ES2299536T3 - Inhibicion del crecimiento de celulas de leucemia mielogena cronica mediante oligodesoxi-nucleotidos antisentido liposomales dirigidos a crkl. - Google Patents
Inhibicion del crecimiento de celulas de leucemia mielogena cronica mediante oligodesoxi-nucleotidos antisentido liposomales dirigidos a crkl. Download PDFInfo
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Abstract
Composición que comprende una formulación liposomal de un polinucleótido que se hibrida a un polinucleótido que codifica Crkl, en la que el liposoma se prepara a partir de fosfolípidos neutros.
Description
Inhibición del crecimiento de células de
leucemia mielógena crónica mediante
oligodesoxi-nucleótidos antisentido liposomales
dirigidos a Crkl.
La presente invención se refiere al campo de la
terapia para el cáncer, específicamente, el tratamiento de la
leucemia mielógena crónica. Más particularmente, estos tratamientos
implican la utilización de oligonucleótidos antisentido y
formulaciones liposomales de los mismos.
La leucemia mielógena crónica (LMC) es un cáncer
hematológico en el que tiene lugar la proliferación incontrolada de
granulocitos. Se caracteriza frecuentemente por la translocación
recíproca de los cromosomas 9 y 22, que resitúa el protooncogen
Ableson (abl) en el extremo 3' de la región de fractura
("breakpoint cluster region") (bcr). Esto produce un
gen bcr-abl quimérico que codifica una
proteína de fusión p210 bcr-abl, que es
tumorigénica y es necesaria para el crecimiento de células de LMC
(Szczylik y otros, 1991; Skorski y otros, 1994; Tari y otros, 1994;
McGahon y otros, 1994; Bedi y otros, 1994).
La proteína bcr-abl se
puede autofosforilar en el aminoácido de tirosina 177 hallado en el
primer exón de bcr. Cuando se fosforila, el dominio de
bcr de la proteína bcr-abl se une al
dominio SH2 de la proteína adaptadora, proteína 2 unida al receptor
del factor de crecimiento (Grb2). A través del dominio SH3, Grb2 se
une al factor de intercambio GDP/GTP Hijo de Sevenless 1 humano
(hSosl) dando lugar a la activación de la proteína ras. La proteína
bcr-abl también puede transfosforilar el
aminoácido de tirosina 177 hallado en la proteína de bcr
normal. Se cree que cuando en la proteína de bcr normal se
transforma la tirosina fosforilada en el aminoácido 177, también se
formará complejo con Grb2. Cuando se expresa la proteína
bcr-abl, en las proteínas p46 y p52 Shc
(Puil y otros, 1994) también se transforma la tirosina fosforilada.
También se ha observado que estas proteínas Shc forman complejos
estables con Grb2. Por lo tanto, Grb2 parece jugar un papel muy
importante en la tumorigenicidad mediada por la proteína
bcr-abl (Puil y otros, 1994; Pendergast y
otros, 1993).
Se ha observado también que otra proteína
adaptadora, tipo Crk (Crkl), se une a
bcr-abl. A diferencia de Grb2, Crkl se une a
bcr-abl mediante el dominio abl. A
través del dominio de SH3, Crkl también se puede unir a hSosl, que
de nuevo conduce a la activación de la proteína Ras (Hoeve y otros,
1994a y 1994b). De este modo, a través de las proteínas adaptadoras
Grb2 y Crkl, la proteína bcr-abl queda unida
a la activación ras, que se sabe que conduce a la
tumorigénesis. Cuando se inhibe la expresión de la proteína
ras, también se inhibe la proliferación de células de LMC.
Por lo tanto, uno de los mecanismos principales en los que la
proteína bcr-abl induce a la proliferación de LMC es
mediante la activación de la proteína ras (Skorski y otros,
1994; 1995). Los oligonucleótidos antisentido liposomales dirigidos
a bcr-abl pueden reducir la proliferación de
células de LMC. Después de la inhibición máxima (75% de inhibición
del crecimiento y un 90% de inhibición de proteína), las células de
LMC aún se pueden recuperar y crecer si los oligonucleótidos
antisentido liposomales se extraen del medio de cultivo. Esto es
probablemente causado por la inhibición incompleta de la síntesis
de proteínas de bcr-abl (Tari y otros, 1994).
De este modo, a pesar de la capacidad de los oligonucleótidos
antisentido para inhibir la proliferación de células de LMC, existe
la necesidad de composiciones y tratamientos más efectivos contra
esta forma de cáncer.
La presente invención está diseñada para superar
las deficiencias de la técnica anterior dando a conocer
composiciones mejoradas y métodos para el tratamiento de LMC. En
particular, la presente invención utiliza oligonucleótidos
antisentido nuevos para dirigir ácidos nucleicos específicos en las
células de pacientes de LMC.
Por lo tanto, en una realización de la invención
se da a conocer un compuesto que comprende un polinucleótido que
hibridiza a un polinucleótido que codifica Grb2. En otra realización
se dispone un compuesto que comprende una formulación liposomal de
un polinucleótido que hibridiza a un polinucleótido que codifica
Crkl, en el que el liposoma es preparado a partir de fosfolípidos
neutros. Estos polinucleótidos pueden ser oligonucleótidos con una
longitud de 8-50 bases. El liposoma puede estar
compuesto ventajosamente del lípido dioleoilfosfatidilcolina. En
otra realización de la invención, el polinucleótido hibridiza para
el lugar de iniciación de traducción de mRNA de Grb2. En otra
realización, el polinucleótido hibridiza para el lugar de inicio de
traducción de mRNA de Crkl. En una realización específica de la
invención el polinucleótido es un oligonucleótido que tiene la
secuencia ATATTTGGCGATGGCTTC. En una realización específica, el
polinucleótido es un oligonucleótido que tiene la secuencia
GTCGAACCGGCGGAGGA.
En otra realización de la invención se prevé un
compuesto formado por un polinucleótido que hibridiza un
polinucleótido que codifica Grb2. En otra realización adicional, se
prevé un compuesto que comprende una formulación liposómica de un
polinucleótido que hibridiza para un polinucleótido que codifica
Crkl. El compuesto puede comprender además un polinucleótido que
hibridiza un polinucleótido que codifica
bcr-abl, en el que el liposoma es preparado
a partir de fosfolípidos neutros.
En otra realización de la invención, se da a
conocer un compuesto que comprende un constructo de expresión que
codifica un primer polinucleótido que hibridiza un polinucleótido
que codifica Grb2, en el que dicho primer polinucleótido se
encuentra bajo el control de un promotor que es activo en células
eucarióticas. De manera similar, en otra realización, se da a
conocer un compuesto que comprende una formulación liposomal de un
constructo de expresión que codifica un primer polinucleótido que
hibridiza un polinucleótido que codifica Crkl, en el que dicho
primer polinucleótido se encuentra bajo el control de un promotor
que es activo en células eucarióticas, en el que el liposoma es
preparado a partir de fosfolípidos neutros.
En otra realización adicional de la invención,
se da a conocer un método para inhibir la proliferación de una
célula cancerosa que comprende el establecer contacto con dicha
célula cancerosa con un compuesto que comprende como mínimo un
polinucleótido que hibridiza un ácido nucleico Grb2. De manera
similar, en otra realización, se da a conocer un método para la
inhibición de la proliferación de una célula cancerosa,
comprendiendo dicha célula cancerosa un compuesto que comprende
como mínimo una formulación liposomal de un polinucleótido que
hibridiza un ácido nucleico Crkl. En esta realización, los
polinucleótidos pueden ser oligonucleótidos que tienen una longitud
de 8-50 bases. El método puede comprender además el
contacto de la célula cancerosa con un compuesto que comprende un
polinucleótido que hibridiza un ácido nucleico
bcr-abl. El compuesto puede comprender
ambos: (i) un polinucleótido que hibridiza un ácido nucleico Grb2 o
(ii) un polinucleótido que hibridiza un ácido nucléico Crkl.
El método anterior se puede aplicar de forma
ventajosa a una célula cancerígena que es una célula de leucemia o,
más específicamente, una célula de leucemia mielogenosa crónica. La
composición puede comprender un liposoma en el que el
polinucleótido está encapsulado. En una realización específica, el
contacto tiene lugar en una paciente. El paciente puede ser un
humano. La composición se puede administrar de forma ventajosa a un
paciente humano en un volumen de 0,50-10,0 ml por
dosis o en una cantidad de 5-30 mg de polinucleótido
por m^{2}. En un régimen particular, la composición se administra
tres veces por semana durante ocho semanas.
Otros objetivos, características y ventajas de
la presente invención serán evidentes a partir de la siguiente
descripción detallada. Debería entenderse, sin embargo, que la
descripción detallada y los ejemplos específicos, a la vez que
indican las realizaciones preferentes de la presente invención, se
proporcionan sólo a modo de ilustración.
Los siguientes dibujos forman parte del presente
documento y se incluyen para demostrar adicionalmente ciertos
aspectos de la presente invención. La presente invención se puede
entender mejor mediante la referencia a uno o más de estos dibujos
combinados con la descripción detallada de realizaciones específicas
presentadas en la presente invención:
Figura 1: Efectos de oligonucleótidos
antisentido liposomales específicos para Grb2 en el crecimiento de
células leucémicas. Se incubaron células BV173, K562 y HL60 con
concentraciones crecientes de oligonucleótidos antisentido
liposomales específicos para Grb2. Después de tres días de
incubación, se realizó un ensayo alamarBlue para determinar los
efectos inhibidores de crecimiento de estos oligonucleótidos en las
células leucémicas. La viabilidad se expresó como el porcentaje de
células no tratadas, que se determinó mediante (absorbancia de
células tratadas /absorbancia de células no tratadas) x 100.
Figura 2: Efectos de oligonucleótidos
antisentido liposomales específicos para Crkl en el crecimiento de
células leucémicas. Se incubaron células BV173, K562 y HL60 con
concentraciones crecientes de oligonucleótidos antisentido
liposomales específicos para Crkl. Después de tres días de
incubación, se realizó un ensayo alamarBlue para determinar los
efectos inhibidores de crecimiento de estos oligonucleótidos en las
células leucémicas. La viabilidad se expresó como el porcentaje de
células no tratadas, que se determinó mediante (absorbancia de
células tratadas /absorbancia de células no tratadas) x 100.
Figura 3: Efectos de oligonucleótidos de
control liposomales específicos en el crecimiento de células
leucémicas. Se incubaron células BV173, K562 y HL60 con
concentraciones crecientes de oligonucleótidos de control
liposomales. Después de tres días de incubación, se realizó un
ensayo alamarBlue para determinar los efectos inhibidores de
crecimiento de estos oligonucleótidos en las células leucémicas. La
viabilidad se expresó como el porcentaje de células no tratadas,
que se determinó mediante (absorbancia de células tratadas
/absorbancia de células no tratadas) x 100.
Figura 4: Secuencias de ADNc y proteína de
GRB2. Se ilustran las secuencias flanqueantes 5' y 3' no
traducidas junto con la región codificante y la secuencia de
aminoácidos. Se indican los dominios SH2 (línea gruesa) y SH3
(línea delgada).
Figura 5: Secuencias de ADNc y proteína de
CRKL. Se ilustran las secuencias flanqueantes 5' y 3' no
traducidas junto con la región codificante y la secuencia de
aminoácidos. Se indican los dominios SH2, SH2', SH3 y SH4 mediante
subrayado.
La leucemia mieloide crónica, o LMC, es un
trastorno clonal en el que las células madre leucémicas producen
glóbulos rojos, neutrófilos, eosinófilos, basófilos,
monocito-macrófagos, plaquetas, células T y células
B. La translocación recíproca entre los cromosomas 9 y 22 da lugar
a un cromosoma 22 acortado, llamado cromosoma de Philadelphia
(Ph^{1}). A pesar de que hasta un 10% de casos de LMC se han
clasificado como Ph negativo, dichos casos se consideran ahora muy
raros.
Esta translocación genera un gen fusionado
bcr-abl, el producto del cual (p210) juega un papel
importante en la tumorigénesis. Esta proteína citoplasmática tiene
aproximadamente 1910 residuos de aminoácidos e incluye los exones 2
y 3 de bcr y el exón 2 de abl. A pesar de los
esfuerzos dirigidos en la inhibición de la síntesis de
bcr-abl utilizando construcciones antisentido, parece
que el fenotipo tumorigénico de células de Ph positivo vuelve
rápidamente después de los tratamientos.
La presente invención se refiere a
oligonucleótidos antisentido y polinucleótidos dirigidos a partes
del gen Crkl y su utilización en el tratamiento del cáncer. Se cree
que el producto génico Crkl interacciona con el producto
bcr-abl y, por lo tanto, participan en la
transformación de las células de LMC. La inhibición de la síntesis
de estas moléculas reduce el crecimiento de células tumorales. En
particular, se contempla que utilizando estas moléculas
antisentido, solas o conjuntamente con otras moléculas antisentido,
es posible tratar de forma efectiva la LMC, y posiblemente otros
cánceres. Se pueden utilizar los propios oligo- o polinucleótidos,
o vectores de expresión que los codifican. El método preferente de
administración de estos ácidos nucleicos es a través de liposomas.
La presente invención, en sus varias realizaciones, se describe con
mayor detalle a continuación.
\vskip1.000000\baselineskip
El término "antisentido" pretende referirse
a moléculas de polinucleótido complementarias a una parte de un ARN
de Crkl, o los ADNs correspondientes al mismo. Ver las figuras 4 y
5. Los polinucleótidos "complementarios" son aquéllos que son
capaces aparear las bases según las reglas estándar de
complementariedad de Watson-Crick. Es decir, las
purinas más grandes se aparearán en las bases con las pirimidinas
más pequeñas para formar combinaciones de guanina emparejada con
citosina (G:C) y adenina emparejada con timina (A:T) en el caso de
ADN, o adenina emparejada con uracilo (A:U) en el caso de ARN. La
inclusión de bases menos comunes, tales como inosina,
5-metilcitosina, 6-metiladenina,
hipoxantina y otras en secuencias de hibridación no interfieren con
el emparejamiento.
El marcaje de ADN de doble cadena (ds) con
polinucleótidos conduce a la formación de una triple hélice; el
marcaje ARN conducirá a la formación de una doble hélice. Los
polinucleótidos antisentido, cuando se introducen en una célula
diana, se unen específicamente a su polinucleótido diana e
interfieren con la transcripción, el procesamiento, el transporte,
la traducción y/o estabilidad del ARN. Las construcciones de ARN
antisentido, o ADN que codifica dichos ARNs antisentido; se pueden
utilizar para inhibir la transcripción o traducción de genes o
ambos en el interior de una célula huésped, in vitro o in
vivo, tal como en el interior de un animal huésped, incluyendo
un sujeto humano.
La concentración intracelular de catión
monovalente es aproximadamente 160 mM, (10 mM Na^{+}; 150 mM
K^{+}). La concentración intracelular de catión divalente es
aproximadamente 20 mM, (18 mM Mg^{++}; 2 mM Ca^{++}). La
concentración de proteína intracelular, que serviría para disminuir
el volumen de hibridación y, por lo tanto, aumenta la concentración
eficaz de muestras de ácidos nucleicos, es 150 mg/ml. Las
construcciones se pueden analizar in vitro en condiciones
que imitan estas condiciones in vivo.
Las construcciones antisentido se pueden diseñar
para unirse al promotor y otras regiones de control, exones,
intrones, o incluso zonas de límites entre
exón-intrón de un gen. Se contempla que las
construcciones antisentido más eficaces para la presente invención
incluirán regiones complementarias al sitio de inicio de ARNm. Se
pueden analizar fácilmente dichas construcciones simplemente
mediante las construcciones in vitro para determinar si
están afectados los niveles de la proteína diana. De forma similar,
la inhibición no específica perjudicial de la síntesis de proteína
también se puede medir determinando la viabilidad de la célula diana
in vitro.
Tal como se utiliza en la presente invención,
los términos "complementario" o "antisentido" significan
polinucleótidos que son sustancialmente complementarios sobre su
longitud completa y tienen muy pocos desajustes de bases. Por
ejemplo, las secuencias de quince bases de longitud se pueden
denominar como complementarias cuando tienen un nucleótido
complementario en trece o catorce nucleótidos de quince.
Naturalmente, las secuencias que son "completamente
complementarias" serán secuencias que son totalmente
complementarias a lo largo de su longitud y no tienen desajustes de
bases.
También se contemplan otras secuencias con
grados inferiores de homología. Por ejemplo, se podría diseñar una
construcción antisentido que tiene regiones limitadas de homología
elevada, pero que también contiene una región no homóloga (por
ejemplo, una ribozima). Estas moléculas, a pesar de tener menos de
un 50% de homología, se unirían a secuencias diana en las
condiciones apropiadas.
Los polinucleótidos según la presente invención
pueden codificar un gen Crkl o una parte de ese gen que es
suficiente para realizar la inhibición antisentido de la expresión
de proteínas. Los polinucleótidos se pueden derivar de ADN
genómico, es decir, clonado directamente del genoma de un organismo
particular. En otras realizaciones, sin embargo, los
polinucleótidos pueden ser ADN complementarios (ADNc). ADNc es ADN
preparado utilizando ARN mensajero (ARNm) como plantilla. De este
modo, un ADNc no contiene ninguna secuencia codificante interrumpida
y habitualmente contiene casi exclusivamente la región o regiones
codificantes para la correspondiente proteína. En otras
realizaciones, el polinucleótido antisentido se puede producir
sintéticamente.
Puede ser ventajoso combinar partes del ADN
genómico con ADNc o secuencias sintéticas para generar
construcciones específicas. Por ejemplo, cuando se desea un intrón
en la construcción final, se necesitará utilizar un clon genómico.
El ADNc o un polinucleótido sintetizado pueden proporcionar más
sitios de restricción conveniente para la parte restante de la
construcción y, por lo tanto, se utilizaría para el resto de la
secuencia.
El ADN y las secuencias de proteína para Grb2 y
Crkl están publicadas en la literatura por Lowenstein y otros
(1992) y ten Hoeve y otros (1993), respectivamente, ambas
incorporadas en la presente invención como referencia. Se prevé que
existen variantes naturales que tienen secuencias diferentes que las
descritas en la presente invención. De este modo, la presente
invención no está limitada a utilizar la secuencia de
polinucleótidos proporcionada para Crkl sino que, en cambio,
incluye la utilización de cualquier variante natural. Dependiendo
de la secuencia particular de dichas variantes, éstas pueden
proporcionar ventajas adicionales en términos de selectividad
diana, es decir, evitar la inhibición antisentido no deseada de
transcritos relacionados. La presente invención también abarca los
mutantes sintetizados químicamente de estas secuencias.
Tal como se afirmó anteriormente, aunque las
secuencias antisentido pueden ser copias genómicas o ADNc de
longitud completa (ver figuras 4 y 5), o amplios fragmentos de las
mismas, también pueden ser fragmentos más cortos, u
"oligonucleótidos" definidos en la presente invención como
polinucleótidos de 50 o menos bases. Aunque los oligómeros más
cortos (8-20) son más fáciles de fabricar y aumentar
la accesibilidad in vivo, otra gran cantidad de factores
están implicados en la determinación de la especificidad del
emparejamiento de bases. Por ejemplo, tanto la afinidad de unión
como la especificidad de unión de un oligonucleótido a su diana
complementaria aumentan con la longitud creciente. Se contempla que
se utilizarán oligonucleótidos de 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16,
17, 18, 19, 20, 25, 30, 35, 40, 45 ó 50 pares de bases. Aunque se
pueden utilizar toda o parte de la secuencia del gen en el contexto
de la construcción antisentido, estadísticamente, cualquier
secuencia de 17 bases de largo debería aparecer sólo una vez en el
genoma humano y, por lo tanto, suficiente para especificar una
única secuencia diana.
En ciertas realizaciones, se puede desear
utilizar construcciones antisentido que incluyen otros elementos,
por ejemplo, aquéllas que incluyen pirimidinas C-5.
Se ha observado que los oligonucleótidos que contienen análogos
propino C-5 de uridina y citidina se unen a ARN con
una afinidad elevada y son potentes inhibidores antisentido de la
expresión génica (Wagner y otros, 1993).
Como una alternativa a la administración
antisentido dirigida, se pueden utilizar ribozimas dirigidas. El
término "ribozima" se refiere a una enzima de base ARN capaz de
dirigir y dividir secuencias de bases particulares en el ADN y el
ARN. Las ribozimas pueden estar directamente dirigidas a células, en
forma de oligonucleótidos de ARN que incorporan secuencias de
ribozimas, o introducidas en la célula como un vector de expresión
que codifica el ARN ribozimal deseado. Las ribozimas se pueden
utilizar y aplicar en gran parte de la misma manera que se describe
para polinucleótido antisentido. Las secuencias de ribozimas también
se pueden modificar en gran parte de la misma manera que se
describe para polinucleótido antisentido. Por ejemplo, se podrían
incorporar bases que no son de Watson-Crick, o
fabricar oligonucleótidos de ARN/ADN mezclados, o modificar el
esqueleto de fosfodiéster, o modificar el
2'-hidroxi en el grupo de azúcar ribosa del ARN.
Alternativamente, los oligo- y polinucleótidos
antisentido según la presente invención se pueden proporcionar como
ARN mediante la transcripción a partir de las construcciones de
expresión que llevan ácidos nucleicos que codifican los oligo- y
polinucleótidos. A lo largo de esta solicitud, el término
"construcción de expresión" pretende incluir cualquier tipo de
construcción genética que contiene un ácido nucleico que codifica un
producto antisentido en el que parte o toda la secuencia de ácido
nucleico es capaz de ser transcrito. Entre los vectores de
expresión habituales se incluyen plásmidos bacterianos o fago, tales
como cualquiera de la serie de pUC o Bluescript^{TM} o, tal y
como se describe posteriormente, vectores víricos adaptados para la
utilización en células eucariotas.
En realizaciones preferentes, el ácido nucleico
codifica un oligo- o polionucleótido antisentido bajo el control
trnascripcional de un promotor. Un "promotor" se refiere a una
secuencia de ADN reconocida por la maquinaria sintética de la
célula, o maquinaria sintética introducida, requerida para iniciar
la transcripción específica de un gen. La frase "bajo control
transcripcional" significa que el promotor está en la posición y
la orientación correctas en relación al ácido nucleico para
controlar el inicio de la ARN polimerasa.
El término promotor se utilizará en la presente
invención para referirse a un grupo de módulos de control
transcripcional que están empaquetados alrededor del sitio de inicio
de la ARN polimerasa II. Muchas de las ideas de cómo se organizan
los promotores derivan de los análisis de varios promotores víricos,
incluyendo aquéllos para las unidades de transcripción temprana de
la HSV timidina quinasa (tk) y SV40. Estos estudios, aumentado por
trabajos más recientes, han mostrado que los promotores están
compuestos de módulos funcionales discretos, consistiendo cada uno
en aproximadamente 7-20 pb de ADN, y conteniendo uno
o más sitios de reconocimiento para las proteínas activadoras o
supresoras transcripcionales.
Como mínimo, un módulo de cada promotor actúa
para situar el sitio de inicio para la síntesis del ARN. El mejor
ejemplo conocido de este módulo es la caja TATA, pero en algunos
promotores falta una caja TATA, tal como el promotor para el gen de
la desoxinucleotidil transferasa terminal de mamífero y el promotor
para los genes de SV40 tardío, un elemento discreto que solapa el
propio sitio de inicio ayuda a fijar el lugar de inicio.
Los elementos promotores adicionales regulan la
frecuencia de inicio transcripcional. Habitualmente, éstos se
localizan en la región de 30-110 pb en dirección
ascendente del sitio de inicio, aunque recientemente se ha
observado que un conjunto de promotores contienen también elementos
funcionales en dirección descendente del sitio de inicio. El
espaciado entre los elementos promotores frecuentemente es flexible,
de manera que la función del promotor se conserva cuando los
elementos se invierten o se mueven entre sí. En el promotor tk, el
espaciado entre los elementos promotores se puede incrementar hasta
50 pb antes de que la actividad empiece a disminuir. Dependiendo
del promotor, parece que los elementos individuales pueden actuar de
forma cooperativa o independientemente para activar la
transcripción.
El promotor particular que se utiliza para
controlar la expresión de un ácido nucleico que codifica el péptido
inhibidor se cree que no es importante, siempre y cuando sea capaz
de expresar el péptido en la célula marcada. De este modo, cuando
una célula está marcada, es preferible situar el ácido nucleico que
codifica el péptido inhibidor de forma adyacente a y bajo el
control de un promotor que es activo en la célula humana. En
general, dicho promotor podría incluir un promotor humano o
vírico.
En varias realizaciones, se pueden utilizar el
promotor del gen inmediato temprano de citomegalovirus humano
(CMV), el promotor temprano de SV40 y la repetición larga terminal
del virus de sarcoma de Rous, para obtener una expresión de nivel
elevado de varias proteínas. También se contempla la utilización de
otros promotores víricos o celulares de mamíferos o bacterianos que
son bien conocidos en la técnica para conseguir la expresión de
péptidos según la presente invención, siempre y cuando los niveles
de expresión sean suficientes para un objetivo determinado.
Mediante la utilización de un promotor con
propiedades bien conocidas, se puede optimizar el nivel y patrón de
expresión de un oligo- o polinucleótidos antisentido. Además, la
selección de un promotor que se regula en respuesta a señales
fisiológicas específicas puede permitir la expresión inducible de
una proteína inhibidora. Por ejemplo, un ácido nucleico bajo el
control del promotor humano PAI-1 da lugar a una
expresión inducible por el factor de necrosis tumoral. Las Tablas 2
y 3 enumeran diferentes elementos/promotores que se pueden
utilizar, en el contexto de la presente invención, para regular la
expresión de las construcciones antisentido. Esta lista no pretende
ser exhaustiva de todos los posibles elementos implicados en la
inducción de la expresión, sino que simplemente son ejemplos de los
mismos.
Los potenciadores se detectaron originalmente
como elementos genéticos que incrementaban la transcripción a
partir de un promotor localizado en una posición distante en la
misma molécula de ADN. Esta capacidad de actuar sobre una distancia
amplia tenía un pequeño precedente en los estudios clásicos de
regulación transcripcional eucariota. El trabajo posterior mostró
que las regiones de ADN con actividad potenciadora se organizan como
los promotores. Es decir, están compuestas de muchos elementos
individuales, cada una unida a una o más proteínas
transcripcionales.
La diferencia básica entre los potenciadores y
los promotores es operacional. Una región potenciadora globalmente
debe ser capaz de estimular la transcripción a una distancia; esta
necesidad no es efectiva para una región de promotor o sus
elementos constituyentes. Por otro lado, un promotor debe tener uno
o más elementos que dirigen el inicio de la síntesis de ARN en un
sitio particular y en una orientación particular, mientras que los
potenciadores carecen de estas especificidades. Los promotores y
potenciadores se solapan y son contiguos frecuentemente, pareciendo
que tienen una organización modular similar.
A continuación se presenta una lista de
promotores víricos, potenciadores/promotores celulares y
potenciadores/promotores inducibles que se podrían utilizar
combinados con el ácido nucleico que codifica un péptido inhibidor
NF-IL6 en una construcción de expresión (Tabla 1 y
tabla 2). Adicionalmente, cualquier combinación de
promotor/potenciador (según la Base de Datos de Promotores
Eucariotas EPDB) también se podría utilizar para conducir la
expresión de un ácido nucleico según la presente invención. La
utilización de un sistema de expresión citoplásmica T3, T7 o SP6 es
otra posible realización. Las células eucariotas pueden soportar la
transcripción citoplásmica de ciertos promotores bacterianos si se
dispone de la polimerasa bacteriana adecuada, como parte del
complejo de administración o como una construcción de expresión
génica adicional.
En ciertas realizaciones de la invención, la
liberación de un ácido nucleico en una célula se puede identificar
in vitro o in vivo mediante la inclusión de un
marcador en la construcción de expresión. El marcador daría lugar a
un cambio identificable en la célula transfectada permitiendo la
fácil identificación de la expresión. Se pueden utilizar enzimas,
tales como la timidina quinasa (tk) del virus herpes simples
(eucariótica) o cloramfenicol acetiltransferasa (CAT)
(procariota).
También se puede incluir una señal de
poliadenilación para realizar la poliadenilación correcta del
transcrito. No se cree que la naturaleza de la señal de
poliadenilación sea crucial para la práctica satisfactoria de la
presente invención, y se puede utilizar cualquier secuencia. Por
ejemplo, se puede utilizar la señal de poliadenilación de SV40,
\beta-globina o adenovirus. También se contempla
como elemento del casete de expresión un terminador. Estos
elementos pueden servir para aumentar los niveles de mensaje y
minimizar la lectura a través del casete en otras secuencias.
En la presente invención, los oligo- y
polinucleótidos antisentido y vectores de expresión están atrapados
en un liposoma. Los liposomas son estructuras vesiculares
caracterizadas por una membrana en bicapa de fosfolípidos y un
medio acuoso interno. Los liposomas multilamelares tienen múltiples
capas lipídicas separadas por medio acuoso. Se forman
espontáneamente cuando los fosfolípidos se suspenden en exceso de
medio acuoso. Los componentes lipídicos experimentan una
autodistribución antes de la formación de estructuras cerradas y
atrapan agua y solutos disueltos entre las bicapas lipídicas (Ghosh
y Bachhawat, 1991). También se contemplan complejos catiónicos de
lípido-ácido nucleico, tales como complejos de lipofectamina-ácido
nucleico.
La liberación del polinucleótido mediada por
liposomas y la expresión de ADN foráneo in vitro ha sido muy
satisfactoria. Wong y otros (1980) demostraron la viabilidad de
liberación mediada por liposomas y la expresión de ADN foráneo en
células cultivadas de embriones de pollito, HeLa y hematomas.
Nicolau y otros (1987) llevaron a cabo la transferencia de genes
mediada por liposomas en ratas después de la inyección
intravenosa.
En ciertas realizaciones de la presente
invención, el liposoma se puede complejar con un virus
hemaglutinante (HVJ). Se ha observado que esto facilita la fusión
con la membrana celular y provoca la entrada en la célula del ADN
encapsulado en el liposoma (Kaneda y otros, 1989). En otras
realizaciones, el liposoma se puede complejar o utilizar
conjuntamente con las proteínas nucleares cromosómicas que no son
histonas (HMG-1) (Kato y otros, 1991). En
realizaciones adicionales, el liposoma se puede complejar o utilizar
conjuntamente con HVJ y HMG-1. Cuando dichos
vectores de expresión se utilizan de forma satisfactoria en la
transferencia y expresión de un polinucleótido in vitro e
in vivo, entonces son aplicables para la presente invención.
Cuando un promotor bacteriano se utiliza en la construcción de ADN,
también será deseable incluir en el interior del liposoma una
polimerasa bacteriana apropia-
da.
da.
"Liposoma" es un término genérico que
abarca una variedad de vehículos lipídicos únicos y multilamelares
formados por la generación de bicapas lipídicas cerradas. Los
fosfolípidos se utilizan para preparar los liposomas según la
presente invención y pueden llevar una carga positiva neta, una
carga negativa neta o ser neutros. Se pueden utilizar directamente
fosfatos para conferir una carga negativa en los liposomas, y se
puede utilizar estearilamina para conferir una carga positiva en
los liposomas.
Los lípidos adecuados para su utilización en la
presente invención se pueden obtener de fuentes comerciales. Por
ejemplo, el dimiristil fosfatidilcolina ("DMPC") se puede
obtener de Sigma Chemical Co., dicetil fosfato ("DCP") se
obtiene de K & K Laboratories (Plainview, N.Y.); colesterol
("Chol") se obtiene de Calbiochem-Behring;
dimiristil fosfatidilglicerol ("DMPG") y otros lípidos se
pueden obtener de Avanti Polar Lipids, Inc. (Birmingham, Ala.). Las
soluciones de reserva de lípidos en cloroformo, cloroformo/metanol o
t-butanol se pueden almacenar a, aproximadamente,
-20ºC. Preferiblemente, se utiliza cloroformo como el único
disolvente ya que se evapora más fácilmente que el metanol.
Los fosfolípidos de fuentes naturales, tales
como fosfatidilcolina de huevo o soja, ácido fosfatídico de cerebro,
fosfatidilinositol de cerebro o planta, cardiolipina de corazón y
fosfatidiletanolamina bacteriana o de planta, no se utilizan
preferiblemente como fosfátido primario, es decir, que constituyen
el 50% o más de la composición total de fosfátido, debido a la
inestabilidad y falta de estanqueidad de los liposomas
resultantes.
Los liposomas utilizados según la presente
invención se pueden fabricar mediante diferentes métodos. El tamaño
de los liposomas varía dependiendo del método de síntesis. Un
liposoma suspendido en solución acuosa está generalmente en forma
de una vesícula esférica, que tiene una o más capas concéntricas de
moléculas de bicapa lipídica. Cada capa consiste en un conjunto
paralelo de moléculas representadas por la fórmula XY, en la que X
es una parte hidrofílica e Y es una parte hidrofóbica. En una
suspensión acuosa, las capas concéntricas se disponen de manera que
las partes hidrofílicas tienden a permanecer en contacto con una
fase acuosa y las regiones hidrofílicas tienden a autoasociarse.
Por ejemplo, cuando las fases acuosas están presentes en el
interior y exterior del liposoma, las moléculas lipídicas formarán
una bicapa, conocida como lamela, de disposición
XY-YX.
Los liposomas dentro del alcance de la presente
invención se pueden preparar según técnicas de laboratorio
conocidas. En una realización preferente, los liposomas se preparan
mediante la mezcla de lípidos liposomales, en un disolvente en un
recipiente, por ejemplo, un vaso, un matraz en forma de pera. El
recipiente debería tener un volumen diez veces superior al volumen
de la suspensión esperada de liposomas. Utilizando un evaporador
rotatorio, se elimina el disolvente, aproximadamente, a 40ºC a
presión negativa. El disolvente se elimina normalmente en
aproximadamente de 5 minutos a 2 horas, dependiendo del volumen
deseado de los liposomas. La composición se puede secar
adicionalmente en un desecador de vacío. Los lípidos secados
generalmente de descartan después de aproximadamente 1 semana
debido a la tendencia a deteriorarse con el tiempo.
Los lípidos secados se pueden hidratar
aproximadamente a 25-50 mM de fosfolípido en agua
estéril, agua libre de pirógeno mediante agitación hasta la
resuspensión de la película de lípido. A continuación, los liposomas
acuosos se pueden separar en alícuotas, cada una colocada en un
vial, liofilizada y sellada al vacío.
Alternativamente, los liposomas se pueden
preparar según otros procedimientos de laboratorio conocidos: el
método de Bangham y otros (1965), el contenido del cual se incorpora
en la presente invención como referencia; el método de Gregoriadis,
tal como se describe en DRUG CARRIERS IN BIOLOGY AND MEDICINE,
G. Gregoriadis ed. (1979) páginas 287-341, el
contenido del cual se incorpora en la presente invención como
referencia; el método de Deamer y Ustet (1983), el contenido del
cual se incorpora en la presente invención como referencia; y el
método de evaporación de fase inversa tal como se describe por Szoka
y Papahadjopoulos (1978). Los métodos mencionados anteriormente se
diferencian con respecto al material acuoso atrapado y sus
proporciones de espacio con respecto a lípido.
Los lípidos secados o liposomas liofilizados
preparados según se ha descrito anteriormente se pueden reconstituir
en una solución de ácido nucleico y diluir hasta una concentración
adecuada con un disolvente adecuado, por ejemplo, DPBS. A
continuación, la mezcla se agita vigorosamente en un mezclador
vórtex. El ácido nucleico no encapsulado se elimina mediante
centrifugación a 29.000 x g y se lavaron los gránulos liposomales.
Los liposomas lavados se resuspenden a una concentración de
fosfolípido total adecuada, por ejemplo, aproximadamente
50-200 mM. La cantidad de ácido nucleico encapsulado
se puede determinar según métodos estándar. Después de la
determinación de la cantidad de ácido nucleico encapsulado en la
preparación de liposoma, los liposomas se pueden diluir hasta la
concentración apropiada y almacenar a 4ºC hasta su uso.
En una realización preferente, se utiliza el
lípido dioleoilfosfatidilcolina. Los oligonucleótidos resistentes a
nucleasa se mezclaron con lípidos en presencia de
t-butanol en exceso. La mezcla se centrifugó antes
de congelarse en baño de acetona/hielo seco. La mezcla congelada se
liofilizó e hidrató con un solución salina tamponada de Hepes
(Hepes 1 mM, NaCl 10 mM, pH 7,5) durante toda la noche y, a
continuación, los liposomas se sonicaron en un sonicador tipo baño
de 10 a 15 minutos. El tamaño de los oligonucleótidos liposomales
variaba habitualmente entre 200-300 nm de diámetro
mediante el medidor de partículas de submicras modelo 370
autodiluido (Nicomp, Santa Barbara, CA).
Retrovirus. Los retrovirus son un grupo
de virus de ARN de cadena única caracterizados por la capacidad en
convertir su ARN en ADN de cadena doble en células infectadas
mediante un proceso de transcripción inversa (Coffin, 1990). A
continuación, el ADN resultante se integra de forma estable en
cromosomas celulares como provirus y dirige la síntesis de
proteínas víricas. La integración da lugar a la retención de las
secuencias de genes víricos en la célula receptora y sus
descendientes. El genoma retroviral contiene tres genes - gag,
pol, y env - que codifican las proteínas de la cápside,
enzima polimerasa, y componentes de envoltura, respectivamente. Una
secuencia encontrada en dirección 5' del gen gag, denominada
ψ, actúa como señal para empaquetar el genoma en viriones.
Dos secuencias largas repetitivas terminales (LTR) se presentan en
los extremos 5' y 3' del genoma vírico. Éstos contienen secuencias
de promotor y potenciador fuertes y también se requieren para la
integración en el genoma de la célula huésped (Coffin, 1990).
Con el fin de construir un vector retroviral, un
ácido nucleico que codifica un Grb2 o Crkl, se inserta una
construcción antisentido en el genoma vírico en el lugar de ciertas
secuencias víricas para producir un virus que es defectuoso en la
replicación. Con el fin de producir viriones, se construye una línea
de células de empaquetamiento que contiene los genes gag,
pol y env pero sin los componentes LTR y \rightarrow
(Mann y otros, 1983). Cuando se introduce en esta línea celular
(mediante precipitación con fosfato cálcico, por ejemplo) un
plásmido recombinante que contiene un ADN insertado, junto con las
secuencias de LTR y \rightarrow retrovirales, la secuencia de
\rightarrow permite que el transcrito de ARN del plásmido
recombinante se empaquete en partículas víricas que, a
continuación, se secretan en el medio de cultivo (Nicolas y
Rubenstein, 1988; Temin, 1986; Mann y otros, 1983). A continuación,
se recoge el medio que contiene los retrovirus recombinantes,
opcionalmente concentrados, y utilizados para transferencia génica.
Los vectores retrovirales son capaces de infectar una gran variedad
de tipos de células. Sin embargo, la integración y la expresión
estable requieren la división de células huésped (Paskind y otros,
1975).
Adenovirus: Los adenovirus humanos son
virus de ADN de doble cadena de tumor con tamaños de genoma de
aproximadamente 36 kB (Tooze, 1981). Como sistema modelo para la
expresión de genes eucariotas, se han estudiado ampliamente los
adenovirus y se han caracterizado bien, lo que los hace un sistema
atractivo para el desarrollo de adenovirus como un sistema de
transferencia de genes. Este grupo de virus es fácil de desarrollar
y manipular, y muestran un amplio rango de huéspedes in
vitro e in vivo. En células infectadas líticamente, los
adenovirus son capaces de evitar la síntesis de proteínas huésped,
dirigiendo las maquinarias celulares para sintetizar grandes
cantidades de proteínas víricas, y producir cantidades abundantes de
virus.
La región E1 del genoma incluye E1A y E1B que
codifican proteínas responsables de la regulación de la
transcripción del genoma vírico, así como de ciertos genes
celulares. La expresión de E2, incluyendo E2A y E2B, permite la
síntesis de funciones víricas replicativas, por ejemplo proteína de
unión a ADN, ADN polimerasa, y una proteína terminal que ceba la
replicación. Los productos génicos de E3 evitan la citólisis
mediante células T citotóxicas y el factor de necrosis tumoral y
parece ser importante para la propagación vírica. Las funciones
asociadas con las proteínas E4 incluyen la replicación de ADN, la
expresión tardía del gen, y la desactivación de la célula huésped.
Los productos génicos tardíos incluyen la mayoría de las proteínas
cápsides del virión, y éstas se expresan sólo después de que tenga
lugar la mayoría del procesamiento de un transcrito primario único
a partir del promotor tardío principal. El promotor tardío principal
(MLP) muestra una eficacia elevada durante la fase tardía de la
infección (Stratford-Perricaudet y Perricaudet,
1991).
Como sólo una pequeña parte del genoma vírico
parece necesitarse in cis (Tooze, 1981), los vectores
derivados de adenovirus ofrecen un potencial excelente para la
sustitución de grandes fragmentos de ADN cuando se utilizan
conjuntamente con líneas celulares, tales como células 293. Se han
desarrollado líneas celulares de riñón embrionario humano
transformado con Ad5 (Graham y otros, 1977) para proporcionar las
proteínas víricas esenciales in trans.
Entre las ventajas particulares de un sistema de
adenovirus para la liberación de proteínas foráneas en una célula
incluyen (i) la capacidad de sustituir piezas relativamente grandes
de ADN vírico por ADN foráneo; (ii) la estabilidad estructural de
adenovirus recombinantes; (iii) la seguridad de administración
adenoviral a humanos; y (iv) la falta de cualquier asociación
conocida de infección adenoviral con cáncer o tumores; (v) la
capacidad de obtener títulos elevados del virus recombinante, y (vi)
la elevada infectividad del adenovirus.
Entre las ventajas adicionales de los vectores
de adenovirus se incluyen los niveles más elevados de expresión
génica. Adicionalmente, la replicación de adenovirus es
independiente de la replicación del gen huésped, a diferencia de
las secuencias retrovirales. Dado que los adenovirus transformantes
de los genes en la región E1 se pueden eliminar fácilmente y aún
proporcionar vectores de expresión eficaces, el riesgo oncogénico de
los vectores de adenovirus se cree que es negligible. (Grunhaus y
Horwitz, 1992).
En general, los sistemas de transferencia de
genes de adenovirus se basan en adenovirus diseñados recombinantes
que resultan incompetentes en la replicación mediante la eliminación
de una parte de su genoma, tal como El, y aún mantiene su
competencia para la infección. Las secuencias que codifican
proteínas foráneas relativamente grandes se pueden expresar cuando
las eliminaciones adicionales se realizan en el genoma del
adenovirus. Por ejemplo, los adenovirus eliminados en las regiones
E1 y E3 son capaces de transportar hasta 10 kB de ADN foráneo y se
pueden desarrollar hasta títulos elevados en células 293
(Stratford-Perricaudet y Perricaudet, 1991).
Sorprendentemente, se ha observado la expresión persistente de
transgenes que siguen a la infección adenoviral.
Otros vectores virales como construcciones de
expresión. Se pueden utilizar otros vectores virales como
construcciones de expresión en la presente invención. Se pueden
utilizar vectores derivados de virus, tales como virus vaccinia
(ridgeway, 1988; Baichwal y Sugden, 1986; Coupar y otros, 1988),
virus adeno-asociados (AAV) (Ridgeway, 1988;
Baichwal y Sugden, 1986; Hermonat y Muzycska, 1984) y virus herpes.
Ofrecen varias características atractivas para varias células de
mamíferos (Friedmann, 1989; Ridgeway, 1988; Balchwal y Sugden, 1986;
Coupar y otros, 1988; Horwich y otros, 1990).
Con el reciente reconocimiento de virus de
hepatitis B anormales, se ganó un nuevo entendimiento en la relación
estructura-función de diferentes secuencias
víricas. Los estudios in vitro mostraron que el virus podía
mantener la capacidad para el empaquetamiento dependiente de un
ayudante y la transcripción inversa a pesar de la eliminación de
hasta un 80% de su genoma (Horwich y otros, 1990). Esto sugirió que
grandes partes del genoma se podrían sustituir por material
genético foráneo. El hepatotropismo y la persistencia (integración)
eran propiedades particularmente atractivas para la transferencia
génica dirigida al hígado. Chang y otros recientemente introdujeron
el gen de cloramfenicol acetiltransferasa (CAT) en el genoma del
virus de la hepatitis B de pato en lugar de las secuencias
codificantes superficiales y presuperficiales de polimerasa. Se
cotransfectó con virus de tipo salvaje en una línea celular de
hematoma aviaria. Se utilizaron medios de cultivo que contenían
títulos elevados del virus recombinante para infectar hepatocitos
primarios de patito. La expresión génica de CAT estable se detectó
durante, como mínimo, 24 horas después de la transfección (Chang y
otros, 1991).
Métodos no víricos: Se contemplan también
en la presente invención varios métodos no víricos para la
transferencia de vectores de expresión en células cultivadas de
mamífero. Entre éstos se incluyen precipitación con fosfato cálcico
(Graham y VanDer Eb, 1973; Chen y Okayama, 1987; Rippe y otros,
1990), DEAE-dextrano (Gopal, 1985), electroporación
(Tur-Kaspa y otros, 1986; Potter y otros, 1984),
microinyección directa (Harland y Weintraub, 1985), liposomas
cargados de ADN (Nicolau y Sene, 1982; Fraley y otros, 1979) y
complejos de lipofectamina-ADN, sonicación celular
(Fechheimer y otros, 1987), bombardeo de genes utilizando
microproyectiles de alta velocidad (Yang y otros, 1990),
policationes (Boussif y otros, 1995) y transfección mediada por
receptor (Wu y Wu, 1987; Wu y Wu, 1988). Algunas de estas técnicas
se pueden adaptar de forma satisfactoria para su uso in vivo
o ex vivo.
En una realización de la presente invención, la
construcción de expresión puede consistir simplemente en un vector
recombinante desnudo. La transferencia de la construcción se puede
llevar a cabo mediante cualquier método mencionado anteriormente
que permeabiliza física o químicamente la membrana celular. Por
ejemplo, Dubensky y otros (1984) inyectaron satisfactoriamente ADN
de poliomavirus en forma de precipitados de CaPO^{4} en el hígado
y el bazo de ratones adultos y recién nacidos demostrando la
replicación vírica activa y la infección aguda. Benvenisty y Neshif
(1986) también demostraron que la inyección intraperitoneal directa
de plásmidos precipitados con CaPO^{4} da lugar a la expresión de
los genes transfectados. Se prevé que el ADN que codifica una
construcción de Grb2 o Crkl también se pueda transferir de una
manera similar in vivo.
Otra realización de la presente invención para
transferir un vector de expresión de ADN desnudo en células puede
implicar el bombardeo de partículas. Este método depende de la
capacidad de acelerar microproyectiles recubiertos de ADN a una
velocidad elevada permitiendo que penetren las membranas celulares y
entren en las células sin matarlas (Klein y otros, 1987). Se han
desarrollado varios dispositivos para acelerar partículas pequeñas.
Uno de dichos dispositivos depende de una descarga de voltaje
elevada para generar una corriente eléctrica que a su vez
proporciona la fuerza motriz (Yang y otros, 1990). Los
microproyectiles utilizados consistían en sustancias biológicamente
inertes, tales como bolas de tungsteno u oro.
Se han bombardeado in vivo órganos
seleccionados que incluyen el hígado, la piel, el tejido muscular de
ratas y ratones (Yang y otros, 1990; Zelenin y otros, 1991). Esto
puede requerir la exposición quirúrgica del tejido o células, para
eliminar cualquier tejido que intervenga entre la pistola y el
órgano diana. El ADN que codifica una construcción de Grb2 o Crkl
se puede administrar mediante este método.
\vskip1.000000\baselineskip
Cuando se lleve a cabo la aplicación clínica de
liposomas que contienen oligo- o polinucleótidos antisentido o
vectores de expresión, será necesario preparar el complejo de
liposoma como una composición farmacéutica apropiada para la
aplicación deseada. Generalmente, esto comprenderá preparar una
composición farmacéutica que está esencialmente libre de pirógenos,
así como cualquier otra impureza que podría ser perjudicial para
humanos o animales. También se puede desear generalmente utilizar
tampones adecuados para hacer que el complejo sea estable y permite
la captación por las células diana.
Las composiciones acuosas de la presente
invención comprenden una cantidad eficaz del vector de expresión
antisentido encapsulado en un liposoma tal como se ha descrito
anteriormente, dispersado adicionalmente en un portador
farmacéuticamente aceptable o medio acuoso. A dichas composiciones
también se les hace referencia como inocula. Las frases
"farmacéuticamente o farmacológicamente aceptables" se refieren
a composiciones que no producen una reacción adversa, alérgica o
desfavorable cuando se administra a un animal, o un humano, según
sea apropiado.
Tal como se utiliza en la presente invención,
"portador farmacéuticamente aceptable" incluye cualquier y
todos los disolventes, medios de dispersión, recubrimientos,
agentes antibacterianos y antifúngicos, agentes isotónicos y
retardantes de la absorción y similares. La utilización de dichos
medios y agentes para sustancias farmacéuticas activas es bien
conocida en la técnica. Excepto en la medida de que cualquier medio
o agente convencional sea incompatible con el ingrediente activo,
se contempla su utilización en las composiciones terapéuticas.
También se pueden incorporar en las composiciones ingredientes
activos complementarios.
Las soluciones de las composiciones terapéuticas
se pueden preparar en agua mezclada de forma adecuada con un
tensoactivo, tal como hidroxipropilcelulosa. Las dispersiones
también se pueden preparar en glicerol, polietilenglicoles
líquidos, mezclas de los mismos y en aceites. En condiciones
habituales de almacenamiento y uso, estas preparaciones contienen
un conservante para evitar el crecimiento de microorganismos.
Las composiciones terapéuticas de la presente
invención se administran de forma ventajosa en forma de
composiciones inyectables como soluciones líquidas o suspensiones;
también se pueden preparar formas sólidas adecuadas para la
solución o suspensión en líquido antes de la inyección. Estas
preparaciones también se pueden emulsionar. Una composición
habitual para dicho objetivo comprende un portador farmacéuticamente
aceptable. Por ejemplo, la composición puede contener 10 mg, 25 mg,
50 mg o hasta, aproximadamente, 100 mg de albúmina de suero humano
por mililitro de solución salina tamponada de fosfato. Entre otros
portadores farmacéuticamente aceptables se incluyen soluciones
acuosas, excipientes no tóxicos, incluyendo sales, conservantes,
tampones y similares.
Entre los ejemplos de disolventes no acuosos
están propilenglicol, polietilenglicol, aceite vegetal y ésteres
orgánicos inyectables, tal como etiloleato. Entre los portadores
acuosos se incluyen agua, soluciones alcohólicas/acuosas,
soluciones salinas, vehículos parenterales, tales como cloruro
sódico, dextrosa de Ringer, etc. Entre los vehículos intravenosos
se incluyen fluidos y rellenador de nutrientes. Entre los
conservantes se incluyen agentes antimicrobianos, antioxidantes,
agentes quelantes y gases inertes. El pH y la concentración exacta
de los diversos componentes de la composición farmacéutica se
ajustan según parámetros bien conocidos.
Las formulaciones adicionales son adecuadas para
la administración oral. Entre las formulaciones orales se incluyen
dichos excipientes habituales tales como, por ejemplo, grados
farmacéuticos de manitol, lactosa, almidón, estearato magnésico,
sacarina sódica, celulosa, carbonato magnésico y similares. Las
composiciones toman la forma de soluciones, suspensiones,
comprimidos, pastillas, cápsulas, formulaciones de liberación
controlada o polvos. Cuando la vía de administración es tópica, la
forma puede ser una crema, pomada, ungüento o pulverizador.
Las composiciones terapéuticas de la presente
invención pueden incluir preparaciones farmacéuticas clásicas. La
administración de composiciones terapéuticas según la presente
invención será mediante cualquier vía habitual siempre y cuando el
tejido diana esté disponible mediante esa vía. Esto incluye
administración oral, nasal, bucal, rectal, vaginal o tópica. La
administración tópica sería particularmente ventajosa para el
tratamiento de cánceres de piel para evitar la alopecia inducida
por la quimioterapia u otro trastorno dérmico hidroproliferativo.
Alternativamente, la administración será mediante inyección
ortotópica, intradérmica, subcutánea, intramuscular,
intraperitoneal o intravenosa. Dichas composiciones se
administrarían normalmente como composiciones farmacéuticamente
aceptables que incluyen portadores fisiológicamente aceptables,
tampones u otros excipientes. Para el tratamiento de enfermedades
de los pulmones, la vía preferente es la administración mediante
aerosol al pulmón. El volumen del aerosol está entre
aproximadamente 0,01 ml y 0,5 ml. De forma similar, una vía
preferente para el tratamiento de una enfermedad asociada con el
colon sería vía enema. El volumen del enema está entre
aproximadamente 1 ml y 100 ml.
Una cantidad eficaz de la composición
terapéutica se determina en base del objetivo pretendido. El término
"dosis unitaria" o "dosificación" se refiere a unidades
físicamente discretas adecuadas para su uso en un sujeto,
conteniendo cada unidad una cantidad predeterminada de la
composición terapéutica calculada para producir las respuestas
deseadas descritas anteriormente, junto con su administración, es
decir, la vía apropiada y la pauta de tratamiento. La cantidad a
administrar, en cuanto al número de tratamientos y las dosis
unitarias, depende de la protección deseada.
Las cantidades precisas de la composición
terapéutica también dependen del criterio del profesional y son
características de cada individuo. Entre los factores que afectan a
la dosis se incluyen el estado físico y clínico del paciente, la
vía de administración, el objetivo pretendido del tratamiento
(alivio de síntomas frente a la curación) y la potencia,
estabilidad y toxicidad de la sustancia terapéutica particular. Para
la presente solicitud, se prevé que la cantidad de composición
terapéutica comprenda una dosis unitaria que variará
aproximadamente en 5-30 mg de polinucleótido.
Habitualmente, los pacientes que son candidatos
para el tratamiento son aquéllos en la fase crónica de LMC. Se
diagnosticaron aproximadamente 7000 nuevos pacientes por año con
LMC, y la duración media de la fase crónica de la enfermedad es de
cinco años. El curso habitual del tratamiento se proporcionará en
ciclos de ocho semanas, aunque se puede utilizar una duración más
larga si no se observan efectos adversos con el paciente, y se
pueden proporcionar términos más cortos de tratamientos si el
paciente no tolera el tratamiento tal como se esperaba. Cada ciclo
consistirá de entre 20 y 35 dosis individuales equidistantes en el
tiempo, aunque esto también puede variar dependiendo de la
situación clínica.
Los p-etoxi oligonucleótidos
resistentes a nucleasa se adquirieron en Oligos Etc. (Willsonville,
OR). La longitud de los oligonucleótidos varía entre 16 y 18 bases.
Las secuencias de los oligonucleótidos, de 5' a 3', son tal como se
indica:
\vskip1.000000\baselineskip
1. Oligonucleótido antisentido que dirige el
sitio de inicio de la traducción de Grb2: ATATTTGGCGATGGCTTC
2. Oligonucleótido antisentido que dirige el
sitio de inicio de la traducción de Crkl: GTCGAACCGGCGGAGGA
3. Oligos de control: GAAGGGCTTCTGCGTC
\vskip1.000000\baselineskip
El lípido, dioleoilfosfatidilcoína, se adquirió
de Avanti Polar Lipids, Inc (Alabaster AL). Los oligonucleótidos
resistentes a nucleasa se mezclaron con lípidos en presencia de un
exceso de t-butanol. La mezcla se centrifugó antes
de ser congelada en un baño de acetona/hielo seco. La mezcla
congelada se liofilizó e hidrató con solución salina tamponada con
Hepes (Hepes 1 mM, NaCl 10 mM, pH 7,5) durante toda la noche y, a
continuación, los liposomas se sonicaron en un sonicador tipo baño
de 10 a 15 minutos. El tamaño de los oligonucleótidos liposomales
variaba habitualmente entre 200-300 nm de diámetro
mediante el medidor de partículas de submicras modelo 370
autodiluido (Nicomp, Santa Barbara, CA).
Las líneas celulares de LMC, BV173 y K562 se
utilizaron para analizar la capacidad de los oligonucleótidos para
inhibir el crecimiento celular. Estas líneas celulares se obtuvieron
originalmente de pacientes de LMC en "crisis blast". Ambas
líneas celulares expresan la proteína de fusión p210
^{Bcr-Abl}. Las células HL60, que se obtuvieron
originalmente de un paciente promielocítico humano, se utilizaron
como control ya que estas células no producen
bcr-ab, y su proliferación es independiente
del mecanismo de señalización de ras.
Cinco mil células K562, diez mil células BV173,
o diez mil células HL60 se sembraron por pocillo en una placa de 96
pocillos en 0,1 ml de medio RPMI 1640 que contenía suero de ternera
fetal al 10%. Después de 2 horas de siembra, las concentraciones
finales de 0-10 \muM de oligonucleótidos
liposomales se añadieron a estas células. Las células se incubaron
con oligonucleótidos liposomales durante 3 días. Los efectos de los
oligonucleótidos liposomales en la proliferación de las células
leucémicas se analizaron mediante el ensayo de alamarBlue (Alamar,
Sacramento, CA).
El alamarBlue es un colorante indicador de
oxidación/reducción en el que la absorbancia está relacionada con
la reducción metabólica celular. Por lo tanto, es una medida del
número de células y la actividad metabólica de las células. Después
de la incubación con oligonucleótidos liposomales, se añadieron 50
\mul de alícuotas de células/pocillo a 130 \mul de medio.
Veinte \mul de colorante alamarBlue se añadieron a cada pocillo.
Después de la incubación durante 6-8 horas a 37ºC,
las placas se leyeron directamente en un lector de microplacas
(Molecular Devices, Menlo Park, CA) a 570 y 595 nm. La diferencia en
la absorbancia entre 570 y 595 nm se tomó como el valor de
absorbancia global de las células leucémicas. Las viabilidades de
células tratadas con oligonucleótidos liposomales se compararon con
las de las células no tratadas.
Los oligonucleótidos antisentido liposomales
específicos para Grb2 pueden inhibir la proliferación de células
leucémicas de manera dependiente de la dosis. Cuando se utilizaron
concentraciones de 5-7 \muM de oligonucleótidos
antisentido liposomales específicos para Grb2 (figura 1), las
viabilidades de las líneas celulares de LMC, BV173 y K562 fueron de
un 10-60% de las de células no tratadas. En otras
palabras, se indujo el 40-90% de la inhibición del
crecimiento en células de LMC. En condiciones idénticas, no se
redujeron las viabilidades celulares de células HL60. De hecho, las
viabilidades de células HL60 no se redujeron hasta utilizar
concentraciones de 8-10 \muM.
Ejemplo 4
comparativo
El ensayo se realizó tal como se describe en el
ejemplo 5. Los oligonucleótidos antisentido liposomales específicos
para Crkl pueden inhibir la proliferación de células leucémicas de
manera dependiente de la dosis. Cuando se utilizaron
concentraciones de 5-8 \muM de oligonucleótidos
antisentido liposomales específicos para Crkl (figura 2), las
viabilidades de las células BV173 fueron de un
10-40% de las de células no tratadas. Cuando se
utilizaron concentraciones de 8-9 \muM de
oligonucleótidos antisentido liposomales, las viabilidades de las
células K562 fueron de un 10-40% de las de células
no tratadas. Las viabilidades de células HL60 no se redujeron hasta
un 40%, excepto cuando se utilizaron concentraciones de 10 \muM de
oligonucleótidos antisentido liposomales.
Los oligonucleótidos de control liposomales que
no se hibridan a secuencias de Grb2 o Crkl no inhiben la
proliferación de células de LMC excepto a concentraciones elevadas.
Las viabilidades de las células BV173 se redujeron en un 50% cuando
se utilizaron concentraciones de 8 \muM o superior de oligos de
control liposomales. Las viabilidades de células K562 y HL60 no se
redujeron excepto a concentraciones de 10 \muM.
Las siguientes referencias proporcionan ejemplos
de procedimientos u otros detalles complementarios a los expuestos
en la presente invención.
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(1) INFORMACIÓN GENERAL:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- SOLICITANTE:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- NOMBRE: Board of Regents, The University of Texas System
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- CALLE: 201 W. 7th Street
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- CIUDAD: Austin
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- ESTADO: Tejas
\vskip0.500000\baselineskip
- (E)
- PAÍS: E.E.U.U.
\vskip0.500000\baselineskip
- (F)
- CÓDIGO POSTAL: 78701
\vskip0.500000\baselineskip
- (G)
- TELÉFONO: (512) 418-3000
\vskip0.500000\baselineskip
- (H)
- TELEFAX: (512) 474-7577
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TÍTULO DE LA INVENCIÓN: INHIBICIÓN DEL CRECIMIENTO DE CÉLULAS DE LEUCEMIA MIELÓGENA CRÓNICA MEDIANTE OLIGODESOXI-NUCLEÓTIDOS ANTISENTIDO LIPOSOMALES DIRIGIDOS A Grb2 O Crk1
\vskip0.800000\baselineskip
- (iii)
- NÚMERO DE SECUENCIAS: 7
\vskip0.800000\baselineskip
- (iv)
- FORMA LEGIBLE POR ORDENADOR:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- TIPO MEDIO: disquete
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- ORDENADOR: compatible con IBM PC
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- SISTEMA OPERATIVO: PC-DOS/MS-DOS
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- SOFTWARE: PatentIn Release #1.0, Version #1.30 (EPO)
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC. ID NO: 1:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 1109 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- HEBRA: única
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ix)
- CARACTERÍSTICAS:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- NOMBRE/CLAVE: CDS
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- LOCALIZACIÓN: 79..729
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC. ID NO: 1:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN DE LA SEC. ID NO: 2:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 217 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: proteína
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC. ID NO: 2:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN DE LA SEC. ID NO: 3:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 1881 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- HEBRA: única
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ix)
- CARACTERÍSTICAS:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- NOMBRE/CLAVE: CDS
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- LOCALIZACIÓN: 510..1418
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC. ID NO: 3:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN DE LA SEC. ID NO: 5:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 303 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: proteína
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID NO: 4:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN DE LA SEC. ID NO: 5:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 18 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- HEBRA: única
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC. ID NO: 5:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipATATTTGGCG ATGGCTTC
\hfill18
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN DE LA SEC. ID NO: 6:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 17 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- HEBRA: única
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC. ID NO: 6:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipGTCGAACCGG CGGAGGA
\hfill17
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN DE LA SEC. ID NO: 7:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 16 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- HEBRA: única
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC. ID NO: 7:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipGAAGGGCTTC TGCGTC
\hfill16
Claims (16)
1. Composición que comprende una formulación
liposomal de un polinucleótido que se hibrida a un polinucleótido
que codifica Crkl, en la que el liposoma se prepara a partir de
fosfolípidos neutros.
2. Composición, según la reivindicación 1, en la
que dicho polinucleótido es un oligonucleótido que tiene una
longitud de 8-50 bases.
3. Composición, según la reivindicación 1, en la
que el polinucleótido es un oligonucleótido que tiene la secuencia
GTCGAACCGGCGGAGGA (SEC ID No: 6).
4. Composición, según la reivindicación 1, en la
que dicho liposoma comprende el lípido dioleoilfosfatidilcolina.
5. Composición que comprende una formulación
liposomal de (i) un polinucleótido que se hibrida a un
polinucleótido que codifica Crkl y (ii) un polinucleótido que se
hibrida a un polinucleótido de codificación
bcr-abl, en la que el liposoma se prepara a
partir de fosfolípidos neutros.
6. Composición, según cualquiera de las
reivindicaciones anteriores, en la que el polinucleótido se hibrida
al sitio de inicio de la traducción de un polinucleótido de
codificación Crkl.
7. Composición que comprende una formulación
liposomal de una construcción de expresión que codifica un primer
polinucleótido que se hibrida al sitio de inicio de la traducción de
un polinucleótido que codifica Crkl, en la que dicho primer
polinucleótido está bajo el control de un promotor que es activo en
células eucariotas, en la que el liposoma se prepara a partir de
fosfolípidos neutros.
8. Composición, según cualquiera de las
reivindicaciones anteriores, para su utilización en un método para
inhibir la proliferación de una célula cancerígena in vitro
que comprende poner en contacto dicha célula cancerígena con dicha
composición.
9. Composición, según la reivindicación 8, en la
que dicha célula cancerígena es una célula de leucemia.
10. Composición, según la reivindicación 9, en
la que dicha célula cancerígena es una célula de leucemia mielógena
crónica.
11. Composición, según cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 10, para su utilización en un método para
inhibir la proliferación de una célula cancerígena que comprende
poner en contacto dicha célula cancerígena con dicha
composición.
12. Composición, según la reivindicación 11, en
la que dicha composición se formula para entrar en contacto con un
paciente.
13. Composición, según la reivindicación 12, en
la que dicho paciente es un humano.
14. Composición, según la reivindicación 13, en
la que dicha composición se administra a dicho humano en un volumen
de 0,50-10,0 ml por dosis.
15. Composición, según la reivindicación 13, en
la que dicha composición se administra a dicho humano en una
cantidad de 5-30 mg de polinucleótido por
m^{2}.
16. Composición, según la reivindicación 13, en
la que dicha composición se administra tres veces por semana
durante ocho semanas.
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