ES2248799T3 - Vector y procedimiento de produccion de hemaglutinina de virus gripales. - Google Patents

Vector y procedimiento de produccion de hemaglutinina de virus gripales.

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Abstract

SE PRESENTA UN METODO DE PREPARACION DE UNA VACUNA RECOMBINANTE DE LA GRIPE UTILIZANDO TECNOLOGIA ADN. LA VACUNA RESULTANTE ES UNA VACUNA DE LA GRIPE POLIVALENTE, PREFERIBLEMENTE TRIVALENTE BASADA EN UNA MEZCLA DE ANTIGENOS RECOMBINANTES DE HEMAGLUTININAS CLONADOS A PARTIR DE VIRUS DE LA GRIPE CON CAPACIDAD EPIDEMICA. LOS ANTIGENOS RECOMBINANTES DE HEMAGLUTININAS SON GLUCOPROTEINAS DE EXTENSION COMPLETA, SIN DIVIDIR (HAO) PRODUCIDAS A PARTIR DE VECTORES DE EXPRESION DE BACULOVIRUS EN CELULAS DE INSECTOS CULTIVADAS Y PURIFICADAS BAJO CONDICIONES NO DESNATURALIZANTES. EN LA REALIZACION PREFERIDA, LOS GENES HA CLONADOS SE MODIFICAN POSTERIORMENTE MEDIANTE LA DELECION DE LAS SECUENCIAS HIDROFOBICAS NATURALES DE PEPTIDOS SEÑAL Y SU SUSTITUCION CON UN PEPTIDO DE SEÑAL DE QUITINASA DE BACULOVIRUS. SE PRESENTA TAMBIEN UN ENFOQUE GENERAL DE LA EXTRACCION Y PURIFICACION EFICACES DE LA PROTEINA HA RECOMBINANTE PRODUCIDA EN LAS CELULAS DE INSECTO PARA LA PURIFICACION DE PROTEINAS RHA OBTENIDAS A PARTIRDE VIRUS DE LA GRIPE DE LOS SUBTIPOS A Y TIPO B.

Description

Vector y procedimiento de producción de hemaglutinina de virus gripales.
Antecedentes de la invención
La presente invención está de manera general dentro del área de las vacunas de la gripe recombinantes.
La gripe epidémica tiene lugar anualmente y es una causa de morbilidad y mortalidad significativas en todo el mundo. Los niños tienen la tasa de ataque más elevada y son en gran medida responsables de la transmisión de los virus de la gripe a la comunidad. Los ancianos y las personas con problemas de salud subyacentes tienen un riesgo incrementado de complicaciones y de hospitalización derivados de la infección por gripe. Solamente en los Estados Unidos tuvieron lugar más de 10.000 muertes durante cada una de las siete temporadas de gripe entre 1956 y 1988 debido a neumonía y gripe, y se informó de más de 40.000 muertes para cada una de dos temporadas (Update: Influenza Activity - United States and Worldwide, and Composition of the 1992-1993 Influenza Vaccine, Morbidity y Mortality Weekly Report. U.S. Department of Health and Human Services, Public Health Service, 41/Nº 18:315-323, 1992). Los virus de la gripe son partículas muy pleomórficas compuestas por dos glicoproteínas de superficie, hemaglutinina (HA) y neuraminidasa (NA). La HA media la fijación del virus a la célula huésped y la fusión de las membranas vírica-celular durante la penetración del virus en la célula. El genoma del virus de la gripe consta de ocho segmentos de ARN de hebra sencilla de sentido negativo, de los cuales el cuarto segmento más grande codifica el gen de la HA. Los virus de la gripe están divididos en los tipos A, B y C sobre la base de diferencias antigénicas. Los virus A de la gripe están descritos por una nomenclatura que incluye el subtipo o tipo, el origen geográfico, el número de cepa y el año de aislamiento, por ejemplo, A/Beijing/353/89. Existen al menos 13 subtipos de HA (H1-H13) y nueve subtipos de NA (N1-N9). Todos los subtipos se encuentran en aves, pero solamente H1-H3 y N1-N2 se encuentran en humanos, cerdos y caballos (Murphy y Webster, "Orthomyxoviruses", en Virology, ed. Fields, B.N., Knipe, D.M., Chanok, R.M., 1091-1152 (Raven Press, New York (1990)).
Los anticuerpos hacia HA neutralizan el virus y constituyen la base de la inmunidad natural hacia la infección por gripe (Clements, "Influenza Vaccines", en Vaccines: New Approaches to Immunological Problems, ed. Ronald W. Ellis, pp. 129-150 (Butterworth-Heinemann, Stoneham, MA, 1992)). La variación antigénica de la molécula de HA es responsable de los frecuentes brotes de gripe y del control limitado de la infección por inmunización.
La estructura tridimensional de HA y la interacción con su receptor celular, el ácido siálico, han sido extensamente estudiadas (Wilson y col., "Structure of the hemagglutinin membrane glycoprotein of influenza virus at 3\ring{A} resolution" Nature, 289:366-378 (1981); Weis y col., "Structure of the influenza virus hemagglutinin complexed with its receptor, sialic acid" Nature, 333:426-431 (1988); Murphy and Webster, 1990). La molécula de HA está presente en el virión como un trímero. Cada monómero existe como dos cadenas, HA1 y HA2, unidas por un único enlace disulfuro. Las células huésped infectadas producen un polipéptido glicosilado precursor (HA0) con un peso molecular de 85.000 aproximadamente, que es cortado posteriormente en HA1 y HA2.
La presencia de anticuerpos IgG e IgA neutralizantes específicos de la HA de la gripe está asociada con una resistencia a la infección y a la enfermedad (Clements, 1992). Las vacunas contra la gripe de virus completo inactivado o parcialmente purificadas (subunidad dividida) son estandarizadas respecto a la cantidad de HA de cada cepa. Las vacunas de la gripe incluyen normalmente de 7 a 25 microgramos de HA de cada una de tres cepas de virus de la gripe.
La función de la otra glicoproteína de superficie principal, NA, en la inmunidad protectora de respuestas de anticuerpos o de células T contra la gripe, no ha sido definida. La neuraminidasa es muy lábil al proceso de purificación y almacenamiento (Murphy and Webster, 1990) y la cantidad de NA en las vacunas de la gripe actuales no está estandarizada. Una vacuna de HA purificada pero no de NA impide la enfermedad en animales desafiados con la gripe (Johansson y col., "Purified influenza virus hemagglutinin and neuraminidase are equivalent in stimulation of antibody response but induce contrasting types of immunity to infection" J. Virology, 63:1239-1246 (1989)). Se encontró que una vacuna experimental basada en el antígeno neuraminidasa no era protectora en un ensayo con humanos (Orga y col., J. Infect. Dis., 135:499-506 (1977)).
Las vacunas de la gripe autorizadas constan de preparaciones de subunidades completas inactivadas por formalina o de subunidades escindidas químicamente de dos virus de la gripe de subtipo A (H1N1 y H3N2) y de un virus de la gripe de subtipo B. Antes de cada temporada de gripe, el U.S. Food and Drug Administration's Vaccines and Related Biologicals Advisory Committee recomienda la composición de una vacuna de la gripe trivalente para la temporada próxima. La vacuna de 1992-93 contenía un virus similar a A/Texas/36/91 (H1N1), un virus similar a A/Beijing/353/89 (H3N2) y un virus B/Panamá/45/90. La FDA aconsejó que la vacuna de la gripe de 1993-94 debería contener las mismas cepas Texas y Panamá y una nueva cepa Beijing de virus de la gripe A (A/Beijing/32/92).
La vacunación de las personas de alto riesgo cada año antes de la temporada de gripe es la medida más eficaz para reducir el impacto de la gripe. Las limitaciones de las vacunas actualmente disponibles incluyen tasas bajas de utilización; poca eficacia en los ancianos y en los niños pequeños; la producción en huevos; la variación antigénica y las reacciones adversas.
El Center for Disease Control (CDC) estima que menos del 30% de los individuos de alto riesgo para la gripe son vacunados cada año (MMWR, 1992). Las actuales vacunas inactivadas consiguen un nivel elevado de protección frente a la enfermedad entre los adultos sanos normales cuando los antígenos de la vacuna y los de los virus de la gripe circulantes están estrechamente relacionados. Entre los ancianos, la tasa de protección frente a la enfermedad es mucho más baja, especialmente para aquéllos que están internados en una institución (Clements, 1992). En un estudio reciente de Powers and Belshe, J. Inf. Dis., 167:584-592 (1993), se observaron respuestas de anticuerpos significativas frente a una vacuna de la gripe de subviriones trivalente en menos del 30 por ciento de los sujetos de 65 años de edad o mayores.
Los virus semilla para las vacunas de la gripe A y B son cepas que existen en la naturaleza y que se replican hasta títulos elevados en la cavidad alantoidea de los huevos de gallina. Alternativamente, la cepa del componente de la gripe A es un virus "remezclado" con los genes de los antígenos de superficie correctos. Un virus "remezclado" es uno que, debido a la segmentación del genoma vírico, tiene características de cada cepa parental. Cuando más de una cepa de virus de la gripe infectan a una célula, estos segmentos víricos se mezclan para crear una progenie de viriones que contienen diferentes mezclas de genes de ambos parentales.
La protección con las vacunas actuales de la gripe completas o escindidas es de corta duración y disminuye a medida que tiene lugar el cambio antigénico en las cepas epidémicas del virus de la gripe. Los virus de la gripe experimentan un cambio antigénico como resultado de la selección inmune de los virus con cambios en la secuencia de aminoácidos de la molécula de hemaglutinina. Idealmente, las cepas vacuna coinciden con las cepas del virus de la gripe que causa la enfermedad. El proceso de fabricación actual de las vacunas de la gripe está, sin embargo, limitado por la propagación del virus en huevos de gallina con embrión. No todas las cepas de virus de la gripe se replican bien en los huevos; por tanto los virus deben ser adaptados o deben construirse virus "remezclados". Hay una considerable heterogeneidad en la hemaglutinina de los virus de la gripe cultivados en huevos en comparación con los aislados primarios procedentes de individuos infectados cultivados en células de mamífero (Wang y col., Virol., 171:275-279 (1989); Rajakumar y col., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 87:4154-4158 (1990). Los cambios en la HA durante la selección y la fabricación de las vacunas de la gripe pueden tener como resultado una mezcla de subpoblaciones de virus antigénicamente distintas. Los virus de la vacuna pueden por tanto diferir de las variantes dentro de las cepas epidémicas, teniendo como resultado niveles subóptimos de protección.
Possee (1986, Virus Research, Volumen 5, páginas 43-59) describe la expresión en la superficie celular de hemaglutinina del virus de la gripe en células de insecto utilizando un vector baculovírico.
Matsuura y col. (1987, J. Gene Virol., Volumen 68, páginas 1233-1250) describen varios vectores de expresión baculovíricos y discuten los requisitos para un nivel de expresión elevado de proteínas tales como glicoproteínas.
Kuroda y col. (1986, MBO Journal, Volumen 5, páginas 1359-1365) describen la expresión de la hemaglutinina del virus de la gripe en células de insecto por un vector baculovírico.
EP0546787 describe la expresión de inmunógenos específicos utilizando antígenos víricos y, en particular, describe fragmentos de ADN quiméricos similares a los que codifican la proteína de superficie HA de un virus de la gripe A.
Ayres y col. (1994, Virology, Volumen 202, páginas 586-605) describen una secuencia de ADN completa del virus de la polihedrosis nuclear de Autographa californica que se dice que contiene 133.894 pares de bases y que se dice que codifica aproximadamente 154 supuestos marcos de lectura abiertos de 150 nucleótidos o más.
Pueden tener lugar reacciones de hipersensibilidad inmediata en personas con alergia severa al huevo debido a proteínas del huevo residuales en la vacuna. La vacuna de la gripe del cerdo de 1976 fue asociada con una frecuencia incrementada del síndrome de Guillain-Barré. No se ha observado, hasta ahora, que vacunas posteriores preparadas a partir de otras cepas del virus de la gripe hayan incrementado la aparición de esta enfermedad poco frecuente.
Un método de producción de una vacuna de la gripe que no requiriera la propagación en huevos tendría como resultado un producto más puro que sería menos probable que causara una reacción inmune adversa. Además, una preparación de vacuna más pura no requeriría la inactivación del virus ni la extracción orgánica de los componentes de la membrana del virus, evitando de este modo la desnaturalización de los epítopos antigénicos y las preocupaciones por la seguridad debidas a los productos químicos residuales en la vacuna.
Además, una vacuna de la gripe producida en ausencia de propagación en huevos evitaría la heterogeneidad genética que tiene lugar durante la adaptación y el pase a través de los huevos. Esto tendría como resultado una vacuna que coincidiría mejor con las cepas epidémicas de la gripe, teniendo como resultado una eficacia mejorada.
Es por tanto un objeto de la presente invención proporcionar un método para producir una vacuna de la gripe que no requiera la replicación en huevos.
Es un objeto más de la presente invención proporcionar un método para producir una vacuna de la gripe altamente purificada que sea rápido y rentable, y que permita la producción de vacunas a partir de las fuentes primarias de la gripe.
Resumen de la invención
En un primer aspecto, la presente invención se refiere a un vector para producir una proteína hemaglutinina HA0 del virus de la gripe recombinante que comprende las siguientes secuencias 5'\rightarrow3': un promotor de la polihedrina procedente de un baculovirus, un codón de inicio de la traducción ATG, un péptido señal, secuencias que codifican la hemaglutinina madura procedentes de una cepa del virus de la gripe, un codón de terminación de la traducción y una señal de poliadenilación del ARN de la polihedrina, caracterizado porque el péptido señal comprende un péptido señal de baculovirus que contiene los aminoácidos 1-18 de la SEC ID Nº: 7.
En un segundo aspecto, la invención se refiere a un vector como el descrito anteriormente en el que la secuencia que codifica el péptido señal y la hemaglutinina no codifica ningún aminoácido intermedio.
En un tercer aspecto, la invención se refiere a un vector como el descrito anteriormente, transfectado a células de insecto cultivadas.
En un cuarto aspecto, la invención se refiere a un método para producir una hemaglutinina que comprende la infección de células de insecto cultivadas con un vector como el descrito anteriormente y el cultivo de las células en un medio nutritivo.
Se proporciona un método para la preparación de una proteína hemaglutinina del virus de la gripe recombinante mediante la expresión en células de insecto utilizando un sistema de expresión baculovírico. La proteína resultante es útil para producir una vacuna de la gripe multivalente basada en una mezcla de antígenos hemaglutinina recombinantes clonados a partir de virus de la gripe que tienen potencial epidémico. Las proteínas hemaglutinina recombinantes son glicoproteínas de longitud completa, no cortadas (HA0), que incluyen las subunidades HA1 y HA2 (HAO) purificadas bajo condiciones no desnaturalizantes hasta un 95% o más de pureza, preferiblemente hasta un 99% de pureza.
Se describe también un proceso para el clonaje de genes de la hemaglutinina de la gripe procedentes de virus de la gripe A y B utilizando sondas oligonucleotídicas especialmente diseñadas y la metodología de la reacción en cadena de la polimerasa (PCR). En la realización preferida, los genes de la HA clonados son modificados por deleción de los nucleótidos que codifican las secuencias del péptido señal hidrofóbico natural y la sustitución por un nuevo péptido señal de baculovirus, para producir una secuencia que codifica el péptido señal inmediatamente colindante a la hemaglutinina. Estos genes quiméricos son introducidos en vectores de expresión baculovíricos de tal manera que el promotor de la polihedrina del baculovirus dirige la expresión de las proteínas HA recombinantes en células de insecto infectadas. El péptido señal de baculovirus de 18 aminoácidos dirige la traducción de la rHA en la ruta de glicosilación de las células de insecto y no está presente en la glicoproteína rHA madura. En la realización preferida, se diseña un vector que no codifica ningún aminoácido intermedio entre el péptido señal y la proteína hemaglutinina.
Esta metodología puede ser extendida a todos los tipos de virus de la gripe, incluyendo pero sin limitarse a, el subtipo A dominante (H1N1), el subtipo A (H3N2) y el tipo B que infectan a humanos, así como los virus de la gripe que infectan a otras especies de mamíferos y aves.
Se describe un procedimiento general para la extracción y purificación eficaces de la proteína HA recombinante producida en células de insecto, para la purificación de las proteína rHA procedentes de los virus de la gripe de los subtipos A y del tipo B. La vacuna recombinante puede ser desarrollada a partir de fuentes primarias del virus de la gripe, por ejemplo, de secreciones nasales procedentes de individuos infectados, en lugar de a partir de virus adaptados a, y cultivados en, huevos de gallina. Esto permite un rápido desarrollo de la vacuna directamente a partir de las cepas epidémicas de la gripe y evita los problemas que surgen de la adaptación del virus al cultivo en huevos, así como de la reacción del paciente a la contaminación con huevo de la vacuna resultante.
Los ejemplos demuestran la formulación y la eficacia clínica de la vacuna en una forma de dosificación inmunizante que incluye antígenos rHA purificados de tres cepas del virus de la gripe recomendadas por la FDA para las temporadas de epidemia de gripe de 1993/1994 y 1994/1995. La inmunidad funcional fue medida utilizando ensayos que cuantifican anticuerpos que se unen a la hemaglutinina de la gripe, que bloquean la capacidad del virus de la gripe para aglutinar glóbulos rojos sanguíneos o que neutralizan el virus de la gripe. Las respuestas inmunes protectoras con las vacunas de rHA fueron medidas en animales que eran susceptibles a la infección por el virus de la gripe o en estudios de desafío en humanos.
Breve descripción de las figuras
La Figura 1 es un esquema del clonaje de los genes de la HA de cepas de la gripe A a partir de preparaciones de ARN vírico purificado, de la purificación de la rHA expresada y de la caracterización biológica de la rHA. Abreviaturas: FDA, Food and Drug Administration; MDCK, Riñón Canino Madin Darby; TPCK, tosilfenilalanil clorometilcetona; ARN, ácido ribonucleico; ADNc, ácido desoxirribonucleico complementario; HA, hemaglutinina; FBS, Suero Bovino Fetal; PCR, Reacción en Cadena de la Polimerasa y BV, Baculovirus.
La Figura 2 es un esquema más detallado del método de la Figura 1 aplicado al clonaje y la expresión del gen de la HA de la cepa del Virus de la Gripe A/Texas/36/91. El gen de la HA de la gripe fue obtenido a partir de ARN purificado de células MDCK infectadas con el virus de la gripe A/Texas/36/91 utilizando transcriptasa inversa y un cebador universal (SEC ID Nº 1), seguido por dos ciclos de amplificación por PCR y clonaje. Según se muestra, en el primer ciclo de reacciones de PCR, se utilizaron el cebador del extremo 5' de SEC ID Nº 2 y el cebador del extremo 3' de SEC ID Nº 3. En el segundo ciclo de reacciones de PCR, se utilizó el cebador del extremo 5' de SEC ID Nº 4 y el cebador del extremo 3' de SEC ID Nº 5. Se construyó un vector de recombinación baculovírico que contenía el promotor de la polihedrina y una secuencia peptídica señal del gen 61K de baculovirus (un gen de baculovirus que codifica un péptido señal que tiene un peso molecular de 61.000 aproximadamente), seguido por las secuencias codificadoras completas de la proteína HA madura. Este vector de recombinación fue utilizado posteriormente para producir un vector de expresión baculovírico que producía HA de esta cepa del virus.
La Figura 3 es una gráfica de la respuesta inmune anti-HA en ratones, día 42, n=5, que representan gráficamente el título de anticuerpos para rHA0-pura; para la vacuna Fluzone® y para rHA0-alumbre, a dosis de 0,5 \mug (barras oscuras), 0,1 \mug (barras sombreadas), 0,02 \mug (barras punteadas) y 0,004 \mug (barras sin rellenar).
Las Figuras 4a, 4b y 4c son gráficas de la respuesta inmune anti-HA en ratones inmunizados con rHA o con la vacuna trivalente autorizada, fórmula de 1994-1995, semanas después de la vacunación frente al título de IHA, para IHA A/Texas/36/91 (Figura 4a), IHA A/Shangdong/9/93 (Figura 4b) y IHA B/Panamá/45/90 (Figura 4c); rHA (rombos) y la vacuna atenuada FLUVIRON® cultivada en huevos (cuadrados).
Descripción detallada de la invención
Se describe un método para preparar una vacuna de la gripe recombinante. Se produce un antígeno hemaglutinina (HA0) de longitud completa, no cortado, de un virus de la gripe con vectores de expresión baculovíricos en células de insecto cultivadas y se purifica bajo condiciones no desnaturalizantes. Dos o más antígenos hemaglutinina purificados de cepas del virus de la gripe A y/o del virus de la gripe B son mezclados para producir una vacuna de la gripe multivalente. Los antígenos recombinantes pueden ser combinados con un vehículo adyuvante para incrementar la eficacia.
La utilización de la tecnología de ADN recombinante para producir vacunas de la gripe ofrece varias ventajas: puede producirse una vacuna de la gripe de ADN recombinante bajo condiciones más seguras y más controladas desde el punto de vista de la rigurosidad; no se requiere la propagación en huevos de virus de la gripe infecciosos; la proteína HA recombinante puede ser más altamente purificada, eliminando virtualmente los efectos colaterales debidos a proteínas contaminantes; los procedimientos de purificación de la HA recombinante no tienen que incluir la inactivación del virus o la extracción orgánica de componentes de la membrana del virus, evitando por tanto la desnaturalización de los antígenos y las preocupaciones sobre la seguridad adicionales debidas a los productos químicos residuales en la vacuna; la producción de HA mediante la tecnología de ADN recombinante proporciona una oportunidad para evitar la heterogeneidad genética que tiene lugar durante la adaptación y el pase a través de huevos, lo cual haría posible que coincidieran mejor las cepas de la vacuna con las cepas epidémicas de la gripe, teniendo como resultado una eficacia mejorada; y un procedimiento recombinante puede permitir también la selección de cepas posteriormente durante el año, dejando de este modo tiempo para selecciones basadas en datos epidemiológicos más fiables.
Sistema de expresión baculovírico
Los baculovirus son virus de ADN de la familia Baculoviridae. Se sabe que estos virus tienen un estrecho rango de huéspedes que está limitado principalmente a especies de insectos lepidópteros (mariposas y polillas). El baculovirus Virus de la Polihedrosis Nuclear de Autographa californica (AcNPV), que se ha convertido en el baculovirus prototipo, se replica eficazmente en células de insecto cultivadas susceptibles. El AcNPV tiene un genoma de ADN circular cerrado de doble hebra de 130.000 pares de bases aproximadamente y está bien caracterizado con respecto al rango de huéspedes, biología molecular y genética.
Muchos baculovirus, incluyendo AcNPV, forman grandes oclusiones cristalinas proteicas dentro del núcleo de las células infectadas. Un único polipéptido, referido como polihedrina, supone el 95% aproximadamente de la masa proteica de estos cuerpos de oclusión. El gen de la polihedrina está presente como una única copia en el genoma vírico del AcNPV. Como el gen de la polihedrina no es esencial para la replicación del virus en células cultivadas, puede ser fácilmente modificado para que exprese genes foráneos. La secuencia del gen foráneo es insertada en el gen del AcNPV justo 3' respecto a la secuencia del promotor de la polihedrina, de tal manera que esté bajo el control transcripcional del promotor de la polihedrina.
Los baculovirus recombinantes que expresan genes foráneos son construidos mediante recombinación homóloga entre el ADN del baculovirus y plásmidos quiméricos que contienen la secuencia génica de interés. Los virus recombinantes pueden ser detectados en virtud de su morfología de placas característica y pueden ser purificados mediante la técnica de purificación de placas hasta la homogeneidad.
Los baculovirus son particularmente idóneos para ser utilizados como vectores de clonaje y expresión eucarióticos. Son generalmente seguros en virtud de su estrecho rango de huéspedes, que está limitado a artrópodos. La U.S. Environmental Protection Agency (EPA) ha aprobado la utilización de tres especies de baculovirus para el control de plagas de insectos. El AcNPV ha sido aplicado a cultivos durante muchos años bajo Permisos de Utilización Experimental de la EPA.
Los virus AcNPV de tipo salvaje y recombinantes se replican en una variedad de células de insecto, incluyendo líneas celulares continuas derivadas del gusano del ejército (armyworm) otoñal, Spodoptera frugiperda (Lepidoptera; Noctuidae). Las células de S. frugiperda tienen un tiempo de duplicación de la población de 18 a 24 horas y pueden ser propagadas en monocapa o en cultivos libres en suspensión.
Las proteínas HA recombinantes pueden ser producidas en, pero sin limitarse a, células derivadas de la especie de lepidópteros Spodoptera frugiperda. Otras células de insecto que pueden ser infectadas por baculovirus, tales como las de las especies Bombix mori, Galleria mellanoma, Trichplusia ni o Lamanthria dispar, podrían ser utilizadas también como sustrato adecuado para producir proteínas HA recombinantes.
La línea celular huésped más preferida para la producción de proteínas a partir de baculovirus recombinantes es Sf900+. Otra línea de células huésped preferida para la producción de proteínas a partir de baculovirus recombinantes es Sf9. Sf900+ y Sf9 son líneas celulares continuas no tumorigénicas, no transformadas, derivadas del gusano del ejército (armyworm) otoñal, Spodoptera frugiperda (Lepidoptera; Noctuidae). Las células Sf900+ y Sf9 son propagadas a 28\pm2ºC sin suplemento de dióxido de carbono. El medio de cultivo utilizado para las células Sf9 es TNMFH, una mezcla sencilla de sales, vitaminas azúcares y aminoácidos, suplementado con un 10% de suero bovino fetal. Aparte del suero bovino fetal, no se utiliza ningún otro producto derivado de animales (esto es, tripsina, etc.) en la propagación de las células. Puede utilizarse también medio de cultivo sin suero (disponible como medio de cultivo de Sf900, Gibco BRL, Gaithersburg, MD) para cultivar las células Sf9 y se prefiere para la propagación de las células Sf900+.
Las células Sf9 tienen un tiempo de duplicación de la población de 18-24 horas y pueden ser propagadas en monocapa o en cultivos libres en suspensión. No se ha descrito que las células de S. frugiperda soporten la replicación de algún virus de mamífero conocido.
Los expertos en la técnica comprenderán que el vector de expresión no está limitado a un sistema de expresión baculovírico. Las proteínas HA recombinantes pueden ser expresadas también en otros vectores de expresión tales como Entomopoxvirus (los poxvirus de insectos), virus de la polihedrosis citoplásmica (CPV) y la transformación de células de insecto con la expresión constitutiva del gen o genes de la HA recombinante.
Aislamiento de Cepas de la Gripe
Una o más cepas de la gripe son aisladas de individuos infectados con la enfermedad. Preferiblemente, las cepas de la gripe son aquéllas identificadas por la Food and Drug Administration (FDA) o por el CDC como poseedoras de un potencial epidémico para la próxima temporada de gripe. Una ventaja del método descrito en la presente es que pueden utilizarse muestras clínicas, tales como secreciones nasales, de pacientes infectados con el virus de la gripe como fuente directa del virus. Alternativamente, pueden ser obtenidas de la FDA o del CDC.
Propagación de Cepas de la Gripe
Las cepas son posteriormente propagadas en células que producen títulos elevados de virus, tales como células de Riñón Canino Madin Darby (MDCK) (disponibles en la American Type Culture Collection bajo el número de acceso ATCC CCL34). Por ejemplo, células MDCK son infectadas en presencia de tripsina parcialmente inactivada con tosilfenilalanil clorometilcetona (TPCK) y de concentraciones de suero bovino fetal optimizadas para producir los títulos más elevados de virus en el primer pase. Las células MDCK son infectadas con las cepas de la gripe a una baja multiplicidad de infección (de 0,1 a 0,5) según se determinó mediante un ensayo estándar de HA (Rosen, "Hemagglutination with Animal Viruses" en Fundamental Techniques in Virology, ed. K. Habel y N.P. Salzman, pp. 276-28 (Academic Press, New York, 1969)). Las células infectadas son incubadas a 33ºC durante 48 horas y los medios analizados para determinar la producción de virus utilizando el ensayo de actividad de hemoaglutinación. Las condiciones que produzcan la actividad HA más elevada son utilizadas posteriormente para preparar cantidades grandes de virus de la gripe.
Purificación del Virus
Las partículas víricas producidas a partir del primer pase son purificadas del medio utilizando un método conocido de purificación tal como centrifugación en gradiente de densidad de sacarosa. Por ejemplo, el virus es recogido 24-48 horas después de la infección mediante centrifugación del medio de las células MDCK infectadas con el virus de la gripe. La pella de virus resultante es resuspendida en tampón y centrifugada a través de un gradiente de sacarosa tamponado. La banda del virus de la gripe es recogida de la región del gradiente de sacarosa del 40-45%, diluida con tampón y aglutinada por centrifugación a 100.000 x g. La pella de virus purificados es resuspendida en tampón y almacenada a -70ºC.
Clonaje de los Genes de la Hemaglutinina del Virus de la Gripe
En la Figura 1 se proporciona una visión de conjunto de los métodos para el clonaje de los genes de la HA. Básicamente, las células son infectadas con la cepa del virus de la gripe que va a ser clonada. El virus es recogido del medio de las células y se aísla el ARN vírico, para las cepas del virus de la gripe A, o bien ARNm en el caso de las cepas del virus de la gripe B. El ARN del virus (-ARN) es extraído de viriones purificados y analizado en geles de agarosa formaldehído utilizando procedimientos estándar. Se sintetiza el ADNc utilizando un sistema de cebadores universales para el ARN vírico procedente de las cepas de la gripe A, o bien cebadores aleatorios para el ARNm de las cepas de la gripe B. Se produce un ADN complementario (ADNc) más-estándar utilizando un cebador oligonucleotídico universal (5'-AGCAAAAGCAGG-3' (SEC ID Nº 1)) que es homólogo a todos los segmentos de ARN de la hemaglutinina en los virus de la gripe A y B (Davis y col., "Construction and characterization of a bacterial clone containing the hemagglutinin gene of the WSN strain (H0N1) of influenza virus", Gene, 10:205-218 (1980)). Se diseñan cebadores que sean homólogos a las regiones conservadas en el extremo 5' y en el extremo 3' de los genes de la hemaglutinina de la gripe. Los cebadores 5' y 3' tienen ambos también sitios de enzimas de restricción en los extremos que no se encuentran en los genes de la hemaglutinina.
Se mezclan los cebadores de la gripe A o B apropiados y el ADNc de la gripe y se amplifican los segmentos del gen de la hemaglutinina utilizando procedimientos estándar de PCR. Los fragmentos de ADN de doble hebra resultantes contienen secuencias codificadoras de la hemaglutinina madura completa. Se utiliza la reacción en cadena de la polimerasa ("PCR") para amplificar el gen de la HA total, que es posteriormente clonado en un huésped bacteriano adecuado tal como E. coli. Los extremos 5' son secuenciados con el fin de identificar el péptido señal de los genes de la HA; posteriormente se utiliza PCR para amplificar los genes de la HA menos el péptido señal. Éste es posteriormente subclonado en un vector de transferencia plasmídico que contiene el promotor de la polihedrina de AcNPV. Los vectores de transferencia resultantes contienen las secuencias 5'\rightarrow3' siguientes: Promotor de la polihedrina del baculovirus NPV de A. californica, un codón de inicio de la traducción ATG, un péptido señal de baculovirus 61K, las secuencias codificadoras de la hemaglutinina madura, el codón de terminación de la traducción de la hemaglutinina natural, la señal de poliadenilación de ARN de la polihedrina y ADN de baculovirus flanquean-
te.
Un ADN plasmídico de transferencia quimérico purificado conteniendo un gen de la hemaglutinina clonado es posteriormente mezclado con ADN de AcNPV de tipo salvaje, coprecipitado con calcio y transfectado a células de S. frugiperda. Los baculovirus recombinantes son seleccionados sobre la base de la morfología de las placas y purificados posteriormente mediante ciclos adicionales de purificación de placas. Los baculovirus recombinantes clonados son sometidos a selección por la expresión de hemaglutinina y se selecciona un único vector de expresión baculovírico para producir un Banco de Virus Maestro.
Cepas de la Gripe A
Los genes de la HA de cepas de la gripe A son clonados a partir de preparaciones de ARN vírico purificado. El ARN vírico es extraído de 100-200 microlitros de viriones de la gripe A purificados que contienen 1.000-2.000 unidades de hemoaglutinación (UHA) de la gripe. Una UHA es la cantidad de virus que aglutinará el 50% de los glóbulos rojos sanguíneos en el ensayo estándar de aglutinación (Rosen, 1969). Los viriones son tratados con proteinasa K para digerir la proteína, posteriormente el ARN del virus es extraído con volúmenes iguales de fenol y cloroformo y precipitado con etanol en presencia de ARNt transportador. El ARN vírico es resuspendido en tampón y digerido con ADNasa sin ARNasa para eliminar cualquier ADN contaminante, posteriormente se repiten las etapas de extracción y precipitación. El ARN del virus (ARNv) es posteriormente analizado utilizando geles de agarosa formaldehído según está descrito por Maniatis y col., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, pp. 86-96 y 366-367 (Cold Spring Harbor Lab., Cold Spring, N.Y., 1982).
Cepas de la Gripe B
Los genes de la HA de las cepas de la gripe B son clonados a partir del ARN mensajero (ARNm) total extraído de células infectadas con la cepa de la gripe B. El ARN total es posteriormente extraído de las células infectadas. Las células recogidas son lisadas en presencia de tiocianato de guanidinio y el ARN celular total es purificado utilizando, por ejemplo, el Kit de Extracción de ARN de Pharmacia Biotech Inc. (Piscataway, NJ). El ARNm total es extraído del ARN celular utilizando columnas de centrifugación de Oligo-(dT)-celulosa empleando, por ejemplo, el Kit de Purificación de ARNm de Pharmacia Biotech, Inc.
Expresión y Procesamiento de la Hemaglutinina Recombinante en Células de Insecto
Los antígenos hemaglutinina recombinante son expresados a niveles elevados en células de S. frugiperda infectadas con los vectores AcNPV-hemaglutinina. El producto primario del gen no es procesado, hemaglutinina de longitud completa (rHA0), y no es secretado, sino que permanece asociado a las membranas periféricas de las células infectadas. Esta HA0 recombinante es una proteína de peso molecular 68.000 que está glicosilada con glucanos de tipo manosa superiores, unidos a N, distintos de los glucanos producidos por la expresión de las proteínas víricas en células de mamífero o de ave. Hay pruebas de que la rHA0 forma trímeros después de la traducción que se acumulan en las membranas citoplásmicas.
Vectores para la Expresión de HA0 y Otras Proteínas
La HA0 es una mejor vacuna debido a su superior estabilidad en comparación con el complejo HA1/HA2, y mantiene un plegamiento correcto durante la purificación y el almacenamiento. La superior estabilidad es particularmente obvia con las cepas B, teniendo como resultado títulos que son alrededor de cinco veces mayores que los obtenidos con las cepas B atenuadas comercialmente disponibles.
Según se describe más adelante en los ejemplos, cuando los genes de la HA fueron clonados en pMGS12 a través de sitios de restricción, el péptido señal de la HA madura fue eliminado y sustituido por el péptido señal de la quitinasa de baculovirus, referido como péptido señal de 61 kD. Como el gen de la HA está conectado con el péptido señal de la quitinasa a través de un sitio de corte, hay entre tres y cinco aminoácidos, dependiendo del sitio de restricción seleccionado, entre la proteína HA0 madura y el péptido señal de 61 kD. Aunque esto no era un problema con las cepas A de la gripe, la HA0 de la cepa B expresada con los aminoácidos adicionales no se plegaba correctamente.
Se desarrollaron dos vías para solucionar este problema. La primera es la utilización de un nuevo vector, pMGS3, que no codifica el péptido señal de 61 kD. La HA0 con su péptido señal nativo es clonada en el vector y expresada. Cuando se caracterizó mediante SDS-PAGE, la HA0 de la cepa B expresada en este vector mostraba una mejor glicosilación y un mejor procesamiento que cuando se expresaba en pMGS12. La HA0 se plegaba tan bien que podía ser convertida cuantitativamente en HA1/HA2. Desgraciadamente, según se determinó mediante Transferencia Western, el rendimiento no era tan elevado. El segundo método incrementa el rendimiento mediante la utilización del péptido señal de 61 kD en pMGS12 para conducir la expresión cuando el gen de la HA0 fue insertado sin la utilización de enzimas de restricción. El nuevo vector, que incluía el péptido señal de 61 kD y el gen de la HA0, sin ninguna secuencia codificadora de aminoácidos intermedios externos, es referido como pMGS27.
El pMGS27 puede ser utilizado para el clonaje y la expresión de cualquier gen en un sistema de expresión de baculovirus. El gen diana, en lugar de ser clonado en el vector por restricción y ligadura, es clonado en el vector por hibridación. Los reactivos están disponibles en Clontech en su Sistema de Clonaje Directo por PCR. El pMGS27 fue diseñado de tal manera que pudiera ser linealizado en el extremo de la región codificadora del péptido señal de la quitinasa, y se crearon dos colas largas de hebra sencilla mediante el tratamiento del pMGS27 linealizado con ADN polimerasa de T4 más dATP.
El gen diana es amplificado utilizando la reacción en cadena de la polimerasa ("PCR") o transcriptasa inversa-PCR ("RT-PCR") con un par de oligonucleótidos diseñados para crear colas de hebra sencilla que sean complementarias a las colas del pMGS27 tratado, después de que el fragmento de la PCR haya sido tratado con ADN polimerasa de T4 y dTTP. Una simple hibridación puede combinar posteriormente las dos moléculas en un plásmido circular que está listo para transformar al huésped. Además de ser más rápido y más sencillo que el método tradicional de restricción-ligadura para clonar el gen de la HA en pMGS12, el pMGS27 tiene la importante ventaja de que no produce aminoácidos extra codificados por los sitios de restricción creados entre el péptido señal de la quitinasa y la proteína HA madura. Estos aminoácidos extra pueden crear a veces dificultades tales como que la peptidasa del péptido señal no pueda cortar la señal, o que la proteína codificada no se pliegue correctamente, como en el caso de la HA de la cepa B.
Purificación de la HA0 Recombinante
Varios días después de la infección, la rHA0 puede ser extraída selectivamente de las membranas periféricas de las células infectadas con AcNPV-hemaglutinina con un detergente no iónico, no desnaturalizante, o mediante otros métodos conocidos por los expertos en la técnica para la purificación de proteínas recombinantes procedentes de células de insecto, incluyendo, pero sin limitarse a, cromatografía de afinidad o en gel y unión a anticuerpos. La rHA0 soluble en detergente puede ser purificada adicionalmente utilizando intercambio iónico con DEAE y cromatografía de afinidad con lectina de lenteja u otros métodos equivalentes conocidos por los expertos en la técnica.
En una realización preferida, la rHA0 es purificada utilizando un procedimiento que es más suave y tiene como resultado una mayor producción de la rHA0 de las cepas B de la gripe. Este procedimiento es de manera general según sigue:
La proteína HA0 que forma una parte integral de la membrana de las células de insecto es separada de las proteínas solubles, de las proteínas de las membranas periféricas y de la mayoría del ADN y del ARN por extracción de las células en una solución alcalina relativamente viscosa, donde un pH alcalino se define como entre 9,5 y 10,5 aproximadamente. La viscosidad es incrementada mediante la inclusión de sacarosa en una concentración de 250 mM aproximadamente. Se incluye un agente reductor de disulfuro, por ejemplo \beta-mercaptoetanol, en una concentración eficaz para impedir la formación de enlaces disulfuro en las proteínas de la mezcla. Las células son suspendidas en el tampón de extracción, homogeneizadas y posteriormente centrifugadas. La pella es lavada por homogeneización en un tampón de baja fuerza iónica que contiene un agente reductor de disulfuro a un pH alcalino (la conductividad es generalmente menor de 1 mS, pH 10,5) y posteriormente la pella es centrifugada. La HA0 es luego extraída de la pella en un tampón que contiene entre un 0,3 y un 1,5% de detergente tal como Triton®, una cantidad de agente disgregante eficaz para prevenir la formación de complejos debida a interacciones de carga, tal como betaína o paurina entre 0,3 y 1,0 M, a un pH alcalino (se prefiere 9,5). La HA0 del sobrenadante es posteriormente purificada mediante cromatografía de intercambio aniónico seguido por cromatografía de intercambio catiónico. La HA0 es aplicada a la columna de intercambio aniónico, por ejemplo de DEAE o Q-Sepharose® (una columna de esferas de agarosa con grupos de aminas cuaternarias), en el mismo tampón que se extrajo pero diluida al menos 1:2 con tampón adicional, después de equilibrar la columna en tampón conteniendo aproximadamente 1/10 de la concentración de detergente y de agente reductor de disulfuro. La HA0 es posteriormente eluida mediante disminución del pH hasta 8,5 aproximadamente. La HA0 eluida es aplicada a una columna de intercambio catiónico en esencialmente el mismo tampón. Los contaminantes son eluidos mediante disminución del pH hasta 7,4 aproximadamente, eluyendo posteriormente la HA0 mediante el incremento de la concentración de sal hasta NaCl 0,15 M.
Este método de purificación preferido se describe con detalle según sigue.
Preparación de la fracción de membranas que contiene la HA recombinante. Las células que expresan la HA recombinante (6,2 g de células procedentes de 0,34 l de cultivo) son suspendidas a 100 mg/ml en pirofosfato de sodio 100 mM, cloruro de sodio 100 mM, sacarosa 250 mM, \beta-mercaptoetanol 0,1%, pH 10,5, enfriado en hielo. Las células se rompen utilizando un homogeneizador Polytron® (Brinkman Instruments Inc., Westbury, NY) colocado en la posición de 4 durante 2 minutos. Se necesita un pH alcalino del medio de homogeneización para incrementar la solubilidad de las proteínas contaminantes y para incrementar la pureza de la preparación de membranas. El homogenado es centrifugado durante 30 minutos a 9.200 g. Se desecha sobrenadante y se recoge la pella. La preparación de la fracción de membranas es seguida por una etapa de lavado de fuerza iónica baja. La pella es resuspendida hasta el volumen original en \beta-mercaptoetanol 0,1% enfriado en hielo, pH 10,5, y homogeneizada utilizando un homogeneizador Polytron® colocado en la posición 4 durante 2 minutos. El homogenado es centrifugado durante 30 minutos a 9.200 g. Se desecha sobrenadante y se recoge la pella. Este lavado de baja fuerza iónica elimina la porción adicional de las proteínas de las membranas periféricas. La preparación de la fracción de membranas tiene como resultado un enriquecimiento considerable en HA recombinante y la eliminación de los ácidos nucleicos contaminantes.
Extracción de la HA recombinante. La HA recombinante es posteriormente extraída de forma selectiva de la pella de membranas bajo condiciones que no desnaturalizan el antígeno. La pella de membranas es homogeneizada en 41 ml de etanolamina 10 mM, pH 9,5, Triton® N101 al 1%, \beta-mercaptoetanol 0,1%, NaCl 25 mM, betaína 400 mM, enfriado en hielo, utilizando un homogeneizador Polytron® colocado en la posición 4 durante 2 minutos. Después de incubar durante 40 minutos a 23ºC, la mezcla es centrifugada durante 30 minutos a 9.200 g. Se decanta el sobrenadante que contiene la HA recombinante y se diluye dos veces con el mismo tampón.
Las proteínas son analizadas mediante electroforesis en gel de SDS poliacrilamida. Las muestras se rompen en un baño de agua en ebullición durante 10 minutos en presencia de dodecil sulfato de sodio (SDS) 2% y \beta-mercaptoetanol 5%; posteriormente son sometidas a electroforesis en un gel de poliacrilamida al 11% en presencia de SDS 0,1% y luego teñidas con Azul de Coomassie.
Purificación cromatográfica. La purificación cromatográfica de la HA recombinante fue simplificada y se eliminó del proceso la costosa cromatografía de afinidad en Sepharose® con Lectina de Lenteja mediante sustitución por un proceso de purificación cromatográfica de dos etapas que tuvo como resultado un antígeno HA recombinante altamente purificado que no estaba desnaturalizado y que era adecuado como componente de una vacuna de la gripe para uso humano. Las matrices de gel para cromatografía utilizadas son Q-Sepharose Fast Flow® y CM-Sepharose Fast Flow® de Pharmacia.
Cromatografía de intercambio aniónico. Todas las cromatografías son realizadas a temperatura ambiente. El extracto que contiene la HA recombinante preparado según se describió anteriormente es aplicado a 1 ml/minuto a la columna de Q-Sepharose Fast Flow® de Pharmacia (5 ml en una columna de Pharmacia C10/10) equilibrada con etanolamina 10 mM pH 9,5, Triton® N101 0,1%, \beta-mercaptoetanol 0,01%, NaCl 25 mM, betaína 400 mM. La columna es lavada posteriormente con el tampón de equilibrado hasta que la absorbancia UV del efluente retorne a la línea base. Bajo estas condiciones, la HA recombinante se une a la columna, mientras que parte de los contaminantes fluyen a través de la misma. La HA recombinante parcialmente purificada es luego eluida con dietanolamina 30 mM pH 8,5, Triton® N101 0,1%, \beta-mercaptoetanol 0,01%, NaCl 25 mM, betaína 400 mM.
Cromatografía de intercambio catiónico. El eluato de la Q-Sepharose® (23 ml) es eluido dos veces con dietanolamina 30 mM pH 8,5, Triton® N101 0,1%, \beta-mercaptoetanol 0,01%, NaCl 10 mM, betaína 400 mM. La columna es lavada posteriormente con 35 ml de fosfato de sodio 10 mM, pH 7,4, Triton® N101 0,1%, \beta-mercaptoetanol 0,01%, NaCl 10 mM, betaína 400 mM. Este tratamiento eluye los contaminantes de la columna mientras que la HA recombinante permanece unida a la CM-Sepharose®. El detergente es luego eliminado mediante lavado de la columna con fosfato de sodio 10 mM, pH 7,4, NaCl 10 mM, hasta que la absorbancia UV del efluente retorne a la línea base. La HA recombinante purificada es eluida con solución salina tamponada con fosfato, pH 7,5 (PBS).
La rHA0 purificada es resuspendida en una solución tamponada isotónica. Después de la eliminación del detergente, la rHA0 purificada aglutinará eficazmente los glóbulos rojos sanguíneos.
Propiedades Estructurales y Biológicas de la HA0 Recombinante
La rHA0 es purificada hasta al menos un 95% de pureza, más preferiblemente hasta el 99% de pureza. Ésta migra predominantemente como un único polipéptido principal de peso molecular 68.000 en un gel de SDS-poliacrilamida. La estructura cuaternaria del antígeno HA0 recombinante purificado fue examinada mediante microscopía electrónica, resistencia a tripsina, análisis de sedimentación de densidad y por la capacidad para aglutinar glóbulos rojos sanguíneos. Estos datos muestran que la HA0 recombinante forma trímeros, que se ensamblan en rosetas.
La rHA0 purificada no aglutina células antes de la eliminación del detergente, sugiriendo que el antígeno debe formar complejos (rosetas) con el fin de entrecruzar los glóbulos rojos sanguíneos de pollo. La capacidad cuantitativa de la rHA0 purificada para aglutinar células es utilizada como medida de la consistencia lote a lote del antígeno. Se define una unidad de hemaglutinina como la cantidad de antígeno requerida para conseguir el 50% de aglutinación en un ensayo estándar de hemaglutinina con glóbulos rojos sanguíneos de pollo. Datos comparativos muestran que los antígenos rHA0 purificados aglutinan los glóbulos rojos sanguíneos con una eficacia comparable a la observada con viriones de la gripe completos.
La HA0 recombinante puede ser cortada en el enlace disulfuro, produciéndose un cambio de conformación que tiene como resultado la formación de dos cadenas, HA1 y HA2, según está descrito por Carr, C.M. y Kim, P.S., "A Spring-loaded Mechanism for the Conformational Change of Influenza Hemagglutinin", Cell, 73:823-832 (1993). El corte de la HA0 recombinante se describe con más detalle en el Ejemplo 6 más adelante. Se cree que, después del corte de la HA0 natural en HA1 y HA2, las cadenas resultan infecciosas al adquirir la capacidad de fusionarse con una célula, creando de este modo una respuesta inmune mejorada. El procesamiento de antígenos tales como la hemaglutinina de la gripe tiene lugar por la unión de los péptidos antigénicos a moléculas del complejo principal de histocompatibilidad (MHC). El complejo antígeno/MHC es reconocido por las células T para iniciar una respuesta inmune, según está descrito en la revisión de Harding y Geuze, Current Opinion in Cell Biology, 5:596-605 (1993). Sin embargo, la rHA0 producida en baculovirus es muy estable y muy inmunogénica como molécula intacta. La comparación de las moléculas de azúcar en la HA0 expresada en células de insecto, muestra que los glucanos son diferentes de los presentes cuando la HA0 es expresada en células de mamífero o de ave.
Producción de Proteínas de Fusión
Pueden producirse proteínas de fusión que consten de la HA0 fusionada a una segunda proteína antigénica cuando la antigenidad de la segunda proteína sea baja o cuando haya ventajas para producir una respuesta inmunogénica hacia múltiples antígenos. Un ejemplo de un segundo antígeno preferido es la neuraminidasa producida por el virus de la gripe. El antígeno puede constar de una proteína celular, vírica o bacteriana, o de una porción antigénica de la misma que incluya al menos de cinco a ocho aminoácidos. Otros antígenos incluyen el antígeno de la hepatitis B, antígenos del VIH y el antígeno carcinoembrionario. Una "respuesta inmune", según se utiliza en la presente, se refiere a una respuesta humoral, medida por la producción de anticuerpos hacia el antígeno, o bien a una respuesta celular, medida por la producción de una respuesta al antígeno mediada por células T. En algunos casos, puede insertarse un "adaptador" de aminoácidos no antigénicos entre la HA y el antígeno con el fin de incrementar adicionalmente la antigenicidad del antígeno en comparación con la de la HA. El proceso implica la construcción de un plásmido de ADN para fusionar genes del antígeno diana con el gen de la HA del virus de la gripe de longitud completa o con fragmentos del mismo, utilizando sondas oligonucleotídicas y la metodología de la reacción en cadena de la polimerasa (PCR).
Los genes de fusión HA-antígeno diana son modificados para obtener una expresión apropiada en células de insecto mediante deleción de las secuencias del péptido señal hidrofóbico naturales y la sustitución de las mismas por un nuevo péptido señal de baculovirus. El gen de fusión es introducido en un vector de expresión baculovírico de tal manera que el promotor de la polihedrina del baculovirus dirija la transcripción de las proteínas de fusión en las células de insecto infectadas. El péptido señal de baculovirus de 18 aminoácidos dirige la traducción del polipéptido de fusión HA-antígeno diana en la ruta de glicosilación de las células de insecto y no está presente en la proteína de fusión madura.
Por ejemplo, el plásmido pA9440, que contiene el gen de la HA de la cepa A/Beijing/32/92 en el plásmido de transferencia baculovírico pMGS12 descrito más adelante, fue utilizado como molde para la amplificación del gen de la HA mediante reacción en cadena de la polimerasa (PCR) utilizando el protocolo recomendado por el proveedor (Gene Amp PCR Cloning Kit, Perkin Elmer Cetus). La mezcla de la reacción de PCR (100 \mul) contenía 20 pmoles de cebadores diseñados para hibridar con porciones del gen de la HA. Los cebadores 5' y 3' fueron diseñados con sitios de endonucleasas de restricción en los extremos que no se encuentran en el gen de la HA. El cebador de PCR 5' (O-567) para los fragmentos HA0 y HA1 comienza 52 pares de bases corriente abajo del extremo 5' de las secuencias codificadoras del gen de la HA natural, eliminando la secuencia del péptido señal natural, y añade un sitio de SmaI inmediatamente 5' a las secuencias codificadoras de la HA. El cebador 5' de la PCR (O-651) para el fragmento HA2 comienza en el nucleótido 1108 del gen de la HA natural, inmediatamente después del codón que codifica el residuo de arginina que es eliminado durante el corte de HA0 para dar HA1 y HA2. El cebador 3' de la PCR (O-680) para los fragmentos HA0 y HA2 fue diseñado para que añadiera un sitio de KpnI inmediatamente después de las secuencias codificadoras de HA, eliminando el codón de parada natural. El cebador 3' de la PCR para HA1 (O-679) trunca el gen inmediatamente antes del residuo de arginina eliminado durante el corte de HA0. La amplificación del fragmento del gen de la HA se llevó a cabo durante 30 ciclos, consistiendo cada uno en 1 minuto a 94ºC para la desnaturalización, 2 minutos a 55ºC para la hibridación de los cebadores y 2 minutos a 72ºC para la extensión. Los fragmentos del gen de la HA amplificados resultantes fueron sometidos a electroforesis en geles de agarosa, purificados a partir del gel utilizando un kit GeneClean (Bio 101, Inc.) y ligados en un plásmido diseñado para aceptar fragmentos generados en PCR (pCRII; Invitrogen). De este modo, se obtuvieron los plásmidos pB142, pB144 y pB330, que contienen los fragmentos de los genes de la HA0, de la HA1 o de la HA2, respectivamente.
Los fragmentos del gen de la HA fueron extraídos de los plásmidos pB142, pB144 y pB330 con los enzimas de restricción SmaI y KpnI y subclonados posteriormente mediante técnicas estándar de ADN recombinante (Sambrook y col., 1989) en el plásmido pMGS12 de transferencia del AcNPV. El plásmido pMGS12 contiene, de 5' a 3', el promotor de la polihedrina del AcNPV, un codón de inicio ATG, la secuencia para un péptido señal susceptible de ser cortado de una glicoproteína de baculovirus de peso molecular 61.000 (61K), sitios de clonaje de los enzimas de restricción SmaI y KpnI y una secuencia de codón de parada universal TAA. Flanqueando estas secuencias reguladoras está un ADN del fragmento I de EcoRI del genoma de AcNPV (Summers y Smith, "A manual of methods for baculovirus vectors and insect cell culture procedures". Texas Agricultural Experimental Station Bulletin Nº 1555 (1987)). Los fragmentos de PCR de la HA clonados fueron escindidos del vector de clonaje pCRII con SmaI y KpnI, purificados mediante electroforesis en gel de agarosa y el kit GeneClean, y ligados en pMGS12 que había sido digerido también con SmaI y KpnI. Los plásmidos de transferencia de AcNPV resultantes, pB879, pB1201 y pB1205, contenían las regiones codificadoras de HA0, HA1 o HA2, respectivamente, ligadas en marco con el péptido señal de baculovirus susceptible de ser cortado del gen de 61K y el promotor de la polihedrina. Los plásmidos de transferencia del AcNPV pB879, pB1201 y pB1205 pueden ser utilizados para fusionar HA0, HA1 o HA2 a cualquier gen de interés.
Las segunda etapa en la construcción de plásmidos de transferencia de genes de fusión HA-CEA era insertar las secuencias codificadoras de CEA en las construcciones que codificaban HA. Sitios de reconocimiento/corte de endonucleasas de restricción para SmaI y KpnI fueron colocados en ambos extremos del gen de CEA mediante amplificación por PCR del plásmido pA9080. El cebador 5' de la PCR, O-649, comienza a 82 pares de bases del extremo 5' del gen, eliminando la secuencia peptídica señal de CEA natural. El cebador 3' de la PCR, O-650, fue diseñado para eliminar los últimos 72 pares de bases en el extremo 3' del gen que codifica la secuencia de la región C-terminal hidrofóbica. La amplificación del fragmento del gen de CEA se llevó a cabo durante 30 ciclos, consistiendo cada uno en 1 minuto a 94ºC para la desnaturalización, 2 minutos a 55ºC para la rehibridación y 2 minutos a 72ºC para la extensión. El fragmento del gen de CEA amplificado resultante fue sometido a electroforesis en un gel de agarosa, purificado con el procedimiento de GeneClean y ligado en pCRII (Invitrogen) de acuerdo con las instrucciones de los fabricantes. El plásmido resultante, pB806, contiene el gen de CEA sin su péptido señal natural, sin su dominio hidrofóbico C-terminal o sin su codón de parada, pero con los dos sitios de SmaI y KpnI en ambos extremos del gen.
Se produjo una preparación plasmídica a gran escala con el plásmido pB806, y el ADN fue digerido con SmaI o con KpnI. Los fragmentos que codificaban CEA fueron purificados mediante electroforesis en gel de agarosa y el kit GeneClean, y los fragmentos purificados fueron ligados en cada una de las tres construcciones que codificaban HA (pB879, pB1201 o pB1205) digeridas con el mismo enzima de restricción. Por ejemplo, fragmentos que codificaban CEA con extremos cortados por SmaI fueron ligados en las construcciones que codificaban HA0, HA1 y HA2 (pB879, pB1201 y pB1205, respectivamente) cortadas con SmaI para crear los plásmidos pB1250, pB1555 y pB1584, respectivamente. Los fragmentos que codificaban CEA con extremos cortados por KpnI fueron ligados en las construcciones que codificaban HA0, HA1 y HA2 cortadas con KpnI para crear pB1264, pB1564 y pB1593. La inserción del gen de CEA en el sitio de SmaI colocaba a las secuencias codificadoras de CEA corriente abajo de las secuencias codificadoras de HA. Para todas las construcciones, los cebadores de la PCR fueron diseñados de manera que el gen del CEA estuviera insertado en marco con HA, y que la traducción del gen de fusión fuera terminada en la señal de terminación de la traducción universal (TAATTAATTAA) (Secuencia ID Nº 4) en las secuencias del vector pMGS12 corriente abajo del sitio de KpnI.
Esta construcción puede ser mejorada por deleción de los aminoácidos intermedios, entre el péptido señal y HA0, según se describe más adelante, o bien entre HA0 y el gen de fusión, con el fin de incrementar el plegamiento y la inmunogenicidad.
Formulación y Envasado de las Vacunas
La rHA puede ser formulada y envasada, sola o en combinación con otros antígenos de la gripe, utilizando métodos y materiales conocidos por los expertos en la técnica de las vacunas de la gripe. En una realización preferida, proteínas HA de dos cepas A y de una cepa B son combinadas para formar una vacuna multivalente.
En una realización particularmente preferida, las HAs son combinadas con un adyuvante, en una cantidad eficaz para incrementar la respuesta inmunogénica frente a las proteínas HA. En este momento, el único adyuvante ampliamente utilizado en humanos ha sido el alumbre (fosfato de aluminio o hidróxido de aluminio). La saponina y su componente purificado Quil A, el adyuvante completo de Freund y otros adyuvantes utilizados en investigación y en aplicaciones veterinarias tienen toxicidades que limitan su uso potencial en vacunas para humanos. Sin embargo, nuevas preparaciones químicamente definidas tales como muramil dipéptido, monofosforil lípido A, conjugados de fosfolípidos tales como los descritos por Goodman-Snitkoff y col., J. Immunol., 147:410-415 (1991), la encapsulación de la proteína en un proteoliposoma según está descrito por Miller y col., J. Exp. Med., 176:1739-1744 (1992) y la encapsulación de la proteína en vesículas lipídicas tales como vesículas lipídicas Novasome™ (Micro Vesicular Systems, Inc., Nashua, NH) podrían ser también útiles.
En la realización preferida, la vacuna es envasada en una única dosis para inmunización mediante administración parenteral (esto es, intramuscular, intradérmica o subcutánea) o mediante administración nasofaríngea (esto es, intranasal). La dosificación eficaz es determinada según se describe en los ejemplos siguientes. El vehículo es normalmente agua o una solución salina tamponada, con o sin un conservante. El antígeno puede estar liofilizado para ser resuspendido en el momento de la administración, o puede estar en solución.
El vehículo puede ser también un sistema de liberación retardada polimérico. Los polímeros sintéticos son particularmente útiles en la formulación de una vacuna para llevar a cabo la liberación controlada de los antígenos. Un ejemplo temprano de esto fue la polimerización de metacrilato de metilo en esferas que tenían diámetros inferiores a una micra para formar las denominadas nanopartículas, descrito por Kreuter, J., Microcapsules and Nanoparticles in Medicine and Pharmacology, M. Donbrow (Ed.) CRC Press, p. 125-148. La respuesta de anticuerpos, así como la protección frente a la infección por el virus de la gripe fue significativamente mejor que cuando el antígeno fue administrado en combinación con hidróxido de aluminio. Experimentos con otras partículas han demostrado que el efecto adyuvante de estos polímeros depende del tamaño y la hidrofobicidad de las partículas.
La microencapsulación ha sido aplicada a la inyección de productos farmacéuticos microencapsulados para obtener una liberación controlada. Varios factores contribuyen a la selección de un polímero particular para la microencapsulación. La reproducibilidad de la síntesis del polímero y del proceso de microencapsulación, el coste de los materiales y del proceso de microencapsulación, el perfil toxicológico, los requisitos para una cinética de liberación variable y la compatibilidad fisicoquímica del polímero y los antígenos, son todos factores que deben ser tenidos en cuenta. Ejemplos de polímeros útiles son policarbonatos, poliésteres, poliuretanos, poliortoésteres y poliamidas, particularmente todos aquéllos que son biodegradables.
Una elección frecuente de vehículo para agentes farmacéuticos y más recientemente para antígenos es poli (d,l-láctido-co-glicólido) (PLGA). Éste es un poliéster biodegradable que tiene una larga historia de uso médico en suturas erosionables, en placas de hueso y en otras prótesis temporales, en las que no ha presentado ninguna toxicidad. Una amplia variedad de productos farmacéuticos, incluyendo péptidos y antígenos, ha sido formulada en microcápsulas de PLGA. Se ha acumulado un conjunto de datos sobre la adaptación del PLGA para la liberación controlada de antígenos, por ejemplo según ha sido revisado por Eldridge, J.H. y col., Current Topics in Microbiology and Immunology. 1989, 146:59-66. La inclusión de antígenos en microesferas de PLGA de 1 a 10 micras de diámetro, ha demostrado tener un notable efecto adyuvante cuando se administran oralmente. El proceso de microencapsulación en PLGA utiliza una separación de fases de una emulsión agua-en-aceite. El compuesto de interés es preparado como una solución acuosa y el PLGA es disuelto en solventes orgánicos adecuados tales como cloruro de metileno y acetato de etilo. Estas dos soluciones inmiscibles son coemulsionadas mediante agitación a alta velocidad. Posteriormente se añade un producto que no sea solvente del polímero, causando la precipitación del polímero alrededor de las gotitas acuosas para formar microcápsulas embrionarias. Las microcápsulas son recogidas y estabilizadas con alguno de una variedad de agentes (alcohol polivinílico (PVA), gelatina, alginatos, polivinilpirrolidona (PVP), metil celulosa) y el solvente es eliminado mediante secado in vacuo o por extracción del solvente.
La presente invención se comprenderá mejor por referencia a los ejemplos no limitantes siguientes.
Ejemplo 1 Propagación y Purificación de Virus de la Gripe
Las cepas para vacuna de la gripe siguientes fueron obtenidas de la FDA en fluido alantoideo de huevos de pollo:
Similar a A/Beijing/353/89 (H3N2)
Similar a A/Beijing/32/92 (H3N2)
Similar a A/Texas/36/91 (H1N1)
B/Panamá/45/90
Con el fin de propagar la cepa original del virus de la gripe obtenida de la FDA, células MDCK fueron infectadas en presencia de tripsina tratada con TPCK (Sigma Chemical Co., St. Louis, MO) y concentraciones de suero bovino fetal optimizadas para producir los títulos más elevados de virus en el primer pase. Las células MDCK fueron infectadas con las cepas de la gripe a una baja multiplicidad de infección (0,1 a 0,5) según se determinó mediante un ensayo estándar de HA (Rosen, "Hemagglutination with Animal Viruses" en Fundamental Techniques in Virology, ed. K. Habel y N.P. Salzman, pp. 276-28 (Academic Press, New York, 1969)). Las células infectadas fueron incubadas a 33ºC durante 48 horas, y los medios fueron analizados para determinar la producción de virus utilizando el ensayo de actividad de hemoaglutinación. Las condiciones que produjeron la actividad más elevada de HA fueron utilizadas para preparar soluciones madre grandes del virus de la gripe. Las concentraciones óptimas de tripsina tratada con TPCK y de suero bovino fetal para los virus de la gripe anteriores están enumeradas en la Tabla 1.
TABLA 1 Concentración Óptima de Tripsina Tratada con TPCK y de Suero Bovino Fetal
A/Beijing/353/89 A/Beijing/32/92 A/Texas/36/91 B/Panamá/45/90
% Suero Bovino Fetal 0,25% 0,25% 0,25% 5,0%
Cantidad de Tripsina
Tratada con TPCK 45 \mug/ml 45 \mug/ml 45 \mug/ml 3 \mug/ml
Purificación del Virus de la Gripe: El virus fue recogido 24-48 horas después de la infección de 10 frascos de cultivo de tejidos T175 mediante clarificación de los medios (1.000 x g durante 10 minutos) de las células MDCK infectadas con el virus de la gripe. El virus fue aglutinado de los medios a 100.000 x g durante 1 hora. El aglutinado de virus resultante fue resuspendido en 1 ml de solución salina tamponada con fosfato (PBS) pH 7,4 y centrifugado a través de 20 ml de un gradiente de sacarosa 20-60% (p/v) en PBS. La banda de virus de la gripe fue recogida de la región de sacarosa 40-45% del gradiente, diluida con PBS y aglutinada a 100.000 x g. La pella de virus purificados fue resuspendida en 0,5 ml de PBS y almacenada a -70ºC.
Ejemplo 2 Clonaje del Gen de la HA del Virus de la Gripe A/Texas/36/91
Un ejemplo específico de la etapa de clonaje de uno de los genes de la HA de la gripe está mostrado en la Figura 2. El ARN del virus fue extraído según se describió anteriormente del virus de la gripe A/Texas/36/91, obtenido del CDC. Se utilizó el cebador universal complementario al extremo 3' de segmentos de ARN de la gripe,
5'-AGCAAAAGCAGG-3' (SEC ID Nº 1), con transcriptasa inversa del Virus de la Leucemia de Maloney Murino (M-MuLV) para producir ADNcs de la gripe. Se utilizó ARN o ARNm vírico purificado (5 \mug) como molde para producir ADNc utilizando la transcriptasa inversa de M-MuLV suministrada en el kit "First-Strand cDNA Synthesis Kit" de Pharmacia Inc. El cebador utilizado para el ADNc del ARN vírico de cepas de la gripe A fue un cebador oligonucleotídico sintético (5'-AGCAAAAGCAGG-3') (SEC ID Nº 1), que es homólogo al extremo 3' de todos los segmentos del gen de la HA de los viriones.
La amplificación de los genes de la HA a partir del ADNc fue realizada mediante la reacción en cadena de la polimerasa (PCR) utilizando condiciones estándar de reacción (Gene Amp Kits; Cetus/Perkin Elmer, Norwalk, CT). La mezcla de la reacción de PCR (100 \mul) contenía 20 pmoles de cebadores específicos para los extremos 5' y 3' del gen de la HA de las cepas de la gripe A (H3) o A (H1) o de la cepa de la gripe B, según se determinó por las secuencias consenso encontradas en los archivos de datos de ADN del GenBank, según se muestra en la Tabla 2. La amplificación se llevó a cabo durante 30 ciclos, constando cada ciclo de 1 minuto de desnaturalización a 94ºC, 2 minutos a 55ºC para la rehibridación y 3 minutos a 72ºC para la extensión. Los productos de la PCR fueron analizados en geles de agarosa al 0,8% para determinar el tamaño correcto antes del clonaje.
Cebadores de PCR del extremo 5' del gen de la HA: 5'-GGG GGT ACC CCC GGG AGC AAA AGC AGG GGA AAA TAA AAA-3' (SEC ID Nº 2) y del extremo 3' del gen de la HA: 5'-GA AAC GTC ACG TCT TAT ACG/T TAG/T ACT CCA TGG CCC-3' (SEC ID Nº 3) fueron utilizados en la PCR para producir el gen de la HA de longitud completa.
Se diseñó un nuevo cebador 5' de la PCR a partir del extremo 5' del gen: extremo 5' menos la secuencia señal: 5'-GGG GGT ACC CCC GGG GAC ACA ATA TGT ATA GGC TAC CAT-3' (SEC ID Nº 4) y a partir del extremo 3' del gen: 5'-GA AAC GTC ACG TCT TAT ACG/T TAG/T ACT CCA TGG CCC-3' (SEC ID Nº 5). Éstos fueron utilizados en PCR para producir el gen de la HA menos la secuencia del péptido señal. Éste fue insertado posteriormente en el vector TA cortado con KpnI. El péptido señal 61K para la expresión de baculovirus y el promotor de la polihedrina fueron insertados posteriormente en el vector TA que contenía el gen de la HA menos la secuencia del péptido señal de la gripe. El vector de recombinación baculovírico resultante contiene el promotor de la polihedrina, el péptido señal de baculovirus 61K y el gen de la HA del virus de la gripe A/Texas/36/91.
Los genes de la HA de las cepas de la gripe B fueron clonados a partir de ARN mensajero (ARNm) total extraído de células MDCK infectadas con el virus de la gripe B de la cepa B/Panamá/45/90. El ARN total fue preparado a partir de 5 frascos T175 de células infectadas. Las células recogidas fueron lisadas en presencia de tiocianato de guanidinio y el ARN celular total fue purificado según se describió anteriormente. El ARNm total fue extraído del ARN celular utilizando columnas de centrifugación de Oligo-(dT)-celulosa según se describió anteriormente.
El cebador utilizado para el ARNm de las cepas de la gripe B fue un cebador oligonucleotídico de ADN aleatorio (Pharmacia, Inc.).
TABLA 2 Cebadores Utilizados para la Amplificación por PCR
100 
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101 
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102
Un ejemplo de los productos de síntesis de ADNc utilizó como molde ARN vírico del virus de la gripe A/Texas/36/
91. La ubicación de los segmentos de ADNc que codifican las proteínas de la gripe podría ser determinada según sigue. El ARN vírico purificado fue combinado en la mezcla de reacción con el cebador de ADN de hebra sencilla universal 5'-AGCAAAAGCAGG-3' (SEC ID Nº 1). Este cebador es complementario al extremo 3' de los segmentos de los viriones de la gripe, según se describió anteriormente. La reacción contenía también la adición de [\alpha-^{32}P]dCTP para visualizar los productos de ADNc que fueron separados en un gel de hidrólisis alcalina al 1,5% (Maniatis y col., 1982) y expuestos a una película X-OMAT-AR.
Ejemplo 3 Clonaje de los Genes de la HA en Plásmidos Bacterianos
Los genes de la rHA amplificados por PCR fueron clonados en un vector plasmídico similar a pUC utilizando el Sistema de Clonaje TA (Invitrogen, Inc.). La presencia de genes de la HA fue verificada mediante análisis de los digestos de enzimas de restricción del ADN plasmídico purificado mediante procedimientos estándar (Maniatis y col., 1982). Los extremos 5' de los genes de la rHA fueron analizados posteriormente mediante secuenciación del ADN y se diseñaron nuevos cebadores para eliminar las secuencias que codificaban los péptidos señal hidrofóbicos en el extremo N de las proteínas HA. Los cebadores oligonucleotídicos 5' y 3' específicos enumerados en la Tabla 2 fueron utilizados posteriormente para amplificar los productos ADNc mediante PCR y clonados en vectores plasmídicos TA de E. coli (Invitrogen, Inc.) utilizando métodos estándar de clonaje. Los clones de ADN resultantes contenían secuencias codificadoras de las HAs maduras.
Los genes de la rHA de A/Texas/36/91, A/Beijing/353/89, A/Beijing/32/92 y B/Panamá/45/90 fueron subclonados mediante procedimientos estándar (Maniatis y col., 1982) en vectores de expresión baculovíricos. Los genes de la HA fueron extraídos de los plásmidos de clonaje TA con los enzimas de restricción apropiados y el fragmento de ADN de la HA purificado fue insertado en un plásmido de recombinación de baculovirus. Los clones bacterianos resultantes fueron sometidos a selección por resistencia a ampicilina y posteriormente cortados con enzimas de restricción para liberar el gen de la HA insertado con el fin de confirmar su presencia. Los plásmidos de recombinación que contenían genes de la HA fueron purificados en gradientes de cloruro de cesio-bromuro de etidio (Maniatis y col., 1982). Los extremos 5' de los plásmidos fueron secuenciados para determinar la presencia de las señales correctas de baculovirus (promotor de la polihedrina de AcNPV, señal de inicio de la traducción ATG y secuencia del péptido señal de baculovirus) y de la secuencia codificadora de HA apropiada en el marco de lectura correcto. Las secuencias de ADN del extremo 5' de los genes de la HA y las secuencias flanqueantes del promotor de la polihedrina de AcNPV y del péptido señal de baculovirus (18 primeros aminoácidos de cada secuencia de aminoácidos) están mostradas como LISTADOS DE SECUENCIAS.
La SEC ID Nº 6 codifica la secuencia del extremo 5' del gen de la HA de A/Beijing/32/92 (rango de la secuencia 1-481). La SEC ID Nº 7 es la secuencia de aminoácidos correspondiente (que comienza en el codón de inicio "ATG" [nucleótido 21] de la SEC ID Nº 6). La secuencia de aminoácidos del péptido señal 61K está mostrada en la SEC ID Nº 7 como los aminoácidos 1-18.
La SEC ID Nº 8 codifica la secuencia del extremo 5' del gen de la HA de A/Texas/36/91 (rango de la secuencia 1-481). La SEC ID Nº 9 es la secuencia de aminoácidos correspondiente (que comienza en el codón de inicio "ATG" [nucleótido 21] de la SEC ID Nº 8). La secuencia de aminoácidos del péptido señal 61K está mostrada en la SEC ID Nº 9 como los aminoácidos 1-18.
La SEC ID Nº 10 codifica la secuencia del extremo 5' del gen de la HA de B/Panamá/45/90 (rango de la secuencia 1-434). La SEC ID Nº 11 es la secuencia de aminoácidos correspondiente (que comienza en el codón de inicio "ATG" [nucleótido 21] de la SEC ID Nº 10). La secuencia de aminoácidos del péptido señal 61K está mostrada en la SEC ID Nº 11 como los aminoácidos 1-18.
En las SEC ID N^{os} 6, 8 y 10, los nucleótidos 1-20 son el extremo 3' del promotor de la polihedrina, los nucleótidos 21-74 codifican el péptido señal 61K y los nucleótidos 75 hasta el final codifican el extremo 5' del gen de la
HA.
Ejemplo 4 Expresión de la HA Recombinante en Células de Insecto
Los plásmidos de recombinación quiméricos que contenían genes de la HA clonados fueron purificados y se mezclaron 2 \mug con 1 \mug de ADN del AcNPV de tipo salvaje. Los ADNs fueron coprecipitados con calcio y transfectados a células de S. frugiperda utilizando procedimientos estándar (Smith, Summers y Fraser, Mol. and Cell. Biol., 3:2156-2165 (1983)). Los baculovirus recombinantes fueron identificados sobre la base de la morfología de las placas, posteriormente fueron además purificados mediante ciclos adicionales de purificación de placas. Los baculovirus recombinantes purificados por la técnica de purificación de placas fueron sometidos a selección por la expresión de la rHA y se seleccionó un único vector de expresión baculovírico para el desarrollo posterior.
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Células de S. frugiperda fueron infectadas con un vector baculovírico que contenía el gen de la HA de la cepa del virus de la gripe B/Panamá/45/90. A las 24, 48 y 72 horas después de la infección, 1 x 10^{6} células fueron sometidas a un pulso de 25 \muCi de [^{35}S]metionina durante 15 minutos con el fin de marcar las proteínas que estaban siendo sintetizadas. Se recogieron las células y se separaron las proteínas en un gel de poliacrilamida al 11% en presencia de SDS al 0,1%. Las proteínas radiomarcadas fueron detectadas por exposición a una película X-OMAT-AR. La posición de los estándares de proteína y su tamaño en kilodaltons (kd) indicaban que la proteína HA recombinante de 85 kd era una de las proteínas principales que estaba siendo sintetizada en las células a las 48 horas y a las 72 horas después de la infección.
Ejemplo 5 Producción y Purificación de HA Recombinante
El vector de expresión baculovírico A8611, que contiene el gen de la gripe A/Beijing/353/89, producido esencialmente según se describió anteriormente para la hemaglutinina de A/Beijing/32/92 bajo el control del promotor de la polihedrina, fue utilizado para infectar células de S. frugiperda. Las células fueron cultivadas a 27ºC a una densidad de 1 x 10^{6} células/ml en medio TNMFH (Gibco BRL, Gaithersburg, MD) suplementado con un 10% de suero bovino fetal, e infectadas a una multiplicidad de infección (MOI) de 1 con el baculovirus recombinante A8611. Durante la infección, la hemaglutinina de la gripe A/Beijing/353/89 se produce bajo el control transcripcional del promotor de la polihedrina del baculovirus. Las células son recogidas 72 horas después de la infección por centrifugación durante 15 minutos a 3.400 x g y lavadas por resuspensión en medio TNMFH sin suero, seguido por centrifugación durante 30 minutos a 10.400 x g. Se decanta el sobrenadante y los aglutinados de células infectadas son almacenados a
-70ºC.
Se desarrolló un proceso en el cual la HA recombinante era extraída selectivamente de las células infectadas bajo condiciones que no desnaturalizaban el antígeno. A no ser que se indique de otro modo, todas las etapas de extracción se llevaron a cabo a 4ºC. La pella celular procedente de 0,5 l de cultivo (5 x 10^{8} células aproximadamente) fue sometida a ruptura durante 2 minutos en 40 ml de Tris-HCl 30 mM, pH 8,4, LiCl 25 mM, Tween-20 1% (v/v), 1 mg/ml de leupeptina, enfriado en hielo, utilizando un homogeneizador Polytron™ (Brinkmann Instruments Inc., Westbury, NY). El homogenado fue centrifugado durante 30 minutos a 9.200 x g. Se desechó el sobrenadante y se recogió la pella. Esta etapa elimina las proteínas solubles y de las membranas periféricas de las células de insecto sin extraer las proteínas de las membranas estructurales como la rHA. Para extraer la rHA, la pella fue homogeneizada durante 2 minutos con el homogeneizador en la posición 4, en 40 ml de Tris 30 mM, etanolamina 10 mM, pH 11, LiCl 25 mM, Tween-20 2%, enfriado en hielo. Después de una incubación de 60 minutos sobre hielo, el pH del homogenado fue ajustado a 8,4 con HCl 1 N, y el material insoluble fue eliminado por centrifugación durante 30 minutos a 9.200 x g. El sobrenadante que contenía la rHA soluble fue decantado y se comprobó el pH y, si era necesario, se ajustó a 8,4 a temperatura ambiente. El material insoluble fue resuspendido en 40 ml de agua para análisis. La proteína HA de las membranas estructurales fue solubilizada bajo las condiciones de pH elevado, detergente Tween-20, y permanecía en solución después de disminuir el pH.
Las proteínas fueron analizadas mediante electroforesis en gel de SDS poliacrilamida. Las muestras fueron sometidas a ruptura en un baño de agua en ebullición durante 10 minutos en presencia de dodecil sulfato de sodio (SDS) al 2% y beta-mercaptoetanol al 5%, posteriormente sometidas a electroforesis en un gel de poliacrilamida al 11% en presencia de SDS al 0,1% y teñidas luego con Azul de Coomassie.
Se desarrolló un proceso de purificación cromatográfica para purificar la HA recombinante que tuvo como resultado un antígeno HA recombinante, altamente purificado, que no estaba desnaturalizado y que era adecuado como componente de una vacuna de la gripe para uso humano. Se utilizó el procedimiento siguiente para purificar la HA de A/Beijing/353/89 a partir de células de S. frugiperda infectadas con el virus recombinante A8611.
La matrices de gel para cromatografía utilizadas para purificar la HA a partir de 0,5 l de células de S. frugiperda infectadas fueron: 30 ml de DEAE Sepharose Fast Flow® de Pharmacia (en una columna C16/20 de Pharmacia) y 4 ml de Sepharose 4B® Lectina de Lenteja de Pharmacia (en una columna C10/10 de Pharmacia). La salida de la columna de DEAE está conectada con la entrada de la columna de lectina de lenteja, y el extracto de células S/N 2 preparado según se describió anteriormente fue aplicado a las columnas acopladas a una velocidad de flujo de 1 ml/minuto. Las columnas fueron lavadas con Tris-HCl 30 mM, pH 8,4, LiCl 25 mM, Tween-20 0,5% hasta que la absorción UV a 280 nm del efluente de la columna de lectina de lenteja retornó a la línea base. Bajo estas condiciones, las mayoría de las proteínas contaminantes se unen a la DEAE, pero la HA recombinante fluye a través de la columna. Los contaminantes restantes pasan a través de la columna de lectina y la rHA glucosilada se une a la matriz de afinidad de lectina de lenteja. La columna de DEAE es desconectada y se lava la columna de lectina con otros 40 ml de Tris-HCl 30 mM, pH 8,4, LiCl 25 mM, Tween-20 0,5%. A continuación, la columna de lectina es lavada con 40 ml de Tris-HCl 30 mM, pH 8,4, LiCl 25 mM, desoxicolato de sodio (DOC) 0,4% (v/v). Esta etapa sustituye el detergente Tween-20 por un detergente como DOC que puede ser eliminado de la proteína mediante diálisis. La HA recombinante es eluida posteriormente de la columna de lectina con 20 ml aproximadamente de 40 ml de Tris-HCl 30 mM, pH 8,4, LiCl 25 mM, desoxicolato de sodio 0,4% (v/v) conteniendo a-D-metil manósido 0,3 M. Los resultados son analizados mediante PAGE al 11%.
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Debido a la variabilidad genética de las proteínas HA de la gripe, los detalles del proceso anterior de purificación pueden variar con cada proteína HA recombinante particular. Por ejemplo, la rHA puede unirse a la columna de intercambio iónico de DEAE en lugar de fluir a través de la misma. Si esto ocurriera, la rHA sería extraída de la columna de DEAE mediante lavado de la columna con un tampón conteniendo una concentración mayor de LiCl, NaCl o de otras sales.
Para eliminar el detergente DOC y otros componentes del tampón, el eluato procedente de la columna de lectina que contenía la rHA purificada fue dializado frente a solución salina tamponada con fosfato, pH 7,5 (PBS). La HA recombinante purificada era al menos un 95% pura, según se determinó mediante análisis en geles de SDS poliacrilamida.
Ejemplo 6 Análisis de la Resistencia a Proteasas de la rHA
La HA madura se ensambla en estructuras triméricas que son resistentes a una variedad de proteasas, incluyendo tripsina, que degradan monómeros de HA (Murphy y Webster, 1990). La resistencia al tratamiento con tripsina puede ser utilizada por tanto como un ensayo para determinar la formación de trímeros funcionales. Se utilizó el procedimiento siguiente para estudiar la resistencia de la rHA al tratamiento con proteasas.
Dos alícuotas de rHA purificada (A/Beijing/353/89) a 60 \mug/ml fueron incubadas sobre hielo durante 30 minutos en Tris-HCl 30 mM, pH 8,4, NaCl 150 mM, en presencia y ausencia de 50 \mug/ml de tripsina tratada con TPCK. La reacción fue parada por la adición de fluoruro de fenil metil sulfonilo 57,4 mM en isopropanol hasta una concentración final de 1 mM. Alícuotas de cada muestra fueron desnaturalizadas por ebullición en SDS al 3% bajo condiciones reductoras, sometidas a electroforesis en geles de poliacrilamida al 11,5% y transferidas a filtros de nitrocelulosa utilizando procedimientos estándar de Transferencia Western. Los polipéptidos de HA fueron detectados utilizando suero anti-HA de cobayo preparado contra la rHA purificada y un conjugado de anti-IgG de cobayo producido en cabra con fosfatasa alcalina.
La rHA no tratada migra al tamaño del precursor de la HA (HA0). El tratamiento con proteasa tiene como resultado dos bandas principales que migran a los tamaños pronosticados para la hemaglutinina HA1 y HA2 de la gripe. Los resultados muestran que la tripsina corta la proteína rHA una vez para producir dos polipéptidos que tienen los tamaños pronosticados para HA1 y HA2. No tiene lugar un procesamiento proteolítico posterior. Estos resultados demuestran que la rHA purificada mediante el proceso anterior es resistente a la degradación por la proteasa. Esta propiedad es consistente con el hecho de que la rHA purificada esté en forma de trímeros.
Ejemplo 7 Inmunogenicidad de la rHA Utilizando un Ensayo de Potencia en Ratón Estandarizado
Un procedimiento para medir la inmunogenicidad de un antígeno es determinar la cantidad necesaria para inducir una respuesta de anticuerpos detectable en ratones (ensayo de potencia en ratón). Se utilizó un ensayo de potencia en ratón estandarizado para medir la inmunogenicidad de la vacuna de rHA0. Grupos de 5-10 ratones son inmunizados una vez con la vacuna que contenía diluciones seriadas de rHA, esto es, 0,500 \mug, 0,1 \mug, 0,02 \mug y 0,004 \mug de rHA purificada. Se recogen sueros 28 días después de la inmunización y se miden los anticuerpos contra el antígeno rHA mediante un ensayo inmunológico en fase sólida con un enzima unido (ELISA) estándar en placas de microvaloración de 96 pocillos. Un ratón se ha seroconvertido si la DO450 a una dilución 1:100 del antisuero del día 28 es mayor que tres desviaciones estándar sobre la media de la DO450 del suero preinmune del ratón. La dosis eficaz de vacuna necesaria para seroconvertir el 50% de los ratones (DE50) es una medida de la inmunogenicidad del antíge-
no.
Por ejemplo, cuatro grupos de 10 ratones son inmunizados una vez con 0,1 \mug, 0,02 \mug, 0,004 \mug o 0,0008 \mug (diluciones de 5 veces) de vacuna de rHA0. Los sueros son recogidos 28 días después de la inmunización y medidos frente a cada antígeno rHA0 de la vacuna para determinar la seroconversión en un ensayo de ELISA. Se calcula la dosis necesaria para seroconvertir el 50% de los ratones (DE_{50}) y se establece una DE_{50} mínima para cada antígeno rHA0.
Datos preliminares muestran que una única dosis de 0,004 \mug de rHA0 seroconvertirá a al menos el 50% de los ratones.
Ejemplo 8 Administración de rHA en Combinación con un Adyuvante y Comparación con las Vacunas de la Gripe Disponibles
Se analizó la potencia en ratón de rHA purificada del virus de la gripe A/Beijing/353/89 con alumbre o sin alumbre (pura) y se comparó con una vacuna de la gripe comercial, FLUZONE® (Connaught Laboratories, Inc., Swiftwater, PA) que contiene la cepa A/Beijing/353/89 de la gripe. La vacuna fue administrada en una dosis de 0,5 \mug, 0,1 \mug, 0,02 \mug y 0,04 \mug. Los ratones fueron reforzados el día 28 con las dosis de rHA purificada anteriormente descritas. El día 42 se recogieron los sueros y se titularon en un ensayo de ELISA para determinar los anticuerpos IgG
anti-HA.
Los resultados están mostrados en la Figura 3. En ausencia de adyuvante, solamente una dosis de 0,5 \mug indujo la producción de un título significativo de anticuerpos (200.000). En presencia de adyuvante, dosis tan pequeñas como de 0,004 \mug de rHA0 produjeron un título de anticuerpos significativo. Los animales inmunizados con rHA (pura) produjeron aproximadamente los mismos niveles de anticuerpos anti-HA que la vacuna comercial. El alumbre incrementó la inmunogenicidad de la rHA, y se generaron títulos de anti-HA que eran 10 o más veces los producidos sin adyuvante.
En resumen, la comparación de la inmunogenicidad de las rHA0s purificadas con una vacuna de viriones completos de la gripe (FLUZONE®, Connaught Laboratories, Inc., Swiftwater, PA), demuestra que la rHA0 produce una respuesta inmune similar en ratones a lo largo de un periodo de 42 días. La adsorción de la rHA0 al alumbre incrementa significativamente la inmunogenicidad de la rHA0 purificada en ratones, según se midió mediante el ensayo descrito en el Ejemplo 7. La combinación con alumbre produce un número de anticuerpos IgG hacia hemaglutinina que es más elevado que el producido por las vacunas de la gripe Fluzone®.
Ejemplo 9 Estudios de Inhibición de la Hemoaglutinación
Los anticuerpos de inhibición de la hemoaglutinación (IHA) se unen a tres de cuatro epítopos conocidos de la hemaglutinina y bloquean la capacidad del virus de la gripe para aglutinar los glóbulos rojos sanguíneos (Wilson y col., "Structure of the hemagglutinin membrane glycoprotein of influenza virus at 3\ring{A} resolution". Nature, 289:366-378 (1981)). Estos determinantes antigénicos están agrupados alrededor del sitio de unión al receptor ácido siálico en los trímeros de hemaglutinina. Anticuerpos hacia estos sitios neutralizarán la infectividad del virus (Weis y col., "Structure of the influenza virus hemagglutinin complexed with its receptor, sialic acid" Nature, 333:426-431 (1988)). El título y la especificidad de los anticuerpos IHA son una medida importante del potencial de una vacuna de la gripe para proteger frente a la infección por cepas similares y relacionadas del virus de la gripe.
Se llevaron a cabo estudios en ratones que comparaban la capacidad de la rHA0 purificada de A/Beijing/353/89 y de FLUZONE® (Connaught Laboratories, Inc., Swiftwater, PA) para inducir la producción de anticuerpos IHA. Grupos de 5 ratones fueron inyectados los días 0 y 28 con 0,5 \mug, 0,1 \mug, 0,02 \mug o 0,004 \mug de rHA0 o con tres veces estas cantidades de hemaglutinina de FLUZONE®, de tal manera que se administraron niveles iguales de hemaglutinina de A/Beijing/353/89 vírica o recombinante. Por ejemplo, los ratones del grupo de la dosis más elevada fueron inmunizados con 1,5 \mug de hemaglutinina de FLUZONE® (0,5 \mug de hemaglutinina de cada cepa) y 0,5 \mug de rHA0. La presencia de antígeno hemaglutinina adicional en la vacuna FLUZONE® procedente de las otras dos cepas de la gripe puede tener como resultado ciertos anticuerpos con reactividad cruzada.
Los anticuerpos anti-hemaglutinina (IgG hacia hemaglutinina) fueron medidos en un ELISA estándar con diluciones frente a rHA0 purificada. Los anticuerpos IHA fueron medidos frente a 4 unidades de hemaglutinina de los antígenos siguientes: virus de la gripe A/Beijing/353/89 completo (A/Bei), antígeno rHA0 purificado de A/Beijing/353/89 y FLUZONE®. El título de IHA es el recíproco de la dilución más elevada de antisuero que inhibe la aglutinación de glóbulos rojos sanguíneos de pollo en un 50%.
La Tabla 3 resume los títulos séricos de IgG frente a hemaglutinina y de IHA en los ratones el día 42. Se produjeron niveles elevados de anticuerpos anti-hemaglutinina con la vacuna de rHA0 recombinante. Estos títulos diez veces mayores aproximadamente que los obtenidos con FLUZONE®. Es muy significativo que la vacuna de rHA0 produjera buenos títulos de anticuerpos que bloqueaban la aglutinación de los glóbulos rojos sanguíneos por el virus A/Beijing/353/89 y los antígenos rHA0. Por tanto, la vacuna de rHA0 producía anticuerpos IHA que reconocían igualmente bien el inmunógeno y el virus de la gripe A/Beijing. Los títulos de IHA más bajos frente a FLUZONE® pueden ser debidos a la incapacidad de los antisueros para bloquear la aglutinación por las otras dos cepas de hemaglutinina de la vacuna FLUZONE®. En contraste, los ratones inmunizados con FLUZONE® producían un título elevado de anticuerpos IHA cuando se midieron solamente frente a ella misma. Los títulos de IHA frente al virus de la gripe A/Beijing/353/89 y frente al antígeno rHA0 estaban considerablemente reducidos. Se observaron patrones similares en los ratones de los grupos de dosis menores.
TABLA 3 Títulos de IHA Frente a rHA0 y FLUZONE®
rHA0 de A/Bei /(día 42) FLUZONE® (día 42)
IgG hacia HA IHA IgG hacia HA IHA
# Ratón rHA0 A/Bei rHA0 FLUZONE rHA0 A/Bei rHA0 FLUZONE
1 4.096.000 1.920 960 15 256.000 <10 <10 600
2 4.096.000 480 480 15 512.000 120 120 600
3 8.192.000 1.920 960 15 256.000 60 60 300
4 4.096.000 960 960 30 128.000 30 30 400
5 4.096.000 1.920 960 60 512.000 80 80 400
Media 4.915.000 1.440 864 27 332.800 58 58 460
Estos datos sugieren también que existen diferencias genéticas entre la cepa del virus de la gripe A/Beijing/353/89 de la FLUZONE® y esta misma cepa del virus de la gripe obtenida de la FDA y pasada una vez en huevos antes de ser utilizada en el ensayo de IHA. El hecho de que los anticuerpos producidos en respuesta a la HA0 recombinante clonada a partir del virus de la gripe A/Beijing/353/89 bloqueen la aglutinación de los glóbulos rojos sanguíneos producida por esta cepa de la gripe así como por ella misma, es una buena prueba de que no hubo ningún cambio genético durante el proceso de clonaje que afectara al sitio de unión al receptor ácido siálico del antígeno rHA0 purificado.
Ejemplo 10 Formulación y Eficacia Clínica de una Vacuna de la Gripe de 1993/1994
Se llevaron a cabo una serie de ensayos clínicos en humanos con el fin de caracterizar la seguridad y la inmunogenicidad en humanos de una vacuna de la gripe experimental que contenía HA recombinante, y para obtener datos preliminares concernientes a la eficacia protectora de tal vacuna frente a la infección natural durante una temporada epidémica. Los resultados demuestran que las vacunas que contenían la hemaglutinina de la gripe recombinante (rHA0), producidas de acuerdo con los métodos descritos en la presente, causaban sorprendentemente menos reacciones adversas locales y proporcionaban una respuesta inmune protectora equivalente o superior cuando se comparaban con una vacuna de la gripe atenuada autorizada, comercialmente disponible, producida en huevos.
Materiales y métodos
Vacunas. Las vacunas de HA recombinante utilizadas en este estudio contenían la glicoproteína HA de longitud completa no cortada (HA0) del virus de la gripe A/Beijing/32/92 (H3N2). La HA0 recombinante (rHA0) fue producida en cultivos de células de lepidóptero (insecto) después de la exposición a un vector baculovírico que contenía insertos de ADNc que codificaban el gen de la HA. La proteína expresada fue purificada bajo condiciones no desnaturalizantes hasta >95%, según se midió por densitometría de barrido cuantitativa del antígeno en masa sometido a electroforesis en geles de dodecil sulfato de sodio-poliacrilamida. La identidad del péptido fue confirmada por análisis de aminoácidos, secuenciación N-terminal y análisis de Transferencia Western con sueros anti-gripe A/Beijing/32/92. Las vacunas de rHA0 contenían una cantidad especificada del antígeno HA sintético disuelta en solución salina tamponada con fosfato o adsorbida al adyuvante fosfato de aluminio (alumbre) en forma de una suspensión gelificada. La vacuna de subviriones trivalente autorizada utilizada en este estudio contenía 15 \mug/dosis de cada una de las HAs procedentes de los virus de la gripe A/Texas/36/91 (H1N1), A/Beijing/32/92 (H3N2) y B/Panamá/45/90 (vacuna de la gripe atenuada FLUZONE® producida en huevos, Connaught Laboratories, Swiftwater, PA).
Estudios Clínicos. Protocolos de estudio idénticos fueron aprobados por los Institutional Review Boards of Saint Louis University y de la University of Rochester. Se inscribieron en ambas instituciones adultos sanos de 18 a 45 años de edad. Los sujetos fueron asignados aleatoriamente para recibir una de las cinco preparaciones de vacuna siguientes de forma doble ciego: (1) 15 \mug de rHA0, (2) \mug de rHA0 más alumbre, (3) 90 \mug de rHA0, (4) vacuna de la gripe inactivada trivalente autorizada o (5) solución salina placebo. Las vacunas fueron administradas mediante inyección intramuscular en un volumen de 0,5 ml. Con el fin de permitir una determinación inicial de la seguridad de las tres preparaciones de vacuna que contenían rHA0, los primeros 25 sujetos que iban a ser vacunados fueron aleatorizados (esto es, 5 personas por cada sección del estudio) independientemente de los demás sujetos y monitorizados estrechamente por contacto telefónico durante las 48 horas siguientes a la vacunación antes de proceder con las vacunaciones restantes. Todos los sujetos fueron instruidos para que rellenaran una ficha diaria informando de reacciones adversas, incluyendo síntomas locales y sistémicos, durante los primeros 6 días después de la vacunación. Los síntomas fueron clasificados por el propio individuo como de naturaleza leve, moderada o grave. Se tomaron las temperaturas orales y se registraron por los participantes si se encontraban febriles. Si estaban presentes una inflamación o un eritema localizado en el lugar de la inyección fueron clasificados siguiendo el criterio de si el área era menor que, o mayor que, el tamaño de una moneda de cuarto de dólar en diámetro, respectivamente. Todas las vacunaciones se realizaron durante la última semana de Noviembre y la primera semana de Diciembre de 1993. Se obtuvieron especímenes de suero de cada sujeto en el momento de la vacunación, 3 semanas después de la vacunación y una vez más a finales de Marzo o en Abril de 1994, al menos de 2 a 3 semanas después de que los virus de la gripe dejaran de circular en las comunidades locales. Los voluntarios de cada institución fueron instruidos para que contactaran con el centro de estudio si experimentaban una enfermedad similar a la gripe durante la temporada epidémica de gripe de invierno. Se definió una enfermedad similar a la gripe como la presencia de cualquier síntoma(s) respiratorio(s) de dos o más días de duración acompañado(s) por fiebre y/o síntomas sistémicos de mialgias o escalofríos. De los sujetos que informaron de síntomas similares a la gripe se obtuvieron muestras nasales y nasofaríngeas con un bastoncillo de algodón para el cultivo y la identificación del virus. A los especímenes clínicos se les dio un número de identificación codificado y se procesaron de manera ciega.
Serología. Para cada tipo de ensayo serológico, todos los especímenes procedentes de las dos instituciones fueron analizados en un lote por un único laboratorio. Se midieron anticuerpos inhibidores de la hemoaglutinación (IHA) hacia el antígeno del virus de la gripe A/Beijing/32/93 (H3N2) en los sueros mediante un ensayo de microvaloración estándar, después de la eliminación del inhibidor no específico con enzimas destructores del receptor y de las aglutininas frías por hemoadsorción a 4ºC. El título fue definido como la mayor dilución del suero que impedía completamente la hemoaglutinación por 4 unidades de antígeno del virus, utilizando 1:4 como la dilución de partida. Los anticuerpos séricos inmunoglobulina G (IgG) específicos de HA fueron medidos por un ensayo sobre inmunoabsorbente con enzima unido (ELISA), utilizando como antígeno de revestimiento rHA0 purificada del virus de la gripe A/Beijing/32/92 (H3N2). La secuencia de los reactivos de la fase sólida hacia fuera consistía en (1) antígeno rHA0 purificado, (2) espécimen de suero, (3) anti-IgG humana de cabra conjugado a fosfatasa alcalina y (4) el sustrato p-nitrofenil fosfato disódico. El título del ELISA fue expresado como la dilución más elevada a la que la densidad óptica del pocillo que contenía antígeno era al menos el doble que la del pocillo control correspondiente sin antígeno. Los anticuerpos neutralizantes fueron medidos utilizando el ensayo de microneutralización previamente descrito por Treanor, J.J. y Betts, R.F., J. Infect. Dis., 168:455-459 (1993). Brevemente, diluciones seriadas de los sueros inactivados por calor fueron mezcladas con 100 DICT_{50} aproximadamente del virus de la gripe A/Beijing/32/92 (H3N2) e incubadas a 37ºC durante 1 hora. La mezcla virus-suero fue posteriormente adsorbida a monocapas confluentes de células de riñón canino Madin-Darby (MDCK) en placas de 96 pocillos durante 1 hora a temperatura ambiente. Las placas fueron lavadas para eliminar el inóculo residual, se volvió a añadir a las mismas MEM de Dulbecco sin suero con 2 \mug/ml de tripsina, y se incubaron en un 5% de CO_{2} a 33ºC durante 72 horas. Las células fueron posteriormente fijadas con metanol y se determinó la replicación vírica utilizando un panel de anticuerpos monoclonales murinos específicos para la matriz y las nucleoproteínas del virus de la gripe A (Center for Disease Control, Atlanta, GA), seguido por anti-IgG de ratón conjugado a fosfatasa alcalina. El título de punto final de los sueros fue definido como la mayor dilución que tenía como resultado más de un 50% de reducción de la señal en comparación con los pocillos control no
neutralizados.
Virología. Se llevaron a cabo cultivos víricos de los especímenes procedentes de las muestras nasofaríngeas recogidas con bastoncillos de algodón en cada institución mediante técnicas estándar. Los especímenes fueron inoculados en células MDCK o en células de riñón de mono Rhesus e incubados a 33ºC durante 14 días. Se analizó la hemoadsorción de las monocapas celulares con eritrocitos de cobayo al 0,4%. Los virus de la gripe fueron identificados en los cultivos que tenían hemoadsorción positiva por IHA utilizando antisueros específicos de H3 (Center for Disease Control).
Análisis Estadísticos. Los títulos de los anticuerpos IHA, IgG del ELISA y neutralizantes recíprocos fueron transformados logarítmicamente para los análisis estadísticos. Se definió una respuesta significativa a la vacunación como un aumento de cuatro veces o mayor del título de anticuerpos entre los especímenes de suero prevacunación y los especímenes de suero de 3 semanas después de la vacunación. La evidencia en el laboratorio de infección por virus de la gripe A (H3N2) fue definida como el aislamiento del virus de las secreciones nasofaríngeas y/o un incremento de cuatro veces o mayor del título de anticuerpos IHA séricos entre los especímenes recogidos en Diciembre 3 semanas después de la vacunación (pretemporada) y los especímenes correspondientes post-temporada recogidos la primavera siguiente. Las diferencias entre los grupos de vacunación fueron analizadas utilizando el Test Exacto de Fisher para comparar las proporciones de sujetos con reacciones adversas, respuestas de anticuerpos significativas o enfermedad o infección de la gripe confirmadas por el laboratorio, y un Análisis de Varianza (ANOVA) para comparar las medias de los log_{2} del recíproco de los títulos de anticuerpo después de la vacunación. Se aplicaron el test de Desigualdad de Bonferroni modificado y el test de Tukey-Kramer cuando fue apropiado para explicar las múltiples comparaciones posibles.
Resultados
Reactogenicidad. Las vacunas de rHA0 utilizadas en este estudio eran seguras y bien toleradas. La frecuencia de reacciones adversas no parecía estar influenciada por el cambio de dosis del antígeno rHA0 de 15 \mug a 90 \mug, pero podía haber sido ligeramente incrementada por la adición de alumbre. Eritema localizado, dolor y sensibilidad a la presión en el lugar de inyección fueron informados de forma significativamente más frecuente por los receptores de la vacuna de subviriones autorizada que por los receptores de 15 \mug o 90 \mug de rHA0 en solución salina. Con la excepción de un individuo que experimentó un dolor moderadamente grave, sensibilidad a la presión y rigidez en el brazo después de la inmunización con la vacuna autorizada, todos los síntomas fueron clasificados como de naturaleza leve y duraron generalmente 1-2 días. El eritema localizado y/o la induración, cuando estaban presentes, tenían un tamaño invariablemente menor que el área de una moneda de cuarto de dólar.
Inmunogenicidad. Los títulos basales de anticuerpos IHA séricos hacia el virus de la gripe A/Beijing/32/92 (H3N2) eran inferiores o iguales a 1:8 en 64 (50%) de los 127 sujetos participantes en el estudio. La mayoría de los sujetos de cada uno de los cuatro grupos de vacunas tenía respuestas serológicas específicas de HA medidas por IHA y ELISA (Tabla 4). Los títulos de anticuerpos IHA séricos después de la vacunación eran mayores o iguales a 1:32 en todos los receptores de las vacunas, con la excepción de dos personas a las que se administraron 15 \mug de rHA0 y de una persona que recibió la vacuna autorizada. La vacunación estaba asociada de igual modo con la producción de anticuerpos neutralizantes en la mayoría de los voluntarios. Los aumentos medios de los títulos de anticuerpo y las tasas de seroconversión tendían a ser ligeramente menores después de la inmunización con 15 \mug de rHA0 que con la vacuna autorizada, aunque estas diferencias no eran estadísticamente significativas. La respuesta de anticuerpos hacia rHA0 no fue incrementada por la adición de alumbre. Los sujetos inmunizados con 90 \mug de rHA0 consiguieron títulos medios de anticuerpos IHA e IgG de ELISA después de la vacunación que eran de dos a cinco veces mayores que los obtenidos en cualquiera de los otros tres grupos de vacunas (las diferencias eran estadísticamente significativas cuando se comparaban los títulos de IHA en suero).
Eficacia Protectora. Durante el periodo de vigilancia, hubo un total de 28 enfermedades similares a la gripe informadas por 26 sujetos. De cuatro de estos individuos (tres de los cuales habían recibido placebo y uno de los cuales había sido inmunizado con 15 \mug de rHA0) se aislaron virus de la gripe A (H3N2) de los cultivos nasofaríngeos. Incrementos significativos del título de anticuerpos IHA hacia el virus de la gripe A/Beijing/32/92 (H3N2) entre especímenes de suero pretemporada y post-temporada estuvieron también presentes en tres de los cuatro casos confirmados por el cultivo, pero no en ninguno de los demás individuos que informaron de la enfermedad. El único receptor de rHA0 que desarrolló posteriormente la enfermedad de la gripe confirmada en el laboratorio tuvo un cultivo positivo obtenido 31 días después de la inmunización, y se había seroconvertido desde un título de IHA prevacunación de menos de 1:4 a un título post-vacunación (pretemporada) de 1:32. Dos receptores más de placebo y un voluntario inmunizado con la vacuna autorizada, tuvieron evidencia serológica de infección por el virus de la gripe A (H3N2) durante la temporada epidémica en ausencia de enfermedad clínica. Comparados con todos los sujetos vacunados (o con todos los sujetos que recibieron cualquier vacuna de rHA0) como un grupo, una proporción significativamente mayor de receptores del placebo tuvieron enfermedad (p<0,05) o infección (p<0,005) de gripe A (H3N2) confirmadas por el laboratorio.
Los hallazgos anteriores indican que las vacunas de la gripe que contenían antígeno rHA0 purificado, preparadas según se describió en la Solicitud de Patente anteriormente identificada, son bien toleradas y capaces de producir respuestas inmunes protectoras en sujetos humanos. Incluso a una dosis de 90 \mug, la rHA0 evaluada en este estudio no era más reactogénica que el placebo de solución salina, y produjo significativamente menos reacciones adversas locales que la vacuna de subviriones trivalente autorizada que contenía como mucho la mitad del antígeno HA total (esto es, 45 \mug).
Las respuestas de anticuerpos neutralizantes específicos de HA hacia la preparación de 15 \mug de rHA0, eran comparables con las producidas por la vacuna de subviriones, y fueron significativamente mejoradas al aumentar la dosis de rHA0 a 90 \mug.
Las tasas globales de infección y enfermedad resultantes de la exposición natural a la cepa epidémica circulante de virus de la gripe A (H3N2), eran significativamente más bajas entre los sujetos vacunados que entre los receptores de placebo. Los datos sugieren que la inmunidad protectora conferida por la rHA0, particularmente cuando es administrada a dosis altas, es comparable o superior a la inducida por las vacunas actualmente disponibles.
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(Tabla pasa a página siguiente)
1
Ejemplo 11 Método para Producir un Vector de Clonaje de HA0 Mejorado
Se diseñó un vector de clonaje mejorado para la expresión de la HA madura en el que el gen que codifica la HA estaba situado inmediatamente corriente abajo de la secuencia que codifica el péptido señal de la quitinasa.
Se Creó pMGS27 Lineal con Colas de Hebra Sencilla.
En el plásmido pMGS12, se clonó la HA en los sitios de SmaI o KpnI inmediatamente corriente abajo del péptido señal de la quitinasa. Las secuencias de ácido nucleico y de aminoácidos están mostradas respectivamente como SEC ID Nº 22 y SEC ID Nº 23:
103
Esta región fue cambiada mediante mutagénesis dirigida por oligos para crear pMGS27 (las bases cambiadas están subrayadas) (SEC ID Nº 24):
104
El plásmido pMGS27 fue linealizado mediante corte con PstI (se muestran los residuos 6-35 de la SEC ID Nº 24):
2
tratando posteriormente el pMGS27 lineal con ADN polimerasa de T4 más dATP para crear colas de hebra sencilla según se muestra a continuación (residuos 23-36 y complemento de los residuos 6-18 de la SEC ID Nº 24):
3
El Gen de la HA Diana fue Clonado en pMGS27.
Etapa 1. Se sintetizaron los cebadores de PCR.
Oligo directo (SEC ID Nº 25):
5' GTC GCC GTG TCC AAC GCG (20 bases del extremo 5' de la HA madura)
Oligo inverso (complemento de la SEC ID Nº 26):
(20 bases del extremo 3' de la HA madura) ATT AA CCGGTCTCTCCGG 5'
PCR del Gen de la HA.
Se utilizó PCR del gen de la HA diana con los dos oligos para obtener (SEC ID Nº 25 y SEC ID Nº 26):
4
Hibridación del Gen de la HA Diana en pMGS27 y Transformación de E. coli .
Se mezclaron el pMGS27 lineal y el fragmento del gen de la HA procedente de la PCR tratado con ADN polimerasa de T4. Las dos moléculas hibridan entre sí para formar un plásmido circular que está listo para ser utilizado en la transformación de E. coli. El diagrama incluye las SEC ID N^{os} 25 y 26, los residuos 23-36 y 6-18 de la SEC ID Nº 24.
5
Según se mostró anteriormente, no hay aminoácidos extra entre el péptido señal y la HA madura.
Ejemplo 12 Preparación y Eficacia de una Vacuna Trivalente de Virus de la Gripe de Tipo A y B de 1995-1996
La vacuna del virus de la gripe, de hemaglutinina recombinante purificada, trivalente, de los tipos A y B (A/Texas/
36/92\1 (H1N1), A/Johanesburg/33/94 (H3N2) y B/Harbin/7/94) es una subunidad no infecciosa derivada de antígenos hemaglutinina (HA) de la gripe recombinantes, purificados. Los genes de la HA fueron clonados a partir de las cepas de virus de la gripe A y B recomendadas por el Center for Disease Control/Food and Drug Administration según se describió anteriormente, y la identidad de cada gen clonado se determinó mediante análisis de la secuencia de ADN. Se utilizaron vectores de expresión baculovíricos que contenían los genes de la HA clonados de las cepas de virus de la gripe A/Texas/36/91 (H1N1), A/Johanesburg/33/94 (H3N2), B/Harbin/7/94, para producir los antígenos HA recombinantes en células de insecto cultivadas. Las proteínas HA recombinantes son hemaglutininas de longitud completa, no cortadas (rHA0) con un peso molecular de 69.000 aproximadamente. Las rHA0 fueron producidas en una línea celular de Spodoptera frugiperda (Lepidóptero) mantenida en un medio de cultivo sin suero. Las vacunas trivalentes están compuestas por rHA0 purificada (más de un 95% de pureza, más probablemente mayor de un 99% de pureza) procedente de las dos cepas de la gripe A y de una cepa B mezcladas en iguales proporciones. La vacuna es suministrada para uso clínico como proteínas rHA0 de los tipos A y B purificadas en solución salina tamponada con fosfato sin conservante añadido.
Estudios animales con vacunas de rHAO monovalentes, bivalentes y trivalentes han demostrado que las mismas carecen de toxicidad significativa. No hay agentes tóxicos o fortuitos detectables en la vacuna. Se llevaron a cabo estudios generales de seguridad e inmunogenicidad de la rHA0 de A/Beijing/32/92 y A/Texas/36/91 en ratones y cobayos. No se observaron reacciones adversas. En ratones, una única inmunización con 15 microgramos de antígenos rHA0 sin adyuvante induce en dos a tres semanas niveles elevados de anticuerpos IgG anti-HA, anticuerpos inhibidores de hemaglutinina (IHA) y anticuerpos neutralizantes.
En un estudio, grupos de diez ratones fueron inmunizados con 15 microgramos de rHA0 purificada de A/Beijing/
32/92 (H3N2) producida en células adaptadas a medios que contenían un 10% de suero bovino fetal o con rHA0 producida en células de insecto adaptadas a medios que contenían un 10% de suero bovino fetal, o con rHA0 producida en células de insecto adaptadas a un medio sin suero (rHA0-SF). Dos y tres semanas después de la inyección se extrajo sangre de los animales y se prepararon muestras de suero. Cada suero fue medido para determinar anticuerpos IgG anti-HA y anticuerpos IHA. Los antígenos rHA0 y rHA0-SF producían ambos títulos similares de anticuerpos anti-HA y de anticuerpos IHA. Dos semanas después de la única inmunización, la mayoría de los ratones tenía títulos significativos de anticuerpos IHA y, hacia la semana tres, 8/10 ratones de cada grupo tenían títulos de IHA de 32 o mayores. Estos y otros estudios bioquímicos e inmunológicos demuestran que la rHA0 producida en cultivos de células de insecto sin suero es indistinguible de la rHA0 producida bajo condiciones de fermentación que contenían suero.
Se llevó a cabo un estudio para comparar la formulación de la vacuna de la gripe de rHA0 trivalente de 1994-1995 con una vacuna de antígeno de superficie del virus purificado autorizada, Fluvirin® (una vacuna de virus de la gripe atenuados producida mediante cultivo en huevos). Cada vacuna contenía 15 \mug de rHA0 o de HA vírica por cada 0,5 ml de las cepas de la gripe A/Texas/36/91 (H1N1), A/Shangdong/9/93 (H3N2) y B/Panamá/45/90. Ambas, la vacuna de rHA0 recombinante y
TABLA 5 Comparación de la Vacuna de rHA0 Trivalente con Fluvirin®
Vacuna de la gripe Fluvirin®
GMT (n=10 ratones) de rHA0 trivalente GMT (n=10 ratones)
Cepa de virus IgG anti-HA IgG anti-HA
utilizada como antígeno semana 0 semana 3 semana 0 semana 3
A/Texas/36/91 (H1N1) <1000 103.000 <1000 11.200
A/Shangdong/32/92 (H3N2) <1000 162.400 <1000 41.000
B/Panamá/45/90 <1000 164.800 <1000 26.000
Cepa de virus IHA IHA
utilizada como antígeno
A/Texas/36/91 (H1N1) <8 1.522 <8 1.088
A/Shangdong/32/92 (H3N2) <8 494 <8 435
B/Panamá/45/90 <8 174 <8 42
Cepa de virus Anticuerpos neutralizantes Anticuerpos neutralizantes
utilizada como antígeno
A/Texas/36/91 (H1N1) <100 5.800 <100 2.720
A/Shangdong/32/92 (H3N2) <100 864 <100 360
B/Panamá/45/90 <100 1.300 <100 700
Modificaciones y variaciones de los métodos y composiciones descritos en la presente para ser utilizados en la preparación y utilización de una vacuna de la gripe recombinante, serán obvias para las personas expertas en la técnica. Tales modificaciones y variaciones están destinadas a ser parte del ámbito de las reivindicaciones adjuntas.
(1) INFORMACIÓN GENERAL
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
SOLICITANTE: MicroGeneSys, Inc.
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TÍTULO DELA INVENCIÓN: UN MÉTODO PARA PRODUCIR VACUNAS MULTIVALENTES DE HEMAGLUTININA DE LA GRIPE
\vskip0.800000\baselineskip
(iii)
NÚMERO DE SECUENCIAS: 32
\vskip0.800000\baselineskip
(iv)
DIRECCIÓN PARA CORRESPONDENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
DESTINATARIO: Patrea L. Pabst
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
CALLE: 2800 One Atlantic Center
\hskip4.2cm
1201 West Peachtree Street 
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
CIUDAD: Atlanta
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
ESTADO: GA
\vskip0.500000\baselineskip
(F)
PAÍS: EE.UU.
\vskip0.500000\baselineskip
(F)
ZIP: 30309-3450
\vskip0.800000\baselineskip
(v)
FORMA LEGIBLE POR ORDENADOR:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
TIPO DE MEDIO: Disco magnético flexible
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
ORDENADOR: IBM PC compatible
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
SISTEMA OPERATIVO: PC-DOS/MS-DOS
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
PROGRAMA: PatentIn Release #1.0, Versión #1.25
\vskip0.800000\baselineskip
(vi)
DATOS DE LA SOLICITUD ACTUAL:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
NÚMERO DE SOLICITUD: PCT/US95/06750
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
FECHA DE REGISTRO: 26-MAYO-1995
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
CLASIFICACIÓN:
\vskip0.800000\baselineskip
(ix)
INFORMACIÓN SOBRE TELECOMUNICACIÓN:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
TELÉFONO: (404)-873-8794
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TELEFAX: (404)-873-8795
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº:1:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 12 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
TIPO DE HEBRA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico)
\vskip0.800000\baselineskip
(iii)
HIPOTÉTICA: NO
\vskip0.800000\baselineskip
(iv)
ANTISENTIDO: NO
\vskip0.800000\baselineskip
(vi)
FUENTE ORIGINAL:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
ORGANISMO: Virus de la gripe
\vskip0.800000\baselineskip
(x)
INFORMACIÓN SOBRE LA PUBLICACIÓN:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
AUTORES: Davis y col.
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TÍTULO:Construction and Characterization of a Bacterial Clone Containing the Hemagglutinin Gene of the WSN Strain (H0N1) of Influenza Virus
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
REVISTA: Gene
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
VOLUMEN: 10
\vskip0.500000\baselineskip
(F)
PÁGINAS: 205-218
\vskip0.500000\baselineskip
(G)
FECHA: 1980
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº:1:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
AGCAAAAGCA GG 
\hfill
12 
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº:2:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 39 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
TIPO DE HEBRA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico)
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº:2:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
GGGGGTACCC CCGGGAGCAA AAGCAGGGGA AAATAAAAA 
\hfill
39 
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº:3:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 35 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
TIPO DE HEBRA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico)
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº:3:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
CCCGGTACCT CAKATKCATA TTCTGCACTG CAAAG 
\hfill
35 
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº:4:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 39 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
TIPO DE HEBRA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico)
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº:4:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
GGGGGTACCC CCGGGGACAC AATATGTATA GGCTACCAT 
\hfill
39 
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº:5:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 35 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
TIPO DE HEBRA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico)
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº:5:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
CCCGGTACCT CAKATKCATA TTCTGCACTG CAAAG 
\hfill
35 
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº:6:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 1793 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
TIPO DE HEBRA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico)
\vskip0.800000\baselineskip
(iii)
HIPOTÉTICA: NO
\vskip0.800000\baselineskip
(iv)
ANTISENTIDO: NO
\vskip0.800000\baselineskip
(vi)
FUENTE ORIGINAL:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
ORGANISMO: Virus de la gripe
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
AISLADO INDIVIDUAL: rHA de A/Beijing/32/92
\vskip0.800000\baselineskip
(ix)
CARACTERÍSTICA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
NOMBRE/CLAVE:líder del ARNm de la polihedrina (parcial)
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
LOCALIZACIÓN: 1 a 18
\vskip0.800000\baselineskip
(ix)
CARACTERÍSTICA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
NOMBRE/CLAVE:región codificadora de la secuencia señal de la proteína 61K de AcNPV
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
LOCALIZACIÓN: 19 a 72
\vskip0.800000\baselineskip
(ix)
CARACTERÍSTICA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
NOMBRE/CLAVE:sitio de restricción de SmaI
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
LOCALIZACIÓN: 76 a 81
\vskip0.800000\baselineskip
(ix)
CARACTERÍSTICA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
NOMBRE/CLAVE:región codificadora de la rHA madura
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
LOCALIZACIÓN: 73 a 1728
\vskip0.800000\baselineskip
(ix)
CARACTERÍSTICA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
NOMBRE/CLAVE:sitio de restricción de KpnI
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
LOCALIZACIÓN: 1771 a 1777
\vskip0.800000\baselineskip
(ix)
CARACTERÍSTICA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
NOMBRE/CLAVE:sitio de restricción de BglII
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
LOCALIZACIÓN: 1776 a 1782
\vskip0.800000\baselineskip
(ix)
CARACTERÍSTICA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
NOMBRE/CLAVE:señal de terminación de la traducción universal
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
LOCALIZACIÓN: 1783 a 1793
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº:6:
\vskip1.000000\baselineskip
6 
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº:7:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 570 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
TIPO DE HEBRA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: péptido
\vskip0.800000\baselineskip
(iii)
HIPOTÉTICA: NO
\vskip0.800000\baselineskip
(iv)
ANTISENTIDO: NO
\vskip0.800000\baselineskip
(v)
TIPO DE FRAGMENTO: N-terminal
\vskip0.800000\baselineskip
(vi)
FUENTE ORIGINAL:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
ORGANISMO: Virus de la gripe
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
AISLADO INDIVIDUAL: rHA de A/Beijing/32/92
\vskip0.800000\baselineskip
(ix)
CARACTERÍSTICA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
NOMBRE/CLAVE:secuencia señal de la proteína 61K de AcNPV
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
LOCALIZACIÓN: 1 a 18
\vskip0.800000\baselineskip
(ix)
CARACTERÍSTICA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
NOMBRE/CLAVE:rHA madura
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
LOCALIZACIÓN: 19 a 552
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº:7:
\vskip1.000000\baselineskip
8
9
10 
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº:8:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 1766 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
TIPO DE HEBRA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico)
\vskip0.800000\baselineskip
(iii)
HIPOTÉTICA: NO
\vskip0.800000\baselineskip
(iv)
ANTISENTIDO: NO
\vskip0.800000\baselineskip
(vi)
FUENTE ORIGINAL:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
ORGANISMO: Virus de la gripe
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
AISLADO INDIVIDUAL: rHa de A/Texas/36/91
\vskip0.800000\baselineskip
(ix)
CARACTERÍSTICA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
NOMBRE/CLAVE:líder del ARNm de la polihedrina (parcial)
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
LOCALIZACIÓN: 1 a 18
\vskip0.800000\baselineskip
(ix)
CARACTERÍSTICA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
NOMBRE/CLAVE:región codificadora del péptido señal de la proteína 61K de AcNPV
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
LOCALIZACIÓN: 19 a 72
\vskip0.800000\baselineskip
(ix)
CARACTERÍSTICA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
NOMBRE/CLAVE:sitio de restricción de SmaI
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
LOCALIZACIÓN: 76 a 81
\vskip0.800000\baselineskip
(ix)
CARACTERÍSTICA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
NOMBRE/CLAVE:sitio de restricción de KpnI
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
LOCALIZACIÓN: 82 a 87
\vskip0.800000\baselineskip
(ix)
CARACTERÍSTICA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
NOMBRE/CLAVE:sitio de restricción de SmaI
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
LOCALIZACIÓN: 88 a 93
\vskip0.800000\baselineskip
(ix)
CARACTERÍSTICA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
NOMBRE/CLAVE:región codificadora de la rHA madura
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
LOCALIZACIÓN: 73 a 1734
\vskip0.800000\baselineskip
(ix)
CARACTERÍSTICA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
NOMBRE/CLAVE:sitio de restricción de KpnI
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
LOCALIZACIÓN: 1744 a 1749
\vskip0.800000\baselineskip
(ix)
CARACTERÍSTICA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
NOMBRE/CLAVE:sitio de restricción de BglII
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
LOCALIZACIÓN: 1750 a 1755
\vskip0.800000\baselineskip
(ix)
CARACTERÍSTICA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
NOMBRE/CLAVE:señal de terminación de la traducción universal
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
LOCALIZACIÓN: 1756 a 1766
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº:8:
\vskip1.000000\baselineskip
11
12 
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº:9:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 572 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
TIPO DE HEBRA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: péptido
\vskip0.800000\baselineskip
(iii)
HIPOTÉTICA: NO
\vskip0.800000\baselineskip
(iv)
ANTISENTIDO: NO
\vskip0.800000\baselineskip
(v)
TIPO DE FRAGMENTO: N-terminal
\vskip0.800000\baselineskip
(vi)
FUENTE ORIGINAL:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
ORGANISMO: Virus de la gripe
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
AISLADO INDIVIDUAL: rHA de A/Texas/36/91
\vskip0.800000\baselineskip
(ix)
CARACTERÍSTICA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
NOMBRE/CLAVE:secuencia señal de la proteína 61K de AcNPV
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
LOCALIZACIÓN: 1 a 18
\vskip0.800000\baselineskip
(ix)
CARACTERÍSTICA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
NOMBRE/CLAVE:rHA madura
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
LOCALIZACIÓN: 19 a 554
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº:9:
13
14
15 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº:10:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 1799 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
TIPO DE HEBRA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: ARN (genómico)
\vskip0.800000\baselineskip
(iii)
HIPOTÉTICA: NO
\vskip0.800000\baselineskip
(iv)
ANTISENTIDO: NO
\vskip0.800000\baselineskip
(vi)
FUENTE ORIGINAL:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
ORGANISMO: Virus de la gripe
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
AISLADO INDIVIDUAL: rHa de B/Panamá/45/90
\vskip0.800000\baselineskip
(ix)
CARACTERÍSTICA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
NOMBRE/CLAVE:líder del ARNm de la polihedrina (parcial)
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
LOCALIZACIÓN: 1 a 18
\vskip0.800000\baselineskip
(ix)
CARACTERÍSTICA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
NOMBRE/CLAVE:región codificadora de la secuencia del péptido señal de la HA
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
LOCALIZACIÓN: 19 a 69
\vskip0.800000\baselineskip
(ix)
CARACTERÍSTICA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
NOMBRE/CLAVE:sitio de restricción de SmaI
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
LOCALIZACIÓN: 22 a 27
\vskip0.800000\baselineskip
(ix)
CARACTERÍSTICA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
NOMBRE/CLAVE:región codificadora de la rHA madura
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
LOCALIZACIÓN: 70 a 1773
\vskip0.800000\baselineskip
(ix)
CARACTERÍSTICA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
NOMBRE/CLAVE:sitio de restricción de KpnI
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
LOCALIZACIÓN: 1777 a 1782
\vskip0.800000\baselineskip
(ix)
CARACTERÍSTICA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
NOMBRE/CLAVE:sitio de restricción de BglII
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
LOCALIZACIÓN: 1783 a 1788
\newpage
\vskip0.800000\baselineskip
(ix)
CARACTERÍSTICA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
NOMBRE/CLAVE:señal de terminación de la traducción universal
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
LOCALIZACIÓN: 1789 a 1799
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº:10:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
16 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº:11:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 585 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
TIPO DE HEBRA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: péptido
\vskip0.800000\baselineskip
(iii)
HIPOTÉTICA: NO
\vskip0.800000\baselineskip
(iv)
ANTISENTIDO: NO
\vskip0.800000\baselineskip
(v)
TIPO DE FRAGMENTO: N-terminal
\vskip0.800000\baselineskip
(vi)
FUENTE ORIGINAL:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
ORGANISMO: Virus de la gripe
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
AISLADO INDIVIDUAL: rHA de B/Panamá/45/90
\vskip0.800000\baselineskip
(ix)
CARACTERÍSTICA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
NOMBRE/CLAVE:péptido señal de la HA
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
LOCALIZACIÓN: 1 a 17
\vskip0.800000\baselineskip
(ix)
CARACTERÍSTICA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
NOMBRE/CLAVE:rHA madura
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
LOCALIZACIÓN: 18 a 568
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº:11:
\vskip1.000000\baselineskip
18
19
20 
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº:12:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 1811 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
TIPO DE HEBRA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico)
\vskip0.800000\baselineskip
(iii)
HIPOTÉTICA: NO
\vskip0.800000\baselineskip
(iv)
ANTISENTIDO: NO
\vskip0.800000\baselineskip
(vi)
FUENTE ORIGINAL:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
ORGANISMO: Virus de la gripe
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
AISLADO INDIVIDUAL: rHa de B/Netherlands/13/94
\vskip0.800000\baselineskip
(ix)
CARACTERÍSTICA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
NOMBRE/CLAVE:líder del ARNm de la polihedrina (parcial)
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
LOCALIZACIÓN: 1 a 18
\vskip0.800000\baselineskip
(ix)
CARACTERÍSTICA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
NOMBRE/CLAVE:región codificadora del péptido señal de la proteína 61K de AcNPV
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
LOCALIZACIÓN: 19 a 72
\vskip0.800000\baselineskip
(ix)
CARACTERÍSTICA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
NOMBRE/CLAVE:sitio de restricción de SmaI
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
LOCALIZACIÓN: 76 a 81
\vskip0.800000\baselineskip
(ix)
CARACTERÍSTICA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
NOMBRE/CLAVE:región codificadora de la rHA madura
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
LOCALIZACIÓN: 73 a 1785
\vskip0.800000\baselineskip
(ix)
CARACTERÍSTICA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
NOMBRE/CLAVE:sitio de restricción de KpnI
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
LOCALIZACIÓN: 1789 a 1794
\vskip0.800000\baselineskip
(ix)
CARACTERÍSTICA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
NOMBRE/CLAVE:sitio de restricción de BglII
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
LOCALIZACIÓN: 1795 a 1800
\vskip0.800000\baselineskip
(ix)
CARACTERÍSTICA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
NOMBRE/CLAVE:señal de terminación de la traducción universal
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
LOCALIZACIÓN: 1801 a 1811
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº:12:
\vskip1.000000\baselineskip
21 
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº:13:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 589 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
TIPO DE HEBRA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: péptido
\vskip0.800000\baselineskip
(iii)
HIPOTÉTICA: NO
\vskip0.800000\baselineskip
(iv)
ANTISENTIDO: NO
\vskip0.800000\baselineskip
(v)
TIPO DE FRAGMENTO: N-terminal
\vskip0.800000\baselineskip
(vi)
FUENTE ORIGINAL:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
ORGANISMO: Virus de la gripe
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
AISLADO INDIVIDUAL: rHA de B/Netherlands/13/94
\vskip0.800000\baselineskip
(ix)
CARACTERÍSTICA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
NOMBRE/CLAVE:secuencia señal de la proteína 61K de AcNPV
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
LOCALIZACIÓN: 1 a 18
\vskip0.800000\baselineskip
(ix)
CARACTERÍSTICA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
NOMBRE/CLAVE:rHA madura
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
LOCALIZACIÓN: 19 a 571
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº:13:
22
23
24 
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº:14:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 1757 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
TIPO DE HEBRA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico)
\vskip0.800000\baselineskip
(iii)
HIPOTÉTICA: NO
\vskip0.800000\baselineskip
(iv)
ANTISENTIDO: NO
\newpage
\vskip0.800000\baselineskip
(vi)
FUENTE ORIGINAL:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
ORGANISMO: Virus de la gripe
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
AISLADO INDIVIDUAL: rHa de A/Shandong/9/93
\vskip0.800000\baselineskip
(ix)
CARACTERÍSTICA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
NOMBRE/CLAVE:líder del ARNm de la polihedrina (parcial)
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
LOCALIZACIÓN: 1 a 18
\vskip0.800000\baselineskip
(ix)
CARACTERÍSTICA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
NOMBRE/CLAVE:región codificadora de la secuencia señal de la proteína 61K de AcNPV
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
LOCALIZACIÓN: 19 a 72
\vskip0.800000\baselineskip
(ix)
CARACTERÍSTICA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
NOMBRE/CLAVE:sitio de restricción de SmaI
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
LOCALIZACIÓN: 76 a 81
\vskip0.800000\baselineskip
(ix)
CARACTERÍSTICA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
NOMBRE/CLAVE:región codificadora de la rHA madura
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
LOCALIZACIÓN: 73 a 1728
\vskip0.800000\baselineskip
(ix)
CARACTERÍSTICA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
NOMBRE/CLAVE:sitio de restricción de KpnI
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
LOCALIZACIÓN: 1735 a 1740
\vskip0.800000\baselineskip
(ix)
CARACTERÍSTICA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
NOMBRE/CLAVE:sitio de restricción de BglII
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
LOCALIZACIÓN: 1741 a 1746
\vskip0.800000\baselineskip
(ix)
CARACTERÍSTICA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
NOMBRE/CLAVE:señal de terminación de la traducción universal
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
LOCALIZACIÓN: 1747 a 1757
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº:14:
\vskip1.000000\baselineskip
25
26 
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº:15:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 571 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
TIPO DE HEBRA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: péptido
\vskip0.800000\baselineskip
(iii)
HIPOTÉTICA: NO
\vskip0.800000\baselineskip
(iv)
ANTISENTIDO: NO
\vskip0.800000\baselineskip
(v)
TIPO DE FRAGMENTO: N-terminal
\newpage
\vskip0.800000\baselineskip
(vi)
FUENTE ORIGINAL:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
ORGANISMO: Virus de la gripe
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
AISLADO INDIVIDUAL: rHA de A/Shandong/9/93
\vskip0.800000\baselineskip
(ix)
CARACTERÍSTICA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
NOMBRE/CLAVE:secuencia señal de la proteína 61K de AcNPV
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
LOCALIZACIÓN: 1 a 18
\vskip0.800000\baselineskip
(ix)
CARACTERÍSTICA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
NOMBRE/CLAVE:rHA madura
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
LOCALIZACIÓN: 19 a 553
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº:15:
\vskip1.000000\baselineskip
27
28
29 
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº:16:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 1814 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
TIPO DE HEBRA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico)
\vskip0.800000\baselineskip
(iii)
HIPOTÉTICA: NO
\vskip0.800000\baselineskip
(iv)
ANTISENTIDO: NO
\vskip0.800000\baselineskip
(vi)
FUENTE ORIGINAL:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
ORGANISMO: Virus de la gripe
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
AISLADO INDIVIDUAL: rHA de B/Shanhai/4/94
\vskip0.800000\baselineskip
(ix)
CARACTERÍSTICA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
NOMBRE/CLAVE:líder del ARNm de la polihedrina (parcial)
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
LOCALIZACIÓN: 1 a 18
\vskip0.800000\baselineskip
(ix)
CARACTERÍSTICA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
NOMBRE/CLAVE:región codificadora de la secuencia señal de la proteína 61K de AcNPV
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
LOCALIZACIÓN: 19 a 72
\vskip0.800000\baselineskip
(ix)
CARACTERÍSTICA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
NOMBRE/CLAVE:sitio de restricción de SmaI
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
LOCALIZACIÓN: 76 a 81
\vskip0.800000\baselineskip
(ix)
CARACTERÍSTICA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
NOMBRE/CLAVE:sitio de restricción de KpnI
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
LOCALIZACIÓN: 82 a 87
\vskip0.800000\baselineskip
(ix)
CARACTERÍSTICA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
NOMBRE/CLAVE:región codificadora de la rHA madura
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
LOCALIZACIÓN: 73 a 1794
\vskip0.800000\baselineskip
(ix)
CARACTERÍSTICA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
NOMBRE/CLAVE:señal de terminación de la traducción universal
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
LOCALIZACIÓN: 1804 a 1814
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº:16:
\vskip1.000000\baselineskip
30
31 
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº:17:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 592 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
TIPO DE HEBRA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: péptido
\vskip0.800000\baselineskip
(iii)
HIPOTÉTICA: NO
\vskip0.800000\baselineskip
(iv)
ANTISENTIDO: NO
\vskip0.800000\baselineskip
(v)
TIPO DE FRAGMENTO: N-terminal
\vskip0.800000\baselineskip
(vi)
FUENTE ORIGINAL:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
ORGANISMO: Virus de la gripe
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
AISLADO INDIVIDUAL: rHA de B/Shanhai/4/94
\vskip0.800000\baselineskip
(ix)
CARACTERÍSTICA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
NOMBRE/CLAVE:péptido señal de la proteína 61K de AcNPV
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
LOCALIZACIÓN: 1 a 18
\vskip0.800000\baselineskip
(ix)
CARACTERÍSTICA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
NOMBRE/CLAVE:rHA madura
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
LOCALIZACIÓN: 19 a 574
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº:17:
32
33
34 
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº:18:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 1802 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
TIPO DE HEBRA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico)
\vskip0.800000\baselineskip
(iii)
HIPOTÉTICA: NO
\vskip0.800000\baselineskip
(iv)
ANTISENTIDO: NO
\vskip0.800000\baselineskip
(vi)
FUENTE ORIGINAL:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
ORGANISMO: Virus de la gripe
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
AISLADO INDIVIDUAL: rHa de B/Harbin/7/94
\vskip0.800000\baselineskip
(ix)
CARACTERÍSTICA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
NOMBRE/CLAVE:líder del ARNm de la polihedrina (parcial)
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
LOCALIZACIÓN: 1 a 18
\vskip0.800000\baselineskip
(ix)
CARACTERÍSTICA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
NOMBRE/CLAVE:región codificadora de la secuencia del péptido señal de HA
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
LOCALIZACIÓN: 19 a 69
\vskip0.800000\baselineskip
(ix)
CARACTERÍSTICA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
NOMBRE/CLAVE:sitio de restricción de SmaI
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
LOCALIZACIÓN: 22 a 27
\vskip0.800000\baselineskip
(ix)
CARACTERÍSTICA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
NOMBRE/CLAVE:región codificadora de la rHA madura
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
LOCALIZACIÓN: 70 a 1776
\vskip0.800000\baselineskip
(ix)
CARACTERÍSTICA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
NOMBRE/CLAVE:sitio de restricción de KpnI
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
LOCALIZACIÓN: 1780 a 1785
\vskip0.800000\baselineskip
(ix)
CARACTERÍSTICA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
NOMBRE/CLAVE:sitio de restricción de BglII
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
LOCALIZACIÓN: 1786 a 1791
\vskip0.800000\baselineskip
(ix)
CARACTERÍSTICA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
NOMBRE/CLAVE:señal de terminación de la traducción universal
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
LOCALIZACIÓN: 1792 a 1802
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº:18:
\vskip1.000000\baselineskip
35
36 
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº:19:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 586 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
TIPO DE HEBRA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: péptido
\vskip0.800000\baselineskip
(iii)
HIPOTÉTICA: NO
\vskip0.800000\baselineskip
(iv)
ANTISENTIDO: NO
\vskip0.800000\baselineskip
(v)
TIPO DE FRAGMENTO: N-terminal
\vskip0.800000\baselineskip
(vi)
FUENTE ORIGINAL:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
ORGANISMO: Virus de la gripe
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
AISLADO INDIVIDUAL: rHA de B/Harbin/7/94
\vskip0.800000\baselineskip
(ix)
CARACTERÍSTICA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
NOMBRE/CLAVE:péptido señal de HA
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
LOCALIZACIÓN: 1 a 17
\vskip0.800000\baselineskip
(ix)
CARACTERÍSTICA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
NOMBRE/CLAVE:rHA madura
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
LOCALIZACIÓN: 18 a 569
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº:19:
\vskip1.000000\baselineskip
37
38
39 
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº:20:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 1757 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
TIPO DE HEBRA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico)
\vskip0.800000\baselineskip
(iii)
HIPOTÉTICA: NO
\vskip0.800000\baselineskip
(iv)
ANTISENTIDO: NO
\vskip0.800000\baselineskip
(vi)
FUENTE ORIGINAL:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
ORGANISMO: Virus de la gripe
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
AISLADO INDIVIDUAL: rHa de A/Johannesburg/33/94
\vskip0.800000\baselineskip
(ix)
CARACTERÍSTICA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
NOMBRE/CLAVE:líder del ARNm de la polihedrina (parcial)
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
LOCALIZACIÓN: 1 a 18
\vskip0.800000\baselineskip
(ix)
CARACTERÍSTICA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
NOMBRE/CLAVE:región codificadora del péptido señal de la proteína 61K de AcNPV
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
LOCALIZACIÓN: 19 a 72
\vskip0.800000\baselineskip
(ix)
CARACTERÍSTICA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
NOMBRE/CLAVE:sitio de restricción de SmaI
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
LOCALIZACIÓN: 76 a 81
\vskip0.800000\baselineskip
(ix)
CARACTERÍSTICA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
NOMBRE/CLAVE:región codificadora de la rHA madura
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
LOCALIZACIÓN: 73 a 1731
\vskip0.800000\baselineskip
(ix)
CARACTERÍSTICA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
NOMBRE/CLAVE:sitio de restricción de KpnI
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
LOCALIZACIÓN: 1735 a 1740
\vskip0.800000\baselineskip
(ix)
CARACTERÍSTICA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
NOMBRE/CLAVE:sitio de restricción de BglII
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
LOCALIZACIÓN: 1741 a 1747
\vskip0.800000\baselineskip
(ix)
CARACTERÍSTICA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
NOMBRE/CLAVE:señal de terminación de la traducción universal
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
LOCALIZACIÓN: 1747 a 1757
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº:20:
\vskip1.000000\baselineskip
40 
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº:21:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 571 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
TIPO DE HEBRA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: péptido
\vskip0.800000\baselineskip
(iii)
HIPOTÉTICA: NO
\vskip0.800000\baselineskip
(iv)
ANTISENTIDO: NO
\vskip0.800000\baselineskip
(v)
TIPO DE FRAGMENTO: N-terminal
\vskip0.800000\baselineskip
(vi)
FUENTE ORIGINAL:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
ORGANISMO: Virus de la gripe
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
AISLADO INDIVIDUAL: rHA de A/Johannesburg/33/94
\vskip0.800000\baselineskip
(ix)
CARACTERÍSTICA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
NOMBRE/CLAVE:secuencia señal de la proteína 61K de AcNPV
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
LOCALIZACIÓN: 1 a 18
\vskip0.800000\baselineskip
(ix)
CARACTERÍSTICA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
NOMBRE/CLAVE:rHA madura
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
LOCALIZACIÓN: 19 a 569
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº:21:
41
42
43 
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº:22:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 39 bases
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
TIPO DE HEBRA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº:22:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
TGGTTGGTCG CCGTTTCTAA CGCGATTCCC GGGGGTACC 
\hfill
39 
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº:23:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 13 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
TIPO DE HEBRA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: péptido
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº:23:
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Trp Leu Val Ala Val Ser Asn Ala Ile Pro Gly Gly Thr}
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº:24:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 43 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
TIPO DE HEBRA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº:24:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
TGGTTAGTCG CCGTGTCCTG CAGGCCAGAG AGGCCTTGGT ACC 
\hfill
43 
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº:25:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 18 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
TIPO DE HEBRA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº:25:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
GTCGCCGTGT CCAACGCG 
\hfill
18 
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº:26:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 18 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
TIPO DE HEBRA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº:26:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
TAATTGGCCA GAGAGGCC 
\hfill
18 
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº:27:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 39 bases
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
TIPO DE HEBRA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº:27:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
GGGGGATCCG GTACCAGCAA AAGCAGGGGA TAATTCTAT 
\hfill
39 
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº:28:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 38 bases
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
TIPO DE HEBRA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº:28:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
GGGGGTACCC CCGGGGACTT TCCAGGAAAT GACAACAG 
\hfill
38 
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº:29:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 44 bases
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
TIPO DE HEBRA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº:29:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
CCCGGTACCG AATCATCCTA GAAACAAGGG TGTTTTTAAT TAAT 
\hfill
44 
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº:30:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 47 bases
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
TIPO DE HEBRA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº:30:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
GGGGAATTCG GTACCCCCGG GAAGGCAATA ATTGTACTAC TCATGGT 
\hfill
47 
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº:31:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 36 bases
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
TIPO DE HEBRA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº:31:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
GGTACCCCCG GGGATCGAAT CTGCACTGGG ATAACA 
\hfill
36 
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº:32:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 50 bases
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
TIPO DE HEBRA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº:32:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
GGGGAATTCG GATCCGGTAC CTCACAGACA GATGGARCAA GAAACATTGT 
\hfill
50

Claims (4)

1. Un vector para producir una proteína hemaglutinina HA0 de la gripe recombinante que comprende las secuencias 5'\rightarrow3' siguientes: un promotor de la polihedrina de un baculovirus, un codón de inicio de la traducción ATG, un péptido señal, secuencias codificadoras de la hemaglutinina madura de una cepa de virus de la gripe, un codón de terminación de la traducción y una señal de poliadelación del ARN de la polihedrina, caracterizado porque el péptido señal comprende un péptido señal de baculovirus que contiene los aminoácidos 1-18 de la SEC ID Nº: 7.
2. Un vector de acuerdo con la reivindicación 1, en el que la secuencia que codifica el péptido señal y la hemaglutinina no codifica ningún aminoácido intermedio.
3. Un vector de acuerdo con la reivindicación 1 o con la reivindicación 2, transfectado en células de insecto cultivadas.
4. Un método para producir una hemaglutinina que comprende la infección de células de insecto cultivadas con un vector de acuerdo con la reivindicación 1 ó 2, y el cultivo de las células en un medio nutritivo.
ES95922133T 1993-09-13 1995-05-26 Vector y procedimiento de produccion de hemaglutinina de virus gripales. Expired - Lifetime ES2248799T3 (es)

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PCT/US1995/006750 WO1996037624A1 (en) 1993-09-13 1995-05-26 A method for producing influenza hemagglutinin multivalent vaccines
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