ES2301163T3 - Tripeptidil aminopeptidasa. - Google Patents

Abstract

UNA AMINOPEPTIDASA DE TRIPEPTIDILO (TPAP) CODIFICADA POR UNA ESTRUCTURA DE ADN QUE CONTIENE: I) LA SECUENCIA DE ADN MOSTRADA EN EL N ADN QUE CODIFICA LA TPAP DE DSM 9570, O III) UNA SECUENCIA DE NUCLEOTIDOS QUE SE HIBRIDIZA A UNA SONDA DE OLIGONUCLEOTIDOS PREPARADA EN BASE A LAS SECUENCIAS DE ADN MOSTRADAS EN EL N SEC 1, 2 O 3 EN BASE A CUALQUIERA DE LAS SECUENCIAS DE AMINOACIDOS MOSTRADAS EN LOS N LA TPAP SE PUEDE OBTENER MEDIANTE UNA TECNOLOGIA DEL ADN RECOMBINANTE. SE PUEDEN PRODUCIR CEPAS DE PRODUCCION DEFICIENTE DE TPAP MEDIANTE LA INACTIVACION O MODIFICACION DE UNA SECUENCIA DE ADN QUE CODIFICA LA TPAP.

Description

Tripeptidil aminopeptidasa.

Campo de la invención

La presente invención se refiere a una tripeptidil aminopeptidasa (TPAP), un constructo de ADN que codifica la TPAP, un método para producir TPAP y métodos para reducir la producción de TPAP en las células en las que no se desea actividad TPAP.

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Antecedentes de la invención

Las tripeptidil aminopeptidasas son enzimas capaces de seccionar fragmentos de N-términos insustituidos de péptidos, oligopéptidos, o proteínas. Las tripeptidil aminopeptidasas pueden ser no específicas, es decir, seccionan cualquier secuencia tripeptídica del extremo N-terminal insustituido, o específicas, es decir capaces de seccionar tipos específicos de secuencias tripeptídicas.

Las tripeptidil aminopeptidasas de origen animal han sido proporcionadas previamente. Por ejemplo, Doebber et al. (1978), Endocrinology 103: 1794-1804, revela una tripeptidil aminopeptidasa aislada de glándulas bovinas pituitarias, que fue mostrada para seccionar tripéptidos del extremo N-terminal de la hormona de crecimiento bovina. En Mammalian Proteases Vol. 2, Exopeptidases (AP 1986, Eds. J.K. McDonald y A.J. Barrett) se describen las tripeptidil aminopeptidasas que están aisladas de glándulas pituitarias de carne bovina, ovarios de cerda preñada y bazo de cerdo, respectivamente.

Una tripeptidil aminopeptidasa bacteriana aislada de Streptomyces lividans 66 está descrita por Krieger et al., Febs Letters vol. 352, No. 3, págs 385-388, 1994. Butler et al., Applied and Environmental Microbiology, Agosto 1995, p. 3145-3150 revelan el gen que codifica dicha peptidasa y la secuencia de aminoácidos deducida. La peptidasa está caracterizada como una serina proteasa con un pH óptimo entre 7.5 y 8.5.

Es bien conocido que la estabilidad de productos producidos de manera microbiana, tales como enzimas u otras proteínas, pueden variar, entre otras cosas, en función del método por el cual se produce el producto y/o el origen o productor microbiano del producto. Una estabilidad reducida de un producto producido de manera microbiana puede, p. ej., deberse a una resistencia reducida al calor, a la luz o a otras condiciones externas, o puede deberse a la composición del propio producto. En relación con ello, la presencia de incluso cantidades pequeñas de actividad proteasa en un producto proteico puede suponer una estabilidad significativamente reducida de dicho producto. Frecuentemente, no obstante, no es posible identificar con exactitud la causa de la estabilidad variable.

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Resumen de la invención

Los presentes inventores han encontrado sorprendentemente que varias especies fúngicas producen TPAP y que los productos proteicos producidos por estos organismos pueden contener cantidades de TPAP inferiores que en algunos casos se ha encontrado que conducen a una estabilidad reducida de estos productos. Los presentes inventores han logrado el aislamiento y la caracterización de dicha TPAP. Se ha establecido que la TPAP es capaz de seccionar tripéptidos no específicamente del N-término insustituido de productos proteicos, un seccionamiento que en algunos casos puede ser deseable, y en otros casos (p. ej. cuando dan como resultado una estabilidad reducida de un producto proteico que comprende la TPAP) es muy indeseable.

Por consiguiente, un objeto de la presente invención es el hecho de proporcionar una tripeptidilpeptidasa substancialmente pura que puede ser usada para seccionar secuencias peptídicas o proteicas. Otro objeto es el hecho de proporcionar un método para producir productos proteicos esencialmente libres de TPAP, en particular productos que son sustratos para TPAP y que tienen una estabilidad reducida en presencia de TPAP.

En un primer aspecto general la presente invención se refiere a una TPAP aislada de origen fúngico. En particular, la TPAP puede ser obtenible a partir de cepas de la especie fúngica Aspergillus. En otros aspectos la invención se refiere a la TPAP identificada por la información de la secuencia de aminoácidos y/o de ADN y/o por características de la proteína enzimática, a los constructos de ADN que codifican la TPAP y a un constructo de ADN que comprende una secuencia de nucleótidos que es complementaria de una parte suficiente de la secuencia de ADN que codifica la TPAP para poder hibridar a dicha secuencia y de ese modo suprimir la capacidad de producción de TPAP de una célula huésped dada.

En un aspecto importante adicional la invención se refiere a un método para reducir la producción de TPAP a partir de una célula productora de TPAP, en dicho método la secuencia de ADN que codifica la TPAP o la secuencia del promotor de TPAP son modificadas o inactivadas para dar como resultado una producción de TPAP reducida a partir de dicha célula.

Definiciones

En el presente contexto el término "TPAP" se destina a indicar una aminopeptidasa que secciona tripéptidos del extremo N-terminal de una secuencia peptídica o proteica, por ejemplo de una secuencia proteica extendida, p. ej. encontrada en una prohormona o una proenzima. Expresado de una manera general, la TPAP es capaz de seccionar el tripéptido XYZ del grupo amino N-terminal insustituido de un péptido o proteína, donde X, Y, Z representa cualquier residuo de aminoácido (es decir, seleccionado de Ala, Arg, Asn, Asp, Cys, Gln, Glu, Gly, His, Ile, Leu, Lys, Met, Phe, Pro, Ser, Thr, Trp, Tyr, Val). En el sustrato de TPAP, X, Y y Z pueden todos ser diferentes o idénticos o dos de X, Y y Z pueden ser idénticos. Se entenderá que la TPAP de la invención no es específica en cuanto a la secuencia de aminoácidos del tripéptido que tiene que ser seccionada. En el ejemplo 7, se dan ejemplos específicos de productos tripeptídicos obtenidos del seccionamiento de péptidos y proteínas de origen natural.

El término "obtenible" según se utiliza con respecto al origen de la parte constituyente de las secuencias de ADN del constructo de ADN de la invención, se destina a indicar que la secuencia de ADN en cuestión puede ser aislada del material del ácido nucleico (ADN o ARN) del organismo pertinente o puede ser preparada en base a tal material. Por ejemplo, la secuencia de ADN puede ser aislada de una biblioteca genómica o de ADNc obtenida a partir del organismo usando procedimientos conocidos en la técnica, o puede ser preparada en base a tal material.

De manera análoga, cuando se usa en relación con la TPAP de la invención el término "obtenible" se destina a indicar que la TPAP puede ser recuperada del organismo en cuestión o puede ser codificada por una secuencia de ADN obtenible a partir de dicho organismo y recuperada de un organismo que exprese dicha secuencia de ADN.

Descripción detallada de la invención La TPAP de la invención

En el transcurso de la investigación que conduce a la presente invención dos TPAPs diferentes han sido aisladas y caracterizadas - una de una cepa de A. niger, la otra de una cepa de A. oryzae. Las dos TPAPs se contemplan como ejemplos representativos de una clase generalmente nueva de tripeptidil amino peptidasas.

Así, en un aspecto la invención se refiere a una TPAP que es codificada por un constructo de ADN comprendiendo

i)

al menos una, pero preferiblemente dos o más de las secuencias de ADN parciales mostradas en las SEC ID Nos. 1, 2 y 3, o

ii)

la secuencia de ADN parcial que codifica la parte N-terminal de una TPAP madura presente en DSM 9570, o

iii)

una secuencia de nucleótidos que hibrida a una sonda de oligonucleótidos preparada en base a las secuencias de ADN mostradas en las SEC ID NO. 1, 2 o 3 o en base a cualquiera de las secuencias de aminoácidos mostradas en las SEC ID Nos. 4-14, y que codifica una TPAP.

Una explicación más detallada de la secuencia de nucleótidos iii) está provista más abajo en la sección titulada "constructo de ADN y vector de la invención".

En otro aspecto la invención se refiere a una TPAP substancialmente pura que tiene una o más de las siguientes características

-

una capacidad de seccionar el sustrato Phe-Pro-Ala-pNA,

-

un peso molecular de aproximadamente 65 kDa (determinado esencialmente como se describe por Laemmli, U.K., 1970. "Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of bacteriophage T4"., Nature, 227, p. 680-685)

-

un pl en la gama de 4-6

-

un pH óptimo en la gama de aproximadamente 5.0-7.5,

-

tiene reactividad cruzada inmunológica con la TPAP purificada de A. niger o la TPAP purificada en A. oryzae,

-

comprende la secuencia N-terminal

Ala-Xaa(1)-Asn-Xaa(2)-Ser-His-Cys-Asp-Ser-Ile-Ile-Thr-Pro-Xaa(3)-Cys-Leu-Lys-Xaa(4)-Leu-Tyr-Asn-Ile-Gly-Asp-Tyr-Gln-Ala-Asp-Xaa(5)-Xaa(6) (SEC ID N° 15), donde cualquier Xaa(1), Xaa(2), Xaa(3), Xaa(4), Xaa(5) y Xaa(6) pueden ser diferentes o idénticos y seleccionados de cualquiera de los residuos de aminoácidos de origen natural. Preferiblemente, Xaa(1) es Lys o Gln, Xaa(2) es Ile o Thr, Xaa(3) es Pro o His, Xaa(4) es Glu o Gln, Xaa(5) es Pro o Ala y/o Xaa(6) es Lys o Asn.

Los anticuerpos que se deben usar para determinar la reacción cruzada inmunológica pueden ser preparados usando la TPAP purificada. Más específicamente, el antisuero contra la enzima de la invención puede ser aumentado inmunizando conejos (u otros roedores) según el procedimiento descrito por N. Axelsen et al. en: A Manual of Quantitative Immunoelectrophoresis, Blackwell Scientific Publications, 1973, Capítulo 23, o A. Johnstone y R. Thorpe, Immunochemistry in Practice, Blackwell Scientific Publications, 1982 (más específicamente págs. 27-31). Las inmunoglobulinas purificadas pueden ser obtenidas a partir de los antisueros, por ejemplo por precipitación de sal [(NH_{4})_{2}
SO_{4}], seguido de diálisis y cromatografía de intercambio iónico, p. ej. en DEAE-Sephadex^{TM}. La caracterización inmunoquímica de proteínas puede hacerse bien por análisis de difusión doble de Ouchterlony (O. Ouchterlony en: Handbook of Experimental Immunology (D.M. Weir, Ed.), Blackwell Scientific Publications, 1967, pp. 655-706), por inmunoelectroforesis cruzada (N. Axelsen et al., supra, capítulos 3 y 4), o por inmunoelectroforesis en cohete (N. Axelsen et al., supra, capítulo 2).

En una forma de realización la TPAP de la invención comprende al menos una de las secuencias de aminoácidos parciales mostradas en las SEC ID Nos. 4-9 y/o tiene un pH óptimo de aproximadamente 5.0-5.5 y/o un pl de aproximadamente 5.1 o 5.2.

En otra forma de realización la TPAP de la invención comprende al menos una de las secuencias de aminoácidos parciales SEC ID Nos 10-14 y/o tiene un pH óptimo en la gama de aproximadamente 5.5-7.5 y/o un pl de aproximadamente 4.5.

La TPAP que es codificada por una secuencia de ADN comprendiendo al menos una de las secuencias mostradas en las SEC ID NO 1, 2 y 3 o aquella contenida en DSM 9570 o que comprende los péptidos mostrados en las SEC ID Nos 4-9 fue aislada de un producto proteico producido por una cepa de A. niger (véase Ejemplo 1 a continuación). La TPA que comprende los péptidos SEC ID Nos 10-14 fue aislada de una cepa de A. oryzae, véase Ejemplo 2 a continuación.

Se cree actualmente que una TPAP de la clase generalmente nueva de tripeptidil aminopeptidas definidas aquí puede ser de cualquier origen, incluso de origen animal o vegetal, pero preferiblemente es de origen microbiano, es decir, bacteriano o fúngico. Incluso los presentes inventores son conscientes de que la presente descripción es el primer informe sobre la TPAP de origen fúngico. La TPAP de la invención puede ser purificada de cepas que son productoras de TPAP natural, o pueden más convenientemente ser técnicas de ADN recombinante como un producto genético homólogo o heterólogo, como se explicará posteriormente más abajo.

En particular, la TPAP de la invención puede ser obtenible de una cepa a partir de Aspergillus, tal como una cepa de A. oryzae, A. Niger, A. japonicus, A. aculeatus, A. nidulans o A. foetidus o una cepa de Trichoderma, p. ej. T. viride, T. reesei, T. longibrachiatum o T. harzianum, o una especie de Fusarium, p. ej. F. oxysporum, F. graminearum o F. solani, o una cepa de Thermomyces, p. ej. T. lanuginosus o T. insolens.

La TPAP de la invención es preferiblemente proporcionada en una forma aislada y substancialmente pura, p. ej. al menos un 90% de pureza tal como al menos un 95% de pureza.

Mientras que la presencia de TPAP en los productos proteicos puede ser considerada indeseable debido a la resultante estabilidad reducida de dicho producto, el uso de la TPAP purificada de la invención para la desestabilización controlada de productos proteicos puede ser ventajoso. Por ejemplo, está contemplado que la TPAP purificada de la invención puede ser usada para la desactivación de enzimas después de que éstas hayan ejercido su efecto deseado, y así, funcionen como una "enzima asesina". Tal desactivación se realiza de forma convencional por termoinactivación (o de forma alternativa, la actividad enzimática indeseada es eliminada por purificación). El uso de la TPAP para la desestabilización de enzimas termofílicas puede ser particularmente ventajoso.

Como un ejemplo de este uso puede ser mencionada la desactivación de AMG usada para la licuefacción del almidón, que se realiza actualmente calentando la mezcla reactiva a altas temperaturas (85°C 80). Esta desactivación puede, p. ej., ser obtenida añadiendo TPAP, preferiblemente en un proceso discontinuo después de que la AMG haya hidrolizado las dextrinas a glucosa. Una termoinactivación de la AMG es luego posible aumentando la temperatura hasta sólo aproximadamente 66°C durante un tiempo breve.

Otro ejemplo es la desactivación de AMG usada en la fermentación de cerveza tal como cerveza baja en calorías. En el procedimiento de fermentación normal de la cerveza, la AMG es inactivada por pasteurización. La adición de TPAP puede reducir la termoestabilidad de la AMG usada y así reducir la temperatura para la pasteurización. Por este tratamiento las características organolépticas pueden ser mejoradas.

Además, la TPAP purificada de la invención puede ser útil para varios objetivos donde un seccionamiento específico de secuencias de tripéptidos es deseable. Por ejemplo, algunas proteínas o péptidos son sintetizados en forma de precursores que comprenden varios residuos aminoácidos adicionales en el residuo de aminoácido N-terminal, cuya presencia es indeseable para la proteína que se debe utilizar. Pudiendo estar, p. ej., en el procesamiento de proteínas o péptidos, que pueden ser sintetizados en forma protegida como proteínas precursoras.

Constructo de ADN y vector de la invención

Conforme a otro aspecto adicional, la invención se refiere a un constructo de ADN que codifica una TPAP, que comprende

i)

al menos una, pero preferiblemente dos o todas las secuencias de ADN parciales mostradas en las SEC ID Nos. 1, 2 y 3, o

ii)

la secuencia de ADN que codifica la parte N-terminal de la TPAP y que está presente en DSM 9570, o

iii)

una secuencia de nucleótidos que hibrida a una sonda de oligonucleótidos preparada en base a cualquiera de las secuencias de ADN mostradas en la SEC ID NO. 1, 2 o 3 o en base a cualquiera de las secuencias de aminoácidos mostradas en la SEC ID Nos. 4-14, y que codifica una TPAP, o

iv)

una secuencia de nucleótidos complementaria a la secuencia de ADN/nucleótidos de i), ii) o iii).

El constructo de ADN de la invención puede ser usado bien para la producción recombinante de TPAP (secuencias de ADN/nucleótidos i)-iii)) o para reducir la capacidad de una célula para producir la TPAP, en la que dicha producción es indeseada (secuencia de nucleótidos iv)).

La secuencia de nucleótidos iii) puede, p. ej., ser aislada de otro organismo u otro organismo relacionado (p. ej. el mismo) conocido o contemplado para producir la TPAP en base a cualquiera de las secuencias del ADN parcial o de aminoácidos parciales mostradas en las SEC ID Nos. 1-14 o la secuencia de ADN que codifica la TPAP parcial de DSM 9570, p. ej. usando los procedimientos descritos aquí, o construida en base a cualquiera de dichas secuencias de ADN o de aminoácidos, p. ej. por introducción de sustituciones de nucleótidos que no dan lugar a otra secuencia de aminoácidos de la TPAP codificada por la secuencia de ADN, pero que corresponden al uso del codón del organismo huésped destinado a la producción de la TPAP, o por introducción de sustituciones de nucleótidos que dan lugar a una secuencia de aminoácidos diferente y en consecuencia, posiblemente, a una estructura proteica diferente que puede dar lugar a una TPAP mutante con propiedades diferentes de aquellas de la TPAP nativa, pero con la actividad TPAP intacta. Otros ejemplos de modificaciones posibles son la inserción de uno o más nucleótidos en la secuencia, adición de uno o más nucleótidos a cada extremo de la secuencia, o delección de uno o más nucleótidos a cada extremo o dentro de la secuencia.

Será entendido que las secuencias de ADN mostradas en las SEC ID Nos. 1-3 y la secuencia de ADN de DSM 9570 son secuencias parciales que pueden ser incluidas en y usadas para aislar una secuencia de ADN que codifica toda la TPAP. Esto puede ser conseguido fácilmente por métodos conocidos en la técnica. Según la presente invención, la secuencia de nucleótidos iii) se destina a incluir dicha secuencia de ADN entera.

La hibridación a la que se hace referencia arriba se destina a indicar que la secuencia de nucleótidos iii) hibrida a la misma sonda que la secuencia de ADN que codifica la TPAP (o a dicha secuencia de ADN que codifica la TPAP) bajo ciertas condiciones específicas que están descritas con detalle en la sección materiales y métodos más adelante. Normalmente, la secuencia de nucleótidos iii) es altamente homóloga a la secuencia de ADN mostrada en la SEC ID NO. 1, 2 o 3 o la secuencia de ADN que codifica la TPAP de DSM 9570 (al comparar la parte de la secuencia de nucleótidos iii) que corresponde a la(s) secuencia(s) de ADN parcial(es) descrita(s) aquí), tal como al menos el 65%, p. ej. al menos un 70% homóloga a dicha secuencia de ADN, p. ej. al menos un 75%, al menos un 80%, al menos un 85%, al menos un 90% o incluso al menos un 95% homóloga a cualquiera o a todas estas secuencias. Correspondientemente, la TPAP de la invención está contemplada para ser al menos un 65%, p. ej. al menos un 70% homóloga a la secuencia de aminoácidos codificada por dicha(s) secuencia(s) de ADN (según ha sido evaluado en base a una comparación entre la parte de la secuencia de aminoácidos de TPAP correspondiente a la parte codificada por la secuencia de ADN en cuestión), p. ej. al menos un 75%, al menos un 80%, al menos un 85%, al menos un 90%, o incluso al menos un 95% homóloga.

La secuencia de nucleótidos iii) puede ser una secuencia de ADN o ARN.

Las secuencias de ADN i)-iii) del constructo de ADN de la invención pueden ser preparadas mediante métodos conocidos. Así, la secuencia de ADN pertinente puede, por ejemplo, ser aislada mediante el establecimiento de una biblioteca genómica o de ADNc de un organismo previsto para contener la secuencia, p. ej. una célula como se ha descrito anteriormente, y mediante la selección de clones positivos por procedimientos convencionales. Ejemplos de tales procedimientos son la hibridación en sondas de oligonucleótidos adecuadas conforme a técnicas estándares (véase Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor, Nueva York 1989), y/o la selección de clones que expresan la actividad pertinente, y/o selección de clones que producen una proteína que es reactiva con un anticuerpo dirigido contra la enzima pertinente.

Un método preferido de aislamiento de una secuencia de ADN de una biblioteca de ADNc o genómica es el uso de la reacción en cadena de la polimerasa (PCR) usando sondas de oligonucleótidos degeneradas. Por ejemplo, la PCR puede ser realizada usando las técnicas descritas en PCR Protocols 1993, ed. Bruce A. White y The polymerase chain reaction, 1994, ed. Kary B. Mull is.

De forma alternativa, las secuencias de ADN i) y ii) pueden simplemente ser aisladas de DSM 9570.

Además, las secuencias de ADN del constructo de ADN de la invención, p. ej. la secuencia de nucleótidos iv) siendo complementaria a la secuencia de ADN/nucleótidos i), ii) o iii), puede ser sintetizada por técnicas establecidas, p. ej. en base a los principios descritos por Narang, SA, 1983, Tetrahedron 39:3 y Itakura et al., 1984, Annu. Rev. Biochem. 53:323.

El constructo de ADN puede ser de origen mezclado genómico y sintético, mezclado sintético y ADNc o mezclado genómico y ADNc preparado ligando fragmentos de origen sintético, genómico o de ADNc (según sea apropiado), los fragmentos correspondiendo a varias partes de la molécula de ADN recombinante entera, conforme a las técnicas estándares.

Se entenderá que un uso preferido de la secuencia de ADN i), ii) o iii) es en la preparación de TPAP recombinante, mientras que un uso preferido de la secuencia de ADN iv) es para la reducción de la capacidad de producción de TPAP de las células destinadas para el uso en la producción de productos proteicos que son sensibles a la TPAP.

Aunque la secuencia de ADN iv) puede ser complementaria a la secuencia codificante de la TPAP entera, es normalmente suficiente que la secuencia de ADN iv) sea complementaria sólo a una parte de dicha secuencia. Expresado de una manera funcional, la secuencia de ADN iv) debe ser complementaria a una longitud suficiente de la secuencia de ADN que codifica la TPAP para permitir la hibridación al ADN que codifica la TPAP y así reducir o prohibir la transcripción de dicho ARNm. Normalmente, es suficiente que la secuencia de ADN iv) comprenda un fragmento de ADN de al menos 17 nucleótidos tal como al menos 300 nucleótidos.

El vector que transporta un constructo de ADN de la invención, preferiblemente un vector de expresión recombinante, puede ser sometido convenientemente a cualquier procedimiento de ADN recombinante, y la elección del vector de expresión frecuentemente dependerá de la célula huésped en la que tenga que ser introducido. Así, el vector puede ser un vector que se replique de manera autónoma, es decir un vector que existe como una entidad extracromosómica, cuya replicación es independiente de la replicación cromosómica, p. ej. un plásmido o un bacteriófago. De forma alternativa, el vector puede ser uno que, al introducirse en una célula huésped, se integre en el genoma de la célula huésped y se replique junto con el (los) cromosoma(s) en el (los) que se haya integrado.

En el constructo de ADN o el vector, la secuencia de ADN debería ser operativamente conectada a una secuencia del promotor adecuada. El promotor puede ser cualquier secuencia de ADN que muestre actividad transcripcional en la célula huésped de elección y puede ser derivado de genes que codifican proteínas bien homólogas o heterólogas a la célula huésped. El promotor puede ser derivado de genes que codifican proteínas tanto extracelulares como intracelulares, tales como amilasas, glucoamilasas, proteasas, lipasas, celulasas y enzimas glicolíticas. Ejemplos de promotores adecuados para dirigir la transcripción del constructo de ADN de la invención son promotores derivados de genes para la TAKA amilasa de A. oryzae, la proteinasa aspártica de Rhizomucor miehei, la glucoamilasa de A. Niger, la \alpha-amilasa neutra de A. niger, la \alpha-amilasa estable en ácido de A. niger, y la lipasa de Rhizomucor miehei. Ejemplos de promotores de genes para enzimas glicolíticas son TPI, ADH, y PGK. El promotor puede ser también un promotor homólogo, es decir un gen nativo de la cepa huésped utilizada.

La secuencia del promotor puede estar provista de enlazadores para introducir sitios de restricción específicos que facilitan la ligación de la secuencia del promotor con el gen de elección o con un péptido señal o prerregión seleccionado.

El constructo de ADN y/o vector de expresión de la invención puede también comprender un terminador adecuado operativamente conectado a la secuencia de ADN que codifica la TPAP y/o una secuencia de poliadenilación. Las secuencias del terminador y de poliadenilación pueden ser derivadas de las mismas fuentes que los promotores. También se pueden insertar secuencias potenciadoras en el constructo.

El constructo de ADN y/o vector puede además comprender una secuencia de ADN que permite que el vector se replique en la célula huésped en cuestión. Ejemplos de tales secuencias son los orígenes de replicación de plásmidos pUC19, pACYC177, pUB110, pE194, pAMB1 y pIJ702.

El constructo de ADN y/o vector puede también comprender un marcador seleccionable. Ejemplos de marcadores de selección incluyen el amdS o argB, trpC o pyrG (los tres últimos marcadores, p. ej. de A. nidulans o A. Niger).

Los procedimientos usados para construir el constructo de ADN de la invención comprenden la ligación de las secuencias de ADN mencionadas anteriormente del promotor, del terminador y otros elementos, respectivamente, e insertarlas en los vectores adecuados que contienen la información necesaria para la replicación, son bien conocidos por los expertos en la técnica (véase, por ejemplo, Sambrook et al. op. cit.).

La célula y un método para producir la TPAP de la invención

En una forma de realización, la célula de la invención que comprende sea un constructo de ADN o sea un vector de expresión de la invención, tal como se ha definido anteriormente, se usa como una célula huésped en la producción recombinante de la TPAP de la invención. En este caso el constructo de ADN o vector de expresión comprende cualquiera de las secuencias de ADN que codifican la TPAP i)-iii) o el inserto de DSM 9570 definido arriba. La célula puede ser transformada con el constructo de ADN, integrando convenientemente el constructo de ADN en el cromosoma huésped, aunque el constructo de ADN puede también existir como una entidad extracromosómica. No obstante, la integración está generalmente considerada como una ventaja ya que la secuencia de ADN es más probable que se mantenga estable en la célula. La integración de los constructos de ADN en el cromosoma huésped puede ser realizada según los métodos convencionales, p. ej. por recombinación homóloga. De forma alternativa, la célula puede ser transfor-
mada con un vector de expresión como se describe más abajo con respecto a los distintos tipos de células huéspedes.

La célula de la invención puede ser una célula de un organismo mayor tal como un mamífero o un insecto, pero es preferiblemente una célula microbiana, p. ej. una célula bacteriana o fúngica (incluso de levadura).

Ejemplos de bacterias adecuadas son bacterias gram positivas tales como Bacillus subtilis, Bacillus licheniformis, Bacillus lentus, Bacillus brevis, Bacillus stearothermophilus, Bacillus alkalophilus, Bacillus amyloliquefaciens, Bacillus coagulans, Bacillus circulans, Bacillus lautus, Bacillus thuringiensis o Streptomyces lividans o Streptomyces murinus, o bacterias gram negativas tales como E. coli. La transformación de las bacterias puede efectuarse por ejemplo por transformación del protoplasto o usando células competentes en un modo conocido per se.

El organismo de la levadura puede ser seleccionado de manera favorable de una especie de Saccharomyces o Schizosaccharomyces, p. ej. Saccharomyces cerevisiae. El hongo filamentoso puede ventajosamente pertenecer a una especie de Aspergillus, p. ej. Aspergillus oryzae, A. nidulans, A. foetidus, A. aculeatus, A. japonicus o A. niger, una especie de Trichoderma, p. ej. T. reesei, T. longibrachiatum o T. harzianum, o una especie de Fusarium, p. ej. F. oxysporum, F. graminearum o F. solani. Las células fúngicas pueden ser transformadas por un proceso que implica la formación de protoplastos y la transformación de los protoplastos, seguido de la regeneración de la pared celular en cierto modo conocido per se.

En otro aspecto la invención se refiere a un método para producir TPAP, este método comprende i) el cultivo de una célula de la invención tal como se ha definido anteriormente en un medio de cultivo adecuado bajo condiciones que permiten la expresión de la TPAP, y la recuperación de la TPAP del cultivo.

El medio usado para cultivar las células puede ser cualquier medio convencional adecuado para hacer crecer la célula huésped en cuestión. Medios adecuados están disponibles por proveedores comerciales o pueden ser preparados según recetas publicadas (p. ej. en catálogos de la American Type Culture Collection). Se cree que la presencia de proteína en el medio puede resultar en una producción de TPAP aumentada.

La TPAP puede ser recuperada del medio por procedimientos convencionales que incluyen la separación de las células del medio por centrifugado o filtración, si fuera necesario después de la disrupción de las células, precipitación de los componentes proteicos del sobrenadante o filtración mediante una sal, p. ej. sulfato de amonio, purificación seguida de una variedad de procedimientos cromatográficos, p. ej. cromatografía de intercambio iónico, cromatografía de afinidad, o similar.

Eliminación o reducción de la actividad TPAP

La identificación de la TPAP como un factor desestabilizante en productos proteicos producidos de manera microbiana puede tener consecuencias importantes para la producción de un gran número de diferentes productos proteicos. De esta manera, según ha sido demostrado por los presentes inventores, cantidades incluso inferiores de TPAP presente en un producto proteico pueden resultar en una termoestabilidad reducida de dicho producto. Por consiguiente, por la presente invención es posible construir cepas productoras con una capacidad de producción de TPAP reducida.

La reducción de la producción de TPAP de una célula productora de TPAP puede convenientemente ser realizada por modificación o inactivación de una secuencia de ADN presente en dicha célula y necesaria para la expresión de TPAP para dar como resultado una producción de TPAP reducida de dicha célula.

La secuencia de ADN que debe ser modificada puede, p. ej., ser una secuencia de ADN que codifica la TPAP o una parte de la misma esencial para exhibir actividad TPAP o puede ser una secuencia reguladora requerida para la expresión de TPAP de una secuencia de ADN que codifica la TPAP.

Como un ejemplo la secuencia reguladora puede ser una secuencia del promotor o una parte funcional de la misma, es decir una parte que es suficiente para efectuar la expresión de TPAP.

La modificación o inactivación de la secuencia de ADN puede ser realizada sometiendo la célula productora de TPAP a mutagénesis y seleccionando las células para las cuales la capacidad de producción de TPAP ha sido reducida. La mutagénesis, que puede ser específica o aleatoria, puede, p. ej., ser realizada usando un agente mutagenizante físico o químico adecuado, usando un oligonucleótido adecuado, o sometiendo la secuencia de ADN a mutagénesis generada por PCR. Además, la mutagénesis puede ser realizada usando cualquier combinación de estos agentes mutagenizantes.

Ejemplos de un agente mutagenizante físico o químico adecuado para este objetivo incluye la irradiación ultravioleta (UV), hidroxilamina, N-metil-N'-nitro-N-nitrosoguanidina (MNNG), O-metil hidroxilamina, ácido nitroso, etil metano sulfonato (EMS), bisulfito de sodio, ácido fórmico, y nucleótidos análogos.

Cuando se utilizan tales agentes, la mutagénesis es normalmente realizada incubando la célula que debe ser mutagenizada en presencia del agente mutagenizante de elección bajo condiciones adecuadas para que la mutagénesis tenga lugar, y seleccionando las células mutadas que tengan una producción de TPAP reducida.

Cuando la modificación o inactivación se realiza por introducción, sustitución o eliminación de uno o más nucleótidos en la secuencia de codificación de TPAP o un elemento regulador requerido para la transcripción o traducción de la misma, los nucleótidos pueden, p. ej., ser insertados o eliminados para dar como resultado la introducción de un codón de detención, la eliminación del codón de iniciación o un cambio del marco de lectura abierto. La modificación o inactivación de la secuencia de codificación de TPAP o un elemento regulador puede ser realizada por mutagénesis dirigida o por mutagénesis generada por PCR conforme a métodos conocidos en la técnica. Aunque en principio, la modificación in vivo puede ser realizada, es decir directamente en la célula transportadora del gen de TPAP que debe ser modificada, se prefiere actualmente realizar la modificación in vitro como se ejemplifica más abajo.

Un ejemplo de un modo conveniente para inactivar o reducir la producción de TPAP de una célula huésped de elección se basa en los principios de sustitución génica o interrupción génica. Por ejemplo, el método de interrupción génica implica el uso de una secuencia de ADN correspondiente al gen endógeno o un fragmento del gen que se desea destruir. Dicha secuencia de ADN es mutada in vitro a un gen defectuoso y transformada en la célula huésped. Por recombinación homóloga el gen defectuoso reemplaza el gen endógeno o fragmento de gen. Puede ser deseable que el gen defectuoso o fragmento de gen codifique un marcador que puede ser usado para la selección de transformantes donde el gen de TPAP ha sido modificado o destruido.

De forma alternativa, la modificación o inactivación de la secuencia puede ser realizada usando técnicas de ADN antisentido establecidas usando una secuencia de nucleótidos complementaria a la secuencia de codificación de TPAP, p. ej. la secuencia de nucleótidos iv) anteriormente descrita. Más específicamente, la producción de TPAP a partir de una célula productora de TPAP puede ser reducida o eliminada introduciendo una secuencia de nucleótidos complementaria a la secuencia de codificación de TPAP y así ser capaz de hibridar el ARNm de la TPAP producida en la célula dentro de la célula de manera que la secuencia de nucleótidos puede ser transcrita en la célula bajo condiciones que permiten que la secuencia de nucleótidos hibride el ARNm de la TPAP y así reducir la cantidad de TPAP traducida de dicho ARNm o eliminar tal traducción.

Los mutantes deficientes en TPAP creados de esta manera son particularmente útiles en la expresión de proteínas heterólogas. En el contexto presente el término "proteínas heterólogas" se destina a significar una proteína que no es nativa a la célula huésped, una proteína nativa donde las modificaciones han sido hechas para alterar la secuencia nativa, o una proteína nativa cuya expresión es alterada de forma cuantitativa como resultado de una manipulación de la célula huésped por técnicas de ADN recombinante.

Se prefiere que la célula productora de TPAP para ser modificada conforme a la presente invención sea una cepa que sea conveniente para la producción de los productos proteicos deseados, bien homólogos o heterólogos a la célula. Por ejemplo, células de los géneros fúngicos Aspergillus, Trichoderma y Fusarium son ejemplos de células productoras preferidas. Por consiguiente, la célula que se prefiere para ser modificada según la presente invención es una célula de Aspergillus sp., en particular una célula de A. Niger, A. oryzae, A. japonicus, A. foetidus o A. nidulans o una célula de una Trichoderma sp., p. ej. T. reesei, T. longibrachiatum o T. harzianum, o una célula de Fusarium sp., p. ej. F. oxysporum, F. graminearum o F. solani.

En una forma de realización específica de la invención la célula para ser modificada es una célula de A. niger o A. oryzae que se usa para la producción de enzimas tales como la AMG.

En otro aspecto la invención se refiere a un método de preparación de un producto esencialmente libre de actividad TPAP, dicho método comprende la transformación de una célula huésped como se ha descrito anteriormente con una capacidad de producción de TPAP reducida o ninguna con una secuencia de ADN que codifica el producto, el cultivo de la célula transformada bajo las condiciones adecuadas para la expresión del producto, y la recuperación del producto del cultivo.

En un aspecto alternativo la invención se refiere a un método para preparar un producto esencialmente libre de actividad TPAP, este producto es codificado por una secuencia de ADN presente en una célula de expresión de TPAP, este método comprende la modificación o inactivación de una secuencia de ADN presente en dicha célula y necesaria para la expresión de la TPAP como se ha descrito anteriormente, y posteriormente cultivar la célula bajo condiciones adecuadas para la expresión del producto, y la recuperación del producto del cultivo.

En otro aspecto ulterior la invención se refiere a un método para preparar un producto esencialmente libre de TPAP por fermentación de una célula productora de TPAP que también produce el producto, este método comprende la adición de una cantidad eficaz de un inhibidor capaz de inhibir la actividad TPAP al caldo de fermentación bien durante o después de que la fermentación haya sido completada, recuperar el producto de interés del caldo de fermentación, y opcionalmente someter el producto recuperado a una purificación posterior. Este método está ilustrado también en los ejemplos más abajo.

En otro aspecto alternativo adicional la invención se refiere a un método para preparar un producto esencialmente libre de actividad TPAP, este producto es codificado por una secuencia de ADN presente en una célula de expresión de TPAP, este método comprende cultivar la célula de expresión de TPAP que codifica el producto bajo condiciones que permiten la expresión del producto, someter el caldo de cultivo resultante a un tratamiento combinado del pH y de la temperatura para reducir la actividad TPAP sustancialmente, y recuperar el producto del caldo de cultivo. De forma alternativa, el tratamiento combinado del pH y de la temperatura puede ser realizado en una preparación enzimática recuperada del caldo de cultivo. El tratamiento combinado del pH y de la temperatura puede opcionalmente ser usado en combinación con un tratamiento con un inhibidor de la TPAP.

Conforme a este aspecto de la invención es posible eliminar al menos un 60% de la actividad TPAP, así como al menos un 75% de la actividad, más preferiblemente al menos un 85% de la actividad, aún más preferiblemente al menos un 95% de la actividad, y más preferiblemente esencialmente al menos un 99% de la actividad TPAP. Está contemplado que una eliminación completa de la actividad TPAP puede ser obtenida usando este método.

El tratamiento combinado del pH y de la temperatura es preferiblemente realizado a un pH en la gama de 6.5-7 y una temperatura en la gama de 25-40°C durante un periodo temporal suficiente para obtener el efecto deseado. Normalmente, 0,5-1 hora es suficiente para obtener el efecto deseado.

Los métodos usados para el cultivo y purificación del producto de interés pueden ser realizados por métodos conocidos en la técnica, p. ej. según se ha descrito antes.

Los métodos de la invención para producir un producto esencialmente sin TPAP es de interés particular en la producción de proteínas eucarióticas, en particular proteínas fúngicas tales como las enzimas. El producto enzimático puede, p. ej., ser seleccionado de una enzima amilolítica, una enzima lipolítica, una enzima proteolítica, una enzima celulítica, una oxidorreductasa o una enzima degradadora de la pared celular vegetal. Ejemplos de enzimas de este tipo incluyen AMG, amilasa, lipasa, cutinasa, esterasa, celulasa, hemicelulasa, proteasa, peroxidasa, lacasa, fenoloxidasa, catalasa, glucosa-oxidasa, fitasa, liasa, pectinasa, glucosidasa, manosidasa, isomerasa, invertasa, trasferasa, ribonucleasa, galactosidasa, transglutaminasa y quitinasa. Las células deficientes en TPAP pueden también ser usadas para expresar proteínas heterólogas de interés farmacéutico tales como las hormonas, factores de crecimiento, receptores, y similares.

Será entendido que el término "proteínas eucarióticas" se destina a incluir no sólo las proteínas nativas, sino también aquellas proteínas (p. ej. enzimas) que han sido modificadas mediante sustituciones de aminoácidos, delecciones, adiciones, u otras modificaciones que pueden hacerse para aumentar la actividad, termoestabilidad, tolerancia al pH y similares.

En otro aspecto la invención se refiere a un producto proteico esencialmente libre de actividad TPAP que es producido con el método de la invención.

Ejemplo 1 Purificación y caracterización de la TPAP de A. niger Materiales y métodos

Sustrato Phe-Pro-Ala-pNA (disponible por Bachem, Suiza).

Inhibidores de la proteasa

Ala-Ala-Phe-clorometilcetona

Benciloxicarbonil-Ala-Pro-Phe-clorometilcetona

Benciloxicarbonil-Gly-Gly-Phe-clorometil-cetona.

Purificación de la TPAP

La TPAP fue purificada de una preparación comercial de AMG de A. niger (disponible por Novo Nordisk A/S, Dinamarca). Una muestra de 300 ml de producto de AMG formulado fue reiteradamente diluida y concentrada a 4°C en un concentrador Filtron® equipado con una membrana de corte de 3 kDa hasta que la conductividad fue inferior a 1,5 mS/cm. Todas las demás fases de purificación fueron realizadas a la temperatura ambiente.

Cromatografía de intercambio catiónico utilizando un gradiente de NaCl

El concentrado (600 ml) fue ajustado a pH 4.0 y filtrado antes de su aplicación a una columna de S-Sepharose de 200 ml (2,6 x 37 cm) equilibrada con 20 mM de acetato sódico, pH 4.0. Se utilizó un flujo de 10 ml/min. La TPAP fue eluida con un gradiente lineal de NaCl de 0 a 0,2 M en 10 volúmenes de columna. Se hizo una agrupación conteniendo la mayor parte de la actividad peptidasa. Se hizo una variación en el tampón a 20 mM de acetato sódico, pH 5.5 en una célula Amicon equipada con una membrana Diaflo con un corte de 10 kDa.

Cromatografía de intercambio aniónico

La agrupación de la columna de S-Sepharose fue purificada adicionalmente en una columna de HiLoad Q-Sepharose HP (50 ml, 2,6 x 10 cm) equilibrada con 20 mM de acetato sódico, pH 5.5. La elución de TPAP fue realizada con un gradiente lineal de NaCl de 0 a 0,5 M en 15 volúmenes de columna. La proteína fue aplicada con un flujo de 8,0 ml/min y eluida con 5,0 ml/min. Se hizo una agrupación conteniendo la mayor parte de TPAP. Se hizo una variación en el tampón a 20 mM de acetato sódico, pH 4.0 en una célula Amicon como se ha descrito anteriormente.

Cromatografía de intercambio catiónico utilizando un gradiente de pH

La agrupación de la columna HiLoad Q-Sepharose HP fue finalmente purificada en una columna Mono S (5/5) equilibrada con 20 mM de acetato sódico, pH 4.0. Un gradiente de pH 4.0 a pH 6.0 fue hecho en 30 volúmenes de columna usando 20 mM de acetato sódico, pH 4.0 y 20 mM de acetato sódico, pH 6.0. El flujo fue 1,0 ml/min. Dos isoenzimas de TPAP se eluyeron a pH 5.1 y 5.2, respectivamente.

Purificación de AMG

AMG G1 ha sido purificada de una preparación comercial de AMG (Novo Nordisk A/S) por cromatografía de intercambio aniónico usando Q-Sepharose. Una columna de 50 ml fue equilibrada con 20 mM de acetato sódico, pH 5.5 y la forma G1 se eluyó con un gradiente lineal de NaCl de 0 a 0,6 M de NaCl en 8 volúmenes de columna. El flujo fue de 8,0 ml/min.

AMG_{trunc} fue purificada después del tratamiento con TPAP de AMG G1 en una columna Mono Q equilibrada con 20 mM de acetato sódico, pH 4.3. Se usó un gradiente lineal de NaCl de 0 a 1,0 M en 30 volúmenes de columna para la elución. El flujo fue 1,0 ml/min.

Ensayo de desestabilización

Partes alícuotas de AMG G1 purificado fueron incubadas con mezclas diferentes de TPAP y tampón en 0,1 M acetato sódico, pH 4.3 durante varias semanas a 37°C. El volumen final fue bien 1 o 2 ml con una concentración de AMG G1 de 10 AGU/ml. 100 \mul de la mezcla de incubación fueron retiradas y diluidas a 2 AGU/ml con 0,1 M de acetato sódico, pH 4.3. Se efectuó un tratamiento de calor a 65°C durante 30 min en la muestra diluida. Tras el enfriamiento de las muestras a la temperatura ambiente, la actividad de las muestras tratadas y no tratadas con calor fue medida en placas de microtitulación usando el sustrato cromogénico p-nitrofenil-\alpha-D-glicopiranósido (pNPG) (Merck, Art. 6792). 50 \mul de pNPG 3 mM en 0,1 M de acetato sódico, pH 4.3 fueron incubados con 25 \mul de muestra durante 30 min a la temperatura ambiente. La reacción fue detenida por la adición de 75 \mul de tetraborato de sodio 0,1 M. La absorbencia a 405 nm fue medida en un lector de microplacas cinético Max UV. T_{30} fue calculado como el porcentaje de actividad retenido después del tratamiento con calor. Todas las mediciones fueron hechas por duplicado.

Ensayo de TPAP

El ensayo fue realizado bien en un lector de placas de microtitulación o en un espectrofotómetro usando una concentración de sustrato de 0,2 mM de Phe-Pro-Ala-pNA en 0,1 M de tampón de acetato de sodio, pH 4.3. Una solución stock de Phe-Pro-Ala-pNA de 5 mM fue hecha en DMSO y diluida antes del uso. La reacción fue seguida durante 4 min a 405 nm bien en un lector de microplacas cinético UV-Max o en un espectrofotómetro y el nivel inicial de seccionamiento fue calculado.

Inhibición de TPAP

Las partes alícuotas que contenían 4 \mug de TPAP fueron incubadas con varios inhibidores de proteasa: 1 mM de Ala-Ala-Phe-clorometilcetona, 1 mM benciloxicarbonil-Ala-Pro-Phe-clorometilcetona y 1 mM benciloxicarbonil-Gly-Gly-Phe-clorometil-cetona. Después de 30 min de incubación la actividad residual fue determinada.

Estabilidad de almacenamiento de caldos de fermentación filtrados

Los caldos de cultivo fueron centrifugados y se realizaron filtrados estériles a través de un filtro de 0,22 \muM. Los caldos fueron hechos al 0,1% con respecto al sorbato de potasio y benzoato de sodio y el pH fue ajustado a 4.3. Las partes alícuotas de 2 ml fueron añadidas a 200 \mul de Ala-Ala-Phe-clorometilcetona 10 mM o a 200 \mul de acetato sódico 0,1 M, pH 4.3. Las muestras fueron retiradas y diluidas hasta 2 AGU/ml antes de la determinación de T_{30} como se ha descrito anteriormente.

Determinación de la actividad AMG (AGU)

La actividad AMG fue determinada según está descrito por K.A. Holm, 1980, Anal. Chem. Acta., 117, págs 359-362. En resumen, el método se basa en la hidrólisis de maltosa por AMG bajo la formación de alfa-D-glucosa. Después de un procedimiento dializante breve y continuo, la concentración de glucosa es determinada por una reacción de glucosa deshidrogenasa (GlucDH) (realizada a pH 7.6). Las condiciones estándares para el método AutoAnalyzer automatizado son:

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Sustrato: maltosa 28 mM

Tampón de incubación: acetato 0,1 M, pH 4.3

Temperatura de incubación: 37°C

Período de incubación: 5 min.

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El área de trabajo enzimático del método es 0,5-4 AGU/ml.

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Resultados

La TPAP fue purificada hasta la homogeneidad de una preparación comercial AMG (Novo Nordisk A/S) según el esquema de purificación mostrado en la Tabla 1. El perfil de elución de la columna de intercambio catiónico final reveló la presencia de dos isoenzimas de TPAP (TPAP-I y II TPAP) con pl 5.1 y 5.2, respectivamente. Ambas isoformas fueron puras según fue juzgado por SDS-PAGE y por secuenciación N-terminal, pero las actividades específicas de las enzimas fueron diferentes (véase Tabla 1). TPAP-II tuvo una actividad específica un 20% más alta que TPAP-I.

Una desamidación de uno o varios residuos de Asn o Gln bien en el caldo de fermentación o durante la purificación puede explicar la pequeña diferencia en pl entre las dos isoformas de TPAP.

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TABLA 1 Purificación de TPAP de una preparación comercial de AMG

1

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pH óptimo

El pH óptimo de TPAP fue determinado usando el mismo procedimiento que en el ensayo de TPAP anteriormente descrito. 0,1 M de tampón acetato fue usado para regular el pH. La curva de pH óptima resultante está mostrada en la Fig. 1. Se puede observar que la TPAP funciona óptimamente a un pH en la gama de 5.0-5.5, en particular 5.25.

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Determinación de la temperatura óptima para TPAP

La relación de temperatura/actividad de TPAP fue determinada en 0,1 M de tampón acetato sódico, pH 5.5 usando el ensayo de TPAP anteriormente descrito. Como se puede observar a partir de la tabla, la TPAP tiene una actividad máxima en la gama de temperatura de 45-55 °C.

TABLA 2

2

Espectrometría de masas

La espectrometría de masas de tiempo de vuelo con ionización/desorción láser asistida por matriz de TPAP purificada de A. niger dio una señal ancha que indicó que la TPAP estaba glicosilada. La masa promedio resultó ser 54,5 kDa.

Ejemplo 2 Purificación y caracterización de la TPAP de A. oryzae Materiales & métodos

Como una materia prima para la purificación, se usó el sobrenadante de una fermentación de A. oryzae IFO 4177 fermentada a pH 5 en un medio conteniendo soja. Después de la fermentación, el caldo de cultivo fue centrifugado para eliminar la mayoría de células.

Purificación

Aprox. 4 L de sobrenadante fue germen filtrado en una placa Seitz EKS. El filtrado EKS fue ultrafiltrado en un casete Filtron con un corte de 3k (Minisette) hasta un volumen mínimo. Ultrafiltrado = 240 ml. 170 ml del ultrafiltrado fue precipitado con sulfato de amonio sólido (AMS) para dar una saturación de AMS aprox. del 90%. Después de la agitación durante al menos 30 min., el AMS precipitado fue recuperado por centrifugado en un centrifugador Sorvall RC3B (4500 rpm, 15 min., a temperatura ambiente). 100 ml de agua desionizada fueron añadidos al AMS precipitado para disolver la proteína y el 1% (p/v) FGV120 de carbón activado fue añadido para eliminar el color. Después de la agitación durante aprox. 1 hora la suspensión fue filtrada en una placa Seitz EK1 para eliminar el carbón (y el color). El filtrado de EK1 fue dializado contra 1) 100 mM de H_{3}BO_{3}, 10 mM de ácido dimetil glutárico, 2 mM de CaCl_{2}, pH 5 y 2) agua desionizada. Después de una filtración de EK1 el dialisato (260 ml) fue congelado en partes alícuotas.

Una alícuota de 120 ml del dialisato fue descongelada y aplicada a una columna G25 Sephadex de 1,4 L equilibrada en 20 mM de CH_{3}COOH/NaOH, pH 5.0. Para eliminar el color y las proteínas muy acídicas, el filtrado G25 fue aplicado a una columna de Q-Sepharose FF de 40 ml equilibrada en el mismo tampón (CH_{3}COOH/NaOH, pH 5.0). Después del lavado de la columna, la proteína unida fue eluida con un gradiente lineal de NaCl (0\rightarrow 200 mM). Las fracciones de la columna fueron analizadas por su actividad TPAP. La mayor parte de la actividad TPAP fue vista en el producto filtrado (70%), mientras que la mayor parte de la proteína se unió a la columna.

El producto filtrado de la columna de Q-Sepharose fue aplicado a una columna de S-sepharose HP de 50 ml equilibrada en 20 mM de CH_{3}COOH/NaOH, pH 5.0. Después del lavado de la columna, la proteína unida fue eluida con un gradiente lineal de NaCl (0\rightarrow200 mM). Las fracciones de la columna fueron analizadas en cuanto a su actividad TPAP. La mayor parte de la actividad TPAP fue otra vez vista en el producto filtrado (75%). El resto de la actividad TPAP estaba al principio del gradiente de NaCl. El producto filtrado + las fracciones 1-11 fueron agrupados y dializados contra 50 mM de H_{3}BO_{3}, 5 mM de ácido dimetil glutárico, 1 mM de CaCl_{2}, pH 6.0.

Después de ajustar el pH de la agrupación dializada a pH 7.0 la enzima fue aplicada a una columna SOURCE Q de 23 ml equilibrada en 50 mM de H_{3}BO_{3}, 5 mM de ácido dimetil glutárico, 1 mM de CaCl_{2}, pH 7.0. Después del lavado de la columna, la proteína unida fue eluida con un gradiente lineal de NaCl (0\rightarrow500 mM). Las fracciones de la columna fueron analizadas por su atividad TPAP. Toda la actividad TPAP fue vista en el producto filtrado (95%). La razón de ello se debe a que la columna ha sido sobrecargada con proteína. El producto filtrado fue dializado contra 20 mM de CH_{3}COOH/NaOH, pH 4.0.

La enzima dializada fue aplicada a una columna de S-sepharose HP de 50 mlequilibrada en 20 mM de CH_{3}COOH/
NaOH, pH 4.0. Después del lavado de la columna, la proteína unida fue eluida con un gradiente de NaCl (0\rightarrow200 mM). Las fracciones de la columna fueron analizadas en cuanto a su actividad TPAP. La actividad TPAP se eluyó con 100 mM de NaCl. La actividad TPAP fue agrupada y dializada contra 20 mM de CH_{3}COOH/NaOH, pH 4.0. Para obtener una mejor resolución del resultado que pudiera dar la columna de S-sepharose, la agrupación dializada fue aplicada a una columna de SOURCE S de 8 ml equilibrada en el mismo tampón (20 mM de CH_{3}COOH/NaOH, pH 4.0). Después del lavado de la columna, la proteína unida fue eluida con un gradiente de NaCl (0\rightarrow200 mM). Las fracciones de la columna fueron analizadas por su actividad TPAP. La actividad TPAP se eluyó con 60 mM de NaCl. La actividad TPAP fue agrupada y dializada contra 20 mM de CH_{3}COOH/NaOH, pH 5.5.

La enzima dializada fue aplicada a una columna de SOURCE Q de 23 ml equilibrada en 20 mM de CH_{3}OOOH/
NaOH, pH 5.5. Después del lavado de la columna, la proteína unida fue eluida con un gradiente de NaCl (0\rightarrow200 mM). La actividad TPAP se eluyó con 30 mM de NaCl. Las fracciones de la columna fueron analizadas por SDS-PAGE y por su actividad TPAP. El gel de SDS-PAGE mostró que las fracciones que contenían actividad TPAP contenían dos bandas mayores: una banda de 65 kDa (TPAP) y una banda de 30 kDa. La banda de TPAP fue difusa mientras que la banda de 30 kDa fue estrecha, indicando que la TPAP estaba glicosilada mientras que la banda de 30 kDa no lo estaba.

Las fracciones conteniendo TPAP fueron concentradas hasta 1 ml por ultrafiltración y aplicadas a una columna de Sephacryl S-100 de 150 ml equilibrada en 20 mM de Tris-acetato, 100 mM de NaCl, pH 5.5. Con un nivel de flujo de 1,0 ml/min, las dos bandas fueron separadas. Las fracciones conteniendo actividad TPAP fueron agrupadas como TPAP de A. oryzae.

Espectrometría de masas

La espectrometría de masas por tiempo de vuelo con ionización/desorción láser asistida por matriz de TPAP purificada de A. oryzae dio una señal ancha que indicó que la TPAP estaba glicosilada. La masa promedio resultó ser de 55,0 kDa.

Perfil de pH de la TPAP de A. oryzae

La dependencia del pH de la actividad TPAP de A. oryzae fue investigada usando el sustrato cromogénico Phe-Pro-Ala-pNA. A 50 \mul de enzima se le añadieron 150 \mul de tampón Britton-Robinson en el pH indicado antes de la incubación con 50 \mul de Phe-Pro-Ala-pNA a una concentración de sustrato final de 0,2 mM. Los ensayos fueron realizados en un lector de placas de microtitulación cinético UV-Max y la reacción siguió durante 3,5 min a 405 nm. La actividad relativa (RA) está provista en la tabla 3 a continuación.

TABLA 3

3

Ejemplo 3 Secuencias peptídicas de la TPAP de A. niger

La secuenciación de aminoácidos N-terminales de las formas I y II intactas de TPAP de A. niger (Ejemplo 1) así como los péptidos derivados de la forma I de TPAP fue realizada en un secuenciador de Applied Biosystems 473A accionado según las instrucciones del fabricante.

Las secuencias de aminoácidos N-terminales de las formas I y II intactas de TPAP fueron determinadas para 30 residuos. Las dos secuencias fueron idénticas y se encontró que eran:

100

La secuencia no presentó ninguna homología a otras proteínas.

Después de la desnaturalización, reducción y S-carboximetilación, los péptidos fueron derivados de la forma I de TPAP por seccionamiento proteolítico usando la proteasa específica de lisilo de Achromobacter. Los péptidos resultantes fueron fraccionados y repurificados usando HPLC de fase inversa. La pureza y la masa de los péptidos fue evaluada usando la espectrometría de masas por tiempo de vuelo con ionización/desorción por láser asistida por matriz usando un VG TofSpec analítico accionado según las recomendaciones del fabricante. Los 7 péptidos siguientes fueron secuenciados.

Péptido 1

101

Asn3 está glicosilado según ha sido mostrado por la espectrometría de masas y la secuenciación de aminoácidos. El péptido 1 es idéntico para los residuos de aminoácidos 1-17 de la TPAP intacta y por lo tanto de la secuencia mostrada en la SEC ID NO. 4.

Péptido 2

102

El péptido 2 es idéntico a los residuos de aminoácidos 18-30 de la TPAP intacta (y por lo tanto de la secuencia de aminoácidos mostrada en la SEC ID NO. 4). El péptido 2 está recuperado en dos formas según ha sido mostrado por la espectrometría de masas y la secuenciación de aminoácidos. Una forma con un residuo de Gln N-terminal y una forma con este residuo de Gln convertido en un residuo de piroglutamato.

Péptido 3

103

Péptido 4

104

Asn6 está glicosilado según ha sido mostrado por la espectrometría de masas y la secuenciación de aminoácidos.

Péptido 5

105

No fue posible diferenciar si Asx15 era un residuo de Asp o Asn.

Péptido 6

106

No fue posible diferenciar si Asx3 era un residuo de Asp o Asn. Xaa1 no fue identificado.

Péptido 7

107

No fue posible diferenciar si Asx4 fue un residuo de Asp o de Asn. Obsérvese que Asn25 no está glicosilado aunque se ha encontrado en la secuencia de consenso para la N-glicosilación.

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Secuencias peptídicas de la TPAP de A. oryzae

La TPAP intacta de secuenciación de aminoácidos N-terminales así como los péptidos derivados de la TPAP se efectuó en un secuenciador de proteínas de Applied Biosystems 473A según las instrucciones del fabricante.

La secuencia de aminoácidos N-terminal de la TPAP intacta fue determinada por SDS-PAGE y por electrotransferencia sobre una membrana de PVDF usando procedimientos estándares. La siguiente secuencia de 23 residuos de aminoácidos fue encontrada:

108

Esta secuencia es claramente homóloga a la secuencia de aminoácidos N-terminal de TPAP de A. niger. En base a esta homología, Xaa es más posiblemente un residuo de Asn glicosilado mientras que Yaa probablemente representa residuos de Cys.

Después de la desnaturalización, reducción y S-carboximetilación, los péptidos fueron derivados de TPAP por seccionamiento proteolítico usando la proteasa específica de lisilo de Achromobacter. Los péptidos resultantes fueron fraccionados y repurificados usando HPLC de fase inversa. La pureza y masa de los péptidos fueron evaluadas mediante la espectrometría de masas por tiempo de vuelo con ionización/desorción láser asistida por matriz usando un VG TofSpec analítico accionado según las recomendaciones del fabricante.

Los 4 péptidos siguientes fueron secuenciados.

Péptido 8

109

Este péptido se superpone con los 6 últimos residuos de aminoácidos determinados por la secuenciación N-terminal de la TPAP intacta de ese modo extendiendo la secuencia N-terminal a 34 residuos.

Péptido 9

110

Este péptido es homólogo al péptido 3 de la TPAP de A. Niger.

Péptido 10

111

Péptido 11

112

Xaa designa un residuo desconocido.

Ejemplo 4

Las composiciones de aminoácidos de las formas I y II de la TPAP de A. niger fueron determinadas. Duplicados de alícuotas liofilizadas de las formas I y II de TPAP fueron hidrolizadas en 6 N de HCl conteniendo 0,1% de fenol a 110°C al vacío durante 16 h. El triptófano fue determinado según la hidrólisis en 3M de ácido metanosulfónico. Después de la hidrólisis, las composiciones de aminoácidos fueron determinadas usando un sistema de análisis de aminoácidos de Applied Biosystems 420A accionado según las instrucciones del fabricante. Los resultados muestran que dentro del error experimental, las formas I y II de la TPAP tienen composiciones de aminoácidos idénticas como se muestra en Tabla 4 a continuación.

TABLA 4

4

Ejemplo 5

Las composiciones de monosacáridos de las formas I y II de la TPAP de A. niger fueron determinadas. Los duplicados de alícuotas liofilizadas de las formas I y II de TPAP fueron hidrolizadas en 2 M de TFA a 100°C al vacío durante 1 h, 2 h y 4 h. Después de la hidrólisis, las composiciones de monosacáridos fueron analizadas por cromatografía de intercambio iónico de alto rendimiento usando una columna CarboPac^{TM} PA1 eluida con 16 mM de NaOH. Los monosacáridos fueron detectados por detección amperométrica pulsada. Debido a la diferente estabilidad y liberación de los monosacáridos en 2 M de TFA, la cantidad de galactosa fue determinada después de 1 h de hidrólisis, la cantidad de manosa después de 2 h de hidrólisis y la cantidad de glucosamina después de 4 h de hidrólisis. Los resultados obtenidos indican diferencias muy inferiores en contenido de manosa de TPAP de forma I y II como se muestra en la tabla a continuación.

TABLA 5

6

Ejemplo 6 Seccionamiento por la TPAP de A. niger

La capacidad de la TPAP de A. niger para desestabilizar la forma AMG G1 fue investigada usando AMG purificada y TPAP (obtenida según se describe en la sección materiales y métodos en el Ejemplo 1) con proporciones de TPAP/AMG iguales que aquellas en los productos formulados. La secuenciación de aminoácidos de las preparaciones desestabilizadas revelaron una modificación en el N-terminal del dominio catalítico de AMG. Un tripéptido comprendiendo los tres primeros residuos de aminoácidos (Ala-Thr-Leu) ha sido seccionado por la peptidasa indicando que la enzima es una tripeptidil aminopeptidasa. La clasificación como una tripeptidilaminopeptidasa, en base al seccionamiento de AMG así como del sustrato cromogénico Phe-Pro-Ala-pNA, fue adicionalmente soportada por la falta de actividad hacia otro sustrato cromogénico Succinil-Ala-Ala-Ala-pNA. En este sustrato, el grupo amino libre en el N-término ha sido succinilada y de ese modo ha provocado que el sustrato sea inaccesible para el seccionamiento por TPAP. El seccionamiento de TPAP de los lotes de AMG no se completó después de 3 semanas de almacenamiento, ya que una mezcla de AMG intacta y truncada (AMG_{trunc}) fue detectada por la secuenciación de los aminoácidos.

La desestabilización de AMG G1 obtenida con varias dosificaciones de TPAP a temperaturas diferentes ha sido investigada. Una dosificación de TPAP en la gama de 3 a 10 \mug/ml dio una desestabilización significante de AMG y también proporciones de TPAP/AMG similares a aquellas medidas en diferentes fermentaciones. El efecto de la desestabilización fue más pronunciado a 37°C, pero también se observó a 25°C un efecto claro en la termoestabilidad después de 27 días de almacenamiento. El almacenamiento a 4°C no afectó a la termoestabilidad de la AMG.

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Ejemplo 7

La especificidad de la TPAP de A. niger fue investigada usando varias proteínas nativas y sustratos peptídicos. Usando estos sustratos se descubrió que la TPAP es altamente no específica con respecto al residuo de aminoácido N-terminal en el punto de seccionamiento. La TPAP es capaz de seccionamiento incluso después de los residuos Pro y los residuos CM-Cys. No obstante, un residuo Pro C-terminal con respecto al punto de seccionamiento inhibe completamente el seccionamiento por la TPAP. Los productos de seccionamiento específico obtenidos a partir del sometimiento de las proteínas nativas al tratamiento de TPAP incluyen las secuencias de tripéptidos IPE, YVD, WRQ, KGA, LPS, ANL, NGT, LMQ, YFE, GPG, GGG, ADG, RST, SVE, KKP, EGV, NTG, AGD, RHN, LKT, VEK, KPE, GVN, TGA, GDR, HNL, HSQ, GTF, TSD, YSK, YLD, SRR, AQD, FVQ, WLM y ATL.

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Ejemplo 8 Inhibición de la actividad TPAP de A. niger

La inhibición de TPAP por el inhibidor de proteasa, la clorometilcetona Ala-Ala-Phe-CMK (AAF-CMK), fue evaluada según las condiciones anteriormente descritas. Se encontró que AAF-CMK inhibió la TPAP completamente.

La adición de AAF-CMK a caldos de fermentación puede inhibir totalmente la actividad TPAP. La termoestabilidad de 5 lotes de AMG diferentes fue investigada con y sin la actividad TPAP presente. La termoestabilidad de los 5 lotes de AMG fue invariada después de 2 semanas de almacenamiento a 37°C cuando la TPAP había sido inhibida. Las muestras correspondientes sin inhibidor fueron todas claramente desestabilizadas.

Ejemplo 9

Partes de 10 ml de caldos de cultivo obtenidas de un cultivo de una cepa de A. niger productora de AMG fueron ajustadas a pH 6.5 o pH 7.0 con hidróxido sódico. Las muestras fueron incubadas a 25°C, 40°C y 50°C, respectivamente, durante una hora y posteriormente las muestras fueron ajustadas a pH 4.3 con ácido acético. La estabilidad de almacenamiento de las muestras tratadas fue medida. Se mostró que este proceso de recuperación simple (basado en un tratamiento de pH a temperaturas elevadas) resultó en una eliminación eficaz de la actividad TPAP (Tabla 6). El tratamiento del caldo de cultivo a pH 6.5/40°C durante una hora redujo la actividad TPAP al 5% y dio un producto muy estable con una termoestabilidad invariada después de dos semanas de almacenamiento a 40°C.

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TABLA 6

7

Todos los números en la tabla son %. Los valores indicados para TPAP y AMG, respectivamente, son la actividad relativa en el tiempo indicado.

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Ejemplo 10 Clonación por PCR

A partir de la secuencia de aminoácidos N-terminal de la TPAP de A. niger, cuya secuencia está mostrada en la SEC ID NO. 3, cuatro cebadores de la PCR fueron diseñados (Tabla 7). ADN genómico de una cepa de A. niger fue usado como molde en cuatro reacciones de la PCR. Fragmentos de la PCR en el tamaño previsto de 65 pares de bases fueron purificados y clonados en el plásmido pCR^{TM} II (Invitrogen Corporation). La secuenciación del inserto para tres clones mostró que dos de ellos contenían la secuencia degenerada en las áreas correspondientes a los cebadores, mientras que la secuencia intermedia fue invariable con respecto a la secuencia de aminoácidos N-terminal.

Para clonar un fragmento de ADN más grande que codifica la tripeptidil aminopeptidasa, se hizo el cebador #6010 (GCACTGTCGAAGCAGCTGTACAACATCGGTG) correspondiente a la secuencia invariable. A partir de otras dos secuencias peptídicas tres cebadores de la PCR fueron diseñados (Tabla 7). Tres reacciones de la PCR (#6010/#5988, #6010/#5989, y #6010/#5990 fueron realizadas usando ADN genómico de A. niger como molde. Las reacciones fueron hechas a dos temperaturas de recocimiento, 42°C y 45°C. Las reacciones #6010/#5989 (un fragmento de aprox. 80 pares de bases) y #6010/#5990 (tres fragmentos de aprox. 120 pares de bases, 500 pares de bases, y 950 pares de bases) muestran el mismo modelo de banda en un gel de agarosa con las dos temperaturas diferentes. En la reacción #6010/#5988 un fragmento de aprox 120 pares de bases fue visto a 42°C, pero a 45°C se vio un fragmento de aprox. 950 pares de bases. El fragmento de 950 pares de bases resultó ser el derecho y fue insertado en el vector AT PCR II. Una cepa de E. coli que albergaba el fragmento de 950 kb fue depositado en el Deutsche Sammlung von Microorganismen und Zellkulturen GmbH, Mascheroder Weg 1b, D-38124 Braunschweig, Alemania el 5 de diciembre de 1994, como DSM 9570, bajo las normas del tratado de Budapest.

TABLA 7 Cebadores de oligonucleótidos

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9

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El fragmento de 950 pares de bases fue secuenciado a partir de ambas extremidades. Se descubrió que este fragmento codificaba la parte N-terminal de TPAP. La secuencia parcial de la parte N-terminal está mostrada en la SEC ID NO. 2, la secuencia parcial obtenida de la secuenciación del otro extremo está mostrada en la SEC ID NO. 3. La secuencia del "fragmento de 950 bases" entero que resultó estar constituido por 908 pares de bases, está mostrado en la SEC ID NO. 1.

Análisis de Southern

ADN genómico de una cepa IFO 4177 de A. niger y de A. oryzae fue aislada como se ha descrito previamente (Yelton et al., 1984, Proc. Natl. Acad. Sci. EEUU. 81: 1470-1474). El ADN genómico fue digerido con enzimas de restricción apropiadas, fraccionado en un gel de agarosa al 0,7%, y transferido a Immobilon^{TM}-N como se describe por el fabricante. Las membranas fueron evaluadas por la presencia de la secuencia de genes de la TPAP de 950 pares de bases marcada con alfa-^{32}P dATP (NewEngland) cebada de forma aleatoria según el método descrito por Feinberg et al., 1983, Anal. Biochem. 132:6. Las membranas fueron luego incubadas durante 2 horas a 65°C en solución de hibridación (5xSSC (0,15 M de NaCl, 0,015 M de citrato de trisodio), 10xDenhardt (0,2% de Ficoll, 0,2% de polivinilpirrolidona, 0,2% de albúmina de suero bovino), 10 mM de EDTA, 1% de SDS, 150 \mug/ml de Poli A, 50 \mug/ml de ARN de levadura). Después, la sonda marcada radioactivamente fue añadida y se incubó a 65°C durante toda la noche con agitación suave. Las membranas fueron lavadas dos veces a 30°C durante 15 minutos en 2XSSC, 1% de SDS. Finalmente, las membranas fueron secadas, cubiertas con un recubrimiento de plástico, y expuestas a una película radiográfica (Fuli-RX) a -70°C.

Los resultados muestran que ambas cepas contienen sólo un gen que codifica la TPAP.

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Referencias citadas en la descripción Esta lista de referencias citada por el solicitante ha sido recopilada exclusivamente para la información del lector. No forma parte del documento de patente europea. La misma ha sido confeccionada con la mayor diligencia; la OEP sin embargo no asume responsabilidad alguna por eventuales errores u omisiones. Bibliografía distinta de patentes citada en la descripción

\bulletDOEBBER et al Endocrinology, 1978, vol. 103, 1794-1804 [0003]

\bullet Mammalian Proteases. Exopeptidases. 1986, vol. 2 [0003]

\bulletKRIEGER et al. Febs Letters, 1994, vol. 352 (3), 385-388 [0004]

\bulletBUTLER et al. Applied and Environmental Microbiology, August 1995, 3145-3150 [0004]

\bulletLAEMMLI, U.K. Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of bacteriophage T4. Nature, 1970, vol. 227, 680-685 [0016]

\bullet N. AXELSEN et al. A Manual of Quantitative Immunoelectrophoresis. Blackwell Scientific Publications, 1973 [0018]

\bullet A. JOHNSTONE; R. THORPE. Immunochemistry in Practice. Blackwell Scientific Publications, 1982, 27-31 [0018]

\bullet O. OUCHTERLONY. Handbook of Experimental Immunology. Scientific Publications, 1967, 665-706 [0018]

\bulletSAMBROOK et al. Molecular Cloning: A Laboratory Manual. 1989 [0035]

\bullet PCR Protocols. 1993 [0036]

\bullet The polymerase chain reaction. 1994 [0036]

\bulletMARANG, SA. Tetrahedron, 1983, vol. 39, 3 [0038]

\bulletITAKURA et al Annu. Rev. Biochem, 1984, vol. 53, 323 [0038]

\bullet K.A. HOLM. Anal. Chem. Acta., 1980, vol. 117, 359-362 [0002]

\bulletYELTON et al. Proc. Natl. Acad. Sci. USA., 1984, vol. 81, 1470-1474 [0131]

\bulletFEINBERG et al. Anal. Biochem., 1983, vol. 132, 6 [0131]

SEC ID NO. 1

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908 bases.

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10

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SEC ID NO. 2

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11

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SEC ID NO. 3

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12

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SEC ID NO. 4

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13

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SEC ID NO. 5

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14

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SEC ID NO. 6

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SEC ID NO. 7

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SEC ID NO. 8

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SEC ID NO. 9

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SEC ID NO. 10

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SEC ID NO. 11

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SEC ID NO. 12

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SEC ID NO. 13

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SEC ID NO. 14

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SEC ID NO. 15

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Claims (13)

1. Método para la reducción o eliminación de la producción de la tripeptidil aminopeptidasa (TPAP) a partir de una célula productora de TPAP del género Aspergillus, en el cual la secuencia de ADN que codifica la TPAP o una parte de la misma esencial para presentar actividad TPAP o la secuencia del promotor de TPAP requerida para la expresión de TPAP a partir de una secuencia de ADN que codifica la TPAP presente en dicha célula son modificadas o inactivadas para dar como resultado una producción reducida o ninguna producción de TPAP a partir de dicha célula.

2. Método según la reivindicación 1, donde la modificación o inactivación de la secuencia de ADN es obtenida sometiendo a la célula productora de TPAP a mutagénesis y seleccionando las células para las cuales la capacidad de producción de TPAP ha sido reducida o eliminada.

3. Método según la reivindicación 2, donde la mutagénesis se hace por mutagénesis aleatoria o dirigida.

4. Método para la reducción o eliminación de la producción de TPAP a partir de una célula productora de TPAP del género Aspergillus, en el cual una secuencia de nucleótidos complementaria a la secuencia de que codifica la TPAP y por lo tanto capaz de hibridar al ARNm de la TPAP producido en la célula es introducida en la célula de manera que la secuencia de nucleótidos puede ser transcrita en la célula bajo unas condiciones que permiten que la secuencia de nucleótidos se hibride al ARNm de la TPAP y de esta manera se reduce la cantidad de TPAP traducida a partir de dicho ARNm o se elimine tal traducción.

5. Célula huésped preparada según las reivindicaciones 1-4.

6. Método para la preparación de un producto donde al menos un 60% de la actividad TPAP es eliminada, dicho método comprende la transformación de una célula huésped según la reivindicación 5 con una secuencia de ADN que codifica el producto, el cultivo de la célula transformada bajo condiciones adecuadas para la expresión del producto, y la recuperación del producto del cultivo.

7. Método para la preparación de un producto donde al menos un 60% de la actividad TPAP es eliminada, dicho producto es codificado por una secuencia de ADN presente en una célula de expresión de TPAP, dicho método comprendiendo la modificación o la inactivación de una secuencia de ADN presente en dicha célula y la codificación de la TPAP o de una parte de la misma esencial para exhibir actividad TPAP o el promotor de TPAP requerido para la expresión de TPAP a partir de una secuencia de ADN que codifica la TPAP según el método de cualquiera de las reivindicaciones 1-4 y posteriormente el cultivo de la célula bajo unas condiciones adecuadas para la expresión del producto, y la recuperación del producto del cultivo.

8. Método de preparación de un producto donde al menos un 60% de la actividad TPAP es eliminada por fermentación de una célula productora de TPAP del género Aspergillus que también produce el producto, este método comprendiendo la adición de una cantidad eficaz de Ala-Ala-Phe-clorometilcetona al caldo de fermentación bien durante o después de que la fermentación haya sido completada, la recuperación del producto de interés del caldo de fermentación, y opcionalmente el sometimiento del producto recuperado a una purificación adicional.

9. Método para la preparación de un producto donde al menos un 60% de la actividad TPAP es eliminada por fermentación de una célula productora de la TPAP del género Aspergillus que también produce el producto, este método comprendiendo el sometimiento del caldo de fermentación o de una preparación enzimática aislada del mismo conteniendo TPAP y del producto de interés a un tratamiento combinado de pH y de temperatura durante un periodo temporal suficiente para reducir la actividad TPAP, y opcionalmente la recuperación del producto del caldo tratado.

10. El método según la reivindicación 9, donde el tratamiento de reducción de la TPAP es realizado a un pH en la gama de 6.5-7 y a una temperatura en la gama de 25-40°C.

11. Método según cualquiera de las reivindicaciones 6-10, donde el producto es una enzima.

12. Método según la reivindicación 11, donde el producto es seleccionado de una enzima amilolítica, una enzima lipolítica, una enzima proteolítica, una enzima celulítica, una oxidorreductasa, y una enzima degradadora de la pared celular vegetal.

13. Método según la reivindicación 12, donde el producto es AMG, lipasa, cutinasa, celulasa, amilasa, proteasa, peroxidasa, transglutaminasa, lacasa, catalasa, glucosa-oxidasa, o fitasa.