ES2301208T3

ES2301208T3 - Composiciones de polinucleotido y antigeno de tumor de prostata.

Info

Publication number: ES2301208T3
Application number: ES98942089T
Authority: ES
Inventors: Reiner Laus; Michael H. Shapero; Larisa Tsavaler
Original assignee: Dendreon Corp
Current assignee: Dendreon Corp
Priority date: 1997-08-20
Filing date: 1998-08-18
Publication date: 2008-06-16
Anticipated expiration: 2018-08-18
Also published as: AU744875B2; JP4234319B2; DE69839123D1; EP1005549B1; CA2300364A1; DE69839123T2; US6194152B1; HK1029139A1; ATE386117T1; EP1005549A2; WO1999009166A3; WO1999009166A2; JP2001514889A; AU9021898A; CA2300364C; NZ503404A

Abstract

Un polinucleótido aislado que codifica un polipéptido que tiene al menos el 80% de identidad de secuencia de aminoácidos con un polipéptido codificado por los nucleótidos 43-3327 de la SEC ID Nº: 14, en el que el % de identidad se calcula usando el programa LALIGN que se encuentra en la serie de programas FASTA Versión 2.0, usando los parámetros por defecto con la matriz BLOSUM50, una ktup de 2 y una penalización por huecos de -12/-2.

Description

Composiciones de polinucleótido y antígeno de tumor de próstata.

Campo de la invención

La invención se refiere a nuevas secuencias codificantes y péptidos obtenidos de tumores de próstata y a métodos in vitro para detectar la presencia de dichas células tumorales.

Antecedentes de la invención

El carcinoma de próstata es una forma de cáncer que afecta a aproximadamente 250.000 hombres en Estados Unidos cada año, convirtiéndolo en uno de los cánceres más frecuentes en los norteamericanos. También es la segunda causa principal de muerte relacionada con cáncer en hombres en este país. Aunque los índices de supervivencia de cinco años para el carcinoma de próstata han aumentado en general durante las pasadas décadas, el tratamiento para la forma metastásica avanzada de la enfermedad no ha mejorado significativamente.

La detección y el tratamiento tempranos del cáncer de próstata continúan siendo, por lo tanto, una de las medidas más eficaces para prevenir su extensión adicional y la mortalidad de la enfermedad. Aunque se han descubierto varios antígenos proteicos que son característicos de tumores malignos, los tumores de próstata no han sido fuentes particularmente abundantes de antígenos diana que puedan usarse para la detección y/o inmunoterapia de la enfermedad, tal como mediante la inmunoterapia pasiva.

Por lo tanto, sería útil proporcionar una o más moléculas o antígenos específicos de enfermedad que puedan usarse en la detección temprana del cáncer de próstata. La presente invención proporciona una nueva secuencia de nucleótidos y los antígenos expresados correspondientes que son útiles en el diagnóstico del carcinoma de próstata.

Sumario de la invención

La presente invención se refiere a una molécula de ácido nucleico aislada que puede ser cualquier forma de molécula de ARN o ADN que sea útil, particularmente en el campo de los métodos de detección de diagnóstico. La molécula de ácido nucleico que se describe en este documento se identificó por su presencia exclusiva en muestras de tejido de tumor de próstata. La molécula tiene, por lo tanto, utilidad para detectar la presencia de células tumorales de próstata en una muestra de tejido o de fluido corporal.

En una realización, el polinucleótido de la invención contiene una región que tiene una identidad de secuencia con la secuencia de la SEC ID Nº: 14 o que es complementaria a dichas secuencias de ácidos nucleicos codificantes.

En otra realización, el polinucleótido de la invención hibridará en condiciones de alta rigurosidad con la secuencia de la SEC ID Nº: 14 o con la complementaria de la misma.

Generalmente, el polinucleótido será de menos de aproximadamente 10 kilobases de longitud. La invención incluye el polinucleótido mencionado. La descripción también se refiere a fragmentos del polinucleótido de la presente invención. En otro aspecto relacionado más, la invención incluye moléculas de ARN que se forman mediante la traducción de la secuencia de ácido nucleico anterior.

La secuencia de ácido nucleico aislada puede comprender los insertos de ADNc de tres vectores plasmídicos pCR2.1 (Invitrogen, San Diego, CA). Los tres clones que, en conjunto, constituyen la secuencia de longitud completa de SP 1-4 (SEC ID Nº: 14) se denominan pCR2.1/SP 1-4 (5' RACE, SEC ID Nº: 27), pCR2.1/SP 1-4 (3' RACE, SEC ID Nº: 28) y pCT2.1/SP 1-4 (SEC ID Nº: 29). Las longitudes aproximadas de los insertos de los plásmidos son de 1700, 3850 y 350 pares de bases, respectivamente. Los vectores depositados el 6 de agosto de 1998 como ATCC 98828, 98829 y 98827 incluyen las secuencias de nucleótidos que codifican la SEC ID Nº: 15.

En otra realización, la invención proporciona un vector que comprende un ADN que codifica un antígeno de tumor de próstata. También se proporciona una célula hospedadora que comprende dicho vector. A modo de ejemplo, las células hospedadoras pueden ser células CHO, E. coli, células de insecto o de levaduras. Se proporciona además un proceso para producir antígenos de tumor de próstata y que comprende cultivar células hospedadoras en condiciones adecuadas para la expresión de un antígeno de tumor de próstata y la recuperación del antígeno de tumor de próstata a partir del cultivo celular.

También son útiles y forman parte de la presente invención moléculas de ácido nucleico aisladas que comprenden un ADN que codifica antígenos de tumor de próstata. En un aspecto, el ácido nucleico aislado comprende un ADN que codifica un antígeno de tumor de próstata que tiene una secuencia de aminoácidos de la SEC ID Nº: 15 o que es complementario a dicha secuencia de ácido nucleico codificante y permanece establemente unido a ella en condiciones de alta rigurosidad. Dichos péptidos tienen utilidad en ensayos de diagnóstico, así como en composiciones antigénicas tales como vacunas peptídicas para uso para desencadenar respuestas inmunes humorales o celulares.

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La invención proporciona además moléculas quiméricas que comprenden un antígeno de tumor de próstata o un dominio extracelular del mismo fusionado con un polipéptido o secuencia de aminoácidos heteróloga. Un ejemplo de dicha molécula quimérica comprende un antígeno de tumor de próstata fusionado con un polipéptido heterólogo que potencia las propiedades inmunogénicas del antígeno.

La memoria descriptiva también se refiere a fragmentos del antígeno de tumor de próstata.

Un aspecto adicional de la invención es uno o más anticuerpos que se unen específicamente a un antígeno de tumor de próstata o a un dominio extracelular del mismo. Opcionalmente, el anticuerpo es un anticuerpo monoclonal. En otro aspecto más, la invención incluye un anticuerpo específico para un antígeno de tumor de próstata. El anticuerpo puede tener aplicaciones de diagnóstico y terapéuticas, particularmente en el tratamiento de trastornos malignos relacionados con la próstata. Pueden ser usos los que emplean polinucleótidos antisentido o de secuencia codificante para modular la expresión del antígeno de tumor de próstata o que emplean anticuerpos específicos para un antígeno de tumor de próstata.

También forman parte de la invención métodos de diagnóstico para detectar un antígeno de tumor de próstata en muestras de tejido específicas y para detectar niveles de expresión de un antígeno de tumor de próstata en tejidos.

Además, el polinucleótido mencionado anteriormente tiene una utilidad especial en diversos ensayos de detección basados en ácidos nucleicos. Los ensayos ejemplares incluyen ensayos de hibridación in situ y ensayos basados en PCR.

La invención también proporciona métodos in vitro para diagnosticar una afección relacionada con un tumor de próstata en un individuo. Se mide la presencia de un antígeno de tumor de próstata en un tejido de un primer individuo y se compara con un tejido de un segundo individuo no afectado. Cuando se detecta un antígeno de tumor de próstata en dicho primer individuo y no en dicho segundo individuo, el primer individuo presenta riesgo de padecer una afección relacionada con un tumor de próstata.

Breve descripción de las figuras

La Figura 1 muestra la secuencia de un polinucleótido obtenido de un tumor de próstata, que se identifica en este documento con la SEC ID Nº: 1;

la Figura 2 muestra la secuencia de un polinucleótido obtenido de un tumor de próstata, que se identifica en este documento con la SEC ID Nº: 2;

la Figura 3 muestra la secuencia de un polinucleótido obtenido de un tumor de próstata, que se identifica en este documento con la SEC ID Nº: 3;

la Figura 4 muestra la secuencia de un polinucleótido obtenido de un tumor de próstata, que se identifica en este documento con la SEC ID Nº: 4;

la Figura 5 muestra la secuencia de un polinucleótido obtenido de un tumor de próstata, que se identifica en este documento con la SEC ID Nº: 5;

la Figura 6 muestra la secuencia de un polinucleótido obtenido de un tumor de próstata, que se identifica en este documento con la SEC ID Nº: 6;

la Figura 7 muestra la secuencia de un polinucleótido obtenido de un tumor de próstata, que se identifica en este documento con la SEC ID Nº: 7;

la Figura 8 muestra la secuencia de un polinucleótido obtenido de un tumor de próstata, que se identifica en este documento con la SEC ID Nº: 8;

las Figuras 9A-9C muestran las secuencias de tres péptidos obtenidos a partir de la SEC ID Nº: 5 como SEC ID Nº: 9 (9A), SEC ID Nº: 10 (9B) y SEC ID Nº: 11 (9C).

La Figura 10 muestra la secuencia de un polinucleótido obtenido de un tumor de próstata de la invención, que se identifica en este documento con la SEC ID Nº: 14; y

la Figura 11 muestra la secuencia del polipéptido obtenido a partir de la SEC ID Nº: 14 e identificado como SEC ID Nº: 15. Las regiones no traducidas 5' y 3' predichas de la SEC ID Nº: 14 se representan en minúsculas, la fase de lectura abierta de las posiciones 43 a 3227 se representa en mayúsculas y el fragmento de ADNc parcial original (SEC ID Nº: 29) se muestra subrayado.

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Descripción detallada de la invención

La presente invención se refiere a una nueva secuencia de nucleótidos que tiene al menos una identidad de secuencia del 80% con un polipéptido codificado por los nucleótidos 43-3227 de la SEC ID Nº: 14, que es exclusiva de tumores de próstata, como se demuestra por la expresión preferencial de dichas secuencias en muestras de tejido de tumor de próstata. Esta secuencia, incluyendo variantes de secuencia y secuencias prolongadas de la misma, tiene utilidad en ensayos de diagnóstico de fluidos corporales o de tejido biopsiado para detectar la presencia de células tumorales. También se incluyen en la presente invención las proteínas y péptidos expresados por la molécula de ADN y pueden usarse en ensayos de diagnóstico, así como en el desarrollo de estrategias farmacológicas para el control de la enfermedad que incluyen la inmunoterapia, por ejemplo, el uso de anticuerpos que estén específicamente dirigidos contra células tumorales.

I. Definiciones

El término "polipéptido", como se usa en este documento, se refiere a un compuesto constituido por una cadena sencilla de restos aminoacídicos unidos por enlaces peptídicos. El término "proteína", como se usa en este documento, puede ser sinónimo del término "polipéptido" o puede referirse, además, a un complejo de dos o más polipéptidos.

Los restos aminoacídicos se denominan en este documento mediante sus notaciones convencionales de una sola letra: A, alanina; C, cisteína, D, ácido aspártico; E; ácido glutámico; F, fenilalanina; G, glicina; H, histidina; I, isoleucina; K, lisina; L, leucina; M, metionina; N, asparagina; P, prolina; Q, glutamina; R, arginina; S, serina; T, treonina; V, valina; W, triptófano; Y, tirosina.

La expresión "antígeno de tumor de próstata", como se usa en este documento, incluye antígenos de tumor de próstata de secuencia nativa y variantes polipeptídicas de los mismos. El antígeno de tumor de próstata puede aislarse de una diversidad de fuentes, tales como de tipos de tejidos humanos o de otro origen, o prepararse mediante métodos recombinantes o sintéticos.

Un "antígeno de tumor de próstata de secuencia nativa" comprende un polipéptido que tiene la misma secuencia de aminoácidos que un antígeno de tumor de próstata obtenido de la naturaleza. Dicho antígeno de tumor de próstata de secuencia nativa puede aislarse de la naturaleza o puede producirse por medios recombinantes o sintéticos. La expresión "antígeno de tumor de próstata de secuencia nativa" incluye específicamente formas truncadas o secretadas de origen natural de un antígeno de tumor de próstata (por ejemplo, formas solubles que contienen, por ejemplo, una secuencia de dominio extracelular), formas variantes de origen natural (por ejemplo, como alternativa, formas de corte y empalme) y variantes alélicas de origen natural de un antígeno de tumor de próstata.

El "porcentaje (%) de identidad de secuencia de aminoácidos" con respecto a las secuencias de aminoácidos identificadas en este documento se define como el porcentaje de restos aminoacídicos en una secuencia candidata que son idénticos a los restos aminoacídicos de la secuencia nativa, después de alinear las secuencias e introducir huecos, si es necesario, para conseguir el máximo porcentaje de identidad de secuencia y sin considerar ninguna sustitución conservativa como parte de la identidad de secuencia.

La expresión "variante de secuencia polipeptídica", como se usa en este documento, se refiere a un antígeno de tumor de próstata activo que tiene una identidad de secuencia de aminoácidos de al menos aproximadamente el 80% con el antígeno de tumor de próstata que tiene la secuencia de aminoácidos deducida y que se muestra en la Figura 11 (SEC ID Nº: 15) para un antígeno de tumor de próstata de secuencia nativa de longitud completa. Dichas variantes de antígeno de tumor de próstata incluyen, por ejemplo, polipéptidos en los que se añaden o se delecionan uno o más restos aminoacídicos en el extremo N o C terminal de la secuencia representada en la Figura 11 (SEC ID Nº: 15).

El término "fragmento", cuando se refiere a un antígeno de tumor de próstata, se refiere a un polipéptido que tiene una secuencia de aminoácidos que es la misma que parte de, pero no toda, la secuencia de aminoácidos del antígeno de tumor de próstata que conserva esencialmente la misma función o actividad biológica que el antígeno de tumor de próstata, o que conserva al menos una de las funciones o actividades del antígeno de tumor de próstata; por ejemplo, un fragmento que conserva la capacidad de unirse a un receptor, o un fragmento que conserva la actividad inmunológica del antígeno de tumor de próstata. El fragmento puede incluir al menos aproximadamente 100-200 restos aminoacídicos contiguos del antígeno de tumor de próstata, al menos aproximadamente 20-100 restos aminoacídicos contiguos, al menos aproximadamente 10-20 restos aminoacídicos contiguos o al menos aproximadamente 9-10 restos aminoacídicos contiguos del antígeno de tumor de próstata.

El término "aislado", cuando se usa para describir los diversos polipéptidos que se describen en este documento, significa que el polipéptido que se ha identificado también se ha separado y/o recuperado a partir de un componente de su entorno natural.

Las expresiones "biológicamente activo" o "actividad biológica", para los fines de este documento, se refieren a una o más formas de antígeno de tumor de próstata que conservan las actividades biológicas y/o inmunológicas del antígeno de tumor de próstata de origen natural o nativo.

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El término "ácido nucleico", como se usa en este documento, se refiere a ADN o ARN o a moléculas que contienen tanto desoxirribonucleótidos como ribonucleótidos. Los ácidos nucleicos incluyen ARNm genómico, ADN, ADNc, ADN genómico y oligonucleótidos, que incluyen ácidos nucleicos con sentido y antisentido. El término "ácido nucleico" también se refiere a fragmentos del polinucleótido de la presente invención con al menos aproximadamente 300-600 nucleótidos de longitud, aproximadamente 150-300 nucleótidos de longitud, aproximadamente 30-150 nucleótidos de longitud o aproximadamente 27-30 nucleótidos de longitud. Dichos ácidos nucleicos también pueden contener modificaciones en la cadena principal de ribosa-fosfato para aumentar la estabilidad y la vida media de dichas moléculas en entornos fisiológicos.

El ácido nucleico puede ser bicatenario, monocatenario o contener porciones de secuencia tanto de doble cadena como de cadena sencilla. La representación de una cadena sencilla también define la secuencia de la otra cadena y, por lo tanto, incluye el complementario de la secuencia.

El término "polinucleótido", como se usa en este documento, se refiere a una molécula polimérica que tiene una estructura principal que contiene bases capaces de formar enlaces de hidrógeno con polinucleótidos típicos, presentando la estructura polimérica las bases de tal forma que permite dicha formación de enlaces de hidrógeno de un modo específico de secuencia entre la molécula polimérica y un polinucleótido típico (por ejemplo, ADN monocatenario). Dichas bases son típicamente inosina, adenosina, guanosina, citosina, uracilo y timidina. Las moléculas poliméricas incluyen ácidos ribonucleicos (ARN) y ácidos desoxirribonucleicos (ADN) monocatenarios y bicatenarios y pueden incluir polímeros que tienen modificaciones en la estructura principal tales como enlaces metilfosfonato.

La expresión "ácido nucleico recombinante", como se usa en este documento, se refiere a un ácido nucleico, originariamente generado in vitro, en general, mediante la manipulación del ácido nucleico por endonucleasas, de una forma que no se encuentra normalmente en la naturaleza.

Las subunidades de ácido nucleico se denominan en este documento mediante las denominaciones convencionales de sus bases; T, timina, A, adenosina, C, citosina; G, guanina; U uracilo; las posiciones variables se denominan mediante las abreviaturas convencionales de la IUPAC; W, A o T/U; R, A o G; S, C o G; K, G o T/U (37 CFR. \NAK1.822).

El "porcentaje (%) de identidad de secuencia de ácido nucleico", con respecto a la secuencia de antígeno de tumor de próstata identificada en este documento, se define como el porcentaje de nucleótidos en una secuencia candidata que son idénticos a los nucleótidos de la secuencia de antígeno de tumor de próstata descrita, después de alinear las secuencias e introducir huecos, si es necesario, para conseguir el máximo porcentaje de identidad de secuencia. El alineamiento con el fin de determinar el porcentaje de identidad de secuencia de ácido nucleico puede conseguirse de diversas formas que están dentro de la experiencia en la técnica, por ejemplo, mediante el uso de un programa informático disponible públicamente tal como un programa ALIGN o Megalign (DNASTAR). Los especialistas en la técnica pueden determinar los parámetros apropiados para medir el alineamiento, incluyendo cualquier algoritmo que se necesite para conseguir el alineamiento máximo a lo largo de las secuencias que se están comparando.

El término "vector" se refiere a una secuencia de nucleótidos que puede aceptar nuevos ácidos nucleicos y propagar esas nuevas secuencias en un hospedador apropiado. Los vectores incluyen, pero sin limitación, plásmidos y virus recombinantes. El vector (por ejemplo, un plásmido o virus recombinante) que comprende el ácido nucleico de la invención puede ser un vehículo, por ejemplo, un plásmido que forma un complejo con una proteína, un plásmido que forma un complejo con sistemas de transducción de ácidos nucleicos basados en lípidos u otros sistemas de vehículos no virales.

La expresión "secuencias de control" se refiere a secuencias de ADN necesarias para la expresión de una secuencia codificante unida operativamente a ellas en un organismo hospedador en particular. Las secuencias de control que son adecuadas para procariotas, por ejemplo, incluyen, un promotor, opcionalmente una secuencia operadora y un sitio de unión a ribosomas. Se sabe que las células eucariotas utilizan promotores, señales de poliadenilación y potenciadores.

Las expresiones "reacción en cadena de la polimerasa" y "PCR" se refieren a un proceso para amplificar una o más secuencias de ácidos nucleicos específicas, en el que (i) cebadores oligonucleotídicos que determinan los extremos de las secuencias a amplificar se hibridan con ácidos nucleicos monocatenarios en una muestra de ensayo, (ii) una polimerasa de ácido nucleico prolonga los extremos 3' de los cebadores hibridados para generar una cadena de ácido nucleico complementaria en secuencia al ácido nucleico con el que hibridaron los cebadores, (iii) el ácido nucleico bicatenario resultante se desnaturaliza para dar dos ácidos nucleicos monocatenarios y (iv) los procesos de hibridación de cebadores, extensión de cebadores y desnaturalización de producto se repiten suficientes veces para generar cantidades que se identifiquen y se midan fácilmente de las secuencias definidas por los cebadores. Las etapas de hibridación, extensión y desnaturalización secuenciales se controlan mediante la variación de la temperatura del recipiente de reacción, normalmente en un modo de repetición cíclica. La hibridación y la extensión se realizan, típicamente, entre 40-80ºC, mientras que la desnaturalización requiere temperaturas de entre aproximadamente 80 y 100ºC. Para regular las reacciones típicamente se usa un "termociclador", tal como Perkin Elmer Model 9600.

El término "anticuerpo" se usa en su sentido más amplio e incluye específicamente anticuerpos monoclonales anti-antígeno de tumor de próstata sencillos (incluyendo anticuerpos agonistas, antagonistas y neutralizantes) y composiciones de anticuerpos anti-antígeno de tumor de próstata con especificidad poliepitópica.

La expresión "anticuerpo monoclonal", como se usa en este documento, se refiere a un anticuerpo obtenido a partir de una población de anticuerpos sustancialmente homogénea, es decir, los anticuerpos individuales que constituyen la población son idénticos excepto por posibles mutaciones de origen natural que pueden presentarse en pequeñas cantidades.

II. Identificación de moléculas de ADN específicas de tumor de próstata

Pueden aislarse genes específicos de cáncer de próstata mediante diversas técnicas conocidas por los especialistas en la técnica que permiten la detección de diferencias en la expresión génica entre dos o más fuentes de ácido nucleico, por ejemplo, la expresión diferencial en respuesta al desarrollo en el tiempo, enfermedad y/o estímulo mitogénico.

Un ácido nucleico que codifica un antígeno de tumor de próstata "aislado" es una molécula de ácido nucleico que se identifica y se separa de al menos un contaminante con el que está normalmente asociado. Un ácido nucleico que codifica un antígeno de tumor de próstata aislado es distinto en forma o en composición del que se encuentra en la naturaleza y se diferencia, por lo tanto, de dichos ácidos nucleicos que codifican antígeno de tumor de próstata tal y como existen en células naturales.

Mediante el uso de expresión diferencial o de diversas estrategias de hibridación sustractiva, puede compararse el ARNm obtenido a partir de tipos celulares relacionados para proporcionar diferencias cualitativas y cuantitativas en especies de ARNm específicas.

La expresión diferencial (DD) usa dos tipos diferentes de cebadores para convertir diferentes fracciones del conjunto de ARNm constitutivo en fragmentos de ADNc bicatenario. Estos fragmentos se separan electroforéticamente para dar un perfil de expresión de tipo "código de barras". El primer cebador se denomina generalmente cebador "anclado". La mayoría de los cebadores anclados usan un grupo de 10-12 dT para conseguir la hibridación con la cola poli(A+) de los ARNm. La síntesis de la primera cadena de ADNc se produce a partir del cebador anclado, anclándose por lo tanto al extremo 3' del transcrito. Los cebadores anclados emplean una o dos bases no-dT para conseguir la hibridación del cebador anclado con un subconjunto de ARNm dentro del conjunto de ARNm. Los cebadores anclados a una sola base generan tres fracciones diferentes, que se corresponden a la presencia de una C, G o T inmediatamente cadena arriba de la región poli(A+). Si se asume que están presentes 10.000-15.000 especies diferentes de ARNm, se espera que cada cebador anclado a una sola base genere aproximadamente 3.000-5.000 primeras cadenas de ADNc diferentes. Hay doce diferentes combinaciones posibles de pares de dos bases inmediatamente cadena arriba de la región poli(A+), representado cada una un subconjunto del conjunto de ARNm considerablemente más pequeño que permutaciones de una sola base. Cada cebador anclado a dos bases selecciona, teóricamente, aproximadamente 1/12 (8%) del conjunto de ARNm constitutivo o aproximadamente 800-1.200 primeras cadenas de ADNc diferentes. Los cebadores anclados que emplean dos bases no-dT para "seleccionar" el conjunto de ARNm proporcionan un número más manejable de fragmentos de ADNc.

Después de haberse completado la síntesis de la primera cadena, se someten alícuotas de las reacciones a una amplificación exponencial (bidireccional) por reacción en cadena de la polimerasa (PCR) usando el cebador anclado original junto con un segundo cebador cadena arriba o "aleatorio". Los cebadores aleatorios contienen secuencias que se diseñan para que hibriden en sitios cadena arriba del cebador anclado, convirtiendo la primera cadena de ADNc en uno o más fragmentos de ADNc truncados. Las muestras de ARN a comparar sirven como moldes para la síntesis de la primera cadena de ADNc en reacciones de transcripción inversa (RT) mediante el uso de un conjunto de 12 cebadores oligo(dT) 3' anclados diferentes. Los ADNc que se producen en las reacciones de RT se usan después en reacciones de DD-PCR por duplicado usando los mismos cebadores 3' anclados que se usan en las reacciones de RT, en combinaciones pareadas de cuatro cebadores 5' aleatorios diferentes. Cada muestra de ARN se amplifica mediante 48 combinaciones pareadas de cebadores. Las muestras de DD-PCR por duplicado se cargan en carriles adyacentes de un gel desnaturalizante de alta resolución, con muestras de diferentes ARN amplificados con las mismas parejas de cebadores anclados y aleatorios, agrupadas en carriles consecutivos. Los geles se someten a autorradiografía y las bandas que aparecen en las muestras obtenidas de tumores de próstata pero no en las muestras de control (tal como en un tejido de próstata normal o en muestras de células HeLa) se seleccionan para un procesamiento adicional. La sección IV proporciona detalles de los procedimientos experimentales que se usaron en los experimentos realizados para apoyar la presente invención.

Como se describe en el Ejemplo I, cuando se comparó el ARN de tejido obtenido de tumor de próstata con ARN de tejido de próstata normal o con muestras de células HeLa, se identificaron 54 productos de DD exclusivos. Las bandas correspondientes se cortaron de los geles, se reamplificaron mediante PCR, se purificaron en gel y los extremos 5' se sometieron a una secuenciación de ADN mediante secuenciación cíclica.

La hibridación sustractiva, seguida de una o más vueltas de amplificación por PCR de las secuencias obtenidas después de la sustracción, es útil para aislar ácidos nucleicos que se expresan preferiblemente, por ejemplo, en patologías pero no en tejidos normales sanos o en un tipo tisular y no en otro.

Como se describe en los Ejemplos 3A-B, se identificó una secuencia de ADNc parcial específica de tumor de próstata mediante el uso de una estrategia de hibridación sustractiva y amplificación por PCR, identificándose la correspondiente secuencia de longitud completa mediante amplificación rápida de los extremos de ADNc [RACE, Frohman,
et al., Proc. Nat. Acad. Sci. 85: 8998-9002 (1988)], usando un cebador oligonucleotídico específico de un único gen.

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Las secuencias se compararon con las bases de datos publicadas, como se analiza en el Ejemplo 2, y se obtuvieron ocho nuevos ARNm/ADNc que se presentan en este documento como SEC ID Nº: 1-4 y 6-8 mediante el método de expresión diferencial, obteniéndose una secuencia adicional denominada SP 1-4 (SEC ID Nº: 14) mediante hibridación sustractiva. Se descubrió que una de las secuencias obtenidas mediante el método de expresión diferencial, la SEC ID Nº: 5, tenía además cierto grado de homología con la tiorredoxina reductasa, de acuerdo con los métodos que se detallan en el Ejemplo 2.

A. Identificación de variantes de secuencia de ADN y péptidos específicos de tumor de próstata

La presente invención incluye, además de moléculas de ADN que tienen las secuencias específicas enumeradas en este documento, variantes de secuencia, secuencias prolongadas y péptidos obtenidos a partir de dichas secuencias. Esta sección describe cómo se identifican estas diversas moléculas de acuerdo con la presente invención.

1. Variantes de secuencia de ADN

a. Identidad de secuencia e hibridación específica. Una secuencia polinucleotídica "variante" codifica una secuencia de aminoácidos "variante" que está alterada en uno o más aminoácidos con respecto a la secuencia polipeptídica de referencia.

Las variantes de secuencia incluyen secuencias polinucleotídicas que tienen una identidad de secuencia de ácido nucleico de al menos aproximadamente el 80%, preferiblemente, una identidad de secuencia de ácido nucleico de al menos aproximadamente el 85%, más preferiblemente, una identidad de secuencia de ácido nucleico de al menos aproximadamente el 90% y, aún más preferiblemente, una identidad de secuencia de ácido nucleico de al menos aproximadamente el 95%-98% con la secuencia de ácido nucleico de la SEC ID Nº: 14.

La identidad de secuencia, en el contexto de un ácido nucleico que codifica un antígeno de tumor de próstata, supone ácidos nucleicos idénticos en las posiciones correspondientes en las dos secuencias que se están comparando. La comparación de secuencias se realiza usando técnicas convencionales conocidas en la técnica, como se detalla a continuación en la Sección IIB.

Una medida funcional de la identidad de secuencia que puede usarse como alternativa para evaluar la similitud de secuencias es la capacidad de una molécula nucleotídica en particular de hibridar con un segundo nucleótido en condiciones definidas. La "hibridación" incluye cualquier proceso por el que una cadena de un ácido nucleico se une con una cadena complementaria mediante emparejamiento de bases. Por lo tanto, en el sentido estricto de la palabra, el término se refiere a la capacidad de la complementaria de la secuencia de ensayo de unirse con la secuencia de ensayo o viceversa.

La similitud de ácidos nucleicos puede determinarse mediante estudios de hibridación. Por lo tanto, por ejemplo, los ácidos nucleicos que hibridan en condiciones de alta rigurosidad con las secuencias de ácidos nucleicos que se muestran en las Figuras 1-8 y 14, o con las complementarias de las mismas, se consideran un gen de antígeno de tumor de próstata. En la técnica son conocidas las condiciones de alta rigurosidad; un ejemplo de dichas condiciones incluye una hibridación a aproximadamente 65ºC en SSPE aproximadamente 5x y un lavado en condiciones de aproximadamente 65ºC en SSPE aproximadamente 0,1x. Véanse Maniatis, et al., MOLECULAR CLONING: A LABORATORY MANUAL, 2ª Edición (1989) y Ausubel, F. M., et al., Eds., CURRENT PROTOCOLS IN MOLECULAR BIOLOGY, John Wiley & Sons, Inc., Copyright (c) 1987, 1988, 1989, 1990 por Current Protocols, incorporándose ambos en este documento como referencia.

Las condiciones de hibridación se basan en la temperatura de fusión (Tm) del complejo de unión de ácido nucleico o sonda y se clasifican, típicamente, mediante el grado de "rigurosidad" de las condiciones en las que se mide la hibridación (Ausubel, et al., 1990). Por ejemplo, una "rigurosidad máxima" se produce, típicamente, a aproximadamente una Tm -5ºC (5% por debajo de la Tm de la sonda); una "alta rigurosidad" a aproximadamente 5-10ºC por debajo de la Tm; una "rigurosidad intermedia" a aproximadamente 10-20ºC por debajo de la Tm de la sonda; y una "baja rigurosidad" a aproximadamente 20-25º por debajo de la Tm. De una forma funcional, pueden usarse condiciones de rigurosidad máximas para identificar secuencias que tienen una identidad absoluta o una identidad casi absoluta con la sonda de hibridación; mientras que se usan condiciones de alta rigurosidad para identificar secuencias que tienen una identidad de secuencia de aproximadamente el 80% o más con la sonda.

2. Degeneración del código genético

Las variantes de secuencia también incluyen moléculas de ácido nucleico que codifican el mismo péptido que está codificado por las moléculas de ácido nucleico específicas de tumor que se describen en este documento. Por lo tanto, cuando se conoce la fase codificante de las diversas moléculas de ácido nucleico identificadas, por ejemplo, por homología con genes conocidos o mediante prolongación de la secuencia, como se describe en las Partes B o C a continuación, se entenderá que pueden producirse varias secuencias codificantes como resultado de la degeneración del código genético. Por ejemplo, el triplete CGT codifica el aminoácido arginina. Como alternativa, la arginina está codificada por CGA, CGC, CGG, AGA y AGG. Por lo tanto, se entenderá que dichas sustituciones en la región codificante caen dentro de las variantes de secuencia que se incluyen en la presente invención. Todas y cada una de estas variantes de secuencia pueden utilizarse de las mismas formas que se describen en este documento para las secuencias parentales identificadas SEC ID Nº: 1-8.

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Se entenderá además que dichas variantes de secuencia pueden o no hibridar con la secuencia parental en condiciones de alta rigurosidad. Esto sería posible, por ejemplo, cuando la variante de secuencia incluye un codón diferente para cada uno de los aminoácidos codificados por los nucleótidos parentales. Sin embargo, dichas variantes se contemplan y se incluyen específicamente en la presente invención. De acuerdo con la presente invención, también se incluyen secuencias que tienen una identidad de al menos el 80% con dichas variantes de secuencia obtenidas por degeneración.

Aunque las variantes de secuencia de nucleótidos son, preferiblemente, capaces de hibridar con las secuencias de nucleótidos que se enumeran en este documento en condiciones de rigurosidad alta o moderadamente alta, existen, en algunas situaciones, ventajas por el uso de variantes basadas en la degeneración del código, como se ha descrito anteriormente. Por ejemplo, pueden seleccionarse codones para aumentar el índice de expresión del péptido en un organismo procariota o eucariota en particular, de acuerdo con el uso de codones óptimo determinado por el organismo hospedador en particular. Como alternativa, puede ser deseable producir ARN que tengan vidas medias más largas que la del ARNm producido por las secuencias enumeradas.

3. Secuencias polinucleotídicas extendidas

Las secuencias polinucleotídicas que se enumeran en este documento pueden prolongarse usando diversos métodos conocidos en la técnica para detectar secuencias cadena arriba tales como elementos promotores y reguladores. Por ejemplo, la reacción en cadena de la polimerasa de "sitios de restricción" es un método directo que usa cebadores universales para recuperar secuencias desconocidas adyacentes a una secuencia conocida. En primer lugar, se amplifica un ADN genómico en presencia de un cebador dirigido contra una secuencia enlazadora y un cebador específico de la región conocida. Las secuencias amplificadas se someten a una segunda vuelta de PCR con el mismo enlazador conector y otro cebador específico interno al primero. Los productos de cada vuelta de PCR se transcriben con una ARN polimerasa apropiada y se secuencian usando una transcriptasa inversa.

Asimismo, puede usarse un método conocido como "PCR inversa" para amplificar o prolongar secuencias usando cebadores divergentes basados en una región conocida. Los cebadores pueden diseñarse usando un programa informático de análisis de cebadores convencional, por ejemplo, GeneWorks (Oxford Biomolecular Systems, CA) para que sean de al menos 15 nt de longitud, con un contenido en GC del 50% o más y para que hibriden con la secuencia diana a temperaturas de aproximadamente 68-72ºC. En método requiere el uso de diversas enzimas de restricción para generar un fragmento adecuado en la región conocida de un gen. Después, el fragmento se circulariza mediante ligamiento y se usa como molde de PCR. Como alternativa, pueden identificarse secuencias adyacentes y de longitud completa y, en particular, uniones intrón/exón, mediante el uso de un kit tal como "PROMOTER-FINDER" (Clontech Labs, Palo Alto, CA). Este kit usa PCR, cebadores anidados y bibliotecas específicas para moverse por el ADN genómico.

Las bibliotecas preferidas para la exploración de ADNc de longitud completa son las que se han seleccionado por tamaños para incluir ADNc más grandes. Se prefieren bibliotecas con cebado aleatorio ya que contienen más secuencias que incluyen las regiones 5' y cadena arriba de los genes. Las bibliotecas genómicas son útiles para la prolongación hacia la región reguladora 5' no traducida. Preferiblemente, dichas bibliotecas se generarán a partir de las células tumorales de interés, tales como las células tumorales de próstata que se ejemplifican en este
documento.

El análisis del tamaño y de la secuencia de las secuencias de longitud completa identificadas de acuerdo con la presente invención puede realizarse mediante métodos convencionales conocidos en la técnica, tales como métodos de secuenciación automática, análisis de tamaños en gel y electroforesis capilar.

Cuando se identifica la secuencia de longitud completa, se entenderá que pueden usarse regiones adicionales de la secuencia de longitud completa para generar sondas de hibridación y/o reactivos para la detección de tumores de acuerdo con la presente invención. En concreto, el conocimiento de una secuencia parcial o de longitud completa hace posible realizar búsquedas en bases de datos fácilmente disponibles para determinar si la secuencia en particular puede tener homologías en otras especies o tejidos, particularmente en tejidos tumorales. En el Ejemplo 2 de este documento se presentan ejemplos de homologías basadas en las secuencias actuales.

La secuencia de longitud completa también puede usarse para construir un ácido nucleico recombinante que se inserte en un vector y se use para expresar el polipéptido codificado, como se analiza en la Parte D a continuación.

Se entiende que, una vez que se genera un ácido nucleico recombinante y se reintroduce en una célula u organismo hospedador, se replicará de forma no recombinante usando la maquinaria celular de la célula hospedadora y, dichos ácidos nucleicos, producidos de forma recombinante aunque posteriormente se repliquen de forma no recombinante, todavía se consideran recombinantes para los fines de la invención.

4. Variantes polipeptídicas

En una realización de la invención, el antígeno de tumor de próstata de secuencia nativa es un antígeno de tumor de próstata de secuencia nativa maduro o de longitud completa que comprende los aminoácidos 1 a 1095 de la Figura 11 (SEC ID Nº: 15). En otra realización de la invención, el antígeno de tumor de próstata de secuencia nativa es un dominio extracelular del antígeno de tumor de próstata de longitud completa. Opcionalmente, el antígeno de tumor de próstata se obtiene o puede obtenerse mediante la expresión del polipéptido codificado por el inserto de ADNc de los vectores pCR2.1/SP 1-4 (5' RACE, SEC ID Nº: 27), pCR2.1/SP 1-4 (3'-RACE, SEC ID Nº: 28) y pCT2.1/SP 1-4 (SEC ID Nº: 29), depositados el 6 de agosto de 1998 como ATCC 98828, 98829 y 98827.

Por lo general, una variante del antígeno de tumor de próstata tendrá una identidad de secuencia de aminoácidos de al menos aproximadamente el 80%, preferiblemente, una identidad de secuencia de aminoácidos de al menos aproximadamente el 85%, más preferiblemente, una identidad de secuencia de aminoácidos de al menos aproximadamente el 90% y, aún más preferiblemente, una identidad de secuencia de aminoácidos de al menos aproximadamente el 95%-98% con la secuencia de aminoácidos que se representa en la Figura 11 (SEC ID Nº: 15).

La similitud de secuencia, en el contexto de un antígeno de tumor de próstata, se refiere a similitud o identidad de secuencia, prefiriéndose la identidad. El término idénticas, en este contexto, supone aminoácidos idénticos en las posiciones correspondientes de las dos secuencias que se están comparando. La similitud, en este contexto, incluye los aminoácidos que son idénticos y los que son similares (funcionalmente equivalentes). Esta similitud o identidad se determinarán usando procedimientos convencionales conocidas en la técnica, por ejemplo, el programa de secuencias "Best Fit", descrito por Devereux, et al., Nucl. Acid. Res. 12: 387-395 (1984), el programa BLASTP o BLASTX [Altshul, et al., Methods in Enzymology 266: 460-480 (1990), Nucl. Acids Res. 25: 3389-3402 (1997)], usando preferiblemente los ajustes por defecto. El alineamiento puede incluir la introducción de huecos en las secuencias que se alinean. Además, para secuencias que contienen más o menos aminoácidos que la proteína nativa pertinente, se entiende que el porcentaje de similitud se determinará en base al número de aminoácidos similares o idénticos en relación con el número total de aminoácidos. El alineamiento, con el fin de determinar el porcentaje de identidad de secuencia de aminoácidos, puede conseguirse de diversas formas que se incluyen dentro de la experiencia en la técnica, por ejemplo, mediante el uso de programas informáticos disponibles públicamente tales como LALIGN o Megalign (DNASTAR) con los parámetros por defecto. El programa LALIGN puede encontrarse en la serie de programas de comparación de secuencias FASTA versión 1.7 (Pearson, et al., 1988; Pearson, 1990; programa disponible en William R. Pearson, Department of Biological Chemistry, Box 440; Jordan Hall, Charlottesville, VA).

Los especialistas en la técnica puede determinar los parámetros apropiados para medir el alineamiento, incluyendo la selección del algoritmo (por ejemplo, "Best Fit" o "BLASTX") necesario para conseguir el alineamiento máximo de las secuencias que se comparan [véase también, Pearson, et al., Methods in Enzymol. 266: 227-258 (1996)].

También se incluyen dentro de la definición de antígenos de tumor de próstata de la presente invención variantes de secuencia de aminoácidos. Estas variantes se incluyen dentro de una o más de tres clases: variantes de sustitución, de inserción o de deleción. Generalmente, estas variantes se preparan mediante mutagénesis específica de sitio de nucleótidos en el ADN que codifica el antígeno de tumor de próstata, mediante el uso de una mutagénesis con casete o por PCR u otras técnicas bien conocidas en la técnica, para producir un ADN que codifique la variante y, posteriormente, expresar el ADN en un cultivo celular recombinante. No obstante, pueden prepararse fragmentos de variantes de antígeno de tumor de próstata que tengan hasta aproximadamente 100-150 restos mediante síntesis in vitro usando las técnicas establecidas. Los variantes de secuencia de aminoácidos se caracterizan por la naturaleza predeterminada de la variación, una característica que las diferencia de las variaciones alélicas o interespecies de origen natural de la secuencia de aminoácidos del antígeno de tumor de próstata. Las variantes presentan, típicamente, la misma actividad biológica cualitativa que el análogo de origen natural, aunque también pueden seleccionarse variantes que tenga características modificadas, como se describirá más detalladamente a continuación.

Una "sustitución" es el resultado del reemplazo de uno o más nucleótidos o aminoácidos por diferentes nucleótidos o aminoácidos, respectivamente.

Una "inserción" o "adición" es el cambio en una secuencia de nucleótidos o de aminoácidos que es el resultado de la adición de uno o más nucleótidos o restos aminoacídicos, respectivamente, en comparación con la secuencia origen natural.

Una "deleción" se define como un cambio en una secuencia de nucleótidos o de aminoácidos, en la que están ausentes uno o más nucleótidos o restos aminoacídicos, respectivamente.

Aunque el sitio o la región para la introducción de una variación en la secuencia de aminoácidos está predeterminado, el cambio en sí no tiene por qué estar predeterminado. Por ejemplo, para optimizar el rendimiento de una mutación en un sitio dado, puede realizarse una mutagénesis aleatoria en el codón o región diana y explorarse las variantes de antígeno de tumor de próstata expresadas para determinar la combinación óptima de actividad deseada. Se conocen bien técnicas para realizar sustituciones en sitios predeterminados en un ADN que tiene una secuencia conocida, por ejemplo, mutagénesis con cebador M13 y mutagénesis por PCR. La exploración de los mutantes puede realizarse directamente mediante PCR o después de la expresión de la secuencia modificada usando ensayos para antígeno de tumor de próstata, por ejemplo, pueden hacerse estudios de detección de anticuerpos.

Típicamente, las sustituciones de aminoácidos son de restos individuales; las inserciones son habitualmente del orden de aproximadamente 1 a 20 aminoácidos, aunque pueden tolerarse inserciones considerablemente más grandes. Las deleciones varían de aproximadamente 1 a aproximadamente 20 restos, aunque en algunos casos las deleciones pueden ser mucho mayores.

Pueden usarse sustituciones, deleciones, inserciones o cualquier combinación de las mismas para lograr un derivado final. Generalmente, estos cambios se realizan en unos pocos aminoácidos para minimizar la alteración de la molécula. Sin embargo, pueden tolerarse cambios mayores en determinadas circunstancias.

Las sustituciones de aminoácidos pueden ser el resultado de reemplazar un aminoácido por otro aminoácido que tenga propiedades estructurales y/o químicas similares, tal como el reemplazo de una leucina por una serina, es decir, reemplazos conservativos de aminoácidos. Opcionalmente, las inserciones o deleciones pueden estar en el intervalo de 1 a 5 aminoácidos.

La variación que permite la conservación de la actividad biológica puede determinarse mediante la realización sistemática de inserciones, deleciones o sustituciones de aminoácidos en la secuencia y el análisis de las variantes resultantes para determinar su actividad. La expresión génica puede medirse mediante métodos inmunológicos tales como la tinción inmunohistoquímica de células o secciones de tejido y el análisis de cultivos celulares o fluidos corporales para cuantificar directamente la expresión del producto génico. Los anticuerpos útiles para la tinción inmunohistoquímica y/o el ensayo de tejidos o fluidos de muestra pueden ser monoclonales o policlonales y pueden generarse contra un antígeno de tumor de próstata nativo, un péptido sintético basado en las secuencias de ADN que se proporcionan en este documento o contra una proteína de fusión heteróloga que incluye un epítopo para un anticuerpo específico de tumor de próstata. Los ejemplos de antígenos de cáncer de próstata con utilidad diagnóstica en ensayos basados en anticuerpos incluyen, pero sin limitación, antígeno prostático específico (PSA, patentes de Estados Unidos Nº 5.710.007; 5.614.372; 5.672.480 y otras), antígeno de membrana específico de próstata (PSMA, patente de Estados Unidos Nº 5.538.866) y calicreína glandular prostática humana (HK-2, patente de Estados Unidos Nº 5.516.639). Se han desarrollado para estas moléculas muchos ensayos de diagnóstico basados en diversas tecnologías diferentes que los especialistas en la técnica usan de forma rutinaria.

Cuando se desean pequeñas modificaciones de las características del antígeno de tumor de próstata se realizan, generalmente, sustituciones de acuerdo con "sustituciones conservativas" conocidas.

Una "sustitución conservativa" se refiere a la sustitución de un aminoácido de una clase por un aminoácido de la misma clase, definiéndose una clase por unas propiedades físico-químicas comunes de las cadenas laterales de los aminoácidos y elevadas frecuencias de sustitución en proteínas homólogas que se encuentran en la naturaleza (determinadas mediante, por ejemplo, una matriz de intercambio de frecuencia Dayhoff convencional o matriz BLOSUM). Seis clases generales de cadenas laterales de aminoácidos, clasificadas como se ha descrito anteriormente, incluyen: Clase I (Cys); Clase II (Ser, Thr, Pro, Ala, Gly); Clase III (Asn, Asp, Gln, Glu); Clase IV (His, Arg, Lys); Clase V (Ile, Leu, Val, Met); y Clase VI (Phe, Tyr, Trp). Por ejemplo, la sustitución de una Asp por otro resto de la clase III, tal como Asn, Gln o Glu, es una sustitución conservativa.

Una "sustitución no conservativa" se refiere a la sustitución de un aminoácido de una clase por un aminoácido de otra clase; por ejemplo, la sustitución de una Ala, un resto de clase II, con un resto de clase III, tal como Asp, Asn, Glu o Gln.

Se realizan cambios importantes en la función o en la identidad inmunológica mediante la selección de sustituciones que sean "sustituciones no conservativas". Por ejemplo, pueden realizarse sustituciones que afecten más significativamente a: la estructura de la cadena principal del polipéptido en la zona de la modificación, por ejemplo, la estructura de hélice alfa o de lámina beta, la carga o la hidrofobicidad de la molécula en el sitio diana o el volumen de la cadena lateral. En general, las sustituciones que se espera produzcan los mayores cambios en las propiedades del polipéptido son aquellas en las que (a) un resto hidrófilo, por ejemplo, serilo o treonilo, sustituye a (o se sustituye por) un resto hidrófobo, por ejemplo, leucilo, isoleucilo, fenilalanilo, valilo o alanilo; (b) una cisteína o prolina sustituye a (o se sustituye por) cualquier otro resto; (c) un resto que tiene una cadena lateral electropositiva, por ejemplo, lisilo, arginilo o histidilo, sustituye a (o se sustituye por) un resto electronegativo, por ejemplo, glutamilo o aspartilo; o (d) un resto que tiene una cadena lateral voluminosa, por ejemplo, fenilalanina, sustituye a (o se sustituye por) uno que no tiene cadena lateral, por ejemplo, glicina.

Típicamente, las variantes del antígeno de tumor de próstata presentan la misma actividad biológica cualitativa y desencadenarán la misma respuesta inmune que el análogo de origen natural, aunque también se seleccionan variantes para modificar las características del antígeno de tumor de próstata, cuando sea necesario. Por ejemplo, pueden modificarse o eliminarse sitios de glicosilación y, más particularmente, uno o más sitios de glicosilación ligados a O o a N. Los especialistas en la técnica entenderán que los cambios de aminoácidos pueden alterar los procesos postraduccionales del antígeno de tumor de próstata, tal como cambiando el número o la posición de los sitios de glicosilación o alterando las características del anclaje a membrana.

Las variaciones pueden realizarse usando métodos conocidos en la técnica, tales como mutagénesis mediada por oligonucleótidos (dirigida), mediante alanina y mutagénesis por PCR. Puede realizarse mutagénesis dirigida [Carter, et al., Nucl. Acids Res. 13: 4331 (1986); Zoller, et al., Nucl. Acids Res. 10: 6487 (1987)], mutagénesis con casete [Wells, et al., Gene 34: 315 (1985)], mutagénesis por restricción y selección [Wells, et al., Philos. Trans. R. Soc. London serA 317: 415 (1986)] u otras técnicas conocidas en el ADN clonado para producir el ADN variante que codifica el antígeno de tumor de próstata.

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También se incluyen en la definición de proteínas de antígeno de tumor de próstata otras proteínas de antígeno de tumor de próstata relacionadas. Por lo tanto, pueden usarse sondas o secuencias de cebadores para una reacción en cadena de la polimerasa (PCR) degenerada para encontrar otras proteínas relacionadas. Pueden diseñarse sondas o secuencias de cebadores útiles para: toda o parte de la secuencia del antígeno de tumor de próstata o secuencias fuera de la región codificante. Como se conoce en general en la técnica, los cebadores de PCR preferidos son de aproximadamente 15 a aproximadamente 35 nucleótidos de longitud, prefiriéndose de aproximadamente 20 a aproximadamente 30, y pueden
contener inosina si es necesario. Las condiciones para la reacción de PCR se conocen generalmente en la técnica.

B. Modificaciones de antígenos de tumor de próstata

Las modificaciones covalentes de un antígeno de tumor de próstata se incluyen dentro del alcance de esta invención. Un tipo de modificación covalente incluye la reacción de restos aminoacídicos dirigidos de un antígeno de tumor de próstata con un agente orgánico derivatizante que es capaz de reaccionar con cadenas laterales seleccionadas o con los restos N o C terminales de un polipéptido de antígeno de tumor de próstata. La derivatización con agentes bifuncionales es útil, por ejemplo, para formar enlaces cruzados entre un antígeno de tumor de próstata con una matriz o superficie de soporte insoluble en agua. Los agentes de entrecruzamiento usados comúnmente incluyen, por ejemplo, 1,1-bis(diazoacetil)-2-feniletano, glutaraldehído, ésteres de N-hidroxisuccinimida, por ejemplo, ésteres con ácido 4-azidosalicílico, imidoésteres homobifuncionales, incluyendo éteres de disuccinimidilo tales como 3,3'-ditiobis(succinimidilpropionato), maleimidas bifuncionales tales como bis-N-maleimido-1,8-octano y agentes tales como metil-3-[(p-azidofenil)ditio]propioimidato.

Otras modificaciones incluyen la desamidación de restos glutaminilo y asparaginilo a los correspondientes restos glutamilo y aspartilo, respectivamente, la hidroxilación de prolina y lisina, la fosforilación de grupos hidroxilo de restos serilo o treonilo, la metilación de los grupos amino de las cadenas laterales de lisina, arginina e histidina [T. E. Creighton, PROTEINS: STRUCTURE AND MOLECULAR PROPERTIES, W. H. Freeman & Co., San Francisco, págs. 79-86 (1983)], la acetilación de la amina N-terminal y la amidación de cualquier grupo carboxilo C-terminal.

Otro tipo de modificación covalente de un polipéptido de antígeno de tumor de próstata que se incluye dentro del alcance de esta invención comprende alterar el patrón de glicosilación nativo del polipéptido, concretamente, la modificación de un polipéptido de antígeno de tumor de próstata de secuencia nativa mediante la deleción de uno o más restos carbohidrato de y/o la adición de uno o más restos carbohidrato al polipéptido del antígeno de tumor de próstata de secuencia nativa.

La adición de sitios de glicosilación en polipéptidos de antígeno de tumor de próstata puede conseguirse mediante la modificación de la secuencia de aminoácidos de los mismos. La modificación puede realizarse, por ejemplo, mediante la adición de, o la sustitución por uno o más restos de serina o treonina en el polipéptido del antígeno de tumor de próstata de secuencia nativa (para sitios de glicosilación ligados a O). La secuencia de aminoácidos del antígeno de tumor de próstata puede modificarse, opcionalmente, mediante cambios a nivel de ADN, particularmente, mediante la mutación del ADN que codifica el polipéptido del antígeno de tumor de próstata en bases preseleccionadas de tal modo que se generen codones que se traducirán en los aminoácidos deseados.

Otro medio de aumentar el número de restos carbohidrato en el polipéptido del antígeno de tumor de próstata es mediante acoplamiento químico o enzimático de glicósidos en el polipéptido. Dichos métodos se describen en la técnica, por ejemplo, en el documento WO 87/05330 publicado el 11 de septiembre de 1987 y en Aplin y Wriston, CRC Crit. Rev. Biochem. págs. 259-306 (1981).

La eliminación de restos carbohidrato presentes en el polipéptido del antígeno de tumor de próstata puede conseguirse químicamente o enzimáticamente o mediante la sustitución mutacional de codones que codifican restos aminoacídicos que sirven como dianas para la glicosilación. Además, pueden eliminarse restos carbohidrato por escisión enzimática mediante el uso de una diversidad de endoglicosidasas y exoglicosidasas, como se describe en Thotakura, et al., Meth. Enzymol. 138: 350 (1987) o mediante técnicas de desglicosilación química que se describen, por ejemplo, en Hakimuddin, et al., Arch. Biochem. Biophys. 259: 52 (1987) y por Edge, et al., Anal. Biochem. 118: 131 (1981).

Otro tipo de modificación covalente de un antígeno de tumor de próstata comprende unir el antígeno con un polímero no proteico, por ejemplo, polietilenglicol, polipropilenglicol o polioxialquilenos, por ejemplo, como se describe en la patente de Estados Unidos Nº 4.791.192.

C. Antígenos polipeptídicos codificados 1. Expresión de antígenos de tumor de próstata

Las secuencias polinucleotídicas que se describen en este documento pueden usarse en moléculas de ADN recombinantes que dirigen la expresión de los polipéptidos correspondientes en células hospedadoras apropiadas. Como se ha analizado anteriormente, la degeneración del código genético supone que pueden usarse otras secuencias de ADN que codifican sustancialmente la misma o una secuencia de aminoácidos funcionalmente equivalente para clonar y expresar los polipéptidos identificados. Pueden seleccionarse los codones preferidos por una célula hospedadora en particular y sustituirse en las secuencias de nucleótidos de origen natural para aumentar el índice y/o la eficacia de la expresión.

El ácido nucleico (por ejemplo, ADNc o ADN genómico) que codifica el polipéptido del antigénico prostático tumoral deseado puede insertarse en un vector capaz de replicarse para la clonación (amplificación del ADN) o para la expresión. El polipéptido puede expresarse de forma recombinante en cualquiera de varios sistemas de expresión de acuerdo con los métodos conocidos en la técnica (Ausubel, et al., 1990).

Las células hospedadoras apropiadas incluyen levaduras, bacterias, arqueobacterias, hongos y células de insecto y de animales, incluyendo células de mamíferos, por ejemplo, células primarias, incluyendo células madre, que incluyen, pero sin limitación, células madre de medula ósea. Más específicamente, éstas incluyen, pero sin limitación, microorganismos tales como bacterias transformadas con un bacteriófago recombinante, vectores de expresión de ADN plasmídicos o cosmídicos y levaduras transformadas con vectores de expresión de levaduras. También se incluyen células de insecto infectadas con un virus recombinante de insectos (tal como baculovirus) y sistemas de expresión de mamíferos.

La secuencia de ácido nucleico a expresar puede insertarse en el vector mediante una diversidad de procedimientos. En general, el ADN se inserta en un sitio de endonucleasa de restricción apropiado usando procedimientos conocidos en la técnica. Los componentes del vector incluyen generalmente, pero sin limitación, uno más de una secuencia señal, un origen de replicación, uno o más genes marcadores, un elemento potenciador, un promotor y una secuencia de terminación de la transcripción. La construcción de vectores adecuados que contienen uno o más de estos componentes emplea técnicas de ligamiento convencionales que conocen los especialistas.

Las proteínas de antígeno de tumor de próstata de la presente invención se producen mediante el cultivo de una célula hospedadora transformada con un vector de expresión que contiene un ácido nucleico que codifica una proteína de antígeno de tumor de próstata en las condiciones apropiadas para inducir o provocar la expresión de la proteína. Las condiciones apropiadas para la expresión de una proteína de antígeno de tumor de próstata variarán con la elección del vector de expresión y de la célula hospedadora y pueden determinarse fácilmente por un especialista en la técnica mediante una experimentación de rutina. Por ejemplo, el uso de promotores constitutivos en el vector de expresión requerirá la optimización del cultivo y de la proliferación de la célula hospedadora, mientras que el uso de un promotor inducible requiere las condiciones de cultivo apropiadas para la inducción. Además, en algunas realizaciones, el tiempo de la recogida es importante. Por ejemplo, los sistemas de baculovirus que se usan en la expresión en células de insecto son virus líticos y, por lo tanto, la selección del tiempo de recogida puede ser clave para el rendimiento del
producto.

Una cepa de célula hospedadora puede seleccionarse por su capacidad para modular la expresión de las secuencias insertadas o para procesar la proteína expresada del modo deseado. Dichas modificaciones de la proteína incluyen, pero sin limitación, acetilación, carboxilación, glicosilación, fosforilación, lipidación y acilación. También puede ser importante el procesamiento postraduccional que escinde una forma "prepro" de la proteína para una inserción, plegamiento y/o función correctas. A modo de ejemplo, células hospedadoras tales como CHO, HeLa, BHK, MDCK, 293, WI38, etc. tienen una maquinaria celular específica y mecanismos característicos para dichas actividades postraduccionales y pueden seleccionarse para asegurar la correcta modificación y procesamiento de la proteína extraña introducida. Son de particular interés las células de Drosophila melanogaster, Saccharomyces cerevisiae y otras levaduras, E. coli, Bacillus subtilis, células SF9, células C129, células 293, Neurospora, BHK, CHO, COS y células HeLa, fibroblastos, líneas celulares de Schwanoma, líneas celulares mieloides y linfoides de mamífero inmortalizadas, células Jukat, células humanas y otras células primarias.

El ácido nucleico debe estar "unido operativamente" mediante su colocación en una relación funcional con otra secuencia de ácido nucleico. Por ejemplo, el ADN de una presecuencia o líder secretor está unido operativamente al ADN de un polipéptido si se expresa como una preproteína que participa en la secreción del polipéptido; un promotor o potenciador está unido operativamente a una secuencia codificante si afecta a la transcripción de la secuencia; o un sitio de unión a ribosomas está unido operativamente a una secuencia codificante si se coloca de tal modo que facilita la traducción. Generalmente, las secuencias de ADN "unidas operativamente" están contiguas y, en el caso de un líder secretor, contiguas y en la misma fase de lectura. Sin embargo, los potenciadores no tienen por qué estar contiguos. La unión se consigue mediante el ligamiento en sitios de restricción oportunos. Si no existe dichos sitios, se usan adaptadores o enlazadores de oligonucleótidos sintéticos de acuerdo con la práctica convencional.

Las secuencias promotoras codifican promotores constitutivos o inducibles. Los promotores pueden ser promotores de origen natural o promotores híbridos. Los promotores híbridos, que combinan elementos de más de un promotor, también se conocen en la técnica y son útiles en la presente invención.

El vector de expresión puede comprender elementos adicionales, por ejemplo, el vector de expresión puede tener dos sistemas de replicación, permitiendo de este modo que se mantenga en dos organismos, por ejemplo, en células de mamífero o de insecto para la expresión y en un hospedador procariota para la clonación y la amplificación.

Tanto los vectores de expresión como los de clonación contienen una secuencia de ácido nucleico que permite que el vector se replique en una o más células hospedadoras seleccionadas. Dichas secuencias se conocen bien para una diversidad de bacterias, levaduras y virus. El origen de replicación del plásmido pBR322 es adecuado para la mayoría de bacterias gram-negativas, el origen del plásmido 2: es adecuado para levaduras y diversos orígenes virales (SV40, polioma, adenovirus, VSV o BPV) son útiles para vectores de clonación en células de mamífero.

Además, para la integración de vectores de expresión, el vector de expresión contiene al menos una secuencia homóloga con el genoma de la célula hospedadora y, preferiblemente, dos secuencias homólogas que flanquean la construcción de expresión. El vector de integración puede dirigirse a un locus específico en la célula hospedadora mediante la selección de la secuencia homóloga apropiada para su inclusión en el vector. Se conocen bien en la técnica construcciones para integrar vectores.

Preferiblemente, el vector de expresión contiene un gen marcador de selección para permitir la selección de las células hospedadoras transformadas. Se conocen bien en la técnica genes de selección y variarán con la célula hospedadora que se use.

Los vectores de expresión y de clonación contienen, típicamente, un gen de selección, también denominado marcador de selección. Los genes de selección típicos codifican proteínas que (a) confieren resistencia a antibióticos u otras toxinas, por ejemplo, ampicilina, neomicina, metotrexato o tetraciclina, (b) complementan deficiencias auxotróficas o (c) suministran nutrientes críticos no disponibles en medios complejos, por ejemplo, el gen que codifica la D-alanina racemasa para Bacilli.

Las células hospedadoras transformadas con una secuencia de nucleótidos que codifica un antígeno de tumor de próstata pueden cultivarse en condiciones adecuadas para la expresión y la recuperación de la proteína codificada del cultivo celular. La proteína producida mediante una célula recombinante puede secretarse, unirse a membrana o contenerse intracelularmente dependiendo de la secuencia y/o del vector que se use. Como entenderán los especialistas en la técnica, pueden diseñarse vectores de expresión que contienen polinucleótidos que codifican el antígeno de tumor de próstata con secuencias señal que dirijan la secreción del antígeno de tumor de próstata a través de una membrana celular procariota o eucariota.

El polipéptido del antígeno de tumor de próstata deseado puede producirse de forma recombinante no sólo directamente, sino también como un polipéptido de fusión con un polipéptido heterólogo, que puede ser una secuencia señal u otro polipéptido que tenga un sitio de escisión específico en el extremo N-terminal de la proteína o polipéptido maduro. En general, la secuencia señal puede ser un componente del vector o puede ser una parte del ADN que codifica el antígeno de tumor de próstata que se inserta en el vector. La secuencia señal puede ser una secuencia señal procariota seleccionada, por ejemplo, del grupo de los líderes de fosfatasa alcalina, penicilinasa, lpp o enterotoxina II termoestable. Para la secreción en levaduras, la secuencia señal puede ser, por ejemplo, el líder de la invertasa de levadura, el líder del factor alfa (incluyendo los líderes del factor \alpha de Saccharomyces y Kluyveromyces, este último descrito en la patente de Estados Unidos Nº 5.010.182) o el líder de la fosfatasa ácida, el líder de la glucoamilasa de C. albicans (documento EP 362.179, publicado el 4 de Abril de 1990) o la señal que se describe en el documento WO 90/13646, publicado el 15 de Noviembre de 1990. En caso de expresión en células de mamífero, pueden usarse secuencias señal de mamíferos para dirigir la secreción de la proteína, tales como secuencias señal de polipéptidos secretados de la misma especie o de especies relacionadas, así como líderes secretores virales.

Según el sistema de expresión seleccionado, la secuencia codificante se inserta en un vector apropiado, que a su vez puede requerir la presencia de ciertos "elementos de control" o "secuencias reguladoras" características. En general, se conocen en la técnica construcciones apropiadas (Ausubel, et al., 1990) y, en muchos casos, están disponibles en proveedores comerciales tales como Invitrogen (San Diego, CA), Stratagene (La Jolla, CA), Gibco BRL (Rockville, MD) o Clontech (Palo Alto, CA).

a. Expresión en sistemas bacterianos. La transformación de células bacterianas puede conseguirse mediante el uso de un promotor inducible tal como el promotor lacZ híbrido del fagémido "BLUESCRIPT" (Stratagene, La Jolla, CA) o "pSPORT1" (Gibco BRL, Rockville, MD). Además, pueden seleccionarse varios vectores de expresión para uso en células bacterianas para producir proteínas de fusión escindibles que puedan detectarse y/o purificarse fácilmente, incluyendo, pero sin limitación, "BLUESCRIPT" (\beta-galactosidasa; Stratagene, La Jolla, CA) o pGEX (glutatión S-transferasa; Promega, Madison, WI).

Un promotor bacteriano adecuado es cualquier secuencia de ácido nucleico capaz de unirse a una ARN polimerasa bacteriana e iniciar la transcripción cadena abajo (3') de la secuencia codificante del gen del antígeno de tumor de próstata en ARNm. Un promotor bacteriano tiene una región de inicio de la transcripción que habitualmente está situada proximal al extremo 5' de la secuencia codificante. Esta región de inicio de la transcripción incluye, típicamente, un sitio de unión a ARN polimerasa y un sitio de inicio de la transcripción. Las secuencias que codifican enzimas de rutas metabólicas proporcionan secuencias promotoras particularmente útiles. Los ejemplos incluyen secuencias promotoras obtenidas a partir de enzimas metabolizantes de azúcares, tales como galactosa, lactosa y maltosa y secuencias obtenidas a partir de enzimas biosintéticas tales como triptófano. También pueden usarse y se conocen en la técnica promotores de bacteriófagos. Además, también son útiles promotores sintéticos y promotores híbridos; por ejemplo, el promotor tac es un híbrido de las secuencias promotoras trp y lac. Además, un promotor bacteriano puede incluir promotores de origen natural de origen no bacteriano que tienen la capacidad de unirse a una ARN polimerasa bacteriana e iniciar la transcripción. También es deseable un sitio de unión a ribosomas eficaz.

El vector de expresión también puede incluir una secuencia de péptido señal que proporcione la secreción de la proteína de antígeno de tumor de próstata en bacterias. La secuencia señal codifica, típicamente, un péptido señal constituido por aminoácidos hidrófobos que dirigen la secreción de la proteína de la célula, como se conoce bien en la técnica. La proteína se secreta al medio de cultivo (bacterias gram-positivas) o al espacio periplásmico, localizado entre la membrana interna y externa de la célula (bacterias gram-negativas). El vector de expresión bacteriano también puede incluir un gen marcador de selección para permitir la selección de las cepas bacterianas que se hayan transformado. Los genes de selección adecuados incluyen genes de resistencia a fármacos tales como ampicilina, cloranfenicol, eritromicina, kanamicina, neomicina y tetraciclina. Los marcadores de selección también incluyen genes biosintéticos, tales como los de las rutas biosintéticas de histidina, triptófano y leucina.

Cuando se requieren grandes cantidades de antígeno de tumor de próstata, por ejemplo, para la inducción de anticuerpos, pueden ser deseables vectores que dirijan la expresión de alto nivel de proteínas de fusión que se purifiquen fácilmente. Dichos vectores incluyen, pero sin limitación, vectores de clonación y de expresión de E. coli multifuncionales tales como BLUESCRIPT® (Strategene, La Jolla, CA) en los que la secuencia que codifica el antígeno de tumor de próstata puede ligarse en el vector en la misma fase de lectura con las secuencias de la Met amino-terminal y de los 7 restos posteriores de beta-galactosidasa, de tal modo que se produce una proteína híbrida; vectores pIN [Van Heeke y Schuster, J. Biol. Chem. 264: 5503-5509 (1989)]; vectores pET (Novagen, Madison, WI); y similares.

Los vectores de expresión para bacterias incluyen los diversos componentes descritos anteriormente y se conocen bien en la técnica. Los ejemplos incluyen vectores para Bacillus subtilis, E. coli, Streptococcus cremoris y Streptococcus lividans, entre otros. Los vectores de expresión bacterianos se utilizan para transformar células hospedadoras bacterianas mediante el uso de procedimientos bien conocidos en la técnica, tales como transfección mediada por cloruro cálcico, electroporación y otras.

b. Expresión en levaduras. Se conocen bien en la técnica sistemas de expresión en levaduras e incluyen vectores de expresión para Saccharomyces cerevisiae, Candida albicans y C. maltosa, Hansenula polymorpha, Kluyveromyces fragilis y K. lactis, Pichia guillerimondii y P. pastoria, Shizosaccharomyces pombe y Yarrowia lipolytica. Los ejemplos de promotores adecuados para su uso en hospedadores de levaduras incluyen los promotores para la 3-fosfoglicerato quinasa [Hitzeman, et al., J. Biol. Chem. 255: 2073 (1980)] u otras enzimas glicolíticas [Hess, et al., J. Adv. Enzyme Reg. 7: 149 (1968); Holland, Biochemistry 17: 4900 (1978)], tales como enolasa, gliceraldehído-3-fosfato deshidrogenasa, hexoquinasa, piruvato descarboxilasa, fosfofructoquinasa, glucosa-6-fosfato isomerasa, 3-fosfoglicerato mutasa, piruvato quinasa, triosafosfato isomerasa, fosfoglucosa isomerasa, factor alfa, promotor de ADH2/GAPDH, glucoquinasa alcohol oxidasa y PGH. [Véanse, por ejemplo, Ausubel, et al., 1990; Grant, et al., Methods in Enzymology 153: 516-544, (1987)].

Otros promotores de levaduras, que al ser inducibles tienen la ventaja adicional de controlar la transcripción por las condiciones de cultivo, incluyen las regiones promotoras para la alcohol deshidrogenasa 2, isocitocromo C, fosfatasa ácida, enzimas de degradación asociadas con el metabolismo del nitrógeno, metalotioneína, gliceraldehído-3-fosfato deshidrogenasa y enzimas responsables de la utilización de maltosa y galactosa. Se describen adicionalmente vectores y promotores adecuados para su uso en la expresión en levaduras en el documento EP 73.657. Los marcadores de selección en levaduras incluyen ADE2, HIS4, LEU2, TRP1 y ALG7, que confiere resistencia a tunicamicina; el gen de la neomicina fosfotransferasa, que confiere resistencia a G418; y el gen CUP1 que permite a la levadura crecer en presencia de iones de cobre.

Pueden construirse vectores de expresión de levaduras para la producción o secreción intracelular de un antígeno de tumor de próstata a partir del ADN que codifica el antígeno de tumor de próstata de interés. Por ejemplo, puede insertarse un péptido señal seleccionado y el promotor constitutivo o inducible apropiado en sitios de restricción adecuados en el plásmido seleccionado para dirigir la expresión intracelular del polipéptido del antígeno de tumor de próstata. Para la secreción del antígeno de tumor de próstata, el ADN que codifica el polipéptido del antígeno de tumor de próstata puede clonarse en el plásmido seleccionado junto con el ADN que codifica el promotor, la secuencia señal o líder secretora del factor alfa de levadura y secuencias enlazadoras (cuando sean necesarias) para la expresión del polipéptido del antígeno de tumor de próstata.

Después, las células de levaduras pueden transformarse con los plásmidos de expresión descritos anteriormente y cultivarse en un medio de fermentación apropiado. Después, la proteína producida por dicha levadura transformada puede concentrarse por precipitación con ácido tricloroacético al 10% y analizarse después de la separación mediante SDS-PAGE y tinción de los geles con colorante azul de Coomassie.

Posteriormente, el antígeno de tumor de próstata recombinante puede aislarse y purificarse a partir del medio de fermentación mediante técnicas conocidas por los especialistas en la técnica.

c. Expresión en sistemas de mamíferos. Las proteínas de antígeno de tumor de próstata pueden expresarse en células de mamíferos. Se conocen en la técnica sistemas de expresión de mamíferos e incluyen sistemas de expresión mediados por vectores retrovirales. Las células hospedadoras de mamíferos pueden transformarse con cualquiera de varios sistemas de expresión basados en virus diferentes, tales como adenovirus, en los que la región codificante puede ligarse en un complejo de transcripción/traducción de adenovirus constituido por el promotor tardío y la secuencia líder tripartita. La inserción en una región E1 o E3 no esencial del genoma viral da como resultado un virus viable capaz de la expresión del polipéptido de interés en células hospedadoras infectadas.

Un sistema vector de expresión preferido es un sistema de vector retroviral como se describe en general en los documentos PCT/US97/01019 y PCT/US97/01048.

Los vectores de expresión de mamíferos adecuados contienen un promotor de mamíferos que es cualquier secuencia de ADN capaz de unirse a una ARN polimerasa de mamífero e iniciar la transcripción cadena abajo (3') de una secuencia codificante de una proteína de antígeno de tumor de próstata en ARNm. Un promotor tendrá una región de inicio de la transcripción que, habitualmente, se sitúa proximal al extremo 5' de la secuencia codificante y una caja TATA, que usa 25-30 pares de bases localizadas cadena arriba del sitio de inicio de la transcripción. Se cree que la caja TATA dirige a la ARN polimerasa II para que inicie la síntesis del ARN en el sitio correcto. Un promotor de mamíferos también contendrá un elemento promotor cadena arriba (elemento potenciador) localizado, típicamente, entre 100 y 200 pares de bases cadena arriba de la caja TATA. Un elemento promotor cadena arriba determina la frecuencia de inicio de la transcripción y puede actuar en cualquier orientación. Son de uso particular como promotores de mamífero los promotores de genes virales de mamíferos, ya que los genes virales están con frecuencia muy expresados y tienen una amplia variedad de hospedadores.

Los ejemplos incluyen promotores obtenidos a partir de los genomas de virus tales como virus del polioma, virus de la viruela aviar (documento UK 2.211.504, publicado el 5 de Julio de 1989), adenovirus (tales como adenovirus 2), papilomavirus bovino, virus del sarcoma aviar, citomegalovirus, retrovirus, virus de la hepatitis B y virus del simio 40 (SV40), de promotores de mamíferos heterólogos, por ejemplo, el promotor de actina o un promotor de inmunoglobulina y de promotores de choque térmico, siempre que dichos promotores sean compatibles con los sistemas de células hospedadoras.

La transcripción de un ADN que codifica un polipéptido de antígeno de tumor de próstata por eucariotas superiores puede aumentarse mediante la inserción de una secuencia potenciadora en el vector. Los potenciadores son elementos de ADN que actúan en cis, habitualmente de aproximadamente 10 a 300 pb, que actúan sobre un promotor para aumentar su transcripción. Se conocen muchas secuencias potenciadoras de genes de mamíferos (globina, elastasa, albúmina, \alpha-fetoproteína e insulina). Típicamente, sin embargo, se usará un potenciador de un virus de células eucariotas. Los ejemplos incluyen el potenciador de SV40, el potenciador del promotor temprano de citomegalovirus, el potenciador de polioma en el lado tardío del origen de replicación y potenciadores de adenovirus. El potenciador se localiza preferiblemente en un sitio 5' del promotor.

En general, las secuencias de terminación de la transcripción y de poliadenilación que reconocen las células de mamíferos son regiones reguladoras localizadas en posición 3' con respecto al codón de terminación de la traducción y, por lo tanto, junto con los elementos promotores, flanquean la secuencia codificante. El extremo 3' del ARNm maduro se forma mediante escisión postraduccional específica de sitio y poliadenilación. Los ejemplos de señales de terminación de la transcripción y de poliadenilación incluyen las que proceden de SV40.

Puede lograrse una producción de proteínas recombinantes de alto rendimiento y larga duración en un sistema de expresión estable. Pueden usarse para este fin vectores de expresión que contienen orígenes de replicación virales o elementos de expresión endógenos y un gen marcador de selección. Están disponibles fácilmente en el mercado, y se conocen por especialistas en la técnica, vectores apropiados que contienen marcadores de selección para su uso en células de mamíferos. Los ejemplos de dichos marcadores de selección incluyen, pero sin limitación, timidina quinasa y adenina fosforribosiltransferasa de virus del herpes simple para uso en células tk- o hprt-, respectivamente.

Los métodos para introducir un ácido nucleico exógeno en hospedadores de mamíferos, así como en otros hospedadores, se conocen bien en la técnica y variarán con la célula hospedadora que se use. Las técnicas incluyen la transfección mediada por dextrano, la precipitación con fosfato cálcico, la transfección mediada por polibreno, la fusión de protoplastos, la electroporación, la infección viral, la encapsulación del polinucleótido o polinucleótidos en liposomas y la microinyección directa del ADN en los núcleos.

d. Expresión en células de insecto. También pueden producirse polipéptidos de antígeno de tumor de próstata en células de insecto. Se conocen bien en la técnica vectores de expresión para la transformación de células de insecto y, en particular, vectores de expresión basados en baculovirus. En un sistema de este tipo, el ADN que codifica el antígeno de tumor de próstata se fusiona cadena arriba de un marcador de epítopo contenido en un vector de expresión de baculovirus. Se usa el virus de la polihedrosis nuclear de Autographa californica (AcNPV) como vector para expresar genes extraños en células Sf9 de Spodoptera frugiperda o en larvas de Trichoplusia. La secuencia que codifica el antígeno de tumor de próstata se clona en una región no esencial del virus, tal como el gen de polihedrina, y se coloca bajo el control del promotor de polihedrina. La inserción con éxito de una secuencia que codifica un antígeno de tumor de próstata producirá el gen de polihedrina inactivo y producirá un virus recombinante que carece de la proteína de la cubierta. Después, se usan los virus recombinantes para infectar células de S. frugiperda o larvas de Trichoplusia en las que se expresa el antígeno de tumor de próstata [Smith, et al., J. Virol. 46: 584 (1994); Engelhard, et al., Proc. Nat. Acad. Sci. 91: 3224-3227 (1994)].

Los marcadores de epítopo adecuados para la fusión con el ADN que codifica el antígeno de tumor de próstata incluyen marcadores poli-his y marcadores de inmunoglobulina (como regiones Fc de IgG). Pueden emplearse una diversidad de plásmidos, incluyendo plásmidos disponibles en el mercado tales como pVL1393 (Novagen Madison, WI). En resumen, el ADN que codifica el antígeno de tumor de próstata o la porción deseada del ADN que codifica el antígeno de tumor de próstata se amplifica por PCR con cebadores complementarios a las regiones 5' y 3'. El cebador 5' puede incorporar sitios de restricción flanqueantes. Después, el producto de PCR se digiere con las enzimas de restricción seleccionadas y se subclona en un vector de expresión.

El baculovirus recombinante se regenera mediante cotransfección del plásmido anterior y del ADN viral
BaculoGold^{TM} (Pharmingen, San Diego, CA) en células de Spodoptera frugiperda ("Sf9") (ATCC CRL 1711) usando lipofectina (disponible en el mercado en Gibco-BRL, Rockville, MD) u otros métodos conocidos por los especialistas en la técnica. El virus se produce a día 4-5 de cultivo en células Sf9 a 28ºC y se usa para amplificaciones adicionales. Los procedimientos se realizan como se ha descrito anteriormente en O'Reilley, et al., BACULOVIRUS EXPRESSION VECTORS: A LABORATORY MANUAL, Oxford University Press (1994).

Pueden prepararse extractos de células Sf9 infectadas por virus recombinante como se describe en Rupert, et al., Nature 362: 175-179 (1993).

Como alternativa, los polipéptidos del antígeno de tumor de próstata con marcadores de epítopos expresados pueden purificarse mediante cromatografía de afinidad o, por ejemplo, puede realizarse la purificación de un polipéptido de antígeno de tumor de próstata marcado con IgG (o marcado con Fc) usando técnicas de cromatografía, incluyendo la cromatografía en columna de proteína A o de proteína G.

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D. Evaluación de la expresión génica

La expresión génica puede evaluarse en una muestra directamente, por ejemplo, mediante técnicas convencionales conocidas por los especialistas en la técnica, por ejemplo, transferencia de Southern para detección de ADN, transferencia de Northern para determinar la transcripción de ARNm, transferencia puntual (de ADN o ARN) o hibridación in situ, usando una sonda apropiadamente marcada, basadas en las secuencias que se proporcionan en este documento. Como alternativa, pueden usarse anticuerpos en ensayos para la detección de ácidos nucleicos, tales como dúplex específicos, incluyendo dúplex de ADN, dúplex de ARN y dúplex híbridos de ADN-ARN o dúplex de ADN-proteína. Pueden marcarse dichos anticuerpos y realizarse el ensayo en el que el dúplex se une a una superficie, de tal modo que tras la formación del dúplex en la superficie puede detectarse la presencia de anticuerpo unido al dúplex.

Como alternativa, la expresión génica puede medirse mediante tinción inmunohistoquímica de células o de secciones de tejido y análisis de cultivos celulares o fluidos corporales para evaluar directamente la expresión de antígenos de tumor de próstata. Los anticuerpos útiles para dichos ensayos inmunológicos pueden ser monoclonales o policlonales y pueden prepararse contra un antígeno de tumor de próstata de secuencia nativa en base a las secuencias de ADN que se proporcionan en este documento.

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1. Purificación de proteína expresada

Pueden purificarse o aislarse después de la expresión polipéptidos de antígeno de tumor de próstata expresados mediante el uso de cualquiera de una diversidad de métodos conocidos por los especialistas en la técnica. La técnica apropiada variará dependiendo de qué otros componentes estén presentes en la muestra. Los componentes contaminantes que se eliminan mediante el aislamiento o purificación son materiales que, típicamente, interfieren con los usos de diagnóstico o terapéuticos del polipéptido y pueden incluir enzimas, hormonas y otros solutos. La etapa o etapas de purificación seleccionadas dependerán, por ejemplo, de la naturaleza del proceso de producción que se usa y del polipéptido de antígeno de tumor de próstata en particular que se produce.

Un polipéptido o proteína de antígeno de tumor de próstata puede recuperarse de un medio de cultivo o a partir de lisados de células hospedadoras. Si está unido a membrana, puede liberarse de la membrana usando una solución detergente adecuada (por ejemplo, Triton-X 100) o por escisión enzimática. Como alternativa, las células que se emplean para la expresión de los polipéptidos de antígeno de tumor de próstata pueden romperse por diversos medios físicos o químicos, tales como ciclos de congelación-descongelación, sonicación, rotura mecánica o mediante el uso de agentes de lisis celular.

Los métodos de purificación ejemplares incluyen, pero sin limitación, cromatografía en columna de intercambio iónico; cromatografía que usa gel de sílice o una resina intercambio catiónico tal como DEAE; filtración en gel usando, por ejemplo, Sephadex G-75; columnas de proteína A-Sepharose para eliminar contaminantes tales como IgG; cromatografía que usa columnas de quelación de metales para unir las formas con marcadores de epítopos del polipéptido del antígeno de tumor de próstata; precipitación con etanol; HPLC de fase inversa; cromatografía de enfoque; SDS-PAGE; y precipitación con sulfato de amonio. Generalmente, un polipéptido de antígeno de tumor de próstata aislado se preparará mediante al menos una etapa de purificación. Por ejemplo, la proteína de antígeno de tumor de próstata puede purificarse usando una columna de anticuerpos anti-antígeno de tumor de próstata convencional. También son útiles técnicas de ultrafiltración y diálisis junto con la concentración de proteínas (véase, por ejemplo, Scopes, R., PROTEIN PURIFICATION, Springer-Verlag, NY, 1982). El grado de purificación necesario variará dependiendo del uso del antígeno de tumor de próstata. En algunos casos, no será necesaria la purificación.

Una vez expresadas y purificadas según sea necesario, las proteínas y ácidos nucleicos del antígeno de tumor de próstata de la presente invención son útiles en varias aplicaciones, como se detallan a continuación.

2. Marcaje de proteína expresada

Los ácidos nucleicos, proteínas y anticuerpos de la invención pueden marcarse. El marcaje, en este documento, se refiere a que un compuesto tiene al menos un elemento, isótopo o compuesto químico unido para permitir la detección del compuesto. En general, los marcadores se clasifican en tres clases: a) marcadores isotópicos, que pueden ser radiactivos o isótopos pesados; b) marcadores inmunes, que pueden ser anticuerpos o antígenos; y c) colorantes coloreados o fluorescentes. Los marcadores pueden incorporarse en el compuesto en cualquier posición que no interfiera con la actividad biológica o característica del compuesto que se va a detectar.

3. Proteínas de fusión de antígeno de tumor de próstata

Los antígenos de tumor de próstata de la presente invención también pueden modificarse de tal modo que formen moléculas quiméricas que comprenden un antígeno de tumor de próstata fusionado con otro polipéptido o secuencia de aminoácidos heteróloga. La expresión "proteína de fusión" que se usa en este documento se refiere a un polipéptido quimérico que comprende un polipéptido de antígeno de tumor de próstata o la secuencia de un dominio del mismo, fusionado con un "polipéptido de dirección". El polipéptido de dirección tiene suficientes restos para facilitar la dirección a un tipo celular o receptor en particular, pero es suficientemente corto como para que no interfiera con la función biológica del polipéptido del antígeno de tumor de próstata. Preferiblemente, el polipéptido de dirección también es bastante único, de tal modo que la proteína de fusión no presente una reactividad cruzada importante con otros tipos celulares o receptores. Los polipéptidos de dirección adecuados tienen, generalmente, al menos aproximadamente 10 restos aminoacídicos y, habitualmente, entre aproximadamente 10 y aproximadamente 500 restos aminoacídicos. Los polipéptidos de dirección preferidos tienen de aproximadamente 20 a aproximadamente 200 restos aminoacídicos.

La proteína de fusión también puede comprender una fusión de un antígeno de tumor de próstata con un polipéptido marcador que proporcione un epítopo al que se pueda unir selectivamente un anticuerpo anti-marcador. El marcador de epítopo se coloca generalmente en el extremo amino o carboxilo terminal del antígeno de tumor de próstata. Dichas formas con marcador de epítopo de un antígeno de tumor de próstata pueden detectarse usando un anticuerpo contra el polipéptido marcador. Además, el suministro del marcador de epítopo permite que el antígeno de tumor de próstata se purifique fácilmente mediante el uso de un anticuerpo anti-marcador u otro tipo de matriz de afinidad que se una al marcador de epítopo. Como alternativa, la proteína de fusión puede comprender una fusión de un antígeno de tumor de próstata con una inmunoglobulina o con una región en particular de una inmunoglobulina. Para una forma bivalente de la molécula quimérica, dicha fusión puede ser con la región Fc de una molécula de IgG o, por ejemplo, GM-CSF. Las proteínas de fusión preferidas incluyen, pero sin limitación, moléculas que facilitan la dirección inmune del antígeno de tumor de próstata.

La proteína de fusión de antígeno de tumor de próstata puede generarse para diversos otros fines usando técnicas bien conocidas en la técnica. Por ejemplo, para la generación de anticuerpos, si el epítopo deseado es pequeño, puede fusionarse una proteína de antígeno de tumor de próstata parcial o completa con una proteína de soporte para formar un inmunógeno. Como alternativa, la proteína de antígeno de tumor de próstata puede generarse como una proteína de fusión para aumentar la capacidad del antígeno de estimular respuestas inmunes celulares y/o humorales (basadas en anticuerpos) o por otras razones.

E. Anticuerpos anti-antígeno de tumor de próstata

La presente invención proporciona además anticuerpos anti-antígeno de tumor de próstata. Los anticuerpos de la presente invención incluyen anticuerpos policlonales, monoclonales, humanizados, biespecíficos y heteroconjugados.

1. Anticuerpos policlonales

Los anticuerpos anti-antígeno de tumor de próstata de la presente invención pueden ser anticuerpo policlonales. Los especialistas en la técnica conocen métodos para la preparación de anticuerpos policlonales. Dichos anticuerpos policlonales pueden producirse en un mamífero, por ejemplo, después de una o más inyecciones de un agente inmunizante y, preferiblemente, un adyuvante. Típicamente, el agente inmunizante y/o adyuvante se inyectarán en el mamífero mediante una serie de inyecciones subcutáneas o intraperitoneales. El agente inmunizante puede incluir un antígeno de tumor de próstata o una proteína de fusión del mismo. Puede ser útil conjugar el antígeno con una proteína que se sabe que es inmunogénica en el mamífero que se está inmunizando. Los ejemplos de dichas proteínas inmunogénicas incluyen, pero sin limitación, hemocianina de lapa californiana (KLH), albúmina sérica, tiroglobulina bovina e inhibidor de tripsina de soja. Los adyuvantes incluyen, por ejemplo, adyuvante completo de Freund y adyuvante MPL-TDM (monofosforil lípido A-trehalosa dicorinomicolato sintético). El protocolo de inmunización puede determinarse por un especialista en la técnica en base a protocolos convencionales o mediante una experimentación de rutina.

2. Anticuerpos monoclonales

Como alternativa, los anticuerpos anti-antígeno de tumor de próstata pueden ser anticuerpos monoclonales. Los anticuerpos monoclonales pueden producirse mediante hibridomas, en los que un ratón, hámster u otro animal hospedador apropiado se inmuniza con un agente inmunizante para generar linfocitos que produzcan o sean capaces de producir anticuerpos que se unirán específicamente al agente inmunizante [Kohler y Milstein, Nature 256: 495 (1975)]. Como alternativa, los linfocitos pueden estimularse in vitro.

El agente inmunizante incluirá, típicamente, el antígeno de tumor de próstata o una proteína de fusión del mismo. Generalmente, se usan células de bazo o células de ganglios linfáticos si se desea que procedan de mamíferos no humanos o se usan linfocitos de sangre periférica ("PBL") si se desean células de origen humano. Los linfocitos se fusionan con una línea celular inmortalizada usando un agente de fusión adecuado, tal como polietilenglicol, para producir una célula de hibridoma [Goding, MONOCLONAL ANTIBODIES: PRINCIPLES AND PRACTICE, Academic Press, págs. 59-103 (1986)]. En general, las líneas celulares inmortalizadas son células de mamíferos transformadas, por ejemplo, células de mieloma de origen de rata, ratón, bovino o humano. Las células de hibridoma se cultivan en un medio de cultivo adecuado que contiene, preferiblemente, una o más sustancias que inhiben el crecimiento o la supervivencia de células inmortalizadas no fusionadas. Por ejemplo, si las células parentales carecen de la enzima hipoxantina guanina fosforribosil transferasa (HGPRT), el medio de cultivo para los hibridomas incluirá, típicamente, hipoxantina, aminopterina y timidina (HAT), sustancias que evitan el crecimiento de células deficientes en HGPRT.

Las líneas celulares inmortalizadas preferidas son las que se fusionan eficazmente, soportan una producción estable de un nivel elevado de anticuerpos y son sensibles a un medio tal como medio HAT. Son líneas celulares inmortalizadas más preferidas líneas de mieloma murino o humano que pueden obtenerse, por ejemplo, de la Colección Americana de Cultivos Tipo (ATCC), Rockville, Maryland. También se han descrito líneas celulares de mieloma humano y de heteromieloma ratón-humano para la producción de anticuerpos monoclonales humanos [Kozbor, J. Immunol. 133: 3001 (1984); Brodeur, et al., MONOCLONAL ANTIBODY PRODUCTION TECHNIQUES AND APPLICATIONS, Marcel Dekker, Inc., Nueva York, págs. 51-63 (1987)].

El medio de cultivo (sobrenadante) en el que se cultivan las células de hibridoma puede analizarse para determinar la presencia de anticuerpos monoclonales dirigidos contra un antígeno de tumor de próstata. Preferiblemente, la especificidad de unión de los anticuerpos monoclonales presentes en el sobrenadante del hibridoma se determina mediante inmunoprecipitación o mediante un ensayo de unión in vitro, tal como un radioinmunoensayo (RIA) o un ensayo inmunoabsorbente ligado a enzimas (ELISA). Se conocen en la técnica procedimientos y ensayos apropiados. La afinidad de unión del anticuerpo monoclonal puede determinarse, por ejemplo, mediante el análisis Scatchard de Munson y Pollard, Anal. Biochem. 107: 220 (1980).

Después de que se identifiquen las células de hibridoma que producen el anticuerpo deseado, las células pueden clonarse mediante procedimientos de dilución limitante y cultivarse mediante métodos convencionales [Goding, 1986]. Los medios de cultivo adecuados para este fin incluyen, por ejemplo, medio de Eagle modificado por Dulbecco y el medio RPMI-1640. Como alternativa, las células de hibridoma pueden cultivarse in vivo como ascitis en un mamífero.

Los anticuerpos monoclonales secretados por los clones seleccionados pueden aislarse o purificarse a partir del medio de cultivo o del líquido ascítico mediante procedimientos de purificación de inmunoglobulina que los especialistas en la técnica usan de forma rutinaria tales como, por ejemplo, cromatografía de proteína A-Sepharose, cromatografía de hidroxil-apatita, electroforesis en gel, diálisis o cromatografía de afinidad.

Los anticuerpos monoclonales también pueden generarse por métodos de ADN recombinante, tales como los que se describen en la patente de Estados Unidos Nº 4.816.567. El ADN que codifica los anticuerpos monoclonales de la invención puede aislarse a partir de las células de hibridoma específicas de antígeno de tumor de próstata y secuenciarse, por ejemplo, mediante el uso de sondas de oligonucleótidos que son capaces de unirse específicamente a los genes que codifican las cadenas pesada y ligera de los anticuerpos murinos. Una vez aislado, el ADN puede insertarse en un vector de expresión, que después se transfecta en células hospedadoras tales como células COS de simio, células de ovario de hámster chino (CHO) o células de mieloma que de otra forma no producirían proteínas de inmunoglobulina, para obtener la síntesis de anticuerpos monoclonales en las células hospedadoras recombinantes. El ADN también puede modificarse, por ejemplo, mediante la sustitución de la secuencia codificante de los dominios constantes de las cadenas pesada y ligera humanas en lugar de las secuencias murinas homólogas [Morrison, et al., Proc. Nat. Acad. Sci. 81: 6851-6855 (1984); Neuberger, et al., Nature 312: 604-608 (1984); Takeda, et al., Nature 314: 452-454 (1985)] o mediante la unión covalente con la secuencia codificante de una inmunoglobulina de toda o parte de la secuencia codificante de un polipéptido no inmunoglobulina. El polipéptido no inmunoglobulina puede sustituir a los dominios constantes de un anticuerpo de la invención o puede sustituir a los dominios variables de un sitio de unión a antígeno de un anticuerpo de la invención para generar un anticuerpo quimérico bivalente.

Los anticuerpos también pueden ser anticuerpos monovalentes. Se conocen bien en la técnica métodos para preparar anticuerpos monovalentes. Por ejemplo, son adecuados métodos in vitro para preparar anticuerpos monovalentes. La digestión de anticuerpos para producir fragmentos de los mismos, particularmente, fragmentos Fab, puede conseguirse mediante el uso de procedimientos de rutina conocidas en la técnica.

3. Anticuerpos humanizados

Los anticuerpos anti-antígeno de tumor de próstata de la invención pueden comprender además anticuerpos humanizados o anticuerpos humanos. La expresión "anticuerpo humanizado" se refiere a formas humanizadas de anticuerpos no humanos (por ejemplo, murinos) que son anticuerpos quiméricos, cadenas de inmunoglobulinas o fragmentos de los mismos (tales como Fv, Fab, Fab', F(ab')_{2} u otras secuencias de anticuerpos parciales de unión a antígeno) que contienen alguna porción de la secuencia procedente de un anticuerpo no humano. Los anticuerpos humanizados incluyen inmunoglobulinas humanas en las que se reemplazan restos de una región determinante de complementariedad (CDR) de la inmunoglobulina humana por restos de una CDR de una especie no humana tal como de ratón, rata o conejo, que tenga la especificidad de unión, afinidad y capacidad deseadas. En general, el anticuerpo humanizado comprenderá sustancialmente todos o al menos un y, generalmente, dos dominios variables en los que todas o sustancialmente todas las regiones CDR se corresponden con las de una inmunoglobulina no humana y todas o sustancialmente todas las regiones FR son las de una secuencia consenso de inmunoglobulina humana. El anticuerpo humanizado también comprenderá, de manera óptima, al menos una porción de una región constante de inmunoglobulina (Fc), típicamente, la de una inmunoglobulina humana [Jones, et al., Nature 321: 522-525 (1986) y Presta, Curr. Op. Struct. Biol. 2: 593-596 (1992)].

Se conocen bien en la técnica métodos para humanizar anticuerpos no humanos. Generalmente, un anticuerpo humanizado tiene uno o más aminoácidos introducidos de un origen que no es humano para asemejarse más a un anticuerpo humano, aunque todavía conserva la actividad de unión original del anticuerpo. Se detallan adicionalmente métodos para la humanización de anticuerpos en Jones, et al., Nature 321: 522-525 (1986); Riechmann, et al., Nature 332: 323-327 (1988); y Verhoeyen, et al., Science 239: 1534-1536 (1988).

Dichos anticuerpos "humanizados" son anticuerpos quiméricos por el hecho de que se ha sustituido sustancialmente menos de un dominio variable humano intacto con la secuencia correspondiente de una especie no humana.

4. Anticuerpos heteroconjugados

También están dentro del alcance de la presente invención anticuerpos heteroconjugados que comprenden dos anticuerpos unidos covalentemente. Pueden prepararse anticuerpos heteroconjugados in vitro usando métodos conocidos en la química de proteínas sintéticas, incluyendo los que implican agentes de entrecruzamiento. Por ejemplo, pueden prepararse inmunotoxinas mediante el uso de una reacción de intercambio disulfuro o mediante la formación de un enlace tioéter.

5. Anticuerpos biespecíficos

Los anticuerpos biespecíficos tienen especificidad de unión por al menos dos antígenos diferentes. Dichos anticuerpos son monoclonales y, preferiblemente, humanos o humanizados. Una de las especificidades de unión de un anticuerpo biespecífico de la presente invención es por un antígeno de tumor de próstata y la otra es, preferiblemente, por una proteína o receptor o subunidad de receptor de la superficie celular.

Se conocen en la técnica métodos para generar anticuerpos biespecíficos y, en general, la producción recombinante de anticuerpos biespecíficos se basa en la coexpresión de dos parejas de cadena pesada/cadena ligera de inmunoglobulina en células de hibridoma en la que las dos cadenas pesadas tienen especificidades diferentes [Milstein y Cuello, Nature 305: 537-539 (1983)]. Dado que la mezcla aleatoria de cadenas pesadas y ligeras de inmunoglobulina da como resultado la producción de potencialmente diez moléculas de anticuerpo diferentes por los hibridomas, la purificación de la molécula correcta requiere habitualmente cierta clase de purificación de afinidad, por ejemplo, cromatografía de afinidad.

III. Utilidad A. Polinucleótidos

Las secuencias polinucleotídicas (o las complementarias de las mismas) que codifican polipéptidos de antígeno de tumor de próstata tienen diversas aplicaciones, incluyendo su uso como sondas de hibridación en el mapeo de cromosomas y genes y en la generación de ARN y ADN antisentido. Además, los ácidos nucleicos que codifican un antígeno de tumor de próstata pueden ser útiles como dianas para la intervención farmacéutica, por ejemplo, para el desarrollo de vacunas de ADN y para la preparación de polipéptidos de antígeno de tumor de próstata mediante técnicas recombinantes, como se describen en este documento. El polinucleótido que se describe en este documento, incluyendo las variantes de secuencia del mismo, puede usarse en ensayos de diagnóstico, particularmente para la detección de células tumorales. Una característica importante de la presente invención es que, actualmente, la secuencia descrita se reconoce como específica de células tumorales de próstata, pero también puede ser característica de otras células tumorales. Por consiguiente, se describen métodos de diagnóstico in vitro basados en la detección de la presencia de dichos polinucleótidos en fluidos corporales o muestras de tejido.

Los ejemplos de ensayos de diagnóstico basados en ácidos nucleicos de acuerdo con la presente invención incluyen ensayos de hibridación, por ejemplo, hibridación in situ y ensayos basados en PCR. Pueden usarse polinucleótidos, incluyendo polinucleótidos de longitud prolongada, variantes de secuencia y fragmentos de los mismos, como se describe en este documento, para generar sondas de hibridación o cebadores de PCR para uso en dichos ensayos. Dichas sondas y cebadores serán capaces de detectar secuencias polinucleotídicas, incluyendo secuencias genómicas, que sean similares o complementarias a los polinucleótidos específicos de tumor que se describen en este documento.

Pueden usarse sondas de hibridación, por ejemplo, para la realización de la hibridación in situ sobre muestras de tejido, tales como secciones de tejido fijadas o congeladas preparadas sobre portaobjetos de microscopio, o células suspendidas. En resumen, se permite que una sonda de ADN o ARN marcada se una a su muestra de ADN o ARN diana en la sección de tejido sobre una preparación microscópica, en condiciones controladas. Generalmente, se usan para este fin sondas de ADNbc constituidas por el ADN de interés clonado en un vector de ADN plasmídico o de bacteriófago, aunque también pueden usarse sondas de ADNmc o ARNmc. Las sondas son generalmente oligonucleótidos de entre aproximadamente 15 y 40 nucleótidos de longitud. Como alternativa, las sondas pueden ser sondas de polinucleótidos generadas mediante extensión de cebadores de inicio aleatorio por PCR o transcripción de ARN in vitro a partir de plásmidos (ribosondas). Típicamente, estas últimas sondas tienen varios cientos de pares de bases de longitud. Las sondas pueden marcarse por cualquiera de varios métodos, que incluyen etiquetas fluorescentes, enzimas o restos radiactivos, de acuerdo con métodos bien conocidos en la técnica. El método de detección en particular se corresponderá con el tipo de marcador utilizado en la sonda (por ejemplo, autorradiografía, detección por rayos X, análisis microscópico fluorescente o visual, según sea apropiado). La reacción puede amplificarse adicionalmente in situ usando técnicas inmunocitoquímicas dirigidas contra el marcador de la molécula detectora que se usa, tal como anticuerpos dirigidos contra un resto de fluoresceína presente en una sonda marcada fluorescentemente o contra avidina o enzimas marcadoras (peroxidasa o fosfatasa alcalina). Pueden encontrarse métodos de marcaje específico y de detección in situ, por ejemplo, en Howard, G. C., Ed., METHODS IN NONRADIOACTIVE DETECTION, Appleton & Lange, Norwalk, CT (1993), que se incorpora en este documento como referencia.

Un ensayo in vitro preferido para la detección de células tumorales de próstata utiliza el presente polinucleótido o fragmentos del mismo como cebadores en un ensayo basado en PCR. De acuerdo con el ensayo in vitro, se amplifican los ácidos nucleicos presentes en una muestra de células o tejido de ensayo mediante la reacción en cadena de la polimerasa (PCR) usando dos cebadores constituidos por al menos 15 nucleótidos obtenidos de la SEC ID Nº: 14, incluyendo cebadores procedentes de variantes y/o prolongaciones de dichas secuencias, como se describen en este documento. Los productos de amplificación se detectan en la muestra mediante un método que sea apropiado para el marcador en particular que se use para marcar los productos de amplificación, de acuerdo con los métodos que se describen en la patente de Estados Unidos Nº 4.683.195. Para uso en métodos de detección por PCR, tal como la hibridación in situ por PCR, se seleccionan cebadores de PCR que sean de al menos 15 nucleótidos de longitud y, preferiblemente, de entre aproximadamente 15 y 30 nucleótidos de longitud y se seleccionan de la molécula de ADN interés de acuerdo con métodos conocidos en la técnica. Aunque dichos cebadores pueden seleccionarse del interior de la secuencia identificada como SEC ID Nº: 14, en este documento, también puede ser deseable seleccionar secuencias que incluyan las secuencias de nucleótidos más largas identificadas de acuerdo con la Sección IIA2 anterior. Preferiblemente, las sondas se seleccionan de tal modo que los dos sitios de hibridación estén separados por aproximadamente 100-1.000 nucleótidos (ocasionalmente hasta por aproximadamente 10.000 nucleótidos).

La hibridación in situ por PCR de muestras de células y/o secciones de tejido proporciona un método de detección muy sensible para tipos celulares poco frecuentes en muestras de tejido o células fijadas. El método de detección mediante hibridación in situ por PCR se realiza de acuerdo con métodos que se conocen en la técnica, por ejemplo, Nuovo, G. J., PCR in situ HYBRIDIZATION: PROTOCOLS AND APPLICATIONS, Raven Press, NY, 1992; patente de Estados Unidos Nº 5.538.871, incorporándose ambas en este documento como referencia.

En resumen, una muestra celular (tejido sobre un portaobjetos microscópico o sedimento de una suspensión celular) se fija usando una preparación de fijación común, tal como formalina tamponada, formaldehído o similares. Se prefiere el tratamiento con proteinasa o detergente después de la fijación para aumentar la permeabilidad celular a los reactivos. La reacción de PCR se realiza in situ mediante una reacción en cadena de la polimerasa (PCR) usando dos cebadores. Como se ha analizado anteriormente, los cebadores se diseñan para que amplifiquen selectivamente la secuencia de nucleótidos que se describe en este documento y, particularmente, la secuencia que se describe como SEC ID Nº: 14. La mezcla de reacción de amplificación contiene, además de la muestra de nucleótidos diana y los cebadores, una ADN polimerasa termoestable, tal como una polimerasa procedente de Thermus aquaticus (Taq polimerasa, patente de Estados Unidos Nº 4.889.818) y una cantidad suficiente de los cuatro desoxirribonucleótidos convencionales (dNTP), uno o más de los cuales pueden estar marcados para facilitar la detección. La mezcla de reacción se somete a varias vueltas de termociclado para producir múltiples copias (productos de amplificación) de la secuencia de nucleótidos diana. Después, los productos de amplificación se detectan en la muestra, por ejemplo, mediante la detección de productos de amplificación marcados radiactivamente.

También pueden seleccionarse sondas de hibridación y cebadores de PCR de las secuencias genómicas que se corresponden con las proteínas de longitud completa identificadas de acuerdo con la presente invención, incluyendo promotores, elementos potenciadores e intrones del gen que codifica el polipéptido de origen natural.

También pueden usarse secuencias de nucleótidos que codifican un polipéptido de antígeno de tumor de próstata para construir sondas de hibridación para mapear el gen que codifica ese antígeno de tumor de próstata y para el análisis genético de los individuos. Las secuencias de nucleótidos que se proporcionan en este documento pueden mapearse en un cromosoma y en regiones específicas de un cromosoma usando técnicas conocidas tales como la hibridación in situ, el análisis de ligamiento contra marcadores cromosómicos conocidos y la exploración de la hibridación con bibliotecas. En resumen, pueden mapearse secuencias en cromosomas mediante la preparación de cebadores de PCR (preferiblemente, de 15-25 pb) del ADNc del antígeno de tumor de próstata. Se usa el análisis informático de la región 3' no traducida para seleccionar rápidamente cebadores que no abarquen más de un exón en el ADN genómico, ya que complicarían el proceso de amplificación. Después, estos cebadores se usan para la exploración por PCR de híbridos de células somáticas que contienen cromosomas humanos individuales. Sólo los híbridos que contengan el gen humano que se corresponde con el cebador producirán un fragmento amplificado.

El mapeo por PCR de híbridos de células somáticas es un procedimiento rápido para asignar un ADN en particular a un cromosoma en particular. Mediante el uso de la presente invención con los mismos cebadores oligonucleotídicos, puede conseguirse la sublocalización con paneles de fragmentos de cromosomas específicos o conjuntos de grandes clones genómicos de una forma análoga. Otras estrategias de mapeo que pueden usarse de forma similar para mapear en su cromosoma incluyen la hibridación in situ, la preexploración con cromosomas marcados mediante citometría de flujo y la preselección mediante hibridación para construir bibliotecas de ADNc específicas de cromosoma.

Pueden detectarse individuos que llevan variaciones de, o mutaciones en el gen que codifica un antígeno de tumor de próstata de la presente invención a nivel de ADN mediante una diversidad de técnicas. Los ácidos nucleicos que se usan para el diagnóstico pueden obtenerse de células de un paciente incluyendo, por ejemplo, material de autopsia y de biopsia tisular. El ADN genómico puede usarse directamente para la detección o puede amplificarse enzimáticamente mediante el uso de PCR [Saiki, et al., Nature 324: 136-166 (1986)] antes del análisis. También puede usarse ARN o ADNc para el mismo propósito. Como ejemplo, pueden usarse cebadores de PCR complementarios al ácido nucleico de la presente invención para identificar y analizar mutaciones en el gen de la presente invención. Pueden detectarse deleciones e inserciones mediante un cambio en el tamaño del producto amplificado en comparación con el genotipo normal.

Pueden identificarse mutaciones puntuales mediante la hibridación de ADN amplificado con ARN radiomarcado de la invención o, como alternativa, con secuencias de ADN antisentido radiomarcadas de la invención. También pueden ponerse de manifiesto cambios de secuencia en localizaciones específicas mediante ensayos de protección frente a nucleasas, tales como protección frente a ARNasa y S1 o mediante el método de escisión química [por ejemplo, Cotton, et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85: 4397-4401 (1985)] o mediante diferencias en las temperaturas de fusión. También pueden usarse "molecular beacons" [Kostrikis, et al., Science 279: 1228: 1229 (1998)], oligonucleótidos sintéticos de cadena sencilla en forma de horquilla que contienen secuencias de sondas que son complementarias al ácido nucleico de la presente invención para detectar mutaciones puntuales u otros cambios de secuencia, así como para controlar los niveles de expresión de antígenos de tumor de próstata.

También pueden usarse polinucleótidos que codifican un antígeno de tumor de próstata o complementarios de dichos polinucleótidos para fines terapéuticos. La expresión de un antígeno de tumor de próstata puede modularse mediante tecnología antisentido, que controla la expresión génica mediante polinucleótidos complementarios, es decir, ADN o ARN antisentido a las regiones de control, 5' o reguladoras del gen que codifica el antígeno tumoral. Por ejemplo, la porción codificante 5' de la secuencia polinucleotídica que codifica la proteína de la presente invención se usa para diseñar un oligonucleótido antisentido de aproximadamente 10 a 40 pares de bases de longitud. Se prefieren oligonucleótidos obtenidos del sitio de inicio de la transcripción, por ejemplo, entre las posiciones -10 y +10 del sitio de inicio. Se diseña un oligonucleótido de ADN antisentido para que sea complementario a una región del gen implicada en la transcripción [Lee, et al., Nucl. Acids Res. 6: 3073 (1979); Cooney, et al., Science 241: 456 (1998); y Dervan, et al., Science 251: 1360 (1991)], interfiriendo de este modo con o evitando la transcripción y la posterior producción del antígeno de tumor de próstata. Un oligonucleótido de ARN antisentido hibrida con el ARNm in vivo y bloquea la traducción de la molécula de ARNm en la proteína de antígeno de tumor de próstata [Okano, J. Neurochem. 56: 560 (1991)]. Las construcciones antisentido pueden administrase a las células mediante procedimientos conocidos en la técnica de tal modo que el ARN o ADN antisentido pueda expresarse in vivo.

Los polinucleótidos terapéuticos que se describen pueden emplearse junto con un vehículo farmacéuticamente aceptable. Dichas composiciones comprenden una cantidad terapéuticamente eficaz del compuesto y un vehículo o excipiente farmacéuticamente aceptable. Dicho vehículo incluye, pero sin limitación, solución salina, solución salina tamponada, dextrosa, agua, glicerol, etanol y combinaciones de los mismos. La formulación se selecciona de acuerdo con el modo de administración.

Pueden emplearse polipéptidos de antígeno de tumor de próstata, así como polipéptidos agonistas o antagonistas que modulan la actividad biológica del mismo, mediante la expresión de dichos polipéptidos in vivo (es decir, "terapia génica"). Pueden modificarse por ingeniería genética ex vivo células de un paciente para que incorporen un polinucleótido (ARN o ADN) que codifica dicho polipéptido , administrando después las células obtenidas por ingeniería genética a un paciente. Dichos métodos de tratamiento se conocen en la técnica. Por ejemplo, pueden modificarse por ingeniería genética células mediante el uso de una partícula retroviral que contiene ARN que codifica un polipéptido de la presente invención.

Como alternativa, pueden modificarse por ingeniería genética in vivo células para la expresión de un polipéptido in vivo mediante procedimientos conocidos en la técnica. A modo de ejemplo, una célula productora capaz de producir una partícula retroviral que contiene un ARN que codifica un polipéptido de la presente invención puede administrase a un paciente para modificar por ingeniería genética las células y que se produzca su expresión, teniendo lugar ambas etapas in vivo. El vehículo de expresión para modificar células por ingeniería genética puede ser distinto de un retrovirus, por ejemplo, un adenovirus que puede usarse para modificar las células por ingeniería genética in vitro o in vivo para su posterior administración in vivo en un vehículo de administración adecuado [véase, por ejemplo, Griscelli, et al., Proc Nat. Acad. Sci. 95: 6367-6372 (1998)].

B. Polipéptidos

De forma similar, el conocimiento de las secuencias de nucleótidos de longitud completa y, en algunos casos, parciales, que se describe en este documento proporciona la base para identificar los diversos polipéptidos codificados por los nucleótidos que se describen en este documento. Dichos antígenos polipeptídicos o fragmentos inmunogénicos de los mismos pueden usarse, por ejemplo, para desencadenar una respuesta inmune (humoral o celular) en un organismo hospedador con el fin de erradicar las células tumorales presentes en el organismo o para estimular la producción de anticuerpos policlonales y/o monoclonales para terapia o para su uso en kits de diagnóstico. El polipéptido de la presente invención puede tener numerosos usos que incluyen su utilidad en la producción de vacunas contra antígenos específicos de tumor. Dichas vacunas pueden formularse para que produzcan una respuesta inmune humoral (de anticuerpos) o celular en el organismo diana. Generalmente, pueden producirse composiciones de vacunas usando polipéptidos de longitud completa o péptidos antigénicos, conjugándose generalmente estos últimos con un vehículo inmunogénico, y pueden producirse composiciones estimulantes de la inmunidad celular de acuerdo con métodos como los que se describen en la solicitud de Estados Unidos Nº. 08/579.823 en trámite y de propiedad común con la presente.

También puede encontrarse utilidad a los polipéptidos de acuerdo con la presente invención en métodos de detección tales como en ensayos de diagnóstico basados en radioinmunoensayo y ELISA. También pueden usarse dichos polipéptidos para producir anticuerpos para su uso como reactivos en dichos ensayos. La preparación y la optimización de dichos ensayos están dentro de las habilidades de los especialistas en la técnica de desarrollo de ensayos.

La descripción también se refiere a un método para identificar un receptor para un antígeno de tumor de próstata. El gen que codifica un receptor para un antígeno de tumor de próstata puede identificarse mediante numerosos métodos conocidos por los especialistas en la técnica, por ejemplo, selección de ligando y selección por FACS [Coligan, et al., Current Protocols in Immunol. 1 (2), Capítulo 5 (1991)]. Puede emplearse la clonación de expresión, en la que se prepara ARN poliadenilado de una célula sensible al antígeno de tumor de próstata, se divide en conjuntos una biblioteca de ADNc generada a partir de este ARN y se usa para transfectar células COS u otras células que no son sensibles al antígeno de tumor de próstata. Las células transfectadas que se cultivan en portaobjetos de vidrio se exponen a antígeno de tumor de próstata marcado. El antígeno de tumor de próstata puede marcarse por una diversidad de medios que incluyen yodación o inclusión de un sitio de reconocimiento para una proteína quinasa específica de sitio. Después de la fijación y de la incubación, los portaobjetos se someten a un análisis autorradiográfico. Los conjuntos positivos se identifican y se preparan subconjuntos que se vuelven a transfectar usando un proceso repetido de formación de subconjuntos y reexploración, produciendo finalmente un único clon que codifica el receptor potencial.

Como un enfoque alternativo para la identificación de receptores, un antígeno de tumor de próstata marcado puede ligarse por fotoafinidad con preparaciones de extracto o de membrana celular que expresan una molécula de receptor. El material entrecruzado se resuelve mediante PAGE y se expone a una película de rayos X. Puede escindirse un complejo marcado que contiene el antígeno de tumor de próstata-receptor, resolverse en fragmentos peptídicos y someterse a microsecuenciación de proteína. La secuencia de aminoácidos obtenida a partir de la microsecuenciación puede usarse para diseñar un conjunto de sondas de oligonucleótidos degeneradas para explorar una biblioteca de ADNc para identificar el gen que codifica un receptor potencial.

La memoria descriptiva también se refiere a métodos para identificar moléculas, tales como fármacos sintéticos, anticuerpos, péptidos u otras moléculas que tienen un efecto modulador sobre la actividad del antígeno de tumor de próstata, por ejemplo, agonistas o antagonistas del receptor de antígeno de tumor de próstata.

Cuando un antígeno de tumor de próstata se une a una proteína, por ejemplo, cuando el antígeno de tumor de próstata funciona como un receptor, el antígeno de tumor de próstata puede usarse en ensayos para identificar otras proteínas o moléculas que puedan participar en la interacción de unión. Por dichos métodos pueden identificarse inhibidores de la interacción de unión receptor-ligando. También pueden usarse proteínas implicadas en dichas interacciones de unión para seleccionar inhibidores peptídicos o pequeñas moléculas o agonistas de la interacción de unión.

Pueden diseñarse ensayos de selección para encontrar compuestos que modulen la actividad biológica de un antígeno de tumor de próstata nativo o de un receptor para dicho antígeno de tumor de próstata. Los ensayos de selección preferidos serán adecuados para la exploración de alto rendimiento de bibliotecas químicas, lo que hace que sean particularmente adecuados para la identificación de pequeñas moléculas candidatas a fármaco. Las pequeñas moléculas que se contemplan incluyen compuestos orgánicos o inorgánicos sintéticos. Los ensayos pueden realizarse en una diversidad de formatos que incluyen formatos de unión proteína-proteína, ensayos de selección bioquímica, inmunoensayos y ensayos basados en células, estando todos ellos bien caracterizados en la técnica.

C. Anticuerpos

El polipéptido del antígeno de tumor de próstata también puede usarse para generar anticuerpos, sin embargo, el polipéptido del antígeno de tumor de próstata debe compartir al menos un epítopo o determinante con la secuencia proteica de longitud completa que se muestra en una cualquiera de las Figuras 9A-C u 11. Los términos "epítopo" o "determinante", en este documento, se refieren a una porción de una proteína que generará y/o se unirá a un anticuerpo. Por lo tanto, en la mayoría de los casos, los anticuerpos generados contra un polipéptido de antígeno de tumor de próstata más pequeño serán capaces de unirse a la proteína de longitud completa. Se prefiere que el epítopo sea único; es decir, que los anticuerpos generados contra el epítopo único muestren escasa o ninguna reactividad cruzada con otros antígenos. En otras palabras, los anticuerpos de la invención se unen específicamente a antígenos de tumor de próstata. La expresión "se unen específicamente", en este documento, se refiere a que los anticuerpos se unen a la proteína con una constate de unión en el intervalo de al menos 10^{6}-10^{8} M, siendo el intervalo preferido de 10^{7}-10^{9} M.

Los anticuerpos anti-antígeno de tumor de próstata de la presente invención pueden tener diversas utilidades, por ejemplo, pueden usarse en ensayos de diagnóstico para determinar la presencia de antígeno de tumor de próstata, tal como para detectar la expresión en células específicas, tejidos y/o suero. Se pueden usar diversos ensayos de diagnóstico conocidos en la técnica, tales como ensayos de unión competitiva, ensayos de sándwich directo o indirecto y ensayos de inmunoprecipitación realizados en fases heterogéneas u homogéneas [Zola, MONOCLONAL ANTIBODIES: A MANUAL OF TECHNIQUES, CRC Press, Inc., 147-158 (1987)]. Los anticuerpos que usan en dichos ensayos de diagnóstico pueden marcarse con un marcador detectable. El marcador detectable debe ser capaz de producir, directa o indirectamente, una señal detectable. Por ejemplo, el marcador detectable puede ser un radioisótopo, tal como ^{3}H, ^{14}C, ^{32}P, ^{35}S o ^{125}I, un compuesto fluorescente o quimioluminiscente, tal como isotiocianato de fluoresceína (FITC), rodamina o luciferina, o una enzima tal como fosfatasa alcalina, beta-galactosidasa o peroxidasa de rábano rusticano. Puede emplearse cualquier método conocido en la técnica para conjugar el anticuerpo con el marcador detectable, incluyendo los métodos que se describen en Hunter, et al., Nature 144: 945 (1962); David et al., Biochemistry 13: 1014 (1974); Pain, et al., J. Immunol. Meth. 40: 219 (1981); y Nygren, J. Histochem. and Cytochem. 30: 407 (1982).

Pueden ser útiles anticuerpos anti-antígeno de tumor de próstata para la purificación de afinidad de antígenos de tumor de próstata a partir de cultivos celulares recombinantes o de fuentes naturales. En este proceso, los anticuerpos contra un antígeno de tumor de próstata se inmovilizan sobre un soporte adecuado, tal como una resina de Sephadex o papel de filtro, usando métodos bien conocidos en la técnica. Después, el anticuerpo inmovilizado se pone en contacto con una muestra que contiene el antígeno de tumor de próstata a purificar y, posteriormente, el soporte se lava con un disolvente adecuado que eliminará sustancialmente todo el material en la muestra excepto el antígeno de tumor de próstata que está unido al anticuerpo inmovilizado. Por último, el soporte se lava con otro disolvente adecuado que liberará el antígeno de tumor de próstata del anticuerpo.

Los anticuerpos de tumor de próstata de la presente invención son capaces de reducir o eliminar la función biológica del antígeno de tumor de próstata con el que reaccionan específicamente. Es decir, la adición de anticuerpos anti-antígeno de tumor de próstata policlonales o, preferiblemente, monoclonales a células que comprenden receptores prostáticos tumorales puede reducir o eliminar la patología asociada con la presencia de un tumor de próstata. Generalmente, se prefiere al menos el 50% de disminución de la actividad, prefiriéndose más al menos aproximadamente el 75%, prefiriéndose particularmente al menos aproximadamente el 85-90% y prefiriéndose especialmente aproximadamente el 95-100% de disminución.

Pueden ensayarse composiciones de anticuerpos anti-tumor de próstata en modelos apropiados de enfermedad para confirmar la especificidad, la eficacia, el metabolismo tisular y para optimizar las dosificaciones de acuerdo con métodos conocidos en la técnica.

Pueden administrase composiciones de anticuerpos anti-tumor de próstata por cualquiera de varias vías y métodos diseñados para proporcionar una concentración uniforme y predecible de anticuerpo en el tejido diana. Las composiciones de anticuerpo pueden administrase solas o junto con otros agentes, tales como compuestos estabilizantes y/o junto con otros agentes farmacéuticos, tales como fármacos u hormonas. Puede alcanzarse un valor terapéutico mediante la administración de uno o más anticuerpos específicos para un antígeno de tumor de próstata. Dichos anticuerpos pueden ser útiles para prevenir la interacción de un antígeno tumoral con su receptor.

Se prefiere un anticuerpo monoclonal humano o humanizado en la aplicación terapéutica. El anticuerpo se administra típicamente como una solución estéril mediante inyección por vía IV en una cantidad de entre aproximadamente 1-15 mg/kg de peso corporal del sujeto, aunque pueden ser adecuadas otras vías de administración parenteral. Los regímenes de tratamiento apropiados variarán dependiendo de la afinidad del anticuerpo en particular seleccionado, de la vía de administración seleccionada, de la dosis y del estado del paciente. Estos parámetros son fáciles de determinar por un especialista usando una experimentación de rutina. En un uso ejemplar, el anticuerpo puede usarse para inhibir el crecimiento tumoral, debiendo administrarse el anticuerpo en el sitio del tumor hasta que se observe una mejora terapéutica.

Una composición terapéutica para usar en el método de tratamiento puede incluir el anticuerpo en una solución inyectable estéril, el anticuerpo en un vehículo de administración por vía oral o el polipéptido en forma nebulizada, todas preparadas de acuerdo con métodos bien conocidos. Dichas composiciones comprenden una cantidad terapéuticamente eficaz del anticuerpo y un vehículo o excipiente farmacéuticamente aceptable. Dicho vehículo incluye, pero sin limitación, solución salina, solución salina tamponada, dextrosa, agua, glicerol, etanol y combinaciones de los mismos.

IV. Materiales y métodos A. Kit y cebadores de detección de expresión diferencial

Se usó un kit de detección de expresión diferencial comercial "HIEROGLYPH mRNA Profile System" (GENOMIX Corp., Foster City, CA) para identificar polinucleótidos que son específicos de células tumorales de próstata. Este sistema se diseña para que produzca fragmentos de ADNc de hasta 1,2-1,5 kb de longitud con una excelente reproducibilidad entre muestras por duplicado. Los cebadores anclados HIEROGLYPH incorporan un sitio derivado del promotor de la ADN polimerasa de T7 de 17 nt (ACGACTCACTATAGGGC; SEC ID Nº: 12) para permitir la secuenciación direccional desde el extremo 3' del transcrito de ARNm original sin que sea necesaria la subclonación del fragmento/vector. Las secuencias que hibridan con el núcleo de los cebadores 5' aleatorios que se usan en el sistema HIEROGLYPH tienen 10 bases de longitud. Se usan veinte cebadores cadena arriba aleatorios diferentes. Los cebadores aleatorios (ARP) incorporan un segmento de 16 nt de la secuencia del cebador inverso universal M13 (148) de 24 monómeros, ACAATTTCACACAGCA, (SEC ID Nº: 13) que permite la secuenciación direccional desde el extremo 5' del transcrito original. Por lo tanto, cada ARP tiene 26 nt de longitud.

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B. Enriquecimiento de ADNc sustraído de próstata

Se preparó ADNc sustraído de próstata "muy enriquecido" mediante métodos que se detallan en el cDNA Subtraction Kit de Clontech Laboratories (Palo Alto, CA). En resumen, se preparó ADNc de ensayo a partir de ARN poli A+ de próstata humana normal; la población de ADNc que contiene las secuencias específicas de tejido de interés. Se preparó el ADNc conductor a partir de una mezcla de ARN poli A+ preparada a partir de 10 tejidos diferentes que incluían bazo, timo, cerebro, corazón, riñón, hígado, pulmón, ovario, placenta y músculo esquelético. La hibridación sustractiva y la PCR primaria se realizaron usando estas dos poblaciones.

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C. Clonación de ácidos nucleicos específicos de tumor de próstata

Todos los procedimientos de clonación se realizaron con kits disponibles en el mercado de acuerdo con los protocolos proporcionados por el fabricante. El ADN sustraído de próstata se generó con el "Clontech PCR-select cDNA subtraction kit" (Clontech, Palo Alto, CA). Los procedimientos de subclonación se realizaron con el "TA cloning kit" (Invitrogen, Carlsbad, CA).

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Ejemplo 1 Clonación molecular de genes de células tumorales de próstata

Los patrones de expresión de ARNm de una próstata normal, de la línea celular de carcinoma prostático LNCaP (ATCC CRL 1740; Colección Americana de Cultivos Tipo; Rockville, MD) y de células HeLa se compararon mediante expresión diferencial (DD) usando el HIEROGLYPH mRNA Profile System que se ha descrito anteriormente. Todos los procedimientos se realizaron esencialmente como se describen en las instrucciones del fabricante que se proporcionan como ficha técnica y se incorporan en este documento como referencia. En resumen, el ARN total sin ADN se aisló a partir de líneas celulares usando el kit SNAP Total RNA (Invitrogen, San Diego, CA). El ARN de tejido prostático se obtuvo en el mercado en Clontech, Inc. (Palo Alto, CA) y se trató con ADNasa sin ARNasa para eliminar contaminantes de ADN genómico. Cualitativamente, el ARN tenía una relación mínima de OD260/OD280 superior a 1,8. Se determinó que el ARN estaba intacto mediante análisis electroforético.

Las copias de la primera cadena de ADNc de los transcritos de ARN se generaron usando una transcriptasa disponible en el mercado ("SUPERSCRIPT", Life Technologies, Rockville, MD) y cebadores 3' "anclados" proporcionados en el kit HIEROGLYPH. La reacción se realizó a 42ºC durante una hora. Después, el ARN transcrito inversamente se sometió a una amplificación mediante reacción en cadena de la polimerasa (PCR) usando reacciones por duplicado que tenían combinaciones pareadas de diez cebadores 3' anclados y cuatro cebadores 5' aleatorios. Los cebadores anclados eran idénticos a los que se usaron en la reacción de la transcriptasa inversa. También estaban presentes en las mezclas de reacción ADN polimerasa AMPLITAQ y [\alpha-^{33}P]dATP. Se realizaron cuatro ciclos de PCR a 46ºC y 25 ciclos a 60ºC. Los productos de reacción se separaron mediante electroforesis en un gel HR-1000 al 4,5% y/o al 6% seguido de autorradiografía de los geles resultantes.

Se evaluaron veinte combinaciones de cebadores en experimentos por duplicado de cada una de las tres fuentes de ARNm, para un total de 120 reacciones de PCR. Los fragmentos de DD-PCR generados en el régimen de selección se analizaron mediante electroforesis en gel en 33 (geles de 61 cm que usan el genomyxLR y geles HR-1000). Las autorradiografías de los geles se analizaron para determinar las bandas que se expresaban específicamente sólo en la muestra de línea celular de carcinoma prostático LnCaP y no en el carcinoma HeLa ni en la próstata normal. Se identificaron un total de 54 productos de DD que cumplían estos criterios; las bandas se escindieron de los geles y se volvieron a amplificar por PCR. Los productos de PCR se purificaron mediante electroforesis en gel de agarosa y los extremos 5' se sometieron a secuenciación de ADN mediante secuenciación cíclica con terminadores didesoxi. Se obtuvo la secuencia de los 54 fragmentos. Los 54 fragmentos pusieron de manifiesto 35 transcritos de ARNm diferentes que se compararon con las publicaciones de las bases de datos que se actualizan diariamente GenBank, división EST de Gen Bank y EMBL. Se descubrió que un total de ocho ARNm/ADNc eran novedosos, como demostró la ausencia de una coincidencia significativa en la base de datos con algoritmos BLASTN o TBLASTX (Ejemplo 2, SEC ID Nº: 1-4 y 6-8). Por este método se identificó la SEC ID Nº: 5 como un nuevo miembro de la familia del gen de la tiorredoxina reductasa.

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Ejemplo 2 Exploración de secuencias de nucleótidos seleccionadas A. Exploración de la identidad de secuencia de las SEC ID Nº: 1-8

Las secuencias de nucleótidos se exploraron con los algoritmos BLASTN y TBLASTX contra las publicaciones de las bases de datos NCBI Entrez NR (6 de mayo de 1997; 309920 secuencias) y NCBI Entrez EST (6 de mayo de 1997; 10155474 secuencias). Se descubrió que las SEC ID Nº: 1-4 y 6-8 no tenían una similitud de secuencia significativa con ninguna secuencia conocida. Se descubrió que la SEC ID Nº: 5 tenía una homología sustancial (de aproximadamente el 78%) mediante BLASTN con una EST de ratón no caracterizada. También se determinó que las secuencias de aminoácidos que se deducen de la SEC ID Nº: 5, y que se incorporan en este documento como SEC ID Nº: 9-11, tenían homología mediante TBLASTX con porciones de la tiorredoxina reductasa de ratón y humana, sugiriendo que la secuencia de nucleótidos detectada codifica un nuevo miembro de la familia de genes de la tiorredoxina reductasa.

B. Exploración de la identidad de secuencia de las secuencias SP 1-4

La secuencia de nucleótidos SP 1-4 (SEC ID Nº: 14) se exploró con los algoritmos BLASTN Y TBLASTX contra las publicaciones de las bases de datos NCBI Entrez NR y NCBI Entrez EST (1 de julio de 1998). Se descubrió que la SEC ID Nº: 14 y las secuencias parciales de la misma tenían menos de aproximadamente el 45% de identidad de secuencia con cualquier secuencia de ácido nucleico conocida. Se descubrió que la secuencia de aminoácidos que se deduce de la SP 1-4, la SEC ID Nº: 15, tenía menos de aproximadamente el 30% de identidad de secuencia con cualquier polipéptido conocido a lo largo de la longitud completa de la secuencia usando el algoritmo BLASTP en una búsqueda que comparaba los aminoácidos 1 a 1095 de la SEC ID Nº: 15 con la base de datos de "non-redundant Genbank CDS translations + PDB + SwissProt + Spupdate + PIR" el 1 de Julio de 1998, sugiriendo que la secuencia de nucleótidos SP 1-4 codifica una nueva proteína.

Ejemplo 3 Clonación molecular de ADNc de SP 1-4 humano A. Aislamiento del inserto de ADNc parcial original

Se amplificó ADNc sustraído de próstata humana, muy enriquecido para secuencias de ADNc parcial específicas de próstata, usando la pareja de cebadores siguiente:

NP1	5'-TCGAGCGGCCGCCCGGGCAGGT-3'	(SEC ID Nº: 16)

NP2	5'-AGGGCGTGGTGCGGAGGGCGGT-3'	(SEC ID Nº: 17)

en un Perkin-Elmer GeneAmp 9600 Cycler durante 11 ciclos con el siguiente perfil de termociclado: 94ºC durante 10 s; 68ºC durante 30 s; 72ºC durante 5 min. Esto se siguió de una vuelta adicional a 72ºC durante 5 min. Los productos se ligaron en el vector de clonación pCR2.1 TA (Invitrogen, San Diego, CA) y se usaron para transformar E. coli. Los transformantes bacterianos individuales resistentes a ampicilina se exploraron mediante PCR para determinar la presencia de un inserto usando la pareja de cebadores siguiente:

M13	Inverso 5'-CAGGAAACAGCTATGA-3'	(SEC ID Nº: 18)

M13	Directo 5'-GTAAAACGACGGCCAGTG-3'	(SEC ID Nº: 19)

y el siguiente perfil de termociclado: 94ºC durante 15 s; 55ºC durante 30 s; 72ºC durante 1 min. Esto se siguió de una vuelta adicional a 72ºC durante 6 min. El inserto SP 1-4 original en el plásmido pCR2.1 (SEC ID Nº: 29) se secuenció usando el cebador inverso M13 (SEC ID Nº: 18) y el cebador M13-20 (SEC ID Nº: 19) en un ABI 373 DNA Sequencer. El inserto SP 1-4 original (SEC ID Nº: 29) se corresponde con los nucleótidos 1534-1875 de la SEC ID Nº: 14. Las secuencias de ADN se analizaron usando el Sequencher 3.0 (Gene Codes Corporation, Ann Arbor, MI).

B. Aislamiento de ADNc de SP 1-4 de longitud completa

Se preparó ADNc "Marathon" a partir de ARN poli A+ de próstata humana normal para realizar la amplificación rápida de los extremos del ADNc tanto 5' como 3' [RACE, Frohman, et al., Proc. Nat. Acad. Sci. 85: 8998-9002, (1998), Clontech Laboratories, Palo Alto, Ca]. La RACE 5' se realizó con la siguiente pareja de cebadores:

AP1	5'-CCATCCTAATACGACTCACTATAGGGC-3'	(SEC ID Nº: 20)

A79331	5'-GCCGAGTAATAGGAGACACGTCGTGG-3'	(SEC ID Nº: 21)

La RACE 3' se realizó con la siguiente pareja de cebadores:

AP1	5'-CCATCCTAATACGACTCACTATAGGGC-3'	(SEC ID Nº: 20); y

A79326	5'-TGGAAACTGGTTGCGAACTTCCG-3'	(SEC ID Nº: 22)

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El perfil de termociclado para todas las reacciones de RACE era de 94ºC durante 15 s; 68ºC durante 4 min durante 30 ciclos usando el Advantage cDNA Polymerase Mix (Clontech Laboratories, Palo Alto, CA). Los productos de RACE 5' y 3' de aproximadamente 4 kb y 1,6 kb, respectivamente, se aislaron mediante electroforesis en gel de agarosa, se ligaron en el vector pCR2.1 TA (Invitrogen, San Diego, CA) y se usaron para transformar células E. coli competentes. Se exploraron las colonias bacterianas individuales resistentes a ampicilina mediante PCR para determinar la presencia de un inserto con la siguiente pareja de cebadores:

AP2	5'-ACTCACTATAGGGCTCGAGCGGC-3'	(SEC ID Nº: 23)

A79331	5'-GCCGAGTAATAGGAGACACGTCGTGG-3'	(SEC ID Nº: 21)

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para los productos de RACE 5' y la siguiente pareja de cebadores:

AP2	5'-ACTCACTATAGGGCTCGAGCGGC-3'	(SEC ID Nº: 23)

A79328	5'-CAAAGTCATTTGGCAGCAGACCAGG-3'	(SEC ID Nº: 24)

para los productos de RACE 3' usando un perfil de termociclado de 94ºC durante 15 s; 55ºC durante 30 s; 72ºC durante 1 min durante 35 ciclos, seguidos de una vuelta adicional a 72ºC durante 6 min. Los productos de PCR se resolvieron mediante electroforesis en gel de agarosa y se cultivaron transformantes bacterianos individuales en medio de cultivo (Caldo Luria suplementado con ampicilina 100 \mug/ml) antes de la preparación del ADN plasmídico. La secuencia de ADN completa de los productos de RACE individuales se determinó mediante secuenciación fluorescente automática usando un secuenciador de ADN ABI 373 junto con los cebadores de ADN de costumbre y el Primer Island Transposition Kit (Perkin-Elmer/Applied Biosystems Division, Foster City, CA).

La secuencia de nucleótidos completa de 5668 pares de bases denominada ADNc de SP 1-4 se muestra en la Figura 10 (SEC ID Nº: 14). La secuencia contiene una sola fase de lectura abierta con un sitio de inicio de la traducción aparente en las posiciones de nucleótidos 43-45 [Kozak, et al., Nucl. Acids Res. 12: 3873-3893 (1994)] con un codón de terminación en las posiciones de nucleótidos 3328-3330 (Figura 10).

La proteína SP 1-4 de longitud completa (SEC ID Nº: 15) que se muestra en la Figura 11 tiene 1095 aminoácidos de longitud. Las regiones importantes de la secuencia de aminoácidos de la proteína SP 1-4 incluyen las regiones transmembrana que se corresponden con los aminoácidos 732-748, 846-876, 681-703, 789-805, 944-971, 820-837 y 999-1015, respectivamente, y los sitios de N-glicosilación potenciales, que comienzan en los aminoácidos 6, 75, 247, 308, 812, 925, 1041 y 1063, respectivamente. Los clones pCR2.1/SP 1-4 (RACE 5', SEC ID Nº: 27) y pCR2.1/SP 1-4 (RACE 3', SEC ID Nº: 28) se han depositado en la ATCC y se les ha asignado los números de depósito ATCC 98829 y 98829, respectivamente

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Ejemplo 4 Expresión de SP 1-4 humana A. RT-PCR

La síntesis de la primera cadena de ADNc se preparó usando ARN poli A+ humano y el SMART PCR cDNA Synthesis Kit (Clontech Laboratories, Palo Alto, CA). La pareja de cebadores

A80552	5'-GATTTTCACCAATGACCGCCG-3'	(SEC ID Nº: 25); y

A80553	5'-CCCCAGCAGCATTGATGTCG-3'	(SEC ID Nº: 26)

se usó para evaluar la expresión con un perfil de termociclado de 94ºC durante 15 s; 65ºC durante 15 s; 72ºC durante 30 s (30 ciclos), seguidos de una vuelta adicional a 72ºC durante 6 min. Los productos de amplificación se resolvieron mediante electroforesis en gel de agarosa y se visualizaron mediante tinción con bromuro de etidio y luz ultravioleta.

Como se muestra en la Tabla 1 a continuación, se amplificaron numerosas muestras y la expresión de ARNm específico de SP 1-4 se detectó claramente mediante RT-PCR en tejido de testículo y de próstata, así como en una línea celular de adenocarcinoma colorrectal (SW480), una muestra de tejido de melanoma (G361) y en LNCaP, que es una línea celular de carcinoma prostático.

TABLA 1

1

B. Hibridación de ácido nucleico

El inserto original aislado a partir de la biblioteca sustraída se usó como una sonda de hibridación para el análisis de transferencia de Northern y de transferencia puntual de ARN. El fragmento se marcó con cebadores aleatorios con ^{32}P-dCTP, se purificó en una microcolumna de centrifugación G-50 y se hibridó con filtros usando ExpressHyb Hybridization Solution (Clontech Laboratories, Palo Alto, CA) a 68ºC durante 2-4 horas. Los filtros se lavaron secuencialmente en SSC 2X [SSC 1X = NaCl 150 mM, citrato sódico 15 mM], SDS al 0,1% a temperatura ambiente durante 30 min, SSC 0,5X, SDS al 0,1% a temperatura ambiente durante 30 min y 0,5X y SDS al 0,1% a 65ºC durante 30 min. Se realizó una autorradiografía durante de una hora a un día a -70ºC usando una película Kodak XAR y una pantalla de intensificación simple.

Los resultados del análisis de transferencia de Northern y de la transferencia puntual de ARN humano de numerosos tejidos de origen tanto adulto como fetal se muestran en las Tablas 2 y 3 a continuación, respectivamente, e indican que el ARNm específico de SP 1-4 se expresa preferiblemente en tejido de próstata.

TABLA 2

2

TABLA 3

4

Aunque la invención se ha descrito con respecto a métodos y realizaciones específicos, se entenderá que pueden realizarse diversas modificaciones y cambios sin alejarse de la invención.

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<110> Dendreon Corporation, et al.

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<120> Composiciones de polinucleótido y antígeno de tumor de próstata

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<130> 7636-0015.41

\vskip0.400000\baselineskip

<140> sin asignar

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<141> sin asignar

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<150> 60/056.110

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<151> 20-08-1997

\vskip0.400000\baselineskip

<160> 29

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<170> FastSEQ para Windows Versión 3.0

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 1

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 257

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 1

\vskip1.000000\baselineskip

5

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\vskip0.400000\baselineskip

<210> 2

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<211> 224

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

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<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 2

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6

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\vskip0.400000\baselineskip

<210> 3

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<211> 128

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\newpage

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 3

7

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 4

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 236

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

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<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 4

8

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 5

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 224

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

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<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 5

9

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 6

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<211> 249

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

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<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 6

10

\newpage

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 7

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 84

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 7

\vskip1.000000\baselineskip

11

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 8

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 254

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 8

\vskip1.000000\baselineskip

12

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 9

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 33

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

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<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 9

\vskip1.000000\baselineskip

13

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 10

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 18

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\newpage

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 10

\vskip1.000000\baselineskip

14

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 11

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 14

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 11

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip0.5cm

15

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 12

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 17

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> primer_bind

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (1)...(17)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> cebador oligonucleotídico

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 12

\vskip1.000000\baselineskip

16

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 13

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 16

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> primer_bind

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (1)...(16)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> cebador oligonucleotídico

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 13

\vskip1.000000\baselineskip

17

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 14

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 5668

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\newpage

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 14

\vskip1.000000\baselineskip

18

19

20

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 15

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 1095

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 15

\vskip1.000000\baselineskip

21

22

23

24

25

26

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 16

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 22

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<212> ADN

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<213> Secuencia artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> primer_bind

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (1)...(22)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> cebador NP1

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 16

\vskip1.000000\baselineskip

27

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 17

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 22

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

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<213> Secuencia artificial

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<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> primer_bind

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<222> (1)...(22)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> cebador NP2

\newpage

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 17

\vskip1.000000\baselineskip

28

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\vskip0.400000\baselineskip

<210> 18

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 16

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<212> ADN

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<213> Secuencia artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> primer_bind

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (1)...(16)

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<223> cebador inverso M13

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\vskip0.400000\baselineskip

<400> 18

\vskip1.000000\baselineskip

29

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\vskip0.400000\baselineskip

<210> 19

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<211> 18

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<212> ADN

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<213> Secuencia artificial

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<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> primer_bind

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<222> (1)...(18)

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<223> cebador directo M13

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<400> 19

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30

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\vskip0.400000\baselineskip

<210> 20

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 27

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<212> ADN

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<213> Secuencia artificial

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<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> primer_bind

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (1)...(27)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> cebador AP1

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 20

\vskip1.000000\baselineskip

31

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 21

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 26

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> primer_bind

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (1)...(26)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> cebador A79331

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 21

\vskip1.000000\baselineskip

32

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 22

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 23

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> primer_bind

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (1)...(23)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> cebador A79326

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 22

\vskip1.000000\baselineskip

33

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 23

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 23

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> primer_bind

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (1)...(23)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> cebador AP2

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 23

\vskip1.000000\baselineskip

34

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 24

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 25

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> primer_bind

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (1)...(25)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> cebador A79328

\newpage

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 24

\vskip1.000000\baselineskip

35

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 25

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 21

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> primer_bind

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (1)...(21)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> cebador A80552

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 25

\vskip1.000000\baselineskip

36

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 26

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 20

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> primer_bind

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (1)...(20)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> cebador A80553

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 26

\vskip1.000000\baselineskip

37

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 27

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 1690

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

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<213> Homo sapiens

\newpage

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 27

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\vskip1.000000\baselineskip

38

\newpage

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 28

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<211> 3848

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<212> ADN

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<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 28

\vskip1.000000\baselineskip

40

41

42

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 29

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 342

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 29

\vskip1.000000\baselineskip

43

Claims

1. Un polinucleótido aislado que codifica un polipéptido que tiene al menos el 80% de identidad de secuencia de aminoácidos con un polipéptido codificado por los nucleótidos 43-3327 de la SEC ID Nº: 14, en el que el % de identidad se calcula usando el programa LALIGN que se encuentra en la serie de programas FASTA Versión 2.0, usando los parámetros por defecto con la matriz BLOSUM50, una ktup de 2 y una penalización por huecos de -12/-2.

2. Un polinucleótido aislado que hibrida en condiciones de alta rigurosidad con los nucleótidos 43-3327 de la SEC ID Nº: 14 o la complementaria de la misma.

3. Un polinucleótido aislado constituido esencialmente por los nucleótidos 43-3327 de la secuencia de nucleótidos de la SEC ID Nº: 14 o la complementaria de la misma.

4. El polinucleótido aislado de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, donde dicho polinucleótido es una molécula de ARN.

5. Un vector que comprende el ácido nucleico de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4.

6. Un vector que comprende el ácido nucleico de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, unido operativamente con secuencias de control reconocidas por una célula hospedadora transformada con dicho vector.

7. Una célula hospedadora que comprende el vector de la reivindicación 5 ó 6.

8. Un proceso para producir un polipéptido de antígeno de tumor de próstata que comprende:

(a) cultivar la célula hospedadora de la reivindicación 7 en condiciones adecuadas para la expresión de dicho polipéptido de antígeno de tumor de próstata; y

(b) recuperar dicho polipéptido de antígeno de tumor de próstata a partir del cultivo celular.

9. Un polipéptido de antígeno de tumor de próstata aislado que tiene al menos el 80% de identidad de secuencia de aminoácidos con los restos aminoacídicos 1 a 1095 de la Figura 11 (SEC ID Nº: 15), en el que el % de identidad se calcula usando el programa LALIGN que se encuentra en la serie de programas FASTA Versión 2.0, usando los parámetros por defecto con la matriz BLOSUM50, una ktup de 2 y una penalización por huecos de -12/-2.

10. Un polipéptido de antígeno de tumor de próstata aislado que comprende los restos aminoacídicos 1 a 1095 de la Figura 11 (SEC ID Nº: 15).

11. Una molécula quimérica que comprende un polipéptido de antígeno de tumor de próstata de acuerdo con la reivindicación 10 fusionado con una secuencia de aminoácidos heteróloga.

12. Un anticuerpo que se une específicamente a un polipéptido de antígeno de tumor de próstata de acuerdo con la reivindicación 10.

13. Un método in vitro para detectar la expresión de un antígeno de tumor de próstata en un individuo, que comprende:

(a) medir la expresión de antígeno de tumor de próstata en un tejido de un primer individuo, teniendo dicho antígeno de tumor de próstata la secuencia de aminoácidos de la SEC ID Nº: 15; y

(b) comparar dicha expresión con la expresión de dicho antígeno de tumor de próstata en un tejido de un segundo individuo no afectado, en el que cuando la expresión de dicho antígeno de tumor de próstata de dicho primer individuo es superior a la expresión de antígeno de tumor de próstata en dicho segundo individuo, el primer individuo presenta riesgo de padecer una afección relacionada con antígeno de tumor de próstata.

14. Un método para detectar células tumorales en una muestra de tejido que comprende:

(a) amplificar ácidos nucleicos generados a partir de dicha muestra mediante reacción en cadena de la polimerasa (PCR) usando dos cebadores, diseñándose dichos dos cebadores para que amplifiquen selectivamente la secuencia de la SEC ID Nº: 14, y

(b) detectar la presencia de los productos de amplificación que se corresponden con al menos una de dichas secuencias o porciones amplificadas de las mismas.