (8,9 g, 68,5 mmol), 2,2-dimetil-1,3-dioxano-4,6-diona (12,0 g, 81,6 mmol), y 4-dimetilaminopiridina (17,0 g, 138 mmol) en CH_{2}Cl_{2} seco (100 ml) se enfrió a 0ºC y se trató con una solución de 1,3-diciclohexilcarbodiimida (75 ml, 1,0 M en CH_{2}Cl_{2}, 75 mmol). La reacción se dejó agitar a temperatura ambiente durante 2 horas y la diciclohexilurea se filtró después y se lavó con CH_{2}Cl_{2}. El filtrado se concentró a presión reducida y el residuo se disolvió en etanol absoluto (400 ml). Después la solución se trató con una solución de monohidato de ácido p-toluenosulfónico (32 g, 168 mmol) en etanol absoluto (100 ml) y se mantuvo a reflujo bajo argón durante 1 hora. En ese momento, el etanol se retiró a presión reducida y el residuo se disolvió en EtOH y se lavó secuencialmente con H_{2}O (300 ml), NaHCO_{3} saturado (200 ml), HCl 1 N (200 ml), NaCl saturado, y se secó (MgSO_{4}). El disolvente se retiró a presión reducida y el residuo se filtró a través de un lecho de sílice con EtOAc al 10% / hexanos al 90% para proporcionar el producto deseado en forma de un aceite (13 g, 96%). TLC (EtOAc al 20% / hexano al 80%) Rf 0,21; ^{1}H RMN (DMSO-d_{6}) \delta 1,17 (t, J=7,01, 3H), 4,06 - 4,14 (m, 4H), 7,25 (t, J=5,1 Hz, 1H), 7,98 (d, J=3,8 Hz, 1H), 8,06 (d, J=4,9 Hz, 1H).

Etapa 2

Preparación de 2-amino-4-hidroxi-6-(2-tienil)pirimidina

23

El procedimiento era similar al usado para el Intermedio A2, etapa 1, usando etil-2-(tienil-2-oil)acetato como material de partida. (Rendimiento al 43%). TLC (MeOH al 6%/ CH_{2}Cl_{2} al 94%) R_{f} 0,23; MS ES 194 [M+H]^{+}; ^{1}H RMN (DMSO-d_{6}) \delta 6,06 (s, 1H), 6,70 (sa, 2H), 7,11 (t, J=4,9 Hz, 1H), 7,64 (d, J=4,9 Hz, 1H), 7,70 (d, J=3,6 Hz, 1H), 10,95 (sa, 1H).

Etapa 3

Preparación de 2-amino-4-cloro-6-(2-tienil)pirimidina

24

El procedimiento era similar al usado para el Intermedio A2, etapa 2, usando 2-amino-4-hidroxi-6-(2-tiofeno)pirimidina como material de partida. (Proporcionó un rendimiento al 33% después de la purificación sobre sílice con EtOAc al 15% / hexanos al 85%. TLC (EtOAc al 20% / hexanes al 80%) R_{f} 0,29; ^{1}H RMN (DMSO-d_{6}) \delta 7,16 - 7,23 (m, 4H), 7,77 (dd, J=0,8, 5,0 Hz, 1H), 7,98 (dd, J=1,0, 3,8 Hz, 1H).

Intermedio A4

Preparación de 2-amino-4-cloro-6-(2-furil)pirimidina

25

Etapa 1

Preparación de 2-amino-4-hidroxi-6-(2-furil)pirimidina

26

Se usó el procedimiento general para la preparación del Intermedio A2, (etapa 1); (rendimiento al 37%). MS (ES) 178 [M+H]^{+}.

Etapa 2

Preparación de 2-amino-4-cloro-6-(2-furil)pirimidina

27

Una solución de 2-amino-4-hidroxi-6-(2-furil)pirimidina (1,40 g, 7,9 mmol) en POCl_{3} (4 ml) se mantuvo a reflujo bajo argón durante 2 horas. El POCl_{3} se destiló; el residuo se diluyó con EtOAc y se vertió sobre NaHCO_{3} saturado helado. Las fases se separaron y la acuosa se extrajo con EtOAc (100 ml). Los extractos reunidos se lavaron con NaCl saturado, se secaron (MgSO_{4}), y el disolvente se retiró a presión reducida para proporcionar 0,5 g de producto bruto, que se usó sin purificación adicional. TLC (EtOAc al 20% / hexane al 80%) R_{f} 0,26; ^{1}H RMN (DMSO-d_{6}) \delta 6,68 (dd, J=1,7,3,4 Hz, 1H), 6,94 (s, 1H), 7,25 (dd, J=1,3,7 Hz, 1H), 7,91 (dd, J=0,8, 1,9 Hz, 1H).

Intermedio A5

Preparación de 6-bencil-4-cloro-5,6,7,8-tetrahidropirido[4,3-d]pirimidin-2-amina

28

Etapa 1

Preparación de 2-amino-7-bencil-5,6,7,8-tetrahidropirido[3,4-d]pirimidin-4(3H)-ona

29

A EtOH (16 ml) enfriado a 0ºC (baño de hielo / H_{2}O) se añadió esferas de Na (204 mg, 8,9 mmol). La mezcla se agitó hasta que todo el Na se disolvió. Se añadió clorhidrato de 1-bencil-4-oxo-3-piperidina-carboxilato metílico (3,0 g, 10,1 mmol) y carbonato de guanidina (1,4 g, 7,6 mmol). La mezcla se mantuvo a reflujo durante 16 horas. Después la reacción se enfrió a temperatura ambiente, el sólido se recogió por filtración, se lavó con EtOH, y se secó en vacío. El compuesto deseado (2,58 g, 10,0 mmol; rendimiento al 99+%); mp = 202 - 212º (dec.); ES MS [M+H]^{+}= 257; TLC (CH_{2}Cl_{2} - MeOH, 90:10); R_{f}= 0,20.

Etapa 2

30

Una solución del producto de la etapa 1 (3,5 g, 13,7 mmol) en POCl_{3} (52 ml) se mantuvo a reflujo bajo argón durante 5 horas. La mezcla de la reacción se enfrió a temperatura ambiente, se vertió sobre hielo, y se dejó agitar a temperatura ambiente durante 2 horas para asegurar la interrupción de POCl_{3}. En ese momento, la mezcla se hizo básica tras la adición de hidróxido de amonio y se extrajo con CH_{2}Cl_{2} (3 x 200 ml). Los extractos orgánicos reunidos se lavaron con NaOH 1 N seguido de salmuera, se secaron (MgSO_{4}), y se concentraron a presión reducida. El residuo se recogió en benceno y se hizo ácido tras la adición de HCl 1 N en éter dietílico. El sólido pardo se filtró para proporcionar 0,35 g de producto bruto, que se usó sin purificación adicional. ES MS [M+H]^{+} = 275.

Intermedio A6

Preparación de 2-amino-6-(trifluorometil)-4-pirimidinil-4-metilbencenosulfonato

31

A una solución de 2-amino-6-(trifluorometil)-4(3H-pirimidinona) (250 mg, 1,4 mmol), trietilamina (196 \mul, 1,4 mmol), N,N dimetilaminopiridina (17 mg, 0,14 mmol), en CH_{2}Cl_{2} (13 ml) enfriada a 0ºC se añadió cloruro de p-toluenosulfonilo (534 mg, 2,8 mmol). La mezcla se agitó a temperatura ambiente durante 16 h. La mezcla se diluyó con CH_{2}Cl_{2}, se lavó con H_{2}O (2 x 20 ml) seguido de salmuera, se secó (Na_{2}SO_{4}), se evaporó, y se secó en vacío. El compuesto deseado (466 mg, 1,4 mmol; rendimiento al 99+%; ES MS [M+H]^{+} = 140.

Usando los procedimientos anteriores para la preparación de A1-A6 y sustituyendo los materiales de partida apropiados, también se prepararon los siguientes intermedios de pirimidina.

TABLA 1

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32

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B. Preparación de intermedios de arilamina

Intermedio B1

Preparación de 1-(4-piridinil)-1H-indol-5-amina

34

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Etapa 1

Preparación de 5-nitro-1-(4-piridinil)-1H-indol

35

A una solución de 5-nitroindol (7,0 g, 43,2 mmol) y clorhidrato de 4-cloropiridina (7,8 g, 51,8 mmol) en DMF (43 ml) se añadió terc-butóxido de potasio (12,1 g, 108,0 mmol), en porciones. La reacción se calentó a 100ºC durante 48 horas. La mezcla se dejó enfriar a temperatura ambiente y se vertió en agua (400 ml). El sólido resultante se retiró por filtración y se secó en vacío. El compuesto deseado (6,04 g, 25,3 mmol; rendimiento al 58%); ^{1}H RMN (DMSO-d_{6}) \delta 8,76 (dd, J=1,7, 4,5, 2H), 8,68 (d, J= 2,2, 1H), 8,06 - 8,13 (m, 2H), 7,92 (d, J= 9,2, 1H), 7,75 (dd, J=1,5, 4,6, 2H), 7,07 (dd, J= 0,9, 3,5, 1H); ES MS [M+H]^{+}= 240.

Etapa 2

Preparación de 1-(4-piridinil)-1H-indol-5-amina

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36

Una mezcla del producto de la etapa 1 (8,27 g, 34,6 mmol) y catalizador de paladio sobre carbón vegetal al 10% (827 mg) en acetato de etilo (166 ml) y EtOH (9 ml) se agitó en hidrógeno a presión atmosférica durante 48 horas. Se añadió otro catalizador (414 mg) y la reacción se agitó durante 24 horas. De nuevo, se añadió otro catalizador (414 mg) y la reacción se agitó 24 horas más. El catalizador se retiró por filtración a través de tierra de diatomeas y el disolvente se retiró del filtrado por evaporación. El residuo se trituró con éter, se recogió por filtración, y se secó en vacío. El compuesto deseado (4,67 g, 22,3 mmol; rendimiento al 65%); mp = 149 - 154ºC; ES MS [M+H]^{+} = 210; TLC (CH_{2}Cl_{2} - MeOH, 95:5); R_{f}= 0,29.

Intermedio B2

Preparación de 4-[(4-aminofenil)sulfanil]fenol

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37

Etapa 1

Preparación de 4-[(4-nitrofenil)sulfanil]fenol

38

A una solución de cloruro de nitrobencenosulfonilo (4 g, 21 mmol) en éter (25 ml) se añadió fenol (1,97 g, 20 mmol) en forma de una solución en éter (25 ml). Después de agitarse durante 15 horas a rt, la mezcla se concentró para proporcionar un sólido bruto que se recristalizó a partir de ácido acético.

El compuesto deseado (4,0 g, 16,2 mmol, rendimiento al 76%). TLC (Hexanos / EtOAc, 70:30); R_{f} = 0,54.

Etapa 2

Preparación de 4-[(4-aminofenil)sulfanil]fenol

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39

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A una solución del producto de la etapa 1 (4 g, 16,2 mmol) en EtOH (500 ml) se añadió SnCl_{2}\bullet2H_{2}O (18,3 g, 81 mmol). La solución se calentó a reflujo. Después de agitarse durante 3 horas, la mezcla se dejó enfriar a rt, y los compuestos volátiles se retiraron por rotavapor. La suspensión resultante se suspendió en EtOAc, y se añadió NaHCO_{3} sólido. Subsiguientemente, la mezcla se filtró y el sólido filtrado se lavó concienzudamente con EtOAc. El filtrado orgánico se lavó con agua, y los lavados acuosos se extrajeron con EtOAc. Los extractos orgánicos reunidos se lavaron con salmuera, se secaron (MgSO_{4}), se filtraron y se concentraron para proporcionar un sólido naranja, que se usó sin purificación adicional. Compuesto deseado (3,0 g, 13,8 mmol, rendimiento al 86%).

TLC (Hexanos / EtOAc, 70:30); R_{f} = 0,34.

Intermedio B3

Preparación de (3-aminofenil)[4-metilsulfanil)fenil]metanona

40

Etapa 1

Preparación de [4-(metilsulfanil)fenil](3-nitrofenil)metanona

41

Se añadió 3-nitrobenzoilcloruro (5,0 g, 26,94 mmol) a una solución de tioanisol (3,16 ml, 26,94 mmol) y 1,2-dicloroetano (95 ml). La mezcla de la reacción resultante se enfrió a 0ºC (baño de hielo / H_{2}O) y se añadió 0,5 equivalentes de tricloruro de aluminio (1,8 g, 13,47 mmol). La reacción se dejó agitar durante 15 minutos a esta temperatura y se retiró el baño frío seguido de la adición de los equivalentes restantes de AlCl_{3} (2,51 g, 18,87). La solución de la reacción se volvió un amarillo/verdoso oscuro y se dejó agitar a temperatura ambiente durante 18 horas, al cabo de las cuales la reacción se interrumpió lentamente con H_{2}O (50 ml). La mezcla se diluyó con CH_{2}Cl_{2} (50 ml) y se lavó con H_{2}O (3 x 50 ml), y las fases orgánicas reunidas se lavaron con NaHCO_{3} saturado (50 ml), se secaron (MgSO_{4}) y se concentraron a presión reducida. El material bruto se purificó por cromatografía en columna sobre gel de sílice (EtOAc / hexano, ¼) para proporcionar 3,3 g (44%) de 4-(metilsulfanil)fenil](3-nitrofenil)metanona en forma de un sólido. EI - LRMS m/z 274 (M^{+}); TLC R_{f} 0,68 (EtOAc / Hex, 2/3).

Etapa 2

Preparación de (3-aminofenil)[4-(metilsulfanil)fenil]metanona

42

Preparado de forma análoga al Intermedio B2, etapa 2. El producto bruto se purificó por cromatografía en columna ultra-rápida, eluyendo con 70:30 Hexanos / EtOAc. TLC: (Hexanos / EtOAc, 70:30);

R_{f}=0,15.

Intermedio B4

Preparación de 4-(4-aminofenoxi)fenol

43

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Etapa 1

Preparación de 4-(4-nitrofenoxi)fenol

44

Una mezcla de p-nitrofluorobenceno (25 g, 0,177 mol), dihidroquinona (19,5 g, 0,177 mol), e hidróxido de sodio (7,08 g, 0,177 mol) en EtOH / H2O (1:1 v/v, 176 ml) se calentó a reflujo durante 20 horas, y subsiguientemente se dejó enfriar a temperatura ambiente. La mezcla de filtró, el filtrado se hizo ácido con HCl diluido acuoso, y el precipitado resultante se filtró para proporcionar el producto bruto en forma de un sólido amarillo. El producto deseado se recristalizó a partir de EtOH. (15 g, 0,064 mol, rendimiento al 37%). TLC (Hexanos / EtOAc, 70:30); R_{f} = 0,44.

Etapa 2

Preparación de 4-(4-aminofenoxi)fenol

45

A una solución del producto de la etapa 1 en EtOH (100 ml) se añadió paladio sobre carbono al 10% (200 mg). Después de agitarse bajo una atmósfera de hidrógeno durante toda la noche, la mezcla se filtró a través de Celite ®. Los compuestos volátiles se retiraron del filtrado para proporcionar el producto bruto que se purificó por cromatografía en columna ultra-rápida eluyendo con Hexanos / EtOAc (85:15, seguido de 75:25). Producto deseado (1,5 g, 7,45 mmol; 86%). TLC (Hexanos / EtOAc, 70:30); R_{f} = 0,41.

Intermedio B5

Preparación de 4-(4-piridiniltio)anilina

46

A una solución de 4-aminotiofenol (20,2 g, 156,5 mmol) en DMF anhidro (200 ml) se añadió clorhidrato de 4-cloropiridina (24,4 g, 161,0 mmol) seguido de carbonato de potasio (44 g, 318, 4 mmol). La mezcla de la reacción se calentó a 80ºC durante toda la noche, después se diluyó acetato de etilo (400 ml) y agua (400 ml). La fase acuosa se volvió a extraer con acetato de etilo (2 x 200 ml). Las fases orgánicas reunidas se lavaron con una solución acuosa saturada de NaCl (200 ml), se secaron sobre MgSO_{4} anhidro y se concentraron a presión reducida. El residuo se filtró a través de un lecho de sílice con acetato de etilo y el material resultante se trituró con una solución éter etílico / hexano para proporcionar el producto deseado (24,7 g, 78%). TLC (acetato de etilo al 50% / hexane al 50%) R_{f} 0,25; ^{1}H RMN (DMSO-d_{6}) \delta 5,67 (sa, 2H), 6,65 (d, J = 8,4 Hz, 2H), 6,88 (d, J = 6,2 Hz, 2H), 7,19 (d, J = 8,4 Hz, 2H), 8,27 (d, J = 6, 2 Hz, 2H), MS [M+H]^{+} = 203.

Intermedio B6

Preparación de 4-[2-(4-piridinil)etil]anilina

47

Etapa 1

Preparación de 4-[(E)-2-(4-nitrofenil)etenil]piridina

48

A un matraz de 3 bocas de 500 ml secado en horno se añadió bromuro de (4-nitrobencil)trifenilfosfonio (15 g, 30,42 mmol) seguido de la adición de THF (100 ml). La solución se enfrió a 0ºC en un baño de hielo. Después se añadió t-butóxido de potasio (3,9 g, 33,02 mmol) en una porción resultando en una suspensión naranja. La suspensión se mantuvo a 0ºC mientras se añadía una solución de 4-piridina-2-carboxaldehido (2,7 g, 24,70 mmol) en THF (20 ml) en 10 minutos. El baño de hielo se retiró y la reacción se agitó a temperatura ambiente durante 2 horas. En ese momento la reacción se interrumpió con solución de cloruro de amonio saturado (50 ml) y se agitó durante 15 minutos. Después la mezcla se extrajo con acetato de etilo (2 x 100 ml), los extractos reunidos se lavaron con solución de NaCL acuosa saturada (100 ml) y se secaron (MgSO_{4}). El disolvente se retiró a presión reducida y el residuo se cromatografió sobre sílice con acetato de etilo al 0% - 50% en hexanos para proporcionar el producto deseado (1,8 g, 32%). TLC (acetato de etilo al 50% / hexano al 50%) R_{f} 0,28; ^{1}H RMN (DMSO-d_{6}) \delta 6,84 (d, J=12,4Hz, 1H), 6,96 (d, J=12,4Hz, 1H), 7,14 (d, J=6,2Hz, 2H), 7,45 (d, J=8,7Hz, H), 8,15 (d, J=8,7Hz, 2H), 8,47 (d, J=6,2Hz, 2H).

Etapa 2

Preparación de 4-[2-(4-piridinil)etil]anilina

49

A un matraz de 50 ml seco purgado con argón se añadió Pd sobre carbono al 10% (285 mg) seguido de la adición de etanol (12 ml) y el producto de la etapa 1 (1,8 g, 8,0 mmol). En ese momento, la línea de argón se sustituyó con un globo de hidrógeno y la reacción se agitó durante toda la noche. La mezcla se filtró a través de un lecho de Celite ® y el filtrado se concentró a presión reducida. El residuo sólido se trituró con éter etílico / hexanos para proporcionar el producto deseado. (1,2 g, 67%). TLC (acetona al 4% / cloruro de metileno al 96%) R_{f} 0,09; ^{1}H RMN (DMSO-d_{6}) \delta 2,67 - 2,83 (m, 4H), 4,83 (sa, 2H), 6,45 (d, J=8,2Hz, 2H), 6,84 (d, J=8,2Hz, 2H), 7,20 (d, J=6Hz, 2H), 8,41 (d, J=6Hz, 2H).

Intermedio B7

Preparación de 3-fluoro-4-(4-piridinilsulfanil)anilina

50

Etapa 1

Preparación de 4-[(2-fluoro-4-nitrofenil)sulfanil]piridina

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51

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Una solución de 4-mercaptopiridina (4,2 g, 35,6 mmol), 3,4-difluoronitrobenceno (5,7 g, 35,7 mmol), y carbonato de potasio (12,4 g, 89,7 mmol) en DMF anhidro (40 ml) se agitó a 40ºC y bajo argón durante 3 horas. TLC mostró la reacción completa. La mezcla se diluyó con acetato de etilo (100 ml) y agua (100 ml) y la fase acuosa se volvió a extraer con acetato de etilo (2 x 100 ml). Las fases orgánicas se lavaron con una solución de NaCl saturada (100 ml) se secaron (MgSO_{4}) y se concentraron a presión reducida. El producto bruto se purificó por cromatografía en columna con acetato de etilo al 50% / hexanos al 50%. Proporcionó el producto deseado en forma de un sólido amarillo (6,3 g, 71%). TLC (EtOAc al 50% / hexane al 50%). R_{f} 0,53; ^{1}H RMN (DMSO-d_{6}) \delta 7,27 (dd, J=0,76, 4,2 Hz, 2H), 7,78 (dt, J=0,76, 7,2 Hz, 1H), 8,11 - 8,15 (m, 1H), 8,28 - 8,33 (m, 1H), 8,5 (dd, J=1,4, 4,6 Hz, 2H), MS [M+H] ^{+}= 251.

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Etapa 2

Preparación de 3-fluoro-4-(4-piridinilsulfanil)anilina

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52

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Una suspensión de 3-fluoro-4-piridiniltio)nitrobenceno (6,3 g, 25,2 mmol), polvo de hierro (6,0 g, 107,4 mmol), ácido acético (100 ml), y agua (1 ml) se agitaron a temperatura ambiente durante toda la noche. La mezcla se diluyó con Et_{2}O (100 ml) y agua (100 ml). La fase acuosa se ajustó a pH 5 con una solución de NaOH 4 N. Las fases orgánicas reunidas se lavaron con una solución acuosa saturada de NaCl (100 ml), se secaron (MgSO_{4}) y se concentraron a presión reducida. El residuo se purificó por cromatografía en columna con acetato de etilo al 50% / hexanos al 50%. Proporcionó el producto deseado en forma de un sólido blanco (4,8 g, 86%). TLC (EtOAc al 50% / hexano al 50%). R_{f} 0,28; ^{1}H RMN (DMSO-d_{6}) \delta 6,04 (sa, 2H), 6,47-6,51 (m, 2H), 6,91 (d, J=6,1 Hz, 2H), 7,22 (t, J=8,4 Hz, 1H), 8,30 (d, J=6,4 Hz, 2H).

Usando procedimientos similares a los descritos para la preparación de los Intermedios B1 - B7, también se prepararon los siguientes compuestos adicionales:

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(Tabla pasa a página siguiente)

TABLA 2 Intermedios B de arilamina

53

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\dotable{\tabskip\tabcolsep#\hfil\tabskip0ptplus1fil\dddarstrut\cr}{
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54

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C. Preparación de los ejemplos de la invención Ejemplo 1 Preparación de N-(2-amino-6-metil-4-piyrimidinil)-N-[3-fluoro-4-(4-piridinilsulfanil)fenil]amina

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55

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Una suspensión de 2-amino-4-cloro-6-metilpirimidina (Intermedio A7, 0,2 g, 1,3 mmol), 3-fluoro-4-(4-piridiniltio) anilina (Intermedio B7, 0,3 g, 1,3 mmol), y K_{2}CO_{3} (0,2 g, 1,3 mmol) en o-xileno (1,3 ml) se calentó a 100ºC en un vial de reacción de 5 ml durante toda la noche. La mezcla de la reacción se diluyó con MeOH y se revistió sobre sílice y se purificó por MPLC (Biotage) con MeOH al 5% - 7% en CH_{2}Cl_{2}. Proporcionó 74 mg de producto (rendimiento al 18%). TLC (MeOH al 6% / CH_{2}Cl_{2} al 94%) R_{f} 0,29; MS ES 328 [M+H]^{+}; ^{1}H RMN (DMSO-d_{6}) \delta 2,12 (s, 3H), 5,92 (s, 1H), 6,38 (sa, 2H), 6,96 (d, J=5,1 Hz, 2H), 7,39 - 7,52 (m, 2H), 8,26 (d, J=11,9 Hz, 1H), 8,33 (d, J=4,8 Hz, 2H), 9,55 (sa, 1H).

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Ejemplo 2 Preparación de 6-etil-N4-[3-fluoro-4-(4-piridinilsulfanil)fenil]-2,4-pirimidinadiamina

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56

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2-Amino-4-cloro-6-etilpirimidina (Intermedio A8, 55,1 mg, 0,25 mmol) e Intermedio B7 (39,4 mg, 0,25 mmol) se suspendieron en HCl 0,01 M acuoso (500 \mul). La mezcla se mantuvo a reflujo durante 6 horas. La reacción se enfrió a temperatura ambiente y el disolvente se evaporó por vacío. El residuo se purificó por cromatografía en fase inversa sobre una columna YMC Pack-pro C18 (marca comercial) eluyendo con acetonitrilo / H_{2}O (gradiente 10:90 - 90:10). El compuesto se volvió a purificar por TLC de preparación eluyendo con CH_{2}Cl_{2} - MeOH (90:10). Compuesto deseado (2,9 mg, 0,0085 mmol; rendimiento al 34%); ^{1}H RMN (Metanol-d_{4}) 8,16 (dd, J=1,7, 4,7, 2H), 8,00 - 8,04 (m, 1H), 7,37 (m, 2H), 6,93 (dd, J=1,8, 4.9, 2H), 5,91 (s, 1H), 2,39 (q, J = 7,7, 2H), 1,13 (t, J= 7,5, 3H);ES MS [M+H]^{+}= 342; TLC (CH_{2}Cl_{2} - MeOH, 90:10); R_{f}= 0,48.

Ejemplos 3-26

Usando los procedimientos anteriores, los ejemplos siguientes de piridinas se sintetizaron y resumieron en la Tabla 3.

57

58

59

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\dotable{\tabskip\tabcolsep#\hfil\tabskip0ptplus1fil\dddarstrut\cr}{
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60

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Seleccionando combinaciones de los Intermedios apropiados A1 - A21 con los Intermedios B1 - B17, se prepararon una diversidad de productos de manera similar y se describen en los Ejemplos 27 - 31.

Ejemplo 27 Preparación de N-(2-amino-6-metil-4-pirimidinil)-N-{4-[(4-piridinilmetil)sulfanil]fenil}amina

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61

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Preparado en rendimiento al 34% a partir del Intermedio A7 y B8: TLC (MeOH al 7% en CH_{2}Cl_{2}) R_{f} 0,36; MS (ES) 324[M+H]^{+}; ^{1}H RMN (DMSO-d_{6}) \delta 2,09 (s, 3H), 4,12 (s, 2H), 5,87 (s, 1H), 6,33 (sa, 2H), 7,19 (d, J=8,5 Hz, 2H), 7,23 (d, J=5,8 Hz, 2H), 7,64 (d, J=8,5 Hz, 2H), 8,43 (d, J=5,3 Hz, 2H), 9,20 (sa, 1H).

Ejemplo 28 Preparación de N-(2-amino-6-metil-4-pirimidinil)-N-{4-[(4-piridinilsulfanil)metil]feniyl}amina

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62

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Preparado en rendimiento al 6% a partir del Intermedio A7 y B8: TLC (MeOH al 7% en CH_{2}Cl_{2}) R_{f} 0,38; MS (ES) 342 [M+H]^{+}; ^{1}H RMN (DMSO-d_{6}) 8 2,06 (s, 3H), 4,30 (s, 2H), 5,84 (s, 1H), 6,13 (sa, 2H), 7,27 - 7,31 (m, 4H), 7,63 (d, J=7,9 Hz, 2H), 8,33 (d, J=6,1Hz, 2H), 8,99 (sa, 1H).

Ejemplo 29 Preparación de N-(2-amino-6-metil-4-pirimidinil)-N-{4-[2-(4-piridinil)etil]fenil}amina

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63

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Preparado en rendimiento al 30% a partir del Intermedio A7 y B6: TLC (MeOH al 8% en CH_{2}Cl_{2}) R_{f} 0,34; MS (ES) 306 [M+H]^{+}; ^{1}H RMN (DMSO-d_{6}) \delta 2,06 (s, 3H), 2,83 - 2,87 (m, 4H), 5,82 (s, 1H), 6,09 (sa, 2H), 7,07 (d, J=8,5 Hz, 2H), 7,21 (d, J=5,8 Hz, 2H), 7,54 (d, J=8,5 Hz, 2H), 8,41 (d, J=6,2 Hz, 2H), 8,87 (s, 1H).

Ejemplo 30 Preparación de N-(2-amino-6-metil-4-pirimidinil)-N-[4-(4-piridinilsulfanil)-3-(trifluorometil)fenil]amina

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Preparado en rendimiento al 1,2% a partir de A7 y B9: TLC (MeOH al 7% en CH_{2}Cl_{2}) R_{f} 0,39; MS (ES) 378 [M+H]^{+}; ^{1}H RMN (DMSO-d_{6}) \delta 2,03 (s, 3H), 5,94 (s, 1H), 6,33 (sa, 2H), 6,91 (d, J=6,5 Hz, 2H), 7,64 (d, J=8,9 Hz, 1H), 8,19 (d, J=2,2 Hz, 1H), 8,33 (d, J=5,9 Hz, 2H), 8,37 (dd, J=2,1, 8,6 Hz, 1H), 9,66 (s, 1H).

Ejemplo 31 Preparación de N-(2-amino-6-metil-4-pirimidinil)-N-[4-(5-isoquinoliniloxi)fenil]amina

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Preparado en rendimiento al 30% a partir de A7 y B10: TLC (MeOH al 6% en CH_{2}Cl_{2}) R_{f} 0,39; MS (ES) 344 [M+H]^{+}; ^{1}H RMN (DMSO-d_{6}) \delta 2,08(s, 3H), 5,85 (s, 1H), 6,11 (sa, 2H), 7,02 - 7,08 (m, 3H), 7,58 (t, J=8,1 Hz, 1H), 7,74 (d, J=8,6 Hz, 2H), 7,84 (d, J=8,2 Hz, 1H), 7,98 (d, J=5,8 Hz, 1H), 8,54 (d, J=5,9 Hz, 1H), 9,03 (sa, 1H), 9,35 (sa, 1H).

Ejemplo 32 Preparación de N-(2-amino-6-metil-4-pirimidinil)-N-[3-fluoro-4-(5-isoquinoliniloxi)fenil]amina

66

Una suspensión de 2-amino-4-cloro-6-metilpirimidina (Intermedio A7, 0,14 g, 1,0 mmol), 3-fluoro-4-(5-isoquinolin-oxi)anilina (Intermedio B10, 0,25 g, 1,0 mmol), y HCl (0,1 ml) in H_{2}O (1,0 ml) se calentó a 70ºC en un vial de reacción de 5 ml durante toda la noche. La mezcla de la reacción se diluyó con MeOH, se trató con NaHCO_{3} saturado, y se revistió sobre sílice y se purificó por MPLC (Biotage) con MeOH al 5% en CH_{2}Cl_{2}. Proporcionó 52 mg de producto (rendimiento al 14%). TLC (MeOH al 6% / CH_{2}Cl_{2} al 94%) R_{f} 0,45; MS (ES) 362 [M+H]^{+}; ^{1}H RMN (DMSO-d_{6}) \delta 2,10 (s, 3H), 5,88 (s, 1H), 6,29 (sa, 2H), 6,93 (d, J=7,9 Hz, 1H), 7,22 (t, J=8,9 Hz, 1H), 7,34 (dd, J=1,7, 8,9 Hz; 1H), 7,55 (t, J=8,1 Hz, 1H), 7,82 (d, J=8,3 Hz, 1H), 8,08 (d, J=5,6 Hz, 1H), 8,21 (dd, J=2,6, 14,2 Hz, 1H), 8,58 (d, J=5,9 Hz, 1H), 9,30 (sa, 1H), 9,36 (s, 1H).

Usando el procedimiento anteriormente descrito para el Ejemplo 32, los Ejemplos 33 - 41 se prepararon de forma similar.

Ejemplo 33 Preparación de N-(2-amino-6-metil-4-pirimidinil)-N-[3,5-dicloro-4-(4-piridinilsulfanil)fenil]amina

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67

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Preparado en rendimiento al 10% a partir de A7 y B14: TLC (MeOH al 5% en CH_{2}Cl_{2}) R_{f} 0,14; MS (ES) 378 [M+H]^{+}; ^{1}H RMN (DMSO-d_{6}) \delta 2,14 (s, 3H), 5,92 (s, 1H), 6,49 (sa, 2H), 6,93 (d, J=6,1 Hz, 2H), 8,13 (s, 2H), 8,35 (d, J=6,2 Hz, 2H), 9,63 (sa, 1H).

Ejemplo 34 Preparación de N-(2-amino-6-metil-4-pirimidinil)-N-[3,5-dicloro-4-(5-isoquinoliniloxi)fenil]amina

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68

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Preparado en rendimiento al 58% a partir de A7 y B12: TLC (EtOAc al 70% / hexanos al 30%) R_{f} 0,18; MS (ES) 412 [M+H]^{+}; ^{1}H RMN (DMSO-d_{6}) \delta 2,13 (s, 3H), 5,89 (s, 1H), 6,38 (sa, 2H), 6,73 (d, J=7,6 Hz, 1H), 7,52 (t, J=7,9 Hz, 1H), 7,82 (d, J=8,2 Hz, 1H), 8,05 (s, 2H), 8,16 (d, J=5,8 Hz, 1H), 8,61 (d, J=5,9 Hz, 1H), 9,36 (s, 1H), 9,42 (s, 1H).

Ejemplo 35 Preparación de N-(2-amino-6-metil-4-pirimidinil)-N-[6-(4-piridinilsulfani)-3-piridinil]amina

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69

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Preparado en rendimiento al 16% a partir de A7 y B13: TLC (MeOH al 6% en CH_{2}Cl_{2}) R_{f} 0,16; MS (ES) 311 [M+H]^{+}; ^{1}H RMN (DMSO-d_{6}) \delta 2,11 (s, 3H), 5,91 (s, 1H), 6,34 (sa, 2H), 7,15 (d, J=6,2 Hz, 2H), 7,48 (d, J=8,8 Hz, 1H), 8,30 (dd, J=2,5, 8,4 Hz, 1H), 8,38 (d, J=6,1 Hz, 2H), 9,00 (d, J=2,4 Hz, 1H), 9,45 (sa, 1H).

Ejemplo 36 Preparación de N-(2-amino-6-fenil-4-pirimidinil)-N-[4-(4-piidinilsulfanil)fenil]amina

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70

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Preparado en rendimiento al 65% a partir de A17: TLC (MeOH al 4% en CH_{2}Cl_{2}) R_{f} 0,22; MS (ES) 372 [M+H]^{+}; ^{1}H RMN (DMSO-d_{6}) \delta 6,46 (sa, 2H), 6,55 (s, 1H), 6,96 (d, J=4,8 Hz, 2H), 7,46 - 7,49 (m, 5H), 7,91 - 8,00 (m, 4H), 8,32 (d, J=4,9 Hz, 2H), 9,57 (sa, 1H).

Ejemplo 37 Preparación de N-[2-amino-6-(3-piridinil)-4-pirimidinil]-N-[3-fluoro-4-(4-piridinilsulfanil)fenil]amina

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Preparado en rendimiento al 45%. TLC (MeOH al 4% en CH_{2}Cl_{2}) R_{f} 0,27; MS (ES) 391 [M+H]^{+}; ^{1}H RMN (DMSO-d_{6}) \delta 6,58 (s, 1H), 6,70 (sa, 2H), 6,99 (d, J=6,4 Hz, 2H), 7,46 - 7,57 (m, 3H), 8,23 - 8,36 (m, 4H), 8,65 (d, J=4,4 Hz, 1H), 9,09 (s, 1H), 9,86 (sa, 1H).

Ejemplo 38 Preparación de N-[2-amino-6-(4-piridinil)-4-piridinil]-N-[3-fluoro-4-(4-piridinilsulfanil)fenil]amina

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72

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Preparado en rendimiento al 22% a partir de A2 y B7: TLC (MeOH al 6% en CH_{2}Cl_{2}) R_{f} 0,32; MS (ES) 391 [M+H]^{+}; ^{1}H RMN (DMSO-d_{6}) \delta 6,63 (s, 1H), 6,74 (sa, 2H), 6,99 (d, J=5,8 Hz, 2H), 7,46 - 7,58 (m, 2H), 7,85 (d, J=5,8 Hz, 2H), 8,31 - 8,36 (m, 3H), 6,70 (d, J=4,3 Hz, 2H), 9,92 (sa, 1H).

Ejemplo 39 Preparación de N-[2-amino-6-(4-piridinil)4-pirimidinil]-N-[3,5-dicloro-4-(4-piridinilsulfanil)fenil]amina

73

Preparado en rendimiento al 0,4% a partir de A2 y B14: TLC (MeOH al 4% en CH_{2}Cl_{2}) R_{f} 0,15; ^{1}H RMN (DMSO-d_{6}) \delta \beta6,60 (s, 1H), 6,82 (sa, 2H), 6,95 (d, J=5,9 Hz, 2H), 7,85 (d, J=5,9 Hz, 2H), 8,18 (s, 2H), 8,36 (d, J=3,8 Hz, 2H), 8,71 (d, J=4,7 Hz, 2H), 9,99 (sa, 1H).

Ejemplo 40 Preparación de N-[2-amino-6-(3-piridinil)-4-pirimidinil]-N-[3-fluoro-4-(5-isoquinoliniloxi)fenil]amina

74

Preparado en rendimiento al 54% a partir de A18 y B11: TLC (MeOH al 5% en CH_{2}Cl_{2}) R_{f} 0,34; MS (ES) 425 [M+H]^{+}; ^{1}H RMN (DMSO-d_{6}) \delta 6,53 (s, 1H), 6,59 (sa, 2H), 6,96 (d, J=7,4 Hz, 1H), 7,26 (t, J=9,6 Hz, 1H), 7,38 - 7,59 (m, 3H), 7,83 (d, J=8,2 Hz, 1H), 8,09 (d, J=5,7 Hz, 1H), 8,23 - 8,31 (m, 2H), 8,58 - 8,65 (m, 2H), 9,09 (sa, 1H), 9,37 (sa, 1H), 9,61 (sa, 1H).

Ejemplo 41 Preparación de N-[2-amino-6-(2-piridinil)4-pirimidinil]-N-[3-fluoro-4-(4-piridinilsulfaninl)fenil]amina

75

Preparado en rendimiento al 60% a partir de A19 y B7: TLC (EtOAc al 50% / hexanos al 50%) R_{f} 0,14; MS (ES) 391 [M+H]^{+}; ^{1}H RMN (DMSO-d_{6}) \delta 6,63 (sa, 2H), 6,98 (d, J=6,6 Hz, 2H), 7,17 (s, 1H), 7,45 - 7,57 (m, 3H), 7,93 (dt, J=1,9,7,7 Hz, 1H), 8,23 - 8,37 (m, 4H), 8,65 - 8,67 (m, 1H), 9,90 (sa, 1H).

Ejemplo 42 Preparación de N-(2-amino-6-etil-4-pirimidinil)-N-[4-(4-piridinilsulfanil)fenil]amina

76

Una mezcla del Intermedio B5 (50,6 mg, 0,250 mmol) y 2-amino - 4- etil-6-cloropirimidina (Intermedio A8, 39,4 mg, 0,25 mmol) en HCl 0,01 M acuoso (500 ml) se mantuvo a reflujo durante 6 horas. La reacción se enfrió a temperatura ambiente y el disolvente se evaporó por vacío. El residuo se purificó por cromatografía en fase inversa sobre una columna YMC Pack-pro ® eluyendo con acetonitrilo / H_{2}O (gradiente 10:90 - 90:10) para dar el compuesto deseado (13,0 mg, 0,040 mmol; rendimiento al 16%); mp = 181 ºC - 186 ºC; ES MS [M+H]^{+}= 324; TLC (CH_{2}Cl_{2} - MeOH, 95:5); R_{f} = 0,41.

Ejemplo 43 Preparación de N-(2-amino-6-cloro-4-pirimidinil)-N-[3-fluoro-4-(4-piridinilsulfanil)fenil]amina

77

2-Amino-4,6 dicloropirimidina (A21, 12 mmol) y 3-fluoro-4-(4-piridiniltio)-anilina (B7, 12 mmol) se suspendieron en agua (150 ml) y se trataron con 10 gotas de ácido clorhídrico concentrado. La mezcla se agitó a 100ºC durante toda la noche. La solución transparente se neutralizó después con hidróxido de amonio. El producto precipitado amarillo se filtró, se lavó con agua, y se purificó por cromatografía en columna con MeOH al 1% - 3% en CH_{2}Cl_{2} para dar el producto deseado en forma de un sólido blanco (1,98 g, 47%).

Ejemplo 44 Preparación de N-(2-amino-6-metil-4-pirimidinil)-N-[2,5-difluoro-4-(4-piridinilsulfanil)fenil]amina

78

El compuesto se preparó usando un procedimiento similar usado para la preparación del Ejemplo 1 (descrito anteriormente) a partir de A7 y B15: HPLC / MS: [M+H]^{+} 346,1 m/z. Tiempo de retención (HPLC / MS) = 1,39 min.

Ejemplo 45 Preparación de N-(2-amino-6-cloro-4-pirimidinil)-N-(3,5-dicloro-4-(4-piridinilsulfanil)fenil]amina

79

El compuesto se preparó usando un procedimiento similar usado para la preparación del Ejemplo 43 (descrito anteriormente) a partir de A21 y B14: HPLC / MS: [M+H]^{+} 399,0 m/z. Tiempo de retención (HPLC / MS) = 3,02 min.

Ejemplo 46 Preparación de N-(2-amino-6-cloro-4-pirimidinil)-N-[3-fluoro-4-(5-isoquinoliniloxi)fenil]amina

80

El compuesto se preparó usando un procedimiento similar usado para la preparación del Ejemplo 43 (descrito anteriormente) a partir de A21 y B11: HPLC / MS: [M+H]^{+} 382,1 m/z. Tiempo de retención (HPLC / MS) = 2,91 min.

Ejemplos 47-49

Usando procedimientos similares a los ejemplos anteriores y usando los Intermedios A y B apropiados, se prepararon los siguientes ejemplos de forma similar:

Ejemplo 47

Preparación de N-(2-amino-6-metil-4-pirimidinil)-N-[1-(4-piridinil)-1H-indol-5-il]amina

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81

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Preparado por medio de la reacción del Intermedio A7 y B1.

Ejemplo 48

Preparación de N-(2-anilino-6-metil-4-pirimidinil)-N-[1-(4-piridinil)-1H-indol-5-il]amina

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82

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Preparado por medio de la reacción del Intermedio A16 y B1.

Ejemplo 49

Preparación de N-(2-anilino-6-metil-4-pirimidinil)-N[4-fluoro-3-(4-piridinilsulfanil)fenil]amina

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83

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Preparado por medio de la reacción del Intermedio A16 y B7.

Ensayo bioquímico de quinasa Rho

Criterios de actividad de ROCK-1: 0 sin efecto (inhibición al <40%), 1 efecto (inhibición al >40%). Las pruebas del ensayo para la inhibición de la fosforilación de ROCK-1 de MBP (Proteína Básica de la Mielina). La reacción (100 \mul del volumen final) se lleva a cabo en placas de 96 pocillos de polipropileno en tampón HEPES 50 mM pH 7,5 conteniendo MgCl_{2} 5 mM y DTT 1 mM. Para cada pocillo gstROCK1 (0,25 \mug de gstROCK1 de BAYER DRT) se combina con MBP (1 \mug) en tampón de reacción (volumen combinado 70 \mul). Se añaden inhibidores (5 \mul de 20 x conc. en DMSO al 40%) a cada pocillo para proporcionar un intervalo de respuesta de dosis en 8 puntos de 1,0 \muM a 5 nM. La reacción se empieza añadiendo 25 \mul de ATP (4x = 12 \muM) en tampón de reacción conteniendo 0,8 \muCi de ^{33}P gamma-ATP (4x) para proporcionar una concentración final de ATP 3 \muM frío y 0,2 \muCi caliente. Las placas se incubaron durante 1 hora a temperatura ambiente deteniéndose la reacción por medio de la adición de 7 \mul de HCl 1 N. La MBP radiactivamente marcada se transfirió a unidades de filtro P30 (EG&G Wallac), se lavó en ácido fosfórico al 1% seguido de lavados breves en agua. Después las unidades de filtro se secaron y la incorporación de ^{33}P se detectó por recuento de centelleo líquido. La incorporación de fondo de ^{33}P se determina por la autofosforilación de ROCK1 sin MBP. Los datos se expresan como inhibición porcentual: inhibición al % = 1-((cpm con inhibidor - de fondo) / (cpm sin inhibidor - de fondo)) * 100.

Claims

1. Un compuesto de la fórmula

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2. Uso de un compuesto como se define en la reivindicación 1, para la fabricación de un fármaco útil para el tratamiento de una indicación mediada por la quinasa Rho.

3. Uso, de acuerdo con la reivindicación 2, para la fabricación de un fármaco para el ser humano.

4. Uso de un compuesto como se define en la reivindicación 1, para la fabricación de un fármaco útil para el tratamiento de la hipertensión, la aterosclerosis, la restenosis, la isquemia cerebral, el vasoespasmo cerebral, la degeneración neuronal, la lesión de la médula espinal, el cáncer de mama, colon, próstata, ovarios, cerebro o pulmón, los trastornos trombóticos, el asma, el glaucoma, la osteoporosis o la disfunción eréctil.

5. Uso, de acuerdo con la reivindicación 4, para la fabricación de un fármaco para el ser humano.