ES2268705T3 - Inhibidor del crecimiento de celulas leucemicas que contienen un derivado oligonucleotidico antisentido frente al gen del tumor de wiloms (wt1). - Google Patents

Inhibidor del crecimiento de celulas leucemicas que contienen un derivado oligonucleotidico antisentido frente al gen del tumor de wiloms (wt1). Download PDF

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Abstract

UN INHIBIDOR DEL CRECIMIENTO DE CELULAS LEUCEMICAS QUE CONTIENE DERIVADOS DE OLIGONUCLEOTIDOS ANTISENTIDO CONTRA EL GEN DEL TUMOR DE WILM (WT1).

Description

Inhibidor del crecimiento de células leucémicas que contiene un derivado oligonucleotídico antisentido frente al gen del tumor de Wilms (WT1).
Campo técnico
La presente invención se refiere a un inhibidor del crecimiento para células de leucemia, que comprende un derivado nucleotídico antisentido.
Técnica anterior
El tumor de Wilms es un tumor de riñón pediátrico que ocurre como resultado de la desactivación de ambos alelos del gen del tumor de Wilms (WT1) ubicado en el cromosoma 11p13 (Call, K.M., et al., Cell 60: 509, 1990). Una secuencia de WT1 en dirección 5', no codificante (C.E. Campbell, et al., Oncogene 9: 583-595, 1994) y una región codificante que incluye el intrón (D.A. Haber, et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 88: 9618-9622, 1991) han sido dadas a conocer previamente, y es de suponer que estén implicadas en el crecimiento y la diferenciación del tumor y demás (D.A. Haber, et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 88: 9618-9622, 1991).
Pritchard-Jones et al en Human Molecular Genetics, Vol 3, 1994, p.1633-1637 sugieren que el gen WT1 está implicado en la regulación de la diferenciación hematopoyética y en la leucemogénesis. Rothenpieler en The Journal of The American Society of Nephrology, vol 5, 1994, página 635 describe oligonucleótidos antisentido dirigidos contra WT1. Phelan et al en Cell Growth & Differentiation, vol 5, Junio 1994, páginas 667-686 indican que el mRNA de WT1 es regulado a la baja en células K562 durante cierta inducción estudiada de diferenciación eritroide y megacariocítica, indicando que esta regulación a la baja no es un fenómeno generalizado de inhibición del crecimiento. Sugieren experimentos antisentido y sentido para estudiar el papel de la proteína WT1 en la diferenciación de células K562.
Descripción de la invención
La presente invención proporciona un inhibidor del crecimiento para células de leucemia que comprende un oligonucleótido antisentido que se dirigen contra el gen del tumor de Wilms (WT1), según se define en las reivindicaciones anejas.
Breve descripción de los dibujos
Fig. 1 es una gráfica que indica los efectos inhibidores del oligonucleótido sobre el crecimiento de la línea celular de leucemia K562.
Fig. 2 es una gráfica que indica la relación entre las concentraciones de oligonucleótidos SE3 y AS3 y el crecimiento de la línea celular de leucemia K562.
Fig. 3 es una gráfica que indica la relación entre las concentraciones de oligonucleótidos SE4 y AS4 y el crecimiento de la línea celular de leucemia K562.
Fig. 4 es una gráfica que indica los efectos en función del tiempo de los oligonucleótidos SE3 y AS3 sobre el crecimiento de la línea celular de leucemia K562.
Fig. 5 es una gráfica que indica los efectos de diversos oligonucleótidos sobre el crecimiento de la línea celular de leucemia K562.
Fig. 6 es una gráfica que indica los efectos inhibidores de diversos oligonucleótidos sobre el crecimiento de la línea celular de leucemia HEL positiva para la expresión de WT1.
Fig. 7 es una gráfica que indica los efectos inhibidores de diversos oligonucleótidos sobre el crecimiento de la línea celular de leucemia THP-1 positiva para la expresión de WT1.
Fig. 8 es una gráfica que indica los efectos inhibidores de diversos oligonucleótidos sobre el crecimiento de la línea celular de linfoma maligno U937 negativa para la expresión de WT1.
Fig. 9 es una gráfica que indica los efectos de los oligonucleótidos SE3 y AS3 sobre la formación de colonias de células de leucemia a partir de células mononucleares de médula ósea obtenidas a partir de pacientes leucémicos.
Fig. 10 es una gráfica que indica los efectos de los oligonucleótidos SE3 y AS3 sobre la formación de colonias de macrófagos granulocíticos a partir de células mononucleares de médula ósea obtenidas a partir de voluntarios sanos.
Fig. 11, el panel A es una fotografía de los resultados de la electroforesis que indica una disminución en el nivel de la proteína WT1 en células en el caso de añadir diversos oligonucleótidos antisentido que se dirigen contra WT1 a un cultivo de células K562; el panel B indica una disminución en el nivel de proteína WT1 en las células en el caso de añadir oligonucleótidos antisentido que se dirigen contra WT1 a células de leucemia recién obtenidas de un paciente con AML.
Descripción detallada de la invención
La presente invención proporciona un inhibidor del crecimiento de células de leucemia, que comprende un oligonucleótido antisentido que se dirigen contra WT1. Los oligonucleótidos antisentido usados en la presente invención son oligonucleótidos antisentido que se dirige contra WT1, ejemplos de los cuales incluyen uno dirigido contra el sitio caperuza de inicio de la transcripción de WT1, uno dirigido contra la región de inicio de la traducción, uno dirigido contra un exón o un dirigido contra un intrón.
Por ejemplo, una secuencia nucleotídica de una cadena de DNA sentido de la región que contiene el sitio caperuza de inicio de la transcripción de WT1 se representa por SEQ ID Nº: 9. Además, una secuencia nucleotídica de una cadena de DNA sentido de los exones 1 a 10 de la región codificante de WT1 se representa por la SEQ ID NO: 10 a 19. La presente invención hace uso de un oligonucleótido antisentido que se dirige contra tal secuencia nucleotídica de la cadena de ADN sentido de WT1. Este oligonucleótido antisentido es un oligonucleótido antisentido que comprende 9 a 30 nucleótidos de cadena de DNA o RNA antisentido para WT1.
Ejemplos de oligonucleótidos antisentido que se dirigen contra el sitio caperuza de inicio de la transcripción incluyen los que tienen las siguientes secuencias de nucleótidos: 5'-AGGGTCGAATGCGGTGGG-3' (SEQ ID Nº: 2) y 5'-TCAAATAAGAGGGGCCGG-3' (SEQ ID Nº: 4). Además, ejemplos de oligonucleótidos antisentido que se dirigen contra la región de inicio de la traducción incluyen oligonucleótidos antisentido que se dirigen contra el codón ATG de iniciación de la traducción y su región en 5' y/o en 3' tal como la secuencia nucleotídica siguiente: 5'-GTCGGAGCC
CATTTGCTG-3' (SEQ ID Nº: 6).
Además, hay diez exones contenidos en la región codificante de WT1 y los ejemplos de los oligonucleótidos antisentido incluyen los que se dirigen contra las secuencias contenidas en cualquiera de estos exones, los que se dirigen contra las secuencias que se extienden a lo largo de dos exones consecutivos cualesquiera después de la maduración por corte y empalme, o los que se dirigen a las secuencias que se extienden a lo largo de un intrón y un exón consecutivos, y los que se extienden a secuencias de todos los intrones y las regiones no codificantes en 3' y 5'. Un ejemplo de un oligonucleótido antisentido de la presente invención es el que se dirige al 6º exón, uno de cuyos ejemplos es el que se dirige a la siguiente secuencia de nucleótidos: 5'-CGTTGTGTGGTTATCGCT-3' (SEQ ID NO: 8).
Además, se incluyen aquellos oligonucleótidos similares a ribozimas con la función de escindir la cadena de DNA o la cadena de RNA para WT1.
La estructura del oligonucleótido antisentido usado en la presente invención es la indicada en la fórmula química 1, donde X puede ser independientemente un oxígeno (O), un azufre (O), un grupo alquilo inferior, amina primaria o amina secundaria. Y puede ser independientemente oxígeno (O) o azufre (S). Z es un átomo de hidrógeno o un grupo hidroxilo. B se elige entre adenina, guanina, timina o citosina cuando Z es un átomo de hidrógeno, o se elige entre adenina, guanina, uracilo o citosina cuando Z es un grupo hidroxilo, y principalmente es un oligonucleótido complementario al DNA o mRNA codificante de WT1. R es, independientemente, un átomo de hidrógeno, un grupo dimetoxitritilo o un grupo alquilo inferior. N es un número entero de 7-28.
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(Fórmula pasa a página siguiente)
1
Fórmula química 1
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Ejemplos preferibles de oligonucleótidos antisentido incluyen no sólo los oligonucleótidos antisentido no modificados, sino también los oligonucleótidos antisentido modificados. Ejemplos de estas formas modificadas incluyen formas alquil inferior fosfonato, como la forma metilfosfonato o la forma etilfosfonato mencionada anteriormente, y otras formas fosforotioato o fosforoamidato (véase la fórmula química 2).
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(Fórmula pasa a página siguiente)
2
Fórmula química 2
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Estos oligonucleótidos antisentido se pueden obtener de acuerdo con los siguientes métodos convencionales.
Los oligonucleótidos antisentido en que X e Y en la fórmula química 1 son 0 y Z es un átomo de hidrógeno o grupo hidroxilo son sintetizados fácilmente por un sintetizador de DNA disponible en el mercado (por ejemplo, el fabricado por Applied Biosystems).
El oligodesoxirribonucleótido antisentido en el que Z es un átomo de hidrógeno se puede obtener por un método tal como síntesis en fase sólida usando fosforoamidito o síntesis en fase sólida usando hidrógeno fosfonato.
Véase, por ejemplo, T. Atkinson y M. Smith en Oligonucleotide Synthesis: A Practical Approach, ed. M.J. Gait, IRL Press, 35-81 (1984); M.H. Caruthers, Science, 230, 281 (1985); A. Kume, M. Fujii, M. Sekine and M. Hata, J. Org. Chem., 49, 2139 (1984); B.C. Froehler y M. Matteucci, Tetrahedron Lett., 27, 469 (1986); P.J. Garegg, I. Lindh, T. Regberg, J. Stawinski, R. Stromberg y C. Henrichson, ibid., 27, 4051 (1986); B.S. Sproat y M.J. Gait en Oligonucleotide Synthesis: A Practical Approach, ed. M.J. Gait, IRL Press, 83-115 (1984); S.L. Beaucage y M.H. Caruthers, Tetrahedron Lett., 22, 1859-1862 (1981); M.D. Matteucci y M.H. Caruthers, Tetrahedron Lett., 21, 719-722 (1980); y, M.D. Matteucci y M.H. Caruthers, J. Am. Chem. Soc., 103, 3185-3191 (1981).
Las formas modificadas con triéster fosfato, en las que X es un grupo alcoxi inferior, se pueden obtener por métodos ordinarios, tales como tratamiento de un oligonucleótido obtenido por síntesis química con una solución de cloruro de tosilo en DMF, metanol y 2,6-lutidina (Moody H.M., et al., Nucleic Acids Res., 17, 4769-4782 (1989).
Las formas modificadas con alquilfosfonato, en que X es un grupo alquilo, se pueden obtener por métodos convencionales, utilizando, por ejemplo, fosfoamidito (M.A. Dorman, et al., Tetrahedron, 40, 95-102 (1984); y, K.L. Agarwal y F. Riftina, Nucleic Acids Res., 6, 3009-3024 (1979)).
Las formas modificadas con fosforotioato en las que Z es S se pueden obtener por métodos convencionales como la síntesis en fase sólida (C.A. Stein, et al., Nucleic Acids Res., 16, 3209-3221 (1988) o la síntesis en fase sólida utilizando disulfuro de tetraetiltiolam (H. Vu y B.L. Hirschbein, Tetrahedron Letters, 32, 3005-3008 (1991)).
Las formas modificadas con fosforoditioato en las que X e Y son ambos S se pueden obtener, por ejemplo, por síntesis en fase sólida convirtiendo el bis-amidito en tioamidito y dejando actuar el azufre sobre el tioamidito (W.K.D. Brill, et al., J. Am. Chem. Soc., 111, 2321-2322 (1989)).
Las formas modificadas con fosforoamidato en que X es una amina primaria o amina secundaria se pueden obtener, por ejemplo, por síntesis en fase sólida, tratando el hidrógeno fosfonato con una amina primaria o secundaria (B. Froehler, et al., Nucleic Acids Res., 16, 4831-4839 (1988)), u oxidando el amidito con hidroperóxido de terc-butilo (H. Ozaki, et al., Tetrahedron Lett., 30, 5899-5902 (1989)).
Aunque la síntesis del oligorribonucleótido antisentido en el que Z es un grupo hidroxilo es extremadamente difícil en comparación con la síntesis del oligodesoxirribonucleótido antisentido ya que debe protegerse el grupo 2'-hidroxilo de la ribosa (azúcar), puede sintetizarse eligiendo adecuadamente el grupo protector y el método de fosforilación (véase, Basic Microbiology Course, Vol. 8, Genetic Engineering, E. Ohtsuka, K. Miura, ed. T. Ando y K. Sakaguchi, Oct. 10, 1987, Kyoritsu Publishing Co., Ltd.).
La purificación y la confirmación de la pureza se pueden llevar a cabo por cromatografía de líquidos de alta eficacia y electroforesis en gel de poliacrilamida. La confirmación del peso molecular se puede realizar por espectrometría de masas con ionización por electropulverización, o por espectrometría de masas con bombardeo de átomos rápidos.
El oligonucleótido antisentido de la presente invención actúa en cualquier estadio desde DNA genómico hasta mRNA maduro, y se cree que la supresión de su expresión inhibe el crecimiento de las células de leucemia. Así, cabe suponer que los oligonucleótidos antisentido de la presente invención serán eficaces en el tratamiento de la leucemia.
Más aún, como se describe más adelante, se cree que los oligonucleótidos antisentido de la presente invención inhiben específicamente células de leucemia sin inhibir el crecimiento de células de médula ósea sanas. Así, también se pueden aplicar al "transplante autólogo de médula ósea" y al "transplante autólogo de células pluripotenciales de sangre periférica" en los que, por ejemplo, después de separar primero las células de médula ósea o las células pluripotenciales de sangre periférica del cuerpo y tratarlas in vitro con los oligonucleótidos antisentido de la presente invención para inhibir el crecimiento de células de leucemia, sólo las células de médula ósea sanas o las células pluripotenciales de sangre periférica sanas se devuelven al cuerpo.
Los oligonucleótidos antisentido de la presente invención también se pueden utilizar en forma de una preparación externa tal como un linimento o una cataplasma por mezcla con una base inactiva adecuada.
Además, los oligonucleótidos antisentido de la presente invención también se pueden utilizar en forma de comprimidos, polvos, gránulos, cápsulas, cápsulas de liposomas, preparados inyectables, líquidos o gotas nasales por adición de un vehículo, agente isotónico, coadyuvante de solubilidad, estabilizante, conservante o analgésico, etc, lo que sea necesario, o se pueden producir como preparados liofilizados. Estas formulaciones se pueden preparar de acuerdo con métodos rutinarios.
Los oligonucleótidos antisentido de la presente invención se pueden aplicar directamente a la zona afectada de los pacientes, o de manera que puedan llegar a la zona afectada como resultado de la administración intravascular, etc. Además, los materiales de inclusión antisentido también se pueden utilizar para mejorar la duración y la penetración en la membrana. Ejemplos de estos incluyen los liposomas, poli-L-lisina, lípidos, colesterol, lipofectina, y sus derivados.
La dosis del oligonucleótido antisentido de la presente invención es tal que se puede utilizar una cantidad preferible preparando adecuadamente una dosis de acuerdo con el estado, la edad, el sexo y el peso corporal del paciente. Adicionalmente, el método de administración se puede elegir adecuadamente a partir de varios métodos de administración, incluida la administración oral, la administración intramuscular, la administración intraperitoneal, la administración intradérmica, la administración subcutánea, la administración intravenosa, la administración intraarterial y la administración rectal, de acuerdo con el estado del paciente, las formas farmacéuticas, etc.
A continuación se proporciona una explicación detallada de la presente invención a través de Ejemplos.
Ejemplos
Ejemplo de síntesis 1
Los oligodesoxirribonucleótidos utilizados más abajo (SEQ ID NOS: 1 a 8) fueron sintetizados utilizando un sintetizador automático (Applied Biosystems), purificados por cromatografía de líquidos de alta eficacia, precipitados tres veces con etanol y suspendidos en tampón fosfato. Los oligonucleótidos sintetizados fueron los enumerados a continuación.
SEQ ID NO: 1: Secuencia sentido del sitio caperuza de inicio de la transcripción (SE1)
SEQ ID NO: 2: Secuencia antisentido del sitio caperuza de inicio de la transcripción (AS1)
SEQ ID NO: 3: Secuencia sentido de la región caperuza de inicio de la transcripción (SE2)
SEQ ID NO: 4: Secuencia antisentido de la región caperuza de inicio de la transcripción (AS2)
SEQ ID NO: 5: Secuencia sentido de la región de inicio de la traducción (SE3)
SEQ ID NO: 6: Secuencia antisentido de la región de inicio de la traducción (AS3)
SEQ ID NO: 7: Secuencia sentido del exón 6 (SE4)
SEQ ID NO: 8: Secuencia antisentido del exón 6 (AS4).
Ejemplo 1
Se inocularon 5 x 10^{4} células/ml de la línea celular de leucemia K562 positiva para la expresión de WT1 en medio RPMI 1640 que no incluía suero vacuno fetal (FCS), contenido en los pocillos de una placa de 96 pocillos de fondo plano en la cantidad de 100 \mul/pocillo. Cada oligonucleótido fue añadido a una serie de tres pocillos hasta una concentración final de 200 \mug/pocillo. Después de incubar durante 2 horas, se añadió FCS a cada pocillo a una concentración final de 10%. Después se añadieron los oligonucleótidos al cultivo en una cantidad igual a la mitad de la cantidad mencionada anteriormente cada 24 horas.
Después de cultivar durante 96 horas, se contó el número de células viables utilizando el método de eliminación de pigmento. Se añadió un volumen igual de PBS que no contenía nucleótido, como cultivo control, y se tomó como 100% el número de células de este cultivo control.
Los resultados se indican en la Fig. 1. Como es evidente a partir de esta figura, todos los oligonucleótidos antisentido inhibían poderosamente el crecimiento celular comparando con los correspondientes oligonucleótidos sentido.
Ejemplo 2
Se realizó el mismo experimento descrito en el Ejemplo 1, pero se añadieron los oligonucleótidos SE3 y AS3 a diversas concentraciones. Como es evidente a partir de la Fig. 2, aunque el oligonucleótido sentido (SE3) virtualmente no inhibía el crecimiento celular, el oligonucleótido antisentido (AS3) inhibió el crecimiento celular de manera dependiente de la dosis.
Ejemplo 3
Se realizó el mismo experimento descrito en el Ejemplo 1, pero se añadieron los oligonucleótidos SE4 y AS4 a diversas concentraciones. Como es evidente a partir de la Fig. 3, aunque el oligonucleótido sentido (SE4) virtualmente no inhibía el crecimiento celular, el oligonucleótido antisentido (AS4) inhibió el crecimiento celular de manera dependiente de la dosis.
Ejemplo 4
Se realizó el mismo experimento descrito en el Ejemplo 1. Sin embargo, las células se cultivaron en una placa de 24 pocillos de fondo plano a una concentración de 5 x 10^{4} células/ml y en la cantidad de 1 ml/pocillo. Se añadieron los oligonucleótidos SE3 y AS3 y se contó diariamente el número de células viables durante 2 a 5 días. Los resultados se muestran en la Fig. 4. Como es evidente a partir de esta figura, aunque se observó crecimiento celular similar al del control en el caso de añadir oligonucleótido sentido, en el caso de añadir oligonucleótido antisentido, el crecimiento celular se inhibía.
Ejemplo 5
Se realizó el mismo experimento descrito en el Ejemplo 1. Sin embargo, SE3, AS3, un oligonucleótido antisentido 5'-AGAGAAGAAGGGAACCCC-3' (SEQ ID NO: 20) (MPO-AS) dirigido contra el gen de mieloperoxidasa (MPO), y un oligonucleótido antisentido 5'-GCGTGGGCAGCCTGGGAA-3' (SEQ ID NO: 21) (FV-AS) contra el factor V de coagulación (FV) de la sangre se utilizaron como oligonucleótidos. Como es evidente de la Fig. 5, el crecimiento celular sólo se inhibió en el caso de utilizar AS3.
Ejemplo 6
Se realizó el mismo experimento descrito en el Ejemplo 1, pero se usaron las líneas celulares HEL y THP-1 positivas en expresión de WT1, así como la línea celular U937 negativa en expresión de WT-1, como células experimentales. Como oligonucleótidos se utilizaron los ocho mismos tipos de oligonucleótidos utilizados en el Ejemplo 1. En el caso de usar la línea celular HEL (Fig. 6) o THP-1 (Fig. 7) positiva en expresión de WT1, el crecimiento celular se inhibía por el oligonucleótido antisentido. En cambio, en el caso de usar la línea celular U937 negativa en expresión de WT-1 (Fig. 8), el crecimiento celular no se inhibía ni siquiera cuando se añadía el oligonucleótido antisentido.
Ejemplo 7
Células de médula ósea de pacientes con leucemia y de voluntarios sanos se trataron con heparina y se suspendieron en medio RPMI 1640 para obtener células mononucleares de médula ósea por centrifugación en gradiente de densidad Ficoll-Hypaque. Se añadió una proteína (100 \mul/pocillo) de las células mononucleares mencionadas anteriormente a una densidad celular de 1,5 x 10^{6} células/ml a una placa de 96 pocillos de fondo plano que contenía \alpha-MEM que contenía GM-CSF (100 ng/ml) y IL-3 (100 unidades/ml). El tratamiento con oligonucleótidos (SE3 y AS3) se realizó de la misma manera que en el Ejemplo 1.
Después de 96 horas, las células se recogieron y cultivaron en placas en medio de metilcelulosa [1,2% de metilcelulosa \alpha-MEM, 20% de FCS, GM-CSF (100 ng/ml), G-CSF (100 ng/ml), IL-3 (100 unidades/ml) y SCF (10 ng/ml)]. El cultivo se realizó en tres series. El día 14 se contó el número de colonias (CFU-L) y de colonias de macrófagos granulocíticos (CFU-GM).
La Fig. 9 indica la morfología de las colonias leucémicas en muestras de cuatro pacientes con leucemia (dos con leucemia mieloide aguda (AML) y dos con leucemia mieloide crónica (CML)). Se puede ver que la formación de colonias era inhibida por el oligonucleótido antisentido. La Fig. 10 indica la apariencia de las colonias de macrófagos granulocíticos en muestras de voluntarios sanos. La formación de colonias no es inhibida por ninguno de los oligonucleótidos antisentido.
Ejemplo 8
Se añadió oligonucleótido al azar, oligonucleótido AS1, oligonucleótido AS2 u oligonucleótido AS3 a una concentración de 200 \mug/ml a células K562 (A) o células de leucemia recién extraídas de un paciente con AML (B) a una densidad celular de 5 x 10^{4} células/pocillo en una placa de 24 pocillos, seguido de la adición de los oligonucleótidos a una concentración de 100 \mug/ml cada 24 horas. Las células se recogieron 4 días después del tratamiento inicial con oligonucleótido, se lavaron con PBS y se lisaron con tampón de muestra Laemli.
Cada lisado celular de 2 x 10^{4} células se calentó a ebullición durante 5 minutos, y después se aplicó a cada calle de un gel de poliacrilamida con 5% de dodecilsulfato de sodio. Tras la electroforesis, las proteínas se transfirieron a un filtro de difluoruro de polivinilideno Immobilon (Millipore Corp. MA, EE.UU). Después este filtro se hibridó usando un anticuerpo policlonal anti-WT1 a un polipéptido sintético (posiciones de aminoácidos 177 a 192: Lys His Glu Asp Pro Met Gly Gln Gln Gly Ser Leu Gly Glu Gln Gln (SEQ ID NO: 22)). Esto fue seguido de tratamiento con anticuerpo anti-inmunoglobulina unida a peroxidasa de rábano picante (Amersham, Little Chalfont, U.K.). Después de lavarlo, el filtro se sumergió en reactivo de detección (Amersham, Little Chalfont, U.K.) durante 1 hora seguida de tratamiento autorradiográfico durante 1 a 5 minutos.
Después de lavar dos veces con TBST (tampón Tris conteniendo 0,05% de Tween 20), el filtro se hibridó con anticuerpo monoclonal anti-actina (Oncogene Science Inc., NY, USA) seguido de autorradiografía de la manera descrita más arriba.
La densidad de las bandas correspondientes a proteína WT1 y actina se midió con un densitómetro CS-9000 (Shimizu, Kyoto) y seguidamente se calculó la relación WT1/actina.
Los resultados se muestran en la Fig. 11 A y B. En estas figuras, la calle 1 muestra los resultados en el caso de añadir oligonucleótido al azar, la calle 2 en el caso de añadir oligonucleótido AS3, la calle 3 en el caso de añadir oligonucleótido AS1, y la calle 4 en el caso de añadir oligonucleótido AS2. En estas figuras, A indica los resultados en el caso de usar células K562, mientras que B los muestra en el caso de utilizar células de leucemia recientes de un paciente con AML.
Como es evidente a partir de la Fig. 11A, en el caso de añadir oligonucleótido WT1 a medio que contiene células K562, el nivel de proteína WT1 disminuía significativamente. Por otro lado, el control en forma de nucleótido al azar no afectó al nivel de proteína WT1. Además, como es evidente a partir de la Fig. 11B, en el caso de añadir oligonucleótido WT1 a medio que contiene células leucémicas recién aisladas de un paciente con AML, el nivel de proteína WT1 disminuía significativamente. Estos resultados mostraban claramente que el oligonucleótido antisentido WT1 inhibe específicamente el crecimiento de células de leucemia disminuyendo el nivel de proteína WT1.
Aplicabilidad industrial
Como se ha expuesto anteriormente, los oligonucleótidos antisentido de la presente invención son eficaces inhibiendo el crecimiento de células leucémicas y, por lo tanto, cabe esperar que sean útiles como nuevo tratamiento para la leucemia.
SEQ ID Nº: 1
Longitud de la secuencia: 18
Tipo de secuencia: Ácido nucleico
Tipo de cadena: Monocatenaria
Tipo de molécula: DNA sintético
Secuencia:
CCCACCGCAT TCGACCCT 
\vskip1.000000\baselineskip
SEQ ID Nº: 2
Longitud de la secuencia: 18
Tipo de secuencia: Ácido nucleico
de cadena: Monocatenaria
de molécula: DNA sintético
Secuencia:
AGGGTCGAAT GCGGTGGG 
\vskip1.000000\baselineskip
SEQ ID Nº: 3
Longitud de la secuencia: 18
Tipo de secuencia: Ácido nucleico
Tipo de cadena: Monocatenaria
Tipo de molécula: DNA sintético
Secuencia:
CCGGCCCCTC TTATTTGA 
\vskip1.000000\baselineskip
SEQ ID Nº: 4
Longitud de la secuencia: 18
Tipo de secuencia: Ácido nucleico
Tipo de cadena: Monocatenaria
Tipo de molécula: DNA sintético
Secuencia:
TCAAATAAGA GGGGCCGG 
\vskip1.000000\baselineskip
SEQ ID Nº: 5
Longitud de la secuencia: 18
Tipo de secuencia: Ácido nucleico
Tipo de cadena: Monocatenaria
de molécula: DNA sintético
Secuencia:
CAGCAAATGG GCTCCGAC 
\vskip1.000000\baselineskip
SEQ ID Nº: 6
Longitud de la secuencia: 18
Tipo de secuencia: Ácido nucleico
Tipo de cadena: Monocatenaria
Tipo de molécula: DNA sintético
Secuencia:
GTCGGAGCCC ATTTGCTG 
\vskip1.000000\baselineskip
SEQ ID Nº: 7
Longitud de la secuencia: 18
de secuencia: Ácido nucleico
Tipo de cadena: Monocatenaria
de molécula: DNA sintético
Secuencia:
AGCGATAACC ACACAACG 
\vskip1.000000\baselineskip
SEQ ID Nº: 8
Longitud de la secuencia: 18
Tipo de secuencia: Ácido nucleico
Tipo de cadena: Monocatenaria
Tipo de molécula: DNA sintético
Secuencia:
CGTTGTGTGG TTATCGCT 
\vskip1.000000\baselineskip
SEQ ID Nº: 9
Longitud de la secuencia: 1272
Tipo de secuencia: Ácido nucleico
Tipo de cadena: Monocatenaria
Tipo de molécula: DNA sintético
Secuencia: 
\vskip1.000000\baselineskip
3
300 
\vskip1.000000\baselineskip
SEQ ID Nº: 10
Longitud de la secuencia: 457
Tipo de secuencia: Ácido nucleico
de cadena: Monocatenaria
de molécula: DNA sintético
Característica de la secuencia: Porción de exón 1 del gen WT1
Secuencia: 
\vskip1.000000\baselineskip
4 
\vskip1.000000\baselineskip
SEQ ID Nº: 11
Longitud de la secuencia: 123
Tipo de secuencia: Ácido nucleico
Tipo de cadena: Monocatenaria
Tipo de molécula: DNA sintético
de la secuencia: Exón 2 del gen WT1
Secuencia: 
\vskip1.000000\baselineskip
5 
\vskip1.000000\baselineskip
SEQ ID Nº: 12
Longitud de la secuencia: 103
Tipo de secuencia: Ácido nucleico
Tipo de cadena: Monocatenaria
Tipo de molécula: DNA sintético
Característica de la secuencia: Exón 3 del gen WT1
Secuencia:
6 
\vskip1.000000\baselineskip
SEQ ID Nº: 13
Longitud de la secuencia: 78
Tipo de secuencia: Ácido nucleico
Tipo de cadena: Monocatenaria
de molécula: DNA sintético
de la secuencia: Exón 4 del gen WT1
Secuencia: 
\vskip1.000000\baselineskip
7 
\vskip1.000000\baselineskip
SEQ ID Nº: 14
Longitud de la secuencia: 51
Tipo de secuencia: Ácido nucleico
Tipo de cadena: Monocatenaria
Tipo de molécula: DNA sintético
Característica de la secuencia: Exón 5 del gen WT1
Secuencia: 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
AGTTGCTGCT GGGAGCTCCA GCTCAGTGAA ATGGACAGAA GGGCAGAGCA A 
\hfill
51 
\vskip1.000000\baselineskip
SEQ ID Nº: 15
Longitud de la secuencia: 97
Tipo de secuencia: Ácido nucleico
Tipo de cadena: Monocatenaria
Tipo de molécula: DNA sintético
Característica de la secuencia: Exón 6 del gen WT1
Secuencia: 
\vskip1.000000\baselineskip
8 
\vskip1.000000\baselineskip
SEQ ID Nº: 16
Longitud de la secuencia: 151
Tipo de secuencia: Ácido nucleico
Tipo de cadena: Monocatenaria
de molécula: DNA sintético
de la secuencia: Exón 7 del gen WT1
Secuencia: 
\vskip1.000000\baselineskip
9 
\vskip1.000000\baselineskip
SEQ ID Nº: 17
Longitud de la secuencia: 90
Tipo de secuencia: Ácido nucleico
Tipo de cadena: Monocatenaria
de molécula: DNA sintético
Característica de la secuencia: Exón 8 del gen WT1
Secuencia: 
\vskip1.000000\baselineskip
10 
\vskip1.000000\baselineskip
SEQ ID Nº: 18
Longitud de la secuencia: 93
Tipo de secuencia: Ácido nucleico
Tipo de cadena: Monocatenaria
Tipo de molécula: DNA sintético
Característica de la secuencia: Exón 9 del gen WT1
Secuencia: 
\vskip1.000000\baselineskip
11 
\vskip1.000000\baselineskip
SEQ ID Nº: 19
Longitud de la secuencia: 158
Tipo de secuencia: Ácido nucleico
Tipo de cadena: Monocatenaria
de molécula: DNA sintético
de la secuencia: Porción de exón 10 del gen WT1
Secuencia: 
\vskip1.000000\baselineskip
12 
\vskip1.000000\baselineskip
SEQ ID Nº: 20
Longitud de la secuencia: 18
Tipo de secuencia: Ácido nucleico
Tipo de cadena: Monocatenaria
Tipo de molécula: DNA sintético
Secuencia:
AGAGAAGAAG GGAACCCC 
\vskip1.000000\baselineskip
SEQ ID Nº: 21
Longitud de la secuencia: 18
Tipo de secuencia: Ácido nucleico
Tipo de cadena: Monocatenaria
Tipo de molécula: DNA sintético
Secuencia:
GCGTGGGCAG CCTGGGAA 
\vskip1.000000\baselineskip
SEQ ID Nº: 22
Longitud de la secuencia: 16
Tipo de secuencia: Aminoácido
Tipo de molécula: Péptido sintético
Secuencia: 
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Lys His Glu Asp Pro Met Gly Gln Gln Gly Ser Leu Gly Gln Gln Gln}
\vskip1.000000\baselineskip
(1) INFORMACIÓN GENERAL:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
SOLICITANTE:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
NOMBRE: KISHIMOTO, TADAMITSU
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
DOMICILIO: 3-5-31, NAKANO-CHO
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
CIUDAD: TONDABAYASHI-SHI
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
ESTADO: OSAKA
\vskip0.500000\baselineskip
(E)
PAÍS: JAPÓN
\vskip0.500000\baselineskip
(F)
CÓDIGO POSTAL (ZIP): 562/JP
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TÍTULO DE LA INVENCIÓN: INHIBIDOR DEL CRECIMIENTO DE CÉLULAS LEUCÉMICAS QUE CONTIENE DERIVADO OLIGONUCLEOTÍDICO ANTISENTIDO CONTRA EL GEN DEL TUMOR DE WILMS (WT1)
\vskip0.800000\baselineskip
(iii)
NÚMERO DE SECUENCIAS: 22
\vskip0.800000\baselineskip
(iv)
FORMATO LEGIBLE POR ORDENADOR:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
TIPO DE MEDIO: Disco blando
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
ORDENADOR: IBM PC compatible
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
SISTEMA OPERATIVO: PC-DOS/MS-DOS
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
PROGRAMA: PatentIn Release #1.0, Versión 1.30 (EPO)
\vskip0.800000\baselineskip
(v)
DATOS DE LA SOLICITUD ACTUAL: NÚMERO DE SOLICITUD: EP 96914430.2
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID Nº: 1:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 18 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: Ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
TIPO DE CADENA: simple
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: otro ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
DESCRIPCIÓN: /desc = "SINTÉTICO"
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID Nº: 1:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
CCCACCGCAT TCGACCCT 
\hfill
18 
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID Nº: 2:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 18 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: Ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
TIPO DE CADENA: simple
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: otro ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
DESCRIPCIÓN: /desc = "SINTÉTICO"
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID Nº: 2:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
AGGGTCGAAT GCGGTGGG 
\hfill
18 
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID Nº: 3:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 18 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: Ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
TIPO DE CADENA: simple
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: otro ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
DESCRIPCIÓN: /desc = "SINTÉTICO"
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID Nº: 3:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
CCGGCCCCTC TTATTTGA 
\hfill
18 
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID Nº: 4:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 18 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: Ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
TIPO DE CADENA: simple
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: otro ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
DESCRIPCIÓN: /desc = "SINTÉTICO"
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID Nº: 4:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
TCAAATAAGA GGGGCCGG 
\hfill
18 
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID Nº: 5:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 18 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: Ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
TIPO DE CADENA: simple
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: otro ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
DESCRIPCIÓN: /desc = "SINTÉTICO"
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID Nº: 5:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
CAGCAAATGG GCTCCGAC 
\hfill
18 
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID Nº: 6:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 18 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: Ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
TIPO DE CADENA: simple
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: otro ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
DESCRIPCIÓN: /desc = "SINTÉTICO"
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID Nº: 6:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
GTCGGAGCCC ATTTGCTG 
\hfill
18 
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID Nº: 7:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 18 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: Ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
TIPO DE CADENA: simple
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: otro ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
DESCRIPCIÓN: /desc = "SINTÉTICO"
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID Nº: 7:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
AGCGATAACC ACACAACG 
\hfill
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID Nº: 8:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 18 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: Ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
TIPO DE CADENA: simple
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: otro ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
DESCRIPCIÓN: /desc = "SINTÉTICO"
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID Nº: 8:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
CGTTGTGTGG TTATCGCT 
\hfill
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID Nº: 9:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 1272 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: Ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
TIPO DE CADENA: simple
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: otro ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
DESCRIPCIÓN: /desc = "SINTÉTICO"
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID Nº: 9:
13 
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID Nº: 10:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 457 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: Ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
TIPO DE CADENA: simple
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: otro ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
DESCRIPCIÓN: /desc = "SINTÉTICO"
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID Nº: 10:
14 
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID Nº: 11:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 123 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: Ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
TIPO DE CADENA: simple
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: otro ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
DESCRIPCIÓN: /desc = "SINTÉTICO"
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID Nº: 11:
\vskip1.000000\baselineskip
15 
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID Nº: 12:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 103 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: Ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
TIPO DE CADENA: simple
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: otro ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
DESCRIPCIÓN: /desc = "SINTÉTICO"
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID Nº: 12:
\vskip1.000000\baselineskip
16 
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID Nº: 13:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 78 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: Ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
TIPO DE CADENA: simple
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: otro ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
DESCRIPCIÓN: /desc = "SINTÉTICO"
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID Nº: 13:
\vskip1.000000\baselineskip
17 
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID Nº: 14:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 51 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: Ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
TIPO DE CADENA: simple
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: otro ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
DESCRIPCIÓN: /desc = "SINTÉTICO"
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID Nº: 14:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
AGTTGCTGCT GGGAGCTCCA GCTCAGTGAA ATGGACAGAA GGGCAGAGCA A 
\hfill
51 
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID Nº: 15:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 97 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: Ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
TIPO DE CADENA: simple
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: otro ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
DESCRIPCIÓN: /desc = "SINTÉTICO"
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID Nº: 15:
\vskip1.000000\baselineskip
18 
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID Nº: 16:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 151 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: Ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
TIPO DE CADENA: simple
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: otro ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
DESCRIPCIÓN: /desc = "SINTÉTICO"
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID Nº: 16:
\vskip1.000000\baselineskip
19 
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID Nº: 17:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 90 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: Ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
TIPO DE CADENA: simple
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: otro ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
DESCRIPCIÓN: /desc = "SINTÉTICO"
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID Nº: 17:
\vskip1.000000\baselineskip
20 
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID Nº: 18:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 93 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: Ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
TIPO DE CADENA: simple
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: otro ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
DESCRIPCIÓN: /desc = "SINTÉTICO"
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID Nº: 18:
\vskip1.000000\baselineskip
21 
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID Nº: 19:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 158 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: Ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
TIPO DE CADENA: simple
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: otro ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
DESCRIPCIÓN: /desc = "SINTÉTICO"
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID Nº: 19:
22 
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID Nº: 20:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 18 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: Ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
TIPO DE CADENA: simple
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: otro ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
DESCRIPCIÓN: /desc = "SINTÉTICO"
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID Nº: 20:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
AGAGAAGAAG GGAACCCC 
\hfill
18 
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID Nº: 21:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 18 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: Ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
TIPO DE CADENA: simple
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: otro ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
DESCRIPCIÓN: /desc = "SINTÉTICO"
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID Nº: 21:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
GCGTGGGCAG CCTGGGAA 
\hfill
18 
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID Nº: 22:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 16 Aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: Aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
TIPO DE CADENA: simple
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: péptido
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID Nº: 22:
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Lys His Glu Asp Pro Met Gly Gln Gln Gly Ser Leu Gly Glu Gln Gln}

Claims (4)

1. Un inhibidor del crecimiento para células de leucemia que contiene un oligonucleótido antisentido frente al gen del tumor de Wilms (WT1), en donde el oligonucleótido tiene 9-30 nucleótidos de longitud y comprende al menos nueve nucleótidos continuos de una de las siguientes secuencias de nucleótidos
5'-AGGGTCGAATGCGGTGGG-3' (SEQ ID Nº: 2); 5'-TCAAATAAGAGGGGCCGG-3' (SEQ ID NO: 4), 5'-GTCGGAGCCCATTTGCTG-3' (SEQ ID Nº: 6); o 5'-CGTTGTGTGGTTATCGCT-3' (SEQ ID NO: 8).
2. Un inhibidor del crecimiento de células de leucemia según la reivindicación 1, en el que el oligonucleótido consiste en la siguiente secuencia de nucleótidos
5'-AGGGTCGAATGCGGTGGG-3' (SEQ ID Nº: 2) o 5'-TCAAATAAGAGGGGCCGG-3' (SEQ ID NO: 4).
3. Un inhibidor del crecimiento de células de leucemia según la reivindicación 1, en el que el oligonucleótido consiste en la siguiente secuencia de nucleótidos
5'-GTCGGAGCCCATTTGCTG-3' (SEQ ID Nº: 6).
4. Un inhibidor del crecimiento de células de leucemia según la reivindicación 1, en el que el oligonucleótido consiste en la siguiente secuencia de nucleótidos
5'-CGTTGTGTGGTTATCGCT-3' (SEQ ID NO: 8).
ES96914430T 1995-06-01 1996-05-24 Inhibidor del crecimiento de celulas leucemicas que contienen un derivado oligonucleotidico antisentido frente al gen del tumor de wiloms (wt1). Expired - Lifetime ES2268705T3 (es)

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