JPH04228088A - 血小板因子４の生物学的作用を阻害するモノクローナル抗体 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【産業上の利用分野】本発明は、ＩｇＧクラスに属し、
ヒトおよびウサギ起源の血小板因子４（ＰＦ４）に特異
的であり、ＰＦ４の生物学的作用を選択的に遮断（ブロ
ック）する性質を有し、血小板系の他のあらゆるタンパ
ク質と相互作用することのない新規なモノクローナル抗
体、該モノクローナル抗体を産生するハイブリドーマ、
該モノクローナル抗体の製造方法、および該モノクロー
ナル抗体を有効成分として含有する医薬組成物に関する
。

【０００２】

【従来の技術】静脈および動脈における血栓の形成は、
患者を重大な結果に導く病理学的過程である。特に、動
脈血栓は冠状動脈、脳および末梢の虚血性病変の主な原
因である。危険性の高い状況下において薬理学的介入に
より動脈血栓を防止することの可能性が、長い間、種々
の薬物を用いて調べられており、実験および臨床の両分
野で重要な結果が得られている。ヘパリンおよび経口の
抗凝固薬が静脈血栓に対して最も広く用いられている薬
物であり、一方、動脈血栓に対してはこれまで血小板凝
集を阻害することができる薬物が最も多く用いられてい
る。アセチルサリチル酸およびチクロピジンが最も広範
に研究されている化合物であり、その作用が最も明解に
記載されている［Ｓｔｅｉｎら，Ｊ．Ａｍ．Ｃｏｌｌ．
Ｃａｒｄｉｏｌ．　１４，８１３−３６（１９８９）］
。

【０００３】最近の数年で、動脈血栓の病因におけるト
ロンビンの役割が新たな角度から評価され、その結果、
動脈においてこのプロテアーゼを阻害することができる
薬物の使用も再考されている。動脈血栓形成の危険の状
況下でヘパリンが臨床的に有効であることが観察され［
Ｔｈｅｒｏｕｘら，Ｎ．Ｅｎｇｌ．Ｊ．Ｍｅｄ．　３１
９，１１０５−１１（１９８８）；Ｎｅｒｉ　Ｓｅｒｎ
ｅｒｉら，Ｌａｎｃｅｔ　３３５，６１５−１８（１９
９０）］、特異的なトロンビン拮抗物質の作用が実験的
に研究されている。特に、トロンビンおよび天然起源の
タンパク質（ヒルジンなど）の活性部位を遮断すること
ができる小さなペプチドが、実験的な動脈血栓形成の防
止に活性であることがわかった［Ｈｅｒａｓら，Ｃｉｒ
ｃｕｌａｔｉｏｎ　７９，６５７−６５（１９８９）；
ＦｉｔｚｇｅｒａｌｄおよびＦｉｔｚｇｅｒａｌｄ，Ｐ
ｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ　８６，
７５８５−８９（１９８９）；Ｅｉｄｔら，Ｊ．Ｃｌｉ
ｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．　８４，１８−２７（１９８９）］
。しかし、ペプチド型物質の使用は選択的なトロンビン
遮断物質を用いる上記の実験に限られるものではなく、
血栓形成過程の別の選択的標的にも広げられている。血
小板凝集過程の最後の段階は、フィブリノーゲンがその
特異的な受容体［細胞活性化の後に血小板表面で発現さ
れる糖タンパク質ＩＩｂ−ＩＩＩａ（ＧＰ　ＩＩｂ−Ｉ
ＩＩａ）］の１つに結合することであることが周知であ
る。フィブリノーゲンとＧＰ　ＩＩｂ−ＩＩＩａの相互
作用は、特異的なモノクローナル抗体によって、または
受容体の特異的なドメインと相互作用することができる
ペプチド、特にＲＧＤ配列を含有するペプチドによって
遮断することができる［Ｒｕｇｇｅｒｉ，Ｃｉｒｃｕｌ
ａｔｉｏｎ　８０，１９２０−２２（１９８９）；Ｆｉ
ｔｚｇｅｒａｌｄ，Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ　８０，１
９１８−１９（１９８９）］。抗体およびペプチドの両
方に関するこの種の技術的進歩は、動脈血栓形成の実験
モデルにおいて、閉塞の防止における重要な薬理学的結
果を得ることを可能にした［Ｈｅｎｋｅｌら，Ｃｉｒｃ
ｕｌａｔｉｏｎ　８０，１７７５−８２（１９８９）；
Ｃｏｌｌｅｒら，Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ　８０，１７
６６−７４（１９８９）；Ｃａｄｒｏｙら，Ｊ．Ｃｌｉ
ｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．　８４，９３９−４４（１９８９）
］。

【０００４】

【発明が解決しようとする課題】本発明は、血小板因子
４（ＰＦ４）に特異的であり、他のあらゆるタンパク質
と交差反応することなく、特に血小板系に関与している
他のあらゆるタンパク質と交差反応することなくＰＦ４
の生物学的作用を遮断する新規なモノクローナル抗体に
関する。この抗体は診断および治療の両目的に有用であ
る。

【０００５】診断用には、抗ＰＦ４抗体をインビボで生
成したＰＦ４ペプチドの性質または量を調べるための試
験キットに利用することができ、これが臨床的に有用な
情報を与える。このような試験キットの１つは、血清試
料中のＰＦ４量を測定するために利用される競争反応機
序を確かめるために、および標準曲線を作成するために
ＥＬＩＳＡ試験で使用される一定量のＰＦ４と一定量の
凍結乾燥した抗ＰＦ４ＭＡｂを含有する。

【０００６】また、本発明の抗ＰＦ４　ＭＡｂを、通常
および既知のサンドイッチ免疫検定法およびＲＩＡ法に
利用することができ、ここでは抗ＰＦ４　ＭＡｂをＰＦ
４ペプチドへの特異的結合のための抗体として利用する
。

【０００７】さらに、抗ＰＦ４抗体は、ＰＦ４へのその
特異的な結合の故に、血清試料からＰＦ４を除去および
／または精製するのに利用することができる。例えば、
このような除去を行うために血液透析を用いることがで
き、ここでは抗ＰＦ４　ＭＡｂをガラスビーズなどの固
体支持体に固定化する。次いで、この抗体−固体支持体
コンプレックスを、血液透析チャンバー内の、血液が患
者に戻る前のチャンバー中の位置に設置する。従って、
血液透析中に血液が固定化ＭＡｂと接触するように血液
透析チャンバーに血液を通すと、血液が患者の循環系に
戻る前に血液のＰＦ４が浄化される。この精製は、例え
ば米国特許Ｎｏ．４，３６１，５０９またはＲｅ．３２
，０１１に記載されているような系であってもよい。

【０００８】治療の目的には、本発明の抗ＰＦ４　ＭＡ
ｂを生理学的に許容しうる担体または希釈剤と混合し、
十分量のＰＦ４を生物学的に不活性化およびこれと結合
するに十分な量で患者に投与して血栓形成を治療または
防止することができる。

【０００９】本発明の抗ＰＦ４　ＭＡｂの別の治療用途
は傷治癒の分野であり、ここでは本ＭＡｂを他の既知の
傷治癒組成物と混合してＰＦ４の抗脈管形成作用を阻害
することができる。

【００１０】

【課題を解決するための手段】動脈レベルでの血栓形成
過程における血小板およびトロンビンの重要性は、血管
壁との相互作用を調節することが血管閉塞を防止する際
に極めて重要でありうることを示唆する。血小板活性化
の過程で、夥しい変調物質が血小板顆粒から放出される
。特に、分子量が約８０００ダルトンであり、血小板因
子４（ＰＦ４）として知られているタンパク質がα−顆
粒から血漿中に放出される。抗ヘパリン作用を別にして
も、このタンパク質は他の重要な生物学的活性、例えば
血管内皮に対する高い親和性、化学走性、免疫学的変調
および脈管形成過程の調節などの活性を保持している［
Ｄｅｕｅｌら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ
．ＵＳＡ　７８，４５８４−４５８７（１９８１）；Ｐ
ｒｏｓｄｏｃｉｍｉら，Ｔｈｒｏｍｂ．Ｈａｅｍｏｓｔ
．　５２，１５７−１５９（１９８４）；Ｎｉｅｗｉａ
ｒｏｗｓｋｉ　Ｓ．およびＨｏｌｔ　Ｊ．Ｃ．，「血小
板：生理学および薬理学」，ｐｐ．４９−８３，Ｌｏｎ
ｇｅｎｅｃｋｅｒＧ．Ｌ．編，Ａｃａｄｅｍｉｃ　Ｐｒ
ｅｓｓ，Ｏｒｌａｎｄｏ（１９８５）；Ｚｕｃｋｅｒら
，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ　８
６，７５７１−７５７４（１９８９）；Ｍａｉｏｎｅら
，Ｓｃｉｅｎｃｅ　２４７，７７−７９（１９９０）］
。これに基づくと、血小板凝集と凝固過程が血栓形成現
象に関与しており、鍵となる因子は恐らくはトロンビン
の局所放出であり、これが一層の血小板凝集とフィブリ
ンの生成の両方を刺激することができ、白血球が内皮に
付着するのを助けることができるのであろう。トロンビ
ンのプロテアーゼ活性は、血漿中に存在する天然の拮抗
物質である抗トロンビンＩＩＩによって遮断される。ト
ロンビンと抗トロンビンＩＩＩ活性の間の平衡の重要性
は、血漿中での後者のその活性相での濃度が血栓形成性
疾患の開始に逆比例するという事実によって高まった。

【００１１】さらに、ヘパリンの抗凝固作用は、抗トロ
ンビンＩＩＩとの結合と、その後の後者の構造的立体配
座における変調の誘導によって介されていることが広く
知られている。これが、プロテアーゼの不活性化を伴う
トロンビン／抗トロンビンＩＩＩコンプレックスの生成
速度の増加を導く。

【００１２】ヘパリンは実際には治療学的処置の結果と
してのみ循環中に存在するので、この作用は生理学的な
効果を有さないはずである。しかし、これらの報告され
た事実は、血管内皮表面のヘパリン様活性の存在を示す
最近得られた証拠に鑑みて、特に重要であると考えられ
る。従って、このような物質はヘパリンと同様、インビ
ボでトロンビン／抗トロンビンＩＩＩコンプレックスの
生成を加速し、血管壁の抗凝固の性質の原因となりうる
。

【００１３】「放出反応」の間に、活性化された血小板
は血小板因子４またはＰＦ４として知られているタンパ
ク質因子を分泌し、これがヘパリン−抗トロンビンＩＩ
Ｉ−トロンビンの３つの組に影響を与えることができる
。 実際のところ、ＰＦ４は高親和性の部位を通してヘパリ
ン分子に結合することができ、抗トロンビンＩＩＩとト
ロンビンの間の結合を妨げることができる。これらの条
件においては、プロテアーゼが主として凝固状態の増大
を生じることによって作用するのが自由である。従って
、血小板は、ＰＦ４の分泌により血管壁の抗凝固の強さ
を変調することができる。

【００１４】興味ある最近の研究［Ｒｕｏｓｌａｈｔｉ
．Ｅ．ら，Ｃｅｌｌ　６４，８６７−８６９（１９９１
）］により、プロテオグリカンとの関係においてもＰＦ
４の役割の重要性が確認され（成長因子活性の変調物質
として記載されている）、また、以下を含む他の重要な
生物学的活性が血小板因子４に起因するものと考えるこ
とができる：・血小板それ自体においてＰＦ４の高親和
性受容体の存在が証明されたことは、細胞−細胞相互作
用の調節におけるこの因子による介在を示唆する。実際
、この受容体の活性化によって、トロンビン、ＡＤＰお
よびアラキドン酸などの凝集物質に対する血小板の感度
の増大が導かれる［Ｃａｐｉｔａｎｉｏら，Ｂｉｏｃｈ
ｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ．　８３９，１６１−
７３（１９８５）］；・ＰＦ４が白血球系列の一部の細
胞（例えば、好中球および単球）に対して走化性である
ことを示す証拠は、特にアテローム性動脈硬化症の過程
における主要かつ重要な役割を単球および血小板のせい
とする最近の理論に照らして、興味ある推論の新しい根
拠を与える。

【００１５】簡単なものではあるがこれらの考察は、血
栓形成過程においてだけではなくＰＦ４の中心的な生物
学的役割の仮説を正当化するのに十分である。従って、
ＰＦ４の生物学的効果を徹底的に研究するため、および
血栓形成病変を治療するための全く新規な薬物を開発す
るために、ＰＦ４の生物学的活性を選択的に遮断するこ
とができる試薬が必要とされている（これらの試薬を用
いて、ＰＦ４が活性である状況下、インビボでＰＦ４を
遮断する）。これらの試薬が、他の生物学的成分と相互
作用することなくＰＦ４を選択的に遮断し、この遮断試
薬が除去されたときにはその生物学的活性を回復させる
ものでなければならないことは明らかである。

【００１６】最近、ＰＦ４の他の生物学的活性にも関心
が向けられている。事実、大きな努力がＰＦ４を抗転移
物質［Ｓｈａｒｐｅ　Ｒ．Ｊ．ら，Ｊ．Ｎａｔｌ．Ｃａ
ｎｃｅｒ　Ｉｎｓｔ．　８２，８４８−８５３（１９９
０）］および免疫刺激物質［Ｚｕｃｋｅｒ　Ｍ．Ｂ．ら
，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ　８
６，７５７１−７５７４（１９８９）］として展開する
ために為されている。この抗転移活性は、内皮細胞増殖
速度の減少による抗脈管形成作用の点で説明されていた
［Ｍａｉｏｎｅ　Ｔ．Ｅ．ら，Ｓｃｉｅｎｃｅ　２４７
，７７−７９（１９９０）］。

【００１７】従って、本発明の目的の１つは、ＰＦ４の
生物学的活性を選択的に遮断して、例えばＰＦ４がヘパ
リンの作用を遮断するのを妨げることができるモノクロ
ーナル抗体（ＭＡｂ）などの特異的な免疫学的試薬を得
ることである。

【００１８】本発明の別の目的は、ＰＦ４の抗脈管形成
作用を遮断することができるＭＡｂを提供することであ
る。このタンパク質は活性化された血小板から放出され
るので、血小板の局所的な活性化（ＰＦ４を放出する）
は内皮細胞の増殖および脈管形成を遅くすることができ
る。従って、本発明の抗ＰＦ４　ＭＡｂのような薬物は
ＰＦ４の抗脈管形成活性を遮断するのに有用であり、そ
れによって内皮細胞の増殖および脈管形成を持続および
促進する。この目的を達成するため、本発明の抗ＰＦ４
　ＭＡｂを、薬学的に許容しうる担体または希釈剤との
医薬組成物の形態で、また好ましくは皮膚または経皮組
成物として、所望により他の既知の傷治癒組成物および
薬物［例えば、表皮成長因子（ＥＧＦ）、ヒアルロン酸
など］との医薬組成物の形態で投与する。

【００１９】調製するＭＡｂの選択は本質的に次のこと
と関係している。即ち、これらが特異的な試薬であるこ
と、およびこれらを得る技術的手段がポリクローナル抗
体の使用に関連する問題、例えば ａ．免疫した動物の間の、また、同じ動物から採取した
試料の間の抗体反応に均一性が欠けていること；ｂ．Ｐ
Ｆ４調製物に通常存在する他のタンパク質との交差反応
を排除するために純度の高い免疫原を大量に必要とする
こと；および ｃ．抗体調製物を投与された生物において免疫反応を起
こす可能性が比較的大きいこと；を回避することである
。

【００２０】本発明は、以下に挙げる目的物を得ること
を可能にするものである： （１）次の特徴： ａ）約１４０〜１６０キロダルトンの分子量；ｂ）他の
ウサギまたはヒト血小板タンパク質と交差反応しないこ
と； ｃ）免疫グロブリンのＩｇＧ型クラスに属すること；を
有し、血小板因子４（ＰＦ４）（ヒトまたはウサギ種な
ど）と特異的に結合し、その生物学的活性（ヘパリンと
の相互作用など）を遮断するモノクローナル抗体；（２
）ウサギＰＦ４で免疫された哺乳動物の脾細胞と、同種
または異種のリンパ様細胞から得られるクローンされた
ハイブリドーマ； （３）クローンした後にウサギＰＦ４で免疫された哺乳
動物の脾細胞と同種または異種のリンパ様細胞を細胞レ
ベルで融合させる、この脾細胞とリンパ様細胞から得ら
れるクローンされたハイブリドーマの製造方法；（４）
上記タンパク質で免疫された哺乳動物の脾細胞と同種ま
たは異種のリンパ様細胞から得られるクローンされたハ
イブリドーマを、インビトロで、即ち培養培地において
、またはこのハイブリドーマがモノクローナル抗体を再
生産および蓄積する哺乳動物の腹腔において増殖させる
ことからなる、ヒトおよびウサギＰＦ４に特異的に結合
してその抗ヘパリン生物学的活性を遮断するモノクロー
ナル抗体の製造方法； （５）上記（１）に記載のモノクローナル抗体を用いて
、ヒトおよびウサギＰＦ４の生物学的活性（例えば、抗
ヘパリン型の活性）を、血小板起源またはその他の別の
タンパク質成分を変化させることなく特異的に遮断する
方法。 さらに、モノクローナル抗体の特異な性質が得られると
、同じ抗体が別の種に属するタンパク質の生物学的活性
を遮断することも可能である（そのアミノ酸配列が同一
であり、保存されているので）。これは、例えばＰＦ４
の場合である。

【００２１】免疫原として用いられるウサギＰＦ４は、
ウサギＰＦ４に対して用いられた従来の方法［Ｇｉｎｓ
ｂｅｒｇら，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．　２５４，１２
３６５−１２３７１（１９７９）］を修飾した、類似の
ヒトタンパク質に対して開示されている方法［Ｍｅｄｉ
ｃｉら，Ｔｈｒｏｍｂ．Ｒｅｓ．　５４，２７７−２８
７（１９８９）］に従って単離ウサギ血小板から精製し
た。

【００２２】多種の動物（ヒツジ、ヤギ、モルモット、
ラットおよびネズミ）をウサギＰＦ４またはタンパク質
コンプレックスで免疫し、特にネズミを用いてモノクロ
ーナル抗体を得た。免疫は皮下、腹腔内、静脈内、筋肉
内などの種々の経路が可能であるが、免疫原を皮下、腹
腔内および静脈内経路、特に皮下経路で注射するのが好
ましい。さらに、免疫の間隔、免疫原の用量および投与
経路は使用する免疫原に依存して変えることができる。 細胞融合に関しては、セルラインおよび適当な化学試薬
に対応する方法が多く記載されている［Ｇａｌｆｒｅ　
Ｇ．およびＭｉｌｓｔｅｉｎ　Ｃ．，Ｍｅｔｈｏｄｓ　
Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ　７３，３−４６（１９８１）］
。ＰＦ４の生物学的活性を評価するために用いられる分
析システムの中で、最も広く用いられているのは抗ヘパ
リン活性に関するシステムである［Ｌａｎｅ　Ｄ．Ａ．
ら，Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｊ．　２１８，７２５−３２（１
９８４）］。ＰＦ４の生物学的活性を調べる方法の１つ
は、その抗ヘパリン活性を調べるための試験であり、即
ちこの試験を用いて、どの試薬がＰＦ４の生物学的活性
を遮断することができるかを調べる。ＰＦ４の抗ヘパリ
ン活性を中和する方法は、ＰＦ４を特異的なモノクロー
ナル抗体とプレインキュベートすることからなり、得ら
れた抗原−抗体結合がＰＦ４の抗ヘパリン生物学的活性
の中和を達成するものであるか否かを、次にヘパリンお
よび検出システムに暴露することによって調べることか
らなる。

【００２３】分析物の正に１つの明確な構造形態を認識
することは分析検定の特異的な特徴を増大させるのが明
白であり、これがモノクローナル抗体に対する第１の必
要条件である。従って、モノクローナル抗体によるＰＦ
４分析物の生物学的活性の遮断（例えば、抗ヘパリン型
のもの）の実験的有意性は、１つの特定の種のＰＦ４を
認識するその能力とは全く別に、抗体それ自体の独特の
性質と考えられなければならない。この場合の特異性は
、主として抗分析物モノクローナル抗体による抗ヘパリ
ン活性遮断によって得られる。同じ生物学的系列に属す
る他の類似タンパク質との干渉作用を起こさずにＰＦ４
を選択的に遮断する利用可能な特異的試薬を得ることは
重要である。

【００２４】Ａ．ハイブリドーマおよびモノクローナル
抗体の調製 　　１．マウスの免疫 　　Ｃｈａｒｌｅｓ　Ｒｉｖｅｒより入手した８週令の
Ｂａｌｂ／ｃマウス４匹を以下の方法に従って免疫した
：腹腔内経路（ｉｐ）による最初の免疫は、精製したウ
サギＰＦ４（５０μｇ）を０．９％ｗ／ｖ　ＮａＣｌに
溶解し、　完全フロイントアジュバントに１：２の比で
乳濁化したものにより行った。１０日後に不完全フロイ
ントアジュバントに同じ比で乳濁化したＰＦ４（５０μ
ｇ）を用いて免疫（ｉｐ）を繰り返した。１５日後に０
．９％ｗ／ｖ　ＮａＣｌに溶解したＰＦ４（５０μｇ）
を別の追加免疫として与えた。３回目の免疫用に調製し
たものと同じ投与を３か月間毎月続けて行った。融合の
直前には、ＰＦ４（２５μｇ）を３日前および２日前に
腹腔内経路で接種し、１日前に静脈内経路で接種した。 次いで抗体力価が最も高いマウスを融合に用いた。この
力価は、眼球部分から採取した血清について評価し、後
記の”抗体産生細胞の検索”において説明する酵素免疫
法により試験を行った。表１は免疫計画を示すものであ
る。

【００２５】

【表１】 １．初期段階の免疫 　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　
　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　
　　　　　　　　　　免疫方法の順列　　　　時間　　
　　投与量　　　投与　　　　　　　　可溶化　　　　
　　　　　　　　　　　　　　　　　　（日）　　　　
（μｇ）　　　　経路　　　　　　　　　　　　　　　
　　　　　　　　　　１回目　　　　　　　　　　０　
　　　５０　　　　腹腔内　　　　ＣＦＡ　　１：２　
　　　２回目　　　　　　　　１０　　　　５０　　　
　腹腔内　　　　ＩＦＡ　　１：２　　　　３回目　　
　　　　　　２５　　　　５０　　　　腹腔内　　　　
ＮａＣｌ　　０．９％４回目〜６回目　　３０日毎　　
５０　　　　腹腔内　　　　ＮａＣｌ　　０．９％　注
：ＣＦＡ　　＝　　完全フロイントアジュバント　　　
　ＩＦＡ　　＝　　不完全フロイントアジュバント

【０
０２６】

【表２】 ２．最終段階の免疫 　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　
　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　
　　　　　　免疫の順列　　　　　時間＊　　投与量　
　　　投与　　　　　　　可溶化方法　　　　　　　　
　　　　　　　　　　　（日）　　　（μｇ）　　　　
　経路　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　
　　１ａ　　　　　　　　−３　　　　２５　　　　腹
腔内　　　　ＮａＣｌ　　０．９％　　　　２ａ　　　
　　　　　−２　　　　２５　　　　腹腔内　　　　Ｎ
ａＣｌ　　０．９％　　　　３ａ　　　　　　　　−１
　　　　２５　　　　静脈内　　　　ＮａＣｌ　　０．
９％　　＊　　＝　　日は融合の日を０とみなして計算
したものである。

【００２７】２）　　細胞融合 　　融合の日に、選択した動物を頸椎脱臼により処置し
た。次いで、確実な汚染源となり得るから腸のどの部分
も傷つけないように注意しながら手術用ハサミおよびピ
ンセットを用いて開腹し、滅菌された状態で脾臓を取り
出した。次いで脾臓をエテルロンメッシュ上に置き、次
いでそれを滅菌ビーカー上に設置し、氷中のＤｕｌｂｅ
ｃｃｏ’ｓ　Ｍｏｄｉｆｉｅｄ　Ｅａｇｌｅ’ｓ　Ｍｅ
ｄｉｕｍ（ＤＭＥＭ）の存在下で乳棒を用いて破砕した
。次いで、このようにして得られた脾臓の断片を滅菌パ
スツールピペットを用いて穏やかにピペッティングする
ことによりさらに分離した。次いで、それらを滅菌１５
ｍｌポリスチレン試験管に移した。結合した残渣は氷浴
中で１０分間の単純沈降分離により除去した。沈殿して
いない細胞懸濁液を別の試験管に移し、４℃、１０００
ｒｐｍで遠心した。上層を除去して、赤血球細胞を溶解
するため細胞ペレットを氷浴中の０．８３％ｗ／ｖ　Ｎ
Ｈ４Ｃｌ中に１０分間再懸濁した。次いで前記と同様に
遠心し、ＤＭＥＭ中での細胞ペレットの遠心および再懸
濁により再び洗浄した。融合に用いた非分泌性のミエロ
ーマ細胞はＮＳ−０細胞株に属する。ミエローマ細胞は
、融合前の１週間、２ｍＭグルタミンおよび１０％ｖ／
ｖウマ血清（ＨＳ）を含有するＤＭＥＭ中、低濃度（２
．５−５×１０５／ｍｌ）で培養した。融合を行う日に
細胞を集め、４℃、１０００ｒｐｍで遠心し、ペレット
を洗浄し、次いで氷浴中のＨＳ不含の培地中で３回遠心
した。洗浄後に、脾細胞およびミエローマ細胞を各々５
：１の比で混合したものをそれぞれノイバウアー・チェ
ンバーでカウントし、５０ｍｌポリプロピレン試験管に
共に入れ、１０００ｒｐｍで遠心した。上層を除去し、
試験管を指で軽くたたくことによりペレットを穏やかに
再懸濁した。通常の融合実験において、脾細胞約８０×
１０６個およびミエローマ細胞１６×１０６個を使用し
た。融合の工程は以下の方法に従い行った：４１％ｖ／
ｖポリエチレングリコール（ＰＥＧ）１５００（１ｍｌ
）を３７℃に加熱し、再懸濁したペレットにゆっくり加
えた。次いでこれを３７℃に設定した穏やかに振盪する
温浴中で１分間インキュベートした。この後、予め３７
℃まで加熱しておいたＤＭＥＭ（１２ｍｌ）を滴下して
、浸透圧衝撃を起こさないようにゆっくりとＰＥＧを希
釈した。３７℃、１０００ｒｐｍで１０分間遠心した細
胞をヒポキサンチン（１×１０−４Ｍ）、アミノプテリ
ン（４×１０−７Ｍ）、チミジン（１．６×１０−５Ｍ
）培地中に再懸濁した。この培地はＤＭＥＭ−ＨＡＴと
して知られるものである。細胞を９６ウエル・プレート
中に培地（１００μｌ）中１×１０５細胞／ウエルの濃
度になるようマルチプル・ピペットを用いて撒いた。こ
れを５％ＣＯ２の存在下３７℃の湿潤状態にあるインキ
ュベーターに入れた。ハイブリドーマの増殖を助けるた
めのいかなる種の細胞も用いなかった（フィーダー層）
。ハイブリドーマは３〜５日以内に現れ、クローンがウ
エルの約半分程度まで到達した時（融合後７〜１５日）
に、培養液（５０μｌ）について抗体の存在を試験した
。固相を用いた酵素免疫法（ＥＬＩＳＡ）によりスクリ
ーニングした（以下の”抗体産生細胞の検索”を参照）
。分泌性のハイブリドーマを増殖させ、この増殖に使用
した培地は以下の様に順次交換した。まず、ＤＭＥＭ−
ＨＴ培地を用いることによりアミノプテリンを除去し、
続いて２０％ＨＳ　ｖ／ｖ、ハイブリドーマ増殖因子（
ＨＥＣＳ）１：１００および２ｍＭグルタミンを含有す
る培地を使用し、最後にＨＥＣＳを除去し、ＨＳの濃度
を１０％まで減少させた。

【００２８】３）　　抗体産生細胞の検索酵素免疫試験
法（ＥＬＩＳＡ）を用いて、融合により得られたハイブ
リドーマの培養液のスクリーニングを行い、それらのハ
イブリドーマがヒトまたはウサギＰＦ４に指向性の特異
的な抗体を分泌しているかどうかを評価した。ＥＬＩＳ
Ａは、実質的にＥｎｇｖａｌｌ［Ｍｅｔｈｏｄｓ　Ｅｎ
ｚｙｍｏｌｏｇｙ，　７０，　４１９−３９，　１９８
０］により記載されている方法に従って行った：ヒトも
しくはウサギ起源の精製ＰＦ４溶液（０．１μｇ）を炭
酸緩衝液（ｐＨ９．５；５０μｌ）中に希釈し、ポリス
チレン微量滴定用プレートの各ウエルに４℃で１６時間
吸着させた。ウエルをリン酸緩衝液（ＰＢＳ）（ｐＨ７
．２）で３回洗浄し、ウエルを３％ｗ／ｖウシ血清アル
ブミン（ＢＳＡ）を含有するＰＢＳ溶液（２００μｌ）
で飽和させ、これを３７℃で１．５時間インキュベート
した。次いでハイブリドーマの増殖が陽性であることが
判明したウエルから得た上清（５０μｌ）と共に３７℃
で３時間インキュベートを続けた。通常の洗浄を３回行
った後、マウスＩｇＧに対するウサギＩｇＧを西洋ワサ
ビペルオキシダーゼとコンジュゲートしたものからなる
第二抗体（抗マウス−ＨＲＰ）を、ＰＢＳ＋１％ｗ／ｖ
ＢＳＡ＋０．０５％ｖ／ｖツィーン２０からなる飽和緩
衝液中に１：１０００の比で希釈したものを５０μｌず
つ各ウエルに入れた。これを３７℃で１時間インキュベ
ートした。ＰＢＳでさらに３回洗浄した後、酢酸緩衝液
（ｐＨ５．０）中のオルトフェニレンジアミンおよびＨ
２Ｏ２からなる発色基質（５０μｌ）を用いて室温で１
５分間インキュベートすることにより検出を行った。陽
性のウエルにおいては黄橙色に発色し、これを１０％ｖ
／ｖ硫酸（５０μｌ）でブロックした。吸光度の測定を
酵素免疫試験用の吸光度計において４９２ｎｍで行った
。

【００２９】４）クローニングおよび凍結　　分泌ハイ
ブリドーマ細胞が充分な数となってすぐに、９６ウエル
プレートの１０％ＤＭＥＭ−ＨＳ、２ｍＭグルタミンお
よび１：１００ＨＥＣＳの培地中、ウエルの５０％での
み細胞が増殖するよう１ウエル当たり０．５細胞の割合
でプレートすることによってクローニングの工程を行っ
た。このようにして増殖させたクローンのＰＦ４に対す
る特異性を、先に述べた（抗体産生細胞の検索）様にし
て行う酵素免疫試験法により再試験した。この様にして
分泌ハイブリドーマの効果的なクローニングを確実なも
のにすることができる。いくつかの場合においてこの方
法を２回繰り返すことができる。分泌細胞株を液体窒素
中で永久保存した。この目的のために、クローンされた
分泌性のハイブリドーマ細胞を培養液から集め、４℃、
１０００ｒｐｍで１０分間遠心し、９０％ＨＳおよび１
０％ｖ／ｖジメチルスルホキシドからなる凍結溶液中に
約５×１０６／ｍｌの数になるよう再懸濁した。次いで
この細胞懸濁液（１ｍｌ）を凍結のため１．８ｍｌバイ
アルに入れた。凍結は徐々に行い、最初に該細胞を１時
間で４℃まで冷却し、次いで２時間で−２０℃とし、次
いで一夜で−８０℃としてそれを最終的に液体窒素中に
保存した。

【００３０】Ｂ．抗体の免疫グロブリンクラスの決定　
　初めの段階に関する限り（抗原の不溶化、ウエルの飽
和および第一抗体による処理）前述のＥＬＩＳＡ法と同
様の方法を用いて、モノクローナル抗体（ＭｏＡｂ）の
免疫グロブリンクラスを決定した。ヒトもしくはウサギ
ＰＦ４と反応する各モノクローナル抗体について、試験
するＬ鎖およびＨ鎖の異なるアイソタイプに対応する８
つの複製物を作成した。その後、抗マウス−ＨＲＰ型の
第二抗体を使用する代わりに、ウサギにおいて製造され
たマウス免疫グロブリンの異なるＬ鎖およびＨ鎖に特異
的な一連の抗体を用いた。この操作に引き続いて、ＨＲ
Ｐとコンジュゲートされた、ウサギＩｇＧに対して指向
性の抗体で処理し、そして最終的に前述の発色基質を用
いて処理を行った。試験した各ＭｏＡｂに対して、選択
されたモノクローナル抗体を形成するＬ鎖およびＨ鎖の
アイソタイプに対応した２ウエルでのみ発色が見られた
。

【００３１】Ｃ．抗体の産生 　　大量のＭｏＡｂを得るために、腫瘍セルラインであ
るハイブリドーマの能力を利用し、細胞接種の約２０日
前にテトラメチルペンタデカン（プリスタン）（０．５
ｍｌ）を用いて腹腔内経路で処置した同系のＢａｌｂ／
ｃマウスの腹腔中で腫瘍による腹水として増殖させた。 この処置はハイブリドーマの接着および増殖を助ける。 インビトロで充分な数の細胞が得られるまで、クローン
化した分泌性ハイブリドーマ細胞を復元した。次いで細
胞を集め、通常の方法で遠心し、ＤＭＥＭ中に２×１０
６／ｍｌの濃度で再懸濁し、約０．５ｍｌを腹腔内投与
により接種した。細胞接種後７〜１０日で、動物は腫瘍
腹水を増加させ、それを腹腔内に入れた針から取り出し
、試験管内に液体を滴下させた。次いで得られた細胞懸
濁液を遠心分離し、血球部分を除去した。次いで免疫グ
ロブリン（Ｉｇ）の精製に必要となるまで、この上層を
−２０℃に保存した。

【００３２】Ｄ．精製 　　腹水から得たＩｇの精製はカプリル酸法により行っ
た。腹水（１０ｍｌ）を６０ｍＭ酢酸緩衝液（ｐＨ４．
０、２０ｍｌ）と混合し、ｐＨを４．８に調節した。１
１μｌ／ｍｌカプリル酸を一滴ずつ加え、次いで室温で
３０分間勢い良く磁気撹拌した。この後、１０℃、２０
０００ｒｐｍで２０分間遠心した。次いで、ペレットを
除去し、Ｉｇを含有している上清をフィルター紙上で濾
過し、ＰＢＳ（ｐＨ７．４）で１２時間透析した。最後
に、タンパク質含量およびＩｇの純度をドデシル硫酸ナ
トリウム（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）の存在下でポリアクリル
アミドゲル電気泳動により決定した。

【００３３】Ｅ．モノクローナル抗体の特性化　　得ら
れたモノクローナル抗体の特異性をウエスタンブロット
法により測定した。Ｌａｅｍｍｌｉ，　Ｎａｔｕｒｅ，
　２２７，　６８０−８５，　１９７０に記載の様にし
てドデシル硫酸ナトリウムポリアクリルアミドゲル電気
泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）を行った後に、Ｔｏｂｗｉｎ
　Ｈ．　ｅｔ　ａｌ．（Ｐｒｏｃ．　Ｎａｔｌ．　Ａｃ
ａｄ．　Ｓｃｉ．　ＵＳＡ　７６，　４３５０−５４，
　１９７９）の方法に従い、ポリアクリルアミドゲルの
タンパク質をセルロースフィルターに移した。 ニトロセルロースフィルターをポリアクリルアミドゲル
と接触するようにして置き、これらを共に、移動槽内に
設置されたプラスチックの’サンドイッチ’の間で圧縮
される２つのスポンジの間に挿入し、タンパク質（ヒト
もしくはウサギＰＦ４）がゲルからニトロセルロースフ
ィルターに転移するようにした。温度を４℃に維持する
冷却系の存在下で、電流は転移中一定とし、４０ｍＡで
１時間、次いで１００ｍＡで１５時間流した。転移後、
ニトロセルロースのタンパク質が存在しない部分を飽和
するために３％ＢＳＡｗ／ｖを含有する飽和緩衝液［８
５ｍＭ　ＮａＣｌ、５０ｍＭトリス（ｐＨ８．０）］中
でニトロセルロースフィルターを３７℃で１時間インキ
ュベートした。モノクローナル抗体を含有する培養液を
同じ飽和緩衝液もしくは精製したＩｇで適当に希釈し、
室温で穏やかに撹拌しながら上清と共に２時間インキュ
ベートした。０．１％ｗ／ｖＢＳＡおよび０．２％ｖ／
ｖＰ４０　Ｎｏｎ−Ｉｄｅｔを含有する緩衝液［８５ｍ
Ｍ　ＮａＣｌ、５０ｍＭトリス（ｐＨ８．０）］を用い
て、１０分間の洗浄を３回行った。第二抗体（抗マウス
ＨＲＰ）とのインキュベートおよびそれに続く洗浄は、
１時間としていたインキュベートの時間を除いて第一抗
体のところで述べたものと同様の方法で行った。検出の
ために２０ｍｌの１００ｍＭトリス、１０ｍＭイミダゾ
ール（ｐＨ７．６）中に溶解したジアミノベンジジン（
５ｍｇ）を使用した。これに３０％ｖ／ｖＨ２Ｏ２（１
０μｌ）を加えた。反応が起こるまで十分な時間蒸留水
を加えることにより検出を停止させた。前述の酵素免疫
法およびイムノブロッティング法により試験を行い、１
１のＭＡｂがウサギＰＦ４に特異的であり、１つのモノ
クローナル抗体がヒトおよびウサギＰＦ４を同時に認識
することが証明された。抗体の特異性およびそのアイソ
タイプを表３に示す。特に、１０Ｂ２と称されるモノク
ローナル抗体は酵素免疫試験法においてヒトおよびウサ
ギＰＦ４と反応することが判明した（表４）。選択され
た抗体の性質をさらに、抗原として、精製ＰＦ４ならび
にヒトおよびウサギ血小板溶解物の全体、精製ヒトおよ
びウサギＰＦ４ならびに血小板不含の血漿から得たヒト
およびウサギ血清を用いたイムノブロッティング法によ
り調べた。 この試験法により、１０Ｂ２と命名した選択されたハイ
ブリドーマは精製ＰＦ４と強く反応し、精製ＰＦ４と共
に泳動するヒトおよびウサギ血小板溶解物中の約８００
０ダルトンの分子量を有する１本のバンドを認識するが
、血小板不含のヒトおよびウサギ血漿とは完全に陰性で
あることが示された。次いでこのモノクローナル抗体を
同系のマウスに接種して腹水中でＩｇを得た。次いでこ
れを上述の様にして精製し、その結果ＰＦ４の生物学的
活性を特異的に阻害する高度に純化された試薬を製造し
た。

【００３４】

【表３】 ｍＡｂの名称　　　　　　　　　　　　アイソタイプ　
　　　　　　　　　　ウサギ　　　　　　ヒト　　　　
　　　　　　　　　　　　　　　　　Ｈ鎖　　　　　　
　　　　　Ｌ鎖　　　　ＥＬＩＳＡ　　ＢＬＯＴ　　Ｅ
ＬＩＳＡ　　ＢＬＯＴ　　Ｉ−ＨＡ７　　　　　　　　
　Ｎ．Ｔ．　　　　　　　　　　　Ｎ．Ｔ．　　　　＋
　　　　＋　　　　　−　　　　−ＩＩ−６Ｈ１２　　
　　　ＧＡＭＭＡ１　　　　　　　ｋ　　　　　　＋　
　　　＋　　　　　−　　　　−ＩＩ−９Ｈ２　　　　
　　　ＧＡＭＭＡ１　　　　　　　ｋ　　　　　　＋　
　　　＋　　　　　−　　　　−ＩＩ−１４Ｆ３　　　
　　ＧＡＭＭＡ１　　　　　　　ｋ　　　　　　＋　　
　　＋　　　　　−　　　　−ＩＩ−５Ｇ８　　　　　
　　ＧＡＭＭＡ１　　　　　　　ｋ　　　　　　＋　　
　　＋　　　　　−　　　　−ＩＩ−１５Ｈ２　　　　
　ＧＡＭＭＡ１　　　　　　　ｋ　　　　　　＋　　　
　＋　　　　　−　　　　−ＩＩ−１Ｃ１２　　　　　
ＧＡＭＭＡ２ｂ　　　　　ｋ　　　　　　＋　　　　＋
　　　　　−　　　　−ＩＩ−１１Ｈ６　　　　　Ｎ．
Ｔ．　　　　　　　　　　　Ｎ．Ｔ．　　　　＋　　　
　＋　　　　　−　　　　−ＩＩ−１２Ｇ１０　　　Ｇ
ＡＭＭＡ２ｂ　　　　　ｋ　　　　　　＋　　　　＋　
　　　　−　　　　−ＩＩ−１０Ｂ２　　　　　ＧＡＭ
ＭＡ１　　　　　　　ｋ　　　　　　＋　　　　＋　　
　　　＋　　　　＋ＩＩ−１５Ｆ１１　　　ＧＡＭＭＡ
１　　　　　　　ｋ　　　　　　＋　　　　＋　　　　
　−　　　　−ＩＩ−１２Ｂ３　　　　　Ｎ．Ｔ．　　
　　　　　　　　　Ｎ．Ｔ．　　　　＋　　　　＋　　
　　　−　　　　−注：＋　　＝　　陽性反応 　　　　−　　＝　　陰性反応 　　　　ｍＡｂ　　＝　　モノクローナル抗体　　　　
Ｎ．Ｔ．　　＝　　試験せず

【００３５】

【表４】 抗体濃度　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　
　吸光度（４９２ｎｍ）［μｇ／ｍｌ］　　　　　　　
　　　　　　１０Ｂ２　　　　　　　　　　　　　　　
　１５Ｆ１１　　　　　　　　　　　　　　　　　　　
　　　　　ｈＰＦ４　　　　ｒａＰＦ４　　　　ｈＰＦ
４　　　　ｒａＰＦ４１５０　　　　　　　　　　０．
３５２　　　　０．４５２　　　　０．０３２　　　　
０．４９７　　７５　　　　　　　　　　０．３４３　
　　　０．４３０　　　　０．００８　　　　０．４５
５　　３７．５　　　　　　　０．１９１　　　　０．
３６７　　　　０．０１２　　　　０．４１５　　１８
．７５　　　　　０．１１８　　　　０．３４５　　　
　０．０１４　　　　０．３４９　　　　９．３７　　
　　　０．０９３　　　　０．３０６　　　　０．０１
６　　　　０．２６５　　　　４．７０　　　　　０．
０４６　　　　０．２１０　　　　０．０１６　　　　
０．２３２　　　　２．３５　　　　　０．０１０　　
　　０．０２６　　　　０．００３　　　　０．１２６
　　　　１．１８　　　　　０．０２７　　　　０．０
００　　　　０．０００　　　　０．０６７　　　　０
．５９　　　　　０．０００　　　　０．０００　　　
　０．０００　　　　０．０００ 注：ｈＰＦ４　　＝　　ヒト血小板因子４　　　　ｒａ
ＰＦ４＝　　ウサギ血小板因子４

【００３６】Ｆ．生物
学的活性の測定 　　ＰＦ４によるヘパリン活性の中和を測定するために
使用する方法は本質的にはＬａｎｅ　ｅｔ　ａｌ．，　
Ｂｉｏｃｈｅｍ．　Ｊ．，　２１８，　７２５−３２，
　１９８４により述べられている。１．５ｍｌエッペン
ドルフ試験管を、３％ＢＳＡを含有するＰＢＳ（５００
μｌ）を用いて４℃で１６時間飽和した。次いで、過剰
のＰＢＳ−ＢＳＡを除去し、一定量のウサギまたはヒト
ＰＦ４（０．２μｇ）（これは、標準ヘパリン（０．０
４μｇ）の抗Ｘａ因子活性を９０％抑制することができ
る）をこれらの試験管中で３３μｇから始めて次第に減
少させていく量のモノクローナル抗体と共にプレインキ
ュベートした。２０μｌの０．１５Ｍ　ＮａＣｌ緩衝液
、５０ｍＭトリス（ｐＨ８．４）中、３７℃で２時間イ
ンキュベートした。このインキュベートの終了時点で、
最終容量が１８０μｌに達するようヘパリン（０．０４
μｇ）を加え、これを３７℃でさらに２時間インキュベ
ートした。この混合物に２５０μｇ／ｍｌヒト抗トロン
ビンＩＩＩ（Ｋａｂｉ　Ｖｉｔｒｕｍ）（２０μｌ）を
加え、混合して微量滴定用プレート中に５０μｌずつ分
注した。これを３７℃で５分間インキュベートした。７
ｎｋａｔ　Ｓ−２２２２／ｍｌの活性を有するウシＸａ
因子（Ｋａｂｉ　Ｖｉｔｒｕｍ）（２５μｌ）を各ウエ
ルに加え、３７℃で１分間インキュベートした。Ｓ−２
２２２基質（５０μｌ）を１ｍＭ／Ｌの濃度で各ウエル
に加え、３７℃で４分間インキュベートした。２０％ｖ
／ｖ酢酸（７５μｌ）で反応をブロックした。発色を４
０５ｎｍで測定した。ＭＡｂ　１０Ｂ２、ヘパリンおよ
びＡＴ　ＩＩＩにより構成される系（すなわち、ＰＦ４
の非存在下）での抗ヘパリン活性を０％とし、ヘパリン
、ＡＴ　ＩＩＩおよびＰＦ４からなる系（すなわち、Ｍ
Ａｂの非存在下）での抗ヘパリン活性を１００％として
、ＰＦ４の抗ヘパリン活性の中和を％で表した。表５は
、ウサギＰＦ４を認識するがその生物学的活性はブロッ
クしない１５Ｆ１１と命名した別のＭＡｂとの比較にお
いて、異なる用量のＭＡｂ　１０Ｂ２を用いて得られた
ヒトおよびウサギＰＦ４の抗ヘパリン活性の中和に関す
るデータを示すものである。ＭＡｂ１０Ｂ２はヒトおよ
びウサギＰＦ４の抗ヘパリン活性を３．６μｇ程度の低
用量で、即ちＰＦ４に対して約１：１のモル比で中和す
ることができる。

【００３７】

【表５】 　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　
　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　
　　　　　　　　　　　　　　　　添加ｍＡｂ　　　　
　　　　　　　　　　＊抗ヘパリン活性の中和率（％）
　　［μｇ］　　　　　　　　　　　　　　　　　　　
　１０Ｂ２　　　　　　　　　　　　１５Ｆ１１　　　
　　　　　　　　　　　　　　　ウサギＰＦ４　　　　
ヒトＰＦ４　　　　ウサギＰＦ４　　　　　　　３３．
００　　　　　　１００．８±１．５　　　　９７．０
±１．０　　　　−４．０±２．１１１．００　　　　
　　　　９５．８±０．８　　　　９８．０±３．０　
　　　　　４　　　±３．２　　３．６０　　　　　　
　　９５．３±０．９　　　　９４．５±１．５　　　
　　　２．５±３．５　　１．２０　　　　　　　　３
２．５±１５．１　　６２．５±１０．５　　−１．５
±３．０　　０．４０　　　　　　　　−１．３±４．
０　　　　　　４．５±４．５　　　　　　３±４．４
　　０．１３　　　　　　　　　　０．８±３．３　　
　　−３．０±６．０　　　　　　４±１．５　　　 値は平均±平均の標準誤差として表した。

【００３８】上記で１０Ｂ２として同定されたハイブリ
ドーマは、ブダペスト条約のもとに仮の受託番号９１０
５０８０１としてＥｕｒｏｐｅａｎ　Ｃｏｌｌｅｃｔｉ
ｏｎ　ｏｆ　Ａｎｉｍａｌ　Ｃｅｌｌ　Ｃｕｌｔｕｒｅ
ｓ　（ＥＣＡＣＣ）に寄託された。

【００３９】以上に本発明を説明したが、ここに記載し
た方法は様々に修飾可能であることは明白である。その
ような修飾は本発明の思想および目的から逸脱している
ものと見なすべきではなく、当業者にとって明らかであ
る修飾のすべてが本発明の特許請求の範囲内に含まれる
。

Claims (21)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】　　（ａ）ＩｇＧクラスに属し；（ｂ）ヒ
   トＰＦ４と反応し； （ｃ）ヘパリンとの比較の上でヒトＰＦ４の生物学的作
   用を遮断し；そして （ｄ）血小板リゼイト中に存在するＰＦ４以外のいずれ
   のタンパク質成分とも反応しないか、または血小板を含
   まない血漿中のいずれのタンパク質とも反応しない；こ
   とを特徴とするモノクローナル抗体。
2. 【請求項２】　　ウサギＰＦ４と反応するが、ウサギ血
   小板リゼイト中に存在するＰＦ４以外のいずれのタンパ
   ク質成分とも反応しないか、または血小板を含まないウ
   サギ血漿中のいずれのタンパク質とも反応しない、請求
   項１に記載のモノクローナル抗体。
3. 【請求項３】　　請求項１に記載のモノクローナル抗体
   を産生するハイブリドーマ。
4. 【請求項４】　　クローン１０Ｂ２である請求項３に記
   載のハイブリドーマ。
5. 【請求項５】　　マウスミエローマＮＳ−Ｏ系統由来の
   細胞と、予めＰＦ４で免疫したマウス由来の脾細胞の融
   合によって得られるハイブリドーマから産生されるモノ
   クローナル抗体。
6. 【請求項６】　　以下の工程： （ａ）マウスをＰＦ４で免疫し； （ｂ）該マウスの脾臓を取り、その細胞の浮遊液を調製
   し； （ｃ）融合促進物質の存在下に該脾細胞をマウスミエロ
   ーマ細胞と融合させ； （ｄ）非融合細胞を増殖させない培養培地中、別々のウ
   エルにおいて該融合細胞を希釈および培養し；（ｅ）ハ
   イブリドーマを含むそれぞれのウエルの上清についてＰ
   Ｆ４に対する抗体の存在を調べ；（ｆ）抗体を産生する
   ハイブリドーマを選択およびクローンし；そして （ｇ）該選択したクローンの上清から目的の抗体を得る
   ；を特徴とする方法によって製造されたモノクローナル
   抗体。
7. 【請求項７】　　方法が以下の工程： （ａ）ハイブリドーマクローンをマウス腹膜中に移し；
   そして （ｂ）目的の抗体を含有する腹水を該マウスから回収す
   る；をさらに含む請求項６に記載のモノクローナル抗体
   。
8. 【請求項８】　　ハイブリドーマを発酵系に導入し、使
   用した培養培地から抗体を回収することをさらに含む方
   法によって製造された請求項７に記載のモノクローナル
   抗体。
9. 【請求項９】　　ハイブリドーマがクローン１０Ｂ２で
   ある請求項７または８に記載のモノクローナル抗体。
10. 【請求項１０】　　ヒトＰＦ４と反応する請求項７〜９
    のいずれかに記載のモノクローナル抗体。
11. 【請求項１１】　　ヒトＰＦ４の生物学的活性を遮断す
    る請求項１０に記載のモノクローナル抗体。
12. 【請求項１２】　　ＰＦ４の生物学的活性が抗ヘパリン
    型のものである請求項１１に記載のモノクローナル抗体
    。
13. 【請求項１３】　　抗体がヒト起源の血小板成分のいず
    れとも交差反応しないものである請求項１０に記載のモ
    ノクローナル抗体。
14. 【請求項１４】　　抗体がヒト起源の血小板を含まない
    血漿のいずれの成分とも交差反応しないものである請求
    項１０に記載のモノクローナル抗体。
15. 【請求項１５】　　（ａ）マウスをＰＦ４で免疫し；（
    ｂ）該マウスの脾臓を取り、その細胞の浮遊液を調製し
    ； （ｃ）融合促進物質の存在下に該脾細胞をマウスミエロ
    ーマ細胞と融合させ； （ｄ）非融合細胞を増殖させない培養培地中、別々のウ
    エルにおいて該融合細胞を希釈および培養し；（ｅ）ハ
    イブリドーマを含むそれぞれのウエルの上清についてＰ
    Ｆ４に対する抗体の存在を調べ；（ｆ）抗体を産生する
    ハイブリドーマを選択およびクローンし；そして （ｇ）該選択したクローンの上清から目的の抗体を得る
    ；ことを特徴とする、ＩｇＧクラスに属し；ヒトＰＦ４
    と反応し；ヒトＰＦ４の生物学的作用を遮断し；そして
    、ヒト起源の血小板成分のいずれとも交差反応しないか
    、またはヒト起源の血小板を含まない血漿のいずれの成
    分とも反応しないモノクローナル抗体の製造方法。
16. 【請求項１６】　　ハイブリドーマをマウス腹膜中に移
    し、そして目的の抗体を含有する腹水を該マウスから回
    収する工程をさらに含む請求項１５に記載の方法。
17. 【請求項１７】　　血栓形成過程を遅延させるに十分な
    量の請求項１、２または６〜８のいずれかに記載のモノ
    クローナル抗体と、薬学的に許容しうる担体または希釈
    剤を含有する医薬組成物。
18. 【請求項１８】　　血栓を予防または治療するための請
    求項１７に記載の組成物。
19. 【請求項１９】　　抗血栓形成作用または血栓溶解作用
    を有する化合物をさらに含有する請求項１７または１８
    に記載の組成物。
20. 【請求項２０】　　ＰＦ４の抗脈管形成活性を遮断する
    に十分な量の請求項１、２または６〜８のいずれかに記
    載の抗ＰＦ４モノクローナル抗体を有効成分として含有
    する、患者の傷部位に投与して傷治癒を促進するための
    医薬組成物。
21. 【請求項２１】　　抗脈管形成作用を有する少なくとも
    １つの化合物をさらに含有する請求項２０に記載の組成
    物。