ES2301159T3 - Proteina supresora de tumores prb2, productos geneticos relacionados, y adn codificante de los mismos. - Google Patents

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Abstract

LA INVENCION SUMINISTRA UNA NUEVA PROTEINA SUPRESORA DE TUMORES (PRB2) DE LA FAMILIA DEL RETINOBLASTOMA, Y EL ADN QUE CODIFICA LA MISMA.

Description

Proteína supresora de tumores pRb2, productos genéticos relacionados, y ADN codificante de los mismos.
Campo de la invención
La presente invención se refiere a una proteína supresora de tumores (pRb2) de la familia de retinoblastoma que se une al dominio transformante de E1A. La invención también se refiere al DNA que codifica pRb2 [SEQ ID NO:2] y los productos génicos relacionados.
Antecedentes de la invención
Actualmente se cree que muchos tipos de cáncer en humanos son causados por un desequilibrio de los reguladores del crecimiento en el interior de una célula. Una disminución en los reguladores del control negativo del crecimiento y/o su desactivación puede causar un estado canceroso. Adicionalmente, un incremento en los reguladores del control positivo del crecimiento puede también causar un estado canceroso.
Desde la identificación del primer gen supresor de tumores, muchos de los esfuerzos en la investigación del cáncer se han centrado en la identificación de nuevos genes supresores de tumores y su participación en el cáncer humano. Se piensa que muchos de los tipos de cáncer humano se desarrollan por una pérdida de heterozigosidad de genes putativos supresores de tumores aún no identificados (Lasko et al., Annu. Rev. Genetics, 25, 281-296 (1991)) según la hipótesis de la doble mutación (two-hit) de Knudson (Knudson, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 68, 820-823 (1971)).
Uno de los genes supresores de tumores más estudiados es el gen de susceptibilidad a retinoblastoma (rb), cuyo producto génico (pRb) se ha demostrado que juega un papel clave en la regulación de la división celular. En células en interfase, pRb participa en el mantenimiento del estado de quiescencia de la célula reprimiendo la transcripción de genes necesarios para el ciclo celular a través de la interacción con factores de transcripción, como E2F (Wagner et al., Nature, 352, 189-190 (1991); Nevins, Science, 258, 424-429 (1992); y Hiebert et al., Genes Develop., 6, 177-185 (1992)). La pérdida de esta actividad puede provocar la transformación celular tal como se evidencia por la inversión del fenotipo transformado en células pRb tras el reemplazo de un pRb funcional (Huang et al., Science 242 1563-1565 (1998); Brookstein et al., Science, 247 712-715 (1990); y Sumegi et al., Cell Growth Differ., 1 247-250
(1990)).
Tras la entrada en el ciclo celular, parece que pRb es fosforilado por quinasas dependientes del ciclo celular (Lees et al., EMBO J. 10 4279-4290 (1991); Hu et al., Mol. Cell. Biol., 12 971-980 (1992); Hinds et al., Cell, 70 993-1006 (1992); Matsushime et al., Nature, 35 295-300 (1992)) que, según se piensa, permiten su disociación de los factores de transcripción y, por tanto, la expresión de genes necesarios para la progresión del ciclo celular. Cabe mencionar que la asociación de pRb con reguladores del ciclo celular como ciclinas y quinasas dependientes del ciclo celular indica un carácter universal de su función.
Sin embargo, la participación de pRb en el cáncer humano se ha restringido a un número limitado de tipos de tumor, indicando que esta hipotética función universal podría ser ejercida por otros productos génicos de una manera específica de cada tipo celular. Consecuentemente, en ratones, la inactivación (knock out) del gen rb afecta sólo a tipos celulares específicos y tras varios días de desarrollo embrionario (Jacks et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 68 820-823 (1992); Lee et al., Nature, 359 288-294 (1992); Clarke et al., Nature, 359 328-330 (1992)).
Una herramienta útil en la identificación de factores celulares implicados en la regulación del ciclo celular ha sido la capacidad de varias proteínas transformantes de virus tumorales de DNA humano para activar la proliferación celular. De esta manera, los reguladores negativos del crecimiento celular podrían ser dianas efectivas para su inactivación por estas proteínas virales, como ocurre con el producto del gen de retinoblastoma.
Se ha encontrado que el adenovirus E1A, al antígeno SV40 T, y el papilomavirus E7 son tres proteínas virales que se unen a pRb. Esta unión es la responsable de la liberación de factores de transcripción necesarios para la expresión de genes del ciclo celular (Nevins, Science, 258 424-429 (1992); Bandara et al., Nature, 351 494-497 (1991)).
Un motivo conservado encontrado en las tres proteínas virales permite la interacción y la formación del complejo con pRb (Moran, Curr. Op. Gen. Dev., 3 63-70 (1993)). En el caso de la proteína del adenovirus E1A, este motivo se localiza en el dominio transformate 2, que es necesario para la activación del crecimiento. El producto p107 relacionado con pRb, también se une en esta región (Egan et al., Mol. Cell. Biol., 8 3955-3959 (1988); Whyte et al., Cell, 56 67-75 (1989)).
El dominio 2 también es el lugar de interacción de una proteína adicional de unión a E1A, p130 (Giordano et al., Oncogene, 6 481-485 (1991)). Esto ha llevado a sugerir que p130 tiene una relación estructural con pRb y p107 (Moran, Curr. Op. Gen. Dev., 3 63-70 (1993)).
El dominio de unión a E1A en pRb y p107 es una región conservada llamada "región bolsillo" (pocket region) (Kaelin et al., Mol. Cell. Biol., 10 3761-3769 (1990); Ewin et al., Cell, 66 1155-1164 (1991)), y se piensa que juega un papel fundamental en la función de estas proteínas. El bolsillo (pocket) está estructuralmente formado por dos regiones A y B, que están conservadas en pRb y p107 y separadas por separadores no conservados de distintos tamaños en pRb y p107.
Además de pRb y p107, existen otras proteínas celulares de unión a E1A que han sido identificadas por experimentos de co-inmunoprecipitación utilizando anticuerpos frente a E1A. Estas proteínas celulares incluyen las formas mayoritarias de los polipéptidos p300, p130, p60/ciclina A y otras formas minoritarias varias (Yee, et al., Virology 147 142-153 (1985); Harlow et al., Mol. Cell. Biol. 6 1579-1589 (1986); Giordano, et al., Cell 58 981-990 (1989); Giordano et al. Science 253 1271-1275 (1991)). La unión a la región N-terminal ha demostrado ser exclusiva de p300 (Egan et al., Mol. Cell. Biol., 8 3955-3959 (1988); Whyte et al., Cell, 56 67-75 (1989); Stein et al., J. Virol., 64 4421-4427 (1990)), y pRb2 falla de forma consistente en la unión a esta región. Ambos dominios 1 y 2 de la proteína E1A han demostrado ser necesarios para la unión a E1A del siguiente grupo de proteínas: pRb, p107, p60/ciclina A, y p130 (Egan et al., Mol. Cell. Biol., 8 3955-3959 (1988); Whyte et al., Cell, 56 67-75 (1989); Giordano et al. Science 253 1271-1275 (1991)). Además, se ha demostrado previamente que el mutante E1A-928 se une a p107 y p60/ciclina A, pero no a pRb y p130.
La asociación de pRb con factores de transcripción, como E2F, sucede por interacción en la región bolsillo (Raychaudhuri et al., Genes Develop., 5 1200-1207 (1991)) y, recientemente, se ha demostrado que p107 ha demostrado ejerce semejante perfil de unión (Cao et al., Nature, 355 176-179 (1992)). Además, en varios cánceres humanos la región bolsillo se encuentra mutada, donde se piensa que una falta de función de la proteína pRb está implicada en la adquisición del fenotipo transformado (Hu et al., EMBO J., 9 1147-1153 (1990)); Huang et al., 1990).
Dyson et al., J. Virology, 66 6893-6902 (1992) sugiere que E1A requiere de dos regiones de pRb para formar complejos estables con la proteína de retinoblastoma y que son necesarias para la asociación de E1A con otras proteínas, incluyendo p130, p107 ciclina A y p33^{cdk2}.
Es necesario identificar y secuenciar nuevos genes relacionados con rb que podrían estar implicados en la inhibición del crecimiento celular. Son necesarios genes relacionados con rb y sus productos proteicos que también tengan actividad supresora de tumores en tipos celulares específicos.
Breve descripción de las figuras
La Figura 1 es una representación esquemática de las formas salvaje y mutante de la proteína E1A. Las formas mutantes son pm928/961, d12-36, d138-67 y d173-120. La naturaleza de cada mutación está representada esquemáticamente.
La Figura 2 es un gel SDS-PAGE que muestra la unión de la proteína pRb2 a una construcción de fusión de la proteína E1A salvaje y la proteína glutation-S-transferasa (GST) (calle 2) y a construcciones de mutantes de E1A fusionadas a una proteína GST: d12-36 (calle 3), d138-67 (calle 4), d173-120 (calle 5), y pm928/961 (calle 6). La proteína GST sin E1A fusionada se incluyó como control (carril 1), que indicaba la no unión con la proteína pRb2.
Compendio de la invención
La presente invención se define en las reivindicaciones de la memoria descriptiva, a la que se hará referencia a continuación.
De esta manera, la presente invención proporciona un vehículo de clonación de DNA recombinante que comprende una secuencia de DNA que comprende la secuencia de DNA del gen de pRb2 humano. Una secuencia preferida de DNA es una secuencia según la SEQ ID NO: 1. El DNA comprende una secuencia que codifica la secuencia de aminoácidos según la SEQ ID NO:2.
En otra realización, la presente invención proporciona una proteína que tiene una secuencia de aminoácidos según la SEQ ID NO:2. La proteína no está fosforilada.
En una realización adicional la presente invención proporciona una línea celular hospedante transformada por el DNA del vehículo de clonación descrito arriba, línea celular hospedante que expresa el DNA del vehículo de clonación para producir una proteína. Preferiblemente el DNA tiene una secuencia según la SEQ ID NO:1, y la proteína producida tiene una secuencia según la SEQ ID NO:2.
Descripción detallada de la invención
La proteína pRb2 es un miembro previamente no secuenciado ni caracterizado de la familia pRb de proteínas supresoras de tumores. Esta proteína se nombró como pRb2 debido a que se une a la proteína Adenovirus E1A de una forma similar a pRb y p107. Así, la secuencia de cDNA que codifica pRb2 se designó como el gen de pRb2.
Se utilizó la reacción en cadena de la Polimerasa (PCR), empleando sondas derivadas de los dominios 1 y 2 del gen rb, para identificar la secuencia de cDNA de pRb2 de la siguiente forma.
\newpage
Se diseñaron oligonucleótidos sintéticos degenerados basados en secuencias conservadas de aminoácidos, flanqueando los espaciadores en pRb y p107. Estos oligonucleótidos se denominaron cebador A y cebador B y se utilizaron como cebadores o iniciadores en la PCR para aislar y clonar la secuencia de cDNA de pRb2.
El cebador A es un oligonucleótido que contiene 18 nucleótidos que codifican la secuencia de aminoácidos Phe-Tyr-Lys-Val-Ile-Glu (SEQ ID NO:3). El extremo 5' del cebador A también contiene nueve nucleótidos que forman un sitio de restricción BamHI.
El cebador B es un oligonucleótido que contiene 18 nucleótidos que codifican la secuencia de aminoácidos Gln-Asp-Leu-His-Arg-Asp (SEQ ID NO:4). El extremo 5' del cebador B también contiene nueve nucleótidos que forman un sitio de restricción HindIII.
Cada uno de los cebadores A y B de 18 nucleótidos equivalen a porciones conservadas en las regiones bolsillo de pRb y p107. Los dos sitios de restricción (BamHI para el cebador A, y HindIII para el cebador B) se usaron para subclonar convenientemente los fragmentos amplificados de la PCR en un vector disponible comercialmente (pBluescript, Stratagene, La Jolla, CA).
El producto de la PCR se usó como sonda para el rastreo de librerías de cDNA de células 293 y HeLa humanas. A partir del rastreo, se identificaron varios clones positivos. Estos clones se secuenciaron y analizaron para un clon que contuviera cDNA completo.
Uno de los clones de cDNA de HeLa contenía un codón de iniciación putativo compatible con la secuencia de iniciación de Kozak (Kozak, J. Mol. Biol., 196 947-950 (1987). Este clon mostraba un único marco de lectura abierto que termina en un codón de terminación 3.249 pares de bases secuencia abajo (ver SEQ ID NO:1). La secuencia completa incluye 55 pares de bases secuencia arriba del marco de lectura abierto que no contiene ningún sitio de iniciación putativo, y una región 3' no codificante terminada en una cola de poli A. El marco de lectura abierto codificaba para un polipéptido de 1.082 aminoácidos (SEQ ID NO:2) con una masa molecular de aproximadamente 120 kD. Este clon de cDNA se denominó rb2 y, de ahí, la proteína codificada pRb2.
La secuencia de la proteína pRb2 (SEQ ID NO:2), al compararla con las secuencias de las proteínas pRb y p107, muestra un alto nivel de identidad, 53% con respecto a p107, y 32% con respecto a pRb. Esto sugiere una relación más próxima de pRb2 con p107. Una comparación parcial de la secuencia de aminoácidos de estas tres proteínas muestra que la región bolsillo está claramente conservada en pRb2, principalmente a nivel de los dominios A y B. Esto sugiere que pRb2 tiene propiedades similares a pRb y p107, como la formación de complejos de proteínas asociadas al ciclo celular, que se sabe que se producen vía la región bolsillo. Esto sugiere que pRb2 podría estar implicada en la maquinaria del ciclo celular. Además, las elevadas identidades encontradas en las porciones C y N-terminal entre pRb2 y p107 indican un papel para estas regiones en la función de p107 y pRb2 que las puede diferenciar de pRb.
El clon de cDNA de pRb2 se transcribió in vitro a un segmento de ARN por la reacción de adición de la caperuza por la RNA polimerasa de T7 sobre el pBluescript-pRb2 lineal. El producto de transcripción resultante (segmento de ARN) se extrajo con una solución de fenol/cloroformo y se precipitó con una solución de etanol.
El producto de transcripción se usó como sustrato para la traducción in vitro a una proteína, usando un lisado de reticulocitos de conejo (Promega, Biotec, Madison, WI) y ^{35}S-metionina como marcador radiactivo (Pelham et al., Eur. J. Biochem., 67 248-256 (1976)). Se produjeron varias formas truncadas de la proteína. La forma proteica más grande de pRb2 migraba a aproximadamente 120 kD en SDS-PAGE. La banda más prominente corresponde a una forma proteica que migra a alrededor de 90 kD, y una tercera forma proteica se encontró que migraba a 85 kD.
Tras el aislamiento, se analizaron las propiedades de unión de la proteína pRb2 de 120 kD y sus formas truncadas de 90 y 85 kD a la proteína E1A. Los resultados de unión a E1A se compararon con las propiedades de unión de las proteína pRb y p107 a E1A. Ambas proteínas pRb y p107 se unen a la proteína de adenoviral E1A a través de sus respectivas regiones bolsillo. La prueba de la unión de la proteína E1A a la proteína pRb2 indicaría que esta última proteína tiene un papel clave en la regulación de la división celular. La capacidad de unión de pRb2 a E1A se determinó a continuación.
Se obtuvieron formas salvajes y mutantes de la proteína E1A. La naturaleza de las mutaciones están representadas en la Figura 1. Se realizó un ensayo de unión para analizar la unión de las proteínas salvaje y mutante de E1A con la proteína pRb2 traducida in vitro (proteína de 120 kD y proteínas truncadas de 90 kD y 85 kD) y preaclaradasde la solución de traducción. Cada una de las tres formas mayoritarias de pRb2 traducidas in vitro se unieron a E1A.
Una mutación de deleción en E1A que implica a la porción N-terminal de E1A (d12-36) no afectó a la unión de pRb2 a E1A. Tampoco se vio afectada la unión de pRb2por mutaciones de deleción que implican al dominio transformante 1 de E1A (mutantes de E1A d138-67 y d173-120). Esto sugiere que la unión de pRb2 a E1A no se produce vía estas regiones de E1A. Sin embargo, la capacidad de unión de la proteína pRb2 se suprimió casi completamente cuando se utilizó una proteína mutante de E1A que contenía una doble mutación en el dominio transformante 2 (mutante E1A pm928/961, donde Gly se sustituyó por Cys en la posición 124, y Glu por Lys en la posición 135). Por tanto, el dominio transformante 2 de E1A es necesario para unirse a pRb2. Esto sugiere que la capacidad de unión de pRb2 a E1A está involucrada, al menos en parte, en la actividad transformante de E1A.
Aunque la proteína pRb2 es similar en peso molecular a la proteína p130 y ambas tienen similares perfiles de unión a las proteínas salvaje y mutante de E1A las dos proteínas no son idénticas. La proteína p130 está fosforilada en restos de Ser y Thr mientras que pRb2 no está fosforilada. Además, p130 existe en más de una forma fosforilada.
El 11 de Agosto de 1993 se depositó en la Colección Americana de Cultivos Tipo (ATCC), Rockville, MD, con el número de registro 75521, un vector de clonación designado como pBluescript-pRb2 que contiene el cDNA de pRb2.
El 11 de Agosto de 1993 se depositó en la ATCC, Rockville, MD, con el número de registro 69383, una estirpe de E. coli designada como E. coli pBluescript-pRb2 conteniendo un plásmido que contiene el cDNA de pRb2.
Es bien conocido por expertos en ingeniería genética el uso de la secuencia nucleotídica SEQ ID NO:1 o secuencias relacionadas que codifican para la proteína pRb2 de la presente invención para producir la proteína pRb2 vía procesos microbiológicos. Para aquella persona experta en la técnica, es más sencillo el uso de la secuencia nucleotídica SEQ ID NO:1 para obtener pRb2 utilizando el vector de clonación pBluescript-pR b2 de la invención.
La fusión de secuencias de nucleótidos que codifican para la proteína pRb2 dentro de un vector de expresión y su transformación o transfección a hospedadores, tanto eucarióticos (levaduras o células de mamíferos) como procarióticos (células bacterianas), son procedimientos estándar utilizados para la producción de proteínas conocidas, como por ejemplo, insulina, interferones, la hormona de crecimiento humana y similares. De acuerdo con la presente invención se pueden emplear procedimientos similares, o modificaciones obvias de los mismos, para preparar proteínas pRb2 por medios microbiológicos o por tecnología de cultivo tisular de mamíferos.
Las moléculas de ácidos nucleicos que codifican para la proteína pRb2 se pueden insertar en vectores conocidos pasa su uso en técnicas estándar de DNA recombinante para obtener la proteína pRb2 recombinante. Las técnicas estándar de ADN recombinante incluyen aquellas técnicas descritas por Sambrook et al., Eds., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2ª ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989 y por Ausubel et al., Current Protocols in Molecular Biology, J. Wiley & Sons, New York, NY (1991). Los vectores pueden ser circulares o no circulares. La célula hospedadora puede ser procariótica o eucariótica. El hospedador procariótico preferido comprende E. coli. El huésped eucariótico preferido incluye levaduras, células de insecto y de mamífero. Las células de mamífero preferidas incluyen, células de primate como células de mono transformadas por virus de simio (por ejemplo, células COS), células humanas y células de ovario de hamster Chino.
El experto en la técnica valorará el hecho de que el fragmento de cDNA representado por SEQ ID NO:1 es sólo un segmento de DNA que codifica para pRb2. Otros segmentos de DNA equivalentes de semejanza sustancial serán inmediatamente considerados como codificantes de pRb2. La presente invención también incluye aquellas secuencias equivalentes de DNA.
Además, la sustitución de aminoácidos equivalentes en la SEQ ID NO:2 no se espera que afecte a la actividad de la proteína pRb2. Estas sustituciones de aminoácidos podrían ser predichas por aquellos expertos en la técnica. Dichas secuencias de aminoácidos equivalentes también se incluyen en la presente invención.
Se proporcionan los siguientes ejemplos no limitantes para ilustrar la invención.
Ejemplos Ejemplo 1 Obtención de cDNA y secuencias de aminoácidos de pRb2 A. Síntesis de los cebadores para la PCR
Los cebadores A y B se sintetizaron utilizando técnicas clásicas de síntesis de nucleótidos y fueron purificados.
El cebador A contenía 18 nucleótidos que codifican para la secuencia polipeptídica según la SEQ ID NO:3. El extremo 5' era de nueve nucleótidos adicionales que formaban un sitio de restricción BamHI. El cebador B contenía 18 nucleótidos que codifican para la secuencia polipeptídica según la SEQ ID NO:4. El extremo 5' era de nueve aminoácidos adicionales que formaban el sitio de restricción HindIII.
B. Amplificación por PCR del banco de cDNA de células 293 humanas
Utilizando técnicas clásicas y por transcripción inversa de RNA de células 293 humanas, se obtuvo una librería de cDNA de lambda-ZAPII. El banco de cDNA se amplificó por PCR con los cebadores A y B del ejemplo 1A arriba descrito. La PCR se llevó a cabo usando el kit GeneAmp^{TM} (Perkin Elmer Cetus, Norwalk, CN) de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Brevemente, tras treinta ciclos incluyendo desnaturalización durante un minuto a 94ºC, un minuto de apareamiento (annealing) a 37ºC, y dos minutos de amplificación a 68ºC, se siguió con 15 minutos de amplificación. Como consecuencia, además de los segmentos de pRb y p107, se amplificó por PCR un fragmento de 1 kb.
C. Subclonación y secuenciación nucleotídica del Fragmento de 1 kb
El fragmento de 1 kb amplificado se subclonó en un vector pBluescript (Stratagene). Tras la subclonación, se llevó a cabo la secuenciación de nucleótidos usando el método didesoxi del kit Sequenase (United States Biochemicals). La secuencia de nucleótidos del fragmento de 1 kb reveló alguna homología con los cDNAs de pRb y p107.
D. Hibridación de bancos de cDNA de células 293 y HeLa con la sonda
El fragmento de 1 kb se utilizó como sonda para escrutar bancos adicionales de cDNA. Por el método del cebador al azar (Boehringer Mannheim) se rastrearon librerías de cDNA Lambda-ZAPII de células 293 y HeLa (Stratagene) respectivamente, utilizando el fragmento de 1 kb marcado con \alpha-^{32}P-CTP. Brevemente, el fago lambda-ZAP se adsorbió a la estirpe bacteriana Escherichia coli BB4 y se cultivó en medio agar. Los filtros de nitrocelulosa se hibridaron con la sonda de PCR en un protocolo de alta astringencia que incluía la mezcla de pre-hibridación: SSPE 5x, solución de Denhardt 10x s, 150 \mug/ml de DNA de esperma de arenque; formamida al 50% y SDS al 2%; añadiendo una mezcla de hibridación de 10^{6} cpm/ml de la sonda de PCR de 1 kb a la mezcla de pre-hibridación; y, lavando tres veces durante veinte minutos cada vez a 42ºC con SSD 0.2x y SDS al 0.1%.
E. Análisis de los clones positivos resultantes de la hibridación con la sonda
A partir de los procedimientos de sondeo del ejemplo 1D se localizaron varios clones positivos. Se realizó la escisión in vivo (Stratagene) sobre varios clones de Lambda-ZAP. Se obtuvieron vectores pBluescript conteniendo clones de cDNA. Se reprodujeron los clones de cDNA y se realizó la secuenciación nucleotídica de cada clon de cDNA tal y como se describe arriba en el ejemplo 1C. Se analizaron los resultados de la secuenciación para determinar el cDNA de longitud completa que incluía el fragmento de 1 kb.
Uno de los clones de cDNA de HeLa contenía un codón de iniciación putativo que era compatible con la secuencia de iniciación de Kozak. Este clon mostró un único marco de lectura abierto terminado en un codón de terminación 3.249 pares de bases secuencia abajo (ver SEQ ID NO:1). La secuencia completa incluía 55 pares de bases secuencia arriba del marco de lectura abierto que no contenía ningún sitio de iniciación putativo, y una región 3' no codificante terminada en una cola de poli A. El marco de lectura abierto codificaba para un polipéptido de 1.082 aminoácidos (SEQ ID NO:2) con una masa molecular de aproximadamente 120 kD. Este clon de cDNA se denominó rb2 y, de ahí, la proteína codificada pRb2. El vector pBluescript clonado con el gen pRb2 se denominó pBluescript-pRb2.
La secuencia de la proteína pRb2 (SEQ ID NO:2, que deriva de la correspondiente secuencia de cDNA) al compararlas con las secuencias de las proteínas pRb y p107 mostró un alto nivel de identidad, 53ª con respecto a p107, y 32% con respecto a pRb. Esto sugiere una relación más próxima de pRb2 con p107. Comparaciones parciales de estas tres secuencias proteicas muestran que la región bolsillo está claramente conservada en pRb2, principalmente a nivel de los dominios A y B.
Ejemplo 2 Unión de pRb2 traducida In Vitro a E1A A. Síntesis de los cebadores para la PCR
El clon de cDNA pBluescript-pRb2 del Ejemplo 1E se transcribió in vitro a un segmento de RNA por la reacción de adición de la caperuza por la RNA polimerasa de T7 sobre un pBluescript-pRb2 lineal. El producto de transcipción resultante (segmento de RNA) se extrajo con una solución de fenol/cloroformo y se precipitó con una solución de etanol.
El segmento de RNA producto de la transcripción se usó como sustrato para la traducción in vitro a una proteína utilizando un lisado de reticulocitos de conejo (Promega, Biotec, Madison, WI) y ^{35}S-metionina como marcaje radiactivo (Pelham et al., Eur. J. Biochem., 67 248-256 (1976)). Se obtuvieron varias formas truncadas de la proteína. La forma más grande migraba aproximadamente 120 kD en SDS-PAGE. L más prominente de estas bandas migraba a alrededor de 90 kD, y una tercera se encontró que migraba a 85 kD.
B. Obtención de proteínas E1A salvaje y mutante
Se obtuvieron las formas salvaje y mutante de la proteína E1A. Las formas mutantes eran pm928/961, d12-36, d138-67 y d173-120. La naturaleza de las mutaciones se representan en la Figura 1. Las formas salvaje y mutante de E1A se subclonaron en pGEX-2T y expresaron en E. coli como proteínas de fusión de GST. Después las proteínas E1A se aislaron de cultivos de E. coli mediante técnicas clásicas.
C. Ensayo de unión para Proteínas pRb2 y E1A
Se llevó a cabo un ensayo de unión para analizar la unión de las proteínas E1A salvaje y mutante del Ejemplo 2B a las proteínas pRb2 traducidas in vitro del Ejemplo 2A pre-aclaradas de la solución de traducción. La proteína pRb2 (120 kD, 90 kD, y 85 kD) se liberó con perlas de glutation-sefarosa y GST-glutation-sefarosa en tampón NETN conteniendo DTT 1mM, PMSF 1 mM, y 10 \mug/ml de leupeptina, a 4ºC.
Se incubaron durante una hora a 4ºC 2 \mug de cada proteína E1A con pRb2 pre-aclarada, y se añadieron las perlas de glutation-sefarosa e incubaron durante una hora más. Las proteínas se resolvieron usando SDS-PAGE de acuerdo con los protocolos clásicos y se utilizó un sistema verificador de datos Fuji de fosfoimagen para revelar la señal de la proteína.
Los resultados del ensayo de unión se representan en la Figura 2, que es un SDS-PAGE que muestra la unión a las construcciones E1A salvaje (calle 2) y E1A mutante: d12-36 (calle 3), d138-67 (calle 4), d173-120 (calle 5), y pm928/961 (calle 6). Se incluyó como control GST sin E1A fusionada (carril 1). Se incluyó como control el producto de la traducción in vitro resultante de una reacción de traducción de reticulocito de conejo con RNA no exógeno, que no dio señal (no mostrado).
Cada una de las 3 formas principales de la proteína pRb2 traducida in vitro (120 kD, 90 kD, y 85 kD) unen E1A. Una mutación de deleción implicada en la porción N-terminal de E1A (d12-36) no afecta la unión con pRb2. La unión de E1A a pRb2 no se vio afectada por las mutaciones de deleción d138-67 o d173-120, ambas implicadas en el dominio transformante de E1A. Esto sugiere que la unión de pRb2 a E1A no se da en estas regiones. Sin embargo, la unión se suprimió casi completamente cuando se usó una proteína de fusión E1A conteniendo una mutación doble en el dominio transformante 2 de E1A (mutante E1A pm928/961, donde Gly se sustituyó por Cysen la posición 124, y Glu por Lys en la posición 135). Por tanto, el dominio transformante 2 de E1A es necesario para unir pRb2. Esto sugiere que la capacidad de unión a E1A de pRb2 está involucrada, al menos en parte, en la actividad transformante de E1A. Para propósitos comparativos, se obtuvieron las proteínas pRb y p107 y se realizó un ensayo de unión con las proteínas E1A salvaje y mutante. La proteína pRb2 mostró características de unión similares a las proteínas pRb y p107.
Debido a que la proteína pRb2 une la proteína E1A de una forma similar a la proteína pRb, la proteína pRb2 es una herramienta diagnóstica útil para identificar células infectadas con adenovirus E1A, o un virus de DNA relacionado productor de oncoproteínas relacionadas con la proteína E1A. Debido a la capacidad de unión de pRb2 a E1A, la proteína debe ser administrada a células infectadas con adenovirus E1A, donde puede actuar como supresor del crecimiento celular para invertir los efectos de la oncoproteína de E1A. Esta inversión de los efectos de la proteína E1A podría restaurar el equilibrio del crecimiento celular en cáncer tumoral de retinoblastoma. De esta manera, se cree que pRb2 es útil como agente supresor de tumores, en el tratamiento de cánceres como el cáncer interocular de retinoblastoma. Además, pRb2 podría ser una herramienta de investigación útil para unir e identificar otras oncoproteínas tumorales de virus de DNA que tienen secuencias relacionadas con la proteína E1A.
La presente invención puede realizarse de otras formas específicas sin apartarse de los atributos esenciales de la misma y, por consiguiente, se hará referencia a las reivindicaciones anejas, en vez de a la memoria descriptiva anterior, indicativas del alcance de la invención.
(1) INFORMACIÓN GENERAL:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
SOLICITANTE:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
NOMBRE: Temple University - Of the Commonwealth System of Higher Education
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
CALLE: Broad Street and Montgomery Avenue
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
CIUDAD: Philadelphia
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
ESTADO: Pennsylvania
\vskip0.500000\baselineskip
(E)
PAÍS: United States of America
\vskip0.500000\baselineskip
(F)
CÓDIGO POSTAL (ZIP): PA 19122
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TÍTULO DE LA INVENCIÓN: Proteína supresora de tumores pRb2, productos génicos relacionados, y ADN codificante de los mismos
\vskip0.800000\baselineskip
(iii)
NÚMERO DE SECUENCIAS: 4
\vskip0.800000\baselineskip
(iv)
TIPO DE LECTURA POR ORDENADOR:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
TIPO DE MEDIO: Floppy disk
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
ORDENADOR: IBM PC compatible
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
SISTEMA OPERATIVO: PC-DOS/MS-DOS
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
SOFTWARE: PatentIn Release #1.0, Version #1.25 (EPO)
\vskip0.800000\baselineskip
(v)
DATOS DE SOLICITUD ACTUAL:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
NÚMERO DE SOLICITUD: EP 94925920.4
\vskip0.800000\baselineskip
(vi)
DATOS DE LA SOLICITUD PRIORITARIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
NÚMERO DE SOLICITUD: US 106496
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
FECHA: 12-AGOSTO-1993
\vskip0.800000\baselineskip
(vii)
DATOS DE LA SOLICITUD PRIORITARIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
NÚMERO DE SOLICITUD: WO US 94/09293
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
FECHA: 12-AGOSTO-1994
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO:1:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGUITUD: 3249 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
CLASE: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
TIPO DE CADENA: Sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:1:
\vskip1.000000\baselineskip
1
2 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(3) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO:2:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGUITUD: 1082 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
CLASE: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:2:
\vskip1.000000\baselineskip
3
4
5 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(4) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO:3:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGUITUD: 6 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
CLASE: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:3:
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Phe Tyr Lys Val Ile Glu}
\vskip1.000000\baselineskip
(5) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO:4:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGUITUD: 6 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
CLASE: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:4:
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Gln Asp Leu His Arg Asp}

Claims (14)

1. Un vector de DNA recombinante que comprende una secuencia de DNA que codifica una proteína que tiene la secuencia de aminoácidos SEQ ID NO:2.
2. Un vector según la reivindicación 1, donde la secuencia de DNA comprende la secuencia de DNA SEQ ID NO:1.
3. Un vector según la reivindicación 1 o 2, que es un vector pBluescript.
4. Un vector según la reivindicación 3, que es ATCC No. 75521.
5. Un DNA esencialmente puro que comprende una secuencia de DNA que codifica una proteína que tiene la secuencia de aminoácidos SEQ ID NO:2
6. Un DNA esencialmente puro según la reivindicación 5, donde la secuencia de DNA comprende la secuencia de DNA SEQ ID NO:1.
7. Una proteína aislada que comprende la secuencia de aminoácidos SEQ ID NO:2, no estando fosforilada la proteína.
8. Una célula hospedadora o línea celular transformada por un vector de DNA recombinante según la reivindicación 1 o 2.
9. Una célula hospedadora o línea celular según la reivindicación 8, donde la célula hospedadora es procatiótica.
10. Una línea celular hospedante transformada según la reivindicación 8 que es ATCC No. 69383.
11. Un método para la preparación de una proteína pRb2 humana no fosforilada que comprende cultivar una célula hospedadora que contiene un vector de DNA recombinante según la reivindicación 1 o 2.
12. Uso de una proteína con la secuencia de aminoácidos SEQ ID NO:2, que no está fosforilada, en la fabricación de un medicamento para uso en el tratamiento del cáncer.
13. Uso según la reivindicación 12, donde la proteína invierte los efectos de la oncoproteína E1A.
14. Uso según la reivindicación 13, donde la proteína actúa para restaurar el equilibrio del crecimiento celular en el tumor del cáncer de retinoblastoma.
ES94925920T 1993-08-12 1994-08-12 Proteina supresora de tumores prb2, productos geneticos relacionados, y adn codificante de los mismos. Expired - Lifetime ES2301159T3 (es)

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