ES2300686T3 - Peptidos sw grelina marcados fluorescentemente. - Google Patents
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Abstract
Un secretagogo de la hormona del crecimiento marcado de la fórmula R1-Cys-F donde R1 es una secuencia peptídica derivada de la secuencia polipeptídica de la grelina del Núm. Id. Sec.: 1, una Cys está unida al aminoácido C-terminal de R1 y F es un fluorocromo.
Description
Péptidos de grelina marcados
fluorescentemente.
La hormona del crecimiento, que se secreta desde
la pituitaria, estimula el crecimiento de todos los tejidos del
cuerpo capaces de crecer. Además, se sabe que la hormona del
crecimiento tiene los siguientes efectos básicos en los procesos
metabólicos del cuerpo: (1) Incremento de la tasa de síntesis de
proteínas en todas las células del cuerpo; (2) Disminución de la
tasa de utilización de carbohidratos en las células del cuerpo; (3)
Incremento de la movilización de los ácidos grasos libres y
utilización de los ácidos grasos para obtener energía. Una
deficiencia en la secreción de la hormona del crecimiento puede
resultar en varios trastornos médicos, tales como el enanismo.
La metodología para determinar la actividad de
un compuesto como secretagogo de la hormona del crecimiento se
conoce en el ámbito. Por ejemplo, se describe un ensayo ex
vivo en Smith, et al., Science,
260,1640-1643 (1993) (ver texto de la Fig. 2 aquí),
pero este ensayo requiere el uso de cultivos celulares y no da una
indicación de la actividad de unión competitiva. Por consiguiente,
sería deseable desarrollar un ligando marcado no radiactivamente que
se pueda utilizar para identificar y caracterizar los receptores
celulares que juegan un papel en la actividad del secretagogo de la
hormona del crecimiento. También sería deseable tener un ligando
marcado no radiactivamente disponible para utilizarlo en un ensayo
para probar los compuestos para la actividad del secretagogo de la
hormona del
crecimiento.
crecimiento.
Tales estudios normalmente requieren un
radioligando de actividad específica alta. Los intentos previos para
desarrollar un análisis de fijación a receptores utilizando ligandos
peptídicos marcados con [T] o [125I] derivados de
GHRP-6 tuvieron un éxito limitado. Ver R. F. Walker,
et al. Neuropharmacol. 989,28, 1139 y C. Y. Bowers et
al., Biochem. Biophys. Res. Comm. 1991, 178,31. Generalmente, la
unión de tales ligandos peptídicos era de baja afinidad y de una
capacidad excesivamente elevada. Además, las afinidades de unión no
se correlacionaban con la actividad secretora de la hormona del
crecimiento de los péptidos. La falta de correlación entre la unión
y la actividad secretora de la hormona del crecimiento más
probablemente era el resultado de la actividad específica
relativamente baja (en el caso de GHRP-6 [T]) y de
las propiedades de unión no específicas de los radioligandos.
El problema a solucionar por la presente
invención era proporcionar un análogo de la grelina marcado con
fluorescencia que se pudiera utilizar en un cribado de alto
rendimiento.
La presente invención se refiere al secretagogo
de la hormona del crecimiento marcado de fórmula
R1-Cys-F
donde R1 es una secuencia peptídica
derivada de la secuencia polipeptídica de la grelina (Núm. Id. Sec.:
1), y F es un colorante fluorescente. En un modo de realización
preferido, R1 es el Núm. Id. Sec.: 2. En otro modo de realización
preferido, R1 es octanoilado. En otro modo de realización preferido,
R1 es N-octanoilado. En un modo de realización más
preferido, R1 es
^{1}Gly-Ser-Dapa(N-octanoilo)-Phe-^{5}Leu-Ser-Pro-Glu-His-^{10}Gln-Arg-Val-Gln-
Gln-^{15}Arg-Lys-Glu-Ser. La N-octanoilación aumenta la estabilidad de la grelina frente la actividad esterasa. En un modo de realización todavía más preferido, F se selecciona del grupo que consiste en Texas Red, tetrametil-rodamina, MR121. ("New fluorescent dyes in the red region for biodiagnostics" M. Sauer et al 1995 J. Fluoresc. Vol. 5, pp 247-261, o BODIPY-FL ácido 4,4-difluoro-5,7-dimetil-4-bora-3a,4a-diaza-s-indaceno-3-propiónico. En un modo de realización más preferido, F es MR121.
Gln-^{15}Arg-Lys-Glu-Ser. La N-octanoilación aumenta la estabilidad de la grelina frente la actividad esterasa. En un modo de realización todavía más preferido, F se selecciona del grupo que consiste en Texas Red, tetrametil-rodamina, MR121. ("New fluorescent dyes in the red region for biodiagnostics" M. Sauer et al 1995 J. Fluoresc. Vol. 5, pp 247-261, o BODIPY-FL ácido 4,4-difluoro-5,7-dimetil-4-bora-3a,4a-diaza-s-indaceno-3-propiónico. En un modo de realización más preferido, F es MR121.
Un secretagogo de la hormona del crecimiento
marcado descrito aquí anteriormente se puede utilizar para
identificar un compuesto que se puede unir al receptor del
secretagogo de la hormona del crecimiento. Dicho secretagogo de la
hormona del crecimiento marcado también se puede utilizar para
identificar un receptor celular como receptor de secretagogo de la
hormona del crecimiento.
La presente invención también proporciona un
proceso para sintetizar un secretagogo de la hormona del crecimiento
marcado que comprende los pasos de a) unión de una Cys al
aminoácido C-terminal; y b) reacción del péptido
que contiene el tiol con un colorante fluorescente. Preferiblemente,
dicho colorante fluorescente se selecciona del grupo que consiste
en Texas Red, tetrametil-rodamina, MR121. ("New
fluorescent dyes in the red region for biodiagnostics" M.
Sauer et al 1995 J. Fluoresc. Vol. 5, pp
247-261, o BODIPY-FL ácido
4,4-difluoro-5,7-dimetil-4-bora-3a,4a-diaza-s-indaceno-3-propiónico.
Muccioli et al. (J. Endocrin. Invest.
2001, 24, p.RC7-RC9) revela una
grelina-Tyr4-^{125}I radiomarcada.
La declaración en p. RC8, columna derecha, de que los sitios de
unión del GHS sintético son mayores que los receptores de la grelina
indica que este péptido de grelina radiomarcado tiene una alta
actividad de unión no específica.
El documento WO01/92292 revela análogos de
grelina no marcados. En el análisis de fijación a receptores
revelado en la p.17, se utiliza una molécula pequeña (no un péptido)
de unión al receptor del secretagogo de la hormona del crecimiento
marcado son ^{35}S.
\newpage
El documento WO01/38355 revela un péptido
relacionado con la motilina con una secuencia que corresponde a la
grelina. Se revela un péptido marcado de forma fluorescente sin
residuo Cys en el extremo C-terminal. Dicho péptido
sólo se utilizó en experimentos in vivo. No hay indicaciones
para el uso del péptido de grelina marcado de forma fluorescente en
cribados, incluyendo los cribados de alto rendimiento.
La presente invención también se refiere a un
método in vitro para identificar un compuesto que se puede
unir a un receptor del secretagogo de la hormona del crecimiento que
comprende el contacto de dicho compuesto con un huésped que expresa
un receptor del secretagogo de la hormona del crecimiento en
presencia de un secretagogo de la hormona del crecimiento marcado
aquí antes descrito, o con una preparación de membrana de tal
huésped, y un control de si el compuesto influencia la unión del
secretagogo de la hormona del crecimiento marcado aquí antes
descrito al receptor del secretagogo de la hormona del crecimiento
mediante la medida de la fluorescencia de la marca del secretagogo
de la hormona del crecimiento marcado unido aquí antes descrito.
El huésped, que no procede de células
embrionarias humanas, puede ser una muestra de tejido, células
primarias o células en cultivo que expresan un receptor del
secretagogo de la hormona del crecimiento de forma natural, o que se
transfectan de forma transitoria o estable con un receptor del
secretagogo de la hormona del crecimiento. Los métodos para
transfectar las células son bien conocidos en el ámbito (Sambrook
et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual (1989), Cold
Spring Harbor Laboratory Press, New York, USA).
Preferiblemente, dicho método es un método de
cribado de alto rendimiento. El método descrito aquí anteriormente
es sensible con respeto al pH del tampón de prueba utilizado. Una
desviación del pH de 0,2 resulta en una pérdida del 50% de la unión.
Por eso, en un modo de realización preferido, el tampón de prueba
utilizado en dicho método tiene un pH de 7,2. Los péptidos de esta
invención tienden a unirse a las superficies. De esta manera, en un
modo de realización preferido, el utensilio de plástico se compone
de una superficie que no se une o se bloquea con una solución de
caseína. El término "utensilio de plástico" como se utiliza
aquí se refiere a las placas utilizadas para en análisis, así como
cualquier tipo de tubo utilizado para preparar soluciones que se
componen de los péptidos de esta invención. Preferiblemente, dicha
solución de caseína contiene caseína al 1%. Más preferiblemente, el
bloqueo se lleva a cabo durante toda la noche. En un modo de
realización más preferido, las placas bloqueadas se lavan con tampón
antes de ser usadas.
La presente invención también proporciona un
método de identificación de un receptor celular como un receptor del
secretagogo de la hormona del crecimiento que comprende el contacto
de un huésped que se sospecha que expresa un receptor del
secretagogo de la hormona del crecimiento con el secretagogo de la
hormona del crecimiento marcado descrito aquí anteriormente y
determinación de si la unión ha tenido lugar o no.
Además, la presente invención se refiere a un
método para identificar la actividad de un compuesto como un
secretagogo de la hormona del crecimiento que comprende el contacto
del compuesto que se sospecha que tienen actividad como secretagogo
de la hormona del crecimiento con un huésped que expresa un receptor
del secretagogo de la hormona del crecimiento en presencia del
secretagogo de la hormona del crecimiento marcado descrito aquí
anteriormente y control de si el compuesto que se sospecha que tiene
actividad como secretagogo de la hormona del crecimiento tiene
influencia en la unión del secretagogo de la hormona del crecimiento
descrito aquí anteriormente al receptor del secretagogo de la
hormona del crecimiento.
Fig. 1: Montaje de las placas para el ensayo de
cribado de alto rendimiento (HTS, por sus siglas en inglés)
Fig. 2: Curvas de competencia del
Zeiss-System, condiciones HTS. A) Competencia de la
grelina (1-19) MR121 con H6935; b) Competencia de la
grelina (1-19) MR121 con hexarelina.
Fig. 3: Afinidad de los análogos fluorescentes,
determinada por análisis de competencia
125I-grelina. A) grelina (1-19)
MR121; b) grelina (1-19) TMR; c) grelina
(1-19) BoFl (BIODIPY-FL); d) grelina
(1-19) Texas Red.
Fig 4: Polarización de los análogos
fluorescentes, determinada según el protocolo del ejemplo 2.2.1 y
2.2.2.
Rojo (Más oscuro, barra de la izquierda):
grelina(1-19)MR121, Azul (Más claro,
barra de la derecha):
grelina(1-19-N-oct)MR121.
1) Polarización fluorescente de los ligandos
fluorescentes unidos totales (en presencia de membranas
GHSR-1a); 2) Polarización fluorescente de los
ligandos libres (en presencia de membranas GHSR-1a y
exceso de competidor); 3) Polarización fluorescente de los ligandos
fluorescentes en tampón.
Ejemplo
1.1
\global\parskip0.900000\baselineskip
La síntesis en fase sólida de flujo continuo se
efectuó en el sistema de síntesis peptídica Pioneer^{TM}, que
empieza con la resina Tenta Gel S RAM (0,25 mmol/g (Rapp Polymere
GmbH, Tübingen, Alemania) según el método descrito en "Fmoc Solid
Phase Peptide Synthesis: A practical approach" (Oxford University
Press 2000) pp 41-74, Eds. W.C. Chan and P.D.
White. Se utilizó el grupo Fmoc lábil a bases para la protección de
a-amino. Se protegieron las cadenas laterales con
los siguientes grupos protectores: -Asn(Trt),
Glu(OtBu), Ser(tBu), His(Trt), Gln(Trt),
His(Trt), Arg(Pbf), Lys(Boc), Cys (Trt). Se
activaron los Fmoc-aminoácidos (4 equiv.) con una
cantidad equivalente de
O-(1,2-dihidro-2-oxopirid-1-il)-N,N,N',
tetrafluoroborato de N'-tetrametiluronio (TPTU) y
N,N-diisopropiletilamina (base de Hünig). La
desprotección de Fmoc se consiguió con piperidina al 20% en DMF. La
síntesis automatizada se interrumpió después de incorporar el
residuo ^{4}Phe en la secuencia diana. La síntesis peptídica se
continuó semimanualmente utilizando un sintetizador de proteínas
SP650 (Labortec AG). Se añadió
Fmoc-^{3}Ser-OH desprotegido de
cadena lateral (0,65 g, 2 mmol), TPTU (0,59 g, 2 mmol), base de
Hünig (1,03 mL) a la resina peptídica y se dejó la unión durante 1
h en disolvente DMF (negativo para el test de la ninhidrina). Se
consiguió la octanoilación del hidroxilo de cadena lateral
utilizando ácido caprílico (2,0 mL, 12 mmol),
N,N'-diisopropilcarbodiimida, (1,9 mL, 12 mmol)
N,N'-dimetilaminopiridina (18 mg, 0,15 mmol) en el
solvente N-metilpirrolidina. Después de 4 horas se
filtró la mezcla de reacción y se siguió la síntesis utilizando el
protocolo de síntesis peptídica estándar (arriba). Se trató la
resina
^{1}Gly-Ser(tBu)-Ser(octanoil)-Phe-^{5}Leu-Ser(tBu)-Pro-Glu(OtBu)-His(Trt)-^{10}Gln(Trt)-Arg(Pbf)-Val-Gln(Trt)-Gln(Trt)-^{15}Arg(Pbf)-Lys(Boc)-Glu(OtBu)-Ser(tBu)-Cys(Trt)-NH_{2}
TentaGel-S (2,0 g) con una mezcla (100 mL) de 95%
de TFA, 2,5% de H_{2}O, 2,5% de EDT, 2,5% de triisopropilsilano
durante 5 horas. Se concentró la mezcla de reacción y se vertió en
dietiléter y el precipitado se recogió mediante filtración y se
liofilizó del agua. Se purificó el péptido bruto (0,80 g) mediante
RP-HPLC preparativa. Se obtuvo
^{1}Gly-Ser-Ser(octanoil)-Phe-^{5}Leu-Ser-Pro-Glu-His-^{10}Gln-Arg-Val-Gln-Gln-^{15}Arg-Lys-Glu-Ser-Cys-NH2
(0,18 g, análisis EM Ion-spray
(M+2H)^{2+}/2 = 1165,4, (M+3H)^{3+}/3 =
777,2).
Ejemplo
1.1b
Se añadió una solución de
Fmoc-L-Dapa-OH
Neosysytem FA04002 8 (3,3 g, 10 mmol) en DMF (10 mL) a una mezcla
pre-activada que contenía ácido caprílico (1,54 mL,
10 mmol), TPTU (2,8 g, 9,5 mmol) y base de Hünig (3,4 mL, 20 mmol)
en DMF (20 mL). La mezcla de reacción se agitó durante 1 h, se
concentró bajo presión reducida, se disolvió en acetato de etilo y
se lavó con 5%/10% KHSO_{4}/K_{2}SO_{4}, salmuera, se secó
sobre Na_{2}SO_{4}, se filtró y se concentró. Cristalización a
partir de acetato de etilo/hexano: 3,7 g, 82% ; EM = 451,4
(MH)^{-}.
La síntesis peptídica incorporando
Fmoc-L-Dapa(N-octanoyl)-OH
se llevó a cabo en un sistema de síntesis peptídica Pioneer^{TM}
como se describe arriba empezando con una resina Tentagel
S-NH_{2} (0,55 mmol), dando el péptido purificado
^{1}Gly-Ser-Dapa(N-octanoil)-Phe-^{5}Leu-Ser-Pro-Glu-His-^{10}Gln-Arg-Val-Gln-Gln-^{15}Arg-Lys-Glu-Ser-Cys-NH_{2}
:135 mg; Ion-spray EM: (M+2H)^{2+}/2 =
1164,8, (M+3H)^{3+}/3 = 776,8).
Ejemplo
1.2
El péptido de arriba, que contiene tiol, (1,3
mg) se disolvió en 9:1 DMSO: tampón fosfato 50 mM pH 6 a una
concentración final 2,5 mM. Se añadieron 1,2 equivalentes de TxR
(Texas Red)-Maleimide (solución en DMSO preparada
fresca 30 mM) y se dejó que la mezcla reaccionara a temperatura
ambiente durante 10 minutos. La mezcla de reacción se purificó
directamente mediante RP-HPLC: 0,17 mg. Análisis EM:
masa monoisotópica calculada: C136H198N36O39S3 = 3055,38; masa
monoisotópica encontrada: 3055,35.
Ejemplo
1.3
El péptido derivado de la tetrametilrodamina
(TMR, por sus siglas en inglés) se preparó de forma análoga al
ejemplo 1.2: A partir de 1,7 mg del material peptídico inicial se
aislaron 0,44 mg de péptido marcado. Análisis EM: masa monoisotópica
calculada: C127H185N35O36S = 2808,34; masa monoisotópica encontrada:
2808,40.
\global\parskip1.000000\baselineskip
Ejemplo
1.4
El péptido derivado de MR121* se preparó de
forma análoga al ejemplo 1.2: A partir de 1,5 mg de material
peptídico inicial se aislaron 0,37 mg del péptido marcado. Análisis
EM: masa monoisotópica calculada: C129H196N37O35S = 2855,44; masa
monoisotópica encontrada: 2855,38.
Ejemplo
1.5
El péptido derivado de BODIPY-FL
(ácido
4,4-difluoro-5,7-dimetil-4-bora-3a,4a-diaza-s-indaceno-3-propiónico)
se preparó de forma análoga al ejemplo 1.2: A partir de 0,7 mg de
material inicial se aislaron 0,20 mg del péptido marcado. Análisis
EM: masa monoisotópica calculada: C119H183BF2N36O34S = 2742,4; masa
monoisotópica encontrada: 2742,4.
Ejemplo
1.6
El péptido derivado de MR121* se preparó de
forma análoga al ejemplo 1.2: A partir de 0,7 mg de material
peptídico inicial se aislaron 0,17 mg de péptido marcado. Análisis
EM: masa monoisotópica calculada: C129H197N36O35S = 2854,46; masa
monoisotópica encontrada: 2854,49.
*MR-121 es un colorante
fluorescente de oxazina. [ver lit.: "New fluorescent dyes in the
red region for biodiagnostics" M. Sauer et al 1995 J.
Fluoresc. Vol. 5, pp 247-261].
Ejemplo
2.1
Las células de riñón de embrión humano HEK 293
(EBNA) crecieron en suspensión y se transfectaron según el método
descrito previamente (Schlaeger and Christensen, Cytotechnology, 30,
71-83, 1999). Se centrifugaron las células durante
10 min a 500 rpm, se lavaron una vez con PBS-0,7 mM
EDTA/(4ºC) y se resuspendieron en
PBS-EDTA-PI (con un cóctel inhibidor
de la proteasa), hasta 2 mL/g de células. Se rompieron las células
con Ultra Turax nivel verde 3 x 15'' con 30'' de rotura en hielo.
Para eliminar los restos se centrifugó la suspensión en un rotor
Sorvall SS34 durante 20 min a 2.000 rpm. Se recogió el sobrenadante
y se centrífugo durante 40 min a 20.000 rpm. Se resuspendió el
sedimento en PBS-EDTA. Se verificó la densidad de
receptor con análisis de fijación a receptores de saturación
utilizando T- MK 0677 para tener 4,9 pmol/mg de proteína.
Ejemplo
2.2
Ejemplo
2.2.1
Las membranas celulares que contienen
GHSR-1ª se diluyeron en tampón FP: Hepes 25 mM,
MgCl_{2} 5 mM, CaCl_{2} 1 mM, PEG al 4%, BSA al 0,1% (fracción
V) a un volumen final de 0,5-1 mL, pasando a través
de una jeringa de 0,4 mm y se sometieron a ultrasonidos 20 pulsos 4
veces mientras se mantenían en hielo. Se preparó una solución 10 nM
de grelina marcada con MR121 (marcador) y soluciones concentradas
x20 de competidor en tampón FP. Para determinar la polarización del
marcador de la unión del receptor, se prepararon tres muestras de
180 \muL: Unión total: Membranas + marcador, Ligando libre:
membranas + marcador + competidor, Fluorescencia de fondo: membranas
+ tampón. Se transfirieron 3 x 50 \muL de cada muestra a placas de
análisis justo después de mezclarlo.
\newpage
Ejemplo
2.2.2
La Figura 1 muestra una posible distribución de
una placa de 384 pocillos para el cribado de alto rendimiento. Para
una serie de cribado, se utilizaron 119 platos de muestra y un plato
de DMSO (membranas p20F1+p22F1). El siguiente, es un ejemplo no
limitante representativo de un protocolo HTS con MR121 como
fluorocromo. Para el análisis, se utilizaron placas Costar para UV
de 384 pocillos con superficie inerte. Se utilizó el siguiente
tampón de análisis: Hepes 25 mM pH 7,2, MgCl_{2} 5 mM, CaCl_{2}
1 mM, polietilenglicol al 4%, y se añadió BSA al 0,1% (Frac. V)
fresco cada semana. Se proporcionaron los receptores como se expone
a continuación: se aislaron las membranas como se describe en el
ejemplo 2.1. La concentración del análisis final era de 1,4 nM de
GHSR-1A como se determina por la unión saturada de
125I-grelina. Los valores típicos para el estoc de
membrana son: Bmax = 6 fmol/\mug; Concentración de proteína = 50
\mug/\muL.
Para evitar la sedimentación, es necesario pasar
las membranas a través de una jeringa (x3/0,4 mm) y someterlas a
ultrasonidos con el equipo "Branson sonifier 250" a un nivel de
intensidad de 3-4 con 4 x 20 pulsos separados por
una pausa de 30 seg. Se mantuvieron las membranas en hielo durante
la exposición a los ultrasonidos. Se diluyeron las membranas hasta
una concentración final del receptor de 1,4 nM.
La grelina marcadora
(1-19)[K19MR121] se diluyó en tampón a partir de un
estoc de DMSO 1 \muM. La concentración del análisis final fue de
0,5 nM. Debido que el péptido tiende a unirse a las superficies, los
utensilios de plástico utilizados para diluir la solución peptídica
o bien estaba compuesta por una superficie inerte, o bien se bloqueó
durante toda la noche con una solución de caseína al 1%, y luego se
lavó con tampón antes de usarse.
Se utilizaron los siguientes pasos para el
cribado de alto rendimiento:
- 1)
- se añadieron 30 \muL de solución de membrana x1,33 a todos los pocillos de las placas de análisis.
- 2)
- se transfirieron 4,4 \mul de tampón a los pocillos "FPBLK"/"100% control" y se transfirieron 4,4 \muL de solución del compuesto de referencia a los pocillos "STD" y "0% control" de placas de reserva a las placas de análisis.
- 3)
- se añadieron 10 \muL de agua con DMSO al 0% a las columnas 3 a 24 de la placa de almacenamiento de compuesto que contenía 1 mL de compuestos 2 mM (Conc. final 20 \muM).
- 4)
- Se mezclaron los contenidos de la placa de almacenamiento.
- 5)
- Se transfirieron 4,4 \muL de compuestos diluidos del plato de almacenamiento al plato de análisis.
- 6)
- Se mezclaron los contenidos de los platos de análisis cinco veces y se incubaron durante 30 min a 24ºC.
- 7)
- se añadieron 5,6 \muL de solución marcadora x7,143 a la placa de análisis excepto en los pocillos A1 a D2 (pocillos marcados "FPBLK" en la Fig. 1) a los cuales se añadieron 5,6 \muL de tampón.
- 8)
- El contenido de las placas de análisis se mezcló 5 veces.
- 9)
- Se transfirieron 30 \muL de solución en cada pocillo de la placa de análisis a la placa de lectura (superficie inerte UV de Corning).
- 10)
- Se incubó la placa de lectura durante 10 minutos a temperatura ambiente.
- 11)
- Se leyó la fluorescencia de MR121 de la placa de lectura a 650-695 nm (5 s, distancia de enfoque de 1 mm, escaneo xy de 0,5 mm), con polarización en paralelo (||) y cruzada (\perp), utilizando un lector de placas de microtitulación plate:vision de Zeiss.
\global\parskip0.000000\baselineskip
<110> F. Hoffmann-La Roche
AG
\vskip0.400000\baselineskip
<120> Grelina marcada fluorescente
\vskip0.400000\baselineskip
<130> 22229
\vskip0.400000\baselineskip
<160> 2
\vskip0.400000\baselineskip
<170> PatenteIn versión 3.2
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 1
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 117
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> precursor de la grelina
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)..(117)
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> grelina
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (24)..(117)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> proteína madura
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> grelina
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (26)..(26)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> residuo derivado del octanoilo
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 1
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 2
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 18
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221>
grelina(1-19)
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)..(18)
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221>
grelina(1-19)
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (3)..(3)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> derivado del octanoilo
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 2
Claims (13)
1. Un secretagogo de la hormona del crecimiento
marcado de la fórmula
R1-Cys-F
donde R1 es una secuencia peptídica
derivada de la secuencia polipeptídica de la grelina del Núm. Id.
Sec.: 1, una Cys está unida al aminoácido C-terminal
de R1 y F es un
fluorocromo.
2. El secretagogo de la hormona del crecimiento
marcado de la reivindicación 1, donde R1 es el Núm. Id. Sec.: 2.
3. El secretagogo de la hormona del crecimiento
marcado de la reivindicación 1, donde R1 está octanoilado.
4. El secretagogo de la hormona del crecimiento
marcado de la reivindicación 1, donde R1 está
N-octanoilado.
5. El secretagogo de la hormona del crecimiento
marcado de la reivindicación 1, donde R1 es
Gly-Ser-Ser(octanoil)-Phe-^{5}Leu-Ser-Pro-Glu-His-^{10}Gln-Arg-Val-Gln-Gln-^{15}Arg-Lys-Glu-Ser.
6. El secretagogo de la hormona del crecimiento
marcado de la reivindicación 1, donde R1 es
^{1}Gly-Ser-Dapa(N-octanoil)-Phe-^{5}Leu-Ser-Pro-Glu-His-^{10}Gln-Arg-Val-Gln-Gln-^{15}Arg-Lys-Glu-Ser.
7. El secretagogo de la hormona del crecimiento
marcado de las reivindicaciones 1 a la 6, donde F se selecciona del
grupo que consiste en TxR, TMR, MR121 o
BODIPY-FL.
8. Utilización in vitro del secretagogo
de la hormona del crecimiento marcado de cualquiera de las
reivindicaciones de la 1 a la 7 para identificar un compuesto que se
puede unir a un receptor de secretagogo de la hormona del
crecimiento.
9. La utilización de la reivindicación 8 que es
un método que consta de los pasos de:
- a)
- contactar dicho compuesto con una membrana aislada a partir de una célula que expresa un receptor de secretagogo de la hormona del crecimiento en la presencia del secretagogo de la hormona del crecimiento marcado de cualquiera de las reivindicaciones 1 a la 7 en un tampón de análisis;
- b)
- lavar dicha membrana para eliminar el secretagogo de la hormona del crecimiento no unido; y
- c)
- controlar si el compuesto influencia la unión del secretagogo de la hormona del crecimiento de cualquiera de las reivindicaciones 1 a la 7 al receptor del secretagogo de la hormona del crecimiento mediante la medida de la fluorescencia de dichas membranas.
10. El uso de la reivindicación 9, donde dicho
método es un método de cribado de alto rendimiento.
11. El uso de las reivindicaciones 9 o 10, donde
dicho tampón de análisis tiene un pH de 7,2.
12. Un proceso para sintetizar un secretagogo de
la hormona del crecimiento marcado según las reivindicaciones 1 a la
7 que comprende los pasos de
- a)
- unir una Cys al aminoácido C-terminal; y
- b)
- reaccionar el péptido con tiol con un colorante fluorescente.
13. Un método in vitro de identificación
de un receptor celular como un receptor del secretagogo de la
hormona del crecimiento que comprende el contacto de un huésped que
se sospecha que expresa un receptor del secretagogo de la hormona
del crecimiento con el secretagogo de la hormona del crecimiento
marcado de cualquiera de las reivindicaciones 1 a la 7 y determinar
si ha tenido lugar la unión.
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