ES2300102T3 - Anticuerpos anti-fibrina soluble humana, hibridoma que los produce y procedimiento de inmunoensayo. - Google Patents
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Abstract
Un anticuerpo monoclonal que reacciona con la fibrina soluble humana en un neoantígeno que se expone de nuevo en una molécula de fibrina en el momento en el que se forma un complejo de fibrina-fibrinógeno por unión de la fibrina desAABB o fibrina desAA y fibrinógeno, pero que no reacciona con el fibrinógeno humano, en el que existe un epítopo reconocido por dicho anticuerpo monoclonal en la cadena Aalfa (17-78) del dominio E en el que se han liberado el fibrinopéptido A o fibrinopéptidos A y B, y dicho anticuerpo monoclonal se une a la fibrina soluble humana no tratada previamente con un agente desnaturalizante de proteínas.
Description
Anticuerpos anti-fibrina soluble
humana, hibridoma que los produce y procedimiento de
inmunoensayo.
La presente invención se refiere a anticuerpos
monoclonales que reaccionan con una fibrina soluble humana, pero no
reaccionan con un fibrinógeno humano, a un hibridoma que segrega el
anticuerpo monoclonal anterior, y a un procedimiento de
inmunoensayo de una fibrina soluble con el anticuerpo monoclonal
anterior. Según el procedimiento de inmunoensayo de la presente
invención, se puede determinar rápidamente y con precisión el
contenido de fibrina soluble en la muestra de plasma sin que
reaccione con o quede afectado por el fibrinógeno, diferentes
fragmentos de fibrinógeno, diferentes fragmentos de fibrina y
diferentes productos de degradación por la plasmina de una fibrina
estabilizada presente en la muestra, incluso sin tratamiento previo
de la muestra de plasma con un agente desnaturalizante de
proteínas, tal como tiocianato sódico (KSCN), de una forma
específica, reproducible e inmunológica. El término "fibrina
soluble humana" usado en el presente documento significa un
complejo de fibrina-fibrinógeno formado por unión
del fibrinógeno con la fibrina desAABB o fibrina desAA.
La trombina actúa sobre el fibrinógeno
normalmente presente en la sangre para liberar consecutivamente
fibrinopéptido A de la cadena A\alpha y fibrinopéptido B de la
cadena B\beta, y forma el monómero I de fibrina (fibrina desAA) y
el monómero II de fibrina (fibrina desAABB), respectivamente. Los
monómeros de fibrina pueden estar presentes en la sangre hasta un
determinado nivel como una fibrina soluble formada por la unión con
el fibrinógeno de la sangre. Sin embargo, a medida que se hace alta
la concentración de los monómeros de fibrina, los monómeros de
fibrina se polimerizan para producir un coágulo de fibrina. Por lo
tanto, es deseable detectar pronto la fibrina soluble en la sangre,
para la predicción precoz de la formación del coágulo de fibrina, es
decir, la formación de trombo, para realizar pronto el tratamiento
para inhibir la coagulación de la sangre, es decir, la formación de
trombo. La detección de la fibrina soluble se puede realizar
mediante un anticuerpo que reacciona con la fibrina soluble, pero no
con el fibrinógeno.
Para el propósito anterior, se ha descrito la
preparación de anticuerpos específicos para la fibrina. Por
ejemplo, Kudryk y col. describieron anticuerpos monoclonales que se
obtenían usando como inmunógeno un fragmento preparado por
tratamiento de un extremo amino de la fibrina con bromuro de
cianógeno, y que reaccionaba con un extremo amino de la cadena
\beta de fibrina [Macromolecular Immunology, 89-94
(1984)]. Además, Hui y col. describen anticuerpos obtenidos por
inmunización con un péptido del extremo amino de la cadena \beta
de fibrina [Hybridoma 5, 215-222 (1985)]. Sin
embargo, tenían la desventaja de que los anticuerpos sólo reconocen
el extremo amino de la cadena \beta de fibrina liberada del
fibrinopéptido B después de su escisión, y por lo tanto no se
podían puede usar para detectar la fibrina I, es decir, la fibrina
desAA.
La solicitud de patente europea nº 152.612 y la
publicación de patente japonesa no examinada (kokai) nº
60-158353 describen un procedimiento de EIA para
determinar la fibrina, que usa un anticuerpo obtenido de un animal
inmunizado con un péptido inmunógeno de un extremo amino de la
cadena \alpha recién producido por escisión del fibrinopéptido A.
Sin embargo, el anticuerpo no puede reaccionar con un complejo de
fibrina en la sangre, porque el extremo amino de la cadena \alpha
de la fibrina queda enmascarado después de unirse al fibrinógeno u
otra fibrina que esté presente en la sangre en cantidad. Por lo
tanto, para corregir este defecto, era necesario que el complejo de
fibrina se tratara previamente con una concentración alta de
tiocianato sódico y de esta forma se convirtiera en un monómero de
fibrina, antes del ensayo [Blood Coagulation and Fibrinolysis,
4,97-102 (1993)]. Además, existía la desventaja de
que el anticuerpo reacciona con los productos de degradación de la
fibrina por la plasmina, fragmentos de fibrina X, Y, D y E, todos
los cuales tienen el mismo epítopo.
El documento WO 8801514 describe un anticuerpo
monoclonal obtenido usando una fibrina humana como inmunógeno. Sin
embargo, el anticuerpo también reacciona con los fragmentos de
fibrina D, X e Y, y la cadena A de fibrinógeno, y por lo tanto no
se puede denominar un anticuerpo específico para la fibrina. Además,
la publicación de patente japonesa no examinada (kokai) nº
2-28197 (correspondiente a la solicitud de patente
holandesa nº 31.8801227) describe un anticuerpo monoclonal que
reacciona con un péptido del aminoácido 111º al 207º de la secuencia
de aminoácidos de la cadena A\alpha del fibrinógeno. El
anticuerpo monoclonal no reacciona con fibrinógeno, sino que
reacciona específicamente con la fibrina. En otras palabras, el
anticuerpo monoclonal reacciona tanto con la fibrina I (fibrina
desAA) como con la fibrina II (fibrina des AABB). Sin embargo, el
anticuerpo monoclonal también reacciona con el dímero D, Degta y la
cadena A de fibrinógeno, y por lo tanto no se puede denominar un
anticuerpo específico para la fibrina. Además, no se puede excluir
la influencia de los productos de degradación de la fibrina por la
plasmina cuando se fabrica un sistema de ensayo usando el anticuerpo
anterior.
Los autores de la presente invención se
implicaron en la investigación para desarrollar de un procedimiento
para medir de forma sencilla y precisa la fibrina soluble con buena
reproducibilidad, y como resultado descubrieron un anticuerpo
monoclonal que reacciona con la fibrina soluble humana en un
neoantígeno que se expone de nuevo en una molécula de fibrina en el
momento en el que se forma el complejo de
fibrina-fibrinógeno por unión de la fibrina desAABB
o fibrina des AA y el fibrinógeno, pero que no reacciona con el
fibrinógeno humano, en el que existe un epítopo reconocido por
dicho anticuerpo monoclonal en la cadena A\alpha
(17-78) del dominio E en el que el fibrinopéptido A
o los fibrinopéptidos A y B son liberados, y dicho anticuerpo
monoclonal se une a la fibrina soluble humana no tratada
previamente con un agente desnaturalizante de proteínas, y además
encontraron que si se usa uno de los anticuerpos monoclonales
anteriores o una combinación de dos de ellos se puede determinar de
forma rápida, precisa y específica el contenido de fibrina soluble
en la muestra de plasma sin que sea afectado por el fibrinógeno,
diferentes fragmentos de fibrinógeno X, Y, D o E, diferentes
fragmentos de fibrina X, Y, D o E y diferentes productos de
degradación por la plasmita de una fibrina presente en la muestra
estabilizada, incluso sin tratar previamente la muestra de plasma
con un agente desnaturalizante de proteínas, tal como el tiocianato
potásico (KSCN). Por lo tanto, el objetivo de la presente invención
es proporcionar los anticuerpos monoclonales nuevos anteriores, los
hibridomas que segregan los anticuerpos monoclonales anteriores, y
un procedimiento de ensayo inmunológico que usa el anticuerpo o
anticuerpos monoclonales anteriores.
La presente invención se refiere a dicho
anticuerpo monoclonal que reacciona con una fibrina soluble humana,
pero que no reacciona con un fibrinógeno humano.
La presente invención también se refiere a un
hibridoma que segrega el anticuerpo monoclonal anterior.
Además, la presente invención se refiere a un
procedimiento para ensayar una fibrina soluble humana, caracterizado
por poner en contacto una muestra con el anticuerpo monoclonal
anterior inmovilizado sobre un vehículo insoluble, y observar la
aglutinación.
Además, la presente invención también se refiere
a un procedimiento de ensayo inmunológico de una fibrina soluble
humana, caracterizado porque el anticuerpo monoclonal anterior se
inmoviliza sobre un vehículo insoluble como un primer anticuerpo,
se pone una muestra en contacto con dicho primer anticuerpo y
después con un segundo anticuerpo marcado que es un anticuerpo de
la misma clase o de una clase diferente del anticuerpo anterior, y
se detecta una señal de dicho marcador de dicho segundo anticuerpo
unido con una fibrina insoluble humana-primer
anticuerpo inmovilizado, o de dicho segundo anticuerpo no unido a la
fibrina insoluble humana-primer anticuerpo
inmovilizado.
Además, la presente invención también se refiere
a un procedimiento para diagnosticar la coagulación intravascular
diseminada (CID), que comprende detectar una fibrina soluble en una
muestra biológica por el ensayo inmunológico anterior.
la fig. 1 es un gráfico que ilustra los
resultados de la determinación de la fibrina soluble en muestras de
personas sanas o de pacientes de CID como se lleva a cabo en el
Ejemplo 7;
la fig. 2 es una curva patrón del EIA como se
lleva a cabo en el Ejemplo 8;
la fig. 3 es un gráfico que ilustra los
resultados de la cromatografía de exclusión molecular mediante
Sephacryl
S-300 de suero normal en el que se ha solubilizado monómero de fibrina con ácido acético, como se lleva a cabo en el Ejemplo 9;
S-300 de suero normal en el que se ha solubilizado monómero de fibrina con ácido acético, como se lleva a cabo en el Ejemplo 9;
la fig. 4 ilustra esquemáticamente un epítopo
recién expuesto en un dominio E en el momento en el que los
monómeros de fibrina se unen con fibrinógenos para formar un
complejo de fibrina-fibrinógeno.
La presente invención se explicará en lo
sucesivo en el orden de anticuerpos monoclonales, hibridomas y
ensayo inmunológico.
Los anticuerpos monoclonales y los hibridomas se
pueden preparar, por ejemplo, usando una fibrina soluble humana
como inmunógeno. La fibrina soluble humana usada como inmunógeno se
puede preparar según, por ejemplo, el procedimiento de Remo Largo,
y col. [Blood, 47,991-1002 (1976)]. Más en
particular, el fibrinógeno se disuelve en solución salina
fisiológica, Se prefiere que la solución salina contenga un
inhibidor (tal como EDTA) de los factores de coagulación de la
sangre (en particular, el factor XIII) que coexisten en cantidades
de trazas en un reactivo de fibrina estándar. Después, se añade
trombina a la solución de fibrinógeno, y la mezcla se incuba a
aproximadamente 37ºC durante aproximadamente 90 minutos para formar
un coágulo de fibrina. El coágulo de fibrina se separa, se lava y
después se disuelve en una solución de urea. Los productos
insolubles se separan, por ejemplo, por centrifugación, para
obtener los monómeros de fibrina purificados. El monómero de fibrina
solubilizado en urea purificado resultante se puede usar como
inmunógeno o un reactivo patrón en el inmunoensayo.
Alternativamente, el coágulo de fibrina formado
por adición de trombina se disuelve y se dializa con un tampón de
acetato, tal como tampón de acetato 50 mM (pH 4,6), para preparar un
monómero de fibrina solubilizado en tampón de acetato que se puede
usar como un reactivo estándar en el inmunoensayo.
Después, la solución de inmunógeno del monómero
de fibrina humana purificado solubilizado en urea se usa para
inmunizar mamíferos (por ejemplo, ratones, ratas, conejos, cabras y
caballos) por el procedimiento de inmunización in vivo. Más
en particular, por ejemplo, la solución de inmunógeno del monómero
de fibrina humana purificado solubilizado en urea se mezcla con un
volumen igual de adyuvante complejo o adyuvante incompleto de Freund
hasta emulsión. La mezcla se administra, por ejemplo, por vía
subcutánea a ratones (una primera inmunización). Después, se repite
el mismo procedimiento a intervalos de dos a cuatro semanas para
efectuar varias inmunizaciones. Se extraen los bazos de forma
aséptica varios días después de la inmunización final, y se aplastan
con un tamiz de acero inoxidable o similar para preparar las
células de bazo que se usan para la fusión de células.
Como el resto de células parentales usadas para
la fusión celular, es decir las células de mieloma, se pueden usar
diferentes tipos de líneas celulares conocidas, tales como p3
(p3/x63-Ag8) [Nature, 256,495-497
(1975), p3-U1 [Current Topics in Microbiology and
Immunology, 81; 1-7 (1978)], NS-1
[Eur. J. Immunol., 6; 511-519 (1976)],
MPC-11 [Cell, 8; 405-415 (1976)],
SP2/0 [Nature, 276; 269-270 (1978)], FO [J. Immunol.
Meth., 35; 1-21 (1980)], x63.6.55.3 [J. Immunol.,
123; 1548-1550 (1979)], S194 [J. Exp. Med., 148;
313-323 (1978)], R210 de ratas [Nature, 277;
131-133 (1979)], o similares.
La fusión de células entre células de bazo
inmunizadas y células de mieloma se puede llevar a cabo por
procedimientos ordinarios. Por ejemplo, se puede usar un promotor
de fusión conocido (polietilenglicol, virus Sendar o similares) y
opcionalmente un agente auxiliar (dimetilsulfóxido o similar). La
relación de células de bazo inmunizadas a células de mieloma puede
ser la misma que en los procedimientos habituales. Por ejemplo, las
células de bazo se pueden usar en cantidades de aproximadamente 1 a
10 veces la cantidad de células de mieloma. Como medio de fusión,
se puede usar por ejemplo el medio Eagle modificado por Dulbecco
(DMEM) que contiene polietilenglicol al 40% (p/vol). La fusión se
lleva a cabo mezclando bien las células de bazo inmunizadas y las
células de mieloma en el medio anterior.
Después, se usa un medio de selección (por
ejemplo, medio HAT) par separar las distintas células del hibridoma.
Los hibridomas objetivo se separan detectando la presencia de los
anticuerpos producidos en el líquido sobrenadante del cultivo de
hibridoma, por ejemplo, por el procedimiento ELISA. Los hibridomas
resultantes de la presente invención que segregan los anticuerpos
monoclonales deseados de la presente invención se pueden cultivar
sucesivamente en medio ordinario, y se pueden almacenar fácilmente
durante periodos largos en nitrógeno líquido o similares.
Como medio para cultivar los hibridomas, se
puede usar cualquier medio adecuado para el cultivo de un hibridoma.
Preferiblemente, se usa un medio que comprende el DMEM que incluye
suero fetal de ternero, L-glutamina, ácido
L-pirúvico y antibióticos (penicilina G y estreptomicina). El cultivo del hibridoma se lleva a cabo preferiblemente por ejemplo en un medio con CO_{2} al 5% y 37ºC durante aproximadamente 3 días, en el caso de cultivo in vitro, o durante aproximadamente 14 días en el caso de cultivo in vivo, por ejemplo en las cavidades abdominales de ratones.
L-pirúvico y antibióticos (penicilina G y estreptomicina). El cultivo del hibridoma se lleva a cabo preferiblemente por ejemplo en un medio con CO_{2} al 5% y 37ºC durante aproximadamente 3 días, en el caso de cultivo in vitro, o durante aproximadamente 14 días en el caso de cultivo in vivo, por ejemplo en las cavidades abdominales de ratones.
Los anticuerpos monoclonales objetivo de la
presente invención se pueden separar y purificar a partir del
cultivo líquido obtenido cultivando los hibridomas de la presente
invención por un procedimiento ordinario, o a partir de la ascitis
de mamíferos adecuados (por ejemplo, ratones o ratas) a los que se
han administrado hibridomas de la presente invención. Cuando se
separan y purifican los anticuerpos monoclonales del líquido de
cultivo resultante o de la ascitis de ratón, se puede usar el
procedimiento aplicado en general para el aislamiento y la
purificación de proteínas. Como ejemplos de los mismos se pueden
mencionar la precipitación por adición de sal de sulfato amónico,
la cromatografía por intercambio iónico, la cromatografía en columna
usando gel de tamices moleculares, la cromatografía en columna de
afinidad usando polisacáridos que se unen a proteína A, diálisis,
liofilización o similares.
Los anticuerpos monoclonales resultantes de la
presente invención reaccionan con una fibrina soluble humana, pero
no reaccionan con un fibrinógeno humano. Además, los anticuerpos
monoclonales de la presente invención reaccionan con un neoantígeno
expuesto de nuevo en una molécula de fibrina en el momento en el que
se forma una fibrina soluble humana, es decir, un complejo de
fibrina-fibrinógeno por unión de la fibrina desAABB
o fibrina desAA y el fibrinógeno, pero no reacciona con un
fibrinógeno humano.
Los anticuerpos monoclonales preferidos de la
presente invención son
(1) el anticuerpo monoclonal [en lo sucesivo
denominado a veces como anticuerpo monoclonal (1)], en particular,
en anticuerpo monoclonal FM nº 43-1 según se
menciona en los siguientes ejemplos, que reacciona específicamente
con una fibrina desAABB tratada con urea (es decir, solubilizada en
urea) un producto de degradación por la plasmina tratado con urea
(es decir, solubilizado en urea) de una fibrina estabilizada, y un
fragmento de fibrina tratada con urea (tal como fragmentos X, Y y
E) pero no reacciona con un fibrinógeno, un producto de degradación
por la plasmina tratado con urea (tal como fracciones X, Y, D y E)
de un fibrinógeno, una fibrina desAA tratada con urea ni una
fibrina desBB tratada con urea, y
(2) el anticuerpo monoclonal [en lo sucesivo
denominado a veces anticuerpo monoclonal (2)], en particular, el
anticuerpo monoclonal FM nº 59-1 mencionado en los
siguientes ejemplos, que reacciona específicamente con una fibrina
desAA tratada con urea, una fibrina desAABB tratada con urea, un
producto de degradación por la plasmina de una fibrina estabilizada
tratado con urea, y un fragmento de fibrina tratado con urea (tal
como fragmentos X, Y y E), pero no reacciona con un fibrinógeno, un
producto de degradación por la plasmina tratado con urea (tal como
fracciones X, Y, D y E) de un fibrinógeno, ni una fibrina desBB.
\newpage
El término "tratado con urea" usado en el
presente documento significa que un antígeno se disuelve en general
en solución de urea aproximadamente 3 M.
Por consiguiente, los hibridomas de la presente
invención segregan los anticuerpos monoclonales que reaccionan con
una fibrina soluble humana, pero no reaccionan con un fibrinógeno
humano, en particular, los anticuerpos monoclonales que reaccionan
con un neoantígeno recién expuesto en una molécula de fibrina en el
momento en el que se forma una fibrina soluble humana, es decir, un
complejo de fibrina-fibrinógeno, por unión de
fibrina desAABB o fibrina desAA y el fibrinógeno, pero no reacciona
con un fibrinógeno humano. Los hibridomas preferidos de la presente
invención segregan el anticuerpo monoclonal (1) o (2).
Se puede producir la reacción de aglutinación
sólo con una fibrina soluble sin producir reacciones de aglutinación
con fibrinógeno, productos de degradación por la plasmina (tales
como fracciones X, Y, D y E) del fibrinógeno, fragmentos de fibrina
(tales como X, Y, D y E), productos de degradación por la plasmina
de fibrina estabilizada, y fibrina desBB en una muestra, por
inmovilización sobre un vehículo insoluble de al menos uno de los
anticuerpos monoclonales anti-fibrina soluble, en
particular, los anticuerpos monoclonales (1) y (2) anteriores, y
poniendo en contacto la muestra con el anticuerpo o anticuerpos
monoclonales. Por lo tanto, estos anticuerpos son útiles como un
reactivo para una determinación inmunológica.
Además, se puede detectar una señal sólo de una
fibrina soluble humana, pero no de fibrinógeno, productos de
degradación por la plasmina (tales como fracciones X, Y, D y E) del
fibrinógeno, fragmentos de fibrina (tales como X, Y, D y E),
productos de degradación por la plasmina de fibrina estabilizada, y
fibrina desBB en una muestra, por inmovilización sobre un vehículo
insoluble de al menos uno de los anticuerpos monoclonales
anti-fibrina soluble, en particular los anticuerpos
monoclonales (1) y (2) anteriores, como un primer anticuerpo,
poniendo en contacto una muestra con el primer anticuerpo
inmovilizado, y después en contacto con un segundo anticuerpo
marcado que son los anticuerpos monoclonales
anti-fibrina soluble, en particular los anticuerpos
monoclonales (1) y (2) anteriores, de un mismo tipo o de diferente
tipo que el primer anticuerpo. Por lo tanto, los anticuerpos son
útiles como un reactivo para una determinación inmunológica.
Por lo tanto, se puede llevar a cabo un
procedimiento de inmunoensayo de la presente invención usando los
anticuerpos monoclonales anti-fibrina soluble de la
presente invención. La muestra usada en el procedimiento de
inmunoensayo de la presente invención no está particularmente
limitada, siempre que tenga la posibilidad de incluir la fibrina
soluble. Los ejemplos de la misma son muestras fisiológicas, en
particular sangre, suero y plasma u orina, en particular plasma. En
el procedimiento del procedimiento de inmunoensayo de la presente
invención, se puede evitar la interferencia del fibrinógeno y las
sustancias relacionadas presentes en la muestra, incluso cuando la
muestra se usa directamente sin tratamiento previo.
En el procedimiento de inmunoensayo según la
presente invención que usa la reacción de aglutinación se puede
usar cualquier vehículo insoluble usado en general en los
procedimientos de determinación inmunológicos que usan la reacción
de aglutinación entre antígenos y anticuerpos, por ejemplo,
partículas de látex (en particular, partículas de látex de
poliestireno). Para inmovilizar los anticuerpos monoclonales de la
presente invención en el vehículo insoluble, se pueden usar
procedimientos conocidos, tales como el procedimiento de unión
química (usando carbodiimida, glutaraldehído, o similares como
agente de reticulación) o procedimientos de adsorción física. Por
lo tanto, se puede producir un complejo del anticuerpo monoclonal y
el vehículo insoluble y usar para el procedimiento de inmunoensayo
de la presente invención.
En el procedimiento inmunológico de
determinación (reacción de aglutinación) de la presente invención se
usan uno o dos de estos anticuerpos monoclonales inmovilizados
sobre el vehículo insoluble anterior. Se pueden usar uno o dos
tipos de complejos anticuerpo-vehículo preparados
por inmovilización de cada uno de los anticuerpos monoclonales
sobre un vehículo insoluble, respectivamente, o se puede usar un
complejo de anticuerpos-vehículo preparado por
inmovilización de dos tipos de anticuerpos monoclonales sobre un
vehículo insoluble. Además, se puede usar una combinación de un
tipo de complejo de anticuerpo-vehículo preparado
por inmovilización de un tipo de anticuerpo monoclonal sobre un
vehículo insoluble y el otro tipo de complejo de
anticuerpo-vehículo preparado por inmovilización de
otro tipo de anticuerpo monoclonal sobre el otro vehículo insoluble.
La reacción de aglutinación se puede medir de forma visual en el
caso de una placa portaobjetos o espectroscópicamente usando una
longitud de onda específica en el caso de una celda de reacción,
para determinar la concentración de la fibrina insoluble en
la
muestra.
muestra.
Específicamente, en el procedimiento
inmunológico de determinación (ensayo de tipo sándwich) de la
presente invención, el anticuerpo monoclonal (1) o (2) se
inmoviliza sobre un vehículo insoluble adecuado para obtener un
anticuerpo inmovilizado. Después, la superficie del vehículo
insoluble se cubre con un agente de bloqueo adecuado, tal como
albúmina de suero bovino (BSA) o albúmina de suero de conejo (RSA)
para evitar una unión no específica del vehículo insoluble y la
muestra. Después, se añade la muestra no diluida y se pone en
contacto con el anticuerpo inmovilizado durante un determinado
periodo de tiempo (por ejemplo, 5 minutos a 3 horas) a una
determinada temperatura (por ejemplo, 4 a 40ºC, preferiblemente
aproximadamente temperatura ambiente) para producir una reacción
(una reacción primaria). Después, se añade un segundo anticuerpo que
es un anticuerpo monoclonal (1) o (2) marcado y se pone en contacto
con la muestra durante un determinado periodo de tiempo (por
ejemplo, 5 minutos a 3 horas) a una determinada temperatura (por
ejemplo, 4 a 40ºC, preferiblemente aproximadamente temperatura
ambiente) para producir una reacción (una reacción secundaria). La
mezcla se lava con un detergente adecuado, tal como una solución
salina fisiológica que contiene tensioactivo, y después se determina
la cantidad de los anticuerpos marcados sobre el vehículo
insoluble. Se puede calcular la cantidad de la fibrina soluble en
la muestra a partir del valor encontrado. También se pueden llevar a
cabo las reacciones primaria y secundaria al mismo tiempo.
El vehículo insoluble que se puede usar en el
procedimiento de tipo sándwich de la presente invención no está
particularmente limitado. Los ejemplos del vehículo son un material
polímero, tal como polietileno, poliestireno, polipropileno,
poli(cloruro de vinilo), poliéster, poliacrilonitrilo,
fluoresceína, dextrano reticulado o polisacárido, o nitrocelulosa,
papel, agarosa y una combinación de los mismos.
Es preferible usar como marcador un enzima,
sustancia fluorescente o fosforescente. Se puede usar una fosfatasa
alcalina, peroxidasa,
\beta-D-galactosidasa como enzima;
isotiocianato de fluoresceína como la sustancia fluorescente; o
éster de acridinio o luciferina como la sustancia fosforescente.
Como antes, se puede diagnosticar la coagulación
intravascular diseminada (CID) que es importante desde un punto de
vista clínico, o controlar con precisión el progreso después del
tratamiento.
La presente invención se ilustrará con más
detalle a continuación, pero no está de ninguna forma limitada por
los siguientes ejemplos.
\vskip1.000000\baselineskip
La fibrina soluble humana usada como inmunógeno
se puede preparar, por ejemplo, según el procedimiento de Remo
Largo y col. [Blood, 47, 991-1002 (1976)].
Más en particular, se disolvió 1 g (peso seco) de fibrinógeno
(Kabi) en 2 litros de solución salina fisiológica que contenía EDTA
al 5%. Después se añadió trombina (50 NIH) y la mezcla se incubó a
37ºC durante 90 minutos. El coágulo de fibrina resultante se lavó
con solución salina fisiológica
(500 ml x 3) por centrifugación. Después, el coágulo de fibrina lavado se disolvió en 20-50 ml de solución de urea 5 M. Después de separar los productos insolubles por centrifugación, la concentración de los monómeros de fibrina se ajustó a 5 mg/ml, y el producto [en lo sucesivo denominado a veces monómero de fibrina soluble (U-FM)] se usó como inmunógeno o reactivo estándar en el inmunoensayo.
(500 ml x 3) por centrifugación. Después, el coágulo de fibrina lavado se disolvió en 20-50 ml de solución de urea 5 M. Después de separar los productos insolubles por centrifugación, la concentración de los monómeros de fibrina se ajustó a 5 mg/ml, y el producto [en lo sucesivo denominado a veces monómero de fibrina soluble (U-FM)] se usó como inmunógeno o reactivo estándar en el inmunoensayo.
Además, el coágulo de fibrina formado por
adición de trombina se dializó con un tampón de acetato 50 mM (pH
3,5) para preparar un monómero de fibrina solubilizado en tampón de
acetato (pH 3,5) [en lo sucesivo denominado a veces el monómero de
fibrina soluble (A-FM)], que se usó para el mismo
propósito.
El monómero de fibrina soluble (A 280 nm = 0,1)
se mezcló con un volumen igual de adyuvante completo de Freund
hasta emulsión, y después se administraron 200 \mul de la mezcla
por vía intraperitoneal a ratones BALB/c para inmunizarlos (primera
inmunización). Después de 30 días, se administraron 200 \mul de la
mezcla mencionada antes por vía intraperitoneal a los ratones
(segunda inmunización). Después de 21 días desde la segunda
inmunización, se administraron 200 \mul de la solución de fibrina
soluble diluida preparada por dilución de solución inmunógeno de
monómero de fibrina soluble (U-FM) (A 280 nm = 0,1)
con un volumen igual de una solución salina fisiológica, por vía
intravenosa a los ratones (inmunización final). Después de 3 días
después de la inmunización final, se sacaron los bazos de forma
aséptica de los ratones para usarlos en la siguiente fusión
celular.
Los bazos sacados de forma aséptica mencionados
antes se pusieron en un disco de laboratorio que contenía 5 ml de
medio DME que contenía suero de ternero fetal al 15%. Después, los
bazos se perfundieron con aproximadamente 15 ml de medio DME que
contenía suero ternero fetal al 15% para hacer salir las células de
bazo. La suspensión de las células de bazo se pasó por una malla de
nailon. Las células del bazo se recogieron en un tubo de
centrifugación de 50 ml y se centrifugaron a 500 x g durante 10
minutos. A los sedimentos resultantes se añadieron 4 ml de solución
de hemólisis (NH_{4}Cl 155 mM, KHCO_{3} 10 mM, Na_{2}EDTA 1
mM; pH 7,0). La suspensión se dejó reposar a 0ºC durante 5 minutos
para la lisis de los glóbulos rojos de la misma. Se añadió un medio
de DME que contenía suero ternero fetal al 15% y la mezcla se
centrifugó. Los sedimentos resultantes se lavaron con medio DME por
el procedimiento de centrifugación y se contó el número de células
de bazo vivas.
Las células de bazo anteriores (1 x 10^{8}) se
añadieron a aproximadamente 2 x 10^{7} células precultivadas de
mieloma de ratón SP2/G-Ag14 (Rikagaku Kenkyusho Gene
Bank), y el conjunto se mezcló bien en un medio de DME, y se
centrifugó (500 x g, 10 minutos). El líquido sobrenadante se aspiró
y se desprendieron los sedimentos. Se añadieron gota a gota 0,5 ml
de solución de polietilenglicol 4000 al 40% (calentado a 38ºC), y
después el tubo de centrifugación se rotó suavemente manualmente
durante 1 min para mezclar así la solución de polietilenglicol con
los sedimentos celulares. Después, se añadió un medio DME calentado
a 38ºC en cantidades de 1 ml cada 30 segundos y el tubo se rotó
suavemente. Después de repetir este procedimiento 10 veces, se
añadieron 20 ml de un medio DME que contenía suero bovino fetal al
15% y se llevó a cabo la centrifugación (500 x g, 10 minutos).
Después de separar el líquido sobrenadante, los
sedimentos celulares se lavaron dos veces por el procedimiento de
centrifugación con un medio HAT (preparado por adición a un medio
DME, de aminopterina, timidina e hipoxantina de modo que sus
concentraciones resultaron 4 x 10^{-7} M, 1,6 x 10^{-5} M y 1 x
10^{-4} M, respectivamente) que contenía suero bovino fetal al
15% y después se suspendió en 40 ml de medio HAT. La suspensión
celular se dividió y se vertió en los pocillos de placas de cultivo
celular de 96 pocillos en una cantidad de 200 \mul, y el cultivo
se inició en un incubador de dióxido de carbono gaseoso que contenía
dióxido de carbono gaseoso al 5% a 37ºC. Durante el cultivo, se
separaron aproximadamente 100 \mul de medio de cada uno de los
pocillos a intervalos de 2 a 3 días y se añadieron 100 \mul de
medio de HAT de nueva aportación para seleccionar los hibridomas
que crecían en el medio de HAT. A partir del día 8, el medio se
sustituyó por un medio de HAT (preparado por adición a un medio de
DME de timidina e hipoxantina, de modo que sus concentraciones
fueran 1,6 x 10^{-5} M y 1 x 10^{-4} M, respectivamente) que
contenía suero bovino fetal al 15% y se observaron los hibridomas.
El día 10, se cribaron los hibridomas que producían anticuerpos
anti-fibrina soluble por el procedimiento ELISA
como se menciona a continuación.
La presencia de anticuerpos producidos en el
líquido sobrenadante del líquido de cultivo del hibridoma se
determinó por el procedimiento ELISA. La solución de inmunógeno de
fibrina soluble (U-FM) (A 280 nm = 0,05, diluida
con solución salina fisiológica) se vertió en los pocillos de placas
ELISA de 96 pocillos (Immulon; Nippon Dynatech K.K.), en una
cantidad de 50 \mul, respectivamente, y se dejó reposar a 25ºC
durante 2 horas. Después, los pocillos se lavaron tres veces con
solución salina fisiológica con Tween 20 al 0,05%, y después se
añadieron 50 \mul del líquido sobrenadante del líquido de cultivo
a los pocillos y la reacción se llevó a cabo a 25ºC durante 1
hora.
Después, se añadieron a los pocillos 50 \mul
de un anticuerpo anti-ratón conjugado con peroxidasa
(Dako Co., Dinamarca) diluido 200 veces con solución salina
fisiológica con Tween 20. Después de completarse la reacción, los
pocillos se lavaron tres veces con solución salina fisiológica con
Tween 20 al 0,05%. Después, se añadieron a los pocillos 250 \mul
de una solución que contenía aminoantipirina 0,5 mM, fenol 10 mM, y
peróxido de hidrógeno al 0,005%, la reacción se llevó a cabo a 25ºC
durante 30 minutos, y se midió la absorción de los pocillos a 490
nm. Como resultado, se observó producción de anticuerpos en tres de
los 192 pocillos. Los hibridomas de los tres pocillos se
transfirieron a una placa de 24 pocillos y se cultivaron durante 4
a 5 días en un medio HAT que contenía suero bovino fetal al 15%.
Después, se confirmó la presencia de los anticuerpos
anti-fibrina soluble producidos por el procedimiento
ELISA, y después se llevó a cabo la clonación por el procedimiento
de dilución limitante. En el procedimiento de dilución limitante, se
vertieron 100 \mul de la suspensión de células diluida con un
medio HT de modo que la concentración de hibridoma resultó de 5
hibridomas/ml en cada uno de los pocillos de la placa de 96
pocillos, en las que se vertieron previamente 2 x 10^{4} células
abdominales de ratones BALB/C normales en cada pocillo. Después de
10 días, se cribaron los clones del hibridoma que producían
anticuerpos específicos anti-fibrina soluble por el
procedimiento ELISA.
Como resultado, se obtuvieron para cada
hibridoma de 20 a 40 clones que producían anticuerpos. A partir de
estos clones, se seleccionaron los estables que presentaban una
fuerte proliferación y una alta capacidad para segregar
anticuerpos, y se volvieron a clonar por el mismo procedimiento
anterior, y se obtuvieron dos hibridomas FM nº 43-1
y FM nº 59-1 que producían anticuerpos
anti-fibrina soluble. Los hibridomas anteriores se
depositaron en el país en el Instituto Japonés de Biociencias y
Tecnología Humana de la Agencia de Ciencia y Tecnología Industrial
[National Institute of Bioscience and Human Technology, Agency of
Industrial Science and Technology] (Dirección: 1-3,
Higashi 1-chome, Tsukuba-shi,
Ibaraki-ken 305, Japón) el 27 de octubre de 1993, y
se transfirieron al depósito internacional el 27 de octubre de 1994.
Los números de depósito internacional (los números entre paréntesis
[ ] después de los números de depósito internacional son los números
de depósito nacionales) son FERMBP-4846
[FERMP-13925] para el hibridoma FM nº
43-1, y FERMBP-4847 [FERMP013926]
para el hibridoma FM nº 59-1. Las reactividades de
los dos anticuerpos monoclonales FM nº 43-1 y FM nº
59-1 segregados de los dos hibridomas anteriores
con fibrinógeno, fragmentos de fibrinógeno X, Y, D y E, fragmentos
de fibrina X, Y, D y E y productos de degradación mediante plasmina
de fibrina estabilizada se examinaron por el procedimiento ELISA
anterior, recubriendo con los anticuerpos anteriores las placas
ELISA de 96 pocillos. En lo sucesivo, el hibridoma FM nº
43-1 se denomina hibridoma FM-1, el
hibridoma FM nº 59-1 se denomina hibridoma
FM-2, el anticuerpo monoclonal FM nº
43-1 se denomina anticuerpo monoclonal
FM-1, el anticuerpo monoclonal FM nº
59-1 se denomina anticuerpo monoclonal
FM-2.
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Se cultivaron hibridomas de ratón
FM-1 y FM-2 respectivamente en medio
de DME que contenía suero bovino fetal al 15% a 37ºC durante 72 a
96 horas en una atmósfera de dióxido de carbono al 5%. Después de
centrifugar los cultivos (10.000 x g, 10 minutos), se añadió
gradualmente sulfato amónico sólido a los líquidos sobrenadantes de
modo que su concentración final era 50%. Las mezclas se enfriaron
con hielo durante 30 minutos, después se dejaron reposar durante 60
minutos y después se centrifugaron (10.000 x g, 10 minutos). Los
residuos se disolvieron en una cantidad pequeña de un tampón de
fosfato 10 mM (pH 8,0) y se aplicaron a una columna de
DEAE-celulosa que se había equilibrado con una
cantidad de 1000 veces de tampón de fosfato 10 mM. Los anticuerpos
monoclonales se eluyeron por el procedimiento de gradiente de
densidad desde tampón de fosfato 10 mM (pH 8,0) a un tampón de
fosfato 10 mM (pH 8,0) que contenía NaCl 0,2 M. Los anticuerpos
monoclonales eluidos se concentraron por el procedimiento de
ultrafiltración y se dializaron a un tampón de fosfato 0,1 M (pH
8,0). Para separar la IgG de suero bovino, los productos dializados
se pasaron por columnas de IgG de anti-suero bovino
de cabra-Sepharosa 4B. Después, las soluciones
pasadas se cargaron en columnas de proteína
A-Sefarosa 4B equilibradas con un tampón de fosfato
0,1 M (pH 8,0). Las columnas se eluyeron con un tampón (pH 3,5) para
obtener la solución del anticuerpo monoclonal específico
anti-FM purificado FM-1 y de la
misma forma el anticuerpo monoclonal FM-2.
Se administró pristano
(2,6,10,14-tetrametilpentadecano) (0,5 ml) por vía
intraperitoneal a ratones BALB/c de 10 a 12 semanas de edad.
Después de 14 a 20 días, se inoculó hibridoma FM-1 o
FM-2 hecho proliferar in vitro, en las cavidades
abdominales de los ratones en una cantidad de 2 x 10^{6}
células/ratón.
Se obtuvieron aproximadamente 10 a 15 ml de
ascitis de un ratón para cada uno de los hibridomas. Las
concentraciones de los anticuerpos eran 2 a 10 mg/ml. La
purificación de los anticuerpos monoclonales de la ascitis se llevó
a cabo por el mismo procedimiento que el de la purificación in
vitro (no obstante, excepto la etapa de pasar por una columna
de IgG de anti-suero bovino de
cabra-Sefarosa).
\vskip1.000000\baselineskip
La clase de inmunoglobulina y la especificidad
de los anticuerpos monoclonales específicos anti-FM,
FM-1 y FM-2, se examinaron por el
procedimiento de inmunodifusión Ouchterlony, y el procedimiento de
inmunoensayo enzimático, respectivamente. La clase de
inmunoglobulina de los anticuerpos monoclonales específicos
anti-FM,
FM-1 y FM-2, era IgG_{2}a, respectivamente. Los resultados se muestran en la Tabla 1.
FM-1 y FM-2, era IgG_{2}a, respectivamente. Los resultados se muestran en la Tabla 1.
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\vskip1.000000\baselineskip
(Tabla pasa a página
siguiente)
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\newpage
En la Tabla 1, se examinó la reactividad de cada
anticuerpo monoclonal por recubrimiento directo con cada antígeno
de la placa ELISA de 96 pocillos. El símbolo "+" significa que
se observó la reacción en ELISA, mientras que el símbolo "-"
significa que la reacción no se observó en ELISA. Se muestran las
secuencias de aminoácidos del péptido de la cadena A\alpha
17-26, del péptido de la cadena B\beta
15-24 y del péptido de la cadena \gamma
312-324 con la expresión de una letra. Los tres
péptidos anteriores usados están disponibles en el comercio
(Peputido Kenkyujo).
(a) Se recubrió con cada antígeno la placa ELISA
de 96 pocillos, después de solubilizar con urea 5 M.
(b) Se recubrió con cada antígeno la placa ELISA
de 96 pocillos, después de solubilizar con tampón de acetato 50 mM
(pH 3,5).
Se recubrió con los antígenos sin el marcador
(a) o (b) la placa ELISA de 96 pocillos, después de disolver en
tampón de tris-HCl 0,1 M (pH 8,0).
Además, los fragmentos de fibrinógeno X, Y, E,
Dcate, Degte y dímero D no reaccionaron con el anticuerpo monoclonal
FM-1 ni FM-2, incluso después de
tratamiento con urea 5 M. Sin embargo, los fragmentos de fibrina X,
Y y E se hicieron reactivos con los anticuerpos monoclonales
FM-1 y FM-2, después de tratamiento
con urea 5 M. Los anticuerpos monoclonales FM-1 y
FM-2 no reaccionan con la cadena A\alpha
(1-625) tratada con urea 5 M de fibrinógeno, cadena
A\alpha (1-208) del fragmento X de fibrinógeno o
cadena A\alpha (1-78) del fragmento E de
fibrinógeno, pero reacciona con la cadena A\alpha
(17-625) tratada con urea 5 M del monómero de
fibrina, cadena A\alpha (17-208) del monómero X,
y cadena A\alpha (17-78) del fragmento de fibrina
E.
Los resultados anteriores sugieren que el
epítopo que los anticuerpos monoclonales anteriores
FM-1 y FM-2 reconocen existe en el
dominio E, en concreto, el epítopo existe en el dominio E tratado
con urea en el que son liberados el fibrinopéptido A o los
fibrinopéptidos A y B. Más en particular, los resultados muestran
que los anticuerpos monoclonales anteriores reconocen la cadena
A\alpha (17-78) del dominio E, en concreto la
cadena A\alpha (17-78) del dominio E en el que son
liberados el fibrinopéptido A o los fibrinopéptidos A y B, y se
tratan con urea.
\vskip1.000000\baselineskip
Una solución (2 ml) que contenía el anticuerpo
monoclonal FM-1 (2,0 mg/ml) y una solución de látex
(2 ml) (poliestireno al 2%, Dow Chemical Co.: tamaño de partículas
= 0,482 \mum) se mezclaron entre sí y se agitaron durante
aproximadamente 1 hora. La mezcla se centrifugó (20.000 x g, 10
minutos) y después el precipitado se suspendió en una solución de
BSA al 0,1% y se agitó durante aproximadamente 1 hora. La suspensión
resultante se volvió a centrifugar (20.000 x g, 10 minutos), y
después el precipitado se suspendió en tampón de
tris-HCl 0,1 M (pH 8,0) y se agitó durante
aproximadamente 2 horas. Así se obtuvo un líquido que contenía un
anticuerpo monoclonal
FM-1/complejo de látex. De la misma forma, se usó el anticuerpo monoclonal FM-2 para preparar el líquido que contenía complejo de un anticuerpo monoclonal FM-2/complejo de látex.
FM-1/complejo de látex. De la misma forma, se usó el anticuerpo monoclonal FM-2 para preparar el líquido que contenía complejo de un anticuerpo monoclonal FM-2/complejo de látex.
El complejo de la mezcla de los anticuerpos
monoclonales con el látex se preparó como sigue: se mezclaron 2 ml
de solución acuosa que contenía 0,66 mg/ml de cada uno de los
anticuerpos monoclonales FM-1 y
FM-2, con 2 ml de solución de látex (poliestireno
al 2%, Dow Chemical Co.: tamaño de partículas = 0,482 \mum) y la
mezcla se agitó durante aproximadamente 1 hora. Después, la mezcla
se trató de la misma forma que antes para preparar el complejo de
anticuerpo monoclonal FM-1/anticuerpo monoclonal
FM-2/látex.
Se repitió el mismo procedimiento, excepto que
se mezcló una solución acuosa que contenía 1 mg/ml de cada uno del
anticuerpo monoclonal FM-1 y anticuerpo monoclonal
FM-2 en una cantidad igual de una solución de látex,
para preparar un complejo de anticuerpo monoclonal
FM-1/anticuerpo monoclonal FM2/látex.
\vskip1.000000\baselineskip
La solución que contenía complejo de
anticuerpo-látex (40 \mul) preparada en el Ejemplo
4 y soluciones acuosas (15 \mul) que contenían diferentes
concentraciones del monómero de fibrina solubilizado en urea se
mezclaron en un portaobjetos de vidrio y se hicieron oscilar.
Después de 3 minutos, se examinó visualmente la aglutinación. Los
resultados se muestran en la Tabla 2. Se usó tampón de
tris-HCl 0,1 M (pH 8,0) que contenía urea 5 M para
la dilución.
En la Tabla 2, "+" significa que hay
aglutinación, mientras que "-" significa que no hay
aglutinación. Además, en la columna de complejo de anticuerpo/látex
en la Tabla 2, el tipo de complejo se expresa por el anticuerpo
monoclonal que se une con el complejo. Por lo tanto, por ejemplo,
FM-1 significa un complejo de anticuerpo
monoclonal
FM-1/látex y FM-1+FM-2 significa una mezcla de cantidades iguales de un complejo de anticuerpo monoclonal
FM-1/látex y un complejo de anticuerpo monoclonal FM-2/látex. Además, FM-1/FM-2 significa un complejo de anticuerpo monoclonal FM-1/anticuerpo monoclonal FM-2/látex.
FM-1/látex y FM-1+FM-2 significa una mezcla de cantidades iguales de un complejo de anticuerpo monoclonal
FM-1/látex y un complejo de anticuerpo monoclonal FM-2/látex. Además, FM-1/FM-2 significa un complejo de anticuerpo monoclonal FM-1/anticuerpo monoclonal FM-2/látex.
Se midieron las concentraciones de fibrina
soluble en cinco muestras (plasma de persona sana A, persona sana
B, paciente de CID C, paciente de CID D y paciente de CID E) usando
la solución de complejo de anticuerpo monoclonal
FM-1/látex del Ejemplo 5. Después se añadió monómero
de fibrina solubilizado en urea y purificado 2 \mug/ml, 4
\mug/ml y 16 \mug/ml, a las muestras y se llevaron a cabo los
ensayos de recuperación. Los valores de las mediciones se
obtuvieron de forma semicuantitativa de la serie de diluciones de la
muestra eliminando la aglutinación. Como se muestra en la Tabla 3,
se observó una buena recuperación. Además, se añadió monómero de
fibrina solubilizado con ácido y purificado 2 \mug/ml, 4 \mug/ml
y 16 \mug/ml a las muestras y se llevaron a cabo los ensayos de
recuperación para obtener resultados similares a los del
procedimiento anterior.
La solución de complejo de anticuerpo monoclonal
FM-1/látex usada en el Ejemplo 6 se usó para medir
las cantidades de fibrina soluble de 12 muestras de plasma de
personas sanas y 15 muestras de plasma de pacientes de CID. Los
resultados se muestran en la figura 1. La cantidad de fibrina
soluble de las personas sanas era menor que 2 \mug/ml en todos
los casos. Al contrario, el valor para los pacientes de CID era
aproximadamente 32 \mug/ml en todos los casos.
Se preparó un líquido con anticuerpo a partir
del anticuerpo monoclonal FM-1 y solución salina
fisiológica tamponada con fosfato 50 mM (pH 7,5) de modo que la
concentración de proteína en la fracción de IgG del anticuerpo
monoclonal FM-1 se hizo 5 \mug/ml. El líquido con
anticuerpo se vertió en cada uno de los pocillos de la placa ELISA
de 96 pocillos (Immunlon; Nippon Dynatech K.K) en una cantidad de 50
\mul, respectivamente, y se dejó reposar a 4ºC durante 24
horas.
La fracción de IgG del anticuerpo monoclonal
FM-2 se marcó con peroxidasa de rábano picante (HRP)
para obtener el anticuerpo marcado.
La placa ELISA de 96 pocillos que llevaba el
anticuerpo monoclonal FM-1 inmovilizado preparado en
(a) se lavó tres veces con solución salina fisiológica con Tween 20
al 0,05%. Se vertió en los pocillos el plasma normal (50 \mul)
que contenía 40 \mug/ml, 20 \mug/ml, 10 \mug/ml, 5 \mug/ml,
2 \mug/ml, 1 \mug/ml o 0,5 \mug/ml del monómero de fibrina
solubilizado en urea obtenido en el Ejemplo 1(a), y la
reacción se llevó a cabo a 25ºC durante 10 minutos. La placa se
lavó tres veces con solución salina fisiológica con Tween 20 al
0,05%. Después, se añadieron a los pocillos 50 \mul de una
solución del anticuerpo monoclonal FM-2 marcado con
peroxidasa de rábano picante (HRP) preparado en (b) en solución
salina fisiológica con Tween 20 al 0,05% (pH 7,5) y la reacción se
llevó a cabo a 25ºC durante 10 minutos. Después de lavar la placa
tres veces con solución salina fisiológica con Tween 20 al 0,05%,
se añadieron a cada pocillo 200 \mul de una solución de sustrato
de HRP (tampón de fosfato 50 mM que contenía aminoantipirina 0,5 mM,
fenol 10 mM, peróxido acuoso al 0,005%; pH 7,5) y la reacción se
llevó a cabo a 25ºC durante 10 minutos. Se midió la absorción de
cada pocillo a 490 nm. La curva patrón resultante se muestra en la
figura 2. Cuando se usó el plasma normal que contenía 40 \mug/ml,
20 \mug/ml, 10 \mug/ml, 5 \mug/ml, 2 \mug/ml, 1 \mug/ml o
0,5 \mug/ml del monómero de fibrina solubilizado en acetato, se
obtuvieron los mismos resultados.
Se añadió el monómero de fibrina desAABB
solubilizado en acetato al plasma normal de modo que la
concentración se hizo 200 \mug/ml, y el conjunto se incubó a 37ºC
durante 30 minutos. El reactivo resultante se diluyó con tampón de
HCl-tris 50 mM (pH 8,0) que contenía NaCl 0,15 M a
4 veces su volumen. El reactivo diluido se cargó en la columna de
Sephacryl S-300 (Pharma; Suecia) equilibrada con el
mismo tampón, y se trató por cromatografía de exclusión molecular.
Se midió la concentración de proteína y fibrina soluble en las
fracciones eluidas. La fibrina soluble se midió de la misma forma
que en el Ejemplo 8. La figura 3 ilustra el patrón del cromatograma
y la actividad de la fibrina soluble.
La actividad máxima de la fibrina soluble se
produce con el peso molecular entre 900.000 y 2.000.000. Esto
significa que el monómero de fibrina desAABB solubilizado en acetato
se une al fibrinógeno para formar el complejo de
fibrina-fibrinógeno. Los resultados del Ejemplo 3
muestran que cada uno de los anticuerpos monoclonales específicos
anti-FM, FM-1 y
FM-2, no reaccionan con el monómero de fibrina
solubilizado en acetato. Además, los resultados del Ejemplo 9
muestran que cuando el complejo de
fibrina-fibrinógeno se forma por unión del monómero
de fibrina solubilizado en acetato con fibrinógeno, los anticuerpos
monoclonales específicos anti-FM,
FM-1 y FM-2, reaccionan con el
complejo. En otras palabras, como se muestra esquemáticamente en la
figura 4, cuando el monómero de fibrina solubilizado en acetato (=
monómero de fibrina en la figura 4) se une con el fibrinógeno para
formar el complejo de fibrina-fibrinógeno, hay un
epítopo recién expuesto (= neoantígeno) que reacciona con los
anticuerpos monoclonales específicos anti-FM,
FM-1 y FM-2. El "monómero de
fibrina" anterior significa una fibrina que está presente en
forma de un monómero. El monómero de fibrina está presente in
vivo de forma transitoria, y se puede convertir con un ácido
in vitro sin desnaturalización. Estos se llaman en general
monómeros de fibrina.
A partir de los resultados anteriores, se puede
confirmar que los anticuerpos monoclonales de la presente invención
reaccionan con el neoantígeno recién expuesto en una molécula de
fibrina en el momento en que se forma un complejo de
fibrina-fibrinógeno por la unión de la fibrina desAA
o fibrina desAABB y el fibrinógeno.
Mediante los anticuerpos monoclonales de la
presente invención, se puede determinar de forma específica, fácil
y rápida la cantidad de fibrina soluble en el plasma del paciente,
incluso en forma de complejo de fibrina cuando se une con el
fibrinógeno, mediante un procedimiento de aglutinación o EIA, sin
que se vea afectado por el fibrinógeno, los productos de
degradación del fibrinógeno por la plasmina, las fracciones X, Y, D
y E, los fragmentos de fibrina X, Y, D y E, y los productos de
degradación de la por la plasmina fibrina estabilizada presentes en
el plasma, incluso sin tratamiento previo de la muestra de plasma.
Esto es posible mediante la presente invención. Por consiguiente,
la presente invención proporciona un medio útil para el diagnóstico
y la investigación clínica del CID o similar.
Como antes, la presente invención se ha
explicado con referencia a realizaciones particulares, pero en el
alcance de la presente invención se incluyen modificaciones y
mejoras obvias para los expertos en la técnica.
Claims (13)
1. Un anticuerpo monoclonal que reacciona con la
fibrina soluble humana en un neoantígeno que se expone de nuevo en
una molécula de fibrina en el momento en el que se forma un complejo
de fibrina-fibrinógeno por unión de la fibrina
desAABB o fibrina desAA y fibrinógeno, pero que no reacciona con el
fibrinógeno humano, en el que existe un epítopo reconocido por
dicho anticuerpo monoclonal en la cadena A\alpha
(17-78) del dominio E en el que se han liberado el
fibrinopéptido A o fibrinopéptidos A y B, y dicho anticuerpo
monoclonal se une a la fibrina soluble humana no tratada
previamente con un agente desnaturalizante de proteínas.
2. Un anticuerpo monoclonal según la
reivindicación 1, que reacciona específicamente con la fibrina
desAABB tratada con urea, un producto de degradación por la
plasmina de la fibrina estabilizada tratado con urea, y un
fragmento de fibrina tratado con urea, pero que no reacciona con el
fibrinógeno tratado con urea, un producto de degradación del
fibrinógeno mediante plasmina tratado con urea, fibrina desAA
tratada con urea ni con fibrina desBB tratada con urea.
3. Un anticuerpo monoclonal según la
reivindicación 2, en el que la reacción con dicha fibrina desAABB
tratada con urea no es inhibida por un péptido de los aminoácidos
17º a 26º en la secuencia de aminoácidos de la cadena A\alpha del
fibrinógeno y un péptido de los aminoácidos 15º a 24º en la
secuencia de aminoácidos de la cadena B\beta del fibrinógeno.
4. Un anticuerpo monoclonal según la
reivindicación 3, en el que la reacción con dicha fibrina desAABB
tratada con urea no es inhibida por un péptido de los aminoácidos
312º a 324º de la secuencia de aminoácidos de la cadena \gamma
del fibrinógeno.
5. Un anticuerpo monoclonal según la
reivindicación 1, que reacciona específicamente con la fibrina desAA
tratada con urea, fibrina desAABB tratada con urea, un producto de
degradación por la plasmita de la fibrina estabilizada tratado con
urea y un fragmento de fibrina tratado con urea, pero no reacciona
con el fibrinógeno tratado con urea, un producto de degradación por
la plasmita del fibrinógeno tratado con urea ni con la fibrina
desBB tratada con urea.
6. Un anticuerpo monoclonal según la
reivindicación 5, en el que la reacción con dicha fibrina desAA
tratada con urea y dicha fibrina desAABB tratada con urea no es
inhibida por un péptido de los aminoácidos 17º a 26º de la
secuencia de aminoácidos de la cadena A\alpha del fibrinógeno y un
péptido de los aminoácidos 15º a 24º de la secuencia de aminoácidos
de la cadena B\beta de fibrinógeno.
7. Un anticuerpo monoclonal según la
reivindicación 5, en el que la reacción con dicha fibrina desAA
tratada con urea y dicha fibrina desAABB tratada con urea no es
inhibida por un péptido de los aminoácidos 312º a 324º de la
secuencia de aminoácidos de la cadena \gamma del fibrinógeno.
8. Un hibridoma caracterizado por
segregar el anticuerpo monoclonal según una cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 7.
9. Un procedimiento de ensayo de la fibrina
soluble humana, caracterizado por poner en contacto una
muestra con el anticuerpo monoclonal según una cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 7 inmovilizado sobre un vehículo insoluble, y
observar la aglutinación.
10. Un procedimiento según la reivindicación 9,
en el que se usa al menos uno de los anticuerpos monoclonales según
las reivindicaciones 2 a 5.
11. Un procedimiento de ensayo inmunológico de
la fibrina soluble humana, caracterizado por inmovilizar un
anticuerpo monoclonal según una cualquiera de las reivindicaciones 1
a 7 sobre un vehículo insoluble como un primer anticuerpo, poner
una muestra en contacto con dicho primer anticuerpo y después con un
segundo anticuerpo marcado que es un anticuerpo de la misma clase o
de una clase diferente del anticuerpo según una cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 7, y detectar una señal de dicho marcador de
dicho segundo anticuerpo unido con el primer anticuerpo
anti-fibrina soluble humana inmovilizado.
12. Un procedimiento según la reivindicación 11,
en el que el anticuerpo monoclonal según la reivindicación 2 ó 5 se
usa como primer anticuerpo, y se usa el anticuerpo monoclonal según
la reivindicación 5 ó 2 como dicho segundo anticuerpo.
13. Un procedimiento para diagnosticar la
coagulación intravascular diseminada que comprende detectar la
fibrina soluble en una muestra biológica por un procedimiento según
una cualquiera de las reivindicaciones 9 a 12.
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