ES2299210T3 - Genes que codifican proteinas con actividad de transglicolacion. - Google Patents
Genes que codifican proteinas con actividad de transglicolacion. Download PDFInfo
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Abstract
El ADN que codifica para una proteína que tiene una secuencia de aminoácidos que tiene una homología del 60% o más con una secuencia de aminoácidos descrita en cualquiera de SEQ ID NOs: 7 a 10 ó 12, y que tiene actividad para transferir un glucósido a la posición 5 de un flavonoide.
Description
Genes que codifican proteínas con actividad de
transglicolación.
La presente invención se refiere a un gen que
codifica para una proteína que tiene actividad para transferir un
glucósido a la posición 5 de un flavonoide, y un procedimiento que
utiliza aquel gen.
La industria de las flores se esfuerza en
desarrollar nuevas variedades diversas. El cambio del color de una
flor es un modo para reproducir eficazmente una nueva variedad. Un
amplio rango de colores ha sido producido satisfactoriamente para
casi todas las variedades comerciales usando métodos de reproducción
clásicos. Con estos métodos, sin embargo, ya que hay restricciones
en el grupo génico para cada especie, es raro que una sola especie
proporcione un amplio rango de variedades coloreadas.
Los colores de las flores están basados en dos
tipos de pigmentos, a saber, flavonoides y carotenoides. Los
flavonoides contribuyen en la coloración de los tonos desde el
amarillo al rojo y azul, mientras que los carotenoides contribuyen
a la coloración de los tonos del naranja o amarillo. Las moléculas
flavonoides que principalmente contribuyen al color de las flores
son las antocianinas que son glucósidos de cianidina, delfinidina,
petunidina, peonidina, malvidina y pelargonidina y los diferentes
antocianos causan cambios notables del color de la flor. Además, el
color de las flores también está afectado por la coloración auxiliar
de flavonoides incoloros, la formación de complejos metálicos,
glucosilación, acilación, metilación y del pH vacuolar (Forkmann,
Plant Breeding, 106, 1, 1991).
La ruta de la biosíntesis de las antocianinas,
que comienza con la fenilalanina, ha sido bien explicada (por
ejemplo, Plant Cell, 7, 1071-1083,
1995), y casi todos los genes implicados en la biosíntesis han sido
clonados. Por ejemplo, entre aquellos genes que se piensan que están
implicados en la biosíntesis de malonilshisonin
(3-0-(6-0-(p-cumaloil)-\beta-D-glucosil)-5-0-(6-0-malonyl-\beta-D-glucosil)-cianidina),
que es una antocianina de perilla, aquellos genes para cuyos
homólogos aún no han sido publicados son sólo los genes de
flavonoide-3'-hidroxilasa,
UDP-glucosa:antocianina (flavonoide)
5-0-glucosil-transferasa
(abreviado como 5GT) y transferasa del grupo malonilo.
Entre estos, se sabe que la
flavonoide-3'-hidroxilasa pertenece
a la familia génica del citocromo P450 (Plant Cell,
7, 1071-1083, 1995), y los genes del
citocromo P450 se asume que muestran homología estructural.
El grupo de hidroxilo en la posición 3 de
moléculas flavonoides está modificado típicamente por la glucosa, y
generalmente la glucosilación y otras modificaciones con glucósidos,
según se piensa, aumentan la estabilidad y la solubilidad de las
antocianinas ("The Flavonoids", Chapman & Hall, 1994).
Los genes que codifican para la
UDP-glucosa:antocianidina o la
flavonoide-3-glucosil-transferasa
(abreviado como 3GT) que cataliza esta reacción son obtenidos a
partir de numerosas plantas tales como grano, cebada, dragones y
gencianas, y sus secuencias de aminoácidos muestran mutuamente una
homología significativa. Por ejemplo, la homología entre las
secuencias de aminoácidos de 3GT de grano monocotiledoneo y genciana
dicotiledonea es el 32%, que entre las secuencias de aminoácidos de
3GT de maíz monocotiledoneo y cebada monocotiledonea es el 73%, y
que entre las secuencias de aminoácidos de 3GT de genciana
dicotiledonea y berenjena dicotiledonea es el 46%.
Además, el gen que codifica para la
UDP-ramnosa:antocianidina
3-glucosidoramnosilo transferasa (3RT) de petunias
también ha sido clonado.
Sin embargo, aun cuando el grupo hidroxilo en la
posición 5 de los flavonoides de numerosas plantas esté glucosilado,
el gen para la enzima (5GT) que cataliza esta reacción aún tiene
que ser obtenido.
Además, aunque haya ejemplos para medir la
reacción por la cual el glucósido es transferido a la posición 5 de
petunias y reserva de antocianinas (Plant, 160,
341-347, 1984, Plant, 168,
586-591, 1986), estas publicaciones sólo describen
la investigación de propiedades enzimológicas usando extractos a
granel o productos parcialmente purificados de pétalos de flor, y
no hay ningún ejemplo de esta enzima que se purifique en su forma
pura. Además, dado que las glucosiltransferasas son típicamente
bioquímicamente inestables, la purificación de la enzima es
difícil.
difícil.
Aunque haya apenas algún caso en el cual el tono
en el color es cambiado por la adición del glucósido a una molécula
de flavonoide, dado que los grupos acilo aromáticos que tienen un
efecto significativo sobre el tono del color están unidos a una
molécula de glucosa o molécula de ramnosa dentro de una antocianina,
la regulación de la reacción de transferencia de glucósidos es
importante en términos de control de la biosíntesis de antocianina,
y en última instancia en el control del color de las flores. Además,
como un ejemplo del color de la flor que se cambia regulando la
expresión del gen de glucosiltransferasa, la reacción por 3RT de
petunia ha sido controlada en petunia transformada para modificar
el color de la flor.
Las especies de planta, que pueden ser
transformadas con un gen exógeno, incluyen, por ejemplo, rosas,
crisantemos, claveles, margaritas, petunias, torenia, campanillas,
calanchoes, tulipanes y gladiolas.
Los inventores de la presente invención, por lo
tanto, procuraron obtener un gen que codificaba para una proteína
que tenía actividad para transferir un glucósido a la posición 5 de
un flavonoide, conduciendo así al logro de la presente
invención.
Por ejemplo, el grupo hidroxilo de la posición 5
de las antocianinas de crisantemos y algunos de las antocianinas de
rosas y claveles no está glucosilado. La estructura de la
antocianina puede ser cambiada introduciendo el gen de 5GT obtenido
según la presente invención en estas plantas.
Además, aunque sea posible cambiar el color de
la flor y estabilizar los flavonoides por la acilación de
flavonoides usando el gen de transferasa del grupo acilo descrito
en la Publicación Internacional Nº WO96/25500, ya que el grupo
acilo no se une directamente al flavonoide, sino más bien se une por
vía de un azúcar, simplemente introduciendo un gen de la
transferasa del grupo acilo solo no es suficiente para cambiar el
color de la flor y hasta puede hacer que el flavonoide no se vuelva
estable.
Sin embargo, introduciendo el gen de 5GT en
combinación con un gen de transferasa del grupo acilo, el azúcar es
unido a la posición 5 del flavonoide permitiéndose así además que el
flavonoide sea acilado. Se puede esperar que esto cambie la
estructura de la antocianina y hacer que el color de la flor se
vuelva azulado.
Además, si la expresión del gen de 5GT de una
planta en la cual la posición 5 de antocianina está glucosilada es
suprimida con el método antisentido o el método de
co-supresión, etcétera, la transferencia del resto
de glucosa a la posición 5 puede ser inhibida. De tal modo que el
color de la flor puede ser cambiado. Por ejemplo, suprimiendo la
actividad de 5GT se puede esperar que, en genciana o campanilla, el
color de la flor se vuelve rojizo.
Los inventores de la presente invención aislaron
el cADN de 5GT de plantas de perilla, torenia, verbena y petunia
usando la tecnología de recombinación génica, y determinaron la
secuencia de nucleótidos del gen estructural. Es decir, los
inventores de la presente invención proporcionaron una secuencia de
ADN que codificaba para 5GT presente en el tejido que expresa
antocianinas en estas plantas. Además, ya que esta enzima transfiere
el glucósido a la posición 5 del pigmento de antocianina, éste
puede ser usado para cambiar el color de la flor y aumentar la
estabilidad de la antocianina.
En un aspecto, la invención se refiere a un
huésped que contiene un ADN exógeno como se define en las
reivindicaciones presentes, en el que el huésped es un
microgranismo procariota, eucariotica o una célula de planta. La
invención también se refiere a una planta que contiene un ADN
exógeno como se define en las reivindicaciones presentes o su
progenie o tejido teniendo dicho ADN.
El método del desplazamiento diferencial, por
ejemplo, puede ser usado para obtener el ADN que codifica para la
enzima de la presente invención. En perilla (Perilla
frutescens), por ejemplo, hay variedades que acumulan
antocianinas (por ejemplo, la forma roja) y otras que no lo hacen
(por ejemplo, la forma verde). Clonando el presente ADN en las
variedades que acumulan antocianinas, pero no presente en las
variedades que no lo hacen, es posible obtener el ADN que codifica
para la enzima de la presente invención.
Más específicamente, el ARN es extraído a partir
de las hojas de la forma roja y forma verde, y el cADN es
sintetizado conforme a métodos estándar. Esto entonces es separado
por electroforesis para aislar el cADN presente en la genoteca de
cADN de la forma roja, pero no presente en la genoteca de cADN de la
forma verde. Después, la genoteca del cADN de la forma roja es
rastreada usando el cADN resultante como una sonda para obtener el
cADN que codifica para la enzima de la presente invención.
Una vez el cADN que codifica para la enzima de
la presente invención es obtenido de la manera descrita
anteriormente, este cADN o su fragmento es usado como una sonda
para rastrear las genotecas de cADN de otras plantas. Por
consiguiente, el ADN que codifica para la enzima de la presente
invención puede ser obtenido a partir de aquellas plantas.
Como un ejemplo del rastreo, en la presente
invención, el ADN que codifica para la enzima de la presente
invención es clonada a partir de perilla por el método de expresión
diferencial (Ejemplo 1). Después, el ADN que codifica para la
enzima de la presente invención es obtenido a partir de verbena
rastreando los cADN de verbena (Verbena hebrida) usando el
ADN clonado del Ejemplo 1 como una sonda (Ejemplo 2). Además, el ADN
que codifica para la enzima de la presente invención es obtenido a
partir de torenia de la misma manera (Ejemplo 3).
Entonces, fue confirmado que las proteínas
codificadas en estos ADN tienen la actividad enzimática de la
presente invención.
Además, el ADN que codifica para la enzima de la
presente invención fue obtenido a partir de petunia (Ejemplo
4).
Los ejemplos de los ADN de la presente invención
incluyen a los que codifican para la secuencia de aminoácidos
descrita en cualquiera de las SEQ ID NOs: 7 a 10 ó 12. Sin embargo,
también se conocen proteínas que tienen una secuencia de
aminoácidos modificada por la adición y/o la deleción de uno o
varios aminoácidos y/o sustituciones por uno o varios otros
aminoácidos para mantener la actividad enzimática similar a la
proteína original. Así, los genes que codifican para una proteína
que tiene una secuencia de aminoácidos modificada por la adición
y/o las deleciones de uno o más aminoácidos y/o sustituciones por
uno o varios otros aminoácidos en relación con la secuencia de
aminoácidos descrita en cualquiera de SEQ ID NOs: 7 a 10 ó 12, cuya
proteína tiene una secuencia de aminoácidos que tiene una homología
del 60% o más con la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NOs: 7 a 10
ó 12 y que todavía mantiene la actividad de transferir un glucósido
a la posición 5 de un flavonoide, también pertenecen a la
presente
invención.
invención.
La presente invención también se refiere a un
gen que codifica para una proteína cuyo gen se hibrida a una
secuencia de nucleótidos que codifica para una secuencia de
aminoácidos que tiene una secuencia de aminoácidos que tiene una
homología del 60% o más con la secuencia de aminoácidos de SEQ ID
NOs: 7 a 10 ó 12 o a sus partes, en las condiciones de 5 x SSC, y
50ºC, y que tiene actividad de transferir un glucósido a la posición
5 de un flavonoide. Además, la temperatura de hibridación óptima
varía de acuerdo con la secuencia de nucleótidos y su longitud, y
es preferible que la temperatura de hibridación sea menor cuanto más
corta es la secuencia de nucleótidos. Por ejemplo, una temperatura
de 50ºC o menos es preferible en el caso de una secuencia de
nucleótidos (18 bases) que codifique para seis aminoácidos.
Aunque los ejemplos de genes seleccionados por
hibridación en esta manera incluyan los que son naturales, tales
como aquellos derivados a partir de plantas, cuyos ejemplos incluyen
un gen derivado de verbena y torenia, también pueden ser aquellos
derivados a partir de otras plantas, cuyos ejemplos incluyen
petunias, rosas, claveles y jacintos. Además, los genes
seleccionados por hibridación también pueden ser cADN o ADN
genómico.
Además, la presente invención también se refiere
a un gen que codifica para una proteína que tiene una secuencia de
aminoácidos que tiene una homología del 60% o más en relación con
una secuencia de aminoácidos de cualquiera de SEQ ID NOs: 7 a 10 ó
12, y que tiene actividad para transferir un glucósido a la posición
5 de un flavonoide. Es decir, como se indica en los Ejemplos, el
ADN que codifica para la enzima de la presente invención muestra
una homología del 20 al 30% en comparación con otros genes de
glucosiltransferasa. Así, la presente invención está incluida en el
grupo de genes que codifican para una proteína que tiene una
homología del 30% o más con una secuencia de aminoácidos descrita
en cualquiera de SEQ ID NOs: 7 a 10 ó 12, y que tiene actividad de
glucosiltransferasa.
Además, como está claro a partir de una
comparación de los resultados de los Ejemplos 1 a 4, la secuencia
de aminoácidos codificada por el ADN de la presente invención varía
de acuerdo con la especie, siendo la homología interespecies del
50% o más (véanse los Ejemplos 3 y 4), y por ejemplo del 60 al 70%
(véase el Ejemplo 2), mientras que la homología de las secuencias
de aminoácidos de las enzimas derivadas a partir de la misma especie
es del 90% o más (véase el Ejemplo 1). Así, el gen que codifica
para una proteína que tiene una secuencia de aminoácidos que tiene
una homología del 60% o más en relación con una secuencia de
aminoácidos descrita en cualquiera de SEQ ID NOs: 7 a 10 ó 12, y
que mantiene la actividad de glucosiltransferasa de la presente
invención están incluidos en la presente invención.
Como se describe detalladamente en los Ejemplos,
el ADN que tiene una secuencia de nucleótidos natal es obtenido,
por ejemplo, por el rastreo de una genoteca de cADN.
Además, el ADN que codifica para una enzima que
tiene una secuencia de aminoácidos modificada puede ser sintetizado
usando mutagénesis de sitio específico ordinaria y la PCR basada en
la secuencia de nucleótidos de un ADN natal. Por ejemplo, un
fragmento de ADN que contiene un sitio en el cual se desea que se
introduzca una modificación es obtenido por digestión de la enzima
de restricción partir del cADN o ADN genómico obtenido como se
describe anteriormente. Usando esto como una plantilla, son
realizadas la mutagénesis de sitio específico o PCR usando un
cebador que contiene la mutación deseada para obtener un fragmento
de ADN que contiene la modificación deseada. Esto entonces es
ligado al ADN que codifica para otra parte de la enzima
objetivo.
De forma alternativa, para obtener el ADN que
codifica para una enzima que tiene una secuencia de aminoácidos
acortada, por ejemplo, el ADN que codifica para una secuencia de
aminoácidos que es más larga que la secuencia de aminoácidos
objetivo, por ejemplo aquella que codifica para la secuencia de
aminoácidos entera, es digerida por una enzima de restricción
deseada, y en el caso de que el fragmento de ADN resultante no
codifique para la secuencia de aminoácidos objetivo entera, la
parte deficiente debería ser complementada ligando el ADN
sintético.
Además, expresando este clon usando un sistema
de expresión génico en E. coli o levadura y miendo la
actividad de la enzima, se puede confirmar que el gen resultante
codifica para la glucosiltransferasa, y clarificando la región de
traducción del gen de glucosiltransferasa que transfiere el
glucósido a la posición 5 de un flavonoide, es obtenido un gen que
codifica para la glucosiltransferasa reivindicado en la presente
invención. Además, expresando dicho gen, puede ser obtenida la
proteína transferasa objetivo que transfiere un glucósido a la
posición 5 de un flavonoide.
De forma alternativa, la proteína puede ser
obtenida usando el anticuerpo frente a una secuencia de aminoácidos
descrita en cualquiera de SEQ ID NOs: 7 a 10 ó 12.
Así, la presente invención también se refiere a
un vector recombinante que contiene el ADN anteriormente mencionado,
y más particularmente, a un vector de expresión y un huésped
transformado con el vector. Tanto procariotas como eucariotas
pueden ser usados para el huésped. Los ejemplos de los procariotas
que rutinariamente pueden ser usados para el huésped incluyen
bacterias, por ejemplo, del género Escherichia tal como
Escherichia coli, y del género Bacillus tal como
Bacillus subtilis.
Los ejemplos de los eucariotas que pueden ser
usados incluyen eucariotas inferiores tales como microorganismos
eucariotas incluyendo hongos tales como levadura o moho. Los
ejemplos de levadura incluyen el género Saccharomyces tal
como Saccharomyces cerevisiae, mientras que los ejemplos de
mohos incluyen el género Aspergillus tal como Aspergillus
oryzae y Aspergillus niger, así como el género
Penicillium. Además, también pueden ser usadas células de
animal o planta, incluyendo los ejemplos de células de animal
sistemas de células de ratón, hámster, mono y de ser humano.
Además, pueden ser usadas como huéspedes células de insecto tales
como las células del gusano de seda o gusanos de seda adultos por
sí mismos.
Los vectores de expresión de la presente
invención contienen una región del control de la expresión, tal como
un promotor, terminador o un origen de replicación, dependiendo del
tipo de huésped en el que deban ser introducidos. Los ejemplos de
promotores de los vectores de expresión bacterianos incluyen los
promotores usados de manera convencional, tales como el promotor
trc, el promotor tac y el promotor lac, mientras que los ejemplos de
promotores de levadura incluyen al promotor de gliceroaldehído
trifosfato deshidrogenasa y el promotor PH05. Los ejemplos de
promotores de moho incluyen la amilasa y trpC. Además, los ejemplos
de promotores para huéspedes de células de animal incluyen a
promotores virales tales como el promotor prematuro SV40 y el
promotor tardío
SV40.
SV40.
La preparación del vector de expresión puede ser
realizada conforme a métodos estándar usando la enzima de
restricción, ligasa, etcétera. Además, la transformación de un
huésped por un vector de expresión también puede ser realizado
conforme a métodos estándar.
En el procedimiento para producir la proteína
anteriormente mencionada, un huésped transformado con el vector de
expresión es cultivado, cruzado o reproducido, la proteína objetivo
puede ser recuperada y purificada a partir del cultivo resultante
conforme a métodos estándar, cuyos ejemplos incluyen filtración,
centrifugación, homogenación celular, cromatografía de filtración
de gel y cromatografía de intercambio iónico.
Además, aunque la presente memoria descriptiva
describa transferasas derivadas a partir de perilla, verbena,
torenia y petunia en las que las transferasas transfieren el
glucósido a la posición 5 de un flavonoide (que simplemente pueden
ser denominadas "glucosiltransferasa" en la presente
invención), un gen que codifica para dicha enzima puede ser
clonado, completamente o parcialmente cambiando el método de
purificación de dicha enzima para purificar una glucosiltransferasa
a partir de otra planta, y determinando la secuencia de aminoácidos
de dicha enzima. Además, usando el cADN de la glucosiltransferasa
derivada a partir de la perilla de la presente invención como una
sonda, el cADN de una glucosiltransferasa diferente fue capaz de ser
obtenido a partir de perilla, y el cADN de una glucosiltransferasa
diferente fue capaz de ser obtenido a partir de una planta
diferente. Así, pueden ser obtenidos otros genes de
glucosiltransferasa usando una parte o la totalidad de un gen de
glucosiltransferasa.
Además, como se indica en la presente memoria
descriptiva, purificando la glucosiltransferasa de perilla,
verbena, torenia y petunia para obtener el anticuerpo frente a dicha
enzima conforme a métodos estándar, el cADN o ADN cromosómico
producen la proteína que reacciona con aquel anticuerpo que puede
ser clonado. Así, la presente invención no está limitada sólo los
genes de glucosiltransferasas derivados a partir de perilla,
verbena, torenia y petunia, sino que también se refiere a la
glucosiltransferasa en el amplio sentido como se define en las
reivindicaciones.
Además, la presente invención también se refiere
a una planta, su progenie o su tejido para el cual el color ha sido
ajustado por la introducción del ADN de glucosiltransferasa como se
define en las reivindicaciones, y su forma puede ser las de flores
de corte también.
Además, la UDP-glucosa es un
ejemplo de un donor de glucósidos en la reacción de transferencia de
glucósidos del glucósido que incluye la antocianina en la presente
memoria descriptiva.
\vskip1.000000\baselineskip
Lo siguiente proporciona una explicación
detallada de la presente invención basada en los Ejemplos. A no ser
que se especifique de otra manera, el procedimiento experimental fue
realizado conforme a los métodos descritos en Molecular Cloning
(Cold Spring Harbor, 1989), "New Biochemistry Experimental
Manual" (Kagaku Dojin, 1996) y la Patente Internacional abierta
a consulta para el público Nº WO96/25500.
\newpage
Ejemplo
1
La perilla (Perilla frutescens) incluye a
las variedades que acumulan antocianinas en sus hojas (por ejemplo,
forma roja (Sakata-no-tane)), y las
variedades que no acumulan antocianinas (por ejemplo, forma azul
(Sakata-no-tane)). La estructura de
la antocianina principal, según se describe, es malonilshisonin
(3-0-(6-0-(p-cumaloil)-\beta-D-glucosil)-5-0-(6-0-malonil-\beta-D-glucosil)-cianidina)
(Agri. Biol. Chem., 53:197-198,
1989).
La expresión diferencial es un método publicado
en Science, 257, 967-971 (1992), y es
usado, por ejemplo, para obtener genes que son expresados
específicamente en tejido.
El ARN total fue extraído a partir de las hojas
de los dos tipos anteriormente mencionados de perilla por el método
del fenol en caliente ("Plant Molecular Biology Manual", Kluwer
Academic Publishers, 1994, págs. D5/1-13). El ARN
de Poly A+ fue purificado a partir del ARN total resultante usando
un kit separador de mARN (Clonetech). 0,9 \mug del ARN de poli A+
fueron retro-transcritos en 33 \mul de mezcla de
reacción usando un cebador de oligo-dT añadido un
ancla (GenHunter, H-T11G, H-TL11A y
H-T11C) para obtener cADN monocatenario. Usando
este cADN como una plantilla, fue realizada la PCR usando el mismo
cebador de oligo-dT añadido un ancla y cebadores
sintéticos (GenHunter, H-AP1 a 8) como
cebadores.
El volumen de la mezcla de la reacción de la PCR
era 20 \mul, y contenía 2 \mul de solución de cADN, 0,2 \muM
de cualquier cebador H-T11G, H-T11A
o H-T11C, 0,2 \muM de cualquier cebador de
H-AP1 por H-AP8, dNTP 0,12 \muM,
5 ó 10 \muCi de ^{32}P de dCTP, Tris-HCl 10 mM
(pH 9,0), KCl 50 mM, 0,01% de Triton X-100,
MgCl_{2} 1,25 mM y 1 unidad de polimerasa Taq. Las condiciones de
reacción comprendidas manteniendo la temperatura a 72ºC durante 20
segundos seguido por la repetición de la reacción en 40 ciclos con
un ciclo que comprende elevar la temperatura a 94ºC durante 30
segundos, bajarla a 40ºC durante 2 minutos y elevarla a 72ºC durante
30 segundos, y luego mantener la temperatura a 72ºC durante 5
minutos.
Los fragmentos de ADN amplificados de esta
manera fueron separados por la misma electroforesis de gel de
poliacrilamida que la usada para la secuenciación de ADN. Después
del secado del gel, el gel fue expuesto a la película de rayos X.
Entre las aproximadamente 2.600 bandas resultantes, había 36 bandas
observadas sólo en la forma roja como consecuencia de la
comparación de las dos variedades. Fueron cortadas del gel seco y
fueron eluidas en 100 \mul de agua. El ADN eluido fue precipitado
con etanol y fue disuelto en 20 \mul de agua. Usando una cantidad
mitad de cada ADN como plantilla, la reacción PCR fue realizada como
se describe anteriormente, y los fragmentos amplificados fueron
obtenidos para 33 de los fragmentos de ADN. El rastreo de la
genoteca y el análisis de inmunotrasferencia fueron realizados
entonces usando estos fragmentos de ADN.
El análisis de inmunotrasferencia fue realizado
de acuerdo con el método descrito más abajo usando los 33 tipos
anteriores de sondas de ADN. Después de la separación del ARN de
poli A+ derivado a partir de la forma roja y forma verde con el gel
de formamida que contenía agarosa del 1,2%, fue transferido el ARN
de poli A+ a una membrana de Nilón. Esta membrana fue hibridada con
las sondas de ADN anteriormente mencionadas marcadas con ^{32}P
de la noche a la mañana a 65ºC en presencia de 5 x SSPE, solución de
5 x Denhalt, 0,5% de SDS y 20 \mug/ml de ADN de esperma de salmón
desnaturalizado. La membrana hibridada fue lavada a 65ºC en 1 x
SSPE y solución de 0,1% de SDS y fue sometida a autoradiografía.
Como resultado, sólo cinco sondas fueron expresadas específicamente
en forma roja. Estos clones son predichos que son genes implicados
en la biosíntesis de antocianinas.
Una genoteca de cADN con \lambdagt10 como un
vector fue preparada usando el ARN de poli A+ obtenido a partir de
las hojas de la forma roja y \lambdagt10 del sistema de clonación
rápido completo (Amersham). Esta genoteca de cADN fue seleccionada
con los cinco fragmentos de ADN descritos anteriormente para obtener
el cADN correspondiente a cada fragmento. Entre estos, un clon
llamado 3R5 fue obtenido usando un fragmento de ADN obtenido por los
cebadores de H-T11A y H-AP3, y este
clon mostró una homología de aproximadamente el 26% en el nivel de
aminoácidos con la
flavonoid-3-0-glucosil-transferasa
de grano antes mencionada.
Además, los clones denominados 3R4 y 3R6 fueron
obtenidos por el rastreo de la genoteca usando las mismas sondas, y
estos mostraron un nivel extremadamente alto de homología con 3R5.
Se muestran las secuencias de nucleótidos completas y las
secuencias de aminoácidos deducidas de 3R4 y 3R6 en SEQ ID NO: 1 y
SEQ ID NO: 2 en el Listado de Secuencias, respectivamente. Además,
las secuencias de aminoácidos deducidas de las proteínas
codificadas por 3R4 y 3R6 mostraron una homología del 92%.
Un clon denominado 8R6 fue obtenido usando un
fragmento de ADN obtenido por los cebadores de
H-T11G y y H-AP8, y este clon no
mostró una homología significativa con ninguna secuencia publicada
hasta ahora. Se muestra esta secuencia en SEQ ID NO: 5 del Listado
de Secuencias. Aunque haya una gran posibilidad de que 8R6 sea un
gen implicado en la biosíntesis de antocianinas, ya que su
estructura carece de homología con los genes publicados hasta
ahora, se predice que un nuevo gen está implicado en la biosíntesis
de antocianina.
En consideración con la estructura de la
antocianina en perilla (la malonilshisonin antes mencionada), se
predice que este gen es una malonil-transferasa.
Para verificar esto, este gen debe ser expresado en levadura y
E. coli seguido por la reacción con antocianina y
malonil-CoA como sustratos. Tal experimento puede
ser llevado a cabo usando, por ejemplo, el método descrito en la
Publicación Internacional Nº WO96/25500. El gen de la
malonil-transferasa es útil en términos de modificar
artificialmente la estructura de la antocianina.
Un fragmento de ADN de aproximadamente 1,5
kilobytes obtenido despuntando el sitio BstXI dividido de p3R4
usando la ADN polimerasa T4 (Takara Shuzo) y luego recortando en el
sitio de división de BamHI en el adaptador, y un fragmento de ADN
de aproximadamente 8 kilobytes obtenido despuntando el extremo EcoRI
dividido de pYE22m y luego digiriendo con BamHI fueron ligados para
obtener un plásmido que fue denominado pY3R4.
Además, la cepa de E. coli JM109 que
tiene pYE22m fue llamada SBM335 de Escherichia coli, y fue
depositada en el "National Institute of Bioscience and
Human-Technology Agency of Industrial Science and
Technology" como FERM BP-5435. En pY3R4, el cADN
que codificaba para glucosiltransferasa fue ligado corriente abajo
del promotor para la gliceroaldehído trifosfato deshidrogenasa sola
del promotor de levadura constitutivo, y la transcripción es
controlada por este promotor.
Usando pY3R4, el G1315 de la levadura
Saccharomyces cerevisiae (Ashikari, et al., Appl.
Microbiol. Biotechnol., 30, 515-520,
1989) fue transformado de acuerdo con el método de Ito, et
al. (Ito, et al., J. Bacteriol., 153,
163-168, 1983). La levadura transformada fue
seleccionada de acuerdo con la recuperación de la capacidad de la
síntesis de triptófano. La cepa transformada resultante fue
cultivada durante 24 horas a 30ºC con agitación en 10 ml del medio
de Burkholder (Burkholder, Amer. J. Bot., 30,
206-210) conteniendo 1% de ácidos casaminos.
Para llevar a cabo un experimento de control, la
levadura que recuperó espontáneamente la capacidad de síntesis de
triptófano fue también cultivada de la misma manera. Después de
recuperar la levadura, las células fueron suspendidas en tampón de
suspensión (tampón fosfato 100 mM (pH 8,5), 0,1% (v/v) de
2-mercaptoetanol, APMSF 10 \muM y
UDP-glucosa 100 \muM) seguido de la adición de
perlas de vidrio (perlas de vidrio, 425-600 micras
lavadas al ácido, Sigma) y agitación vigorosa para machacar las
células. Las células machacadas entonces fueron centrifugadas
durante 20 minutos a 15.000 revoluciones por minuto y el
sobrenadante fue usado como una solución enzimática a granel para
la medida de la actividad de la enzima descrita más abajo.
Después de proporcionar 50 \mul de la mezcla
de reacción que contenían 20 \mul de solución enzimática a granel
(tampón fosfato 100 mM (pH 8,5),
cianidin-3-glucósido 670 \muM,
UDP-glucosa 1 mM) durante 10 minutos a 30ºC, 50
\mul de solución de acetonitrilo del 50% que contenía TFA del 0,1%
fue añadida para parar la reacción. El sobrenadante obtenido
centrifugando durante 5 minutos a 15.000 revoluciones por minuto fue
pasado por un filtro Samprep LCR4(T)-LC
(Millipore) para eliminar las impurezas. Esto entonces fue analizado
por cromatografía líquida de alta resolución (HPLC). El análisis
fue realizado usando una columna de fase inversa (Asahipak
ODP-50, 4,6 mm de diámetro x 250 mm, Showa Denko),
la fase móvil consistió en TFA/H_{2}O del 0,5% para la solución A
y TFA del 0,5%, CH_{3}CN del 50% para la solución B. El caudal era
0,6 ml/min y las fracciones fueron eluidas en un gradiente de B20%
\rightarrow B100% (20 minutos) seguido por el mantenimiento en
B100% durante 5 minutos.
20 \mul de la mezcla de reacción fueron usados
para el análisis. A_{520\ nm}, AUFS 0,5 (Shimadzu
SPD-10A) y un detector de serie de fotodiodo
(Shimadzu SPD-M6A) a una absorbancia de
600-250 nm fueron usados para la detección. En el
caso de la reacción de la solución enzimática a granel de levadura
que expresaba pY3R4, además del sustrato
cianidin-3-glucósido (tiempo de
retención: 17 minutos), un nuevo pico fue observado en el tiempo de
retención de 14,5 minutos. Ya que no fue observado en el caso de la
reacción de la solución enzimática a granel de levadura del
experimento de control, este nuevo pico, según se consideraba, fue
generado debido a la actividad de la proteína originada a partir de
pY3R4. Como consecuencia de la co-cromatografía con
cianidin-3,5-diglucósido, el tiempo
de retención de este pico coincidió con él de
cianidin-3,5-diglucósido, y sus
espectros de absorción fueron también idénticos entre sí. Basado en
estas observaciones, el cADN de 3R4 de perilla fue encontrado que
codificaba para 5GT.
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Ejemplo
2
Los pétalos fueron recogidos a partir de la
variedad Verbena Hanatemari violeta (Suntory) y fueron
molidos con un mortero y mano de mortero en nitrógeno líquido. El
ARN fue extraído a partir de los tejidos de base de acuerdo con un
método que usa tiocianato de guanidina/cloruro de cesio, y el ARN de
poli A+ fue obtenido por el método recomendado por el fabricante
usando Oligotex (Takara Shuzo). El método que usaba tiocianato de
guanidina/cloruro de cesio fue llevado a cabo conforme al método
descrito detalladamente en "Methods in Molecular Biology",
vol. 2 (Humana Press Inc., 1984) de R. McGookin y Robert J. Slater,
et al.
Usando el ARN de poli A+ resultante como
plantilla, fue sintetizado cADN bicatenario usando el kit de
síntesis de ZAP-cADN (Stratagene), después, una
genoteca de cADN fue preparada usando el kit de clonación
Uni-ZAP XR (Stratagene) de acuerdo con el método
recomendado por el fabricante.
La genoteca del fago \lambda obtenida como se
describe anteriormente fue rastreado de la manera siguiente usando
el cADN de p3R4 de perilla como una sonda. Los filtros fueron
mantenidos a 42ºC durante 1 hora en tampón de hibridación (5 x SSC,
formamida del 30%, tampón de fosfato de sodio 50 mM (pH 7,0), SDS
del 3%, reactivo de bloqueo del 2% (Boehringer), lauroilsarcosina
del 0,1%, 80 \mug/ml de ADN de esperma de salmón). El fragmento
de cADN de 5GT de perilla marcado con DIG, cADN de p3R4, fue añadido
a la solución de hibridación y los filtros fueron incubados durante
16 horas más.
Después del lavado de los filtros con la
solución lavadora (5 x SSC 50ºC, SDS del 1%), los clones positivos
marcados con fosfato
anti-DIG-alcalino fueron detectados
inmunológicamente usando
5-bromo-4-cloro-3-indolilfosfato
y sal de azul de nitrotetrazolio de acuerdo con el método descrito
por el fabricante (Boehringer).
Como resultado, fueron obtenidos siete clones
positivos. Estos cADN fueron excindidos en un plásmido pBluescript
SK usando el método recomendado por Stratagene. Cuando las
longitudes del cADN fueron investigadas por electroforesis en gel
de agarosa, fue observada una inserción de una longitud máxima de
2,0 kilobytes.
Los plásmidos fueron extraídos a partir de los
clones resultantes, y las secuencias de nucleótidos cerca de los
extremos 3' y 5' del cADN fueron determinadas de acuerdo con el
método de la secuencia didesoxi usando el reactivo fluorescente
como es recomendado por Perkin-Elmer con el
secuenciador de ABI 373A (Perkin-Elmer). Como
resultado, cinco de los siete clones tenían las mismas secuencias de
nucleótidos mutuamente aunque las longitudes del cADN fueran
diferentes. La secuencia de nucleótidos entera de pSHGT8 fue
determinada. La determinación de las secuencias de nucleótidos fue
realizada como se describe anteriormente por la utilización de el
kit de deleción de kilo-secuencias (Takara Shuzo)
para obtener una serie de clones de cADN delecionados, o usando un
oligocebador específico para la secuencia interna de pSHGT8.
El cADN insertado en pSHGT8 tenía una longitud
de 2062 bp, e incluía un marco de lectura abierto (ORF) que
consistía en 1386 bp de longitud (incluyendo un codon de
terminación). Se muestra esta secuencia en SEQ ID NO: 3. La
secuencia de aminoácidos de este ORF tenía una homología del 68% con
la secuencia de aminoácidos de 5GT de perilla codificada por p3R4,
y una homología del 64% con éste codificada por p3R6. Además,
también tenía una homología del 22 al 25% con los 3GT de plantas
monocotiledoneas y dicotiledoneas, y una homología del 21% con 3RT
de petunia.
Un fragmento de ADN de aproximadamente 2,0
kilobytes obtenido digiriendo pSHGT8 con BamHI/XhoI, y un fragmento
de ADN de aproximadamente 8 kilobytes obtenido digiriendo pYE22m con
BamHI/SalI fueron ligados, y el plásmido resultante fue denominado
pYHGT8. PYHGT8 fue expresado en células de levadura de la misma
manera que el Ejemplo 1, y fue medida la actividad enzimática de la
proteína codificada por pSHGT8. Como resultado, en la mezcla de
reacción que contenía la solución enzimática a granel de levadura
transformada con pYHGT8, un producto fue obtenido que coincidió con
cianidin-3,5-diglucósido tanto en el
tiempo de retención como en el espectro de la absorción. Basado en
esta observación, el cADN de pSHGT8 de Verbena fue
determinado para codificar para 5GT.
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo
3
Los pétalos fueron recogidos a partir de la
variedad de torenia "Summer Wave Blue" (Suntory) y fueron
molidos en un mortero y mano de mortero en nitrógeno líquido. El
ARN fue extraído a partir de los tejidos de tierra de acuerdo con
un método que usa tiocianato de guanidina/cloruro de cesio, y el ARN
de poli A+ fue obtenido por el método recomendado por el fabricante
usando Oligotex (Takara Shuzo). El método que usa tiocianato de
guanidina/cloruro de cesio fue llevado a cabo conforme al método
descrito detalladamente en "Methods in Molecular Biology",
vol. 2 (Humana Press Inc., 1984) de R. McGookin y Robert J. Slater,
et al.
Usando el ARN de poli A+ resultante como
plantilla, el cADN bicatenario fue sintetizado usando el kit de
síntesis de ZAP-cADN de Strategene, después, una
genoteca de cADN fue preparada usando el kit de clonación
Uni-ZAP XR (Stratagene) de acuerdo con el método
recomendado por el fabricante.
La genoteca del fago \lambda obtenida como se
describe anteriormente fue seleccionado de la misma manera que el
Ejemplo 2 usando el cADN de p3R4 de perilla como una sonda. Como
resultado, fueron obtenidos ocho clones positivos. Después de la
excisión del cADN en el plásmido pBluescript SK, las longitudes del
cADN fueron investigadas por electroforesis de gel de agarosa, lo
que reveló que la longitud máxima de inserción fue de 1,6
kilobytes.
Los plásmidos fueron extraídos a partir de los
clones resultantes, y las secuencias de nucleótidos cerca de ambos
extremos 5' y 3' fueron determinadas de la misma manera que el
Ejemplo 2. Como resultado, seis de los ocho clones, según se
consideraba, tenían mutuamente las mismas secuencias de nucleótidos
aunque las longitudes del cADN fueran diferentes. La secuencia de
nucleótidos entera del cADN de pSTGT5 fue determinada.
El cADN codificado en pSTGT5 fue de 1671 bp de
longitud, e incluyó un marco de lectura abierto (ORF) que consistía
en 1437 bp de longitud (incluyendo un codon de terminación). Se
muestra esta secuencia en SEQ ID NO: 4. La secuencia de aminoácidos
de este ORF tenía una homología del 58% con la secuencia de
aminoácidos de 5GT de perilla codificada por p3R4, y una homología
del 57% con esto codificada por p3R6, y, una homología del 57% con
esto codificada por pSHGT8 de Verbena. Además, también tenía
una homología del 19 al 23% con 3GT de plantas monocotiledoneas y
dicotiledoneas, y una homología del 20% con 3RT de petunia.
Un fragmento de ADN de aproximadamente 1,6
kilobytes obtenido digiriendo pSTGT5 con SmaI/KpnI, y un fragmento
de ADN de aproximadamente 8 kilobytes obtenido despuntando el sitio
de pYE22m digerido con EcoRI y luego digiriendo con KpnI fueron
ligados, y el plásmido resultante fue designado como pYTGT5. PYTGT5
fue expresado en células de levadura de la misma manera que el
Ejemplo 1, y fue medida la actividad enzimática de la proteína
codificada por pSTGT5. Como resultado, en la mezcla de reacción que
contiene la solución enzimática a granel de levadura transformada
con pYTGT5, un producto fue obtenido que coincidió con
cianidin-3,5-diglucósido tanto en el
tiempo de retención como en el espectro de absorción. Basado en
esta observación, el cADN de pSTGT5 de Torenia fue determinado que
codificaba para 5GT.
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo
4
Una genoteca de cADN fue preparada por el ARN
extraído a partir de los pétalos de petunia de la variedad "Old
Glory Blue" de la manera descrita detalladamente por T. Holton,
et al. (Plant Journal, 1993 4:
1003-1010).
La genoteca cADN fue rastreada de la misma
manera que el Ejemplo 2 usando la mezcla de los cADN de 5GT de
perilla, torenia y verbena obtenidos a partir de la manera descrita
anteriormente como sondas. Como resultado, fueron obtenidos cuatro
clones de cADN positivos y fueron excindidos en el plásmido
pBluescript SK. Las longitudes del cADN fueron investigadas por
electroforesis de gel de agarosa, un cADN de una longitud máxima de
2,0 kilobytes fue observado.
Los plásmidos fueron extraídos a partir de los
clones resultantes, y la secuencia de nucleótidos cerca del extremo
5' fue determinada de la misma manera que el Ejemplo 2. Como
resultado, dos de los cuatro clones, pSPGT1, parecían que
codificaban una secuencia de aminoácidos con un alto grado de
homología con aquellas de 5GT de perilla, torenia y verbena
obtenidas hasta entonces. Por lo tanto, la secuencia de nucleótidos
entera de pSPGT1 fue determinada.
El cADN de pSPGT1 tenía una longitud de 2015 bp,
e incluía un marco de lectura abierto (ORF) que consistía en 1407
bp (incluyendo un codon de terminación). Se muestra esta secuencia
en SEQ ID NO: 6. La secuencia de aminoácidos de este ORF tenía una
homología del 57% con la de 5GT codificada por p3R4 de perilla, una
homología del 54% con la codificada por p3R6, el 55% con la
codificada por pSHGT8 de verbena, y el 51% de la codificada por
pTGT5 de torenia. Además, también tenía una homología del 20 al 29%
con 3GT de plantas monocotiledoneas y dicotiledoneas, y una
homología del 20% con 3RT de petunia. Basado en esta observación, el
cADN de pSPGT1 obtenido a partir de petunia, según se consideraba,
codificaba para 5GT.
Como se ha descrito anteriormente, el cADN que
codificaba para las enzimas que transfieren un glucósido a la
posición 5 de un flavonoide que proviene en perilla, verbena,
torenia y petunia fueron clonados y sus secuencias de nucleótidos
fueron determinadas. Además, claramente se mostró que los cADN
aislados que codificaban para 5GT por la actividad enzimática de su
proteína expresada en la levadura. La introducción de estos cADN en
un vector de expresión de planta adecuado y la transferencia de los
constructos de expresión resultantes en una planta hace posible
proporcionar, aumentar o disminuir la actividad de 5GT en la planta
transformada, lo que conduce a la regulación del color de la flor.
Además, usando esta enzima, la estructura de las antocianas puede
ser cambiada o pueden ser sintetizadas antocianas más estables en
plantas o in vitro.
<110> Suntory Limited
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\vskip0.400000\baselineskip
<120> Genes que codifican proteínas que
tienen actividad de transglucosilación
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<130> GPS/FP5766662
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<151>
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<160> 12
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<170> PatentIn Ver. 2.1
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<210> 1
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<211> 1507
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<212> ADN
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<213> Perilla frutescens
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<220>
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<221> CDS
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<222> (17)..(1399)
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<400> 1
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<210> 2
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<211> 1474
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<212> ADN
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<213> Perilla frutescens
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<220>
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<221> CDS
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<222> (29)..(1360)
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<400> 2
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<210> 3
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 2062
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<212> ADN
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<213> Verbena hybrida
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<220>
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<221> CDS
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<222> (26)..(1411)
\newpage
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<400> 3
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<210> 4
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<211> 1671
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<212> ADN
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<213> Torenia hybrida
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<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> CDS
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<222> (45)..(1481)
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<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> Otras propiedades
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<222> (234)..(236)
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<223> Xaa (64) es Cys o Phe
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<220>
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<221> Otras propiedades
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (237)..(239)
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<223> Xaa (65) es Ser o Pro
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<400> 4
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<210> 5
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<211> 1437
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<212> ADN
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<213> Perilla frutescens
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<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> CDS
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<222> (294)..(1301)
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<400> 5
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<210> 6
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<211> 2105
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<212> ADN
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<213> Petunia hybrida
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<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> CDS
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<222> (341)..(1747)
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<400> 6
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<210> 7
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<211> 460
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<212> PRT
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<213> Perilla frutescens
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<400> 7
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<210> 8
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<211> 443
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<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Perilla frutescens
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<400> 8
\vskip1.000000\baselineskip
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\hskip1.2cm
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\vskip1.000000\baselineskip
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<210> 9
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<211> 461
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<212> PRT
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<213> Verbena hybrida
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<400> 9
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<210> 10
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<211> 478
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<212> PRT
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<213> Torenia hybrida
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<220>
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<221> SITIO
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<222> 64
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<223> Xaa (64) es Cya o Phe
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<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> SITIO
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<222> 65
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<223> Xaa (65) es Ser o Pro
\newpage
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<400> 10
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<210> 11
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<211> 335
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<212> PRT
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<213> Perilla frutescens
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<400> 11
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<210> 12
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<211> 468
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<212> PRT
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<213> Petunia hybrida
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<400> 12
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Claims (10)
1. El ADN que codifica para una proteína que
tiene una secuencia de aminoácidos que tiene una homología del 60%
o más con una secuencia de aminoácidos descrita en cualquiera de SEQ
ID NOs: 7 a 10 ó 12, y que tiene actividad para transferir un
glucósido a la posición 5 de un flavonoide.
2. El ADN como se expone en la reivindicación 1
que codifica para una proteína, en el que dicho gen puede ser
hibridado en las condiciones de 5 x SCC y 50ºC con todo o una parte
de una secuencia de nucleótidos que codifica para una secuencia de
aminoácidos descrita en cualquiera de SEQ ID NOs: 7 a 10 ó 12, y que
tiene actividad para transferir un glucósido en la posición 5 de un
flavonoide.
3. Un vector que contiene ADN como se expone en
la reivindicación 1 o la reivindicación 2.
4. Un huésped que contiene un ADN de vector como
se expone en la reivindicación 3, en el que dicho huésped es un
microorganismo procariota, eucariota o una célula de planta.
5. Un huésped que contiene un ADN exógeno como
se expone en la reivindicación 1 ó 2, en el que dicho huésped es un
microorganismo procariota, eucariota o una célula de planta, en el
que dicha planta es de una especie seleccionada a partir de: rosa,
crisantemo, clavel, margarita, campanilla, calanchoes, tulipán y
gladiolas.
6. Una proteína codificada por el ADN como se
expone en cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, cuya proteína
tiene una secuencia de aminoácidos que tiene una homología del 60% o
más con la secuencia de aminoácidos de cualquiera de SEQ ID NOs: 7
a 10.
7. Un procedimiento para producir una proteína
que comprende cultivar o reproducir un huésped como se expone en la
reivindicación 4 o la reivindicación 5, y recuperar una proteína que
tiene actividad para transferir un glucósido en la posición 5 de un
flavonoide a partir de dicho huésped.
8. Una planta que contiene un ADN del vector que
se expone en la reivindicación 3, o su progenie o tejido que tiene
dicho ADN.
9. Una planta que contiene un ADN exógeno como
se expone en cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, o su
progenie o tejido que tiene dicho ADN, en el que dicha planta es de
una especie seleccionada a partir de: rosa, crisantemo, clavel,
margarita, campanilla, calanchoes, tulipán y gladiolas.
10. Una flor de corte de la planta como se
expone en la reivindicación 8 o la reivindicación 9 o su progenie
que tiene dicho ADN.
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