ES2300272T3 - Metodo y aparato para la electromanipulacion intracelular. - Google Patents
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Abstract
Un aparato para destruir células diana que comprende: (i) un generador de pulso; (ii) un agrupamiento de electrodos, el agrupamiento de electrodos que comprende al menos un par de agujas capaces de ser insertadas en tejidos in vivo, conteniendo el tejido las células diana, y ser capaces de dirigir los pulsos eléctricos ultracortos a dichas células diana in vivo; y (iii) un sistema de distribución adaptado para comunicar uno o más pulsos eléctricos ultracortos desde el generador de pulsos al agrupamiento de electrodos, caracterizado en que el generador de pulsos está configurado para producir dicho uno o más pulsos eléctricos ultracortos que tienen una duración de pulso de no más de 1 microsegundo y una intensidad de campo eléctrico mayor de 10 kV/cm.
Description
Método y aparato para la electromanipulación
intracelular.
Las células biológicas consisten en citoplasma
rodeado por una membrana. El citoplasma es conductor, la membrana,
que está hecha de un bicapa de lípidos, se puede considerar un
dieléctrico. La aplicación de campos eléctricos a las células
biológicas produce aumento de carga eléctrica en la membrana
celular, y por consiguiente un cambio en la diferencia de potencial
a través de la membrana. Para células eucariotas la diferencia de
potencial transmembrana en condiciones de equilibrio es
aproximadamente de 70 mV. Para afectar a los procesos de la
membrana por medio de campos eléctricos externos, la amplitud de
estos campos ("E") debe ser tal que genere una diferencia de
potencial ("V_{m}") al menos del mismo orden que el potencial
de reposo. La amplitud de un campo eléctrico es:
donde a es el radio de la célula y
f es un factor de forma que depende de la forma de la célula. Para
células esféricas, f es 1.5; para células cilíndricas de longitud
1, con hemisferios de diámetro d en cada extremo, el factor de
forma
es
Para una célula biológica con un radio supuesto
de alrededor de 5 \mum y una forma esférica, el campo eléctrico
externo requerido para generar una diferencia de potencial de la
misma amplitud que el potencial de reposo a través de la membrana
es del orden de 100 V/cm. Debido a su menor tamaño, el campo
eléctrico requerido para afectar la permeabilidad de la membrana de
bacterias es mucho mayor, del orden de kV/cm.
Para campos eléctricos externos de una magnitud
tal que el cambio en el potencial de membrana sea del orden del
potencial de reposo, la apertura de canales inducida por voltaje en
la membrana produce un flujo de iones a través de la membrana. Esto
lleva a cambios en la concentración de iones cerca de la membrana
celular, y por consiguiente causa estrés en la célula. El estrés
dura del orden de milisegundos, y generalmente no produce daño
celular permanente. Si la intensidad del campo eléctrico se aumenta
tal que la diferencia de potencial a través de la membrana celular
alcanza niveles del orden de un voltio, la permeabilidad de la
membrana aumenta a un nivel tal que bien la célula necesita de
segundos a horas para recuperarse (rotura reversible), o se puede
producir la muerte celular. El mecanismo de la rotura de la membrana
no se comprende bien. Una hipótesis común es que se generan poros
en la membrana. Los poros pueden ser de tamaños que permitan el
intercambio de macromoléculas. Si las diferencias de potencial
transmembrana son lo suficientemente altas los poros no se cerrarán
más. Se ha descrito el uso del efecto de rotura reversible en la
electroporación y en la prevención de las incrustaciones
biológicas. El efecto irreversible se ha utilizado en la
desbacterización de agua y alimentos.
El efecto de los campos eléctricos sobre las
células biológicas no depende simplemente de la magnitud del campo
eléctrico aplicado, sino también de su duración. Esto se puede
entender considerando un modelo para el circuito eléctrico
equivalente de la célula, mostrado esquemáticamente en la Fig. 1. El
modelo mostrado en la Fig. 1 no tiene en cuenta el efecto de las
estructuras en el interior de la célula. La célula (en suspensión)
se modela mediante una resistencia y una capacitancia. Para la
duración de un pulso que es largo comparado con el tiempo de
relajación dieléctrico de la suspensión, se puede despreciar el
componente capacitivo de la impedancia de la suspensión. Para
muchas suspensiones de células y agua de mar (esto es, soluciones
acuosas con fuerzas iónicas relativamente altas) el tiempo de
relajación dieléctrica es del orden de nanosegundos. La membrana
celular se puede modelar como un condensador, el citoplasma como una
resistencia. La membrana externa contiene canales a los que afectan
la diferencia de potencial aplicada y permiten el flujo de iones a
través de la membrana, representado una corriente de fugas. Los
canales abiertos por voltaje se pueden modelar como resistencias
variables, dependientes de voltaje.
Cuando se aplica un pulso de diferencia de
potencial a una célula, se acumulan cargas en la membrana y la
diferencia de potencial de la membrana aumenta. La constante de
tiempo de carga de la membrana celular se puede representar por la
ecuación (3):
siendo \rho_{1} la resistencia
del medio de suspensión, por ejemplo agua, siendo \rho_{2} la
resistencia del citoplasma, C la capacitancia por unidad de área, y
r el radio de la célula (célula esférica). Utilizando datos típicos
para células, se puede calcular la duración de los pulsos de campo
eléctrico requeridos para generar una diferencia de potencial de 1
V a través de la membrana. La energía, W, disipada en la suspensión
está dada
por:
En la Fig. 2 se representan el campo eléctrico y
la densidad de energía frente a la duración del pulso para células
esféricas de radio de 5 \mum en una suspensión con una resistencia
de 50 \Omegacm. Se asume que la resistencia del citoplasma es de
100 \Omegacm. Las curvas muestran un mínimo a 150 nsec. Esta es la
duración del pulso donde se predice que el aturdimiento o la muerte
de este tipo de células biológicas es más eficaz. Se han descrito
estudios experimentales que confirman tal mínimo.
Schoenbach, K.H. et al., "The Effect of
Pulsed Electric Field on Biological Cells: Experiments and
Applications", IEEE Transactions on Plasma Science,
25(2), abril de 1997, pp. 285-292, describe
experimentos para explorar el efecto de campos eléctricos pulsados
con amplitudes en el rango de 100 V/cm-100 KV/cm en
bacterias y plagas acuáticas. La duración del pulso fue tan corta
que el calentamiento de la materia biológica se pudo despreciar
(resumen). Para explorar el efecto de campos eléctricos con
duraciones de pulso menores que aquellas utilizadas en experimentos
anteriores, se utilizaron sistemas de potencia de pulso que
permitían que se generaran pulsos de alto voltaje de 60 ns, 300 ns
y 2 \mus de duración. La carga consistía en una suspensión acuosa
que contenía los organismos a probar. El medio se colocó en cubetas
disponibles comercialmente entre dos electrodos planos de aluminio.
Con una distancia mínima de 1 mm, se pudieron obtener campos
eléctricos máximos de 100 kV/cm en los sistemas de 60 y 300 ns. Sin
embargo, la descarga disruptiva de superficie en la superficie de la
suspensión ha limitado el campo máximo a alrededor de 80 kV/cm. No
hay divulgación de un agrupamiento de electrodos que comprende al
menos un par de agujas capaces de ser insertadas en tejido in
vivo, conteniendo el tejido las células diana, y siendo capaz
de dirigir los pulsos eléctricos ultracortos a dichas células diana
in vivo.
WO 98/47562 se refiere un aparato de
agrupamientos de electrodos que facilita la distribución eficaz de
ondas eléctricas, y particularmente la distribución a una región
tridimensional predeterminada de tejido en un paciente. Se
proporciona un sistema en donde el agrupamiento de electrodos está
localizado in situ en un paciente. La región de tratamiento
predeterminada se puede someter entonces a los efectos de
electropermeabilización de los campos eléctricos, que fomenta la
introducción de agentes terapéuticos dentro de las células de la
región. La onda eléctrica proporcionada por un generador puede ser
un pulso que decae exponencialmente, un pulso cuadrado, un tren de
pulsos oscilantes unipolares o un tren de pulsos bipolares. La
intensidad de campo eléctrico puede estar deseablemente entre 0.2
kV/cm hasta 20 kV/cm, de forma más común de 0.5 kV/cm hasta 3
kV/cm. La duración del pulso puede ser desde 100 nanosegundos hasta
100 milisegundos y puede haber desde 1 hasta 10000 pulsos por
segundo. No hay divulgación de pulsos eléctricos que tienen una
duración de pulso de no más de un 1 microsegundo y una intensidad
de campo eléctrico de más de 10 kV/cm.
Las modificaciones de las células que llevan a
la ruptura de la membrana celular pueden llevar a la muerte celular
a través de la necrosis, un tipo no fisiológico de destrucción
celular. Sería provechoso ser capaz de iniciar la muerte celular a
través de apoptosis de una manera selectiva. Esto permitiría la
destrucción de las células sin generar el daño no específico a los
tejidos circundantes debido a la inflamación y cicatrización que se
observa normalmente con la necrosis. La capacidad de modificar
selectivamente las células en formas que lleven a apoptosis podría
proporcionar un nuevo método para la destrucción selectiva de
células/tejido indeseado (por ejemplo, células tumorales, células
grasas o células de cartílago) al tiempo que se minimizan los
efectos secundarios sobre el tejido circundante.
La presente invención se refiere a un aparato
para destruir células diana según las reivindicaciones. El pulso de
campo eléctrico ultracorto generalmente tiene al menos una amplitud
y duración suficientes cuando se aplica como una secuencia de
pulsos para modificar estructuras subcelulares en las células diana
al menos de una forma transitoria. La amplitud de los pulsos
individuales no excede el campo de la rotura irreversible de las
células diana. La amplitud y duración de el(los)
pulso(s) de campo eléctrico ultracorto(s) se eligen
típicamente de modo que sean insuficientes para alterar de forma
permanente la permeabilidad de las membranas de superficie de las
células diana, por ejemplo, rompiendo las membranas de
superficie.
El uso de pulsos de campo eléctrico con
duraciones de pulso y tiempos de subida sustancialmente más cortos
que los utilizados normalmente en la electroporación convencional
proporciona el potencial para métodos no líticos de lesión celular
selectiva o ablación fisiológica que se aplicarán a la mayoría de
los tipos celulares. Por ejemplo, como ha sugerido la contracción
observada en eosinófilos expuestos a uno o más pulsos de campo
eléctrico ultracortos, perturbar las estructuras intracelulares
puede llevar a la inducción de apoptosis. La inducción localizada
de apoptosis se podría utilizar para esculpir tejidos con fines
cosméticos o matar selectivamente células tumorales, por ejemplo,
para eliminar selectivamente tejidos tales como papilomas y
nevos.
\global\parskip0.900000\baselineskip
El ataque a las subestructuras de las células
más que a las membranas de las células puede tener utilidad en
tratamientos que implican la destrucción selectiva de células (por
ejemplo, células tumorales) sin dañar sustancialmente al
tejido(s) circundante(s). La mayoría de las
aplicaciones terapéuticas del método del campo eléctrico pulsado
requieren que los campos se apliquen a tejidos más que a células
individuales. Con los pulsos comparativamente largos que se usan
actualmente en tales tratamientos (por ejemplo, de varios cientos de
microsegundos de duración), sin embargo, el campo eléctrico parece
ser menos eficaz al tratar tejidos comparado con células
individuales. Se sabe que aunque el tejido generalizado se puede
considerar como un agregado de células, con diferentes tipos de
interconexiones célula-célula, la electroporación de
tejido consiste en la electroporación de células individuales.
Existen dos diferencias principales entre la electroporación de
células individuales en una suspensión y la electroporación de
tejido. En el tejido, el campo eléctrico local extracelular depende
de una manera complicada de muchas células adyacentes. Además, para
tejidos la proporción de volumen extracelular a intracelular
normalmente es pequeña, justo lo contrario de la mayoría de las
condiciones de electroporación in vitro. Esto significa que
si el intercambio químico entre los volúmenes intra- y extracelular
es la causa principal del estrés celular, y por lo tanto muerte
celular, la electroporación de tejidos con pulsos de microsegundos
puede ser intrínsicamente menos dañina in vivo que la mayoría
de las condiciones de electroporación in vitro. Puesto que
los pulsos ultracortos pueden afectar solo al interior de la célula,
se espera que tales pulsos tengan aproximadamente el mismo efecto
sobre tejidos que sobre células individuales.
Otra ventaja de usar pulsos ultracortos del tipo
empleado en la presente invención es la baja potencia de estos
pulsos. Aunque la potencia eléctrica de los pulsos puede ser de
varios megavatios, la energía de estos pulsos es con frecuencia tan
baja (debido su duración extremadamente corta) que los efectos
térmicos se pueden despreciar. El método de la potencia del pulso
presente es por lo tanto un método "frío" que permite la
modificación de las células a través de efectos eléctricos sin
crear ningún efecto térmico sustancial relacionado. Por ejemplo,
los efectos térmicos asociados con los pulsos empleados en el
presente método típicamente solo generan aumentos de temperatura en
el medio o tejido interno del orden de 1-2ºC. La
capacidad de modificar eléctricamente las células de una manera
"fría" es particularmente útil donde el intento es modificar
selectivamente estructuras subcelulares dentro de una célula diana
sin afectar sustancialmente a la membrana celular.
El aparato según la invención incluye un
generador de pulsos capaz de producir una salida de pulsos
eléctricos ultracortos y un sistema de distribución capaz de
dirigir la salida de pulsos eléctricos a las células diana, por
ejemplo, capaz de dirigir selectivamente la salida de pulsos
eléctrico a células diana in vivo de una manera que evita
causar lesiones sustanciales al tejido circundante.
La Fig. 1 representa un circuito eléctrico
equivalente de una célula en suspensión.
La Fig. 2 es un gráfico que muestra el campo
eléctrico requerido para cargar la membrana de la superficie de una
célula a 1 V y la correspondiente densidad de energía frente a la
duración del pulso.
La Fig. 3 muestra una célula de leucemia
HL-60 y un circuito eléctrico equivalente
simplificado de una célula que contiene un núcleo.
La Fig. 4 muestra la curva diferencia de
potencial-tiempo para modelado de aplicación de
pulsos de campo eléctrico de 60 nsec y 6 \musec a una célula
teórica. La línea de puntos muestra el pulso de diferencia de
potencial aplicado, la línea de rayas muestra las diferencias de
potencial calculadas a través de la membrana de superficie, la
línea sólida gruesa muestra la diferencia de potencial a través de
las membranas intracelulares.
La Fig. 5 muestra exámenes microscópicos
(aumentos 10X) de neutrófilos humanos teñidos 0, 10, 20 y 30 minutos
después de ser sometidos a un pulso de campo eléctrico de 60 nsec,
60 kV/cm ("A4"), sin utilizar un aparato según la invención,
en comparación con controles sin tratar (Fresco).
La Fig. 6 muestra exámenes microscópicos
(aumentos 10X) de neutrófilos humanos teñidos 0, 10, 20 y 30 minutos
después de ser sometidos a un pulso de campo eléctrico de 300 nsec,
40 kV/cm ("B6"), sin utilizar un aparato según la invención,
en comparación con controles sin tratar (Fresco).
La Fig. 7 muestra exámenes microscópicos
(aumentos 160X) de neutrófilos humanos teñidos inmediatamente
después de ser sometidos a un pulso de campo eléctrico de 60 nsec,
60 kV/cm ("A42"), un pulso de campo eléctrico de 300 nsec, 40
kV/cm ("B6"), o un pulso de campo eléctrico de 300 nsec, 60
kV/cm ("B8") sin utilizar un aparato según la invención.
La Fig. 8 muestra exámenes microscópicos
(aumentos 280X) de neutrófilos humanos teñidos inmediatamente
después de ser sometidos a un pulso de campo eléctrico de 60 nsec,
60 kV/cm (A4), o un pulso de campo eléctrico de 300 nsec, 40 kV/cm
(B6), sin utilizar un aparato según la invención.
La Fig. 9 muestra exámenes microscópicos de
neutrófilos humanos teñidos con mieloperoxidasa (aumentos 280X)
inmediatamente después de ser sometidos a un pulso de campo
eléctrico de 60 nsec, 60 kV/cm (A4), un pulso de campo eléctrico de
300 nsec, 40 kV/cm (B6), o un pulso de campo eléctrico de 300 nsec,
60 kV/cm (B8), sin utilizar un aparato según la invención, en
comparación con controles sin tratar (FRESCO).
La Fig. 10 es un gráfico del área nuclear (en
píxeles) de las células después de ser sometidas a un pulso de
campo eléctrico de 60 nsec, 60 kV/cm (A4), un pulso de campo
eléctrico de 300 nsec, 40 kV/cm (B6), o un pulso de campo eléctrico
de 300 nsec, 60 kV/cm (B8), sin utilizar un aparato según la
invención, en comparación con controles sin tratar (FRESCO).
La Fig. 11 es un gráfico de la densidad absoluta
a distancias desde su origen para neutrófilos humanos después de 2
horas de migración en placas rellenas de agarosa en respuesta a
estimulación con fMLP bacteriana; los neutrófilos se sometieron a
un pulso de campo eléctrico de 60 nsec, 60 kV/cm (A4), un pulso de
campo eléctrico de 300 nsec, 40 kV/cm (B6), o un pulso de campo
eléctrico de 300 nsec, 60 kV/cm (B8), sin utilizar un aparato según
la invención, en comparación con controles sin tratar (FRESCO).
\global\parskip1.000000\baselineskip
La Fig. 12 es un gráfico de la densidad absoluta
a distancias desde su origen para neutrófilos humanos después de 2
horas de migración no estimulada (tampón control) en placas rellenas
de agarosa; los neutrófilos se sometieron a un pulso de campo
eléctrico de 60 nsec, 60 kV/cm (A4), un pulso de campo eléctrico de
300 nsec, 40 kV/cm (B6), o un pulso de campo eléctrico de 300 nsec,
60 kV/cm (B8), sin utilizar un aparato según la invención, en
comparación con controles sin tratar (FRESCO).
La Fig. 13 es un gráfico de la distancia media
migrada por neutrófilos humanos en condiciones no estimuladas
(tampón control) y estimuladas (fMLP bacteriana) después de ser
sometidos a un pulso de campo eléctrico de 60 nsec, 60 kV/cm (A4),
un pulso de campo eléctrico de 300 nsec, 40 kV/cm (B6), o un pulso
de campo eléctrico de 300 nsec, 60 kV/cm (B8), sin utilizar un
aparato según la invención, en comparación con controles sin tratar
(FRESCO).
La Fig. 14 es un gráfico que muestra el efecto
de exposición de células de leucemia promielocítica
HL-60 en fase de crecimiento logarítmico a pulsos
de campo eléctrico de duración variable (60 nsec, 2 \musec, 10
\musec, ó 200 \musec).
La Fig. 15 es un gráfico que muestra el efecto
de exposición de células de leucemia promielocítica
HL-60 en fase de crecimiento estacionario a pulsos
de campo eléctrico de duración variable (60 nsec, 2 \musec, 10
\musec, ó 200 \musec).
La Fig. 16 es un gráfico que muestra el
porcentaje de apoptosis de células HL-60 como una
función del tiempo después de ser sometidas a pulsos IEM de 60
nsec, 60 kV/cm (A4), 300 \musec, 40 kV/cm (B6) o 300 \musec, 60
kV/cm (B8).
La Fig. 17 es un gráfico que muestra el
porcentaje de necrosis de células HL-60 como una
función del tiempo después de ser sometidas a pulsos IEM de 60
nsec, 60 kV/cm (A4), 300 \musec, 40 kV/cm (B6) o 300 \musec, 60
kV/cm (B8).
La Fig. 18 es un gráfico que muestra el
porcentaje de apoptosis de células HL-60 como una
función del tiempo después de ser sometidas a pulsos IEM de 60
nsec, 60 kV/cm (A4), 300 \musec, 40 kV/cm (B6) o 300 \musec, 60
kV/cm (B8).
La Fig. 19 es un gráfico que muestra el
porcentaje de necrosis de células HL-60 como una
función del tiempo después de ser sometidas a pulsos IEM de 60
nsec, 60 kV/cm (A4), 300 \musec, 40 kV/cm (B6) o 300 \musec, 60
kV/cm (B8).
La Fig. 20 muestra un esquema de un aparato para
modificar células, no según la invención, que incluye un generador
de pulsos tipo línea con un interruptor entrehierro puesto en marcha
por láser.
La Fig. 21 es un gráfico que muestra su forma de
un pulso de campo eléctrico ejemplar (como un gráfico de diferencia
de potencial frente al tiempo) que se puede utilizar en los métodos
presentes.
La Fig. 22 es un gráfico que muestra un espectro
de Fourier (como un gráfico de amplitud en V/Hz frente a
frecuencia) del pulso de campo eléctrico mostrado en la Fig. 21.
La Fig. 23 es un gráfico (diferencia de
potencial frente a tiempo) que muestra la forma de pulso ejemplar
de 60 nsec en comparación con un pulso de 10 microsegundos (10
\musec).
La Fig. 24 es un gráfico que muestra un espectro
de Fourier (como un gráfico de amplitud en V/Hz frente a
frecuencia) para los pulsos de 60 nsec y 10 \musec mostrados en la
Fig. 23.
La Fig. 25 es un gráfico que muestra el trazado
de la diferencia de potencial frente al tiempo para un pulso
eléctrico ultracorto producido por el generador de pulsos
ultracortos mostrado en el panel del recuadro; el pulso eléctrico
resultante es casi rectangular en forma y alcanza una diferencia de
potencial máxima en el rango de 5-6 kV, que cuando
se aplica a una suspensión de células a través de electrodos
separados 0.1 cm, utilizando un aparato no según la invención,
proporciona intensidades eléctricas en el rango de
50-60 kV/cm.
La Fig. 26 muestra exámenes microscópicos de
eosinófilos humanos teñidos con calceína (derecha) y mediante el
colorante Wright-Giemsa modificado (izquierda). Los
paneles superiores muestran la apariencia de los eosinófilos no
tratados (control), con tinción negativa de los gránulos
intracelulares dentro los eosinófilos teñidos con calceína. Tras 3
(paneles medios) ó 5 (paneles inferiores) pulsos (60 nsec, 53
kV/cm), una subserie de eosinófilos marcados con calceína
desarrolla un tinción brillante de los gránulos intracelulares al
tiempo que mantienen su marcaje citoplásmico de calceína, lo que
indica pérdida de la integridad de la membrana en los gránulos
teñidos brillantemente sin pérdida de la integridad de la membrana
de superficie (es decir, retención de la tinción citoplásmica de
calceína).
La Fig. 27 muestra exámenes microscópicos de los
efectos del tratamiento con Triton X-100 en la
tinción de calceína libre de gránulos de eosinófilos; FILA
SUPERIOR: imágenes de tinción con Wright-Giemsa
(arriba) y fluorescente (abajo) de eosinófilos (izquierda),
eosinófilos teñidos con calceína-AM (1 \muM)
(centro), y eosinófilos incubados durante 5 minutos en Triton
X-100 al 0.001% + calceína libre 1 \muM (derecha);
FILA INFERIOR: imágenes de tinción con
Wright-Giemsa (arriba) y fluorescente (abajo) de
eosinófilos tratados con calceína libre 1 \muM + Triton
X-100 al 0.005% durante 5 minutos (izquierda),
eosinófilos tratados con Triton X-100 al 0.001% +
calceína libre 1 \muM durante 5 minutos (centro) y eosinófilos
incubados con Triton X-100 al 0.05% + calceína
libre 1 \muM durante 5 minutos (derecha).
La Fig. 28 muestra las líneas de un campo
eléctrico generado en tejido entre un par de electrodos de aguja
insertados en el tejido.
La Fig. 29 muestra un agrupamiento hexagonal de
posiciones que se pueden usar para aplicar pulsos de campo
eléctrico ultracortos a un área definida de tejido in
vivo.
En el circuito equivalente simple mostrado en la
Fig. 1, se modeló la célula como un medio homogéneo, conductor
rodeado por una membrana dieléctrica. Tener en cuenta las
estructuras en las células, tal como el núcleo de la célula en
células eucariotas, requiere un modelo más complejo del circuito
equivalente. Se pueden utilizar las células de leucemia
HL-60 para demostrar la complejidad de las
estructuras en el interior de la célula. El núcleo es claramente
visible como lo son las estructuras más pequeñas dentro de él, por
ejemplo, los nucleolos. Se puede modelar las subestructuras
tratando la membrana que rodea el núcleo como un condensador y el
interior del núcleo como una resistencia, ambos elementos en serie
y en paralelo a la resistencia que describe el citoplasma en el
primer circuito equivalente, simplificado (ver, por ejemplo, la Fig.
3). De forma similar, los nucleolos también se pueden describir
mediante un arreglo de condensador resistencia en paralelo a la
resistencia del núcleo.
Los principios básicos de los circuitos
eléctricos indican que los campos eléctricos de baja frecuencia
afectarán principalmente la capacitancia mayor, que es la membrana
externa. Al aumentar la frecuencia, la membrana externa, sin
embargo, se evitará de forma efectiva, y la diferencia de potencial
aplicada se mostrará a través de la membrana interna (del núcleo).
Este modelo predice que a frecuencias de alrededor de 1 MHz, la
diferencia de potencial aplicada debería mostrarse principalmente a
través de la membrana del núcleo, más que a través de la membrana
externa. Esto significa que sería de esperar que los pulsos más
cortos con componentes de frecuencias más altas afecten al núcleo
de una célula más que a la membrana de la célula.
Asumiendo que diámetro de las estructuras
intracelulares diana, d, es pequeño comparado con el diámetro de la
célula, y que las estructuras están situadas en el centro de la
célula, la diferencia de potencial a través de la estructura
intracelular, V_{is}, se puede modelar según la ecuación:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
donde \rho_{is} es la
resistencia de la estructura intracelular diana. Se predice que la
carga de la membrana intracelular ocurra con una constante de
tiempo,
T_{is}:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
La diferencia de potencial a través de la
membrana de la estructura intracelular, Vism, se da por consiguiente
como:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
donde u(0) y u(T) son
funciones escalón a t=0 y
t=T.
El desarrollo temporal de la diferencia de
potencial aplicada, la diferencia de potencial a través del membrana
de superficie aquella a través de la membrana de la estructura
intracelular (ecuación 7) se muestran en la Figura 4 para los
parámetros celulares D=0 \mum, d=5 \mum,
\rho_{c}=\rho_{n}=100 \Omegam, c_{m}=1 \muF/cm^{2},
c_{n}= 0.5 \muF/cm^{2}, y una duración del pulso de T=60 nsec.
En este caso, se aplica un pulso rectangular, mientras que en las
situaciones experimentales, el pulso es más típicamente trapezoidal.
Se ha descrito el valor para la capacitancia de la membrana de la
superficie externa de la célula en trabajos publicados (ver, por
ejemplo, Schwan, Biophysik, 1, 190 (1963)) y se asume
que la capacitancia de las estructuras intracelulares es bien igual
bien la mitad de este valor, dependiendo de la estructura de la
membrana intracelular específica. El núcleo está rodeado por dos
membranas de bicapa lipídica que forman la envuelta nuclear,
mientras que otras estructuras intracelulares (por ejemplo,
gránulos intracelulares) pueden tener solo una membrana de bicapa
lipídica alrededor de ellos.
A partir de este modelo teórico simple, se puede
extraer varias conclusiones:
1. La diferencia de potencial a través de la
membrana intracelular puede alcanzar valores del mismo orden que la
diferencia de potencial a través de la membrana externa si la
duración del pulso es mayor que el tiempo de carga de la membrana
intracelular y el tiempo de subida del pulso es pequeño comparado
con este tiempo de carga. La importancia de la segunda condición se
puede ilustrar considerando la respuesta eléctrica de una célula a
dos pulsos con el mismo campo eléctrico, pero bastante diferentes en
los tiempos de subida (y duraciones). Se supone que los pulsos
eléctricos son similares en forma pero el pulso de duración
ultracorta (60 nsec) tiene tiempos de subida y bajada de 10 nsec,
mientras que el pulso más largo (6 \musec) tiene tiempos de
subida y bajada de 1 \musec. Si las dimensiones de las células,
capacitancias y resistencias son iguales, el pulso corto, de tiempo
de subida rápido da como resultado diferencias de potencial a través
de las membranas intracelular y de superficie que son comparables
para ambas membranas, mientras que el pulso más largo con el tiempo
de subida de microsegundos da como resultado diferencia de potencial
casi despreciable a través de la membrana intracelular. La
diferencia de potencial a través de la membrana externa para el
pulso más largo, sin embargo, alcanza el valor de la diferencia de
potencial aplicada, favoreciendo la electroporación de esta
membrana. Este efecto se ha usado en aplicaciones médicas donde se
usan pulsos en el rango temporal de decenas de microsegundos a
milisegundos para facilitar la distribución de drogas y genes a
las
células.
células.
2. Para alcanzar diferencias de potencial de más
de 1 voltio a través de membranas intracelulares, se requieren
amplitudes de campo eléctrico en el rango de megavoltio/m en una
escala de tiempo del tiempo de carga de la membrana intracelular.
Para las estructuras intracelulares con dimensiones características
de \mum, capacitancias de membrana del orden de \muF/cm^{2},
y resistencias de citoplasma de 100 \Omegam, el tiempo de carga
(ecuación 6) es menor de 6 nsec. La velocidad de cambio de
intensidad del campo eléctrico requerida es por consiguiente dE/dt
> 10^{14} voltio/(metro segundo). Solo si se satisfacen ambas
condiciones (es decir, amplitud de campo eléctrico grande más
velocidades de cambio en el campo eléctrico extremadamente rápidas),
se pueden esperar efectos intracelulares.
3. Se espera que la diferencia de potencial a
través de las membranas intracelulares sea casi linealmente
dependiente del diámetro de la estructura intracelular. Serían de
esperar efectos más pronunciados en las estructuras internas más
grandes con los mismos parámetros eléctricos.
Alcanzar una diferencia de potencial crítica a
través de la membrana intracelular es condición necesaria pero no
suficiente para la "electromanipulación intracelular"
("IEM"). Para cambiar las estructuras de la membrana, por
ejemplo, abrir defectos de membrana a un tamaño que permita el paso
de macromoléculas a través de ellos, se necesita aplicar la
diferencia de potencial crítica durante el tiempo suficiente para
permitir la expansión de los defectos a un tamaño apropiado. Se han
descrito estimaciones de la diferencia de potencial requerida para
alcanzar tales efectos en la membrana de superficie, pero no existen
tales estimaciones para membranas intracelulares. El modelo
descrito aquí por lo tanto solo proporciona condiciones para el
inicio de los efectos dependientes de campo eléctrico sobre las
membranas intracelulares, y no describe los procesos específicos
que suceden en las membranas. Sin embargo, este análisis ilustra
claramente que reducir la duración del pulso, o más precisamente,
reducir el tiempo de subida del pulso a valores menores que el
tiempo de carga para las membranas intracelulares, y aumentar las
intensidades del campo eléctrico al rango de megavoltio/m permitiría
el ataque preferencial a las membranas intracelulares. El trabajo
experimental descrito aquí establece que al menos en ciertos casos,
la aplicación de una secuencia de pulsos múltiples ultracortos
dentro de un período de tiempo relativamente corto puede amplificar
el efecto sobre las estructuras intracelulares sin causar defectos
sustanciales en la membrana de la superficie
externa.
externa.
El método presente típicamente utiliza pulsos de
campo eléctrico ultracortos que tienen una amplitud y duración
suficientes para modificar estructuras subcelulares en las células
diana, al menos cuando se aplican como una secuencia de pulsos
ultracortos en un período de tiempo relativamente corto, por
ejemplo, una secuencia de 3-5 pulsos ultracortos en
un intervalo de tiempo de 10 segundos o menos. La amplitud y
duración de cada pulso de campo eléctrico ultracorto se puede
elegir de modo que sea insuficiente para alterar la permeabilidad
de las membranas de superficie de las células diana, por ejemplo,
induciendo poros en las membranas de las células. Las células diana
están presentes como parte de un tejido. Cada pulso de campo
eléctrico ultracorto tiene una duración de pulso de no más de
alrededor de 1 microsegundo y una amplitud de al menos alrededor de
20 kV/cm. Caracterizados de una manera diferente, los pulsos de
campo eléctrico ultracortos típicamente tienen una duración de
pulso de no más que alrededor de 1 microsegundo y proporcionan una
densidad total de energía de al menos alrededor de 75 mJ/cc.
Preferiblemente, los pulsos de campo eléctrico ultracortos
proporcionan una densidad total de energía de no más de alrededor
de 10 J/cc. Más típicamente, la densidad total de energía
proporcionada por cada pulso de campo eléctrico ultracorto es de
alrededor de 75 mJ/cc hasta alrededor de 2000 mJ/cc y,
preferiblemente, alrededor de 100 mJ/cc hasta alrededor de 1000
mJ/cc. En casos en los que se aplican pulsos extremadamente cortos,
por ejemplo, pulsos que tienen una duración de alrededor de 10
nanosegundos o menos, la densidad total de energía proporcionada
por el pulso de campo eléctrico puede ser sólo del orden de
alrededor de 10 a 20 mJ/cc. Además de tener duraciones cortas, los
pulsos de campo eléctrico utilizados en los métodos presentes
normalmente tienen tiempos de subida de 50 nsec o menos.
La amplitud de un pulso de campo eléctrico (la
diferencia de potencial aplicada divida por la distancia entre los
electrodos) es generalmente al menos alrededor de 20 kV/cm, pero no
debería exceder el voltaje de ruptura del tejido que incluye las
células diana. El voltaje de ruptura aumenta con la disminución de
la duración del pulso, y se puede determinar experimentalmente. En
las condiciones normalmente empleadas en el método presente, sin
embargo, el voltaje de ruptura en general no excede de 500 kV/cm.
Los pulsos de campo eléctrico utilizados en los métodos presentes
que tienen duraciones de 10 a 500 nsec típicamente tienen amplitudes
de alrededor de 20 kV/cm hasta alrededor de 300 kV/cm.
Para minimizar los efectos potenciales en la
temperatura media interna del medio ("efectos térmicos"), los
pulsos de campo eléctrico generalmente tienen un tiempo de subida
rápido y una duración corta. Los pulsos deberían ser
preferiblemente de menos de un microsegundo, pero más de 100
picosegundos de duración. La duración normal de un pulso es de
alrededor de 1 nanosegundo hasta alrededor de 500 nanosegundos,
teniendo los pulsos típicamente una duración de 10 hasta 300
nanosegundos. La duración óptima del pulso variará dependiendo del
tipo de célula, tipo de tejido y tratamiento deseado, entre otros
factores. El pulso debería ser preferentemente rectangular o
trapezoidal, pero también se pueden utilizar otras formas de pulsos.
Por ejemplo, para abrir tanto las membranas externas como internas
de la célula, se podría combinar un pulso intenso corto con otro
pulso menos intenso más largo. Otros ejemplos de formas de pulsos
adecuados incluyen pulsos exponenciales que decaen, pulsos
unipolares y pulsos
bipolares.
bipolares.
El tiempo de subida del pulso de campo eléctrico
ultracorto es típicamente de no más de alrededor del 20% y,
preferiblemente, de no más de alrededor del 10% de la duración del
pulso. Por ejemplo, si la duración del pulso es de alrededor de 100
nanosegundos, el tiempo de subida del pulso es preferiblemente de
alrededor de 10 nanosegundos o más corto. Para pulsos con
duraciones de pulso de alrededor de 400 nanosegundos o más largos,
son normales tiempos de subida del pulso de alrededor de
30-40 nanosegundos. Con pulsos que tienen duraciones
extremadamente cortas, por ejemplo, un nanosegundo o menos, el
tiempo de subida es con frecuencia un porcentaje mayor de la
duración del pulso. Por ejemplo, pulsos con una duración de menos de
un nanosegundo, pueden tener normalmente un tiempo de subida que es
de hasta alrededor del 50% de la duración del pulso.
La duración, tiempo de subida y distribución de
de frecuencias de la transformada de Fourier del pulso están
relacionadas. La Figura 24 muestra el espectro de Fourier de un
pulso corto (60 nsec) que se extiende al rango de 10 MHz y para un
pulso largo (10 microsec) que se extiende hasta el rango de 100 KHz.
Con el aumento en la frecuencia (es decir, disminución del tiempo
de subida del pulso), la membrana de la superficie externa de la
diana se evitará de forma efectiva, y la diferencia de potencial
aplicada se mostrará a través de la membrana interna (del núcleo).
Este comportamiento se muestra en la Fig. 4, donde se representa la
diferencia de potencial a través de la membrana de superficie
(externa) y aquella a través de la membrana del núcleo frente a la
frecuencia. La Figura 4 predice que a frecuencias de alrededor de 1
MHz, la diferencia de potencial aplicada debería mostrarse
principalmente a través de la membrana de estructuras subcelulares,
tal como el núcleo, más que a través de la membrana de la
superficie externa. Los pulsos de campo eléctrico con una duración
de menos de alrededor de 1 microsegundo y tiempos de subida de 40
nanosegundos o menos tienen transformadas de Fourier que incluyen
frecuencias de más de 1 MHz con amplitudes sustanciales.
El espectro de Fourier de los pulsos que se
utilizan en los métodos presentes puede incluir frecuencias con
amplitudes sustanciales de hasta alrededor de 1 GHz. Típicamente,
los pulsos utilizados en los métodos presentes tienen espectros de
Fourier que incluyen frecuencias por encima de 1 MHz con amplitudes
mayores del 50% de la diferencia de potencial máxima en el espectro
(de aquí en adelante referido como mayor que "V_{MAX}/2").
Preferiblemente, los espectros de Fourier de los pulsos incluyen
frecuencias entre 5 y 50 MHz con amplitud mayor que V_{MAX}/2.
Por ejemplo, un pulso rectangular de 60 nanosegundos tal como el que
se muestra en la Fig. 21 tiene un espectro de Fourier que incluye
frecuencias con amplitud mayor que V_{MAX}/2 hasta alrededor de
10 MHz. Por el contrario, el espectro de Fourier de un pulso
rectangular de 10 microsegundos tiene solo frecuencias de esta
amplitud hasta alrededor de 200-500 kHz (ver la
comparación en las Figs. 23 y 24).
Como se ha indicado anteriormente, para
modificar estructuras subcelulares en las células diana puede ser
provechoso aplicar una serie de pulsos de campo eléctrico
ultracortos en un intervalo de tiempo relativamente corto. Por
ejemplo, se ha encontrado que la aplicación de una secuencia de 3 a
5 pulsos de campo eléctrico ultracortos (por ejemplo, pulsos
trapezoidales con duraciones de 10-300 nsec y
amplitudes de alrededor de 25 a 300 kV/cm) puede ser más eficaz
para modificar subestructuras que un pulso individual de la misma
amplitud y duración (ver el Ejemplo 9). Por ejemplo, la aplicación
de secuencia de multipulsos con aproximadamente un intervalo de un
segundo (retraso) entre pulsos puede romper gránulos en los
eosinófilos sin daño significativo a la membrana externa de la
célula. Donde se emplean secuencias de multipulsos en los métodos
presentes, el intervalo de tiempo entre los pulsos subsiguientes
puede variar en un amplio rango, por ejemplo, entre 1.0
milisegundos y 100 segundos. Como otro ejemplo, las secuencias de
pulsos múltiples con intervalos de tiempo entre pulsos de alrededor
de 0.1-3 segundos son bastante adecuadas para
iniciar apoptosis. Aunque se pueden utilizar números mayores de
pulsos, las secuencias multipulso utilizadas en los métodos
presentes típicamente incluyen hasta alrededor de 20 pulsos, que en
general están especiados a intervalos regulares de tiempo. Se
pueden obtener resultados adecuados con frecuencia para ciertos
tipos de células (por ejemplo, eosinófilos, neutrófilos y
linfocitos T) aplicando 3-5 pulsos de campo
eléctrico ultracortos en un período de tiempo relativamente corto,
por ejemplo, en un período de tiempo no mayor de alrededor de 5 a 10
segundos. Como se ha indicado anteriormente, la amplitud y duración
del pulso de campo eléctrico ultracorto se eligen típicamente de
modo que la secuencia de pulsos no altere de forma permanente la
permeabilidad de las membranas de superficie de las células diana,
por ejemplo, rompiendo las membranas de superficie.
El método presente se puede utilizar para
modificar diferentes células. Por ejemplo, las células diana pueden
ser cualquiera de diferentes células normales, tal como adipocitos,
células de hueso, células vasculares, células musculares, células
de cartílago y similares. En algunos casos, la técnica se puede usar
para modificar selectivamente ciertos tipos de células en presencia
de otras células. Por ejemplo, los parámetros del métodos presente
se pueden ajustar para inducir selectivamente apoptosis en células
tumorales in vivo (por ejemplo, células de carcinoma,
células de sarcoma, o células de papiloma) sin afectar de forma
sustancial a las células normales en el tejido circundante. Como
otro ejemplo, la técnica se puede utilizar para destruir
selectivamente eosinófilos en una mezcla que incluye eosinófilos y
neutrófilos (ver, por ejemplo, la Tabla II en el Ejemplo 4 aquí).
Los experimentos descritos aquí indican que las técnicas presentes
se pueden utilizar para modificar selectivamente células de
crecimiento más rápido en presencia de células de crecimiento más
lento (por ejemplo, células en fase estacionaria). En otros casos,
la selectividad puede estar basada simplemente en limitar
espacialmente la aplicación de pulso(s) de campo eléctrico
ultracorto(s). Por ejemplo, utilizando una configuración de
electrodos apropiada, las células en un área predeterminada del
tejido se pueden modificar selectivamente in vivo (por
ejemplo, a través del inicio de la apoptosis) sin alterar las
células en el tejido inmediatamente circundante. Los dispositivos
que incorporan tales configuraciones de electrodos se utilizan
actualmente con pulsos convencionales de electroporación (pulsos
con duración de \musec) para aumentar la distribución de drogas
terapéuticas a células en un área predeterminada.
El aparato de la invención se puede usar en un
método que se puede utilizar para iniciar apoptosis en células
diana aplicando al menos un pulso de campo eléctrico ultracorto con
una duración del pulso de no más de alrededor de 1 microsegundo a
las células diana. En tales casos, el pulso de campo eléctrico
normalmente proporciona una densidad total de energía de al menos
alrededor 75 mJ/cm, aunque se pueden utilizar pulsos con menor
energía, en particular donde el pulso tiene una duración
extremadamente corta y una amplitud relativamente alta o donde se
aplican secuencias de pulsos múltiples a las células diana en un
intervalo de tiempo relativamente corto, por ejemplo, con un
espaciamiento de 1-2 segundos entre los pulsos
sucesivos.
Tras la elección de los parámetros correctos, se
puede usar el presente método para destruir selectivamente células
diana en una mezcla que incluye las células diana y un segundo tipo
de células. Por ejemplo, se puede utilizar el método para destruir
eosinófilos de forma selectiva en una mezcla que incluye eosinófilos
y neutrófilos.
El método presente típicamente utiliza un
aparato para electromanipulación intracelular que incluye un
generador de pulsos y un sistema de distribución adaptado para
dirigir la salida del pulso eléctrico a las células diana. El
generador de pulsos incluye una red formadora de pulsos y un
interruptor de alto voltaje. La red formadora de pulsos puede ser
un cable de lato voltaje, línea triplaca, o una red formadora de
pulsos construida de condensadores e inductores individuales en un
arreglo de línea de transmisión. El interruptor de alto voltaje
puede ser de forma adecuada un interruptor en estado gaseoso,
líquido o sólido. La energía en la red formadora de pulsos se puede
almacenar de forma capacitiva, que requiere un interruptor de
cerrado para liberar un pulso, o de forma inductiva, que requiere
un interruptor de apertura para liberar un pulso. Después de
desencadenar el interruptor, se lanza un pulso eléctrico a la
carga, es decir, las células diana en forma de tejido. El
interruptor se puede hacer funcionar por medio de varios métodos
comunes, por ejemplo, de forma óptica o eléctrica. La última se
puede alcanzar utilizando un tercer electrodo o mediante
sobrevoltaje en el interruptor. Se muestra un ejemplo de un sistema
de energía pulsado de cable adecuado, diseñado para generar pulsos
ultracortos del tipo utilizado en el método presente en la Fig. 20.
La Figura 21 muestra la forma típica de un pulso utilizado en los
métodos presentes y el espectro de Fourier correspondiente del pulso
se muestra en la Figura 22. Los pulsos de campo eléctrico pueden
variar en longitud ("duración") cambiando la red formadora de
pulsos, tal como mediante reducción o aumento de la longitud del
cable o la línea triplaca, o utilizando un interruptor que se puede
cerrar o abrir. Se describe un ejemplo específico de un aparato
adecuado para modificar células mediante electromanipulación
intracelular en el Ejemplo 10 aquí.
La "carga", que incluye las células diana
en el tejido está localizada entre dos o más electrodos. Estos
electrodos pueden ser de material sólido, alambres, o combinaciones
de los mismos. Se conecta un(a) (serie de)
electrodo(s) a la conexión de alto voltaje del generador de
pulsos, y un(a) segunda (serie de) electrodo(s) se
conecta a la conexión de tierra del generador de pulsos de una
manera adecuada, por ejemplo, a través de una segunda línea de
transmisión o un cable de alto voltaje. El material del electrodo es
un conductor, lo más normal metal.
Un generador de pulsos de campo eléctrico
ultracortos típico (``generador "USPEF") incluye una red
formadora de pulsos distribuida, un interruptor para permitir la
transferencia rápida de energía eléctrica a la carga, y la carga
misma (ver, por ejemplo, la Figura 25, recuadro). Si se carga tal
red formadora de pulsos hasta 18 kV, y después se libera, esta
carga puede producir un pulso de duración ultracorta casi
rectangular (ver Figura 25), que cuando se aplica a una carga de 10
\Omega, produce una diferencia de potencial máxima de 9
megavoltios. La intensidad de campo eléctrica correspondiente entre
dos electrodos separados por 1.0 mm es 90 kV/cm. La potencia
eléctrica máxima, V^{2}/R, que se puede alcanzar en estas
condiciones es de 8.1 MW, mientras que las energía (potencia x
duración del pulso) transferida a la carga es solo de 0.49 julios.
Para un volumen de suspensión de células de 100 \muL, la densidad
de energía es por lo tanto 4.5 J/cc. Esta transferencia de energía
da como resultado un aumento en la temperatura máxima calculado de
solo alrededor de 1ºK para un pulso individual.
En una forma de realización particularmente
útil, el aparato incluye un generador de pulso capaz de producir
pulsos eléctricos ultracortos y un sistema de distribución capaz de
dirigir selectivamente la salida de pulsos eléctricos a las células
diana in vivo, por ejemplo, capaz de dirigir selectivamente
la salida de pulsos eléctricos a células tumorales in vivo
de una manera que evita causar lesiones sustanciales al tejido
circundante. El generador de pulsos en un aparato de este tipo es
típicamente capaz de generar pulsos eléctricos que tienen una
duración de 1 a 500 nanosegundos y amplitudes de al menos 10 kV/cm.
El sistema de distribución incluye uno o más pares de electrodos
capaces de ser insertados en tejido in vivo en forma de una
agrupación de electrodos de agujas. En otra configuración, el
sistema de distribución incluye al menos un electrodo que es un
componente de un catéter. Las configuraciones básicas para sistemas
de distribución se describen en
WO-A-97/49450. Para su uso en los
métodos presentes, tal sistema de distribución no necesita incluir
un puerto de infusión para la administración intravascular de una
composición
farmacéutica.
farmacéutica.
Los siguientes ejemplos se presentan para
ilustrar la presente invención y para asistir al experto en la
materia en hacer y usar la misma. No se pretende que los ejemplos
de un modo u otro limiten el ámbito de la invención.
Se realizaron experimentos para determinar los
efectos de pulsos eléctricos de banda ultra ancha, baja energía,
corta duración (Electromanipulación intracelular o "IEM") para
inducir muerte celular retrasada, dependiente del tiempo y/o
dependiente de la energía/potencia en neutrófilos humanos. Se
sometieron grupos de células a pulsos individuales rectangulares
que tenían los siguientes parámetros y se compararon con células
control no tratadas: A4 - 60 nsec, 60 kV/cm; B6 - 300 nsec, 40
kV/cm; y B8 - 300 nsec, 60 kV/cm.
Las células se tiñeron con
calceína-AM, una sonda fluorescente verde que tiñe
el citoplasma de células vivas, intactas, y después se expusieron a
varios pulsos de IEM. Inmediatamente después de la exposición a IEM,
las células se tiñeron con homodímero de bromuro de etidio (EtBr),
una sonda fluorescente roja no permeable a la membrana que tiñe el
núcleo de las células que muestran daño en la membrana plasmática.
Las células se centrifugaron sobre portaobjetos de vidrio
(cytospin). Las células se observaron en condiciones para
fluorescencia de calceína (panel izquierdo) o EtBr (panel medio)
(ver Figs. 5-7). Las imágenes se capturaron, y se
marcaron los campos. Las células se tiñeron después con colorante
de Wright (panel derecho), se observaron los mismos campos, y se
capturaron las imágenes en condiciones para microscopía óptica. Las
imágenes se observaron a una amplificación de 10X.
Los neutrófilos humanos recién aislados muestran
una duración de la vida limitada y sufren muerte celular durante el
cultivo in vitro. A tiempo 0 (T0) después de la IEM, solo un
pequeño porcentaje de células (2-5%) muestran
fluorescencia de EtBr, lo que indica pocas células con la membrana
rota (ver la Fig. 5a). Después de 1 horas, se indica un pequeño
aumento en el número de células rotas. Las células aparecen como
pequeños círculos rosáceos (citoplasma) con puntos purpúreos
oscuros (núcleos) dentro de ellos.
Con los parámetros de pulso de A4 a T0 después
de la IEM, no se observa aumento en el número de células
fluorescente con EtBr, lo que indica que las células están aún
intactas (ver Fig. 5). Se produce un pequeño aumento dependiente
del tiempo en el número de neutrófilos que muestran fluorescencia de
EtBr, indicando un pequeño aumento en la muerte celular. A T30, hay
un pequeño aumento en el número de células muertas comparadas con
las células control de T30.
Con los parámetros de pulso B6 a T0 después de
la IEM, no se observa aumento en el número de fluorescencia de
EtBr, lo que indica que las células están aún intactas (ver Fig. 6).
Sin embargo, se produce un aumento más rápido en el número de
células fluorescentes con EtBr con el tiempo. Obsérvese en B6, a T20
y T30 (panel medio) hay aumentos en el porcentaje de células
muertas y en el panel de la derecha, son evidentes aumentos en el
número de células lisadas, rotas. Estas aparecen como manchas
rosáceas (citoplasma derramado) alrededor de núcleos oscuros. Se
observaron resultados similares con el pulso B8.
\vskip1.000000\baselineskip
Se examinó la capacidad de la IEM para alterar
estructuras subcelulares sin romper la membrana plasmática. Se
"modificaron" vesículas que contenían proteasas en los
neutrófilos antes de que se "modificara" el núcleo,
demostrando de esta manera selectividad para modificar estructuras
subcelulares.
Método: Los parámetros de IEM incluyeron
sin tratar o control (fresco), A4 (60 nsec, 60 kV/cm), B6 (300 nsec,
40 kV/cm), y B8 (300 nsec, 60 kV/cm). Todas las exposiciones fueron
inmediatamente después de la exposición de IEM (T0) y las imágenes
fueron a 160X aumentos (Fig. 7) ó 280X aumentos (Figuras 8 y 9).
Resultados: Figura 7. Con condiciones de
parámetros de pulso A4 a T0 tras la IEM, no se observó aumento en
la fluorescencia con EtBr, lo que indica que las células están aún
intactas. Los neutrófilos A4 mostrados están intactos y muestran
morfología similar a las células control. El citoplasma muestra
fluorescencia (panel izquierdo) y tinción de Wright (panel derecho)
relativamente uniformes. Los cambios nucleares son mínimos (tinción
púrpura oscuro de núcleos lobulados o irregulares, rodeados por un
citoplasma teñido más claro).
Por el contrario, con los parámetros del pulso
B6 a T0 tras la IEM, el citoplasma muestra fluorescencia con
calceína desigual con "poros" o "agujeros" que muestran la
ausencia de fluorescencia (panel izquierdo). La tinción de Wright
(panel derecho) también indica "poros" o "agujeros". La
tinción nuclear aparece de alguna manera desigual, con inicios de
evidencia de "poros" o "agujeros".
Con los parámetros del pulso B8 a T0 tras la
IEM, la tinción citoplásmica es casi inexistente y la tinción
nuclear muestra "poros" o "agujeros" significativos (panel
derecho). El control B8 (panel izquierdo, tinción de Wright)
muestra los neutrófilos no expuestos a IEM (normal), pero preparados
al mismo tiempo que los neutrófilos expuestos a la IEM B8.
B5 (panel derecho, tinción de Wright) muestras
condiciones de IEM (300 nsec, 30 kV/cm) entre A4 y B6. Obsérvese
cómo los "poros" o "agujeros" empiezan a hacerse evidentes
en el citoplasma. El control B5 (panel izquierdo, tinción de
Wright) muestra neutrófilos no expuestos a IEM (normal), pero
preparados al mismo tiempo que los neutrófilos expuestos a IEM
B5.
Figura 8. Los neutrófilos de los parámetros de
pulso A4 y B6 se muestran a una amplificación mayor (280X) para
mostrar de forma más clara las características citoplásmicas. Los
"poros" o "agujeros" están presentes en B6, pero no en
A4.
Figura 9. Se muestran los neutrófilos tras la
tinción con mieloperoxidasa, que tiñe las vesículas de los
neutrófilos que contienen proteasas utilizadas para matar
bacterias. La tinción con mieloperoxidasa a T0 en frescos y
parámetros A4 de IEM aparece relativamente granular, indicando la
presencia de numerosas vesículas pequeñas que contienen proteasas.
Con parámetros B6 de IEM, la tinción es más difusa, lo que indica la
ruptura de vesículas. Con los parámetros B8 de IEM, la tinción es
casi inexistente, indicando que casi todas las vesículas se han
roto con las condiciones de energía/potencia más altas.
\vskip1.000000\baselineskip
Se examinó la capacidad de IEM para inducir
contracción nuclear en neutrófilos y células HL-60.
La contracción nuclear es una característica típica de la muerte
celular por apoptosis (muerte celular programada).
Método: Los parámetros de IEM incluyeron
sin tratar o control (fresco), A4 (60 nsec, 60 kV/cm), B6 (300 nsec,
40 kV/cm), y B8 (300 nsec, 60 kV/cm). Las células se tiñeron con
tinción de Wright inmediatamente después de ser sometidas al pulso
de IEM, los núcleos se ajustaron a la escala gris y se determinó el
área de píxeles. Se determinaron los tamaños de los núcleos de 30 a
42 células y se representó cada uno según el área de
píxel.
píxel.
Resultado: Los núcleos de neutrófilos
expuestos a los tres parámetros de IEM son significativamente más
pequeños que las células control (ver Figura 10). Se determinó el
área nuclear media en píxeles para cada condición (condiciones de
IEM). En contraste con el control que tenía un área media de píxeles
de 15152 \pm 338 (30 determinaciones), las células sometidas a un
pulso de IEM tenían las siguientes áreas medias en píxeles:
A4 - 11871 \pm 324 (30 determinaciones);
B6 - 13814 \pm 338 (42 determinaciones); y
B8 - 12147 \pm 338 (35 determinaciones).
Las células de leucemia promielocítica
HL-60 también mostraron contracción nuclear (datos
no mostrados).
\vskip1.000000\baselineskip
Se examinaron los parámetros de IEM requeridos
para inducir muerte celular en diferentes tipos de células. Se
observó que los eosinófilos eran más sensibles a IEM que los
neutrófilos.
Método: Los parámetros de IEM incluyeron
sin tratar o control (fresco), A4 (60 nsec, 60 kV/cm), B6 (300 nsec,
40 kV/cm), y B8 (300 nsec, 60 kV/cm) así como parámetros de IEM
adicionales como se indica. Las preparaciones de neutrófilos
humanos incluyen algunos eosinófilos contaminantes, que son más
abundantes durante las estaciones de fiebre del heno/alergia (al
tiempo de estos estudios). Se determinó el número de eosinófilos
como un porcentaje del número de neutrófilos mediante morfología y
conteo de células con un microscopio óptico.
\newpage
Resultado: Al aumentar la
energía/potencia de la IEM, el número de eosinófilos presentes
inmediatamente después de la IEM desciende significativamente de la
población de células sin pérdidas significativas de neutrófilos
(ver la Tabla I).
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
La IEM altera la función de los neutrófilos sin
romper la membrana plasmática. Los efectos sobre la quimiotaxis son
diferentes que los efectos sobre el movimiento no estimulado, lo que
sugiere un efecto selectivo sobre la función de los
neutrófilos.
Método: Los parámetros de IEM incluyeron
sin tratar o control (S), A4 (60 nsec, 60 kV/cm), B6 (300 nsec, 40
kV/cm), y B8 (300 nsec, 60 kV/cm). Las células se expusieron a
varios parámetros de IEM, se colocaron en pocillos cortados en
placas rellenas de agarosa, y después se indujeron a arrastrarse en
respuesta a un tampón control (movimiento no estimulado) o a
un estimulante químico de fMLP bacteriano (quimiotaxis).
Después de dos horas de movimiento en agarosa, las células se
tiñeron y se determinaron la densidad absoluta a distancias del
origen y la distancia media migrada por la población de neutrófilos
mediante análisis de imagen.
Resultado: Para la quimiotaxis, hay una relación
directa entre energía/potencia y la inhibición de la función de la
quimiotaxis; mayor energía/potencia da como resultado aumentos en la
inhibición de la quimiotaxis determinada mediante la densidad
absoluta a distancias del origen en cada (Fig. 11) y distancia media
migrada (Fig. 13). Hubo una inhibición del 61.6%, 62.4%, y 87.8%
con los parámetros A4, B6, y B8, respectivamente, como un porcentaje
de la migración del control estimulado con fMLP bacteriana, según
se determina mediante la distancia media migrada por la población
de neutrófilos (ver Tabla II).
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\newpage
Por el contrario, para el movimiento no
estimulado parece haber poco efecto entre energía/potencia e
inhibición del movimiento (ver Figs. 12 y 13). La relación entre
energía/potencia del pulso e inhibición del movimiento no
estimulado no está clara. Con los parámetros A4, B6, y B8,
respectivamente (ver Tabla II), las células no estimuladas pulsadas
mostraron pequeñas cantidades de inhibición de la migración con
respecto al control no estimulado.
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Se examinó el efecto de la IEM sobre la
proliferación de células HL-60 en fase de
crecimiento logarítmico. La proliferación se inhibió por la IEM
como función de la duración del pulso. Estos resultados indican un
potencial para la IEM para matar selectivamente células que crecen
con rapidez, por ejemplo, células tumorales.
Método: Las células HL-60
se mantuvieron a una densidad de 100-300000
células/ml, condiciones para tiempo de duplicación celular máximo
(10-14 h, crecimiento en fase logarítmica). Las
células se expusieron a varios parámetros de IEM manteniendo la
energía de exposición constante (200-250 mJ/ml) con
diferentes duraciones de pulso según se indica. Las células se
diluyeron después a 50000 células/ml y se determinó el número de
células viables (células que excluyeron el azul tripán; esto es,
células vivas) después de 0, 24, y 48 horas usando un hemocitómetro
con un microscopía óptica.
Resultados: El número de células viables
no fue diferente del control inmediatamente después del tratamiento
con IEM (ver Fig. 14). Veinticuatro horas después de la IEM, las
células tratadas crecían a tasas similares al control, excepto en
las condiciones de los tiempos de pulsos más largos (200 \musec).
Después de 48 horas, la tasa de proliferación de las células
expuestas a un pulso de 0.06-10 \musec empezó a
descender, indicando más sucesos de muerte que sucesos de
proliferación. Las células expuestas a un pulso de 200 \musec
aumentaron su tasa de proliferación hasta casi la tasa del
control.
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Se examinó el efecto de la IEM sobre la
proliferación de células HL-60 en fase de
crecimiento estacionario. El crecimiento se aumentó por la IEM como
función de la duración del pulso. Estos resultados indican un
potencial para condiciones específicas de IEM para fomentar el
crecimiento de células que se dividen lentamente.
Método: Las células HL-60
se mantuvieron a una densidad de 1-3000000
células/ml durante 3-5 días, condiciones para un
tiempo de duplicación mínimo (casi crecimiento en fase
estacionaria). Las células se expusieron a varios parámetros de IEM
manteniendo la energía de exposición constante
(1.7-1.9 J/ml) con diferentes duraciones de pulso
según se indica. Las células se diluyeron después da 50000
células/ml y se determinó el número de células viables (células que
excluyeron el azul tripán; esto es, células vivas) después de 0, 24,
y 48 horas usando un hemocitómetro con microscopía óptica.
Resultados: El número de células viables
no fue significativamente diferente del control inmediatamente
después del tratamiento con IEM (ver Fig. 15). Después de 24 y 48
horas, las tasas de proliferación eran mayores que el control para
células expuestas a un pulso de 0.05 ó 200 \musec. La tasa de
proliferación fue menor que el control para células expuestas a un
pulso de 10 \musec. Se observó que un pulso de duración mínima
inhibía la proliferación de células que crecen lentamente.
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Los experimentos descritos en el Ejemplo 3
anteriormente (ver Fig. 10) demostraron que los pulsos de IEM pueden
dar como resultado la contracción del núcleo, una señal de la
apoptosis. Nuevos datos utilizando marcadores más específicos y
definitivos para apoptosis así como para necrosis, apoyan la
hipótesis de que los pulsos de IEM inducen apoptosis en neutrófilos
y células HL-60.
Método: Los parámetros de IEM incluyen
sin tratar o control (fresco), A4 (60 nsec, 60 kV/cm, 216 mJ/cc), B6
(300 nsec, 40 kV/cm, 480 mJ/cc), y B8 (300 nsec, 60 kV/cm, 1.08
J/cc). Se incubaron los neutrófilos o las células
HL-60 con anexina V-FITC y
homodímero de bromuro de etidio ("EtBr"). La unión a anexina
V-FITC se usó como un marcador cuantitativo de
apoptosis. La anexina V muestra unión a fosfatidilserina dependiente
de calcio. Mientras que la fosfatidilserina está normalmente
restringida a la capa interna de la membrana celular en células
normales y es por lo tanto inaccesible a la anexina V en solución,
las células apoptóticas expresan fosfatidilserina en su capa
externa en la membrana, dando como resultado en la unión fácil de
anexina V a sus superficies. El EtBr se une al ADN, pero es
impermeable a la membrana celular. La fluorescencia de EtBr se da
solamente en células que han roto sus membranas. Por lo tanto, las
células apoptóticas muestran solo fluorescencia de anexina mientras
que las células necróticas muestran fluorescencia por EtBr más o
menos fluorescencia de anexina. Las células se exponen a la IEM y a
los tiempos indicados tras la IEM, se evalúan las células mediante
microscopía de fluorescencia, se cuentan y se expresan como
porcentaje de células que muestran apoptosis y necrosis.
Resultados: Las células control
(neutrófilos humanos) no muestran marcadores significativos para
apoptosis o necrosis durante el paso del tiempo del experimento
(ver Figs. 16 y 17). Esto indica que estos pulsos no matan la
célula mediante rotura de la membrana. Las células
HL-60 expuestas a las condiciones de IEM A4, B6, y
B8 muestran un aumento de la apoptosis dependiente del tiempo y
dependiente de energía o potencia. En A4, B6, y B8, las células
empiezan a mostrar los marcadores de apoptosis después de 5, 3, y 1
horas, respectivamente (ver Fig. 16). Mientras las células
apoptóticas continúan hacia la muerte celular, se produce necrosis,
secundaria a la apoptosis (ver Fig. 17). Esto está indicado
mediante la aparición de necrosis solo después de la apoptosis. La
necrosis secundaria en un efecto específico in vitro. In
vivo, las células apoptóticas son eliminadas mediante
fagocitosis antes de que se produzcan la necrosis e inflamación. Las
Figuras 18 y 19 muestran resultados similares para
neutrófilos
humanos.
humanos.
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La calceína libre es una fluoresceína modificada
altamente fluorescente con 6 cargas negativas y 2 positivas que no
es penetrante a la membrana. En su forma de éster metílico,
calceína-AM, es no fluorescente y permeable a la
membrana. Cuando se usa como tinción fluorescente para células, la
calceína-AM pasa a través de la membrana y se corta
en calceína libre + el residuo de éster metílico por actividades
esterasas intracelulares. Esta modificación atrapa la calceína
libre en el citoplasma de la célula, y la retención de la calceína
libre es un criterio común para la integridad de la membrana de
superficie. Además de permanecer atrapada en la célula, la calceína
intracelular libre también permanece excluida de otros
compartimentos intracelulares unidos a la membrana debido a su
naturaleza impenetrable a la membrana (un efecto ilustrado en los
eosinófilos marcados con calceína-AM que muestran
fluorescencia de calceína citoplásmica libre brillante y "tinción
negativa" de sus gránulos intracelulares
grandes).
grandes).
Se expusieron alícuotas de una preparación de
leucocitos enriquecida en eosinófilos (65% de eosinófilos) a
calceína libre 1 \muM en HBSSw/o más cantidades crecientes
(0%-0.05%) de Triton X-100 (5 minutos, 25ºC) y se
examinaron microscópicamente. Los eosinófilos expuestos a calceína
libre sin Triton no mostraron tinción con calceína consistente con
las características de impenetrable a la membrana de la calceína
libre. La autofluorescencia roja de los eosinófilos fue fácilmente
visible y también era visible en todas las condiciones hasta e
incluyendo la exposición a calceína libre + Triton al 0.01%. Sin
embrago, en la condición de calceína libre + Triton al 0.01%,
eosinófilos ocasionales mostraron un gránulo verde brillante aislado
dentro del patrón de autofluorescencia del eosinófilo. En la
condición de calceína libre + Triton al 0.05%, la iluminación
fluorescente reveló muchas áreas discretas de fluorescencia verde
pálida con áreas puntuadas de fluorescencia verde brillante
sobrepuestas. Tras la tinción de Wright-Giemsa,
estas se reconocieron como núcleos residuales de células totalmente
solubilizadas por el detergente (fluorescencia verde pálida) con
gránulos eosinofílicos asociados que corresponden exactamente a las
áreas puntuadas de fluorescencia brillante (ver Fig. 26). Estos
resultados ilustran que los gránulos de eosinófilos tratados con
detergente se tiñen de manera brillante con calceína libre,
presumiblemente debido a la interacción entre los componentes
catiónicos de los gránulos de eosinófilos y la calceína libre
aniónica, y son paralelos a los resultados de otros usando
anticuerpos marcados con fluoresceína.
Los eosinófilos teñidos con
calceína-AM atrapan la calceína libre en su
citoplasma tras la tinción (izquierda), y la calceína intracelular
se excluye de los gránulos grandes de los eosinófilos como se
muestra a la izquierda. Sin tratamiento con Triton, la calceína
libre es incapaz de teñir el citoplasma de eosinófilos (centro):
solo es visible la autofluorescencia de los eosinófilos. Con
incubación en Triton al 0.001%, la calceína libre continúa siendo
excluida de los eosinófilos, pero tiñe los gránulos finos de un PMN
que muestras efectos evidentes del detergente (derecha) (ver Fig.
27). Con el tratamiento con Triton al 0.005% (izquierda), la
morfología de algunos eosinófilos sugiere solubilización parcial
por el detergente que se acompaña por la tinción brillante de la
calceína libre de los gránulos de eosinófilos, y los PMN
solubilizados por el detergente muestran unos patrones de tinción
muy finos de "arena de calceína" fluorescente. Con el
tratamiento de Triton al 0.01% + calceína libre 1 \muM (centro),
todos los eosinófilos muestran cambios nucleares que sugieren
efectos del detergente, y muchos contienen 1-2
gránulos brillantes en un fondo de autofluorescencia roja. Con el
tratamiento de Triton al 0.05% + calceína libre 1 \muM, solo se
ven remanentes nucleares de eosinófilos (derecha, arriba), algunos
con gránulos eosinofílicos asociados que son brillantemente
fluorescentes con calceína libre (derecha, abajo).
En la Figura 25 se ilustra un generador de
pulsos típico para producir efectos USPEF, y consiste en una red
formadora de pulsos (típicamente un cable coaxial o una línea
triplaca), un interruptor y la carga. En el caso de una carga
equilibrada (resistencia de la carga = la impedancia de la red
formadora de pulso), el pulso de diferencia de potencial a través
de la carga tiene una amplitud de la mitad de la diferencia de
potencial aplicada a la red formadora de pulsos (para los
experimentos descritos, la red formadora de pulsos comprende 5
cables de alto voltaje de 50 \Omega en paralelo, que alcanzan la
impedancia requerida de 10 \Omega para operaciones ajustadas). La
duración del pulso es el doble de la longitud del cable o la línea
triplaca, dividido por la velocidad de la onda electromagnética en
el dieléctrico de la red formadora de pulsos. El interruptor es un
entrehierro simple en el aire atmosférico. La diferencia de
potencial de ruptura se fija variando la distancia de la abertura.
La carga consiste en los 100 \muL de suspensión de células a ser
expuestas al USPEF, y cuando se usa solución salina equilibrada de
Hanks sin Ca^{++} ni Mg^{++} (HBSSw/o) para resuspender las
células, tiene una resistencia eléctrica de 100 \Omegacm. La carga
se coloca en una cubeta de electroporación (BioRad, Inc., Hercules,
CA) construida con electrodos de aluminio en placas paralelas de 1
cm^{2} de área y separadas por 0.1 cm, dando como resultado una
resistencia de la carga R = 10 \Omega.
Se purificaron leucocitos polimorfonucleares
(PMN) a partir de sangre heparinizada obtenida de donantes adultos
voluntarios, utilizando sedimentación con
hypaque-ficoll, sedimentación con dextrano y lisis
hipotónica. Estas preparaciones de células eran típicamente
92-95% de PMN, 5-8% de eosinófilos y
1-3% células mononucleares. Tras la purificación,
las preparaciones de PMN se marcaron con calceína-AM
1 \muM (Molecular Probes, Inc. Eugene, OR) según las directrices
del fabricante, se lavaron y ajustaron a 20 x 10^{6}/ml en
solución salina equilibrada de Hanks sin Ca^{++} ni Mg^{++}
(HBSSw/o).
Inmediatamente después de la aplicación de
USPEF, las células se retiraron de la cubeta, se diluyeron 1:4 en
HBSS con Ca^{++} y Mg^{++} (HBSSw) y se aplicaron a portaobjetos
de vidrio (1000 rpm, 5 minutos) utilizando un Cytospin 3 (Shandon
Southern, Sewickley, PA). Se prepararon preparaciones múltiples en
portaobjetos para cada condición de pulso (1000 rpm, 5 minutos) y
se mantuvieron en una caja sellada hasta que se examinaron
microscópicamente. Los exámenes microscópicos usaron bien un
fotomicroscopio Olympus BH-1 con una cámara digital
Kodak DC-120, o un microscopio invertido Olympus
IX70 con una cámara de video OlymPix CCD a una magnificación
de
100X.
100X.
Los experimentos iniciales usaron PMN marcados
con calceína-AM para alcanzar el marcaje
fluorescente del citoplasma y mostraron que aplicaciones
individuales de USPEF de 3.6 ó 5.3 megavoltios/m podrían afectar las
distribuciones intracelulares de calceína libre y la morfología
teñida con Wright-Giemsa en estas células evaluadas
microscópicamente. Aplicaciones múltiples de USPEF indujeron
cambios sujetivos tanto en las distribuciones intracelulares de
calceína libre como en la morfología de los PMN teñidos con
Wright-Giemsa, pero el efecto más impactante se vio
en los eosinófilos que contaminaban las preparaciones de PMN. Se
vieron células "centelleantes" (células con tinción
citoplásmica de calceína más gránulos brillantes fluorescentes
localizados centralmente, grandes) con ambas intensidades de campo
eléctrico cuando se utilizaron \geq3 aplicaciones USPEF (ver Tabla
1). Cuando se examinaron mediante tinción
Wright-Giemsa, las células "centelleantes" eran
siempre eosinófilos, y con frecuencia aparecían "encogidas"
relativas a la apariencia de los eosinófilos de la condición
control.
Reconociendo que la tinción intensa de la
calceína libre de los gránulos de eosinófilos solo podría ocurrir
si la integridad de la membrana de los gránulos se perdía, dos
preparaciones de leucocitos ricos en eosinófilos (65% y 87% de
eosinófilos) se expusieron a USPEF (60 nsec, 53 kV/cm x3 ó x5) y las
células se examinaron microscópicamente (ver Figura 26). Las
preparaciones de células control teñidas con
calceína-AM mostraron eosinófilos con tinción de
calceína libre brillante en el citoplasma y exclusión de la calceína
libre de sus gránulos intracelulares.
La Figura 26 muestras células
"centelleantes" en una preparación de eosinófilos expuesta a
tratamiento de USPEF (60 nsec, 53 kV/cm x3 (medio) y x5 (abajo)).
Los eosinófilos control marcados con calceína-AM
(arriba) muestran tinción de calceína libre citoplásmica brillante
con exclusión de la fluorescencia de los gránulos intracelulares.
La aplicación de tratamientos de USPEF múltiples a esta preparación
de células da como resultado la aparición de células
"centelleantes" con tinción de calceína libre citoplásmica
brillante (indicando que la membrana de superficie está intacta) y
fluorescencia brillante de algunos gránulos intracelulares,
indicando que la calceína libre citoplásmica ha ganado acceso a y
marcado los componentes catiónicos intragranulares. Los paneles
medios también ilustran la morfología "encogida" de los
eosinófilos advertida con frecuencia en las condiciones de 60 nsec,
53 kV/cm x3 y x5. A la derecha hay un eosinófilo de tamaño normal
con tinción brillante de calceína libre citoplásmica/gránulos no
teñidos, y 3 eosinófilos "encogidos", todos células
"centelleantes" están a la izquierda.
Después de las exposiciones a USPEF en ambas
condiciones, el 39% y el 77% (3 exposiciones USPEF), y el 42% y el
58% (5 exposiciones de USPEF) de todas las células tenían
características "centelleantes" (tinción citoplásmica de
calceína libre intensa más subpoblaciones de gránulos intracelulares
brillantemente fluorescentes, centrales) y eran eosinófilos en una
tinción de Wright-Giemsa posterior, respectivamente.
Considerando el grado de enriquecimiento de eosinófilos en las
preparaciones a ensayar, el 76-84% (3 exposiciones
USPEF) y el 59-71% (5 exposiciones USPEF) del total
de eosinófilos habían adquirido las características
"centelleantes" tras estos tratamientos.
Los gránulos de los eosinófilos contienen varias
proteínas catiónicas que podrían unirse potencialmente a la
calceína libre altamente aniónica si la membrana del gránulo se
rompiese, como se muestra en el experimento de solubilización con
Triton. Por lo tanto, se concluye que el desarrollo de la morfología
"centelleante" en los eosinófilos cargados con
calceína-AM tras aplicaciones repetidas de USPEF es
el resultado de la formación de poros/rotura selectiva de la
membrana de los gránulos de los eosinófilos durante las aplicaciones
de USPEF, que permiten a la calceína libre citoplásmica entrar en
el gránulo y unirse a los componentes catiónicos del gránulos. Se
interpreta esto como una evidencia sólida de que se puede alcanzar
la formación de poros/rotura selectiva de las membranas
intracelulares sin pérdida de la integridad de la membrana de
superficie con aplicaciones de USPEF.
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Se inocularon subcutáneamente ratones
inmunocompetentes C57B1/6 de siete a 8 semanas de edad con
1.5x10^{6} células de fibrosarcoma de ratón B10.2 en 0.1 ml de
PBS utilizando una jeringuilla de 1 cc equipada con una aguja de
27-gauge. El sitio de inyección fue bien en la
región del flanco bien en el lomo del animal. Dos a tres semanas
más tarde se extirparon los tumores y se cortaron en dos partes a lo
largo del eje ecuatorial. Una parte sirvió como control ajustado y
la otra parte se expuso a tres pulsos cada uno a 300 nsec y 60 kV/cm
(1.08 J/cc).
Se colocaron los cortes de tumor (de 0.1 cm de
espesor) en una cubeta de electroporación entre dos electrodos
separados 0.1 cm y se añadió solución salina equilibrada de Hanks
para llenar la cubeta. Estos tejidos se expusieron a pulsos según
se indica, se retiraron, y se prepararon para el análisis. Los
tejidos se incubaron durante 5 horas a 37ºC en medio RPMI con suero
bovino fetal al 10%. Los tejidos se fijaron después en formalina
tamponada al 10% durante 18 horas. Se eliminó el aire de los tejidos
utilizando vacío y los tejidos desgaseados se embebieron en
parafina. Se prepararon láminas de cuatro micrómetros y se colocaron
sobre portaobjetos de vidrio pretratados con APES al 2% en acetona.
Se eliminó la parafina mediante lavados sucesivos en xileno, etanol
absoluto, etanol al 95%, etanol al 70%, y PBS. Se incubaron las
preparaciones de tejido con proteinasa K (40 ug/ml) durante 15
minutos
a 40ºC.
a 40ºC.
Las preparaciones de tejido se prepararon para
examen de fragmentación de ADN como un marcador para apoptosis
utilizando un anticuerpo anti-digoxigenina de oveja
marcado con rodamina (Apoptag^{TM} de Intergen) y microscopía de
fluorescencia según el protocolo del fabricante. Las preparaciones
se contratiñeron con DAPI. Los núcleos normales se tiñeron de azul
por el DAPI y los núcleos apoptóticos se tiñeron de rojo con la
rodamina. Se contaron de dos o trescientas células y puntuadas como
azules (normales) o rojas (apoptóticas). El índice apoptótico se
define como el número de núcleos apoptóticos divididos por el número
total de núcleos. Los resultados se muestran en la Tabla IV a
continuación.
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La Tabla IV ilustra el índice apoptótico
(porcentaje de células apoptóticas) en un tumor representativo que
se expuso a tres pulsos consecutivos de 300 nsec a 6 kV en
comparación con un control sin pulso. Alrededor del 6% de los
núcleos del tumor control eran apoptóticos cuando se tomaron las
muestras de cuatro secciones diferentes del mismo tumor. Por el
contrario, el 35% de núcleos del tumor expuesto a la secuencia de
pulsos ultra cortos de alta intensidad eran apoptóticos. Esto
representa un aumento de 6 veces en los núcleos apoptóticos después
de la exposición a estos pulsos. En un total de 6 tumores de
diferentes animales, se observó un aumento de 3-6
veces en los núcleos apoptóticos en tumores expuestos a pulsos de
campo eléctrico, aunque el número absoluto de núcleos apoptóticos
en tumores no tratados varió del 4% al 30%. No se observaron
diferencias entre tejidos tumorales control y tratados cuando se
compararon tres pulsos consecutivos a 60 nsec y 6 kV (datos no
mostrados). Estos resultados indican que los pulsos ultracortos de
alta intensidad pueden inducir apoptosis en tejido tumoral.
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Los experimentos iniciales con pulsos eléctricos
ultracortos se han realizado con células tumorales en cultivo. Para
valorar totalmente la potencial eficacia de los pulsos de campo
eléctricos ultracortos para el tratamiento de tumores humanos, se
utilizarán modelos animales. Los experimentos con células intactas
en cultivo indican que la apoptosis es el mecanismo principal para
la muerte de las células inducida por pulsos eléctricos ultracortos.
Para investigar el potencial para el tratamiento del cáncer en
humanos en el futuro, se utilizarán modelos animales para
establecer el efecto de los pulsos de campo eléctrico ultracortos en
los tumores animales in vivo. Los ratones C57BL/6
representan un modelo bien caracterizado y aceptado para evaluar
estrategias terapéuticas del cáncer como un precursor necesario
para los ensayos clínicos en seres humanos. Esta especie es muy
eficaz ya que una línea de células tumorales está derivada para
este animal.
Para los tumores de fibrosarcoma de ratón, se
utilizará el modelo de ratones C57BL/6 inmunocompetentes. Ratones
de siete a 8 semanas de edad se inocularán de forma subcutánea o
intradérmica con 5x10^{6} células de fibrosarcoma de ratón B10.2
en 0.1 ml de solución salina tamponada con fosfato ("PBS")
utilizando una jeringuilla de 1 cc equipada con una aguja de
27-gauge. El sitio de la inyección será en el lomo
del animal para no interferir con su movimiento o alimentación. Se
espera que las masas tumorales se formen durante un período de 6
semanas en una masa de alrededor de 5-10 mm de
diámetro. No se permitirá que la masa del tumor resultante supere el
10% del peso corporal antes de ser sometida al tratamiento de
pulsos eléctricos ultracortos.
Los ratones con tumores subcutáneos inducidos se
dividirán en seis grupos diferentes y en cinco de los grupos los
tumores se expondrán a tratamiento de pulsos eléctricos ultracortos
in vivo. El sexto grupo servirá como grupo control sin
tratar para seguir el curso del desarrollo del tumor. Los parámetros
de pulso para los cinco tratamientos diferentes se usarán basados
en los resultados de los experimentos ex vivo. Las
condiciones de pulso eléctrico ultracorto para los cinco grupos
diferentes se muestran en la Tabla V a continuación.
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Como se indica mediante los parámetros en la
Tabla V, se usarán pulsos eléctricos de corta duración (de
nanosegundos a cientos de nanosegundos), alto voltaje (decenas de
kilovoltios), baja energía (decenas de milijulios a varios julios),
no térmicos. Estos pulsos no dan como resultado la rotura permanente
de la membrana plasmática de la célula, pero pueden alterar las
estructuras subcelulares tal como el núcleo, mitocondrias y/o
vesículas por mecanismo(s) desconocido(s). Los pulsos
se administrarán a través de un agrupamiento de electrodos
consistente en un par de agujas de acero inoxidable del tamaño de
las agujas de acupuntura separadas 5 mm. El par de agujas se
insertará en el tumor o en el margen circundante de tejido sano al
menos a la profundidad del tumor. La corriente pasará de forma
sincrónica a través de pares de agujas opuestos produciendo un campo
homogéneo dentro y justo fuera de la sección cruzada definida por
las agujas (ver la Figura 28 para una representación del campo
eléctrico generado durante el pulso). La densidad de energía es más
intensa en el plano unido por las dos agujas y disminuye fuera de
este plano. Los pares de agujas estarán energizados en ambas
polaridades. El par de agujas se retirará y se volverá a insertar
en dos posiciones adicionales de modo que la composición total
corresponda aproximadamente a un hexágono regular (ver la Figura
29). El tratamiento del tumor con pulsos secuenciales de cada una
de las tres posiciones se refiere aquí como "ciclo de un
pulso". El agrupamiento de agujas se insertará en el tejido
sano justo rodeando el tumor de modo que el tumor esté contenido
dentro del hexágono definido por el agrupamiento. Se administrará
un ciclo de un pulso por tumor, a menos que el tumor exceda los
límites del agrupamiento, en cuyo caso se administrará un segundo
ciclo de un pulso en un agrupamiento compensatorio para abarcar la
parte del tumor que no está cubierta por el primer ciclo de pulso.
Típicamente, para cada posición en el ciclo de pulso, se aplicarán
secuencias de múltiples pulsos al tumor en un intervalo de tiempo
relativamente corto, por ejemplo, se aplicarán secuencias de
5-10 pulsos con un espaciamiento de
1-2 segundos entre pulsos sucesivos en cada
posición.
Cuando se tratan los tumores con pulsos
eléctricos ultracortos in vivo, los ratones se colocarán en
un sistema con oxígeno y una entrada de isofluorano al 2% para
permitir la sedación continuada durante el procedimiento quirúrgico
entero. El área alrededor del tumor se afeita con maquinilla
eléctrica y se prepara con betadina. Se insertará un agrupamiento
de electrodos del tamaño de agujas de acupuntura dentro de o
rodeando al tumor y se administrarán pulsos eléctricos ultracortos
en un período de tiempo relativamente corto. El tiempo total del
procedimiento es de menos de 10 minutos. El ratón se colocará
después en una jaula nueva y se espera que se mueva en 2
minutos.
Tras la IEM, los animales se seguirán
diariamente y el tamaño del tumor se determinará al menos dos veces
a la semana durante un período de 4 semanas utilizando un compás
calibrador. Al final de este período, los tumores se extirparán y
se examinará para la presencia de apoptosis. Se utilizarán varios
métodos para el análisis de la apoptosis incluyendo uno o más de
los siguientes:
- (1)
- mediante histología fluorescente para apoptosis;
- (2)
- para fragmentación de ADN usando marcaje con fluoresceína y microscopía de fluorescencia;
- (3)
- mediante microscopía de fluorescencia y citometría de flujo para unión con anexina V-FITC (necrosis) en tumores después de cortar, y digestión con colagenasa;
- (4)
- para activación de caspasa utilizando el sustrato fluorescente DEVD-AFC; y
- (5)
- para activación de caspasa mediante análisis de inmunotransferencia utilizando un anticuerpo de caspasa 3.
A lo largo de esta solicitud se hace referencia
a varias publicaciones. Las divulgaciones de estas publicaciones en
su totalidad se incorporan por referencia en esta solicitud para
describir más completamente el estado de la técnica a la que esta
invención se refiere.
La invención se ha descrito con referencia a
varias formas de realización y técnicas específicas e ilustrativas.
Sin embargo, se debe entender que se pueden hacer muchas variaciones
y modificaciones al tiempo que permanecen dentro del ámbito de la
invención.
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(Tabla pasa a página
siguiente)
Claims (9)
1. Un aparato para destruir células diana que
comprende:
- (i)
- un generador de pulso;
- (ii)
- un agrupamiento de electrodos, el agrupamiento de electrodos que comprende al menos un par de agujas capaces de ser insertadas en tejidos in vivo, conteniendo el tejido las células diana, y ser capaces de dirigir los pulsos eléctricos ultracortos a dichas células diana in vivo; y
- (iii)
- un sistema de distribución adaptado para comunicar uno o más pulsos eléctricos ultracortos desde el generador de pulsos al agrupamiento de electrodos, caracterizado en que el generador de pulsos está configurado para producir dicho uno o más pulsos eléctricos ultracortos que tienen una duración de pulso de no más de 1 microsegundo y una intensidad de campo eléctrico mayor de 10 kV/cm.
2. El aparato de la reivindicación 1, en donde
la duración del pulso es de al menos 100 picosegundos.
3. El aparato de la reivindicación 1 en donde la
duración del pulso es de 1 a 500 nanosegundos.
4. El aparato de cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 3, en donde el generador de pulso se configura
para producir pulsos eléctricos ultracortos de intensidad de campo
eléctrico de al menos 20 kV/cm.
5. El aparato de la reivindicación 4, en donde
el generador de pulsos se configura para producir un pulso de
intensidad de campo eléctrico de no más de 200 kV/cm.
6. El aparato de cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 5, en donde el generador de pulso se configura
para producir cada pulso eléctrico ultracorto con una densidad
total de energía de 75 mJ/cc hasta 2000 mJ/cc.
7. El aparato de cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 6, en donde el generador de pulso se configura
para producir cada pulso eléctrico ultracorto tal que tiene un
espectro de Fourier que incluye frecuencias entre 1 MHz y 1
GHz.
8. El aparato de cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 7, en donde el generador de pulsos se configura
para producir cada pulso eléctrico ultracorto tal que el pulso
tiene un tiempo de subida que no es más del 20% de la duración del
pulso.
9. El aparato de cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 7, en donde el generador de pulso se configura
para producir cada pulso eléctrico ultracorto tal que tiene un
tiempo de subida de no más de 40 nsec.
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