ES2300419T3 - Metodo para producir vacunas antigripales polivalentes a base de hemaglutinina. - Google Patents
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Abstract
Un vector para producir una proteína hemaglutinina de la gripe glicosilada, madura, recombinante, sustancialmente pura, producida por un sistema de expresión baculovírico en células de insecto cultivadas, donde dicha proteína hemaglutinina es purificada hasta un 95% o más y dicha proteína es inmunogénica, induce una respuesta inmune protectora cuando es utilizada como vacuna; y dicha proteína hemaglutinina comprende además una segunda proteína que está fusionada a la hemaglutinina, conteniendo dicho vector las secuencias 5''-->3'' siguientes: el promotor de la polihedrina de un baculovirus; un ácido nucleico que comprende los nucleótidos 19-72 de la SEC ID Nº: 6 u 8 que codifica un péptido señal de baculovirus, o un ácido nucleico que codifica un péptido señal de baculovirus que contiene los aminoácidos 1-18 de la SEC ID Nº: 7 ó 9; secuencias codificadoras de la hemaglutinina madura procedentes de una cepa de la gripe; la secuencia codificadora de la segunda proteína; un codón de terminación de la traducción y una señal de poliadenilación del ARN de la polihedrina.
Description
Método para producir vacunas antigripales
polivalentes a base de hemaglutinina.
La presente invención está de manera general
dentro del área de las vacunas de la gripe recombinantes.
La gripe epidémica tiene lugar anualmente y es
una causa de morbilidad y mortalidad significativas en todo el
mundo. Los niños tienen la tasa de ataque más elevada y son en gran
medida responsables de la transmisión de los virus de la gripe a la
comunidad. Los ancianos y las personas con problemas de salud
subyacentes tienen un riesgo incrementado de complicaciones y de
hospitalización derivados de la infección por gripe. Solamente en
los Estados Unidos tuvieron lugar más de 10.000 muertes durante cada
una de las siete temporadas de gripe entre 1956 y 1988 debido a
neumonía y gripe, y se informó de más de 40.000 muertes para cada
una de dos temporadas (Update: Influenza Activity - United States
and Worldwide, and Composition of the 1992-1993
Influenza Vaccine, Morbidity and Mortality Weekly Report.
U.S. Department of Health and Human Services, Public Health Service,
41/Nº 18:315-323, 1992). Los virus de la gripe son
partículas muy pleomórficas compuestas por dos glicoproteínas de
superficie, hemaglutinina (HA) y neuraminidasa (NA). La HA media la
fijación del virus a la célula huésped y la fusión de las membranas
vírica-celular durante la penetración del virus en
la célula. El genoma del virus de la gripe consta de ocho segmentos
de ARN de hebra sencilla de sentido negativo, de los cuales el
cuarto segmento más grande codifica el gen de la HA. Los virus de
la gripe están divididos en los tipos A, B y C sobre la base de
diferencias antigénicas. Los virus A de la gripe están descritos por
una nomenclatura que incluye el subtipo o tipo, el origen
geográfico, el número de cepa y el año de aislamiento, por ejemplo,
A/Beijing/353/89. Existen al menos 13 subtipos de HA
(H1-H13) y nueve subtipos de NA
(N1-N9). Todos los subtipos se encuentran en aves,
pero solamente H1-H3 y N1-N2 se
encuentran en humanos, cerdos y caballos (Murphy y Webster,
"Orthomyxoviruses", en Virology, ed. Fields, B.N.,
Knipe, D.M., Chanok, R.M., 1091-1152 (Raven Press,
New York (1990)).
Los anticuerpos hacia HA neutralizan el virus y
constituyen la base de la inmunidad natural hacia la infección por
gripe (Clements, "Influenza Vaccines", en Vaccines: New
Approaches to Immunological Problems, ed. Ronald W. Ellis, pp.
129-150 (Butterworth-Heinemann,
Stoneham, MA, 1992)). La variación antigénica de la molécula de HA
es responsable de los frecuentes brotes de gripe y del control
limitado de la infección por inmunización.
La estructura tridimensional de HA y la
interacción con su receptor celular, el ácido siálico, han sido
extensamente estudiadas (Wilson y col., "Structure of the
hemagglutinin membrane glycoprotein of influenza virus at
3\ring{A} resolution" Nature,
289:366-378 (1981); Weis y col., "Structure of the
influenza virus hemagglutinin complexed with its receptor, sialic
acid" Nature, 333:426-431 (1988); Murphy
and Webster, 1990). La molécula de HA está presente en el virión
como un trímero. Cada monómero existe como dos cadenas, HA1 y HA2,
unidas por un único enlace disulfuro. Las células huésped
infectadas producen un polipéptido glicosilado precursor (HA0) con
un peso molecular de 85.000 aproximadamente, que es cortado
posteriormente en HA1 y HA2.
La presencia de anticuerpos IgG e IgA
neutralizantes específicos de la HA de la gripe está asociada con
una resistencia a la infección y a la enfermedad (Clements, 1992).
Las vacunas contra la gripe de virus completo inactivado o
parcialmente purificadas (subunidad dividida) son estandarizadas
respecto a la cantidad de HA de cada cepa. Las vacunas de la gripe
incluyen normalmente de 7 a 25 microgramos de HA de cada una de tres
cepas de virus de la gripe.
La función de la otra glicoproteína de
superficie principal, NA, en la inmunidad protectora de respuestas
de anticuerpos o de células T contra la gripe, no ha sido definida.
La neuraminidasa es muy lábil al proceso de purificación y
almacenamiento (Murphy and Webster, 1990) y la cantidad de NA en las
vacunas de la gripe actuales no está estandarizada. Una vacuna de
HA purificada pero no de NA impide la enfermedad en animales
desafiados con la gripe (Johansson y col., "Purified influenza
virus hemagglutinin and neuraminidase are equivalent in stimulation
of antibody response but induce contrasting types of immunity to
infection" J. Virology, 63:1239-1246
(1989)). Se encontró que una vacuna experimental basada en el
antígeno neuraminidasa no era protectora en un ensayo con humanos
(Orga y col., J. Infect. Dis., 135:499-506
(1977)).
Las vacunas de la gripe autorizadas constan de
preparaciones de subunidades completas inactivadas por formalina o
de subunidades escindidas químicamente de dos virus de la gripe de
subtipo A (H1N1 y H3N2) y de un virus de la gripe de subtipo B.
Antes de cada temporada de gripe, el U.S. Food and Drug
Administration's Vaccines and Related Biologicals Advisory
Committee recomienda la composición de una vacuna de la gripe
trivalente para la temporada próxima. La vacuna de
1992-93 contenía un virus similar a A/Texas/36/91
(H1N1), un virus similar a A/Beijing/353/89 (H3N2) y un virus
B/Panamá/45/90. La FDA aconsejó que la vacuna de la gripe de
1993-94 debería contener las mismas cepas Texas y
Panamá y una nueva cepa Beijing de virus de la gripe A
(A/Beijing/32/92).
La vacunación de las personas de alto riesgo
cada año antes de la temporada de gripe es la medida más eficaz
para reducir el impacto de la gripe. Las limitaciones de las vacunas
actualmente disponibles incluyen tasas bajas de utilización; poca
eficacia en los ancianos y en los niños pequeños; la producción en
huevos; la variación antigénica y las reacciones adversas.
El Center for Disease Control (CDC) estima que
menos del 30% de los individuos de alto riesgo para la gripe son
vacunados cada año (MMWR, 1992). Las actuales vacunas inactivadas
consiguen un nivel elevado de protección frente a la enfermedad
entre los adultos sanos normales cuando los antígenos de la vacuna y
los de los virus de la gripe circulantes están estrechamente
relacionados. Entre los ancianos, la tasa de protección frente a la
enfermedad es mucho más baja, especialmente para aquéllos que están
internados en una institución (Clements, 1992). En un estudio
reciente de Powers and Belshe, J. Inf. Dis.,
167:584-592 (1993), se observaron respuestas de
anticuerpos significativas frente a una vacuna de la gripe de
subviriones trivalente en menos del 30 por ciento de los sujetos de
65 años de edad o mayores.
Los virus semilla para las vacunas de la gripe A
y B son cepas que existen en la naturaleza y que se replican hasta
títulos elevados en la cavidad alantoidea de los huevos de gallina.
Alternativamente, la cepa del componente de la gripe A es un virus
"remezclado" con los genes de los antígenos de superficie
correctos. Un virus "remezclado" es uno que, debido a la
segmentación del genoma vírico, tiene características de cada cepa
parental. Cuando más de una cepa de virus de la gripe infectan a
una célula, estos segmentos víricos se mezclan para crear una
progenie de viriones que contienen diferentes mezclas de genes de
ambos parentales.
La protección con las vacunas actuales de la
gripe completas o escindidas es de corta duración y disminuye a
medida que tiene lugar el cambio antigénico en las cepas epidémicas
del virus de la gripe. Los virus de la gripe experimentan un cambio
antigénico como resultado de la selección inmune de los virus con
cambios en la secuencia de aminoácidos de la molécula de
hemaglutinina. Idealmente, las cepas vacuna coinciden con las cepas
del virus de la gripe que causa la enfermedad. El proceso de
fabricación actual de las vacunas de la gripe está, sin embargo,
limitado por la propagación del virus en huevos de gallina con
embrión. No todas las cepas de virus de la gripe se replican bien
en los huevos; por tanto los virus deben ser adaptados o deben
construirse virus "remezclados". Hay una considerable
heterogeneidad en la hemaglutinina de los virus de la gripe
cultivados en huevos en comparación con los aislados primarios
procedentes de individuos infectados cultivados en células de
mamífero (Wang y col., Virol., 171:275-279
(1989); Rajakumar y col., Proc. Natl. Acad. Sci. USA,
87:4154-4158 (1990). Los cambios en la HA durante la
selección y la fabricación de las vacunas de la gripe pueden tener
como resultado una mezcla de subpoblaciones de virus antigénicamente
distintas. Los virus de la vacuna pueden por tanto diferir de las
variantes dentro de las cepas epidémicas, teniendo como resultado
niveles subóptimos de protección.
Possee (1986, Virus Research, Volumen 5,
páginas 43-59) describe la expresión en la
superficie celular de hemaglutinina del virus de la gripe en
células de insecto utilizando un vector baculovírico.
Matsuura y col. (1987, J. Gene Virol.,
Volumen 68, páginas 1233-1250) describen varios
vectores de expresión baculovíricos y discuten los requisitos para
un nivel de expresión elevado de proteínas tales como
glicoproteínas.
Kuroda y col. (1986, MBO Journal, Volumen
5, páginas 1359-1365) describen la expresión de la
hemaglutinina del virus de la gripe en células de insecto por un
vector baculovírico.
EP0546787 describe la expresión de inmunógenos
específicos utilizando antígenos víricos y, en particular, describe
fragmentos de ADN quiméricos similares a los que codifican la
proteína de superficie HA de un virus de la gripe A.
Ayres y col. (1994, Virology, Volumen
202, páginas 586-605) describen una secuencia de ADN
completa del virus de la polihedrosis nuclear de Autographa
californica que se dice que contiene 133.894 pares de bases y
que se dice que codifica aproximadamente 154 supuestos marcos de
lectura abiertos de 150 nucleótidos o más.
Pueden tener lugar reacciones de
hipersensibilidad inmediata en personas con alergia severa al huevo
debido a proteínas del huevo residuales en la vacuna. La vacuna de
la gripe del cerdo de 1976 fue asociada con una frecuencia
incrementada del síndrome de Guillain-Barré. No se
ha observado, hasta ahora, que vacunas posteriores preparadas a
partir de otras cepas del virus de la gripe hayan incrementado la
aparición de esta enfermedad poco frecuente.
Un método de producción de una vacuna de la
gripe que no requiriera la propagación en huevos tendría como
resultado un producto más puro que sería menos probable que causara
una reacción inmune adversa. Además, una preparación de vacuna más
pura no requeriría la inactivación del virus ni la extracción
orgánica de los componentes de la membrana del virus, evitando de
este modo la desnaturalización de los epítopos antigénicos y las
preocupaciones por la seguridad debidas a los productos químicos
residuales en la vacuna.
Además, una vacuna de la gripe producida en
ausencia de propagación en huevos evitaría la heterogeneidad
genética que tiene lugar durante la adaptación y el pase a través
de los huevos. Esto tendría como resultado una vacuna que
coincidiría mejor con las cepas epidémicas de la gripe, teniendo
como resultado una eficacia mejorada.
Es por tanto un objeto de la presente invención
proporcionar un método para producir una vacuna de la gripe que no
requiera la replicación en huevos.
Es un objeto más de la presente invención
proporcionar un método para producir una vacuna de la gripe
altamente purificada que sea rápido y rentable, y que permita la
producción de vacunas a partir de las fuentes primarias de la
gripe.
En un primer aspecto, la presente invención se
refiere a un vector para producir una proteína hemaglutinina de la
gripe glicosilada, madura, recombinante, sustancialmente pura,
producida por un sistema de expresión baculovírico en células de
insecto cultivadas, donde dicha proteína hemaglutinina es purificada
hasta un 95% o más y dicha proteína es inmunogénica, induce una
respuesta inmune protectora cuando es utilizada como vacuna; y
dicha proteína hemaglutinina comprende además una segunda proteína
que está fusionada a la hemaglutinina, conteniendo dicho vector las
siguientes secuencias 5'\rightarrow3': un promotor de la
polihedrina de un baculovirus; un ácido nucleico que comprende los
nucleótidos 19-72 de la SEC ID Nº: 6 u 8 que
codifica un péptido señal de baculovirus, o un ácido nucleico que
codifica un péptido señal de baculovirus que comprende los
aminoácidos 1-18 de la SEC ID Nº: 7 ó 9; secuencias
codificadoras de la hemaglutinina madura de una cepa del virus de
la gripe; una secuencia codificadora de la segunda proteína; un
codón de terminación de la traducción y una señal de
poliadenilación del ARN de la polihedrina.
Preferiblemente, el péptido señal deriva del gen
61K de baculovirus.
Preferiblemente, la secuencia que codifica el
péptido señal y la hemaglutinina no codifica ningún aminoácido
intermedio.
Preferiblemente, el vector contiene además una
secuencia que codifica una segunda proteína que es expresada como
una proteína de fusión con la hemaglutinina.
Preferiblemente, el vector es transfectado en
células de insecto cultivadas.
En otro aspecto, la invención se refiere a un
método para producir un vector para la expresión de una proteína
hemaglutinina de la gripe glicosilada, madura, recombinante,
sustancialmente pura, producida por un sistema de expresión
baculovírico en células de insecto cultivadas, donde dicha proteína
hemaglutinina es purificada hasta un 95% o más y dicha proteína es
inmunogénica, induce una respuesta inmune protectora cuando es
utilizada como vacuna; y dicha proteína hemaglutinina comprende
además una segunda proteína que está fusionada a la hemaglutinina,
conteniendo dicho vector las siguientes secuencias
5'\rightarrow3': un promotor de la polihedrina de un baculovirus;
un ácido nucleico que comprende los nucleótidos
19-72 de la SEC ID Nº: 6 u 8 que codifica un
péptido señal de baculovirus, o un ácido nucleico que codifica un
péptido señal de baculovirus que comprende los aminoácidos
1-18 de la SEC ID Nº: 7 ó 9; secuencias
codificadoras de la hemaglutinina de una cepa del virus de la gripe
seleccionada del grupo que consta de las cepas del virus de la gripe
A y las cepas del virus de la gripe B; una secuencia codificadora
de la segunda proteína; un codón de terminación de la traducción y
una señal de poliadenilación del ARN de la polihedrina, que
comprende: la recogida del virus del medio celular y el aislamiento
del ARN vírico, para las cepas de la gripe A, o de ARNm para las
cepas de la gripe B; la síntesis de ADNc utilizando un cebador
universal (5'-AGCAAAAGCAGG-3' (SEC
ID Nº: 1)) para el ARN vírico de las cepas de la gripe A o
cebadores aleatorios para el ARNm de las cepas de la gripe B, donde
los cebadores 5' y 3' tienen sitios de enzimas de restricción en
los extremos que no se encuentran en los genes de la hemaglutinina;
la amplificación de los cebadores de la gripe A o B y del ADNc de la
gripe mezclados con los segmentos del gen de la hemaglutinina para
producir fragmentos de ADN de doble hebra que contienen secuencias
codificadoras de la hemaglutinina madura completa; la
identificación del péptido señal de los genes de la hemaglutinina,
amplificando posteriormente los genes de la hemaglutinina menos el
péptido señal; y el clonaje de los genes de la hemaglutinina menos
el péptido señal en un vector que contiene el promotor de la
polihedrina de AcNPV.
En otro aspecto, la invención se refiere a un
método para producir un vector para la expresión de una
hemaglutinina de la gripe glicosilada, madura, recombinante,
sustancialmente pura, producida por un sistema de expresión de
baculovirus en células de insecto cultivadas, en el que dicha
proteína hemaglutinina es purificada hasta un 95% o más y dicha
proteína es inmunogénica e induce una respuesta inmune protectora
cuando es utilizada como vacuna, conteniendo dicho vector las
siguientes secuencias 5'\rightarrow3': un promotor de la
polihedrina de un baculovirus; un ácido nucleico que comprende los
nucleótidos 19-72 de la SEC ID Nº: 6 u 8 que
codifica un péptido señal de baculovirus, o un ácido nucleico que
codifica un péptido señal de baculovirus que comprende los
aminoácidos 1-18 de la SEC ID Nº: 7 ó 9; las
secuencias codificadoras de hemaglutinina de una cepa del virus de
la gripe seleccionada del grupo que consta de las cepas del virus de
la gripe A y de las cepas del virus de la gripe B; una secuencia
codificadora de la segunda proteína; un codón de terminación de la
traducción; y una señal de poliadenilación del ARN de la
polihedrina, que comprende: la recogida del virus del medio celular
y el aislamiento del ARN vírico, para las cepas de la gripe A, o del
ARNm para las cepas de la gripe B; la síntesis de ADNc utilizando
un cebador universal
(5'-AGCAAAAGCAGG-3' (SEC ID Nº: 1))
para el ARN vírico de las cepas de la gripe A o cebadores
aleatorios para el ARNm de las cepas de la gripe B, donde los
cebadores 5' y 3' tienen sitios de enzimas de restricción en los
extremos que no se encuentran en los genes de la hemaglutinina; la
amplificación de los cebadores de la gripe A o B y del ADNc de la
gripe mezclados con los segmentos génicos de hemaglutinina para
producir fragmentos de ADN de doble hebra que contienen secuencias
codificadoras de la hemaglutinina madura completa; la
identificación del péptido señal de los genes de la hemaglutinina,
amplificando posteriormente los genes de la hemaglutinina menos el
péptido señal; y el clonaje de los genes de la hemaglutinina menos
el péptido señal en un vector que contiene el promotor de la
polihedrina de AcNPV.
Preferiblemente, los genes de la hemaglutinina
son clonados en el (los) vector(es) utilizando PCR, de tal
manera que el vector codifique el péptido señal acoplado
directamente a la hemaglutinina sin ningún aminoácido
intermedio.
\newpage
Preferiblemente, el método descrito
anteriormente comprende además la transfección del vector en células
de insecto y la selección de células por la expresión de
hemaglutinina.
La invención se refiere también a un vector
preparado de acuerdo con el (los) método(s)
descrito(s) anteriormente. Preferiblemente, dicho vector
expresa hemaglutinina de la gripe glicosilada, madura, recombinante,
sustancialmente pura.
Preferiblemente, el vector codifica juntos un
péptido señal y la hemaglutinina con la secuencia de aminoácidos de
la SEC ID Nº: 7.
Preferiblemente, el péptido señal deriva del gen
61K de baculovirus.
Se proporciona un método para la preparación de
una proteína hemaglutinina del virus de la gripe recombinante
mediante la expresión en células de insecto utilizando un sistema de
expresión baculovírico. La proteína resultante es útil para
producir una vacuna de la gripe multivalente basada en una mezcla de
antígenos hemaglutinina recombinantes clonados a partir de virus de
la gripe que tienen potencial epidémico. Las proteínas hemaglutinina
recombinantes son glicoproteínas de longitud completa, no cortadas
(HA0), que incluyen las subunidades HA1 y HA2 (HAO) purificadas
bajo condiciones no desnaturalizantes hasta un 95% o más de pureza,
preferiblemente hasta un 99% de pureza.
Se describe también un proceso para el clonaje
de genes de la hemaglutinina de la gripe procedentes de virus de la
gripe A y B utilizando sondas oligonucleotídicas especialmente
diseñadas y la metodología de la reacción en cadena de la
polimerasa (PCR). En la realización preferida, los genes de la HA
clonados son modificados por deleción de los nucleótidos que
codifican las secuencias del péptido señal hidrofóbico natural y la
sustitución por un nuevo péptido señal de baculovirus, para
producir una secuencia que codifica el péptido señal inmediatamente
colindante a la hemaglutinina. Estos genes quiméricos son
introducidos en vectores de expresión baculovíricos de tal manera
que el promotor de la polihedrina del baculovirus dirige la
expresión de las proteínas HA recombinantes en células de insecto
infectadas. El péptido señal de baculovirus de 18 aminoácidos dirige
la traducción de la rHA en la ruta de glicosilación de las células
de insecto y no está presente en la glicoproteína rHA madura. En la
realización preferida, se diseña un vector que no codifica ningún
aminoácido intermedio entre el péptido señal y la proteína
hemaglutinina.
Esta metodología puede ser extendida a todos los
tipos de virus de la gripe, incluyendo pero sin limitarse a, el
subtipo A dominante (H1N1), el subtipo A (H3N2) y el tipo B que
infectan a humanos, así como los virus de la gripe que infectan a
otras especies de mamíferos y aves.
Se describe un procedimiento general para la
extracción y purificación eficaces de la proteína HA recombinante
producida en células de insecto, para la purificación de las
proteína rHA procedentes de los virus de la gripe de los subtipos A
y del tipo B. La vacuna recombinante puede ser desarrollada a partir
de fuentes primarias del virus de la gripe, por ejemplo, de
secreciones nasales procedentes de individuos infectados, en lugar
de a partir de virus adaptados a, y cultivados en, huevos de
gallina. Esto permite un rápido desarrollo de la vacuna
directamente a partir de las cepas epidémicas de la gripe y evita
los problemas que surgen de la adaptación del virus al cultivo en
huevos, así como de la reacción del paciente a la contaminación con
huevo de la vacuna resultante.
Los ejemplos demuestran la formulación y la
eficacia clínica de la vacuna en una forma de dosificación
inmunizante que incluye antígenos rHA purificados de tres cepas del
virus de la gripe recomendadas por la FDA para las temporadas de
epidemia de gripe de 1993/1994 y 1994/1995. La inmunidad funcional
fue medida utilizando ensayos que cuantifican anticuerpos que se
unen a la hemaglutinina de la gripe, que bloquean la capacidad del
virus de la gripe para aglutinar glóbulos rojos sanguíneos o que
neutralizan el virus de la gripe. Las respuestas inmunes
protectoras con las vacunas de rHA fueron medidas en animales que
eran susceptibles a la infección por el virus de la gripe o en
estudios de desafío en humanos.
\vskip1.000000\baselineskip
La Figura 1 es un esquema del clonaje de los
genes de la HA de cepas de la gripe A a partir de preparaciones de
ARN vírico purificado, de la purificación de la rHA expresada y de
la caracterización biológica de la rHA. Abreviaturas: FDA, Food and
Drug Administration; MDCK, Riñón Canino Madin Darby; TPCK,
tosilfenilalanil clorometilcetona; ARN, ácido ribonucleico; ADNc,
ácido desoxirribonucleico complementario; HA, hemaglutinina; FBS,
Suero Bovino Fetal; PCR, Reacción en Cadena de la Polimerasa y BV,
Baculovirus.
La Figura 2 es un esquema más detallado del
método de la Figura 1 aplicado al clonaje y la expresión del gen de
la HA de la cepa del Virus de la Gripe A/Texas/36/91. El gen de la
HA de la gripe fue obtenido a partir de ARN purificado de células
MDCK infectadas con el virus de la gripe A/Texas/36/91 utilizando
transcriptasa inversa y un cebador universal (SEC ID Nº 1), seguido
por dos ciclos de amplificación por PCR y clonaje. Según se
muestra, en el primer ciclo de reacciones de PCR, se utilizaron el
cebador del extremo 5' de SEC ID Nº 2 y el cebador del extremo 3'
de SEC ID Nº 3. En el segundo ciclo de reacciones de PCR, se utilizó
el cebador del extremo 5' de SEC ID Nº 4 y el cebador del extremo
3' de SEC ID Nº 5. Se construyó un vector de recombinación
baculovírico que contenía el promotor de la polihedrina y una
secuencia peptídica señal del gen 61K de baculovirus (un gen de
baculovirus que codifica un péptido señal que tiene un peso
molecular de 61.000 aproximadamente), seguido por las secuencias
codificadoras completas de la proteína HA madura. Este vector de
recombinación fue utilizado posteriormente para producir un vector
de expresión baculovírico que producía HA de esta cepa del
virus.
La Figura 3 es una gráfica de la respuesta
inmune anti-HA en ratones, día 42, n=5, que
representa gráficamente el título de anticuerpos para
rHA0-pura; para la vacuna Fluzone® y para
rHA0-alumbre, a dosis de 0,5 \mug (barras
oscuras), 0,1 \mug (barras sombreadas), 0,02 \mug (barras
punteadas) y 0,004 \mug (barras sin rellenar).
Las Figuras 4a, 4b y 4c son gráficas de la
respuesta inmune anti-HA en ratones inmunizados con
rHA o con la vacuna trivalente autorizada, fórmula de
1994-1995, semanas después de la vacunación frente
al título de IHA, para IHA A/Texas/36/91 (Figura 4a), IHA
A/Shangdong/9/93 (Figura 4b) y IHA B/Panamá/45/90 (Figura 4c); rHA
(rombos) y la vacuna atenuada FLUVIRON® cultivada en huevos
(cuadrados).
\vskip1.000000\baselineskip
Se describe un método para preparar una vacuna
de la gripe recombinante. Se produce un antígeno hemaglutinina
(HA0) de longitud completa, no cortado, de un virus de la gripe con
vectores de expresión baculovíricos en células de insecto
cultivadas y se purifica bajo condiciones no desnaturalizantes. Dos
o más antígenos hemaglutinina purificados de cepas del virus de la
gripe A y/o del virus de la gripe B son mezclados para producir una
vacuna de la gripe multivalente. Los antígenos recombinantes pueden
ser combinados con un vehículo adyuvante para incrementar la
eficacia.
La utilización de la tecnología de ADN
recombinante para producir vacunas de la gripe ofrece varias
ventajas: puede producirse una vacuna de la gripe de ADN
recombinante bajo condiciones más seguras y más controladas desde
el punto de vista de la rigurosidad; no se requiere la propagación
en huevos de virus de la gripe infecciosos; la proteína HA
recombinante puede ser más altamente purificada, eliminando
virtualmente los efectos colaterales debidos a proteínas
contaminantes; los procedimientos de purificación de la HA
recombinante no tienen que incluir la inactivación del virus o la
extracción orgánica de componentes de la membrana del virus,
evitando por tanto la desnaturalización de los antígenos y los
problemas sobre la seguridad adicionales debidos a los productos
químicos residuales en la vacuna; la producción de HA mediante la
tecnología de ADN recombinante proporciona una oportunidad para
evitar la heterogeneidad genética que tiene lugar durante la
adaptación y el pase a través de huevos, lo cual haría posible que
coincidieran mejor las cepas de la vacuna con las cepas epidémicas
de la gripe, teniendo como resultado una eficacia mejorada; y un
procedimiento recombinante puede permitir también la selección de
cepas posteriormente durante el año, dejando de este modo tiempo
para selecciones basadas en datos epidemiológicos más fiables.
\vskip1.000000\baselineskip
Los baculovirus son virus de ADN de la familia
Baculoviridae. Se sabe que estos virus tienen un estrecho
rango de huéspedes que está limitado principalmente a especies de
insectos lepidópteros (mariposas y polillas). El baculovirus Virus
de la Polihedrosis Nuclear de Autographa californica (AcNPV),
que se ha convertido en el baculovirus prototipo, se replica
eficazmente en células de insecto susceptibles cultivadas. El AcNPV
tiene un genoma de ADN circular cerrado de doble hebra de 130.000
pares de bases aproximadamente y está bien caracterizado con
respecto al rango de huéspedes, biología molecular y genética.
Muchos baculovirus, incluyendo AcNPV, forman
grandes oclusiones cristalinas proteicas dentro del núcleo de las
células infectadas. Un único polipéptido, referido como polihedrina,
supone el 95% aproximadamente de la masa proteica de estos cuerpos
de oclusión. El gen de la polihedrina está presente como una única
copia en el genoma vírico del AcNPV. Como el gen de la polihedrina
no es esencial para la replicación del virus en células cultivadas,
puede ser fácilmente modificado para que exprese genes foráneos. La
secuencia del gen foráneo es insertada en el gen del AcNPV justo 3'
respecto a la secuencia del promotor de la polihedrina, de tal
manera que esté bajo el control transcripcional del promotor de la
polihedrina.
Los baculovirus recombinantes que expresan genes
foráneos son construidos mediante recombinación homóloga entre el
ADN del baculovirus y plásmidos quiméricos que contienen la
secuencia génica de interés. Los virus recombinantes pueden ser
detectados en virtud de su morfología de placas característica y
pueden ser purificados mediante la técnica de purificación de
placas hasta la homogeneidad.
Los baculovirus son particularmente idóneos para
ser utilizados como vectores de clonaje y expresión eucarióticos.
Son generalmente seguros en virtud de su estrecho rango de
huéspedes, que está limitado a artrópodos. La U.S. Environmental
Protection Agency (EPA) ha aprobado la utilización de tres especies
de baculovirus para el control de plagas de insectos. El AcNPV ha
sido aplicado a cultivos durante muchos años bajo Permisos de
Utilización Experimental de la EPA.
Los virus AcNPV de tipo salvaje y recombinantes
se replican en una variedad de células de insecto, incluyendo
líneas celulares continuas derivadas del gusano del ejército
(armyworm) otoñal, Spodoptera frugiperda
(Lepidoptera; Noctuidae). Las células de S.
frugiperda tienen un tiempo de duplicación de la población de
18 a 24 horas y pueden ser propagadas en monocapa o en cultivos
libres en suspensión.
Las proteínas HA recombinantes pueden ser
producidas en, pero sin limitarse a, células derivadas de la especie
de lepidópteros Spodoptera frugiperda. Otras células de
insecto que pueden ser infectadas por baculovirus, tales como las
de las especies Bombix mori, Galleria mellanoma, Trichplusia
ni o Lamanthria dispar, podrían ser utilizadas también
como sustrato adecuado para producir proteínas HA recombinantes.
La línea celular huésped más preferida para la
producción de proteínas a partir de baculovirus recombinantes es
Sf900+. Otra línea de células huésped preferida para la producción
de proteínas a partir de baculovirus recombinantes es Sf9. Sf900+ y
Sf9 son líneas celulares continuas no tumorigénicas, no
transformadas, derivadas del gusano del ejército (armyworm) otoñal,
Spodoptera frugiperda (Lepidoptera; Noctuidae).
Las células Sf900+ y Sf9 son propagadas a 28\pm2ºC sin suplemento
de dióxido de carbono. El medio de cultivo utilizado para las
células Sf9 es TNMFH, una mezcla sencilla de sales, vitaminas
azúcares y aminoácidos, suplementado con un 10% de suero bovino
fetal. Aparte del suero bovino fetal, no se utiliza ningún otro
producto derivado de animales (esto es, tripsina, etc.) en la
propagación de las células. Puede utilizarse también medio de
cultivo sin suero (disponible como medio de cultivo de Sf900, Gibco
BRL, Gaithersburg, MD) para cultivar las células Sf9 y se prefiere
para la propagación de las células Sf900+.
Las células Sf9 tienen un tiempo de duplicación
de la población de 18-24 horas y pueden ser
propagadas en monocapa o en cultivos libres en suspensión. No se ha
descrito que las células de S. frugiperda soporten la
replicación de algún virus de mamífero conocido.
Los expertos en la técnica comprenderán que el
vector de expresión no está limitado a un sistema de expresión
baculovírico. Las proteínas HA recombinantes pueden ser expresadas
también en otros vectores de expresión tales como Entomopoxvirus
(los poxvirus de insectos), virus de la polihedrosis citoplásmica
(CPV) y la transformación de células de insecto con la expresión
constitutiva del gen o genes de la HA recombinante.
Una o más cepas de la gripe son aisladas de
individuos infectados con la enfermedad. Preferiblemente, las cepas
de la gripe son aquéllas identificadas por la Food and Drug
Administration (FDA) o por el CDC como poseedoras de un potencial
epidémico para la próxima temporada de gripe. Una ventaja del método
descrito en la presente es que pueden utilizarse muestras clínicas,
tales como secreciones nasales, de pacientes infectados con el
virus de la gripe como fuente directa del virus. Alternativamente,
pueden ser obtenidas de la FDA o del CDC.
Las cepas son posteriormente propagadas en
células que producen títulos elevados de virus, tales como células
de Riñón Canino Madin Darby (MDCK) (disponibles en la American Type
Culture Collection bajo el número de acceso ATCC CCL34). Por
ejemplo, células MDCK son infectadas en presencia de tripsina
parcialmente inactivada con tosilfenilalanil clorometilcetona
(TPCK) y de concentraciones de suero bovino fetal optimizadas para
producir los títulos más elevados de virus en el primer pase. Las
células MDCK son infectadas con las cepas de la gripe a una baja
multiplicidad de infección (de 0,1 a 0,5) según se determinó
mediante un ensayo estándar de HA (Rosen, "Hemagglutination with
Animal Viruses" en Fundamental Techniques in Virology, ed.
K. Habel y N.P. Salzman, pp. 276-28 (Academic
Press, New York, 1969)).
Las células infectadas son incubadas a 33ºC
durante 48 horas y los medios analizados para determinar la
producción de virus utilizando el ensayo de actividad de
hemoaglutinación. Las condiciones que produzcan la actividad HA más
elevada son utilizadas posteriormente para preparar cantidades
grandes de virus de la gripe.
Las partículas víricas producidas a partir del
primer pase son purificadas del medio utilizando un método conocido
de purificación tal como centrifugación en gradiente de densidad de
sacarosa. Por ejemplo, el virus es recogido 24-48
horas después de la infección mediante centrifugación del medio de
las células MDCK infectadas con el virus de la gripe. La pella de
virus resultante es resuspendida en tampón y centrifugada a través
de un gradiente de sacarosa tamponado. La banda del virus de la
gripe es recogida de la región del gradiente de sacarosa del
40-45%, diluida con tampón y aglutinada por
centrifugación a 100.000 x g. La pella de virus purificados es
resuspendida en tampón y almacenada a -70ºC.
En la Figura 1 se proporciona una visión de
conjunto de los métodos para el clonaje de los genes de la HA.
Básicamente, las células son infectadas con la cepa del virus de la
gripe que va a ser clonada. El virus es recogido del medio de las
células y se aísla el ARN vírico, para las cepas del virus de la
gripe A, o bien ARNm en el caso de las cepas del virus de la gripe
B. El ARN del virus (-ARN) es extraído de viriones purificados y
analizado en geles de agarosa formaldehído utilizando procedimientos
estándar. Se sintetiza el ADNc utilizando un sistema de cebadores
universales para el ARN vírico procedente de las cepas de la gripe
A, o bien cebadores aleatorios para el ARNm de las cepas de la
gripe B. Se produce un ADN complementario (ADNc)
más-estándar utilizando un cebador
oligonucleotídico universal
(5'-AGCAAAAGCAGG-3' (SEC ID Nº 1))
que es homólogo a todos los segmentos de ARN de la hemaglutinina en
los virus de la gripe A y B (Davis y col., "Construction and
characterization of a bacterial clone containing the hemagglutinin
gene of the WSN strain (H0N1) of influenza virus", Gene,
10:205-218 (1980)). Se diseñan cebadores que sean
homólogos a las regiones conservadas en el extremo 5' y en el
extremo 3' de los genes de la hemaglutinina de la gripe. Los
cebadores 5' y 3' tienen ambos también sitios de enzimas de
restricción en los extremos que no se encuentran en los genes de la
hemaglutinina.
Se mezclan los cebadores de la gripe A o B
apropiados y el ADNc de la gripe y se amplifican los segmentos del
gen de la hemaglutinina utilizando procedimientos estándar de PCR.
Los fragmentos de ADN de doble hebra resultantes contienen
secuencias codificadoras de la hemaglutinina madura completa. Se
utiliza la reacción en cadena de la polimerasa ("PCR") para
amplificar el gen de la HA total, que es posteriormente clonado en
un huésped bacteriano adecuado tal como E. coli. Los extremos
5' son secuenciados con el fin de identificar el péptido señal de
los genes de la HA; posteriormente se utiliza PCR para amplificar
los genes de la HA menos el péptido señal. Éste es posteriormente
subclonado en un vector de transferencia plasmídico que contiene el
promotor de la polihedrina de AcNPV. Los vectores de transferencia
resultantes contienen las secuencias 5'\rightarrow3' siguientes:
Promotor de la polihedrina del baculovirus NPV de A.
californica, un codón de inicio de la traducción ATG, un
péptido señal de baculovirus 61K, las secuencias codificadoras de la
hemaglutinina madura, el codón de terminación de la traducción de
la hemaglutinina natural, la señal de poliadenilación de ARN de la
polihedrina y ADN de baculovirus flanqueante.
Un ADN plasmídico de transferencia quimérico
purificado conteniendo un gen de la hemaglutinina clonado es
posteriormente mezclado con ADN de AcNPV de tipo salvaje,
coprecipitado con calcio y transfectado a células de S.
frugiperda. Los baculovirus recombinantes son seleccionados
sobre la base de la morfología de las placas y purificados
posteriormente mediante ciclos adicionales de purificación de
placas. Los baculovirus recombinantes clonados son sometidos a
selección por la expresión de hemaglutinina y se selecciona un único
vector de expresión baculovírico para producir un Banco de Virus
Maestro.
\vskip1.000000\baselineskip
Los genes de la HA de cepas de la gripe A son
clonados a partir de preparaciones de ARN vírico purificado. El ARN
vírico es extraído de 100-200 microlitros de
viriones de la gripe A purificados que contienen
1.000-2.000 unidades de hemoaglutinación (UHA) de
la gripe. Una UHA es la cantidad de virus que aglutinará el 50% de
los glóbulos rojos sanguíneos en el ensayo estándar de aglutinación
(Rosen, 1969). Los viriones son tratados con proteinasa K para
digerir la proteína, posteriormente el ARN del virus es extraído con
volúmenes iguales de fenol y cloroformo y precipitado con etanol en
presencia de ARNt transportador. El ARN vírico es resuspendido en
tampón y digerido con ADNasa sin ARNasa para eliminar cualquier ADN
contaminante, posteriormente se repiten las etapas de extracción y
precipitación. El ARN del virus (ARNv) es posteriormente analizado
utilizando geles de agarosa formaldehído según está descrito por
Maniatis y col., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, pp.
86-96 y 366-367 (Cold Spring Harbor
Lab., Cold Spring, N.Y., 1982).
\vskip1.000000\baselineskip
Los genes de la HA de las cepas de la gripe B
son clonados a partir del ARN mensajero (ARNm) total extraído de
células infectadas con la cepa de la gripe B. El ARN total es
posteriormente extraído de las células infectadas. Las células
recogidas son lisadas en presencia de tiocianato de guanidinio y el
ARN celular total es purificado utilizando, por ejemplo, el Kit de
Extracción de ARN de Pharmacia Biotech Inc. (Piscataway, NJ). El
ARNm total es extraído del ARN celular utilizando columnas de
centrifugación de Oligo-(dT)-celulosa empleando, por
ejemplo, el Kit de Purificación de ARNm de Pharmacia Biotech,
Inc.
\vskip1.000000\baselineskip
Los antígenos hemaglutinina recombinantes son
expresados a niveles elevados en células de S. frugiperda
infectadas con los vectores AcNPV-hemaglutinina. El
producto primario del gen es hemaglutinina de longitud completa
(rHA0) sin procesar, y no es secretado, sino que permanece asociado
a las membranas periféricas de las células infectadas. Esta HA0
recombinante es una proteína de peso molecular 68.000 que está
glicosilada con glucanos de tipo manosa superiores, unidos a N,
distintos de los glucanos producidos por la expresión de las
proteínas víricas en células de mamífero o de ave. Hay pruebas de
que la rHA0 forma trímeros después de la traducción que se acumulan
en las membranas citoplásmicas.
\vskip1.000000\baselineskip
La HA0 es una mejor vacuna debido a su superior
estabilidad en comparación con el complejo HA1/HA2, y mantiene un
plegamiento correcto durante la purificación y el almacenamiento. La
superior estabilidad es particularmente obvia con las cepas B,
teniendo como resultado títulos que son alrededor de cinco veces
mayores que los obtenidos con las cepas B atenuadas comercialmente
disponibles.
\newpage
Según se describe más adelante en los ejemplos,
cuando los genes de la HA fueron clonados en pMGS12 a través de
sitios de restricción, el péptido señal de la HA madura fue
eliminado y sustituido por el péptido señal de la quitinasa de
baculovirus, referido como péptido señal de 61 kD. Como el gen de la
HA está conectado con el péptido señal de la quitinasa a través de
un sitio de corte, hay entre tres y cinco aminoácidos, dependiendo
del sitio de restricción seleccionado, entre la proteína HA0 madura
y el péptido señal de 61 kD. Aunque esto no era un problema con las
cepas A de la gripe, la HA0 de la cepa B expresada con los
aminoácidos adicionales no se plegaba correctamente.
Se desarrollaron dos vías para solucionar este
problema. La primera es la utilización de un nuevo vector, pMGS3,
que no codifica el péptido señal de 61 kD. La HA0 con su péptido
señal nativo es clonada en el vector y expresada. Cuando se
caracterizó mediante SDS-PAGE, la HA0 de la cepa B
expresada en este vector mostraba una mejor glicosilación y un
mejor procesamiento que cuando se expresaba en pMGS12. La HA0 se
plegaba tan bien que podía ser convertida cuantitativamente en
HA1/HA2. Desgraciadamente, según se determinó mediante
Transferencia Western, el rendimiento no era tan elevado. El segundo
método incrementa el rendimiento mediante la utilización del
péptido señal de 61 kD en pMGS12 para conducir la expresión cuando
el gen de la HA0 fue insertado sin la utilización de enzimas de
restricción. El nuevo vector, que incluía el péptido señal de 61 kD
y el gen de la HA0, sin ninguna secuencia codificadora de
aminoácidos intermedios extraños, es referido como pMGS27.
El pMGS27 puede ser utilizado para el clonaje y
la expresión de cualquier gen en un sistema de expresión de
baculovirus. El gen diana, en lugar de ser clonado en el vector por
restricción y ligadura, es clonado en el vector por hibridación.
Los reactivos están disponibles en Clontech en su Sistema de Clonaje
Directo por PCR. El pMGS27 fue diseñado de tal manera que pudiera
ser linealizado en el extremo de la región codificadora del péptido
señal de la quitinasa, y se crearon dos colas largas de hebra
sencilla mediante el tratamiento del pMGS27 linealizado con ADN
polimerasa de T4 más dATP.
El gen diana es amplificado utilizando la
reacción en cadena de la polimerasa ("PCR") o transcriptasa
inversa-PCR ("RT-PCR") con un
par de oligonucleótidos diseñados para crear colas de hebra sencilla
que sean complementarias a las colas del pMGS27 tratado, después de
que el fragmento de la PCR haya sido tratado con ADN polimerasa de
T4 y dTTP. Una simple hibridación puede combinar posteriormente las
dos moléculas en un plásmido circular que está listo para
transformar al huésped. Además de ser más rápido y más sencillo que
el método tradicional de restricción-ligadura para
clonar el gen de la HA en pMGS12, el pMGS27 tiene la importante
ventaja de que no produce aminoácidos extra codificados por los
sitios de restricción creados entre el péptido señal de la
quitinasa y la proteína HA madura. Estos aminoácidos extra pueden
crear a veces dificultades tales como que la peptidasa del péptido
señal no pueda cortar la señal, o que la proteína codificada no se
pliegue correctamente, como en el caso de la HA de la cepa B.
Varios días después de la infección, la rHA0
puede ser extraída selectivamente de las membranas periféricas de
las células infectadas con AcNPV-hemaglutinina con
un detergente no iónico, no desnaturalizante, o mediante otros
métodos conocidos por los expertos en la técnica para la
purificación de proteínas recombinantes procedentes de células de
insecto, incluyendo, pero sin limitarse a, cromatografía de afinidad
o en gel y unión a anticuerpos. La rHA0 soluble en detergente puede
ser purificada adicionalmente utilizando intercambio iónico con DEAE
y cromatografía de afinidad con lectina de lenteja u otros métodos
equivalentes conocidos por los expertos en la técnica.
En una realización preferida, la rHA0 es
purificada utilizando un procedimiento que es más suave y tiene como
resultado una mayor producción de la rHA0 de las cepas B de la
gripe. Este procedimiento es de manera general según sigue:
La proteína HA0 que forma una parte integral de
la membrana de las células de insecto es separada de las proteínas
solubles, de las proteínas de las membranas periféricas y de la
mayoría del ADN y del ARN por extracción de las células en una
solución alcalina relativamente viscosa, donde un pH alcalino se
define como entre 9,5 y 10,5 aproximadamente. La viscosidad es
incrementada mediante la inclusión de sacarosa en una concentración
de 250 mM aproximadamente. Se incluye un agente reductor de
disulfuro, por ejemplo \beta-mercaptoetanol, en
una concentración eficaz para impedir la formación de enlaces
disulfuro en las proteínas de la mezcla. Las células son
suspendidas en el tampón de extracción, homogeneizadas y
posteriormente centrifugadas. La pella es lavada por
homogeneización en un tampón de baja fuerza iónica que contiene un
agente reductor de disulfuro a un pH alcalino (la conductividad es
generalmente menor de 1 mS, pH 10,5) y posteriormente la pella es
centrifugada. La HA0 es luego extraída de la pella en un tampón que
contiene entre un 0,3 y un 1,5% de detergente tal como Triton®, una
cantidad de agente disgregante eficaz para prevenir la formación de
complejos debida a interacciones de carga, tal como betaína o
paurina entre 0,3 y 1,0 M, a un pH alcalino (se prefiere 9,5). La
HA0 del sobrenadante es posteriormente purificada mediante
cromatografía de intercambio aniónico seguido por cromatografía de
intercambio catiónico. La HA0 es aplicada a la columna de
intercambio aniónico, por ejemplo de DEAE o
Q-Sepharose® (una columna de esferas de agarosa con
grupos de aminas cuaternarias), en el mismo tampón que se extrajo
pero diluida al menos 1:2 con tampón adicional, después de
equilibrar la columna en tampón conteniendo aproximadamente 1/10 de
la concentración de detergente y de agente reductor de disulfuro.
La HA0 es posteriormente eluida mediante disminución del pH hasta
8,5 aproximadamente. La HA0 eluida es aplicada a una columna de
intercambio catiónico en esencialmente el mismo tampón. Los
contaminantes son eluidos mediante disminución del pH hasta 7,4
aproximadamente, eluyendo posteriormente la HA0 mediante el
incremento de la concentración de sal hasta NaCl 0,15 M.
Este método de purificación preferido se
describe con detalle según sigue.
Preparación de la fracción de membranas que
contiene la HA recombinante. Las células que expresan la HA
recombinante (6,2 g de células procedentes de 0,34 l de cultivo)
son suspendidas a 100 mg/ml en pirofosfato de sodio 100 mM, cloruro
de sodio 100 mM, sacarosa 250 mM,
\beta-mercaptoetanol 0,1%, pH 10,5, enfriado en
hielo. Las células se rompen utilizando un homogeneizador Polytron®
(Brinkman Instruments Inc., Westbury, NY) colocado en la posición
de 4 durante 2 minutos. Se necesita un pH alcalino del medio de
homogeneización para incrementar la solubilidad de las proteínas
contaminantes y para incrementar la pureza de la preparación de
membranas. El homogenado es centrifugado durante 30 minutos a 9.200
g. Se desecha sobrenadante y se recoge la pella. La preparación de
la fracción de membranas es seguida por una etapa de lavado de
fuerza iónica baja. La pella es resuspendida hasta el volumen
original en \beta-mercaptoetanol 0,1% enfriado en
hielo, pH 10,5, y homogeneizada utilizando un homogeneizador
Polytron® colocado en la posición 4 durante 2 minutos. El homogenado
es centrifugado durante 30 minutos a 9.200 g. Se desecha
sobrenadante y se recoge la pella. Este lavado de baja fuerza iónica
elimina la porción adicional de las proteínas de las membranas
periféricas. La preparación de la fracción de membranas tiene como
resultado un enriquecimiento considerable en HA recombinante y la
eliminación de los ácidos nucleicos contaminantes.
Extracción de la HA recombinante. La HA
recombinante es posteriormente extraída de forma selectiva de la
pella de membranas bajo condiciones que no desnaturalizan el
antígeno. La pella de membranas es homogeneizada en 41 ml de
etanolamina 10 mM, pH 9,5, Triton® N101 al 1%,
\beta-mercaptoetanol 0,1%, NaCl 25 mM, betaína 400
mM, enfriado en hielo, utilizando un homogeneizador Polytron®
colocado en la posición 4 durante 2 minutos. Después de incubar
durante 40 minutos a 23ºC, la mezcla es centrifugada durante 30
minutos a 9.200 g. Se decanta el sobrenadante que contiene la HA
recombinante y se diluye dos veces con el mismo tampón.
Las proteínas son analizadas mediante
electroforesis en gel de SDS poliacrilamida. Las muestras se rompen
en un baño de agua en ebullición durante 10 minutos en presencia de
dodecil sulfato de sodio (SDS) 2% y
\beta-mercaptoetanol 5%; posteriormente son
sometidas a electroforesis en un gel de poliacrilamida al 11% en
presencia de SDS 0,1% y luego teñidas con Azul de Coomassie.
Purificación cromatográfica. La
purificación cromatográfica de la HA recombinante fue simplificada y
se eliminó del proceso la costosa cromatografía de afinidad en
Sepharose® con Lectina de Lenteja mediante sustitución por un
proceso de purificación cromatográfica de dos etapas que tuvo como
resultado un antígeno HA recombinante altamente purificado que no
estaba desnaturalizado y que era adecuado como componente de una
vacuna de la gripe para uso humano. Las matrices de gel para
cromatografía utilizadas son Q-Sepharose Fast Flow®
y CM-Sepharose Fast Flow® de Pharmacia.
Cromatografía de intercambio aniónico.
Todas las cromatografías son realizadas a temperatura ambiente. El
extracto que contiene la HA recombinante preparado según se
describió anteriormente es aplicado a 1 ml/minuto a la columna de
Q-Sepharose Fast Flow® de Pharmacia (5 ml en una
columna de Pharmacia C10/10) equilibrada con etanolamina 10 mM pH
9,5, Triton® N101 0,1%, \beta-mercaptoetanol
0,01%, NaCl 25 mM, betaína 400 mM. La columna es lavada
posteriormente con el tampón de equilibrado hasta que la absorbancia
UV del efluente retorne a la línea base. Bajo estas condiciones, la
HA recombinante se une a la columna, mientras que parte de los
contaminantes fluyen a través de la misma. La HA recombinante
parcialmente purificada es luego eluida con dietanolamina 30 mM pH
8,5, Triton® N101 0,1%, \beta-mercaptoetanol
0,01%, NaCl 25 mM, betaína 400 mM.
Cromatografía de intercambio catiónico.
El eluato de la Q-Sepharose® (23 ml) es eluido dos
veces con dietanolamina 30 mM pH 8,5, Triton® N101 0,1%,
\beta-mercaptoetanol 0,01%, NaCl 10 mM, betaína
400 mM. La columna es lavada posteriormente con 35 ml de fosfato de
sodio 10 mM, pH 7,4, Triton® N101 0,1%,
\beta-mercaptoetanol 0,01%, NaCl 10 mM, betaína
400 mM. Este tratamiento eluye los contaminantes de la columna
mientras que la HA recombinante permanece unida a la
CM-Sepharose®. El detergente es luego eliminado
mediante lavado de la columna con fosfato de sodio 10 mM, pH 7,4,
NaCl 10 mM, hasta que la absorbancia UV del efluente retorne a la
línea base. La HA recombinante purificada es eluida con solución
salina tamponada con fosfato, pH 7,5 (PBS).
La rHA0 purificada es resuspendida en una
solución tamponada isotónica. Después de la eliminación del
detergente, la rHA0 purificada aglutinará eficazmente los glóbulos
rojos sanguíneos.
La rHA0 es purificada hasta al menos un 95% de
pureza, más preferiblemente hasta el 99% de pureza. Ésta migra
predominantemente como un único polipéptido principal de peso
molecular 68.000 en un gel de SDS-poliacrilamida.
La estructura cuaternaria del antígeno HA0 recombinante purificado
fue examinada mediante microscopía electrónica, resistencia a
tripsina, análisis de sedimentación de densidad y por la capacidad
para aglutinar glóbulos rojos sanguíneos. Estos datos muestran que
la HA0 recombinante forma trímeros, que se ensamblan en rosetas.
La rHA0 purificada no aglutina células antes de
la eliminación del detergente, sugiriendo que el antígeno debe
formar complejos (rosetas) con el fin de entrecruzar los glóbulos
rojos sanguíneos de pollo. La capacidad cuantitativa de la rHA0
purificada para aglutinar células es utilizada como medida de la
consistencia lote a lote del antígeno. Se define una unidad de
hemaglutinina como la cantidad de antígeno requerida para conseguir
el 50% de aglutinación en un ensayo estándar de hemaglutinina con
glóbulos rojos sanguíneos de pollo. Datos comparativos muestran que
los antígenos rHA0 purificados aglutinan los glóbulos rojos
sanguíneos con una eficacia comparable a la observada con viriones
de la gripe completos.
La HA0 recombinante puede ser cortada en el
enlace disulfuro, produciéndose un cambio de conformación que tiene
como resultado la formación de dos cadenas, HA1 y HA2, según está
descrito por Carr, C.M. y Kim, P.S., "A
Spring-loaded Mechanism for the Conformational
Change of Influenza Hemagglutinin", Cell,
73:823-832 (1993). El corte de la HA0 recombinante
se describe con más detalle en el Ejemplo 6 más adelante. Se cree
que, después del corte de la HA0 natural en HA1 y HA2, las cadenas
resultan infecciosas al adquirir la capacidad de fusionarse con una
célula, creando de este modo una respuesta inmune mejorada. El
procesamiento de antígenos tales como la hemaglutinina de la gripe
tiene lugar por la unión de los péptidos antigénicos a moléculas del
complejo principal de histocompatibilidad (MHC). El complejo
antígeno/MHC es reconocido por las células T para iniciar una
respuesta inmune, según está descrito en la revisión de Harding y
Geuze, Current Opinion in Cell Biology,
5:596-605 (1993). Sin embargo, la rHA0 producida en
baculovirus es muy estable y muy inmunogénica como molécula
intacta. La comparación de las moléculas de azúcar en la HA0
expresada en células de insecto, muestra que los glucanos son
diferentes de los presentes cuando la HA0 es expresada en células de
mamífero o de ave.
Pueden producirse proteínas de fusión que
consten de la HA0 fusionada a una segunda proteína antigénica cuando
la antigenicidad de la segunda proteína sea baja o cuando haya
ventajas para producir una respuesta inmunogénica hacia múltiples
antígenos. Un ejemplo de un segundo antígeno preferido es la
neuraminidasa producida por el virus de la gripe. El antígeno puede
constar de una proteína celular, vírica o bacteriana, o de una
porción antigénica de la misma que incluya al menos de cinco a ocho
aminoácidos. Otros antígenos incluyen el antígeno de la hepatitis
B, antígenos del VIH y el antígeno carcinoembrionario. Una
"respuesta inmune", según se utiliza en la presente, se
refiere a una respuesta humoral, medida por la producción de
anticuerpos hacia el antígeno, o bien a una respuesta celular,
medida por la producción de una respuesta al antígeno mediada por
células T. En algunos casos, puede insertarse un "adaptador"
de aminoácidos no antigénicos entre la HA y el antígeno con el fin
de incrementar adicionalmente la antigenicidad del antígeno en
comparación con la de la HA. El proceso implica la construcción de
un plásmido de ADN para fusionar genes del antígeno diana con el gen
de la HA del virus de la gripe de longitud completa o con
fragmentos del mismo, utilizando sondas oligonucleotídicas y la
metodología de la reacción en cadena de la polimerasa (PCR).
Los genes de fusión HA-antígeno
diana son modificados para obtener una expresión apropiada en
células de insecto mediante deleción de las secuencias del péptido
señal hidrofóbico naturales y la sustitución de las mismas por un
nuevo péptido señal de baculovirus. El gen de fusión es introducido
en un vector de expresión baculovírico de tal manera que el
promotor de la polihedrina del baculovirus dirija la transcripción
de las proteínas de fusión en las células de insecto infectadas. El
péptido señal de baculovirus de 18 aminoácidos dirige la traducción
del polipéptido de fusión HA-antígeno diana en la
ruta de glicosilación de las células de insecto y no está presente
en la proteína de fusión madura.
Por ejemplo, el plásmido pA9440, que contiene el
gen de la HA de la cepa A/Beijing/32/92 en el plásmido de
transferencia baculovírico pMGS12 descrito más adelante, fue
utilizado como molde para la amplificación del gen de la HA
mediante reacción en cadena de la polimerasa (PCR) utilizando el
protocolo recomendado por el proveedor (Gene Amp PCR Cloning Kit,
Perkin Elmer Cetus). La mezcla de la reacción de PCR (100 \mul)
contenía 20 pmoles de cebadores diseñados para hibridar con
porciones del gen de la HA. Los cebadores 5' y 3' fueron diseñados
con sitios de endonucleasas de restricción en los extremos que no se
encuentran en el gen de la HA. El cebador de PCR 5'
(0-567) para los fragmentos HA0 y HA1 comienza 52
pares de bases corriente abajo del extremo 5' de las secuencias
codificadoras del gen de la HA natural, eliminando la secuencia del
péptido señal natural, y añade un sitio de SmaI
inmediatamente 5' a las secuencias codificadoras de la HA. El
cebador 5' de la PCR (0-651) para el fragmento HA2
comienza en el nucleótido 1108 del gen de la HA natural,
inmediatamente después del codón que codifica el residuo de arginina
que es eliminado durante el corte de HA0 para dar HA1 y HA2. El
cebador 3' de la PCR (0-680) para los fragmentos HA0
y HA2 fue diseñado para que añadiera un sitio de KpnI
inmediatamente después de las secuencias codificadoras de HA,
eliminando el codón de parada natural. El cebador 3' de la PCR para
HA1 (0-679) trunca el gen inmediatamente antes del
residuo de arginina eliminado durante el corte de HA0. La
amplificación del fragmento del gen de la HA se llevó a cabo
durante 30 ciclos, consistiendo cada uno en 1 minuto a 94ºC para la
desnaturalización, 2 minutos a 55ºC para la hibridación de los
cebadores y 2 minutos a 72ºC para la extensión. Los fragmentos del
gen de la HA amplificados resultantes fueron sometidos a
electroforesis en geles de agarosa, purificados a partir del gel
utilizando un kit GeneClean (Bio 101, Inc.) y ligados en un plásmido
diseñado para aceptar fragmentos generados en PCR (pCRII;
Invitrogen). De este modo, se obtuvieron los plásmidos pB142, pB144
y pB330, que contienen los fragmentos de los genes de la HA0, de la
HA1 o de la HA2, respectivamente.
Los fragmentos del gen de la HA fueron extraídos
de los plásmidos pB142, pB144 y pB330 con los enzimas de
restricción SmaI y KpnI y subclonados posteriormente
mediante técnicas estándar de ADN recombinante (Sambrook y col.,
1989) en el plásmido pMGS12 de transferencia del AcNPV. El plásmido
pMGS12 contiene, de 5' a 3', el promotor de la polihedrina del
AcNPV, un codón de inicio ATG, la secuencia para un péptido señal
susceptible de ser cortado de una glicoproteína de baculovirus de
peso molecular 61.000 (61K), sitios de clonaje de los enzimas de
restricción SmaI y KpnI y la secuencia de un codón de
parada universal TAA. Flanqueando estas secuencias reguladoras está
un ADN del fragmento I de EcoRI del genoma de AcNPV (Summers
y Smith, "A manual of methods for baculovirus vectors and insect
cell culture procedures". Texas Agricultural Experimental
Station Bulletin Nº 1555 (1987)). Los fragmentos de PCR de la HA
clonados fueron escindidos del vector de clonaje pCRII con
SmaI y KpnI, purificados mediante electroforesis en
gel de agarosa y el kit GeneClean, y ligados en pMGS12 que había
sido digerido también con SmaI y KpnI. Los plásmidos
de transferencia de AcNPV resultantes, pB879, pB1201 y pB1205,
contenían las regiones codificadoras de HA0, HA1 o HA2,
respectivamente, ligadas en marco con el péptido señal de
baculovirus susceptible de ser cortado del gen de 61K y el promotor
de la polihedrina. Los plásmidos de transferencia del AcNPV pB879,
pB1201 y pB1205 pueden ser utilizados para fusionar HA0, HA1 o HA2
a cualquier gen de interés.
La segunda etapa en la construcción de plásmidos
de transferencia de genes de fusión HA-CEA era
insertar las secuencias codificadoras de CEA en las construcciones
que codificaban HA. Sitios de reconocimiento/corte de endonucleasas
de restricción para SmaI y KpnI fueron colocados en
ambos extremos del gen de CEA mediante amplificación por PCR del
plásmido pA9080. El cebador 5' de la PCR, 0-649,
comienza a 82 pares de bases del extremo 5' del gen, eliminando la
secuencia peptídica señal de CEA natural. El cebador 3' de la PCR,
0-650, fue diseñado para eliminar los últimos 72
pares de bases en el extremo 3' del gen que codifica la secuencia
de la región C-terminal hidrofóbica. La
amplificación del fragmento del gen de CEA se llevó a cabo durante
30 ciclos, consistiendo cada uno en 1 minuto a 94ºC para la
desnaturalización, 2 minutos a 55ºC para la rehibridación y 2
minutos a 72ºC para la extensión. El fragmento del gen de CEA
amplificado resultante fue sometido a electroforesis en un gel de
agarosa, purificado con el procedimiento de GeneClean y ligado en
pCRII (Invitrogen) de acuerdo con las instrucciones de los
fabricantes. El plásmido resultante, pB806, contiene el gen de CEA
sin su péptido señal natural, sin su dominio hidrofóbico
C-terminal o sin su codón de parada, pero con los
dos sitios de SmaI y KpnI en ambos extremos del
gen.
Se produjo una preparación plasmídica a gran
escala con el plásmido pB806, y el ADN fue digerido con SmaI
o con KpnI. Los fragmentos que codificaban CEA fueron
purificados mediante electroforesis en gel de agarosa y el kit
GeneClean, y los fragmentos purificados fueron ligados en cada una
de las tres construcciones que codificaban HA (pB879, pB1201 o
pB1205) digeridas con el mismo enzima de restricción. Por ejemplo,
fragmentos que codificaban CEA con extremos cortados por
SmaI fueron ligados en las construcciones que codificaban
HA0, HA1 y HA2 (pB879, pB1201 y pB1205, respectivamente) cortadas
con SmaI para crear los plásmidos pB1250, pB1555 y pB1584,
respectivamente. Los fragmentos que codificaban CEA con extremos
cortados por KpnI fueron ligados en las construcciones que
codificaban HA0, HA1 y HA2 cortadas con KpnI para crear
pB1264, pB1564 y pB1593. La inserción del gen de CEA en el sitio de
SmaI colocaba a las secuencias codificadoras de CEA
corriente abajo de las secuencias codificadoras de HA. Para todas
las construcciones, los cebadores de la PCR fueron diseñados de
manera que el gen del CEA estuviera insertado en marco con HA, y que
la traducción del gen de fusión fuera terminada en la señal de
terminación de la traducción universal (TAATTAATTAA) (Secuencia ID
Nº 4) en las secuencias del vector pMGS12 corriente abajo del sitio
de KpnI.
Esta construcción puede ser mejorada por
deleción de los aminoácidos intermedios, entre el péptido señal y
HA0, según se describe más adelante, o bien entre HA0 y el gen de
fusión, con el fin de incrementar el plegamiento y la
inmunogenicidad.
La rHA puede ser formulada y envasada, sola o en
combinación con otros antígenos de la gripe, utilizando métodos y
materiales conocidos por los expertos en la técnica de las vacunas
de la gripe. En una realización preferida, proteínas HA de dos
cepas A y de una cepa B son combinadas para formar una vacuna
multivalente.
En una realización particularmente preferida,
las HAs son combinadas con un adyuvante, en una cantidad eficaz
para incrementar la respuesta inmunogénica frente a las proteínas
HA. En este momento, el único adyuvante ampliamente utilizado en
humanos ha sido el alumbre (fosfato de aluminio o hidróxido de
aluminio). La saponina y su componente purificado Quil A, el
adyuvante completo de Freund y otros adyuvantes utilizados en
investigación y en aplicaciones veterinarias tienen toxicidades que
limitan su uso potencial en vacunas para humanos. Sin embargo,
nuevas preparaciones químicamente definidas tales como muramil
dipéptido, monofosforil lípido A, conjugados de fosfolípidos tales
como los descritos por Goodman-Snitkoff y col.,
J. Immunol., 147:410-415 (1991), la
encapsulación de la proteína en un proteoliposoma según está
descrito por Miller y col., J. Exp. Med.,
176:1739-1744 (1992) y la encapsulación de la
proteína en vesículas lipídicas tales como vesículas lipídicas
Novasome^{TM} (Micro Vesicular Systems, Inc., Nashua, NH) podrían
ser también útiles.
En la realización preferida, la vacuna es
envasada en una única dosis para inmunización mediante
administración parenteral (esto es, intramuscular, intradérmica o
subcutánea) o mediante administración nasofaríngea (esto es,
intranasal). La dosificación eficaz es determinada según se describe
en los ejemplos siguientes. El vehículo es normalmente agua o una
solución salina tamponada, con o sin un conservante. El antígeno
puede estar liofilizado para ser resuspendido en el momento de la
administración, o puede estar en solución.
El vehículo puede ser también un sistema de
liberación retardada polimérico. Los polímeros sintéticos son
particularmente útiles en la formulación de una vacuna para llevar a
cabo la liberación controlada de los antígenos. Un ejemplo temprano
de esto fue la polimerización de metacrilato de metilo en esferas
que tenían diámetros inferiores a una micra para formar las
denominadas nanopartículas, descrito por Kreuter, J.,
Microcapsules and Nanoparticles in Medicine and
Pharmacology, M. Donbrow (Ed.) CRC Press, p.
125-148. La respuesta de anticuerpos, así como la
protección frente a la infección por el virus de la gripe fue
significativamente mejor que cuando el antígeno fue administrado en
combinación con hidróxido de aluminio. Experimentos con otras
partículas han demostrado que el efecto adyuvante de estos
polímeros depende del tamaño y la hidrofobicidad de las
partículas.
La microencapsulación ha sido aplicada a la
inyección de productos farmacéuticos microencapsulados para obtener
una liberación controlada. Varios factores contribuyen a la
selección de un polímero particular para la microencapsulación. La
reproducibilidad de la síntesis del polímero y del proceso de
microencapsulación, el coste de los materiales y del proceso de
microencapsulación, el perfil toxicológico, los requisitos para una
cinética de liberación variable y la compatibilidad fisicoquímica
del polímero y los antígenos, son todos factores que deben ser
tenidos en cuenta. Ejemplos de polímeros útiles son policarbonatos,
poliésteres, poliuretanos, poliortoésteres y poliamidas,
particularmente todos aquéllos que son biodegradables.
Una elección frecuente de vehículo para agentes
farmacéuticos y más recientemente para antígenos es poli
(d,l-láctido-co-glicólido)
(PLGA). Éste es un poliéster biodegradable que tiene una larga
historia de uso médico en suturas erosionables, en placas de hueso
y en otras prótesis temporales, en las que no ha presentado ninguna
toxicidad. Una amplia variedad de productos farmacéuticos,
incluyendo péptidos y antígenos, ha sido formulada en microcápsulas
de PLGA. Se ha acumulado un conjunto de datos sobre la adaptación
del PLGA para la liberación controlada de antígenos, por ejemplo
según ha sido revisado por Eldridge, J.H. y col., Current Topics
in Microbiology and Immunology. 1989,
146:59-66. La inclusión de antígenos en microesferas
de PLGA de 1 a 10 micras de diámetro, ha demostrado tener un
notable efecto adyuvante cuando se administran oralmente. El proceso
de microencapsulación en PLGA utiliza una separación de fases de
una emulsión agua-en-aceite. El
compuesto de interés es preparado como una solución acuosa y el
PLGA es disuelto en solventes orgánicos adecuados tales como cloruro
de metileno y acetato de etilo. Estas dos soluciones inmiscibles
son coemulsionadas mediante agitación a alta velocidad.
Posteriormente se añade un producto que no sea solvente del
polímero, causando la precipitación del polímero alrededor de las
gotitas acuosas para formar microcápsulas embrionarias. Las
microcápsulas son recogidas y estabilizadas con alguno de una
variedad de agentes (alcohol polivinílico (PVA), gelatina,
alginatos, polivinilpirrolidona (PVP), metil celulosa) y el
solvente es eliminado mediante secado in vacuo o por
extracción del solvente.
La presente invención se comprenderá mejor por
referencia a los ejemplos no limitantes siguientes.
\vskip1.000000\baselineskip
Las cepas para vacuna de la gripe siguientes
fueron obtenidas de la FDA en fluido alantoideo de huevos de
pollo:
\vskip1.000000\baselineskip
Similar a A/Beijing/353/89 (H3N2)
Similar a A/Beijing/32/92 (H3N2)
Similar a A/Texas/36/91 (H1N1)
B/Panamá/45/90
\vskip1.000000\baselineskip
Con el fin de propagar la cepa original del
virus de la gripe obtenida de la FDA, células MDCK fueron infectadas
en presencia de tripsina tratada con TPCK (Sigma Chemical Co., St.
Louis, MO) y concentraciones de suero bovino fetal optimizadas para
producir los títulos más elevados de virus en el primer pase. Las
células MDCK fueron infectadas con las cepas de la gripe a una baja
multiplicidad de infección (0,1 a 0,5) según se determinó mediante
un ensayo estándar de HA (Rosen, "Hemagglutination with Animal
Viruses" en Fundamental Techniques in Virology, ed. K.
Habel y N.P. Salzman, pp. 276-28 (Academic Press,
New York, 1969)). Las células infectadas fueron incubadas a 33ºC
durante 48 horas, y los medios fueron analizados para determinar la
producción de virus utilizando el ensayo de actividad de
hemoaglutinación. Las condiciones que produjeron la actividad más
elevada de HA fueron utilizadas para preparar soluciones madre
grandes del virus de la gripe. Las concentraciones óptimas de
tripsina tratada con TPCK y de suero bovino fetal para los virus de
la gripe anteriores están enumeradas en la Tabla 1.
Purificación del Virus de la Gripe: El
virus fue recogido 24-48 horas después de la
infección de 10 frascos de cultivo de tejidos T175 mediante
clarificación de los medios (1.000 x g durante 10 minutos) de las
células MDCK infectadas con el virus de la gripe. El virus fue
aglutinado de los medios a 100.000 x g durante 1 hora. El
aglutinado de virus resultante fue resuspendido en 1 ml de solución
salina tamponada con fosfato (PBS) pH 7,4 y centrifugado a través
de 20 ml de un gradiente de sacarosa 20-60% (p/v) en
PBS. La banda de virus de la gripe fue recogida de la región de
sacarosa 40-45% del gradiente, diluida con PBS y
aglutinada a 100.000 x g. La pella de virus purificados fue
resuspendida en 0,5 ml de PBS y almacenada a -70ºC.
Un ejemplo específico de la etapa de clonaje de
uno de los genes de la HA de la gripe está mostrado en la Figura 2.
El ARN del virus fue extraído según se describió anteriormente del
virus de la gripe A/Texas/36/91, obtenido del CDC. Se utilizó el
cebador universal complementario al extremo 3' de segmentos de ARN
de la gripe, 5'-AG
CAAAAGCAGG-3' (SEC ID Nº 1), con transcriptasa inversa del Virus de la Leucemia de Maloney Murino (M-MuLV) para producir ADNcs de la gripe. Se utilizó ARN o ARNm vírico purificado (5 \mug) como molde para producir ADNc utilizando la transcriptasa inversa de M-MuLV suministrada en el kit "First-Strand cDNA Synthesis Kit" de Pharmacia Inc. El cebador utilizado para el ADNc del ARN vírico de cepas de la gripe A fue un cebador oligonucleotídico sintético (5'-AGCAAAAGCAGG-3') (SEC ID Nº 1), que es homólogo al extremo 3' de todos los segmentos del gen de la HA de los viriones.
CAAAAGCAGG-3' (SEC ID Nº 1), con transcriptasa inversa del Virus de la Leucemia de Maloney Murino (M-MuLV) para producir ADNcs de la gripe. Se utilizó ARN o ARNm vírico purificado (5 \mug) como molde para producir ADNc utilizando la transcriptasa inversa de M-MuLV suministrada en el kit "First-Strand cDNA Synthesis Kit" de Pharmacia Inc. El cebador utilizado para el ADNc del ARN vírico de cepas de la gripe A fue un cebador oligonucleotídico sintético (5'-AGCAAAAGCAGG-3') (SEC ID Nº 1), que es homólogo al extremo 3' de todos los segmentos del gen de la HA de los viriones.
La amplificación de los genes de la HA a partir
del ADNc fue realizada mediante la reacción en cadena de la
polimerasa (PCR) utilizando condiciones estándar de reacción (Gene
Amp Kits; Cetus/Perkin Elmer, Norwalk, CT). La mezcla de la
reacción de PCR (100 \mul) contenía 20 pmoles de cebadores
específicos para los extremos 5' y 3' del gen de la HA de las cepas
de la gripe A (H3) o A (H1) o de la cepa de la gripe B, según se
determinó por las secuencias consenso encontradas en los archivos
de datos de ADN del GenBank, según se muestra en la Tabla 2. La
amplificación se llevó a cabo durante 30 ciclos, constando cada
ciclo de 1 minuto de desnaturalización a 94ºC, 2 minutos a 55ºC
para la rehibridación y 3 minutos a 72ºC para la extensión. Los
productos de la PCR fueron analizados en geles de agarosa al 0,8%
para determinar el tamaño correcto antes del clonaje.
Cebadores de PCR del extremo 5' del gen de la
HA: 5'-GGG GGT ACC CCC GGG AGC AAA AGC AGG GGA AAA
TAA AAA-3' (SEC ID Nº 2) y del extremo 3' del gen
de la HA: 5'-GA AAC GTC ACG TCT TAT ACG/T TAG/T ACT
CCA TGG CCC-3' (SEC ID Nº 3) fueron utilizados en
la PCR para producir el gen de la HA de longitud completa.
Se diseñó un nuevo cebador 5' de la PCR a partir
del extremo 5' del gen: extremo 5' menos la secuencia señal:
5'-GGG GGT ACC CCC GGG GAC ACA ATA TGT ATA GGC TAC
CAT-3' (SEC ID Nº 4) y a partir del extremo 3' del
gen: 5'-GA AAC GTC ACG TCT TAT ACG/T TAG/T ACT CCA
TGG CCC-3' (SEC ID Nº 5). Éstos fueron utilizados en
PCR para producir el gen de la HA menos la secuencia del péptido
señal. Éste fue insertado posteriormente en el vector TA cortado
con KpnI. El péptido señal 61K para la expresión de
baculovirus y el promotor de la polihedrina fueron insertados
posteriormente en el vector TA que contenía el gen de la HA menos la
secuencia del péptido señal de la gripe. El vector de recombinación
baculovírico resultante contiene el promotor de la polihedrina, el
péptido señal de baculovirus 61K y el gen de la HA del virus de la
gripe A/Texas/36/91.
Los genes de la HA de las cepas de la gripe B
fueron clonados a partir de ARN mensajero (ARNm) total extraído de
células MDCK infectadas con el virus de la gripe B de la cepa
B/Panamá/45/90. El ARN total fue preparado a partir de 5 frascos
T175 de células infectadas. Las células recogidas fueron lisadas en
presencia de tiocianato de guanidinio y el ARN celular total fue
purificado según se describió anteriormente. El ARNm total fue
extraído del ARN celular utilizando columnas de centrifugación de
Oligo-(dT)-celulosa según se describió
anteriormente.
El cebador utilizado para el ARNm de las cepas
de la gripe B fue un cebador oligonucleotídico de ADN aleatorio
(Pharmacia, Inc.).
\vskip1.000000\baselineskip
Un ejemplo de los productos de síntesis de ADNc
utilizó como molde ARN vírico del virus de la gripe
A/Texas/36/
91. La ubicación de los segmentos de ADNc que codifican las proteínas de la gripe podría ser determinada según sigue. El ARN vírico purificado fue combinado en la mezcla de reacción con el cebador de ADN de hebra sencilla universal 5'-AGCAAAAGCAGG-3' (SEC ID Nº 1). Este cebador es complementario al extremo 3' de los segmentos de los viriones de la gripe, según se describió anteriormente. La reacción contenía también la adición de [\alpha-^{32}P]dCTP para visualizar los productos de ADNc que fueron separados en un gel de hidrólisis alcalina al 1,5% (Maniatis y col., 1982) y expuestos a una película X-OMAT-AR.
91. La ubicación de los segmentos de ADNc que codifican las proteínas de la gripe podría ser determinada según sigue. El ARN vírico purificado fue combinado en la mezcla de reacción con el cebador de ADN de hebra sencilla universal 5'-AGCAAAAGCAGG-3' (SEC ID Nº 1). Este cebador es complementario al extremo 3' de los segmentos de los viriones de la gripe, según se describió anteriormente. La reacción contenía también la adición de [\alpha-^{32}P]dCTP para visualizar los productos de ADNc que fueron separados en un gel de hidrólisis alcalina al 1,5% (Maniatis y col., 1982) y expuestos a una película X-OMAT-AR.
Los genes de la rHA amplificados por PCR fueron
clonados en un vector plasmídico similar a pUC utilizando el
Sistema de Clonaje TA (Invitrogen, Inc.). La presencia de genes de
la HA fue verificada mediante análisis de los digestos de enzimas
de restricción del ADN plasmídico purificado mediante procedimientos
estándar (Maniatis y col., 1982). Los extremos 5' de los genes de
la rHA fueron analizados posteriormente mediante secuenciación del
ADN y se diseñaron nuevos cebadores para eliminar las secuencias que
codificaban los péptidos señal hidrofóbicos en el extremo N de las
proteínas HA. Los cebadores oligonucleotídicos 5' y 3' específicos
enumerados en la Tabla 2 fueron utilizados posteriormente para
amplificar los productos ADNc mediante PCR y clonados en vectores
plasmídicos TA de E. coli (Invitrogen, Inc.) utilizando
métodos estándar de clonaje. Los clones de ADN resultantes
contenían secuencias codificadoras de las HAs maduras.
Los genes de la rHA de A/Texas/36/91,
A/Beijing/353/89, A/Beijing/32/92 y B/Panamá/45/90 fueron
subclonados mediante procedimientos estándar (Maniatis y col.,
1982) en vectores de expresión baculovíricos. Los genes de la HA
fueron extraídos de los plásmidos de clonaje TA con los enzimas de
restricción apropiados y el fragmento de ADN de la HA purificado
fue insertado en un plásmido de recombinación de baculovirus. Los
clones bacterianos resultantes fueron sometidos a selección por
resistencia a ampicilina y posteriormente cortados con enzimas de
restricción para liberar el gen de la HA insertado con el fin de
confirmar su presencia. Los plásmidos de recombinación que
contenían genes de la HA fueron purificados en gradientes de cloruro
de cesio-bromuro de etidio (Maniatis y col., 1982).
Los extremos 5' de los plásmidos fueron secuenciados para determinar
la presencia de las señales correctas de baculovirus (promotor de
la polihedrina de AcNPV, señal de inicio de la traducción ATG y
secuencia del péptido señal de baculovirus) y de la secuencia
codificadora de HA apropiada en el marco de lectura correcto. Las
secuencias de ADN del extremo 5' de los genes de la HA y las
secuencias flanqueantes del promotor de la polihedrina de AcNPV y
del péptido señal de baculovirus (18 primeros aminoácidos de cada
secuencia de aminoácidos) están mostradas como LISTADOS DE
SECUENCIAS.
La SEC ID Nº 6 codifica la secuencia del extremo
5' del gen de la HA de A/Beijing/32/92 (rango de la secuencia
1-481). La SEC ID Nº 7 es la secuencia de
aminoácidos correspondiente (que comienza en el codón de inicio
"ATG" [nucleótido 19] de la SEC ID Nº 6). La secuencia de
aminoácidos del péptido señal 61K está mostrada en la SEC ID Nº 7
como los aminoácidos 1-18.
La SEC ID Nº 8 codifica la secuencia del extremo
5' del gen de la HA de A/Texas/36/91 (rango de la secuencia
1-481). La SEC ID Nº 9 es la secuencia de
aminoácidos correspondiente (que comienza en el codón de inicio
"ATG" [nucleótido 19] de la SEC ID Nº 8). La secuencia de
aminoácidos del péptido señal 61K está mostrada en la SEC ID Nº 9
como los aminoácidos 1-18.
La SEC ID Nº 10 codifica la secuencia del
extremo 5' del gen de la HA de B/Panamá/45/90 (rango de la secuencia
1-434). La SEC ID Nº 11 es la secuencia de
aminoácidos correspondiente (que comienza en el codón de inicio
"ATG" [nucleótido 21] de la SEC ID Nº 10). La secuencia de
aminoácidos del péptido señal 61K está mostrada en la SEC ID Nº 11
como los aminoácidos 1-18.
En las SEC ID N^{os} 6, 8 y 10, los
nucleótidos 1-20 son el extremo 3' del promotor de
la polihedrina, los nucleótidos 21-74 codifican el
péptido señal 61K y los nucleótidos 75 hasta el final codifican el
extremo 5' del gen de la HA.
\vskip1.000000\baselineskip
Los plásmidos de recombinación quiméricos que
contenían genes de la HA clonados fueron purificados y se mezclaron
2 \mug con 1 \mug de ADN del AcNPV de tipo salvaje. Los ADNs
fueron coprecipitados con calcio y transfectados a células de S.
frugiperda utilizando procedimientos estándar (Smith, Summers y
Fraser, Mol. and Cell. Biol., 3:2156-2165
(1983)). Los baculovirus recombinantes fueron identificados sobre la
base de la morfología de las placas, posteriormente fueron además
purificados mediante ciclos adicionales de purificación de placas.
Los baculovirus recombinantes purificados por la técnica de
purificación de placas fueron sometidos a selección por la
expresión de la rHA y se seleccionó un único vector de expresión
baculovírico para el desarrollo posterior.
Células de S. frugiperda fueron
infectadas con un vector baculovírico que contenía el gen de la HA
de la cepa del virus de la gripe B/Panamá/45/90. A las 24, 48 y 72
horas después de la infección, 1 x 10^{6} células fueron
sometidas a un pulso de 25 \muCi de [^{35}S]metionina
durante 15 minutos con el fin de marcar las proteínas que estaban
siendo sintetizadas. Se recogieron las células y se separaron las
proteínas en un gel de poliacrilamida al 11% en presencia de SDS al
0,1%. Las proteínas radiomarcadas fueron detectadas por exposición
a una película X-OMAT-AR. La
posición de los estándares de proteína y su tamaño en kilodaltons
(kd) indicaban que la proteína HA recombinante de 85 kd era una de
las proteínas principales que estaba siendo sintetizada en las
células a las 48 horas y a las 72 horas después de la infección.
\vskip1.000000\baselineskip
El vector de expresión baculovírico A8611, que
contiene el gen de la gripe A/Beijing/353/89, producido
esencialmente según se describió anteriormente para la
hemaglutinina de A/Beijing/32/92 bajo el control del promotor de la
polihedrina, fue utilizado para infectar células de S.
frugiperda. Las células fueron cultivadas a 27ºC a una densidad
de 1 x 10^{6} células/ml en medio TNMFH (Gibco BRL, Gaithersburg,
MD) suplementado con un 10% de suero bovino fetal, e infectadas a
una multiplicidad de infección (MOI) de 1 con el baculovirus
recombinante A8611. Durante la infección, la hemaglutinina de la
gripe A/Beijing/353/89 se produce bajo el control transcripcional
del promotor de la polihedrina del baculovirus. Las células son
recogidas 72 horas después de la infección por centrifugación
durante 15 minutos a 3.400 x g y lavadas por resuspensión en medio
TNMFH sin suero, seguido por centrifugación durante 30 minutos a
10.400 x g. Se decanta el sobrenadante y los aglutinados de células
infectadas son almacenados a -70ºC.
Se desarrolló un proceso en el cual la HA
recombinante era extraída selectivamente de las células infectadas
bajo condiciones que no desnaturalizaban el antígeno. A no ser que
se indique de otro modo, todas las etapas de extracción se llevaron
a cabo a 4ºC. La pella celular procedente de 0,5 l de cultivo (5 x
10^{8} células aproximadamente) fue sometida a ruptura durante 2
minutos en 40 ml de Tris-HCl 30 mM, pH 8,4, LiCl 25
mM, Tween-20 1% (v/v), 1 mg/ml de leupeptina,
enfriado en hielo, utilizando un homogeneizador Polytron^{TM}
(Brinkmann Instruments Inc., Westbury, NY). El homogenado fue
centrifugado durante 30 minutos a 9.200 x g. Se desechó el
sobrenadante y se recogió la pella. Esta etapa elimina las proteínas
solubles y las de las membranas periféricas de las células de
insecto sin extraer las proteínas integrales de las membranas como
la rHA. Para extraer la rHA, la pella fue homogeneizada durante 2
minutos con el homogeneizador en la posición 4, en 40 ml de Tris 30
mM, etanolamina 10 mM, pH 11, LiCl 25 mM, Tween-20
2%, enfriado en hielo. Después de una incubación de 60 minutos
sobre hielo, el pH del homogenado fue ajustado a 8,4 con HCl 1 N, y
el material insoluble fue eliminado por centrifugación durante 30
minutos a 9.200 x g. El sobrenadante que contenía la rHA soluble fue
decantado y se comprobó el pH y, si era necesario, se ajustó a 8,4
a temperatura ambiente. El material insoluble fue resuspendido en
40 ml de agua para análisis. La proteína integral HA de las
membranas fue solubilizada bajo las condiciones de pH elevado,
detergente Tween-20, y permanecía en solución
después de disminuir el pH.
Las proteínas fueron analizadas mediante
electroforesis en gel de SDS poliacrilamida. Las muestras fueron
sometidas a ruptura en un baño de agua en ebullición durante 10
minutos en presencia de dodecil sulfato de sodio (SDS) al 2% y
beta-mercaptoetanol al 5%, posteriormente sometidas
a electroforesis en un gel de poliacrilamida al 11% en presencia de
SDS al 0,1% y teñidas luego con Azul de Coomassie.
Se desarrolló un proceso de purificación
cromatográfica para purificar la HA recombinante que tuvo como
resultado un antígeno HA recombinante, altamente purificado, que no
estaba desnaturalizado y que era adecuado como componente de una
vacuna de la gripe para uso humano. Se utilizó el procedimiento
siguiente para purificar la HA de A/Beijing/353/89 a partir de
células de S. frugiperda infectadas con el virus recombinante
A8611.
La matrices de gel para cromatografía utilizadas
para purificar la HA a partir de 0,5 l de células de S.
frugiperda infectadas fueron: 30 ml de DEAE Sepharose Fast Flow®
de Pharmacia (en una columna C16/20 de Pharmacia) y 4 ml de
Sepharose 4B® Lectina de Lenteja de Pharmacia (en una columna C10/10
de Pharmacia). La salida de la columna de DEAE está conectada con
la entrada de la columna de lectina de lenteja, y el extracto de
células S/N 2 preparado según se describió anteriormente fue
aplicado a las columnas acopladas a una velocidad de flujo de 1
ml/minuto. Las columnas fueron lavadas con Tris-HCl
30 mM, pH 8,4, LiCl 25 mM, Tween-20 0,5% hasta que
la absorción UV a 280 nm del efluente de la columna de lectina de
lenteja retornó a la línea base. Bajo estas condiciones, las
mayoría de las proteínas contaminantes se unen a la DEAE, pero la HA
recombinante fluye a través de la columna. Los contaminantes
restantes pasan a través de la columna de lectina y la rHA
glicosilada se une a la matriz de afinidad de lectina de lenteja. La
columna de DEAE es desconectada y se lava la columna de lectina con
otros 40 ml de Tris-HCl 30 mM, pH 8,4, LiCl 25 mM,
Tween-20 0,5%. A continuación, la columna de
lectina es lavada con 40 ml de Tris-HCl 30 mM, pH
8,4, LiCl 25 mM, desoxicolato de sodio (DOC) 0,4% (v/v). Esta etapa
sustituye el detergente Tween-20 por un detergente
como DOC que puede ser eliminado de la proteína mediante diálisis.
La HA recombinante es eluida posteriormente de la columna de lectina
con 20 ml aproximadamente de 40 ml de Tris-HCl 30
mM, pH 8,4, LiCl 25 mM, desoxicolato de sodio 0,4% (v/v) conteniendo
a-D-metil manósido 0,3 M. Los
resultados son analizados mediante PAGE al 11%.
Debido a la variabilidad genética de las
proteínas HA de la gripe, los detalles del proceso anterior de
purificación pueden variar con cada proteína HA recombinante
particular. Por ejemplo, la rHA puede unirse a la columna de
intercambio iónico de DEAE en lugar de fluir a través de la misma.
Si esto ocurriera, la rHA sería extraída de la columna de DEAE
mediante lavado de la columna con un tampón conteniendo una
concentración mayor de LiCl, NaCl o de otras sales.
Para eliminar el detergente DOC y otros
componentes del tampón, el eluato procedente de la columna de
lectina que contenía la rHA purificada fue dializado frente a
solución salina tamponada con fosfato, pH 7,5 (PBS). La HA
recombinante purificada era al menos un 95% pura, según se determinó
mediante análisis en geles de SDS poliacrilamida.
La HA madura se ensambla en estructuras
triméricas que son resistentes a una variedad de proteasas,
incluyendo tripsina, que degradan monómeros de HA (Murphy y
Webster, 1990). La resistencia al tratamiento con tripsina puede
ser utilizada por tanto como un ensayo para determinar la formación
de trímeros funcionales. Se utilizó el procedimiento siguiente para
estudiar la resistencia de la rHA al tratamiento con proteasas.
Dos alícuotas de rHA purificada
(A/Beijing/353/89) a 60 \mug/ml fueron incubadas sobre hielo
durante 30 minutos en Tris-HCl 30 mM, pH 8,4, NaCl
150 mM, en presencia y ausencia de 50 \mug/ml de tripsina tratada
con TPCK. La reacción fue parada por la adición de fluoruro de fenil
metil sulfonilo 57,4 mM en isopropanol hasta una concentración
final de 1 mM. Alícuotas de cada muestra fueron desnaturalizadas por
ebullición en SDS al 3% bajo condiciones reductoras, sometidas a
electroforesis en geles de poliacrilamida al 11,5% y transferidas a
filtros de nitrocelulosa utilizando procedimientos estándar de
Transferencia Western. Los polipéptidos de HA fueron detectados
utilizando suero anti-HA de cobayo preparado contra
la rHA purificada y un conjugado de anti-IgG de
cobayo producido en cabra con fosfatasa alcalina.
La rHA no tratada migra al tamaño del precursor
de la HA (HA0). El tratamiento con proteasa tiene como resultado
dos bandas principales que migran a los tamaños pronosticados para
la hemaglutinina HA1 y HA2 de la gripe. Los resultados muestran que
la tripsina corta la proteína rHA una vez para producir dos
polipéptidos que tienen los tamaños pronosticados para HA1 y HA2.
No tiene lugar un procesamiento proteolítico posterior. Estos
resultados demuestran que la rHA purificada mediante el proceso
anterior es resistente a la degradación por la proteasa. Esta
propiedad es consistente con el hecho de que la rHA purificada esté
en forma de trímeros.
Un procedimiento para medir la inmunogenicidad
de un antígeno es determinar la cantidad necesaria para inducir una
respuesta de anticuerpos detectable en ratones (ensayo de potencia
en ratón). Se utilizó un ensayo de potencia en ratón estandarizado
para medir la inmunogenicidad de la vacuna de rHA0. Grupos de
5-10 ratones son inmunizados una vez con la vacuna
que contenía diluciones seriadas de rHA, esto es, 0,500 \mug, 0,1
\mug, 0,02 \mug y 0,004 \mug de rHA purificada. Se recogen
sueros 28 días después de la inmunización y se miden los
anticuerpos contra el antígeno rHA mediante un ensayo inmunológico
en fase sólida con un enzima unido (ELISA) estándar en placas de
microvaloración de 96 pocillos. Un ratón se ha seroconvertido si la
DO450 a una dilución 1:100 del antisuero del día 28 es mayor que
tres desviaciones estándar sobre la media de la DO450 del suero
preinmune del ratón. La dosis eficaz de vacuna necesaria para
seroconvertir el 50% de los ratones (DE50) es una medida de la
inmunogenicidad del antígeno.
Por ejemplo, cuatro grupos de 10 ratones son
inmunizados una vez con 0,1 \mug, 0,02 \mug, 0,004 \mug o
0,0008 \mug (diluciones de 5 veces) de vacuna de rHA0. Los sueros
son recogidos 28 días después de la inmunización y medidos frente a
cada antígeno rHA0 de la vacuna para determinar la seroconversión en
un ensayo de ELISA. Se calcula la dosis necesaria para
seroconvertir el 50% de los ratones (DE_{50}) y se establece una
DE_{50} mínima para cada antígeno rHA0.
Datos preliminares muestran que una única dosis
de 0,004 \mug de rHA0 seroconvertirá a al menos el 50% de los
ratones.
Se analizó la potencia en ratón de rHA
purificada del virus de la gripe A/Beijing/353/89 con alumbre o sin
alumbre (pura) y se comparó con una vacuna de la gripe comercial,
FLUZONE® (Connaught Laboratories, Inc., Swiftwater, PA) que
contiene la cepa A/Beijing/353/89 de la gripe. La vacuna fue
administrada en una dosis de 0,5 \mug, 0,1 \mug, 0,02 \mug y
0,04 \mug. Los ratones fueron reforzados el día 28 con las dosis
de rHA purificada anteriormente descritas. El día 42 se recogieron
los sueros y se titularon en un ensayo de ELISA para determinar los
anticuerpos IgG anti-HA.
Los resultados están mostrados en la Figura 3.
En ausencia de adyuvante, solamente una dosis de 0,5 \mug indujo
la producción de un título significativo de anticuerpos (200.000).
En presencia de adyuvante, dosis tan pequeñas como de 0,004 \mug
de rHA0 produjeron un título de anticuerpos significativo. Los
animales inmunizados con rHA (pura) produjeron aproximadamente los
mismos niveles de anticuerpos anti-HA que la vacuna
comercial. El alumbre incrementó la inmunogenicidad de la rHA, y se
generaron títulos de anti-HA que eran 10 o más
veces los producidos sin adyuvante.
En resumen, la comparación de la inmunogenicidad
de las rHA0s purificadas con una vacuna de viriones completos de la
gripe (FLUZONE®, Connaught Laboratories, Inc., Swiftwater, PA),
demuestra que la rHA0 produce una respuesta inmune similar en
ratones a lo largo de un periodo de 42 días. La adsorción de la rHA0
al alumbre incrementa significativamente la inmunogenicidad de la
rHA0 purificada en ratones, según se midió mediante el ensayo
descrito en el Ejemplo 7. La combinación con alumbre produce un
número de anticuerpos IgG hacia hemaglutinina que es más elevado
que el producido por las vacunas de la gripe Fluzone®.
Los anticuerpos de inhibición de la
hemoaglutinación (IHA) se unen a tres de cuatro epítopos conocidos
de la hemaglutinina y bloquean la capacidad del virus de la gripe
para aglutinar los glóbulos rojos sanguíneos (Wilson y col.,
"Structure of the hemagglutinin membrane glycoprotein of influenza
virus at 3\ring{A} resolution". Nature,
289:366-378 (1981)). Estos determinantes antigénicos
están agrupados alrededor del sitio de unión al receptor ácido
siálico en los trímeros de hemaglutinina. Anticuerpos hacia estos
sitios neutralizarán la infectividad del virus (Weis y col.,
"Structure of the influenza virus hemagglutinin complexed with its
receptor, sialic acid" Nature,
333:426-431 (1988)). El título y la especificidad de
los anticuerpos IHA son una medida importante del potencial de una
vacuna de la gripe para proteger frente a la infección por cepas
similares y relacionadas del virus de la gripe.
Se llevaron a cabo estudios en ratones que
comparaban la capacidad de la rHA0 purificada de A/Beijing/353/89 y
de FLUZONE® (Connaught Laboratories, Inc., Swiftwater, PA) para
inducir la producción de anticuerpos IHA. Grupos de 5 ratones
fueron inyectados los días 0 y 28 con 0,5 \mug, 0,1 \mug, 0,02
\mug o 0,004 \mug de rHA0 o con tres veces estas cantidades de
hemaglutinina de FLUZONE®, de tal manera que se administraron
niveles iguales de hemaglutinina de A/Beijing/353/89 vírica o
recombinante. Por ejemplo, los ratones del grupo de la dosis más
elevada fueron inmunizados con 1,5 \mug de hemaglutinina de
FLUZONE® (0,5 \mug de hemaglutinina de cada cepa) y 0,5 \mug de
rHA0. La presencia de antígeno hemaglutinina adicional en la vacuna
FLUZONE® procedente de las otras dos cepas de la gripe puede tener
como resultado ciertos anticuerpos con reactividad cruzada.
Los anticuerpos
anti-hemaglutinina (IgG hacia hemaglutinina) fueron
medidos en un ELISA estándar con diluciones frente a rHA0
purificada. Los anticuerpos IHA fueron medidos frente a 4 unidades
de hemaglutinina de los antígenos siguientes: virus de la gripe
A/Beijing/353/89 completo (A/Bei), antígeno rHA0 purificado de
A/Beijing/353/89 y FLUZONE®. El título de IHA es el recíproco de la
dilución más elevada de antisuero que inhibe la aglutinación de
glóbulos rojos sanguíneos de pollo en un 50%.
La Tabla 3 resume los títulos séricos de IgG
frente a hemaglutinina y de IHA en los ratones el día 42. Se
produjeron niveles elevados de anticuerpos
anti-hemaglutinina con la vacuna de rHA0
recombinante. Estos títulos eran diez veces mayores aproximadamente
que los obtenidos con FLUZONE®. Es muy significativo que la vacuna
de rHA0 produjera buenos títulos de anticuerpos que bloqueaban la
aglutinación de los glóbulos rojos sanguíneos por el virus
A/Beijing/353/89 y por los antígenos rHA0. Por tanto, la vacuna de
rHA0 producía anticuerpos IHA que reconocían igualmente bien el
inmunógeno y el virus de la gripe A/Beijing. Los títulos de IHA más
bajos frente a FLUZONE® pueden ser debidos a la incapacidad de los
antisueros para bloquear la aglutinación por las otras dos cepas de
hemaglutinina de la vacuna FLUZONE®. En contraste, los ratones
inmunizados con FLUZONE® producían un título elevado de anticuerpos
IHA cuando se midieron solamente frente a ella misma. Los títulos
de IHA frente al virus de la gripe A/Beijing/353/89 y frente al
antígeno rHA0 estaban considerablemente reducidos. Se observaron
patrones similares en los ratones de los grupos de dosis
menores.
Estos datos sugieren también que existen
diferencias genéticas entre la cepa del virus de la gripe
A/Beijing/353/89 de la FLUZONE® y esta misma cepa del virus de la
gripe obtenida de la FDA y pasada una vez en huevos antes de ser
utilizada en el ensayo de IHA. El hecho de que los anticuerpos
producidos en respuesta a la HA0 recombinante clonada a partir del
virus de la gripe A/Beijing/353/89 bloqueen la aglutinación de los
glóbulos rojos sanguíneos producida por esta cepa de la gripe así
como por ella misma, es una buena prueba de que no hubo ningún
cambio genético durante el proceso de clonaje que afectara al sitio
de unión al receptor de cido siálico en el antígeno rHA0
purificado.
Se llevaron a cabo una serie de ensayos clínicos
en humanos con el fin de caracterizar la seguridad y la
inmunogenicidad en humanos de una vacuna de la gripe experimental
que contenía HA recombinante, y para obtener datos preliminares
concernientes a la eficacia protectora de tal vacuna frente a la
infección natural durante una temporada epidémica. Los resultados
demuestran que las vacunas que contenían la hemaglutinina de la
gripe recombinante (rHA0), producidas de acuerdo con los métodos
descritos en la presente, causaban sorprendentemente menos
reacciones adversas locales y proporcionaban una respuesta inmune
protectora equivalente o superior cuando se comparaban con una
vacuna de la gripe atenuada autorizada, comercialmente disponible,
producida en huevos.
Vacunas. Las vacunas de HA recombinante
utilizadas en este estudio contenían la glicoproteína HA de longitud
completa no cortada (HA0) del virus de la gripe A/Beijing/32/92
(H3N2). La HA0 recombinante (rHA0) fue producida en cultivos de
células de lepidóptero (insecto) después de la exposición a un
vector baculovírico que contenía insertos de ADNc que codificaban
el gen de la HA. La proteína expresada fue purificada bajo
condiciones no desnaturalizantes hasta >95%, según se midió por
densitometría de barrido cuantitativa del antígeno en masa sometido
a electroforesis en geles de dodecil sulfato de
sodio-poliacrilamida. La identidad del péptido fue
confirmada por análisis de aminoácidos, secuenciación
N-terminal y análisis de Transferencia Western con
sueros anti-gripe A/Beijing/32/92. Las vacunas de
rHA0 contenían una cantidad especificada del antígeno HA sintético
disuelta en solución salina tamponada con fosfato o adsorbida al
adyuvante fosfato de aluminio (alumbre) en forma de una suspensión
gelificada. La vacuna de subviriones trivalente autorizada utilizada
en este estudio contenía 15 \mug/dosis de cada una de las HAs
procedentes de los virus de la gripe A/Texas/36/91 (H1N1),
A/Beijing/32/92 (H3N2) y B/Panamá/45/90 (vacuna de la gripe atenuada
FLUZONE® producida en huevos, Connaught Laboratories, Swiftwater,
PA).
Estudios Clínicos. Protocolos de estudio
idénticos fueron aprobados por los Institutional Review Boards of
Saint Louis University y de la University of Rochester. Se
inscribieron en ambas instituciones adultos sanos de 18 a 45 años
de edad. Los sujetos fueron asignados aleatoriamente para recibir
una de las cinco preparaciones de vacuna siguientes de forma doble
ciego: (1) 15 \mug de rHA0, (2) \mug de rHA0 más alumbre, (3) 90
\mug de rHA0, (4) vacuna de la gripe inactivada trivalente
autorizada o (5) solución salina placebo. Las vacunas fueron
administradas mediante inyección intramuscular en un volumen de 0,5
ml. Con el fin de permitir una determinación inicial de la
seguridad de las tres preparaciones de vacuna que contenían rHA0,
los primeros 25 sujetos que iban a ser vacunados fueron
aleatorizados (esto es, 5 personas por cada sección del estudio)
independientemente de los demás sujetos y monitorizados
estrechamente por contacto telefónico durante las 48 horas
siguientes a la vacunación antes de proceder con las vacunaciones
restantes. Todos los sujetos fueron instruidos para que rellenaran
una ficha diaria informando de reacciones adversas, incluyendo
síntomas locales y sistémicos, durante los primeros 6 días después
de la vacunación. Los síntomas fueron clasificados por el propio
individuo como de naturaleza leve, moderada o grave. Se tomaron las
temperaturas orales y se registraron por los participantes si se
encontraban febriles. Si estaban presentes una inflamación o un
eritema localizado en el lugar de la inyección, éstos fueron
clasificados siguiendo el criterio de si el área era menor que, o
mayor que, el tamaño de diámetro de una moneda de cuarto de dólar,
respectivamente. Todas las vacunaciones se realizaron durante la
última semana de Noviembre y la primera semana de Diciembre de 1993.
Se obtuvieron especímenes de suero de cada sujeto en el momento de
la vacunación, 3 semanas después de la vacunación y una vez más a
finales de Marzo o en Abril de 1994, al menos de 2 a 3 semanas
después de que los virus de la gripe dejaran de circular en las
comunidades locales. Los voluntarios de cada institución fueron
instruidos para que contactaran con el centro de estudio si
experimentaban una enfermedad similar a la gripe durante la
temporada epidémica de gripe del invierno. Se definió una
enfermedad similar a la gripe como la presencia de cualquier
síntoma(s) respiratorio(s) de dos o más días de
duración acompañado(s) por fiebre y/o síntomas sistémicos de
mialgias o escalofríos. De los sujetos que informaron de síntomas
similares a la gripe se obtuvieron muestras nasales y faríngeas con
un bastoncillo de algodón para el cultivo y la identificación del
virus. A los especímenes clínicos se les dio un número de
identificación codificado y se procesaron de manera ciega.
Serología. Para cada tipo de ensayo
serológico, todos los especímenes procedentes de las dos
instituciones fueron analizados en un lote por un único
laboratorio. Se midieron anticuerpos inhibidores de la
hemoaglutinación (IHA) hacia el antígeno del virus de la gripe
A/Beijing/32/93 (H3N2) en los sueros mediante un ensayo de
microvaloración estándar, después de la eliminación del inhibidor
no específico con enzimas destructores del receptor y de las
aglutininas frías por hemoadsorción a 4ºC. El título fue definido
como la mayor dilución del suero que impedía completamente la
hemoaglutinación por 4 unidades de antígeno del virus, utilizando
1:4 como la dilución de partida. Los anticuerpos séricos
inmunoglobulina G (IgG) específicos de HA fueron medidos por un
ensayo sobre inmunoabsorbente con enzima unido (ELISA), utilizando
como antígeno de revestimiento rHA0 purificada del virus de la
gripe A/Beijing/32/92 (H3N2). La secuencia de los reactivos de la
fase sólida hacia fuera consistía en (1) antígeno rHA0 purificado,
(2) espécimen de suero, (3) anti-IgG humana de cabra
conjugado a fosfatasa alcalina y (4) el sustrato
p-nitrofenil fosfato disódico. El título del ELISA
fue expresado como la dilución más elevada a la que la densidad
óptica del pocillo que contenía antígeno era al menos el doble que
la del pocillo control correspondiente sin antígeno. Los anticuerpos
neutralizantes fueron medidos utilizando el ensayo de
microneutralización previamente descrito por Treanor, J.J. y Betts,
R.F., J. Infect. Dis., 168:455-459 (1993).
Brevemente, diluciones seriadas de los sueros inactivados por calor
fueron mezcladas con 100 DICT_{50} aproximadamente del virus de
la gripe A/Beijing/32/92 (H3N2) e incubadas a 37ºC durante 1 hora.
La mezcla virus-suero fue posteriormente adsorbida
a monocapas confluentes de células de riñón canino
Madin-Darby (MDCK) en placas de 96 pocillos durante
1 hora a temperatura ambiente. Las placas fueron lavadas para
eliminar el inóculo residual, se volvió a añadir a las mismas MEM
de Dulbecco sin suero con 2 \mug/ml de tripsina, y se incubaron
en un 5% de CO_{2} a 33ºC durante 72 horas. Las células fueron
posteriormente fijadas con metanol y se determinó la replicación
vírica utilizando un panel de anticuerpos monoclonales murinos
específicos para la matriz y las nucleoproteínas del virus de la
gripe A (Center for Disease Control, Atlanta, GA), seguido por
anti-IgG de ratón conjugado a fosfatasa alcalina. El
título de punto final de los sueros fue definido como la mayor
dilución que tenía como resultado más de un 50% de reducción de la
señal en comparación con los pocillos control no neutralizados.
Virología. Se llevaron a cabo cultivos
víricos de los especímenes procedentes de las muestras nasofaríngeas
recogidas con bastoncillos de algodón en cada institución mediante
técnicas estándar. Los especímenes fueron inoculados en células
MDCK o en células de riñón de mono Rhesus e incubados a 33ºC durante
14 días. Se analizó la hemoadsorción de las monocapas celulares con
eritrocitos de cobayo al 0,4%. Los virus de la gripe fueron
identificados en los cultivos que tenían hemoadsorción positiva por
IHA utilizando antisueros específicos de H3 (Center for Disease
Control).
Análisis Estadísticos. Los recíprocos de
los títulos de los anticuerpos IHA, IgG del ELISA y neutralizantes
fueron transformados logarítmicamente para los análisis
estadísticos. Se definió una respuesta significativa a la
vacunación como un aumento de cuatro veces o mayor del título de
anticuerpos entre los especímenes de suero prevacunación y los
especímenes de suero de 3 semanas después de la vacunación. La
evidencia en el laboratorio de infección por virus de la gripe A
(H3N2) fue definida como el aislamiento del virus de las secreciones
nasofaríngeas y/o un incremento de cuatro veces o mayor del título
de anticuerpos IHA séricos entre los especímenes recogidos en
Diciembre 3 semanas después de la vacunación (pretemporada) y los
especímenes correspondientes post-temporada
recogidos la primavera siguiente. Las diferencias entre los grupos
de vacunación fueron analizadas utilizando el Test Exacto de Fisher
para comparar las proporciones de sujetos con reacciones adversas,
respuestas de anticuerpos significativas o enfermedad o infección
de la gripe confirmadas por el laboratorio, y un Análisis de
Varianza (ANOVA) para comparar las medias de los log_{2} del
recíproco de los títulos de anticuerpo después de la vacunación. Se
aplicaron el test de Desigualdad de Bonferroni modificado y el test
de Tukey-Kramer cuando fue apropiado para explicar
las múltiples comparaciones posibles.
Reactogenicidad. Las vacunas de rHA0
utilizadas en este estudio eran seguras y bien toleradas. La
frecuencia de reacciones adversas no parecía estar influenciada por
el cambio de dosis del antígeno rHA0 de 15 \mug a 90 \mug, pero
podía haber sido ligeramente incrementada por la adición de alumbre.
Eritema localizado, dolor y sensibilidad a la presión en el lugar
de inyección fueron informados de forma significativamente más
frecuente por los receptores de la vacuna de subviriones autorizada
que por los receptores de 15 \mug o 90 \mug de rHA0 en solución
salina. Con la excepción de un individuo que experimentó un dolor
moderadamente grave, sensibilidad a la presión y rigidez en el
brazo después de la inmunización con la vacuna autorizada, todos
los síntomas fueron clasificados como de naturaleza leve y duraron
generalmente 1-2 días. El eritema localizado y/o la
induración, cuando estaban presentes, tenían un tamaño
invariablemente menor que el área de una moneda de cuarto de
dólar.
Inmunogenicidad. Los títulos basales de
anticuerpos IHA séricos hacia el virus de la gripe A/Beijing/32/92
(H3N2) eran inferiores o iguales a 1:8 en 64 (50%) de los 127
sujetos participantes en el estudio. La mayoría de los sujetos de
cada uno de los cuatro grupos de vacunas tenía respuestas
serológicas específicas de HA medidas por IHA y ELISA (Tabla 4).
Los títulos de anticuerpos IHA séricos después de la vacunación eran
mayores o iguales a 1:32 en todos los receptores de las vacunas,
con la excepción de dos personas a las que se administraron 15
\mug de rHA0 y de una persona que recibió la vacuna autorizada. La
vacunación estaba asociada de igual modo con la producción de
anticuerpos neutralizantes en la mayoría de los voluntarios. Los
aumentos medios de los títulos de anticuerpo y las tasas de
seroconversión tendían a ser ligeramente menores después de la
inmunización con 15 \mug de rHA0 que con la vacuna autorizada,
aunque estas diferencias no eran estadísticamente significativas.
La respuesta de anticuerpos hacia rHA0 no fue incrementada por la
adición de alumbre. Los sujetos inmunizados con 90 \mug de rHA0
consiguieron títulos medios de anticuerpos IHA e IgG del ELISA
después de la vacunación que eran de dos a cinco veces mayores que
los obtenidos en cualquiera de los otros tres grupos de vacunas
(las diferencias eran estadísticamente significativas cuando se
comparaban los títulos de IHA en suero).
Eficacia Protectora. Durante el periodo
de vigilancia, hubo un total de 28 enfermedades similares a la gripe
informadas por 26 sujetos. De cuatro de estos individuos (tres de
los cuales habían recibido placebo y uno de los cuales había sido
inmunizado con 15 \mug de rHA0) se aislaron virus de la gripe A
(H3N2) de los cultivos nasofaríngeos. Incrementos significativos
del título de anticuerpos IHA hacia el virus de la gripe
A/Beijing/32/92 (H3N2) entre especímenes de suero pretemporada y
post-temporada estuvieron también presentes en tres
de los cuatro casos confirmados por el cultivo, pero no en ninguno
de los demás individuos que informaron de la enfermedad. El único
receptor de rHA0 que desarrolló posteriormente la enfermedad de la
gripe confirmada en el laboratorio tuvo un cultivo positivo
obtenido 31 días después de la inmunización, y se había
seroconvertido desde un título de IHA prevacunación de menos de 1:4
a un título post-vacunación (pretemporada) de 1:32.
Dos receptores más de placebo y un voluntario inmunizado con la
vacuna autorizada, tuvieron evidencia serológica de infección por
el virus de la gripe A (H3N2) durante la temporada epidémica en
ausencia de enfermedad clínica. Comparados con todos los sujetos
vacunados (o con todos los sujetos que recibieron cualquier vacuna
de rHA0) como un grupo, una proporción significativamente mayor de
receptores del placebo tuvieron enfermedad (p<0,05) o infección
(p<0,005) de gripe A (H3N2) confirmadas por el laboratorio.
Los hallazgos anteriores indican que las vacunas
de la gripe que contenían antígeno rHA0 purificado, preparadas
según se describió en la Solicitud de Patente anteriormente
identificada, son bien toleradas y capaces de producir respuestas
inmunes protectoras en sujetos humanos. Incluso a una dosis de 90
\mug, la rHA0 evaluada en este estudio no era más reactogénica
que el placebo de solución salina, y produjo significativamente
menos reacciones adversas locales que la vacuna de subviriones
trivalente autorizada que contenía como mucho la mitad del antígeno
HA total (esto es, 45 \mug).
Las respuestas de anticuerpos neutralizantes
específicos de HA hacia la preparación de 15 \mug de rHA0, eran
comparables con las producidas por la vacuna de subviriones, y
fueron significativamente mejoradas al aumentar la dosis de rHA0 a
90 \mug.
Las tasas globales de infección y enfermedad
resultantes de la exposición natural a la cepa epidémica circulante
de virus de la gripe A (H3N2), eran significativamente más bajas
entre los sujetos vacunados que entre los receptores de placebo.
Los datos sugieren que la inmunidad protectora conferida por la
rHA0, particularmente cuando es administrada a dosis altas, es
comparable o superior a la inducida por las vacunas actualmente
disponibles.
Se diseñó un vector de clonaje mejorado para la
expresión de la HA madura en el que el gen que codifica la HA
estaba situado inmediatamente corriente abajo de la secuencia que
codifica el péptido señal de la quitinasa.
\vskip1.000000\baselineskip
En el plásmido pMGS12, se clonó la HA en los
sitios de SmaI o KpnI inmediatamente corriente abajo
del péptido señal de la quitinasa. Las secuencias de ácido nucleico
y de aminoácidos están mostradas respectivamente como SEC ID Nº 22
y SEC ID Nº 23:
\vskip1.000000\baselineskip
Esta región fue cambiada mediante mutagénesis
dirigida por oligos para crear pMGS27 (las bases cambiadas están
subrayadas) (SEC ID Nº 24):
\vskip1.000000\baselineskip
El plásmido pMGS27 fue linealizado mediante
corte con PstI (se muestran los residuos 6-35
de la SEC ID Nº 24):
\vskip1.000000\baselineskip
tratando posteriormente el pMGS27
lineal con ADN polimerasa de T4 más dATP para crear colas de hebra
sencilla según se muestra a continuación (residuos
23-36 y complemento de los residuos
6-18 de la SEC ID Nº
24):
\vskip1.000000\baselineskip
Etapa
1
Se sintetizaron los cebadores de PCR.
\vskip1.000000\baselineskip
Oligo directo (SEC ID Nº 25):
- 5' GTC GCC GTG TCC AAC GCG (20 bases del extremo 5' de la HA madura)
\vskip1.000000\baselineskip
Oligo inverso (complemento de la SEC ID Nº
26):
- (20 bases del extremo 3' de la HA madura) ATT AA CCGGTCTCTCCGG 5'
\newpage
Se utilizó PCR del gen de la HA diana con los
dos oligos para obtener (SEC ID Nº 25 y SEC ID Nº 26):
Se mezclaron el pMGS27 lineal y el fragmento del
gen de la HA procedente de la PCR tratado con ADN polimerasa de T4.
Las dos moléculas hibridan entre sí para formar un plásmido circular
que está listo para ser utilizado en la transformación de E.
coli. El diagrama incluye las SEC ID N^{os} 25 y 26, los
residuos 23-36 y 6-18 de la SEC ID
Nº 24.
Según se mostró anteriormente, no hay
aminoácidos extra entre el péptido señal y la HA madura.
La vacuna del virus de la gripe, de
hemaglutinina recombinante purificada, trivalente, de los tipos A y
B (A/Texas/
36/92\1 (H1N1), A/Johanesburg/33/94 (H3N2) y B/Harbin/7/94) es una subunidad no infecciosa derivada de antígenos hemaglutinina (HA) de la gripe recombinantes, purificados. Los genes de la HA fueron clonados a partir de las cepas de virus de la gripe A y B recomendadas por el Center for Disease Control/Food and Drug Administration según se describió anteriormente, y la identidad de cada gen clonado se determinó mediante análisis de la secuencia de ADN. Se utilizaron vectores de expresión baculovíricos que contenían los genes de la HA clonados de las cepas de virus de la gripe A/Texas/36/91 (H1N1), A/Johanesburg/33/94 (H3N2), B/Harbin/7/94, para producir los antígenos HA recombinantes en células de insecto cultivadas. Las proteínas HA recombinantes son hemaglutininas de longitud completa, no cortadas (rHA0) con un peso molecular de 69.000 aproximadamente. Las rHA0 fueron producidas en una línea celular de Spodoptera frugiperda (Lepidóptero) mantenida en un medio de cultivo sin suero. Las vacunas trivalentes están compuestas por rHA0 purificada (más de un 95% de pureza, más probablemente mayor de un 99% de pureza) procedente de las dos cepas de la gripe A y de una cepa B mezcladas en iguales proporciones. La vacuna es suministrada para uso clínico como proteínas rHA0 de los tipos A y B purificadas en solución salina tamponada con fosfato sin conservante añadido.
36/92\1 (H1N1), A/Johanesburg/33/94 (H3N2) y B/Harbin/7/94) es una subunidad no infecciosa derivada de antígenos hemaglutinina (HA) de la gripe recombinantes, purificados. Los genes de la HA fueron clonados a partir de las cepas de virus de la gripe A y B recomendadas por el Center for Disease Control/Food and Drug Administration según se describió anteriormente, y la identidad de cada gen clonado se determinó mediante análisis de la secuencia de ADN. Se utilizaron vectores de expresión baculovíricos que contenían los genes de la HA clonados de las cepas de virus de la gripe A/Texas/36/91 (H1N1), A/Johanesburg/33/94 (H3N2), B/Harbin/7/94, para producir los antígenos HA recombinantes en células de insecto cultivadas. Las proteínas HA recombinantes son hemaglutininas de longitud completa, no cortadas (rHA0) con un peso molecular de 69.000 aproximadamente. Las rHA0 fueron producidas en una línea celular de Spodoptera frugiperda (Lepidóptero) mantenida en un medio de cultivo sin suero. Las vacunas trivalentes están compuestas por rHA0 purificada (más de un 95% de pureza, más probablemente mayor de un 99% de pureza) procedente de las dos cepas de la gripe A y de una cepa B mezcladas en iguales proporciones. La vacuna es suministrada para uso clínico como proteínas rHA0 de los tipos A y B purificadas en solución salina tamponada con fosfato sin conservante añadido.
Estudios en animales con vacunas de rHAO
monovalentes, bivalentes y trivalentes han demostrado que las mismas
carecen de toxicidad significativa. No hay agentes tóxicos o
fortuitos detectables en la vacuna. Se llevaron a cabo estudios
generales de seguridad e inmunogenicidad de la rHA0 de
A/Beijing/32/92 y A/Texas/36/91 en ratones y cobayos. No se
observaron reacciones adversas. En ratones, una única inmunización
con 15 microgramos de antígenos rHA0 sin adyuvante induce en dos a
tres semanas niveles elevados de anticuerpos IgG
anti-HA, anticuerpos inhibidores de hemaglutinina
(IHA) y anticuerpos neutralizantes.
En un estudio, grupos de diez ratones fueron
inmunizados con 15 microgramos de rHA0 purificada de
A/Beijing/
32/92 (H3N2) producida en células adaptadas a medios que contenían un 10% de suero bovino fetal o con rHA0 producida en células de insecto adaptadas a medios que contenían un 10% de suero bovino fetal, o con rHA0 producida en células de insecto adaptadas a un medio sin suero (rHA0-SF). Dos y tres semanas después de la inyección se extrajo sangre de los ratones y se prepararon muestras de suero. Cada suero fue medido para determinar anticuerpos IgG anti-HA y anticuerpos IHA. Los antígenos rHA0 y rHA0-SF producían ambos títulos similares de anticuerpos anti-HA y de anticuerpos IHA. Dos semanas después de la única inmunización, la mayoría de los ratones tenía títulos significativos de anticuerpos IHA y, hacia la semana tres, 8/10 ratones de cada grupo tenían títulos de IHA de 32 o mayores. Estos y otros estudios bioquímicos e inmunológicos demuestran que la rHA0 producida en cultivos de células de insecto sin suero es indistinguible de la rHA0 producida bajo condiciones de fermentación que contenían suero.
32/92 (H3N2) producida en células adaptadas a medios que contenían un 10% de suero bovino fetal o con rHA0 producida en células de insecto adaptadas a medios que contenían un 10% de suero bovino fetal, o con rHA0 producida en células de insecto adaptadas a un medio sin suero (rHA0-SF). Dos y tres semanas después de la inyección se extrajo sangre de los ratones y se prepararon muestras de suero. Cada suero fue medido para determinar anticuerpos IgG anti-HA y anticuerpos IHA. Los antígenos rHA0 y rHA0-SF producían ambos títulos similares de anticuerpos anti-HA y de anticuerpos IHA. Dos semanas después de la única inmunización, la mayoría de los ratones tenía títulos significativos de anticuerpos IHA y, hacia la semana tres, 8/10 ratones de cada grupo tenían títulos de IHA de 32 o mayores. Estos y otros estudios bioquímicos e inmunológicos demuestran que la rHA0 producida en cultivos de células de insecto sin suero es indistinguible de la rHA0 producida bajo condiciones de fermentación que contenían suero.
Se llevó a cabo un estudio para comparar la
formulación de la vacuna de la gripe de rHA0 trivalente de
1994-1995 con una vacuna de antígeno de superficie
del virus purificado autorizada, Fluvirin® (una vacuna de virus de
la gripe atenuados producida mediante cultivo en huevos). Cada
vacuna contenía 15 \mug de rHA0 o de HA vírica por cada 0,5 ml de
las cepas de la gripe A/Texas/36/91 (H1N1), A/Shangdong/9/93 (H3N2)
y B/Panamá/45/90. Ambas, la vacuna de rHA0 recombinante y
Modificaciones y variaciones de los métodos y
composiciones descritos en la presente para ser utilizados en la
preparación y utilización de una vacuna de la gripe recombinante,
serán obvias para las personas expertas en la técnica. Tales
modificaciones y variaciones están destinadas a ser parte del ámbito
de las reivindicaciones adjuntas.
(1) INFORMACIÓN GENERAL
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- SOLICITANTE: MicroGeneSys, Inc.
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TÍTULO DE LA INVENCIÓN: UN MÉTODO PARA PRODUCIR VACUNAS MULTIVALENTES DE HEMAGLUTININA DE LA GRIPE
\vskip0.800000\baselineskip
- (iii)
- NÚMERO DE SECUENCIAS: 32
\vskip0.800000\baselineskip
- (iv)
- DIRECCIÓN PARA CORRESPONDENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- DESTINATARIO: Patrea L. Pabst
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- CALLE: 2800 One Atlantic Center1201 West Peachtree Street
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- CIUDAD: Atlanta
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- ESTADO: GA
\vskip0.500000\baselineskip
- (E)
- PAÍS: EE.UU.
\vskip0.500000\baselineskip
- (F)
- ZIP: 30309-3450
\vskip0.800000\baselineskip
- (v)
- FORMA LEGIBLE POR ORDENADOR:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- TIPO DE MEDIO: Disco magnético flexible
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- ORDENADOR: IBM PC compatible
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- SISTEMA OPERATIVO: PC-DOS/MS-DOS
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- PROGRAMA: PatentIn Release #1.0, Versión #1.25
\vskip0.800000\baselineskip
- (vi)
- DATOS DE LA SOLICITUD ACTUAL:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- NÚMERO DE SOLICITUD: PCT/US95/06750
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- FECHA DE REGISTRO: 26-MAYO-1995
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- CLASIFICACIÓN:
\vskip0.800000\baselineskip
- (ix)
- INFORMACIÓN SOBRE TELECOMUNICACIÓN:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- TELÉFONO: (404)-873-8794
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TELEFAX: (404)-873-8795
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº:1:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 12 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE HEBRA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico)
\vskip0.800000\baselineskip
- (iii)
- HIPOTÉTICA: NO
\vskip0.800000\baselineskip
- (iv)
- ANTISENTIDO: NO
\vskip0.800000\baselineskip
- (vi)
- FUENTE ORIGINAL:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- ORGANISMO: Virus de la gripe
\vskip0.800000\baselineskip
- (x)
- INFORMACIÓN SOBRE LA PUBLICACIÓN:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- AUTORES: Davis y col.
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TÍTULO: Construction and Characterization of a Bacterial Clone Containing the Hemagglutinin Gene of the WSN Strain (H0N1) of Influenza Virus
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- REVISTA: Gene
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- VOLUMEN: 10
\vskip0.500000\baselineskip
- (F)
- PÁGINAS: 205-218
\vskip0.500000\baselineskip
- (G)
- FECHA: 1980
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº:1:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipAGCAAAAGCA GG
\hfill12
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº:2:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 39 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE HEBRA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico)
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº:2:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipGGGGGTACCC CCGGGAGCAA AAGCAGGGGA AAATAAAAA
\hfill39
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº:3:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 35 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE HEBRA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico)
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº:3:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipCCCGGTACCT CAKATKCATA TTCTGCACTG CAAAG
\hfill35
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº:4:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 39 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE HEBRA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico)
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº:4:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipGGGGGTACCC CCGGGGACAC AATATGTATA GGCTACCAT
\hfill39
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº:5:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 35 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE HEBRA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico)
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº:5:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipCCCGGTACCT CAKATKCATA TTCTGCACTG CAAAG
\hfill35
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº:6:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 1793 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE HEBRA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico)
\vskip0.800000\baselineskip
- (iii)
- HIPOTÉTICA: NO
\vskip0.800000\baselineskip
- (iv)
- ANTISENTIDO: NO
\vskip0.800000\baselineskip
- (vi)
- FUENTE ORIGINAL:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- ORGANISMO: Virus de la gripe
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- AISLADO INDIVIDUAL: rHA de A/Beijing/32/92
\vskip0.800000\baselineskip
- (ix)
- CARACTERÍSTICA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- NOMBRE/CLAVE: líder del ARNm de la polihedrina (parcial)
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- LOCALIZACIÓN: 1 a 18
\vskip0.800000\baselineskip
- (ix)
- CARACTERÍSTICA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- NOMBRE/CLAVE: región codificadora de la secuencia señal de la proteína 61K de AcNPV
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- LOCALIZACIÓN: 19 a 72
\vskip0.800000\baselineskip
- (ix)
- CARACTERÍSTICA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- NOMBRE/CLAVE: sitio de restricción de SmaI
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- LOCALIZACIÓN: 76 a 81
\vskip0.800000\baselineskip
- (ix)
- CARACTERÍSTICA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- NOMBRE/CLAVE: región codificadora de la rHA madura
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- LOCALIZACIÓN: 73 a 1728
\vskip0.800000\baselineskip
- (ix)
- CARACTERÍSTICA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- NOMBRE/CLAVE: sitio de restricción de KpnI
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- LOCALIZACIÓN: 1771 a 1777
\vskip0.800000\baselineskip
- (ix)
- CARACTERÍSTICA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- NOMBRE/CLAVE: sitio de restricción de BglII
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- LOCALIZACIÓN: 1776 a 1782
\vskip0.800000\baselineskip
- (ix)
- CARACTERÍSTICA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- NOMBRE/CLAVE: señal de terminación de la traducción universal
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- LOCALIZACIÓN: 1783 a 1793
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº:6:
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº:7:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 570 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE HEBRA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: péptido
\vskip0.800000\baselineskip
- (iii)
- HIPOTÉTICA: NO
\vskip0.800000\baselineskip
- (iv)
- ANTISENTIDO: NO
\vskip0.800000\baselineskip
- (v)
- TIPO DE FRAGMENTO: N-terminal
\vskip0.800000\baselineskip
- (vi)
- FUENTE ORIGINAL:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- ORGANISMO: Virus de la gripe
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- AISLADO INDIVIDUAL: rHA de A/Beijing/32/92
\vskip0.800000\baselineskip
- (ix)
- CARACTERÍSTICA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- NOMBRE/CLAVE: secuencia señal de la proteína 61K de AcNPV
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- LOCALIZACIÓN: 1 a 18
\vskip0.800000\baselineskip
- (ix)
- CARACTERÍSTICA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- NOMBRE/CLAVE: rHA madura
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- LOCALIZACIÓN: 19 a 552
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº:7:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº:8:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 1766 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE HEBRA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico)
\vskip0.800000\baselineskip
- (iii)
- HIPOTÉTICA: NO
\vskip0.800000\baselineskip
- (iv)
- ANTISENTIDO: NO
\vskip0.800000\baselineskip
- (vi)
- FUENTE ORIGINAL:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- ORGANISMO: Virus de la gripe
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- AISLADO INDIVIDUAL: rHa de A/Texas/36/91
\vskip0.800000\baselineskip
- (ix)
- CARACTERÍSTICA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- NOMBRE/CLAVE: líder del ARNm de la polihedrina (parcial)
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- LOCALIZACIÓN: 1 a 18
\vskip0.800000\baselineskip
- (ix)
- CARACTERÍSTICA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- NOMBRE/CLAVE: región codificadora del péptido señal de la proteína 61K de AcNPV
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- LOCALIZACIÓN: 19 a 72
\vskip0.800000\baselineskip
- (ix)
- CARACTERÍSTICA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- NOMBRE/CLAVE: sitio de restricción de SmaI
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- LOCALIZACIÓN: 76 a 81
\vskip0.800000\baselineskip
- (ix)
- CARACTERÍSTICA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- NOMBRE/CLAVE: sitio de restricción de KpnI
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- LOCALIZACIÓN: 82 a 87
\vskip0.800000\baselineskip
- (ix)
- CARACTERÍSTICA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- NOMBRE/CLAVE: sitio de restricción de SmaI
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- LOCALIZACIÓN: 88 a 93
\vskip0.800000\baselineskip
- (ix)
- CARACTERÍSTICA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- NOMBRE/CLAVE: región codificadora de la rHA madura
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- LOCALIZACIÓN: 73 a 1734
\vskip0.800000\baselineskip
- (ix)
- CARACTERÍSTICA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- NOMBRE/CLAVE: sitio de restricción de KpnI
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- LOCALIZACIÓN: 1744 a 1749
\vskip0.800000\baselineskip
- (ix)
- CARACTERÍSTICA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- NOMBRE/CLAVE: sitio de restricción de BglII
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- LOCALIZACIÓN: 1750 a 1755
\vskip0.800000\baselineskip
- (ix)
- CARACTERÍSTICA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- NOMBRE/CLAVE: señal de terminación de la traducción universal
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- LOCALIZACIÓN: 1756 a 1766
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº:8:
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº:9:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 572 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE HEBRA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: péptido
\vskip0.800000\baselineskip
- (iii)
- HIPOTÉTICA: NO
\vskip0.800000\baselineskip
- (iv)
- ANTISENTIDO: NO
\vskip0.800000\baselineskip
- (v)
- TIPO DE FRAGMENTO: N-terminal
\vskip0.800000\baselineskip
- (vi)
- FUENTE ORIGINAL:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- ORGANISMO: Virus de la gripe
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- AISLADO INDIVIDUAL: rHA de A/Texas/36/91
\vskip0.800000\baselineskip
- (ix)
- CARACTERÍSTICA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- NOMBRE/CLAVE: secuencia señal de la proteína 61K de AcNPV
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- LOCALIZACIÓN: 1 a 18
\vskip0.800000\baselineskip
- (ix)
- CARACTERÍSTICA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- NOMBRE/CLAVE: rHA madura
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- LOCALIZACIÓN: 19 a 554
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº:9:
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº:10:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 1799 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE HEBRA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: ARN (genómico)
\vskip0.800000\baselineskip
- (iii)
- HIPOTÉTICA: NO
\vskip0.800000\baselineskip
- (iv)
- ANTISENTIDO: NO
\vskip0.800000\baselineskip
- (vi)
- FUENTE ORIGINAL:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- ORGANISMO: Virus de la gripe
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- AISLADO INDIVIDUAL: rHa de B/Panamá/45/90
\vskip0.800000\baselineskip
- (ix)
- CARACTERÍSTICA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- NOMBRE/CLAVE: líder del ARNm de la polihedrina (parcial)
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- LOCALIZACIÓN: 1 a 18
\vskip0.800000\baselineskip
- (ix)
- CARACTERÍSTICA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- NOMBRE/CLAVE: región codificadora de la secuencia del péptido señal de la HA
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- LOCALIZACIÓN: 19 a 69
\vskip0.800000\baselineskip
- (ix)
- CARACTERÍSTICA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- NOMBRE/CLAVE: sitio de restricción de SmaI
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- LOCALIZACIÓN: 22 a 27
\vskip0.800000\baselineskip
- (ix)
- CARACTERÍSTICA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- NOMBRE/CLAVE: región codificadora de la rHA madura
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- LOCALIZACIÓN: 70 a 1773
\vskip0.800000\baselineskip
- (ix)
- CARACTERÍSTICA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- NOMBRE/CLAVE: sitio de restricción de KpnI
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- LOCALIZACIÓN: 1777 a 1782
\vskip0.800000\baselineskip
- (ix)
- CARACTERÍSTICA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- NOMBRE/CLAVE: sitio de restricción de BglII
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- LOCALIZACIÓN: 1783 a 1788
\vskip0.800000\baselineskip
- (ix)
- CARACTERÍSTICA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- NOMBRE/CLAVE: señal de terminación de la traducción universal
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- LOCALIZACIÓN: 1789 a 1799
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº:10:
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº:11:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 585 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE HEBRA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: péptido
\vskip0.800000\baselineskip
- (iii)
- HIPOTÉTICA: NO
\vskip0.800000\baselineskip
- (iv)
- ANTISENTIDO: NO
\vskip0.800000\baselineskip
- (v)
- TIPO DE FRAGMENTO: N-terminal
\vskip0.800000\baselineskip
- (vi)
- FUENTE ORIGINAL:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- ORGANISMO: Virus de la gripe
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- AISLADO INDIVIDUAL: rHA de B/Panamá/45/90
\vskip0.800000\baselineskip
- (ix)
- CARACTERÍSTICA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- NOMBRE/CLAVE: péptido señal de la HA
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- LOCALIZACIÓN: 1 a 17
\vskip0.800000\baselineskip
- (ix)
- CARACTERÍSTICA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- NOMBRE/CLAVE: rHA madura
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- LOCALIZACIÓN: 18 a 568
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº:11:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº:12:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 1811 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE HEBRA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico)
\vskip0.800000\baselineskip
- (iii)
- HIPOTÉTICA: NO
\vskip0.800000\baselineskip
- (iv)
- ANTISENTIDO: NO
\vskip0.800000\baselineskip
- (vi)
- FUENTE ORIGINAL:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- ORGANISMO: Virus de la gripe
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- AISLADO INDIVIDUAL: rHa de B/Netherlands/13/94
\vskip0.800000\baselineskip
- (ix)
- CARACTERÍSTICA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- NOMBRE/CLAVE: líder del ARNm de la polihedrina (parcial)
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- LOCALIZACIÓN: 1 a 18
\vskip0.800000\baselineskip
- (ix)
- CARACTERÍSTICA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- NOMBRE/CLAVE: región codificadora del péptido señal de la proteína 61K de AcNPV
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- LOCALIZACIÓN: 19 a 72
\vskip0.800000\baselineskip
- (ix)
- CARACTERÍSTICA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- NOMBRE/CLAVE: sitio de restricción de SmaI
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- LOCALIZACIÓN: 76 a 81
\vskip0.800000\baselineskip
- (ix)
- CARACTERÍSTICA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- NOMBRE/CLAVE: región codificadora de la rHA madura
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- LOCALIZACIÓN: 73 a 1785
\vskip0.800000\baselineskip
- (ix)
- CARACTERÍSTICA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- NOMBRE/CLAVE: sitio de restricción de KpnI
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- LOCALIZACIÓN: 1789 a 1794
\vskip0.800000\baselineskip
- (ix)
- CARACTERÍSTICA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- NOMBRE/CLAVE: sitio de restricción de BglII
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- LOCALIZACIÓN: 1795 a 1800
\vskip0.800000\baselineskip
- (ix)
- CARACTERÍSTICA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- NOMBRE/CLAVE: señal de terminación de la traducción universal
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- LOCALIZACIÓN: 1801 a 1811
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº:12:
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº:13:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 589 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE HEBRA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: péptido
\vskip0.800000\baselineskip
- (iii)
- HIPOTÉTICA: NO
\vskip0.800000\baselineskip
- (iv)
- ANTISENTIDO: NO
\vskip0.800000\baselineskip
- (v)
- TIPO DE FRAGMENTO: N-terminal
\vskip0.800000\baselineskip
- (vi)
- FUENTE ORIGINAL:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- ORGANISMO: Virus de la gripe
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- AISLADO INDIVIDUAL: rHA de B/Netherlands/13/94
\vskip0.800000\baselineskip
- (ix)
- CARACTERÍSTICA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- NOMBRE/CLAVE: secuencia señal de la proteína 61K de AcNPV
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- LOCALIZACIÓN: 1 a 18
\vskip0.800000\baselineskip
- (ix)
- CARACTERÍSTICA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- NOMBRE/CLAVE: rHA madura
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- LOCALIZACIÓN: 19 a 571
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº:13:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº:14:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 1757 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE HEBRA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico)
\vskip0.800000\baselineskip
- (iii)
- HIPOTÉTICA: NO
\vskip0.800000\baselineskip
- (iv)
- ANTISENTIDO: NO
\vskip0.800000\baselineskip
- (vi)
- FUENTE ORIGINAL:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- ORGANISMO: Virus de la gripe
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- AISLADO INDIVIDUAL: rHa de A/Shandong/9/93
\vskip0.800000\baselineskip
- (ix)
- CARACTERÍSTICA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- NOMBRE/CLAVE: líder del ARNm de la polihedrina (parcial)
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- LOCALIZACIÓN: 1 a 18
\vskip0.800000\baselineskip
- (ix)
- CARACTERÍSTICA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- NOMBRE/CLAVE: región codificadora de la secuencia señal de la proteína 61K de AcNPV
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- LOCALIZACIÓN: 19 a 72
\vskip0.800000\baselineskip
- (ix)
- CARACTERÍSTICA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- NOMBRE/CLAVE: sitio de restricción de SmaI
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- LOCALIZACIÓN: 76 a 81
\vskip0.800000\baselineskip
- (ix)
- CARACTERÍSTICA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- NOMBRE/CLAVE: región codificadora de la rHA madura
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- LOCALIZACIÓN: 73 a 1728
\vskip0.800000\baselineskip
- (ix)
- CARACTERÍSTICA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- NOMBRE/CLAVE: sitio de restricción de KpnI
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- LOCALIZACIÓN: 1735 a 1740
\vskip0.800000\baselineskip
- (ix)
- CARACTERÍSTICA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- NOMBRE/CLAVE: sitio de restricción de BglII
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- LOCALIZACIÓN: 1741 a 1746
\vskip0.800000\baselineskip
- (ix)
- CARACTERÍSTICA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- NOMBRE/CLAVE: señal de terminación de la traducción universal
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- LOCALIZACIÓN: 1747 a 1757
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº:14:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº:15:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 571 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE HEBRA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: péptido
\vskip0.800000\baselineskip
- (iii)
- HIPOTÉTICA: NO
\vskip0.800000\baselineskip
- (iv)
- ANTISENTIDO: NO
\vskip0.800000\baselineskip
- (v)
- TIPO DE FRAGMENTO: N-terminal
\vskip0.800000\baselineskip
- (vi)
- FUENTE ORIGINAL:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- ORGANISMO: Virus de la gripe
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- AISLADO INDIVIDUAL: rHA de A/Shandong/9/93
\vskip0.800000\baselineskip
- (ix)
- CARACTERÍSTICA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- NOMBRE/CLAVE: secuencia señal de la proteína 61K de AcNPV
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- LOCALIZACIÓN: 1 a 18
\vskip0.800000\baselineskip
- (ix)
- CARACTERÍSTICA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- NOMBRE/CLAVE: rHA madura
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- LOCALIZACIÓN: 19 a 553
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº:15:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº:16:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 1814 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE HEBRA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico)
\vskip0.800000\baselineskip
- (iii)
- HIPOTÉTICA: NO
\vskip0.800000\baselineskip
- (iv)
- ANTISENTIDO: NO
\vskip0.800000\baselineskip
- (vi)
- FUENTE ORIGINAL:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- ORGANISMO: Virus de la gripe
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- AISLADO INDIVIDUAL: rHA de B/Shanhai/4/94
\vskip0.800000\baselineskip
- (ix)
- CARACTERÍSTICA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- NOMBRE/CLAVE: líder del ARNm de la polihedrina (parcial)
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- LOCALIZACIÓN: 1 a 18
\vskip0.800000\baselineskip
- (ix)
- CARACTERÍSTICA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- NOMBRE/CLAVE: región codificadora de la secuencia señal de la proteína 61K de AcNPV
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- LOCALIZACIÓN: 19 a 72
\vskip0.800000\baselineskip
- (ix)
- CARACTERÍSTICA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- NOMBRE/CLAVE: sitio de restricción de SmaI
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- LOCALIZACIÓN: 76 a 81
\vskip0.800000\baselineskip
- (ix)
- CARACTERÍSTICA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- NOMBRE/CLAVE: sitio de restricción de KpnI
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- LOCALIZACIÓN: 82 a 87
\vskip0.800000\baselineskip
- (ix)
- CARACTERÍSTICA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- NOMBRE/CLAVE: región codificadora de la rHA madura
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- LOCALIZACIÓN: 73 a 1794
\vskip0.800000\baselineskip
- (ix)
- CARACTERÍSTICA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- NOMBRE/CLAVE: señal de terminación de la traducción universal
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- LOCALIZACIÓN: 1804 a 1814
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº:16:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº:17:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 592 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE HEBRA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: péptido
\vskip0.800000\baselineskip
- (iii)
- HIPOTÉTICA: NO
\vskip0.800000\baselineskip
- (iv)
- ANTISENTIDO: NO
\vskip0.800000\baselineskip
- (v)
- TIPO DE FRAGMENTO: N-terminal
\vskip0.800000\baselineskip
- (vi)
- FUENTE ORIGINAL:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- ORGANISMO: Virus de la gripe
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- AISLADO INDIVIDUAL: rHA de B/Shanhai/4/94
\vskip0.800000\baselineskip
- (ix)
- CARACTERÍSTICA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- NOMBRE/CLAVE: péptido señal de la proteína 61K de AcNPV
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- LOCALIZACIÓN: 1 a 18
\vskip0.800000\baselineskip
- (ix)
- CARACTERÍSTICA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- NOMBRE/CLAVE: rHA madura
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- LOCALIZACIÓN: 19 a 574
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº:17:
\newpage
\newpage
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº:18:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 1802 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE HEBRA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico)
\vskip0.800000\baselineskip
- (iii)
- HIPOTÉTICA: NO
\vskip0.800000\baselineskip
- (iv)
- ANTISENTIDO: NO
\vskip0.800000\baselineskip
- (vi)
- FUENTE ORIGINAL:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- ORGANISMO: Virus de la gripe
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- AISLADO INDIVIDUAL: rHa de B/Harbin/7/94
\vskip0.800000\baselineskip
- (ix)
- CARACTERÍSTICA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- NOMBRE/CLAVE: líder del ARNm de la polihedrina (parcial)
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- LOCALIZACIÓN: 1 a 18
\vskip0.800000\baselineskip
- (ix)
- CARACTERÍSTICA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- NOMBRE/CLAVE: región codificadora de la secuencia del péptido señal de HA
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- LOCALIZACIÓN: 19 a 69
\vskip0.800000\baselineskip
- (ix)
- CARACTERÍSTICA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- NOMBRE/CLAVE: sitio de restricción de SmaI
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- LOCALIZACIÓN: 22 a 27
\vskip0.800000\baselineskip
- (ix)
- CARACTERÍSTICA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- NOMBRE/CLAVE: región codificadora de la rHA madura
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- LOCALIZACIÓN: 70 a 1776
\vskip0.800000\baselineskip
- (ix)
- CARACTERÍSTICA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- NOMBRE/CLAVE: sitio de restricción de KpnI
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- LOCALIZACIÓN: 1780 a 1785
\vskip0.800000\baselineskip
- (ix)
- CARACTERÍSTICA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- NOMBRE/CLAVE: sitio de restricción de BglII
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- LOCALIZACIÓN: 1786 a 1791
\vskip0.800000\baselineskip
- (ix)
- CARACTERÍSTICA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- NOMBRE/CLAVE: señal de terminación de la traducción universal
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- LOCALIZACIÓN: 1792 a 1802
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº:18:
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº:19:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 586 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE HEBRA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: péptido
\vskip0.800000\baselineskip
- (iii)
- HIPOTÉTICA: NO
\vskip0.800000\baselineskip
- (iv)
- ANTISENTIDO: NO
\vskip0.800000\baselineskip
- (v)
- TIPO DE FRAGMENTO: N-terminal
\vskip0.800000\baselineskip
- (vi)
- FUENTE ORIGINAL:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- ORGANISMO: Virus de la gripe
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- AISLADO INDIVIDUAL: rHA de B/Harbin/7/94
\vskip0.800000\baselineskip
- (ix)
- CARACTERÍSTICA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- NOMBRE/CLAVE: péptido señal de HA
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- LOCALIZACIÓN: 1 a 17
\vskip0.800000\baselineskip
- (ix)
- CARACTERÍSTICA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- NOMBRE/CLAVE: rHA madura
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- LOCALIZACIÓN: 18 a 569
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº:19:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº:20:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 1757 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE HEBRA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico)
\vskip0.800000\baselineskip
- (iii)
- HIPOTÉTICA: NO
\vskip0.800000\baselineskip
- (iv)
- ANTISENTIDO: NO
\vskip0.800000\baselineskip
- (vi)
- FUENTE ORIGINAL:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- ORGANISMO: Virus de la gripe
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- AISLADO INDIVIDUAL: rHa de A/Johannesburg/33/94
\vskip0.800000\baselineskip
- (ix)
- CARACTERÍSTICA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- NOMBRE/CLAVE: líder del ARNm de la polihedrina (parcial)
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- LOCALIZACIÓN: 1 a 18
\vskip0.800000\baselineskip
- (ix)
- CARACTERÍSTICA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- NOMBRE/CLAVE: región codificadora del péptido señal de la proteína 61K de AcNPV
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- LOCALIZACIÓN: 19 a 72
\vskip0.800000\baselineskip
- (ix)
- CARACTERÍSTICA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- NOMBRE/CLAVE: sitio de restricción de SmaI
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- LOCALIZACIÓN: 76 a 81
\vskip0.800000\baselineskip
- (ix)
- CARACTERÍSTICA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- NOMBRE/CLAVE: región codificadora de la rHA madura
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- LOCALIZACIÓN: 73 a 1731
\vskip0.800000\baselineskip
- (ix)
- CARACTERÍSTICA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- NOMBRE/CLAVE: sitio de restricción de KpnI
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- LOCALIZACIÓN: 1735 a 1740
\vskip0.800000\baselineskip
- (ix)
- CARACTERÍSTICA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- NOMBRE/CLAVE: sitio de restricción de BglII
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- LOCALIZACIÓN: 1741 a 1747
\vskip0.800000\baselineskip
- (ix)
- CARACTERÍSTICA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- NOMBRE/CLAVE: señal de terminación de la traducción universal
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- LOCALIZACIÓN: 1747 a 1757
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº:20:
\newpage
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº:21:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 571 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE HEBRA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: péptido
\vskip0.800000\baselineskip
- (iii)
- HIPOTÉTICA: NO
\vskip0.800000\baselineskip
- (iv)
- ANTISENTIDO: NO
\vskip0.800000\baselineskip
- (v)
- TIPO DE FRAGMENTO: N-terminal
\vskip0.800000\baselineskip
- (vi)
- FUENTE ORIGINAL:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- ORGANISMO: Virus de la gripe
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- AISLADO INDIVIDUAL: rHA de A/Johannesburg/33/94
\vskip0.800000\baselineskip
- (ix)
- CARACTERÍSTICA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- NOMBRE/CLAVE: secuencia señal de la proteína 61K de AcNPV
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- LOCALIZACIÓN: 1 a 18
\vskip0.800000\baselineskip
- (ix)
- CARACTERÍSTICA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- NOMBRE/CLAVE: rHA madura
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- LOCALIZACIÓN: 19 a 569
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº:21:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº:22:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 39 bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE HEBRA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº:22:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipTGGTTGGTCG CCGTTTCTAA CGCGATTCCC GGGGGTACC
\hfill39
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº:23:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 13 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE HEBRA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: péptido
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº:23:
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Trp Leu Val Ala Val Ser Asn Ala Ile Pro Gly
Gly Thr}
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº:24:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 43 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE HEBRA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº:24:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipTGGTTAGTCG CCGTGTCCTG CAGGCCAGAG AGGCCTTGGT ACC
\hfill43
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº:25:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 18 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE HEBRA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº:25:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipGTCGCCGTGT CCAACGCG
\hfill18
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº:26:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 18 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE HEBRA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº:26:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipTAATTGGCCA GAGAGGCC
\hfill18
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº:27:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 39 bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE HEBRA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº:27:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipGGGGGATCCG GTACCAGCAA AAGCAGGGGA TAATTCTAT
\hfill39
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº:28:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 38 bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE HEBRA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº:28:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipGGGGGTACCC CCGGGGACTT TCCAGGAAAT GACAACAG
\hfill38
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº:29:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 44 bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE HEBRA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº:29:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipCCCGGTACCG AATCATCCTA GAAACAAGGG TGTTTTTAAT TAAT
\hfill44
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº:30:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 47 bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE HEBRA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº:30:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipGGGGAATTCG GTACCCCCGG GAAGGCAATA ATTGTACTAC TCATGGT
\hfill47
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº:31:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 36 bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE HEBRA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº:31:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipGGTACCCCCG GGGATCGAAT CTGCACTGGG ATAACA
\hfill36
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº:32:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 50 bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE HEBRA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº:32:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipGGGGAATTCG GATCCGGTAC CTCACAGACA GATGGARCAA GAAACATTGT
\hfill50
Claims (13)
1. Un vector para producir una proteína
hemaglutinina de la gripe glicosilada, madura, recombinante,
sustancialmente pura, producida por un sistema de expresión
baculovírico en células de insecto cultivadas, donde dicha proteína
hemaglutinina es purificada hasta un 95% o más y dicha proteína es
inmunogénica, induce una respuesta inmune protectora cuando es
utilizada como vacuna; y dicha proteína hemaglutinina comprende
además una segunda proteína que está fusionada a la hemaglutinina,
conteniendo dicho vector las secuencias 5'\rightarrow3'
siguientes: el promotor de la polihedrina de un baculovirus; un
ácido nucleico que comprende los nucleótidos 19-72
de la SEC ID Nº: 6 u 8 que codifica un péptido señal de
baculovirus, o un ácido nucleico que codifica un péptido señal de
baculovirus que contiene los aminoácidos 1-18 de la
SEC ID Nº: 7 ó 9; secuencias codificadoras de la hemaglutinina
madura procedentes de una cepa de la gripe; la secuencia
codificadora de la segunda proteína; un codón de terminación de la
traducción y una señal de poliadenilación del ARN de la
polihedrina.
2. El vector de la reivindicación 1, en el que
el péptido señal deriva del gen 61K de baculovirus.
3. El vector de la reivindicación 1, en el que
la secuencia que codifica el péptido señal y la hemaglutinina no
codifica ningún aminoácido intermedio.
4. El vector de la reivindicación 1, que
comprende además una secuencia que codifica una segunda proteína
que es expresada como una proteína de fusión con la
hemaglutinina.
5. El vector de la reivindicación 1 transfectado
en células de insecto cultivadas.
6. Un método para producir un vector para la
expresión de una proteína hemaglutinina de la gripe glicosilada,
madura, recombinante, sustancialmente pura, producida por un sistema
de expresión baculovírico en células de insecto cultivadas, donde
dicha proteína hemaglutinina es purificada hasta un 95% o más y
dicha proteína es inmunogénica, induce una respuesta inmune
protectora cuando es utilizada como vacuna; y dicha proteína
hemaglutinina comprende además una segunda proteína que está
fusionada a la hemaglutinina, conteniendo dicho vector las
secuencias 5'\rightarrow3' siguientes: el promotor de la
polihedrina de un baculovirus; un ácido nucleico que comprende los
nucleótidos 19-72 de la SEC ID Nº: 6 u 8 que
codifica un péptido señal de baculovirus, o un ácido nucleico que
codifica un péptido señal de baculovirus que contiene los
aminoácidos 1-18 de la SEC ID Nº: 7 ó 9; las
secuencias codificadoras de hemaglutinina de una cepa de la gripe
seleccionada del grupo que consta de las cepas de la gripe A y de
las cepas de la gripe B; la secuencia que codifica la segunda
proteína; un codón de terminación de la traducción y una señal de
poliadenilación del ARN de la polihedrina, que comprende:
- la recogida del virus del medio celular y el aislamiento del ARN vírico, para las cepas de la gripe A, o de ARNm para las cepas de la gripe B;
- la síntesis de ADNc utilizando un cebador universal (5'-AGCAAAAGCAGG-3' (SEC ID Nº: 1)) para el ARN vírico de las cepas de la gripe A o cebadores aleatorios para el ARNm de las cepas de la gripe B, donde los cebadores 5' y 3' tienen sitios de enzimas de restricción en los enzimas que no se encuentran en los genes de la hemaglutinina;
- la amplificación de los cebadores de la gripe A o B y del ADNc de la gripe mezclado con los segmentos del gen de la hemaglutinina con el fin de producir fragmentos de ADN de doble hebra que contengan secuencias codificadoras de la hemaglutinina madura completa;
- la identificación del péptido señal de los genes de la hemaglutinina y la amplificación posterior de los genes de la hemaglutinina menos el péptido señal; y
- el clonaje de los genes de la hemaglutinina menos el péptido señal en un vector que contenga el promotor de la polihedrina de AcNPV.
7. Un método para producir un vector para la
expresión de una proteína hemaglutinina de la gripe glicosilada,
madura, recombinante, sustancialmente pura, producida por un sistema
de expresión baculovírico en células de insecto cultivadas, donde
dicha proteína hemaglutinina es purificada hasta un 95% o más y
dicha proteína es inmunogénica, induce una respuesta inmune
protectora cuando es utilizada como vacuna, conteniendo dicho
vector las secuencias 5'\rightarrow3' siguientes: el promotor de
la polihedrina de un baculovirus; un ácido nucleico que comprende
los nucleótidos 19-72 de la SEC ID Nº: 6 u 8 que
codifica un péptido señal de baculovirus, o un ácido nucleico que
codifica un péptido señal de baculovirus que contiene los
aminoácidos 1-18 de la SEC ID Nº: 7 ó 9; las
secuencias codificadoras de hemaglutinina de una cepa de la gripe
seleccionada del grupo que consta de las cepas de la gripe A y de
las cepas de la gripe B; la secuencia que codifica la segunda
proteína; un codón de terminación de la traducción y una señal de
poliadenilación del ARN de la polihedrina, que comprende:
- la recogida del virus del medio celular y el aislamiento del ARN vírico, para las cepas de la gripe A, o de ARNm para las cepas de la gripe B;
- la síntesis de ADNc utilizando un cebador universal (5'-AGCAAAAGCAGG-3' (SEC ID Nº: 1)) para el ARN vírico de las cepas de la gripe A o cebadores aleatorios para el ARNm de las cepas de la gripe B, donde los cebadores 5' y 3' tienen sitios de enzimas de restricción en los extremos que no se encuentran en los genes de la hemaglutinina;
- la amplificación de los cebadores de la gripe A o B y del ADNc de la gripe mezclado con los segmentos del gen de la hemaglutinina con el fin de producir fragmentos de ADN de doble hebra que contengan secuencias codificadoras de la hemaglutinina madura completa;
- la identificación del péptido señal de los genes de la hemaglutinina y la amplificación posterior de los genes de la hemaglutinina menos el péptido señal; y
- el clonaje de los genes de la hemaglutinina menos el péptido señal en un vector que contenga el promotor de la polihedrina de AcNPV.
8. El método de la reivindicación 6 ó 7, en el
que los genes de la hemaglutinina son clonados en el vector
utilizando PCR, de tal manera que el vector codifica el péptido
señal acoplado directamente a la hemaglutinina sin ningún
aminoácido intermedio.
9. El método de la reivindicación 6 ó 7, que
comprende además la transfección del vector en células de insecto y
la selección de las células por la expresión de hemaglutinina.
10. Un vector preparado de acuerdo con el método
de cualquiera de las reivindicaciones 6 a 9.
11. Un vector de acuerdo con la reivindicación
10, expresando dicho vector hemaglutinina de la gripe glicosilada,
madura, recombinante, sustancialmente pura.
12. Un vector de acuerdo con la reivindicación 3
o un método de acuerdo con la reivindicación 8, donde el vector
codifica un péptido señal y la hemaglutinina juntos, teniendo la
secuencia de aminoácidos de la SEC ID Nº: 7.
13. Un método de acuerdo con la reivindicación
8, en el que el péptido señal deriva del gen 61K de baculovirus.
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