ES2299174T3 - Metodos para modular las respuestas de celulas t mediante manipulacion de una cadena gamma comun de receptores de citoquinas. - Google Patents

Abstract

CUANDO EL COMPLEJO (TCR)/CD3 DEL RECEPTOR DE CELULAS T SE ESTIMULA SIN NECESIDAD DEL REQUISITO DE COESTIMULACION A TRAVES DE LA INTERACCION CD28/B7, LAS CELULAS T ENTRAN EN UN ESTADO DE NO CORRESPONDENCIA ESPECIFICA AL ANTIGENO O ANERGIA. ESTA INVENCION SE BASA, AL MENOS EN PARTE, EN EL DESCUBRIMIENTO DE QUE LA SEÑALIZACION A TRAVES DE UNA CADENA {PS} DEL RECEPTOR COMUN DE CITOQUINA (P.E. RECEPTOR DE INTERLEUQUINA-2, RECEPTOR DE INTERLEUQUINA-4, RECEPTOR DE INTERLEUQUINA-7) EVITA LA INDUCCION DE LA ANERGIA DE LAS CELULAS T. ESTA CADENA {PS} HA DEMOSTRADO ESTAR ASOCIADA A LA QUINASA JAK QUE TIENE UN PESO MOLECULAR APROXIMADO DE 116 KD ( COMO SE DETERMINA POR LA ELECTROFORESIS DEL GEL DE POLIACRILAMIDA DE SULFATO DE DODECIL DE SODIO) Y DE QUE LA SEÑALIZACION A TRAVES DE LA CADENA {PS} INDUCE LA FOSFORILIZACION DE LA QUINASA JAK. CONFORME A ESTO, SE MUESTRAN METODOS PARA ESTIMULAR O INHIBIR LA PROLIFERACION MEDIANTE UNA CELULA T QUE EXPRESA UNA CADENA {PS} DEL RECEPTOR DE CITOQUINA.

Description

Métodos para modular las respuestas de células T mediante manipulación de una cadena \gamma común de receptores de citoquinas.

Antecedentes de la invención

La inducción de respuestas de células T específicas de antígeno implica interacciones múltiples entre receptores de la superficie celular en las células T y ligandos en las células presentadoras de antígeno (CPAs). La interacción principal es entre el complejo del receptor de la célula T (TCR)/CD3 en una célula T y un complejo de molécula del complejo mayor de histocompatibilidad (MHC)/péptido antigénico en una célula presentadora de antígeno. Esta interacción desencadena una señal de activación primaria, específica de antígeno, en la célula T. Además de la señal de activación primaria, la inducción de respuestas de las células T requiere una segunda señal coestimuladora. En ausencia de una coestimulación adecuada, la señalización de TCR puede inducir un estado de anergia en la célula T. La presentación apropiada posterior de un antígeno a una célula T anérgica fracasa en provocar una respuesta adecuada (ver Schwartz, R.H. (1990) Science 248: 1349).

Se puede desencadenar una señal coestimuladora en una célula T a través de un receptor de superficie de célula T, tal como CD28. Por ejemplo, se ha demostrado que se puede potenciar la estimulación policlonal subóptima de células T (por ejemplo mediante anticuerpos anti-CD3 o ésteres de forbol, cualquiera de los cuales puede proporcionar una señal de activación primaria) mediante entrecruzamiento de CD28 con anticuerpos anti-CD28 (Linsley, P.S. et al. (1991) J. Exp. Med. 173: 721; Gimmi, C.D. et al. (1991) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88: 6575). Además, la estimulación de CD28 puede prevenir la inducción de anergia en clones de células T (Harding, F.A. (1992) Nature 356: 607-609). Se han identificado los ligandos naturales de CD28 en CPAs. Los ligandos de CD28 incluyen miembros de la familia de proteínas B7, tal como B7-1 (CD80) y B7-2 (B70) (Freedman, A.S. et al (1987) J. Immunol. 137: 3260-3267; Freeman, G.J. et al (1989) J. Immunol. 143: 2714-2722; Freeman, G.J. et al (1991) J. Exp. Med. 174: 625-631; Freeman, G.J. et al. (1993) Science 262: 909-911; Azuma, M. et al. (1993) Nature 366: 76-79; Freeman, G.J. et al. (1993) J. Exp. Med. 178: 2185-2192). Además de a CD28, se ha mostrado que las proteínas de la familia B7 se unen a otro receptor en la superficie de la células T relacionado con CD28, denominado CTLA4, que también puede tener un papel en la coestimulación de células T (Linsley, P.S. et al. (1991) J. Exp. Med. 174: 561-569; Freeman, G.J. et al. (1993) Science 262: 909-911).

La elucidación de la relación receptor:ligando de CD28/CTLA4 y la familia de proteínas B7, y el papel de esta interacción en la coestimulación, ha llevado a aproximaciones terapéuticas que implican la manipulación de las interacciones extracelulares de los receptores de superficie en células T que se unen a moléculas coestimuladoras. Por ejemplo, se ha usado una proteína de fusión CTLA4Ig, que se une tanto a B7-1 como a B7-2 y bloquea su interacción con CD28/CTLA4, para inhibir el rechazo de injertos alogénicos y xenogénicos (ver por ejemplo, Turka, L.A. et al (1992) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89: 11102-11105; Lenschow, D.J. et al. (1992) Science 257: 789-792). De forma similar, se han utilizado anticuerpos que reaccionan con B7-1 y/o B7-2 para inhibir la proliferación de células T y la producción de IL-2 in vitro e inhibir las respuestas inmunes primarias al antígeno in vivo (Hathcock, K.S. et al. (1993) Science 262: 905-907; Azuma, M. et al. (1993) Nature 366: 76-79; Powers, G.D. et al. (1994) Cell. Immunol. 153: 298-311; Cheng, C. et al. (1994) J. Immunol. 152: 2105-2114). En conjunto, estos estudios indican que la vía coestimuladora mediada por los receptores de superficie de células T que se unen a moléculas coestimuladoras tal como B7-1 y B7-2 son dianas deseables para la manipulación de las respuestas inmunes.

Compendio de la invención

Cuando se estimulan a través de complejo receptor de células T (TCR)/CD3 sin la coestimulación indispensable a través de la interacción CD28/B7, las células T entran en una estado de falta de respuesta o anergia. Esta invención se basa, al menos en parte, en el descubrimiento de que la señalización a través de una cadena \gamma común de receptores de citoquinas (por ejemplo, receptor de interleuquina-2, receptor de interleuquina-4, receptor de interleuquina-7) previene la inducción de anergia en células T. Se ha encontrado que esta cadena \gamma está asociada con una quinasa JAK que tiene un peso molecular de alrededor de 116 kD (determinado mediante electroforesis en gel de poliacrilamida con dodecilsulfato sódico) y que la señalización a través de la cadena \gamma induce fosforilación de la quinasa JAK. Se propone definir anergia como "el estado de falta de respuesta como resultado de la estimulación de TCR sin señalización de \gamma_{c}".

De acuerdo con esto, una forma de realización de esta invención se refiere a métodos in vitro para estimular la proliferación mediante una célula T que expresa una cadena \gamma de receptores de citoquinas y que ha recibido una señal de activación primaria en condiciones que normalmente producirían falta de respuesta en la célula T (es decir, falta de coestimulación). La falta de respuesta de células T o anergia se previene poniendo en contacto células T con un agente que se une a la cadena \gamma del receptor de citoquina y estimula una señal intracelular en la célula T que da como resultado la proliferación de células T. Típicamente, el agente es un anticuerpo anti-cadena \gamma capaz de entrecruzar el receptor o una forma soluble del ligando natural que se une a la cadena \gamma, tal como interleuquina-4 o interleuquina-7. De forma alternativa, las células T se pueden poner en contacto con un agente que actúa de forma intracelular para estimular la fosforilación de la quinasa JAK de 116 kD. Para inducir una respuesta inmune contra un patógeno, tal como un virus, bacteria, o parásito in vivo, se puede administrar el patógeno o un componente del mismo conjuntamente con un agente que se une a la cadena \gamma del receptor de citoquina y estimula una respuesta intracelular en la célula T. De forma similar, se puede inducir la inmunidad tumoral en un huésped que tiene un tumor in vivo o ex vivo poniendo en contacto células T del sujeto en presencia de células tumorales que expresan antígenos tumorales con un agente estimulador de la cadena \gamma (por ejemplo, un anticuerpo anti-cadena \gamma de entrecruzamiento).

Otra forma de realización de la invención se refiere a métodos para inducir la falta de respuesta a un antígeno en una célula T que expresa una cadena \gamma de receptor de citoquinas. Las células T se ponen en contacto ex vivo en presencia de un antígeno con un agente que inhibe la distribución de una señal a través de la cadena \gamma del receptor de citoquinas dando como resultado una célula T con falta de respuesta al antígeno. Tales agentes pueden actuar de forma extracelular para inhibir la distribución de una señal a través de la cadena \gamma, tal como una anticuerpo inhibidor o bloqueante anti-cadena \gamma o un agente que se une al ligando natural de la cadena \gamma para inhibir la unión del ligando a la cadena \gamma (por ejemplo, un anticuerpo anti-interleuquina-2, un anticuerpo anti-interleuquina-4 o un anticuerpo anti-interleuquina-7). De forma alternativa, el agente puede actuar intracelularmente para inhibir la distribución de una señal a través de la cadena \gamma del receptor de citoquinas, tal como un agente que inhibe la asociación de la cadena \gamma con la quinasa JAK de 116 kD o inhibe la fosforilación de la cadena \gamma o de la quinasa JAK o de ambas. Los métodos para inducir la falta de respuesta de células T son particularmente útiles para inhibir el rechazo al trasplante y la enfermedad de injerto frente al huésped y para tratar enfermedades autoinmunes.

Breve descripción de las figuras

Las Figuras 1A-B son representaciones gráficas de la proliferación de células T específicas de DR7 tras exposición a LBL-DR7, demostrando que IL-2, IL-4 e IL-7 pueden prevenir la inducción de anergia en células T. En panel A, a las células T se les da una señal anérgica mediante estimulación con antígeno (LBL-DR7) al tiempo que se bloquea la coestimulación con CTLA4Ig. En el panel B, a las células T se les da una señal anérgica mediante estimulación con el antígeno solo (t-DR7) en ausencia de una señal coestimuladora.

Las Figuras 2A-B son representaciones gráficas de la proliferación de células T específicas de DR7 tras exposición a LBL-DR7, demostrando que el entrecruzamiento de la cadena \gamma común de los receptores de IL-2, IL-4 e IL-7 previene la inducción de anergia en células T. En panel A, a las células T se les da una señal anérgica mediante estimulación con antígeno (LBL-DR7) al tiempo que se bloquea la coestimulación con CTLA4Ig. En el panel B, a las células T se les da una señal anérgica mediante estimulación con el antígeno solo (t-DR7) en ausencia de una señal coestimuladora.

Las Figuras 3A-E son fotografías de filtros de inmunoprecipitación, que reproducen la asociación y fosforilación de \gamma_{c} y una quinasa JAK de 116 kD tras la estimulación de células T con IL-2, IL-4 o IL-7. El panel A reproduce la coinmunoprecipitación de la quinasa JAK de 116 kD con \gamma_{c} mediante un anticuerpo anti-IL-2R\gamma y la fosforilación tanto de \gamma_{c} como de la quinasa JAK de 116 kD mediante unión de un anticuerpo anti-fosfotirosina (4G10). La proteína de 116 kD es miembro de la familia de quinasas JAK, demostrado mediante unión de un anticuerpo anti-JAK (R80) (Panel B), pero no se une a anticuerpos contra JAK 1 (Panel C), JAK 2 (Panel D) o Tyk2 (Panel E).

La Figura 4A es una fotografía de un filtro de inmunoprecipitación, que muestra la fosforilación de la quinasa JAK de 116 kD tras estimulación de las células T específicas de DR7 con una señal antigénica y una señal coestimuladora (t-DR7/B7-1) pero no una señal antigénica sola (t-DR7).

La Figura 4B es una fotografía de un filtro de inmunoprecipitación, que muestra la fosforilación de la quinasa JAK de 116 kD tras estimulación de las células T específicas de DR7 con una señal antigénica (t-DR7) y bien IL-2, IL-4 o IL-7.

Descripción detallada de la invención

El término "una cadena gamma común de receptores de citoquinas" o "\gamma_{c}" como se usa aquí se refiere a una subunidad polipeptídica compartida por determinados receptores de citoquinas, entre otros el receptor de interleuquina-2 (IL-2), el receptor de interleuquina 4 (IL-4) y el receptor de interleuquina-7 (IL-7). La cadena gamma está presente en los receptores de IL-2 de afinidad intermedia (subunidades \beta\gamma) y de alta afinidad (subunidades \alpha\beta\gamma). En una forma de realización, \gamma_{c} es un polipéptido codificado por una secuencia de nucleótidos divulgada en Takeshita, T. et al. (1992) Science 257: 379-382 y por un gen que mapea en el cromosoma humano Xq13. Se han descrito cebadores de oligonucleótidos que se pueden utilizar para obtener el ácido nucleico que codifica la \gamma_{c} humana en Noguchi, M. et al. (1993) Cell 73: 147-157; Puck, J.M. et al. (1993) Hum. Mol. Genet. 2: 1099-1104; y DiSanto, J.P. et al. (1994) Eur. J. Immunol. 24: 475-479. En otra forma de realización, \gamma_{c} es un polipéptido de alrededor de 64 kD.

Se describen varios aspectos de la invención en más detalle en las siguientes subsecciones.

I. Agentes que estimulan a través de una cadena gamma común a receptores de citoquinas A. Citoquinas

Las citoquinas que pueden estimular a través de \gamma_{c} incluyen IL-2, IL-4 e IL-7. También se pueden usar para estimular a través de \gamma_{c} otras citoquinas que se unen a un receptor que utiliza \gamma_{c}. Las citoquinas que se describen aquí están disponibles comercialmente. Por ejemplo IL-2, IL-4 e IL-7 se pueden obtener de Genzyme Corp.

B. Anticuerpos anti-cadena \gamma

Se puede usar para estimular a través de \gamma_{c} una forma estimuladora de un anticuerpo, o un fragmento del mismo, que se une a \gamma_{c}. Una "forma estimuladora" de un anticuerpo anti-\gamma_{c} se refiere a una forma del anticuerpo que induce una señal intracelular a través de \gamma_{c} tras unión a \gamma_{c}. En una forma de realización, la forma estimuladora del anticuerpo anti-\gamma_{c} es un anticuerpo soluble que se entrecruza, por ejemplo, mediante un anticuerpo secundario. En otra forma de realización, la forma estimuladora de anti-\gamma_{c} es una forma inmovilizada de un anticuerpo, por ejemplo, un anticuerpo unido a un soporte sólido, como una placa de cultivo o bola.

El anticuerpo estimulador puede ser un antisuero policlonal o un anticuerpo monoclonal. Los anticuerpos que se unen a \gamma_{c} se pueden preparar mediante métodos estándar conocidos en la técnica. Los animales se pueden inmunizar con un "inmunógeno" \gamma_{c}. El término "inmunógeno" se usa aquí para describir una composición que contiene un péptido o proteína \gamma_{c} como ingrediente activo utilizado para la preparación de anticuerpo contra \gamma_{c}. Tanto los fragmentos de proteína o péptido de \gamma_{c} solubles como los unidos a membrana son adecuados para usar como inmunógeno. Por ejemplo, el inmunógeno \gamma_{c} puede ser una célula que expresa un receptor de citoquina que utiliza \gamma_{c} (por ejemplo, una línea celular que expresa una forma de IL-2R, IL-4R o IL-7R que contiene \gamma_{c}). Una célula preferida para usar como inmunógeno es una célula T, que expresa \gamma_{c} de forma constitutiva. De forma alternativa, el inmunógeno puede ser una proteína \gamma_{c} purificada o un fragmento de péptido \gamma_{c}. Se puede purificar una proteína \gamma_{c} a partir de células mediante técnicas estándar o producirla de forma recombinante mediante expresión en una célula huésped de un ácido nucleico que codifica \gamma_{c} (por ejemplo, un ácido nucleico que tiene la secuencia divulgada en Takeshita, T. et al. (1992) Science 257: 379-382). Se puede sintetizar químicamente un fragmento de péptido \gamma_{c} basado en la secuencia de aminoácido predicha de una secuencia de proteína \gamma_{c} (por ejemplo, como se divulga en Takeshita, citado anteriormente). Se puede usar directamente una forma aislada de proteína o péptido \gamma_{c} por si mismo como inmunógeno, o de forma alternativa, se puede unir a una proteína soporte adecuada mediante técnicas convencionales, incluyendo mediante acoplamiento químico. La proteína \gamma_{c} aislada también se puede modificar de forma covalente o no covalente con materiales no proteínicos tal como lípidos o carbohidratos para aumentar la inmunogenicidad o solubilidad. De forma alternativa, una proteína \gamma_{c} aislada puede acoplar con o incorporar en una partícula viral, un virus replicante, u otro microorganismo para aumentar la inmunogenicidad.

Como una alternativa al uso de una proteína o péptido como inmunógeno, es posible usar ácido nucleico (por ejemplo, ADN) que codifica una proteína o péptido \gamma_{c} como inmunógeno para la así denominada inmunización genética. De esta manera, el término "inmunógeno" también se pretende que incluya ácido nucleico que codifica una proteína o péptido contra el que se van a obtener los anticuerpos. Para obtener anticuerpo mediante inmunización genética, se administra una construcción de un vector de expresión que contiene la proteína de interés (por ejemplo \gamma_{c} o un péptido de la misma) de forma intracelular en la piel de un animal (por ejemplo, ratón) recubriendo partículas (por ejemplo, partículas de oro) con la construcción e inyectando las partículas en la piel. Esto da como resultado la producción de antígeno en la piel y el desarrollo de una respuesta de anticuerpos específica (ver por ejemplo, Tang, D.C. et al. (1992) Nature 356: 152-154; Eisenbraun, M.D. et al. (1993) DNA Cell Biol. 12: 791-797; Wang, B. et al. (1993) DNA Cell Biol. 12: 799-805).

Los anticuerpos policlonales para \gamma_{c} generalmente se pueden obtener en animales mediante métodos estándar. Los animales se pueden estimular hasta que el título del anti-\gamma_{c} alcanza una meseta. Además, se pueden usar agentes agregantes tal como alumbre para aumentar la respuesta inmune. Las moléculas de anticuerpo se pueden entonces recoger del mamífero (por ejemplo, de la sangre) y aislar mediante técnicas bien conocidas, tal como cromatografía con proteína A, para obtener la fracción de IgG. Para aumentar la especificidad del anticuerpo, se pueden purificar los anticuerpos mediante cromatografía de inmunoafinidad utilizando un inmunógeno unido a una fase sólida. El anticuerpo se pone en contacto con el inmunógeno unido a una fase sólida durante un período de tiempo suficiente para que el inmunógeno reaccione con las moléculas de anticuerpo para formar un complejo inmune unido a una fase sólida. Los anticuerpos unidos se separan del complejo mediante técnicas estándar.

El término "anticuerpo monoclonal" o "composición de anticuerpo monoclonal", como se usa aquí, se refiere a una población de moléculas de anticuerpo que contienen solo una especie de un sitio de unión a antígeno capaz de inmunoreaccionar con un epítopo particular. Una composición de anticuerpo monoclonal de esta manera muestra típicamente una afinidad de unión única para una proteína particular con la que inmunoreacciona. Preferiblemente, el anticuerpo monoclonal usado en el método objeto se caracteriza además como que inmunoreacciona con una proteína \gamma_{c} derivada de seres humanos.

Los anticuerpos monoclonales útiles en las composiciones y métodos de la invención están dirigidos a un epítopo de una \gamma_{c}. Se puede preparar un anticuerpo monoclonal contra un epítopo de \gamma_{c} utilizando una técnica que proporciona la producción de moléculas de anticuerpo mediante líneas celulares en cultivo continuo. Estas incluyen pero no están limitadas a la técnica del hibridoma originalmente descrita por Kohler and Milstein (1975, Nature 256: 495-497), y la técnica más reciente de hibridoma de células B humanas (Kozbor et al. (1983) Immunol Today 4: 72), técnica del hibridoma EBV (Cole et al. (1985), Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy, Alan R. Liss, Inc., pp. 77-96), y técnicas del trioma. Otros métodos que pueden producir anticuerpos monoclonales de forma eficaz útiles en la presente invención incluyen técnicas de presentación en fagos (Marks et al. (1992) J. Biol. Chem. 16007-16010).

En una forma de realización, la preparación de anticuerpo aplicada en el método objeto es un anticuerpo monoclonal producido por una línea celular de hibridoma. Las técnicas de fusión de hibridomas fueron introducidas por Kohler y Milstein (Kohler et al. Nature (1975) 256: 495-97; Brown et al.(1981) J. Immunol. 127: 539-46; Brown et al. (1980) J. Biol. Chem. 255: 4980-83; Yeh et al. (1976) PNAS 76: 2927-31; y Yeh et al. (1982) Int. J. Cancer 29: 269-75). De esta manera, las composiciones de anticuerpos monoclonales de la presente invención se pueden producir mediante el siguiente método, que comprende los pasos de:

(a) Inmunizar un animal con un inmunógeno \gamma_{c}. Preferiblemente, se usa un mamífero roedor, tal como un conejo, rata o ratón. El mamífero se mantiene después durante un período de tiempo suficiente para que el mamífero produzca células que secretan moléculas de anticuerpo que inmunoreaccionan con el inmunógeno \gamma_{c}. Tal inmunoreacción se detecta mediante cribado de las moléculas de anticuerpo así producidas para la inmunoreactividad con una preparación de la proteína inmunógena. Opcionalmente, puede ser deseable cribar las moléculas de anticuerpo con una preparación de la proteína en la forma en la se va a detectar por las moléculas de anticuerpo en un ensayo, por ejemplo, una forma de \gamma_{c} asociada a membrana. Estos métodos de cribado son bien conocidos para los expertos en la materia, por ejemplo, ensayo de inmunoabsorción unido a enzima (ELISA) y/o citometría de flujo.

(b) Se prepara después una suspensión de células productoras de anticuerpos recogidas de cada mamífero inmunizado que secreta el anticuerpo deseado. Después de un tiempo suficiente, el mamífero se sacrifica y se obtienen los linfocitos somáticos productores de anticuerpo. Las células productoras de anticuerpos pueden derivar de los nódulos linfáticos, bazo, y sangre periférica de los animales sensibilizados. Se prefieren las células del bazo, y se pueden separar mecánicamente en células individuales en un medio fisiológicamente tolerable utilizando métodos bien conocidos en la técnica. Los linfocitos de ratón dan un porcentaje mayor de fusiones estables con los mielomas de ratón descritos más adelante. También se pueden utilizar células somáticas de rata, conejo o rana. Los cromosomas de las células del bazo que codifican las inmunoglobulinas deseadas se inmortalizan mediante fusión de las células del bazo con células de mieloma, generalmente en presencia de un agente de fusión tal como polietilenglicol (PEG). Se puede utilizar cualquiera de varias líneas celulares de mieloma como compañero de fusión según técnicas estándar; por ejemplo las líneas de mieloma P3-NS1/1-Ag4-1, P3-x63-Ag8.653 o Sp2/O-Ag14. Estas líneas de mieloma están disponibles de la Colección Americana de Cultivos Tipo (ATCC), Rockville, Md.

Las células resultantes, que incluyen los hibridomas deseados, se hacen crecer después en un medio selectivo, tal como medio HAT, en el que las células parentales no fusionadas de mieloma o linfocitos finalmente mueren. Solo las células de hibridoma sobreviven y se pueden crecer en condiciones de dilución limitante para obtener clones aislados. Los sobrenadantes de los hibridomas se criban para la presencia de anticuerpo de la especificidad deseada, por ejemplo, mediante técnicas de inmunoensayo utilizando el antígeno que se ha usado para la inmunización. Los clones positivos se pueden subclonar después en condiciones de dilución limitante y los anticuerpos monoclonales producidos se pueden aislar. Existen varios métodos convencionales para el aislamiento y purificación de los anticuerpos monoclonales de modo que se liberen de otras proteínas y otros contaminantes. Los métodos normalmente utilizados para la purificación de anticuerpos monoclonales incluyen precipitación con sulfato de amonio, cromatografía de intercambio iónico, y cromatografía de afinidad (ver, por ejemplo, Zola et al. en Monoclonal Hybridoma Antibodies: Techniques And Applications, Hurell (ed.) pp. 51-52 (CRC Press 1982)). Los hibridomas producidos según estos métodos se pueden propagar in vitro o in vivo (en líquido ascítico) utilizando métodos conocidos en la técnica.

En general, la línea celular individual se puede propagar in vitro, por ejemplo en recipientes de cultivo de laboratorio, y se puede recoger el medio de cultivo que contiene concentraciones elevadas de un anticuerpo monoclonal específico individual mediante decantación, filtración o centrifugación. De modo alternativo, se puede aumentar el rendimiento de anticuerpo monoclonal inyectando una muestra del hibridoma en un animal histocompatible del tipo usado para proporcionar las células somáticas y de mieloma para la fusión original. Se desarrollan tumores que secretan los anticuerpos monoclonales específicos producidos por los híbridos de células fusionadas en el animal inyectado. Los fluidos corporales del animal, tal como el líquido ascítico o suero, proporcionan anticuerpos monoclonales a concentraciones elevadas. Cuando se usan hibridomas humanos o hibridomas EBV, se necesario evitar el rechazo del xenoinjerto inyectado en animales tales como ratones. Se pueden usar ratones inmunodeficientes o desnudos o se puede pasar primero el hibridoma a un ratón desnudo irradiado como un tumor sólido subcutáneo, cultivar in vitro y después inyectarl intraperitonealmente en ratones desnudos sensibilizados con pristano, irradiados que desarrollan ascitis tumorales que secretan grandes cantidades de anticuerpos monoclonales humanos específicos.

Tanto los medios como los animales útiles para la preparación de estas composiciones son bien conocidos en la técnica y están disponibles comercialmente e incluyen medios de cultivo sintéticos, ratones endogámicos y similares. Un medio sintético ejemplar es el medio esencial mínimo de Dulbecco (DMEM; Dulbecco et al. (1959) Virol. 8: 396) suplementado con glucosa 4.5 gm/l, glutamina 20 mM, y suero fetal de ternera al 20%. Una cepa de ratón endogámica ejemplar es la Balb/c.

Cuando los anticuerpos producidos en sujetos no humanos se usan de forma terapéutica en seres humanos, son reconocidos en grados variables como extraños y se puede generar una respuesta inmune en el paciente. Una aproximación para minimizar o eliminar este problema, que es preferible a la inmunosupresión general, es producir derivados quiméricos de anticuerpos, es decir, moléculas de anticuerpo que combinan una región variable animal no humana y una región constante humana. Tales anticuerpos son los equivalentes de los anticuerpos monoclonales y policlonales descritos anteriormente, pero pueden ser menos inmunogénicos cuando se administran a seres humanos, y por lo tanto más posible que sean tolerados por los pacientes.

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Los anticuerpos monoclonales quiméricos de ratón-humano (esto es, anticuerpos quiméricos) que reaccionan con \gamma_{c} se pueden producir mediante métodos de ADN recombinante conocidos en la técnica. Por ejemplo, se sustituye un gen que codifica la región constante de una molécula murina (o de otras especies) de anticuerpo anti-\gamma_{c} humana con un gen que codifica una región constante humana (ver Robinson et al., Publicación Internacional de Patente PCT/US86/02269; Akira et al., solicitud de patente europea 184187; Taniguchi, M. solicitud de patente europea 171496, Morrison et al., solicitud de patente europea, 173494; Neuberger et al, solicitud de PCT WO 86/01533; Cabilly et al., patente de EE.UU. No. 4816567; Cabilly et al., solicitud de patente europea 125023; Better et al., (1988 Science 240: 1041-1043); Liu et al. (1987) PNAS 84:3439-3443; Liu et al. (1987) J. Immunol. 139: 3521-3526; Sun et al. (1987) PNAS 84: 214-218; Nishimura et al. (1987) Canc. Res. 47: 999-1005; Wood et al. (1985) Nature 314: 446-449; y Shaw et al. (1988) J. Natl. Cancer Inst. 80: 1553-1559).

Un anticuerpo quimérico se puede "humanizar" adicionalmente reemplazando partes de la región variable no implicadas en la unión al antígeno con partes equivalente de regiones variables humanas. Se proporcionan revisiones generales sobre anticuerpos quiméricos "humanizados" en Morrison, S.L. (1985) Science 229: 1202-1207 y en Obi et al. (1986) BioTecniques 4: 214. Esos métodos incluyen aislamiento, manipulación, y expresión de secuencias de ácidos nucleicos que codifican toda o una parte de la región variable de una inmunoglobulina de al menos una de una cadena pesada o ligera. Las fuentes de tales ácidos nucleicos son bien conocidas para los expertos en la materia y, por ejemplo, se pueden obtener de un hibridoma que produce anticuerpo anti-\gamma_{c}. El ADNc que codifica el anticuerpo quimérico, o un fragmento del mismo, se puede clonar después en un vector de expresión apropiado. Los anticuerpos "humanizados" adecuados se pueden producir de forma alternativa mediante sustitución CDR o CEA (ver patente de EE.UU. 5225539 a Winter; Jones et al. (1986) Nature 321: 552-525; Verhoeyan et al. (1988) Science 239: 1534; y Beidler et al. (1988) J. Immunol. 141: 4053-4060).

Como alternativa a humanizar los mAb (anticuerpo monoclonal) de un ratón u otras especies, se puede generar un mAb humano dirigido contra una proteína humana. Se han creado ratones transgénicos que llevan repertorios de anticuerpos humanos que se pueden inmunizar con una proteína \gamma_{c} o una célula humana que expresa \gamma_{c}. Se pueden usar después los esplenocitos de estos ratones transgénicos inmunizados para crear hibridomas que secretan mAb humanos que reaccionan específicamente con la \gamma_{c} humana (ver, por ejemplo, Wood et al., publicación de PCT WO 91/00906; Kucherlapati et al., publicación de PCT WO 91/10741; Longberg et al. publicación de PCT WO 92/03918; Kay et al. publicación de PCT WO 92/03917; Lonberg, N. et al. (1994) Nature 368: 856-859; Green, L.L. et al. (1994) Nature Genet. 7: 13-21; Morrison, S.L. et al. (1994) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81: 6851-6855; Bruggeman et al. (1993) Year Immunol. 7: 33-40; Tuaillon et al. (1993) PNAS 90: 3720-3724; Bruggeman et al. (1991) Eur. J. Immunol. 21: 1323-1326).

Las composiciones de anticuerpos monoclonales de la invención también se pueden producir por otros métodos conocidos para los expertos en la materia de la tecnología del ADN recombinante. Se ha desarrollado un método alternativo, referido como método de "presentación combinatoria de anticuerpos" para identificar y asilar fragmentos de anticuerpos que tienen una especificidad de antígeno particular, y se puede utilizar para producir anticuerpos monoclonales anti-\gamma_{c} (para descripciones de la presentación combinatoria de anticuerpos ver por ejemplo, Sastry et al. (1989) PNAS 86: 5728; Huse et al. (1989) Science 246: 1275; y Orlandi et al. (1989) PNAS 86: 3833). Después de inmunizar un animal con un inmunógeno \gamma_{c} como se ha descrito anteriormente, se clona el repertorio de anticuerpos del conjunto de células B. Se conocen en general métodos para obtener directamente la secuencia de ADN de las regiones variables de una población diversa de moléculas de inmunoglobulinas utilizando una mezcla de cebadores oligómeros y PCR. Por ejemplo, se pueden usar mezclas de cebadores de oligonucleótidos correspondientes a la secuencia líder 5' (péptido señal) y/o secuencias de entramado 1 (FR1), así como un cebador de una región constante 3' para amplificación por PCR de las regiones variables de las cadenas pesadas y ligeras de un número de anticuerpos murinos (Larrick et al. (1991) Biotechniques 11: 125-156). También se puede usar una estrategia similar para amplificar las regiones variables de cadenas pesadas y ligeras humanas a partir de anticuerpos humanos (Larrick et al (1991) Methods: Companion to Methods in Enzymology 2: 106-110).

En una forma de realización ilustrativa, se aísla ARN de células B activadas a partir de, por ejemplo, células de sangre periférica, médula ósea, o preparaciones de bazo, utilizando protocolos estándar (por ejemplo, patente de EE.UU. No. 4683202; Orlandi, et al. PNAS (1989) 86: 3833-3837; Sastry et al., PNAS (1989) 86: 5728-5732; y Huse et al. (1989) Science 246: 1275-1281). Se sintetiza la primera hebra de ADNc utilizando cebadores específicos para la región constante de la(s) cadena(s) pesada(s) y cada una de las cadenas ligeras \kappa y \gamma, así como cebadores para la secuencia señal. Usando cebadores de PCR de la región variable, se amplifican las regiones variables tanto de la cadena pesada como de la ligera, cada una sola o en combinación, y se ligan en vectores apropiados para su manipulación adicional en la generación de paquetes de presentación. Los cebadores de oligonucleótidos útiles en los protocolos de amplificación pueden ser únicos o degenerados o incorporar inosina en la posiciones de degeneración. También se pueden incorporar secuencias de reconocimiento de endonucleasas de restricción en los cebadores para permitir la clonación del fragmento amplificado en un vector en un marco de lectura predeterminado para la expresión.

La genoteca de genes V clonados a partir del repertorio de anticuerpos derivados de inmunización se puede expresar por una población de paquetes de presentación, preferiblemente derivados de fagos filamentosos, para formar una librería de presentación de anticuerpos. Idealmente, el paquete de presentación comprende un sistema que permite el muestreo de librerías de presentación de anticuerpos muy grandes y diversas, una selección rápida después de cada ronda de separación por afinidad, y aislamiento fácil del gen del anticuerpo a partir de los paquetes de presentación purificados. Además de los kits comercialmente disponibles para la generación de librerías de presentación en fago (por ejemplo, Recombinant Phage Antibody System de Pharmacia, no. de catálogo 27-9400-01; y kit de presentación en fago SurfZAP^{TM} de Stratagene, no. de catálogo 240612), se pueden encontrar ejemplos de métodos y reactivos particularmente manejables para su uso en la generación de una librería de presentación en fagos de diversos anticuerpos anti-\gamma_{c} en, por ejemplo, Ladner et al., patente de EE.UU. No. 5223409; Kang et al., publicación internacional No. WO 92/18619; Dower et al., publicación internacional No. WO 91/17271; Winter et al., publicación internacional No. WO 92/20791; Markland et al., publicación internacional No. WO 92/15679; Breitling et al., publicación internacional No. WO 93/01288; McCafferty et al., publicación internacional No. WO 92/01047; Garrad et al., publicación internacional No. WO 92/09690; Ladner et al., publicación internacional No. WO 90/02809; Fuchs et al. (1991) Bio/Technology 9:1370-1372; Hay et al. (1992) Hum. Antibod. Hybridomas 3: 81-85; Huse et al. (1989) Science 246: 1275-1281; Griffths et al. (1993) EMBO J. 12: 725-734; Hawkins et al. (1992) J. Mol. Biol. 226: 889-896; Clackson et al. (1991) Nature 352: 624-628; Gram et al. (1992) PNAS 89: 3576-3580; Garrad et al. (1991) Bio/Technology 9: 1373-1377; Hoogenboom et al. (1991) Nuc. Acid Res. 19: 4133-4137; y Barbas et al. (1991) PNAS 88: 7978-7982.

En ciertas formas de realización, los dominios de la región V de las cadenas pesadas y ligeras se pueden expresar en el mismo polipéptido, unidos por un enlazador flexible para formar un fragmento Fv de cadena sencilla, y clonar posteriormente el gen scFV en el vector de expresión deseado o genoma de fago. Como se describe en general en McCafferty et al., Nature (1990) 348: 552-554, se pueden usar los dominios completos V_{H} y V_{L} de un anticuerpo, unidos por un enlazador flexible (Gly_{4}-Ser)_{3} para producir un anticuerpo de cadena sencilla que puede hacer el paquete de presentación separable basado en la afinidad de antígeno. Los anticuerpos scFv inmunoreactivos con \gamma_{c} se pueden posteriormente formular en una preparación farmacéutica para su uso en el método objeto.

Una vez presentados en la superficie de un paquete de presentación (por ejemplo, fago filamentoso), la librería de anticuerpos se criba con una proteína \gamma_{c}, o péptido o un fragmento del mismo, para identificar y aislar los paquetes que expresan un anticuerpo que tienen especificidad por \gamma_{c}. Se pueden recuperar los ácidos nucleicos que codifican el anticuerpo seleccionado a partir de paquete de presentación en fagos (por ejemplo, a partir del genoma del fago) y subclonar en otros vectores de expresión mediante técnicas de ADN recombinante estándar.

C. Otros agentes estimuladores

También se abarcan en la invención los fragmentos de péptidos o formas modificadas de ligandos naturales para la cadena gamma común de los receptores de citoquinas que estimulan a través de la cadena gamma. Por ejemplo, se puede usar un fragmento de péptido o forma modificada de IL-2, IL-4 o IL-7 que retiene la capacidad de estimular a través de \gamma_{c}. Además, miméticos de péptidos y otras moléculas pequeñas (por ejemplo drogas) que se unen a y estimulan a través de \gamma_{c}. Se puede identificar una citoquina modificada, fragmento de péptido, mimético de péptido o molécula pequeña que estimula a través de \gamma_{c} mediante cribado de sustancias utilizando ensayos de cribado como se han descrito aquí. De forma alternativa, se puede usar el diseño racional de drogas para diseñar una molécula que interaccione con \gamma_{c}.

Otro tipo de agente estimulador contemplado en la invención es un ácido nucleico que codifica un ligando estimulador para \gamma_{c}. Por ejemplo, se puede introducir el ácido nucleico (por ejemplo ADN) que codifica un anticuerpo anti-\gamma_{c} (o fragmento del mismo) o una citoquina que se une a un receptor que contiene \gamma_{c} (por ejemplo, IL-2, IL-4, IL-7) en células in vitro, o administrar a un sujeto in vivo, como terapia génica para estimular las respuestas de células T y prevenir la inducción de anergia. Los vectores recombinantes de expresión para expresar proteínas o péptidos en células (por ejemplo, vectores virales recombinantes), y mecanismos de distribución de ácidos nucleicos adecuados para la terapia génica in vitro o in vivo, son bien conocidos en la técnica. Se puede usar un vector de expresión que codifica una forma soluble, secretada de un anticuerpo anti-\gamma_{c}, o una citoquina para producir dentro de las células un ligando de \gamma_{c} que se secreta después de las células y se une a un receptor de citoquina de superficie que contiene \gamma_{c} en las células T activadas (por ejemplo, en cultivo o in vivo) para prevenir la inducción de la anergia.

Un tipo alternativo de agente estimulador de \gamma_{c} ya que es uno que actúa intracelularmente para desencadenar una señal mediada por \gamma_{c}. De este modo, este agente no se une a la parte extracelular de \gamma_{c} o de un receptor que contiene \gamma_{c}, sino que mimetiza o induce una señal intracelular (por ejemplo, segundo mensajero) asociada con la ligación de \gamma_{c}. En una forma de realización, el agente que actúa de forma intracelular para desencadenar una señal mediada por \gamma_{c} estimula la fosforilación de \gamma_{c}. En otra forma de realización, el agente estimula la fosforilación de una quinasa JAK de 116 kD.

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II. Agentes que inhiben la señalización a través de una cadena gamma común a receptores de citoquinas A. Anticuerpos anti-cadena \gamma

Se puede usar una forma inhibidora, o bloqueante de un anticuerpo, o un fragmento del mismo, que se une a \gamma_{c} pero no estimula a través de \gamma_{c} para inhibir la señalización a través de \gamma_{c}. Una "forma inhibidora" de un anticuerpo anti-\gamma_{c} se refiere a una forma del anticuerpo que se une a \gamma_{c} pero no induce una señal intracelular a través de \gamma_{c} tras la unión. Además, la forma inhibidora del anticuerpo anti-\gamma_{c} preferiblemente inhibe o previene la interacción de \gamma_{c} con sus ligandos naturales, por ejemplo, inhibe o previene la señalización a través de \gamma_{c} por IL-2, IL-4 o IL-7. En una forma de realización, la forma inhibidora del anticuerpo anti-\gamma_{c} es un anticuerpo soluble que no entrecruza \gamma_{c}. En otra forma de realización, la forma inhibidora de anti-\gamma_{c} es un fragmento de anticuerpo, tal como un fragmento Fab o Fv, que se une a \gamma_{c} pero no induce una señal a través de \gamma_{c}. Se pueden preparar anticuerpos inhibidores anti-\gamma_{c}, y fragmentos de los mismos, utilizando metodologías estándar, según se ha descrito anteriormente.

B. Anticuerpos anti-citoquina

También se puede inhibir una señal a través de \gamma_{c} utilizando un anticuerpo, o un fragmento del mismo, que neutraliza una citoquina que se une a un receptor que contiene \gamma_{c} (por ejemplo, un anticuerpo neutralizante contra IL-2, IL-4 o IL-7). El término "anticuerpo neutralizante" se refiere a un anticuerpo que se une a la citoquina e inhibe o previene su interacción con su receptor en una célula T. Los anticuerpos contra citoquinas tal como IL-2, IL-4 o IL-7 están disponibles comercialmente o se pueden preparar utilizando metodologías estándar, según se ha descrito anteriormente.

C. Otros agentes inhibidores

También se incluyen en la invención fragmentos de péptidos o formas modificadas de ligandos naturales para la cadena gamma común de los receptores de citoquinas que inhiben la señalización a través de la cadena gamma. Por ejemplo, se puede utilizar un fragmento peptídico o forma modificada de IL-2, IL-4 o IL-7 que retiene la capacidad de unirse a \gamma_{c} pero que ya no es capaz de estimulación a través de \gamma_{c}. Además, se pueden usar miméticos de péptidos y otras moléculas pequeñas (por ejemplo, drogas) que se unen a \gamma_{c} e inhiben y previenen la unión de los ligandos naturales citoquinas a \gamma_{c} para de esta manera inhibir la señalización intracelular a través de \gamma_{c}. Se puede identificar una citoquina modificada, fragmento peptídico, mimético de péptido o molécula pequeña que inhibe la señalización intracelular de \gamma_{c} mediante cribado de sustancias utilizando ensayos de cribado según se ha descrito aquí. De forma alternativa, se puede utilizar el diseño racional de drogas para diseñar una molécula que bloquee la unión de los ligandos naturales citoquinas (por ejemplo, IL-2, IL-4 o IL-7) con \gamma_{c}.

Otro tipo de agente inhibidor que se contempla en la invención es un ácido nucleico que tiene sentido opuesto a un ácido nucleico que codifica \gamma_{c} (por ejemplo, antisentido a una región codificante o reguladora del gen \gamma_{c}). Por ejemplo, se puede introducir un ácido nucleico antisentido (por ejemplo, ADN) en células in vitro, o administrar a un sujeto in vivo, como terapia génica para inhibir las respuestas de células T e inducir anergia específica de antígeno. El ácido nucleico antisentido puede ser un oligonucleótido o un vector de expresión recombinante que contiene un ADNc o un gen de \gamma_{c}, o una parte del mismo, en una orientación que lleva a la expresión de un ácido nucleico antisentido de \gamma_{c}. Se puede introducir el ácido nucleico antisentido en células T in vitro o in vivo mediante un sistema de distribución adecuado para terapia génica in vitro o in vivo que son conocidos en la técnica.

Un tipo alternativo de agente inhibidor de \gamma_{c} es uno que actúa intracelularmente para inhibir una señal mediada por \gamma_{c}. De esta manera, este agente no bloquea la unión de un ligando natural citoquina a la parte extracelular de un receptor que contiene \gamma_{c}, sino que inhibe una señal intracelular (por ejemplo, segundo mensajero) asociado con la ligación de \gamma_{c}. En una forma de realización, el agente que actúa de forma intracelular para inhibir la señal mediada por \gamma_{c} inhibe la fosforilación de \gamma_{c}. En otra forma de realización, el agente inhibe la fosforilación de una quinasa JAK de 116 kD. En aún otra forma de realización, el agente inhibe una interacción, o asociación, entre \gamma_{c} y la quinasa JAK de 116 kD.

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III. Usos terapéuticos de los agentes estimuladores de la cadena gamma

Se puede utilizar un agente que estimula una señal intracelular a través de \gamma_{c} para estimular una respuesta de célula T a un antígeno previniendo la inducción de la anergia específica de antígeno en la célula T y estimulando la proliferación de la célula T. La estimulación a través de \gamma_{c} puede ser terapéuticamente útil para aumentar, prolongar y/o mantener las respuestas inmunes en las que se da la presentación del antígeno a una célula T en condiciones que pueden inducir de forma natural la anergia de células T. Por ejemplo, las células T específicas para antígenos tumorales pueden ser susceptibles de volverse anérgicas mediante estimulación de la célula T con antígenos tumorales en la superficie de las células tumorales en ausencia de una señal coestimuladora (por ejemplo, las células tumorales que no expresan moléculas coestimuladoras tal como B7-1 o B7-2 pueden anergizar las células T, de esta manera modulando negativamente las respuestas antitumorales). De acuerdo con esto, se pueden aumentar las respuestas antitumorales mediante estimulación de las células T específicas de antígenos tumorales a través de \gamma_{c} en presencia de una señal específica de antígeno tumoral. Por ejemplo, se puede administrar un agente estimulador de \gamma_{c} como se ha descrito anteriormente a un sujeto que tiene un tumor. De forma alternativa, las células T de un sujeto que tiene un tumor se pueden poner en contacto in vitro con células tumorales y un agente estimulador de \gamma_{c} y después volver a administrarlas al sujeto.

Adicionalmente, se pueden aumentar y prolongar las respuestas de células T a patógenos, tal como virus, bacterias, hongos, parásitos y similares, administrando a un sujeto que tiene el patógeno un agente estimulador de \gamma_{c} descrito aquí. También se puede aumentar la eficacia de la vacunación estimulando las células T a través de \gamma_{c}. Por ejemplo, se puede administrar la vacuna junto con un agente estimulador de \gamma_{c} para aumentar la respuesta inmune contra el material de vacunación.

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IV. Usos terapéuticos de los agentes inhibidores de la cadena gamma

Se pueden utilizar los agentes inhibidores de \gamma_{c} de la invención para inhibir una respuesta de células T a un antígeno y, además, para inducir anergia de células T específica de antígeno de modo que la célula T no responda al antígeno tras la reexposición. Para inhibir una respuesta de célula T e inducir anergia, se pone en contacto una célula T con un agente inhibidor de \gamma_{c} en presencia de una señal específica de antígeno. El grado de reacción de una célula T a un antígeno se puede inhibir según los métodos de la invención bien in vitro bien in vivo. Para inhibir las células T in vitro, las células T se ponen en contacto con un agente inhibidor de \gamma_{c} junto con una célula presentadora de antígeno a la célula T (por ejemplo, una célula alógena para inhibir respuestas específicas de aloantígeno). Para inhibir las respuestas de células T e inducir anergia in vivo, se administra un agente inhibidor de \gamma_{c} a un sujeto. En este caso, las células T reciben la estimulación por antígeno requerida a través del complejo TCR/CD3 mediante un estímulo endógeno in vivo (por ejemplo, un autoantígeno o un antígeno extraño presentado por célula presentadoras de antígeno in vivo). De forma alternativa, se puede coadministrar un estímulo antigénico con el agente inhibidor de \gamma_{c} (por ejemplo, para inducir anergia específica de alergeno, el alergeno se puede coadministrar con el agente inhibidor de \gamma_{c}). Además, las respuestas de células T se pueden inhibir de forma no específica administrando una señal a través del complejo TCR/CD3 con un reactivo no específico, tal como un anticuerpo anti-CD3 junto con un agente inhibidor
de \gamma_{c}.

De forma adicional o alternativa, para inhibir las respuestas de células T e inducir anergia en un sujeto, también puede ser beneficioso inhibir o prevenir que las células T reciban una señal coestimuladora in vivo, tal como la señal coestimuladora mediada por la interacción de CD28 con B7-1 o B7-2. De acuerdo con esto, además de poner en contacto una célula T con un agente inhibidor de \gamma_{c}, la célula T también se puede poner en contacto con otro agente que inhiba la generación de una señal coestimuladora en células T, tal como una molécula bloqueante que se una a CD28, B7-1 o B7-2. Los ejemplos de moléculas bloqueantes adecuadas incluyen un fragmento Fab anti-CD28, anticuerpos bloqueantes anti-B7-1 o anti-B7-2 (es decir, anticuerpos que bloquean las interacciones CD28-B7-1/B7-2 pero no inducen una señal coestimuladora en células T) y formas solubles de CTLA4, CD28, B7-1 o B7-2 (por ejemplo, una proteína de fusión CTLA4Ig). Además, se pueden usar combinaciones de moléculas bloqueantes, por ejemplo un anticuerpo anti-B7-1 y un anticuerpo anti-B7-2.

Los métodos de la invención para inhibir una respuesta de células T a un antígeno e inducir anergia específica de antígeno son aplicables a varias situaciones clínicas donde es deseable modular negativamente las respuestas de células T, como se describe en mayor detalle en las subsecciones siguientes.

A. Trasplante de órgano/EICH: La inducción de la anergia en células T es útil en situaciones de trasplante celular, de tejido, piel y órgano y en el trasplante de médula ósea (por ejemplo, para inhibir la enfermedad del injerto contra el huésped (EICH)). Por ejemplo, la anergización de células T aloreactivas puede dar como resultado la disminución de la destrucción de tejido en trasplante de tejido y aceptación de injerto a largo plazo sin necesidad de inmunosupresión generalizada. Típicamente, en trasplantes de tejido, el rechazo del injerto se inicia mediante su reconocimiento como extraño por las células T, seguido por una reacción inmune que destruye el injerto. Se puede administrar un agente inhibidor de \gamma_{c} a un receptor de trasplante junto con las células trasplantadas para inducir falta de respuesta de células T específica de aloantígeno. Se puede coadministrar un agente que inhibe una señal coestimuladora a través de CD28/CTLA4Ig, tal como CTLA4Ig, con el agente inhibidor de \gamma_{c}.

Las aproximaciones descritas anteriormente se pueden aplicar de forma similar a la situación de trasplante de médula ósea para anergizar de forma específica células T aloreactivas de la médula ósea del donante. Se puede incubar la médula ósea del donante antes del trasplante in vitro con células del receptor (por ejemplo, células hematopoyéticas) y un agente inhibidor de \gamma_{c}. En la incubación se pueden incluir agentes adicionales que inhiban la generación de una señal coestimuladora en las células T (por ejemplo, anticuerpos anti-B7-1 y/o anti-B7-2, CLTA4Ig, etc). La médula ósea tratada se administra después al receptor, que puede ser tratado adicionalmente in vivo con un agente inhibidor de \gamma_{c} solo o en combinación con un agente que inhibe una señal coestimuladora.

Se puede valorar la eficacia de un agente inhibidor de \gamma_{c} particular para prevenir el rechazo al trasplante de órgano o EICH utilizando modelos animales que son predictivos de eficacia en seres humanos. Los ejemplos de sistemas apropiados que se pueden usar incluyen injertos cardiacos alógenos en ratas e injertos de células de islotes pancreáticos xenogénicos en ratones, de los que ambos se han usado para examinar los efectos inmunosupresores de las proteínas de fusión CLTA4Ig in vivo como se describe en Lenschow et al. Science, 257: 789-792 (1992) y Turka et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 89: 11102-11105 (1992). Además, se pueden utilizar modelos murinos de EICH (ver Paul ed., Fundamental Immunology, Raven Press, Nueva York, 1989, pp. 846-847) para determinar el efecto de inducir falta de respuesta en células T utilizando un agente inhibidor de \gamma_{c} en el desarrollo de esa enfermedad.

B. Enfermedades autoinmunes: La inducción de la falta de respuesta de células T específica de antígeno mediante los métodos de la invención también puede ser terapéuticamente útil para tratar enfermedades autoinmunes. Muchos trastornos autoinmunes son el resultado de la activación inadecuada de células T que reaccionan contra el tejido propio (es decir, reaccionan contra autoantígenos) y que inducen la producción de citoquinas y autoanticuerpos implicados en la patología de las enfermedades. Prevenir la activación de las células T autorreactivas puede de esta manera reducir o eliminar los síntomas de la enfermedad. La administración de un agente inhibidor de \gamma_{c} se puede usar para inhibir las respuestas de células T a los autoantígenos y, además, para inducir anergia específica de autoantígenos. Para tratar un trastorno autoinmune, se administra un agente inhibidor de \gamma_{c} a un sujeto en necesidad de tratamiento. De forma alternativa, para trastornos autoinmunes con un autoantígeno conocido, se puede coadministrar el autoantígeno al sujeto con el agente inhibidor.

Este método se puede usar para tratar varias enfermedades autoinmunes y trastornos que tienen un componente autoinmune, entre otras diabetes mellitus, artritis (incluyendo artritis reumatoide, artritis reumatoide juvenil, artrosis, artropatía soriásica), esclerosis múltiple, miastenia grave, lupus eritematoso sistémico, tiroiditis autoinmune, dermatitis (incluyendo dermatitis atópica y dermatitis eccematosa), soriasis, síndrome de Sjögren, incluyendo queratoconjuntivitis seca secundaria al síndrome de Sjögren, alopecia areata, respuestas alérgicas debidas a reacciones a la picadura de artrópodos, enfermedad de Crohn, úlcera afta, iritis, conjuntivitis, queratoconjuntivitis, colitis ulcerosa, asma, asma alérgico, lupus eritematoso cutáneo, escleroderma, vaginitis, proctitis, exantema farmacógeno, reacciones reversas de lepra, eritema leprosa nodular, uveítis autoinmune, encefalomielitis alérgica, encefalopatía hemorrágica necrótica aguda, pérdida de audición sensorineural progresiva idiopática bilateral, anemia aplásica, anemia de leucocitos pura, trombocitopenia idiopática, policondritis, granulomatosis de Wegener, hepatitis crónica activa, síndrome de Stevens-Johnson, celiaquía idiopática, liquen plano, enfermedad de Crohn, oftalmopatía de Graves, sarcoidosis, cirrosis biliar primaria, uveítis posterior, y fibrosis pulmonar intersticial.

La eficacia de los agentes de entrecruzamiento de \gamma_{c} en prevenir o mitigar los trastornos autoinmunes se puede determinar utilizando varios modelos animales bien caracterizados de enfermedades autoinmunes humanas. Los ejemplos incluyen encefalitis autoinmune experimental murina, lupus eritematoso sistémico en ratones MRL/lpr/lpr o ratones híbridos NZB, artritis autoinmune de colágeno murina, diabetes mellitus en ratones NOD y ratas BB, y miastenia grave experimental murina (ver Paul ed., Fundamental Immunology, Raven Press, Nueva York, 1989, pp. 840-856).

C. Alergia: La respuesta del anticuerpo IgE en la alergia atópica es altamente dependiente de células T y, de esta manera, la inhibición de las respuestas de células T específicas de alergeno y la inducción de anergia específica de alergeno pueden ser terapéuticamente útiles en el tratamiento de la alergia y las reacciones alérgicas. Por ejemplo, se puede administrar un agente inhibidor de \gamma_{c} a un sujeto alérgico expuesto a un alergeno para inducir apoptosis en células T específicas de alergeno, por lo tanto modulando negativamente las respuestas alérgicas en el sujeto. La administración de un agente inhibidor de \gamma_{c} a un sujeto alérgico se puede acompañar de exposición ambiental al alergeno o mediante la coadministración del alergeno al sujeto. Las reacciones alérgicas pueden ser de naturaleza sistémica o local, dependiendo de la vía de entrada del alergeno y del patrón de deposición de las IgE en los mastocitos o basófilos. De esta manera, puede ser necesario inhibir las respuestas de las células T de forma local o sistémica mediante la administración adecuada de un agente inhibidor de \gamma_{c}. Por ejemplo, en una forma de realización, se coadministran un agente inhibidor de \gamma_{c} y un alergeno de forma subcutánea a un sujeto alérgico.

D. Inducción de anergia específica de antígeno: Los métodos de la invención para inducir la falta de respuesta de las células T se pueden aplicar esencialmente a cualquier antígeno (por ejemplo, proteína) para anergizar las células T a ese antígeno en un sujeto. De esta manera, se puede administrar un antígeno de interés al que se van a anergizar las células T a un sujeto junto con un agente inhibidor de \gamma_{c}. El antígeno se puede administrar de una forma soluble a unido a un vehículo o soporte (por ejemplo, una bola). Esta aproximación básica tiene una aplicación amplia como un complemento a terapias que utilizan una molécula potencialmente inmunogénica para fines terapéuticos. Por ejemplo, un número creciente de aproximaciones terapéuticas utiliza una molécula proteinácea, tal como un anticuerpo, una proteína de fusión o similares, para el tratamiento de un trastorno clínico. Una limitación al uso de tales moléculas terapéuticamente es que pueden provocar una respuesta inmune dirigida contra la molécula terapéutica en el sujeto que está siendo tratado (por ejemplo, la eficacia a anticuerpos monoclonales murinos en sujetos humanos se dificulta mediante la inducción de una respuesta inmune contra los anticuerpos en el sujeto humano). El método de la invención para inducir falta de respuesta en células T específica de antígeno se puede aplicar a estas situaciones terapéuticas para permitir el uso a largo plazo de la molécula terapéutica en el sujeto sin provocar una respuesta inmune. Por ejemplo, para anergizar células T que responden a anticuerpos terapéuticos (por ejemplo, un mAb murino que normalmente activa las células T específicas para el anticuerpo en un sujeto humano), el anticuerpo terapéutico se administra a un sujeto (por ejemplo, un ser humano) junto con un agente inhibidor de \gamma_{c}. El método puede implicar adicionalmente la administración de un agente que inhibe una señal coestimuladora mediada por CD28/CTLA4, tal como CTLA4Ig.

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V. Administración de formas terapéuticas de agentes estimuladores o inhibidores de la cadena gamma

Los agentes de la invención se administran a sujetos en una forma biológicamente compatible adecuada para la administración farmacéutica in vivo para estimular o inhibir las respuestas de células T. Mediante "forma biológicamente compatible adecuada para la administración in vivo" se quiere decir una forma del agente a ser administrado en la que cualquier efecto tóxico está superado por los efectos terapéuticos del agente. Se pretende que el término sujeto incluya organismos vivos en los que se puede provocar una respuesta inmune, por ejemplo, mamíferos. Los ejemplos de sujetos incluyen seres humanos, monos, perros, gatos, ratones, ratas, y especies transgénicas de los mismos. La administración de un agente de la invención según se ha descrito aquí puede ser en cualquier forma farmacológica incluyendo una cantidad terapéuticamente activa de un agente estimulador o inhibidor de \gamma_{c} solo o en combinación con otra molécula terapéutica (por ejemplo, un agente que estimula o inhibe una señal a través de un receptor (por ejemplo, CD28/CTLA4) para una molécula coestimuladora (por ejemplo, B7-1 y/o B7-2), tal como anticuerpos estimuladores o bloqueantes de CD28, anticuerpos bloqueantes de B7-1 ó B7-2, CTLA4Ig etc.) y soporte farmacéuticamente aceptable. La administración de de una cantidad terapéuticamente activa de las composiciones terapéuticas de la presente invención se define como una cantidad eficaz, a dosis y durante períodos de tiempo necesarios para alcanzar el resultado deseado. Por ejemplo, una cantidad terapéuticamente activa de un agente estimulador o inhibidor de \gamma_{c} puede variar según factores tal como el estado de la enfermedad, edad, sexo, y peso del individuo, y la capacidad del agente para provocar una respuesta deseada en el individuo. Las pautas de dosis se pueden ajustar para proporcionar la respuesta terapéutica óptima. Por ejemplo, se pueden administrar varias dosis divididas diariamente o se puede reducir la dosis proporcionalmente según lo indiquen las exigencias de la situación terapéutica.

El compuesto activo se puede administrar de una manera conveniente tal como mediante inyección (subcutánea, intravenosa, etc.), administración oral, inhalación, aplicación transdérmica, o administración rectal. Dependiendo de la vía de administración, el compuesto activo se puede recubrir en un material para proteger el compuesto de la acción de las enzimas, ácidos y otras situaciones naturales que pueden inactivar el compuesto.

Para administrar un agente de otra forma que mediante administración parenteral, puede ser necesario recubrir el ligando con, o coadministrar el ligando con, un material para prevenir su inactivación. Se puede administrar un agente a un individuo en un soporte o diluyente adecuado, administrar con inhibidores de enzimas o en un soporte apropiado tal como liposomas. Los diluyentes farmacéuticamente aceptables incluyen soluciones tamponadas salinas y acuosas. Los inhibidores de enzimas incluyen inhibidor pancreático de tripsina, diisopropilfluorofosfato (DEP) y trasylol. Los liposomas incluyen emulsiones de agua en aceite en agua así como liposomas convencionales (Strejan et al., (1984) J. Neuroimmunol. 7: 27).

El compuesto activo también se puede administrar de forma parenteral o intraperitoneal. Las dispersiones también se pueden preparar en glicerol, polietilenglicoles líquidos, y mezclas de los mismos y en aceites. En condiciones normales de almacenamiento y uso, estas preparaciones pueden contener un conservante para prevenir el crecimiento de microorganismos.

Las composiciones farmacéuticas adecuadas para uso inyectable incluyen soluciones (cuando son solubles en agua) o dispersiones acuosas estériles y polvos estériles para la preparación extemporánea de soluciones o dispersiones estériles inyectables. En todos los casos, la composición debe ser estéril y debe ser fluida hasta el punto de que exista una inyectabilidad fácil. Debe ser estable en condiciones de producción y almacenamiento y se debe conservar contra la acción contaminante de microorganismos tales como bacterias y hongos. El soporte debe ser un solvente o medio de dispersión que contiene, por ejemplo, agua, etanol, poliol (por ejemplo, glicerol, propilenglicol, y polietilenglicol líquido, y similares), y mezclas adecuadas de los mismos. Se puede mantener la fluidez adecuada, por ejemplo, mediante el uso de un recubrimiento tal como lecitina, mediante el mantenimiento del tamaño de partícula requerido en el caso de una dispersión y mediante el uso de agentes tensoactivos. Se puede alcanzar la prevención de la acción de microorganismos mediante varios agentes antibacterianos y antifúngicos, por ejemplo, parabenos, clorobutanol, fenol, ácido ascórbico, timerosal, y similares. En muchos casos, será preferible incluir agentes isotónicos, por ejemplo, azúcares, polialcoholes tal como manitol, sorbitol, cloruro de sodio en la composición. Se puede producir la absorción prolongada de las composiciones inyectables incluyendo en la composición un agente que retrase la absorción, por ejemplo, monoestearato de aluminio y gelatina.

Se pueden preparar soluciones estériles inyectables incorporando el compuesto activo en la cantidad requerida en un solvente apropiado con uno o una combinación de los ingredientes enumerados anteriormente, según se requiera, seguido mediante esterilización por filtración. En general, las dispersiones se preparan incorporando el compuesto activo en un vehículo estéril que contiene un medio básico de dispersión y los otros ingredientes requeridos de aquellos enumerados anteriormente. En el caso de polvos estériles para la preparación de soluciones estériles inyectables, los métodos preferidos son secado por vacío y liofilización que produce un polvo del principio activo más cualquier ingrediente adicional deseado de una solución previamente esterilizada por filtración del mismo.

Cuando el compuesto activo se protege adecuadamente, como se ha descrito anteriormente, el compuesto de puede administrar de forma oral, por ejemplo, con un diluyente inerte o un soporte comestible asimilable. Como se usa aquí "soporte farmacéuticamente aceptable" incluye cualquiera de los solventes, medios de dispersión, recubrimientos, agentes antibacterianos y antifúngicos, agentes isotónicos y de retraso de la absorción, y similares. El uso de tales medios y agentes para sustancias farmacéuticamente activas es bien conocido en la técnica. Excepto en tanto que cualquier medio o agente convencional sea incompatible con el principio activo, se contempla el uso de los mismos en composiciones terapéuticas. También se pueden incorporar compuestos activos suplementarios a las composiciones.

Es especialmente provechoso formular las composiciones parenterales en formas de unidades de dosis para facilidad de administración y uniformidad de las dosis. Las formas de unidades de dosis como se usa aquí se refiere a unidades físicamente discretas como dosis unitarias para tratar a sujetos mamíferos; cada unidad contiene una cantidad predeterminada de compuesto activo calculado para producir el efecto terapéutico deseado en asociación con el soporte farmacéutico requerido. La especificación para las formas de dosis de la invención están dictadas por y son directamente dependientes de (a) las características únicas del compuesto activo y el efecto terapéutico particular a alcanzar, y (b) las limitaciones intrínsecas en la técnica de mezclar tal compuesto activo para el tratamiento de la sensibilidad en individuos.

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VI. Ensayos de cribado

Otro aspecto de la invención se refiere a los ensayos de cribado para la identificación de agentes que inhiben o estimulan la señalización a través de \gamma_{c}. En una forma de realización, un método para identificar un agente que inhibe la señalización a través de \gamma_{c} implica: poner en contacto una célula T que expresa un receptor de citoquina que contiene \gamma_{c} (por ejemplo, IL-2R, IL-4R, IL-7R) con un primer agente que estimula un señal de activación primaria (por ejemplo, un anticuerpo anti-CD3 o un antígeno presentado por una célula presentadora de antígeno) y un segundo agente que estimula una señal a través de \gamma_{c} (por ejemplo una citoquina tal como IL-2, IL-4 ó IL-7 o un anticuerpo que entrecruza \gamma_{c}) en presencia y ausencia de una sustancia a probar. Se mide la proliferación de la célula T y se identifica la sustancia que inhibe la señalización a través de \gamma_{c} basada en la capacidad de la sustancia de inhibir la proliferación de la célula T (es decir, la respuesta proliferativa de la célula T se inhibe en presencia de la sustancia comparada con la respuesta proliferativa en ausencia de la sustancia). Se puede medir la proliferación de células T mediante ensayos estándar, tal como incorporación de timidina tritiada. De forma alternativa, después de la estimulación de la célula T con el primer y el segundo agente como se ha descrito anteriormente en presencia y ausencia de una sustancia a probar, se puede medir una respuesta intracelular, tal como la asociación entre \gamma_{c} y la quina JAK de 116 kD, la fosforilación de \gamma_{c} o la fosforilación de la quinasa JAK de 116. Se puede identificar una sustancia que inhibe la señalización a través de \gamma_{c} basada en la capacidad de la sustancia de inhibir una asociación entre \gamma_{c} y la quinasa JAK de 116 kD, la fosforilación de \gamma_{c} o la fosforilación de la quinasa JAK 116. Se puede medir la asociación entre \gamma_{c} y la quinasa JAK de 116 kD mediante ensayos de coinmunoprecipitación, según se describe en el Ejemplo 3. La fosforilación de \gamma_{c} y de la quinasa JAK 116 se pueden ensayar utilizando anticuerpos anti-fosfotirosina, según se describe en el Ejemplo 3.

De forma alternativa, se pueden usar ensayos de cribado para identificar agentes que estimulan una señal intracelular a través de \gamma_{c}. En una forma de realización, uno de tales ensayos de cribado implica poner en contacto una célula T que expresa un receptor de citoquina que contiene \gamma_{c} (por ejemplo, IL-2R, IL-4R, IL-7R) con un agente que estimula una señal de activación primaria (por ejemplo, un anticuerpo anti-CD3 o un antígeno presentado por una célula presentadora de antígeno) sin inducir una señal coestimuladora a través de CD28/CTLA4, en presencia o ausencia de una sustancia a ser probada, seguido por la medida de la proliferación de células T. La estimulación de la célula T solo con el agente que estimula la señal primaria de activación resultará en la inducción anergia en la célula T y falta de proliferación de la célula T. Se puede identificar una sustancia que estimula una señal a través de \gamma_{c} basada en su capacidad de prevenir la inducción de anergia en la célula T. Esto es, en presencia de la sustancia estimuladora, la célula T proliferará y responderá al antígeno tras la reexposición. De forma alternativa, se puede medir una respuesta intracelular, tal como la fosforilación de \gamma_{c} o de la quinasa JAK de 116 kD. Se puede identificar un agente que estimula a través de \gamma_{c} basado en la capacidad de la sustancia para inducir la fosforilación de \gamma_{c} o de la quinasa JAK de 116 kD.

En otra forma de realización, se utiliza un sistema de ensayo del doble híbrido tal como el descrito en la patente de EE.UU. No. 5283173 y solicitud de PCT WO 94/10300 para identificar agentes que inhiben una interacción entre \gamma_{c} y una quinasa JAK de 116 kD. Los kits para realizar el sistema del doble híbrido están disponibles comercialmente de Clontech, Palo Alto, CA. De forma alternativa, se pueden preparar y utilizar proteínas de fusión de glutation-S-transferasa con \gamma_{c} y/o la quinasa JAK de 116 kD para identificar agentes que inhiben una interacción entre \gamma_{c} y una quinasa JAK de 116 kD. Por ejemplo, se hace una fusión de GST con una proteína, se incuba con una preparación marcada de la otra proteína, en presencia y ausencia de una sustancia a ser probada, y se precipita el complejo \gamma_{c}-quinasa JAK de 116 kD con glutation-agarosa. Se puede identificar una sustancia que inhibe una interacción entre \gamma_{c} y la quinasa JAK de 116 kD basada en la capacidad de la sustancia de reducir la cantidad de proteína que se precipita con la proteína de fusión de GST.

La invención se ilustra adicionalmente mediante los siguientes ejemplos que no se deben interpretar como limitantes. Los contenidos de todas las referencias, patentes y solicitudes de patentes publicadas citadas a lo largo de esta aplicación se incorporan aquí mediante referencia.

Ejemplo 1 IL-2, IL-4 e IL-7 previenen la inducción de anergia en células T

En los Ejemplos, se usó un sistema modelo clónico de células T humanas específicas de aloantígeno. Se generaron clones de células T específicas del aloantígeno HLA-DR7, TC-3 y TC-4 (CD4^{+}, CD8^{-}, CD28^{+}, B7^{-}) utilizando metodología estándar. En varios experimentos, se cultivaron los clones de células T específicos de DR7 con una línea de células linfoblastoides DR7^{+} (LBL-DR7) o células NIH-3T3 transfectadas para expresar DR-7 solo (t-DR7) o DR-7 y B7-1 (t-DR7/B7-1). LBL-DR7 es una línea de células B linfoblastoides transformada con EBV, que es homocigótica para HLA-DR7 y expresa con intensidad B7-1, B7-2, LFA-1, LFA-3 y ICAM-1. Las células NIH-3T3 transfectantes se describen en Gimmi, C.D. et al. (1993) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90: 6586. En varios experimentos, se añadieron al cultivo diferentes citoquinas o anticuerpos. Antes de cada experimento, los clones de células T se dejaron descansar durante 10 a 14 días en IL-2 sin reestimulación con aloantígeno. Antes de su uso, las células se cultivaron durante la noche sin estímulo o IL-2.

En una primera serie de experimentos, los clones de células T específicas de aloantígeno (es decir, específicas de DR7) se incubaron en un cultivo primario con 1) LBL-DR7, 2) LBL-DR7 más CTLA4Ig, en medio o en presencia de varias citoquinas, 3) t-DR7/B7-1 ó 4) t-DR7 en medio o en presencia de varias citoquinas. Las citoquinas usadas en los experimentos, y las concentraciones usadas de citoquinas, son como sigue: IL-2 (50 U/ml); IL-4 (5 ng/ml) (Genzyme, Cambridge, MA); IL-6 (30 ng/ml) (Genzyme); IL-7 (10 ng/ml) (Genzyme); IL-12 (10 U/ml) (Genetics Institute, Cambridge, MA); TNF\alpha (500 U/ml) (Genzyme); IFN\gamma (500 U/ml) (Biogen, Cambridge, MA). Antes de usar, las células LBL-DR7 y los transfectantes de NIH-3T3 se trataron con mitomicina C. En algunos experimentos, las células LBL-DR7 se irradiaron (9600 rads). Los clones de células T se cultivaron en un cultivo primario durante 24 horas. Después del cultivo primario, las células T se separaron de las LBL-DR7 mediante Ficoll y de los transfectantes de NIH-3T3 mediante Percoll, y se recultivaron en medio sin IL-2 durante 12 horas. Cada población se reexpuso posteriormente a estimulantes LBL-DR7 en cultivo secundario. Se cultivaron muestras y se midió la proliferación mediante incorporación de [^{3}H]-timidina (1 \muCi).

Los resultados para las células T estimuladas con LBL-DR7 se muestran en la Figura 1, panel A. Los resultados para las células T estimuladas con transfectantes NIH-3T3 se muestran en la Figura 1, panel B. Los resultados representan la respuesta a la reexposición y se expresan como medias de cultivos en triplicado. Se obtuvieron resultados idénticos con ambos clones TC-3 y TC-4. Después del cultivo primario bien con una línea de células linfoblastoide homocigótica para HLA-DR7 (LBL-DR7) bien con transfectantes que expresan HLA-DR7 y la molécula coestimuladora B7-1 (t-DR7/B7-1), los clones de célula T aloreactivas específicas para HLA-DR7 proliferaron significativamente a una reexposición secundaria con células LBL-DR7. Por el contrario, cuando el cultivo primario de clones de células T fue bien con células LBL-DR7 en presencia de CTLA4-Ig, para bloquear la coestimulación mediada por la familia B7, o con transfectantes que expresaban HLA-DR7 solo (t-DR7), se anergizaron y no respondieron en la reexposición a células LBL-DR7. La adición de concentraciones variables de IFN-\gamma, TNF-\alpha, IL-6, IL-10, o IL-12 al cultivo primario con LBL-DR7 más CTLA4-Ig o t-DR7 no previno la inducción de la anergia. Esto fue de alguna manera sorprendente ya que IFN-\gamma, IL-6, IL-10, e IL-12 cada uno por separado pudo inducir la proliferación del clon de células T. Por el contrario, la adición de IL-2, IL-4 o IL-7 al cultivo primario bien con LBL-DR7 más CTLA4-Ig bien con t-DR7, previno la inducción de la anergia.

Ejemplo 2 La estimulación de la cadena \gamma común de los receptores de IL-2, IL-4 e IL-7 previene la inducción de anergia en células T

Puesto que solo la adición de IL-2, IL-4, e IL-7 exógenas previno la inducción de la anergia específica de aloantígeno (ver Ejemplo 1) y puesto que estas citoquinas comparten la \gamma_{c}, se examinó si señalización de \gamma_{c} durante el cultivo primario podría estar asociada con la prevención de la anergia. Para estudiar este punto, se utilizaron mAb específicos. Los diferentes anticuerpos estaban dirigidos contra: 1) las cadenas \alpha ó \beta del receptor de IL-2 (\alphaIL-2R\alpha y \alphaIL-2R\beta), 2) las cadenas del receptor convencional de IL-4 o IL-7 (\alphaIL-4R y \alphaIL-7R), y 3) la cadena \gamma común compartida por los receptores de IL-2, IL-4, e IL-7 (\alpha\gamma_{c}). El cultivo primario de los clones de células T se hizo con LBL-DR7 más CTLA4-Ig o con t-DR7, junto con cada uno de los mAbs anteriores entrecruzados con Ig de conejo anti-ratón (RaM). Los cultivos primarios y la reexposición se realizaron según se ha descrito en el Ejemplo 1. Los anticuerpos contra IL-2R\alpha (IgG2a) (D. A. Fox, et al. (1984) J. Immunol. 133: 1250) (Coulter), IL-2R\beta (IgG) (M. Kamio, et al. (1990) Int. Immunol. 2: 521) (Coulter), IL-4R (IgG1) (W. C. Fanslow, et al. (1993) Blood 81: 2998) (Genzyme), IL-7R (IgGl) (R. G. Goodwin, et al. (1990) Cell 60: 941) (Genzyme) or \gamma_{c} (IgG1) (T. Nakarai, et al. (1994) J. Exp. Med. 180: 241) y RaM se utilizaron todos a una concentración de 10 \mug/ml. Se obtuvieron idénticos resultados cuando se usó un anticuerpo \gamma_{c} biotinilado y el entrecruzamiento se realizó con estreptavidina (10 \mug/ml), en RPMI libre de biotina. Se obtuvieron resultados idénticos con ambos clones TC-3 y TC-4.

Los resultados para las células T estimuladas con LBL-DR7 se muestran en la Figura 2, panel A. Los resultados para las células T estimuladas con t-DR7 se muestran en la Figura 2, panel B. El entrecruzamiento de IL-2R\alpha, IL-2R\beta, IL-4R o IL-7R durante el cultivo primario no previno la inducción de la anergia. Por el contrario, el entrecruzamiento de \gamma_{c} durante el cultivo primario previno la inducción de anergia y dio como resultado tanto proliferación como producción de IL-2 en la reexposición, comparable a la observada en células control no anergizadas. Estos resultados demuestran que en presencia de señalización de TCR, el entrecruzamiento de la cadena \gamma común es suficiente para prevenir la inducción de anergia. Además, estos datos apoyan la hipótesis de que el efecto común de IL-2, IL-4 e IL-7 para prevenir la inducción de anergia es mediada a través de la vía de señalización de \gamma_{c}.

Ejemplo 3 La prevención de la inducción de anergia en células T está asociada con la fosforilación de la quinasa JAK de 116 kD

Para examinar si se podría identificar la vía de señalización común mediada a través de \gamma_{c} después de la estimulación con IL-2, IL-4 e IL-7, se cultivaron clones de células T con IL-2, IL-4 o IL-7 y los lisados celulares se inmunoprecipitaron con mAb anti-\gamma_{c}. Se incubaron clones de células T humanas auxiliares específicas de aloantígeno en medio D-MEM libre de suero sin IL-2 durante 12 horas y posteriormente se estimularon durante 15 minutos con medio, IL-2, IL-4, IL-7, TNF\alpha, o IL-12. Las células se lisaron con tampón de lisis que contenía Tris-HCl 10 mM, pH 7.6, EDTA 5 mM, NaCl 50 mM, pirofosfato de sodio 30 mM, NaFl 50mM, ortovanadato de sodio 1 mM, aprotinina 5 \mug/ml, pepstatina 1 \mug/ml, e inhibidor de tripsina de soja 2 \mug/ml, fluoruro de fenilmetilsulfonilo 1 mM, y NP-40 al 0.5% (Sigma). Para el experimento mostrado en la Figura 3, panel A, las inmunoprecipitaciones se realizaron con anticuerpo anti-\gamma_{c}, los complejos inmunes se aislaron con proteína A-sepharosa, se lavaron tres veces con tampón de lisis y se analizaron en SDS-PAGE en gradiente 6-12%. Las proteínas transferidas a membranas de nitrocelulosa se bloquearon durante 1 hora a temperatura ambiente mediante agitación en TBST (Tris-HCl 20 mM, pH 7.6, NaCl 137 mM, Tween-20 al 0.1%), con seroalbúmina bovina al 10%. Para la detección de fosfoproteínas, las membranas se incubaron con el anticuerpo monoclonal anti-fosfotirosina 4G10 (1:2000) durante 60 minutos a temperatura ambiente. Las membranas se lavaron tres veces con tampón de lavado (Tris-HCl 50 mM, pH 7.6, NaCl 200 mM, Tween-20 al 0.1%), seguido mediante incubación durante 60 minutos con IgG de oveja anti-ratón conjugada a peroxidasa de rábano (1:5000) (Amersham, Arlington Heights, IL). Las membranas se lavaron tres veces con tampón de lavado seguido mediante incubación con el sustrato de quimioluminiscencia aumentado (Amersham), se expusieron a una película de rayos X y se revelaron. Después de la inmunoextinción del ECL, la inmunotransferencia se lavó completamente mediante incubación en Tris-HCl 62.5 mM (pH 6.8), SDS al 3% peso/volumen y \beta-mercaptoetanol 100 mM a 50ºC durante 1 hora. Para los otros experimentos mostrados en la Figura 3, las membranas se bloquearon y se volvieron a probar con anticuerpo anti-JAK (R80) (1:1000) (panel B), o mAbs específicos de péptidos para JAK1 (panel C), JAK2 (panel D) y Tyk2 (panel E), se lavaron y realizó la detección como se ha descrito anteriormente.

La Figura 3, panel A. muestra que la banda de 64 kD de \gamma_{c} coinmunoprecipita con una banda de 116 kD. La inmunotransferencia con el mAb anti-fosfotirosina demostró la fosforilación tanto de la banda de 64 kD como de la 116 kD en residuo(s) de tirosina. Estos resultados sugieren que \gamma_{c} está físicamente asociada con una molécula de 116 kD, que se cofosforila con \gamma_{c} tras la estimulación de células T con IL-2, IL-4 o IL-7. Además, estos resultados apoyan el papel crítico de \gamma_{c} en la transducción de señales de IL-2, IL-4 e IL-7.

Para determinar si el sustrato fosforilado de 116 kD era un miembro de la familia de proteínas quinasas Janus (quinasas JAK), se usó un anticuerpo policlonal (R80) dirigido contra el dominio funcional, carboxi-terminal (JH1) de los miembros de la familia JAK. La inmunotransferencia con el anticuerpo común a las quinasa JAK (R80), tras la inmunoprecipitación con el mAb anti-\gamma_{c} demostró que la banda de 116 kD que se coprecipitaba con \gamma_{c}, era reconocida por R80 (Figura 3, panel B). Por el contrario, al volver a probar la inmunotransferencia con mAbs específicos para JAK1, JAK2 y Tyk2, se demostró que la banda de 116 kD no era reconocida por ninguno de estos mAbs (Figura 3, paneles C, D y E, respectivamente). Estos resultados indican que la señalización de \gamma_{c} da como resultado la fosforilación de miembro de la familia de quinasas JAK de 116 kD, diferente de JAK1, JAK2 y Tyk2.

Puesto que la señalización de la cadena \gamma dio como resultado la fosforilación de la quinasa JAK de 116 kD y la prevención de anergia, se examinó si la fosforilación de la quinasa JAK de 116 kD se inducía en varias condiciones que prevenían la inducción de anergia. Se cultivaron clones de células T con medio, t-DR7 o t-DR7/B7-1 durante 24 horas. Tras el cultivo, las células T se separaron de los transfectantes mediante gradiente de Percoll, se lisaron, y después se inmunoprecipitaron con R80. Se prepararon lisados celulares, se inmunoprecipitaron con el anticuerpo común de JAK (R80) y se realizó un análisis por inmunotransferencia con el anticuerpo monoclonal anti-fosfotirosina 4G10 (1:2000) según se ha descrito anteriormente. El cultivo con t-DR7/B7-1 (condiciones no anergizantes) dio como resultado una fosforilación significativa de la proteína de 116 kD (Figura 4, panel A). Por el contrario, tras el cultivo con t-DR7 (condiciones anergizantes), no hubo aumento significativo en la fosforilación de la proteína de 116 kD comparado con el medio control. El cultivo de clones de células T con células t-DR7 en presencia de IL-2, IL-4 o IL-7, pero no con TNF\alpha o IL-12, no solo previno la inducción de la anergia, sino que también dio como resultado la fosforilación de la proteína de 116 kD (Figura 4, panel B).

Los resultados anteriores demuestran que la señalización de \gamma_{c} representa un paso crítico en la prevención de la anergia. Sin tener en cuenta los mecanismos de señalización distantes, el resultado funcional del entrecruzamiento de \gamma_{c} parece ser crítico para la prevención de la anergia ya que el entrecruzamiento de otras cadenas de los receptores no induce este efecto funcional. Estos resultados subrayan el papel central de \gamma_{c} en la regulación de la supervivencia y función de células T. Puesto que prácticamente todos los timocitos humanos y murinos expresan \gamma_{c} (Cao, X. et al. (1993) Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90:8464), no es sorprendente la redundancia de citoquinas que pueden señalizar a través de \gamma_{c}, proteger el huésped contra la inducción de anergia de células T y/o deleción clónica. Puesto que la coestimulación CD28 induce tanto la acumulación de IL-2 como el aumento en la expresión del receptor de IL-2, esta vía es altamente eficiente en prevenir la inducción de anergia a través de IL-2, mientras que otras citoquinas capaces de señalización a través de \gamma_{c} podrían ser igualmente eficaces en prevenir la inducción de la anergia en otros microambientes. Por ejemplo, la producción de IL-7 por células de médula estromal (Henney, C.S. (1989) Immunol. Today 10: 170) proporciona un mecanismo para prevenir la inducción de anergia en el microambiente de la médula. Además, las citoquinas descritas más recientemente entre otras IL-13 e IL-15 también pueden señalizar a través de \gamma_{c}, y por lo tanto, extender el repertorio de citoquinas que pueden prevenir la inducción de la anergia.

Claims (29)

1. Un método in vitro para estimular la proliferación mediante una célula T que expresa una cadena \gamma de receptor de citoquinas y que ha recibido un señal de activación primaria en condiciones que normalmente producen falta de respuesta en una célula T, que comprende poner en contacto la célula T con un agente que se une a la cadena \gamma del receptor de citoquina y estimula una señal intracelular en la célula T, con la condición de que el agente no consista en interleuquina-2 natural.

2. Uso de un agente que se une a la cadena \gamma del receptor de citoquinas y estimula una señal intracelular en la célula T para la preparación de una composición farmacéutica para el aumento, prolongación y/o mantenimiento de una respuesta inmune que comprende estimular la proliferación mediante una célula T que expresa una cadena \gamma de receptor de citoquinas y que ha recibido un señal de activación primaria en condiciones que normalmente producen falta de respuesta en una célula T, en donde el agente es un anticuerpo anti-cadena \gamma o un fragmento del mismo.

3. El método de la reivindicación 1, en donde el agente es interleuquina-4 o interleuquina-7 o es un anticuerpo anti-cadena \gamma o un fragmento del mismo.

4. Un método in vitro para estimular la proliferación mediante una célula T que expresa una cadena \gamma de receptor de citoquinas y que ha recibido un señal de activación primaria en condiciones que normalmente producen falta de respuesta en una célula T, que comprende poner en contacto la célula T con un agente que actúa intracelularmente para estimular la fosforilación de una quinasa JAK que tiene un peso molecular de alrededor de 116 kD determinado mediante electroforesis en gel de poliacrilamida con dodecilsulfato de sodio.

5. Uso de un agente que actúa intracelularmente para estimular la fosforilación de una quinasa JAK que tiene un peso molecular de alrededor de 116 kD determinado mediante electroforesis en gel de poliacrilamida con dodecilsulfato de sodio para la preparación de una composición farmacéutica para el aumento, prolongación y/o mantenimiento de una respuesta inmune que comprende estimular la proliferación mediante una célula T que expresa una cadena \gamma de receptor de citoquinas y que ha recibido una señal de activación primaria en condiciones que normalmente producen falta de respuesta en una célula T.

6. El método de la reivindicación 1, 3 ó 4, que comprende además poner en contacto la célula T con un agente que estimula una señal de activación primaria en la célula T.

7. El uso de la reivindicación 2, 3 ó 5, en donde la composición farmacéutica comprende además un agente que estimula una señal de activación primaria en la célula T.

8. El método de la reivindicación 6, que comprende además poner en contacto la célula T con un agente que estimula una señal coestimuladora en la célula T.

9. El uso de la reivindicación 7, en donde la composición farmacéutica comprende además un agente que estimula una señal coestimuladora en la célula T.

10. El método de la reivindicación 6 u 8 ó el uso de la reivindicación 7 ó 9, en donde el agente que estimula una señal de activación primaria en la célula T es un antígeno.

11. El método o el uso de la reivindicación 10, en donde el antígeno es un antígeno tumoral o un patógeno seleccionado del grupo que consiste en un virus, una bacteria, y un parásito.

12. Un método in vitro para inducir falta de respuesta a un antígeno en una célula T que expresa una cadena \gamma de receptor de citoquinas que comprende poner en contacto la célula T en presencia de un antígeno con un agente que inhibe la distribución de una señal a través de la cadena \gamma del receptor de citoquinas.

13. Un método in vitro para inducir anergia en una célula T en un trasplante de médula ósea de modo que se inhibe la enfermedad del injerto contra el huésped en un receptor que se va tratar con dicha médula ósea que comprende poner en contacto una célula T de un donante que expresa una cadena \gamma de receptor de citoquinas con una célula que expresa un antígeno receptor y un agente que inhibe la distribución de una señal a través de la cadena \gamma del receptor de citoquinas en la célula T.

14. El método de la reivindicación 12 ó 13, en donde el agente actúa de forma extracelular para inhibir la distribución de una señal a través de la cadena \gamma de receptor de citoquinas.

15. El método de la reivindicación 14, en donde el agente se une a la cadena \gamma de receptor de citoquinas sin estimular un señal intracelular en la célula T a través de la cadena \gamma de receptor de citoquinas o se une a un ligando natural de la cadena \gamma de receptor de citoquinas para inhibir la unión del ligando a la cadena \gamma del receptor de citoquinas.

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16. El método de la reivindicación 15, en donde el agente es un anticuerpo anti-cadena \gamma o es un anticuerpo anti-interleuquina-2, un anticuerpo anti-interleuquina-4 o un anticuerpo anti-interleuquina-7.

17. El método de la reivindicación 12 ó 13, en donde el agente actúa de forma intracelular para inhibir la distribución de una señal a través de la cadena \gamma de receptor de citoquinas.

18. El método de la reivindicación 17, en donde el agente inhibe la asociación de la cadena \gamma del receptor de citoquinas con una quinasa JAK que tiene un peso molecular de alrededor de 116 kD determinado mediante electroforesis en gel de poliacrilamida con dodecilsulfato de sodio.

19. El método de la reivindicación 17, en donde el agente inhibe la fosforilación de la cadena \gamma del receptor de citoquinas y/o de una quinasa JAK que tiene un peso molecular de alrededor de 116 kD determinado mediante electroforesis en gel de poliacrilamida con dodecilsulfato de sodio.

20. El método de la reivindicación 14, 15, 16, 17, 18 ó 19 para inhibir la enfermedad del injerto contra el huésped en un receptor de trasplante de médula ósea.

21. El método de la reivindicación 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18 ó 19 que comprende además poner en contacto la célula T con el antígeno.

22. El método de la reivindicación 10, 11, 14, 16, 17, 18 ó 19, en donde la composición farmacéutica comprende además el antígeno.

23. El método de la reivindicación 21 o el uso de la reivindicación 22, en donde el antígeno es un aloantígeno o un autoantígeno.

24. El método de la reivindicación 21 ó 23, en donde dichas células T se usan para la preparación de una composición farmacéutica diseñada para la administración a un sujeto.

25. El método de la reivindicación 24, en donde el antígeno está en la superficie de una célula alogénica o xenogénica y el sujeto es un receptor de una célula alogénica o xenogénica.

26. El método de la reivindicación 24 ó 25, en donde el sujeto sufre una enfermedad autoinmune o trastorno asociado con una respuesta inmune inapropiada o anormal.

27. Un método para identificar un agente que inhibe la distribución de una señal a través de la cadena \gamma del receptor de citoquinas en una célula T, que comprende

(a)

poner en contacto una célula T que expresa la cadena \gamma del receptor de citoquinas con

(1)

un primer agente que estimula un señal de activación primaria en la célula T,

(2)

un segundo agente que estimula una señal intracelular a través de la cadena \gamma del receptor de citoquinas, y

(3)

un tercer agente a ser probado para la capacidad de inhibir la distribución de la señal a través de la cadena \gamma del receptor de citoquinas; y

(b)

determinar la presencia de proliferación de células T, en donde la inhibición de la proliferación de células T indica que el tercer agente inhibe la distribución de una señal a la célula T a través de la cadena \gamma del receptor de citoquinas.

28. El método de la reivindicación 27, en donde el segundo agente es una citoquina.

29. El método de la reivindicación 28, en donde la citoquina se selecciona del grupo que consiste en interleuquina-2, interleuquina-4 e interleuquina-7.