ES2281079T3 - Celula huesped que expresa niveles reducidos de metaloproteasa y metodos de utilizacion de la celula huesped para la produccion de proteinas. - Google Patents

Celula huesped que expresa niveles reducidos de metaloproteasa y metodos de utilizacion de la celula huesped para la produccion de proteinas. Download PDF

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Abstract

LA PRESENTE INVENCION TRATA DE NUEVAS CELULAS HUESPED Y DE PROCEDIMIENTOS PARA PRODUCIR PROTEINAS. DE FORMA MAS ESPECIFICA LA INVENCION TRATA DE UNA CELULA HUESPED QUE RESULTA UTIL PARA LA EXPRESION DE PROTEINAS HETEROLOGAS, ESTANDO DICHA CELULA HUESPED MODIFICADA GENETICAMENTE CON EL FIN DE QUE EXPRESE UNOS NIVELES SIGNIFICATIVAMENTE REDUCIDOS DE UNA METALOPROTEASA. ADEMAS LA INVENCION TRATA DE UN PROCEDIMIENTO PARA PRODUCIR UNA PROTEINA HETEROLOGA, INCLUYENDO DICHO PROCEDIMIENTO CULTIVAR LA CELULA HUESPED EN UN MEDIO DE CRECIMIENTO ADECUADO, SEGUIDO DE LA RECUPERACION DE LA PROTEINA DESEADA.

Description

Célula huésped que expresa niveles reducidos de metaloproteasa y métodos de utilización de la célula huésped para la producción de proteínas.
Campo técnico
La presente invención se refiere a células huéspedes nuevas y a métodos para la producción de proteínas. Más específicamente la invención se refiere a una célula huésped de Aspergillus útil para la expresión de proteínas heterólogas. Además la invención se refiere a un método para producir una proteína heteróloga, este método comprende el cultivo de la célula huésped en un medio de crecimiento adecuado, seguido de la recuperación de la proteína deseada.
Estado de la técnica
El uso de células huéspedes recombinantes en la expresión de proteínas heterólogas ha simplificado en los últimos años inmensamente la producción de cantidades grandes de proteínas comercialmente valiosas, que por otra parte son obtenibles sólo por la purificación de sus fuentes nativas. Habitualmente, hay una selección variada de sistemas de expresión a partir de los cuales hacer la elección para la producción de cualquier proteína dada, incluso de huéspedes eubacterianos y eucarióticos. La selección de un sistema de expresión apropiado frecuentemente no sólo depende de la capacidad de la célula huésped para producir rendimientos adecuados de la proteína en un estado activo, sino que también en gran parte puede ser determinada por el uso final pretendido de la proteína.
Un problema frecuentemente encontrado es el nivel alto de enzimas proteolíticas producido por una célula huésped dada o en el medio de cultivo. Se ha sugerido que se podría proporcionar un organismo huésped privado de la capacidad de producir compuestos proteolíticos específicos. Por ejemplo, la solicitud de patente internacional WO 90/00192 describe huéspedes filamentosos fúngicos incapaces de excretar una proteinasa aspártica enzimáticamente activa. Aspergillus awamori carente de una proteína aspártica y fue usado para expresar quimosina bovina dando como resultado una expresión aumentada por un factor dos en comparación con la cepa y EP 574 347 describe huéspedes de Aspergillus carentes de una serina proteasa del tipo subtilisina.
Las metaloproteasas han sido aisladas de varias fuentes eucarióticas. Las metaloproteasas neutras, es decir metaloproteasas que tienen actividad óptima a pH neutro, aisladas de cepas de Aspergillus también han sido proporcionadas. Las metaloproteasas neutras han sido clasificadas en dos grupos. Npl y NplI [Sekine; Agric. Biol. Chem. 1972 36 207-216]. Recientemente la secuencia de nucleótidos de ADNc de una metaloproteasa neutra II de Aspergillus oryzae ha sido descrita [Tatsumi H, Murakami S, Tsuji R F, Ishida Y, Murakami K, Masaki A, Kawabe H, Arimura H, Nakano E y Motel H; Mol. Gen. Genet. 1991 228 97-103]- la secuencia de nucleótidos de ADNc de una metaloproteasa neutra I de Aspergillus oryzae nunca había sido descrita.
Aunque las metaloproteasas habían sido descritas, su papel en relación con la reducción de la estabilidad de los productos obtenidos a partir de estos organismos nunca había sido descrito.
Resumen de la invención
Según la presente invención se ha encontrado ahora que las metaloproteasas neutras de Aspergillus pueden reducir significativamente la estabilidad del producto obtenido por una célula.
En consecuencia, la presente invención proporciona una célula huésped de Aspergillus útil para la expresión de un producto proteico heterólogo, esta célula ha sido genéticamente modificada para expresar significativamente niveles reducidos de una metaloproteasa, NplI, con actividad óptima proteolítica en la gama de pH 6-8, en comparación con la célula parental.
En otro aspecto, la invención proporciona un método para producir un producto proteico heterólogo en una célula huésped de la invención, este método comprende la introducción en la célula huésped de una secuencia de ácidos nucleicos que codifican la proteína, el cultivo de la célula huésped en un medio de crecimiento adecuado, y el aislamiento del producto proteico heterólogo.
Con el método de la invención, la acción proteolítica que surge de NplI metaloproteasa NplI ha sido significativamente reducida, mejorando de ese modo la estabilidad de la proteína obtenida por el método. Además, la proteína obtenida por el método de la invención puede ser obtenido como una proteína precursora, es decir un zimógeno, una proteína híbrida, una proteína obtenida como una secuencia pro o secuencia prepro, o en forma no madurada.
Breve descripción de los dibujos
La presente invención está ilustrada con más detalle en referencia a los dibujos anexos, donde:
Fig. 1 muestra un mapa del plásmido PSO2, cf. ejemplo 1;
Fig. 2 muestra la construcción de la cepa HowB101 de Aspergillus oryzae, cf. ejemplo 1;
Fig. 3 muestra la construcción del plásmido PJaL218, cf. ejemplo 4; y
Fig. 4 muestra un mapa del plásmido PToC56, cf. ejemplo 3.
Descripción detallada de la invención Células huéspedes
La presente invención proporciona una célula huésped de Aspergillus útil para la expresión de proteínas heterólogas, esta célula, cuando se compara con la célula parental, ha sido genéticamente modificada para expresar niveles significativamente reducidos de una metaloproteasa neutra de Aspergillus, NplI, que tiene actividad óptima proteolítica en la gama de pH 6-8.
La célula parental es la fuente de dicha célula huésped. Puede ser una célula tipo salvaje. De forma alternativa, además de una reducción a nivel de la metaloproteasa neutra, puede ser genéticamente alterada en otro aspecto.
Para producir la proteína deseada, la célula huésped de la invención obviamente debe soportar regiones genéticas estructurales (es decir regiones que comprenden las secuencias de nucleótidos codificantes) y reguladoras (es decir regiones que comprenden secuencias de nucleótidos necesarias para p. ej. la transcripción, la traducción y la terminación) necesarias para la expresión del producto deseado. La naturaleza de este tipo de regiones estructurales y reguladoras depende en gran medida del producto y de la célula huésped en cuestión. El diseño genético de la célula huésped de la invención puede ser realizado por un experto en la técnica, usando la tecnología del ADN recombinante estándar para la transformación o transfección de una célula huésped [véase p. ej. Sambrook et al.; Molecular Cloning, Cold Spring Harbor. NY, 1989].
Preferiblemente, la célula huésped es modificada por métodos conocidos en la técnica para la introducción de un vehículo de donación apropiado, es decir un plásmido o un vector, que comprende un fragmento de ADN que codifica el producto deseado. El vehículo de donación puede ser introducido en la célula huésped bien como un plásmido que se replica de manera autónoma o integrado en el cromosoma. Preferiblemente el vehículo de clonación comprende una o más regiones estructurales operativamente enlazadas a una o más regiones reguladoras apropiadas.
Las regiones estructurales son regiones que soportan secuencias de nucleótidos que codifican el producto deseado. Las regiones reguladoras incluyen regiones del promotor que comprenden secuencias de control de la transcripción y de la traducción, las regiones del terminador que comprenden señales de parada, y regiones de poliadenilación. El promotor, es decir una secuencia de nucleótidos que presenta una actividad transcripcional en la célula huésped de elección, puede ser un derivado de un gen que codifica una proteína extracelular o intracelular, preferiblemente una enzima, tal como una amilasa, una glucoamilasa, una proteasa, una lipasa, una celulasa, una xilanasa, una oxidorreductasa, una pectinasa, una cutinasa, o una enzima glicolítica. Ejemplos de promotores adecuados para la transcripción en una célula huésped fúngica son promotores derivados del gen que codifica la TAKA amilasa de Aspergillus oryzae,
\alpha-amilasa neutra de Aspergillus Niger, \alpha-amilasa estable ácida de Aspergillus niger, glucoamilasa de Aspergillus niger o Aspergillus awamsii (gluA), acetamidasa de Aspergillus niger, proteasa alcalina de Aspergillus oryzae, triosa fosfato isomerasa de Aspergillus oryzae, proteinasa aspártica de Rhizopus meihei, y lipasa de Rhizopus meihei. Preferidos son los promotores de la TAKA-amilasa de Aspergillus oryzae y de la gluA de Aspergillus awamsii.
El vehículo de clonación puede también comprender un marcador seleccionable, p. ej- un gen, cuyo producto complementa un defecto en la célula huésped, o uno que confiere resistencia a los antibióticos, tal como resistencia a la ampicilina, a la canamicina, al cloranfenicol o a la tetraciclina. Ejemplos de marcadores de la selección de Aspergillus incluyen amdS, pyrG, argB, niaD y sC, un marcador que da lugar a la resistencia a la higromicina. Preferidos para el uso en una célula huésped de Aspergillus son los marcadores amdS y pyrG de Aspergillus nidulans o Aspergillus oryzae. Un marcador mamífero frecuentemente usado es el gen dihidrofolato reductasa (DHFR). Además, la selección puede ser realizada por cotransformación.
Los procedimientos usados para enlazar el constructo de ADN de la invención, el promotor, terminador y otros elementos, respectivamente, y para insertarlos en vehículos de clonación adecuados conteniendo la información necesaria para la replicación, son conocidos por los expertos en la técnica [véase p. ej. Sambrook et al.; Molecular Cloning, Cold Spring Harbor. NY, 1989].
La célula huésped de la invención puede ser cualquier célula huésped de Aspergillus usada de forma convencional para la expresión heteróloga de proteínas.
En una forma de realización preferida, el hongo Aspergillus es una cepa seleccionada del grupo que consiste en Aspergillus oryzae, Aspergillus Niger, Aspergillus nidulans, Aspergillus awamori, Aspergillus phoenicis, Aspergillus japonicus, Aspergillus foetus.
Productos
El producto final deseado, es decir la proteína heteróloga expresada por la célula huésped de la invención, puede ser cualquier proteína eubacteriana o eucariótica.
Tal y como se define aquí, un "producto proteico heterólogo" es una proteína que no es nativa de la célula huésped, o una proteína nativa en la que se han hecho modificaciones para alterar la secuencia nativa, o una proteína nativa cuya expresión es alterada de forma cuantitativa como resultado de una manipulación de una secuencia nativa reguladora requerida para la expresión de la proteína nativa, tal como un promotor, un centro de unión del ribosoma, etc., u otra manipulación de la célula huésped por técnicas de ADN recombinante.
Debido a la ausencia de metaloproteasa neutra, la proteína heteróloga expresada por la célula huésped puede también ser una proteína precursora, es decir un zimógeno, una proteína híbrida, una proteína obtenida como una secuencia pro o secuencia pre-pro, o en forma no madurada. En una forma de realización preferida el producto es una enzima.
En una forma de realización más específica, el producto es una enzima eucariótica, tal como insulina, hormona del crecimiento, glucagón, somatostatina, interferón, PDGF, factor VII, factor VIII, uroquinasa, EPO, quimosina, activador del tejido plasminógeno, o albúmina de suero.
En otra forma de realización preferida, el producto es una enzima fúngica, de levadura, o de origen bacteriano.
Preferiblemente la enzima es una enzima de glicosidasa, p. ej. una amilasa, en particular una \alpha-amilasa (EC 3.2.1.1), una \beta-amilasa (EC 3.2.1.2), una glucan 1,4-\alpha-glucosidasa (EC 3.2.1.3), una celulasa (EC 3,2.1.4), una endo-1,3(4)-\beta-glucanasa (EC 3.2.1,6), un endo-1,4-\beta-glucanasa (EC 3.2.1.8), una poligalacturonasa (EC 3,2.1.15), una \alpha-glucosidasa (EC 3.2.1.20), una \beta-glucosidasa (EC 3.2.1.21), una \alpha-galactosidasa (EC 3.2.1.22), una \beta-galactosidasa (EC 3.2.1.23), una xilan-endo-1,3-\beta-xilosidasa (EC 3.2.1.32), una endo-1,3-\beta-glucanasa (EC 3.2.1.39), una endo-1,3-\alpha-glucanasa (EC 3.2.1.59), una endo-1,2-\beta-glucanasa (EC 3.2.1.71), una endo-1,6-8-glucanasa (EC 3,2.1.75), una celulosa-1,4-\beta-celobiosidasa (EC 3.2.1.91, también conocidas como celobiohidrolasas).
En otra forma de realización preferida la enzima es una enzima lipolítica, en particular una lipasa, una esterasa, una fosfolipasa, o una liso-fosfolipasa.
En una tercera forma de realización preferida la enzima es una fitasa, en particular una 3-fitasa (EC 3.1.3.8) o una 6-fitasa (EC 3.1.3.26).
En una cuarta forma de realización preferida la enzima es una enzima proteolítica.
En una quinta forma de realización preferida la enzima es una oxidorreductasa, tal como una peroxidasa o una lacasa, una pectinasa, o una cutinasa.
Polipéptidos preferidos híbridos son proquimosina y proteasas tipo pro-tripsina.
Metaloproteasas
En el contexto de esta invención una metaloproteasa es una enzima proteolítica que contiene un centro metálico de zinc catalítico que participa en la hidrólisis del esqueleto peptídico. El centro de zinc activo diferencia a estas proteasas de las calpainas, cuyas actividades son dependientes de la presencia de calcio. La confirmación de una proteasa como una metaloproteasa es la pérdida de actividad proteolítica realizada por eliminación del centro de zinc. El centro de zinc puede ser eliminado con 1,10-fenantrolina (1 mM). Después de la titulación con Zn^{2+} (0,1-100 \muM), la actividad proteolítica es restaurada.
En una forma de realización preferida, la metaloproteasa contemplada en el contexto de esta invención es una metaloproteasa neutra, que es una metaloproteasa que posee actividad óptima proteolítica en la región del pH neutro, es decir en la gama de aproximadamente pH 6-8, preferiblemente la gama de aproximadamente pH 6.5-7.5, alrededor de pH 7.
Más particularmente, la metaloproteasa contemplada en el contexto de esta invención es una metaloproteasa neutra de Aspergillus de grupo NplI.
Modificaciones genéticas
La célula huésped de la invención, genéticamente modificada para expresar niveles significativamente reducidos de una metaloproteasa neutra puede ser modificada usando la tecnología del ADN recombinante estándar, conocida por el experto en la técnica. La secuencia de genes responsable de la producción de la metaloproteasa puede ser inactivada o eliminada en su totalidad.
En una forma de realización particular, la célula huésped de la invención es una modificada genéticamente en las regiones estructurales o reguladoras que codifican la metaloproteasa. Las técnicas conocidas y útiles incluyen, pero no se limitan a, mutagénesis específica o aleatoria, mutagénesis generada por PCR, deleción, inserción y/o sustitución del ADN sitio específico, técnicas de interrupción génica o de sustitución génica, técnicas antisentido, o una combinación de éstas.
La mutagénesis puede ser realizada usando un agente mutagenizante físico o químico adecuado. Ejemplos de un agente mutagenizante físico o químico adecuado para el presente objetivo incluye irradiación ultravioleta (UV), hidroxilamina, N-metil-N'-nitro-N-nitrosoguanidina (MNNG), O-metil hidroxilamina, ácido nitroso, etil metano sulfonato (EMS), bisulfito sódico, ácido fórmico, y análogos del nucleótido. Cuando estos agentes son usados, la mutagénesis es normalmente realizada incubando la célula para ser mutagenizada en presencia del agente mutagenizante de elección bajo condiciones adecuadas para que ocurra la mutagénesis, y seleccionando las células mutadas que tienen una producción significativamente reducida de metaloproteasa.
La modificación puede también ser realizada por introducción, sustitución o eliminación de uno o más nucleótidos en la secuencia de codificación de la metaloproteasa o un elemento regulador requerido para la transcripción o traducción de la misma. Los nucleótidos pueden, p. ej., ser insertados o eliminados para resultar en la introducción de un codón de detención, la eliminación del codón de iniciación o un cambio en el marco de lectura abierto. La modificación o inactivación de la secuencia estructural o un elemento regulador puede ser realizada por mutagénesis dirigida o mutagénesis generada por PCR conforme a métodos conocidos en la técnica. Aunque en principio, la modificación puede ser realizada in vivo, es decir directamente en la célula que lleva el gen de la metaloproteasa, se prefiere actualmente la realización de la modificación in vitro.
Un modo conveniente de inactivar o reducir la producción de la metaloproteasa de una célula huésped de elección se basa en los principios de interrupción génica. Este método conlleva el uso de una secuencia de ADN correspondiente al gen endógeno o fragmento del gen que se desea destruir. Dicha secuencia de ADN es mutada in vitro a un gen defectuoso y transformado en la célula huésped. Por recombinación homóloga, el gen defectuoso reemplaza el gen endógeno o fragmento de gen. Puede ser deseable que el gen defectuoso o fragmento de gen codifique un marcador que pueda ser usado para la selección de transformantes donde el gen que codifica la metaloproteasa ha sido modificado o destruido.
De forma alternativa, la modificación o inactivación de la secuencia de ADN puede ser realizada usando técnicas antisentido establecidas usando una secuencia de nucleótidos complementaria a la secuencia de codificación de la metaloproteasa.
Debido a la modificación genética, la célula huésped de la invención expresa niveles de metalproteasas significativamente reducidos. En una forma de realización preferida el nivel de metaloproteasa expresado por la célula huésped es reducido más de aproximadamente el 50%, preferiblemente más de aproximadamente el 85%, más preferido más de aproximadamente el 90%, aún más preferido más de aproximadamente el 95%. En una forma de realización más preferida, el producto expresado por la célula huésped está esencialmente libre de cualquier actividad metaloproteasa.
Métodos para la producción de proteínas
En otro aspecto, la invención proporciona un método para producir proteínas (es decir polipéptidos y/o proteínas), este método comprende el cultivo de la célula huésped de la invención en un medio de crecimiento adecuado, seguido de la recuperación del producto deseado.
Con el método de la invención, la acción proteolítica de la metaloproteasa neutra, NplI, ha sido significativamente reducida, de ese modo mejorando la estabilidad del producto obtenido. Además, debido a la ausencia de metaloproteasa, la proteína heteróloga expresada por la célula huésped puede ser obtenida como una proteína precursora, es decir un zimógeno, una proteína híbrida, una proteína obtenida como una secuencia pro o secuencia pre-pro, o en forma no madurada.
El caldo o medio usado para el cultivo puede ser cualquier medio convencional adecuado para hacer crecer la célula huésped en cuestión, y puede estar compuesto según los principios de la técnica anterior. El medio preferiblemente contiene fuentes de nitrógeno y carbono y otras sales inorgánicas. Los medios adecuados, p. ej. medios mínimos o complejos, están disponibles por proveedores comerciales, o pueden ser preparados según recetas publicadas, p. ej. el catálogo de cepas de la American Type Culture Collection (ATCC).
Después del cultivo, la proteína es recuperada por el método convencional para el aislamiento y purificación de las proteínas de un caldo de cultivo. Los procedimientos de purificación bien conocidos incluyen la separación de las células del medio por centrifugado o filtración, precipitación de los componentes proteicos del medio mediante una sal tal como sulfato de amonio, y métodos cromatográficos tales como p. ej. la cromatografía de intercambio iónico, la cromatografía de filtración en gel, cromatografía de afinidad, etc.
Ejemplos
La invención está posteriormente ilustrada con referencia a los ejemplos siguientes que no están destinados a ser de ninguna manera limitadores del objetivo de la invención según está reivindicado.
Materiales y métodos Cepas
IFO 4177 de Aspergillus oryzae, disponible por Institute for Fermentation, Osaka, 17-25 Juso Hammachi 2- Chome Yodogawa-Ku, Osaka, Japón.
DH5a de Escherichia coli, Hanahan D, J. Mol. Biol. 1983 166 557.
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Genes
NplI, gen que codifica la Metaloproteasa II Neutra.
pyrG: gen que codifica la orotidina-5'-fosfato-descarboxilasa, una enzima implicada en la biosíntesis de uridina.
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Plásmidos
pUC118; Yanish-Perron et al., 1985 Gene 33 103.
pSO2; la construcción de este plásmido está descrita en el ejemplo 1.
pJers4; un subclón de pSO2.
pSO5; construcción de este plásmido a partir de pS02 está descrita en el ejemplo 1.
pJaL198; la construcción de este plásmido a partir de pJaL198 está descrita en el ejemplo 1.
pJaL218: la construcción de este plásmido a partir de pJaL218 está descrita en el ejemplo 2.
p3SR2; Kelly J M y Hynes M J, EMBO Journal 1985 4 475-479.
pToC90; un subclón de p3SR2.
pToC56; la construcción de este plásmido está descrita en EP 238,023 B.
pCR^{TM} II; Disponible por Invitrogen Corporation, San Diego, CA, EEUU.
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Ejemplo 1
Clonación de Metaloproteasa II Neutra (NplI) de Aspergillus oryzae Construcción de pJaL198
A partir de la secuencia de nucleótidos de ADNc publicada que codifica NplI de Aspergillus oryzae [Tatsumi et al.: mol. Gen. Genet. 1991 228 97-103], dos oligonucleótidos fueron diseñados de modo que la parte de codificación del gen NplI fue amplificada en una reacción PCR.
Un cebador (CTAGGATCCAAGGCATTTATGCGTGTCACTACTCTC; SEC ID NO: 7) fue construido de modo que el extremo 3' de la secuencia de nucleótidos corresponda con la parte N-terminal del gen NplI (subrayado), y el extremo 5' es para facilitar la clonación (contiene un sitio de la endonucleasa de restricción BamHI).
Un cebador (CTACTCGAGTTAGCACTTGAGCTCGATAGC; SEC ID NO: 8) fue construido de modo que el extremo 3' de la secuencia de nucleótidos corresponda con la parte C terminal del gen NplI (subrayado), y el extremo 5' es para facilitar la clonación (contiene un sitio de la endonucleasa de restricción XhoI).
El ADN genómico de IFO 4177 de Aspergillus oryzae fue usado como molde en la reacción PCR. La reacción de amplificación fue realizada en volúmenes de 100 \mul conteniendo 2,5 unidades de Taq-polimerasa, 100 ng de ADN genómico de Aspergillus oryzae, 50 mM de KCl, 10 mM de tris-HCl pH 8.0, 1,5 mM de MgCl_{2}, 250 nM de cada dNTP, y 100 pM de cada uno de los dos cebadores anteriormente descritos.
La amplificación se efectuó en un Perkin-Elmer Cetus DNA Termal 480, y consistió en un ciclo de 3 minutos a 94ºC, seguido de 25 ciclos de 1 minuto a 94ºC, 30 segundos a 55ºC, y 1 minuto a 72ºC. La reacción PCR produce un fragmento de ADN de aprox. 1,1 kb de longitud. Este fragmento fue aislado por electroforesis en gel, purificado, clonado en el vector pCR^{TM} II (Invitrogen Corporation), y secuenciado usando métodos estándar conocidos en la técnica de biología molecular. El plásmido resultante fue llamado pJaL 198.
Ejemplo 2
Interrupción genómica de NplI Construcción de JaL121
Para generar cepas de Aspergillus oryzae que fueron específicamente deficitarias en la producción de NplI, una estrategia de sustitución génica como se describe por Miller et al.: Mol. Cell. Biol. 1985 5 1714-1721, fue empleada.
Clonación del gen pyrG de Aspergillus oryzae
El gen pyrG de Aspergillus oryzae fue clonado por hibridación cruzada con el gen pyrG de Aspergillus Niger [W. van Hartingsveldt et al.: Mol, Gen. Genet. 1987 206 71-75]. Una biblioteca lambda de ADN de IFO 4177 de Aspergillus oryzae parcialmente digerido con SauIIIA fue evaluado a baja astringencia con un fragmento de 1 kb de ADN del gen pyrG de Aspergillus Niger. ADN de un clon positivo fue subclonado en un vector pUC118. El plásmido resultante, pS02, demostró contener el gen pyrG por complementación de un pyrG mutante de Aspergillus Niger, cf. Fig. 1.
Construcción de una cepa pyrG Minus de Aspergillus oryzae
Un plásmido de deleción de pyrG, pSOS, conteniendo aproximadamente 1 kb de secuencias flanqueantes de pyrG en cada extremo, fue construido a partir del plásmido pSO2. La cepa IFO 4177 de Aspergillus oryzae fue transformada con este constructo, y los transformantes fueron seleccionados por resistencia al ácido 5-fluoro-orótico, una característica del fenotipo de los mutantes de pyrG. Un transformante, HowB101, demostró por el análisis de Southern que tenía la deleción prevista en el locus de pyrG. Siendo un mutante de pyrG. HowB101 requiere uridina para el crecimiento. HowB101 puede ser transformado con el gen pyrG tipo salvaje por selección por la capacidad para crecer sin uridina.
Las fases implicadas en la construcción de HowB101 están ilustradas en la Fig. 2.
Construcción del plásmido de interrupción pJaL218
El pásmido pJaL198 es digerido con BstEII y tratado con polimerasa Klenow para hacer los extremos romos. El fragmento de 4,9 kb fue aislado por electroforesis en gel y purificado. Este fragmento de ADN fue luego tratado con fosfatasa alcalina bacteriana para eliminar los grupos 5' fosfato, según las instrucciones del fabricante, extraído con fenol y precipitado.
El plásmido pJers4 fue digerido con HindIII y tratado con polimerasa Klenow para hacer los extremos romos. El fragmento de 1,8 kb que codifica el gen pyrG de Aspergillus oryzae fue aislado por electroforesis en gel y purificado.
Los dos fragmentos fueron mezclados y ligados. Después de las transformaciones de DH5\alpha de E. coli, las colonias que llevan los plásmidos correctos son identificadas por digestión con la enzima de restricción de minipreparaciones plásmidas. La construcción de pJaL218 está ilustrada en la Fig. 3.
pJaL218 consiste en el vector pCR^{TM} II que contiene un fragmento que lleva el gen NplII flanqueado por sitios EcoRI, donde el fragmento central BstEII ha sido sustituido por un fragmento de ADN de 1,8 kb que codifica el gen pyrG de Aspergillus oryzae.
Transformación de Aspergillus oryzae
15 \mug de plásmido pJaL218 es digerido hasta la terminación por EcoRI. La terminación de la digestión fue controlada realizando una alícuota en un gel. El resto del ADN fue extraído con fenol, precipitado y resuspendido en 10 \mul de agua estéril.
La transformación de la cepa huésped HowB101 de Aspergillus oryzae fue realizada por el método del protoplasto [Christensen et al.: Biotechnoloqy 1988 6 1419-1422]. Normalmente, los micelios de Aspergillus oryzae fueron hechos crecer en un caldo nutritivo rico. Los micelios fueron separados del caldo por filtración. Novozyme^{TM} (disponible por Novo Nordisk A/S, Dinamarca) fue añadida a los micelios en un tampón estabilizante osmóticamente, 1,2 M de MgSO_{4}, tampón fosfato sódico pH 5.0. La suspensión fue incubada durante 60 minutos a 37ºC con agitación. El protoplasto fue filtrado a través de Miracloth para eliminar el detrito micelial. El protoplasto fue cosechado y lavado dos veces con STC (1,2 M de sorbitol, 10 mM de CaCl_{2}, 10 mM de tris-HCl pH 7.5). El protoplasto fue finalmente resuspendido en 200-1000 \mul de STC.
Para la transformación. Se añadieron 5 \mug de ADN a 100 \mul de suspensión del protoplasto. Se añadieron 200 \mul de solución PEG (60% PEG 4000,10 mM de CaCl_{2}. 10 mM de tris-HCl pH 7.5), y la mezcla fue incubada durante 20 minutos a temperatura ambiente. El protoplasto fue cosechado y lavado dos veces con 1,2 M de sorbitol. El protoplasto fue finalmente resuspendido 200 \mul 1,2 M sorbitol, colocado en placas selectivas (medio mínimo + 10 g/l Bacto-agar (Difco), e incubado a 37ºC.
Después de 3-4 días de crecimiento a 37ºC, los transformantes estables aparecen como colonias que crecen enérgicamente y se esporulan.
Identificación de interrupciones génicas
A partir de colonias estables, las esporas individuales son alineadas en placas mínimas frescas. Las colonias individuales son seleccionadas y realineadas para dar cultivos puros.
Treinta y tres transformantes fueron seleccionados para ver si el fragmento de ADN transformado se había integrado por un doble cruzamiento en el gen correspondiente en el cromosoma por PCR. La reacción PCR y el ADN genómico de los transformantes fueron realizados según el modo descrito anteriormente.
Los cebadores usados fueron CCCTTCTTTCCAAACCG (SEC ID NO: 9), que está localizado en 5' desde la región de la codificación del gen NplI, y pyrG-5' (GGGTGAGCCACTGCCTC; SEC ID NO: 10), que es específico para el gen pyrG. Un transformante dio el producto de PCR previsto en 1,1 kb.
A partir de los análisis de Southern, donde el ADN genómico del transformante y de Aspergillus oryzae fue digerido con EcoRI, fraccionado por electroforesis en gel de agarosa, transferido a filtros de membrana Immobilan-N, y evaluado con el fragmento EcoRI de 1,1 kb de pJaL1 98 conteniendo el gen NplI, se descubrió que la banda tipo salvaje en 3,8 kb había sido desplazada a una banda en el transformante de 10 kb. Esto demuestra que el ADN transformado se había integrado en el gen NplI en múltiples copias. La cepa fue designada JaL121.
Ejemplo 3
Producción de quimosina en JaL121
La cepa JaL121 de Aspergillus oryzae fue transformada con el plásmido pToC56 (cf. Fig. 4), que es un plásmido de expresión fúngico para la enzima quimosina de mamífero, por cotransformación con pToC90. La construcción del plásmido pToC56 está descrita en EP 98 993 A.
Los transformantes fueron seleccionados por crecimiento en un medio mínimo que contenía 10 mM de acetamida, y cribados por presencia de pToC56 por la capacidad de producir quimosina. Un transformante fue hecho crecer en frascos de agitación durante 4 días a 30ºC en un medio que contenía maltodextrina, harina de soja y peptona. Un transformante de pToC56 en IFO 4177 de Aspergillus oryzae fue hecho crecer con el transformante JaL121.
Cada día, las muestras del caldo de fermentación fueron recogidas y aplicadas a SDS-PAGE y transferencia de Western. La membrana de transferencia fue incubada con el anticuerpo de conejo específico de quimosina, seguido del anticuerpo de conejo de la cabra acoplado a la peroxidasa.
La coloración de la membrana mostró que en el primero y en el segundo día de fermentación, los sobrenadantes de los transformantes de IFO 4177 de Aspergillus oryzae contenían cantidades pequeñas de quimosina, o productos de degradación de la misma. Más adelante no se detectó más quimiotripsina. Por el contrario, los transformantes de JaL121 contenían al menos diez veces el tamaño completo de quimosina. La cantidad de quimosina en los sobrenadantes aumentó durante los dos-tres primeros días y luego se mantuvo constante.
INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº: 1:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 2052 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
TIPO DE CADENA: único
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico)
\vskip0.800000\baselineskip
(vi)
FUENTE ORIGINAL:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
ORGANISMO: Fusarium oxysporum 
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
CEPA: DSM 2672
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
AISLAMIENTO INDIVIDUAL: p45
\vskip0.800000\baselineskip
(ix)
CARACTERÍSTICA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
NOMBRE/CLAVE: mat_péptido
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
LOCALIZACIÓN:785..2049
\vskip0.800000\baselineskip
(ix)
CARACTERÍSTICA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
NOMBRE/CLAVE: sig_péptido
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
LOCALIZACIÓN:55..784
\vskip0.800000\baselineskip
(ix)
CARACTERÍSTICA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
NOMBRE/CLAVE: intrón
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
LOCALIZACIÓN:364..415
\vskip0.800000\baselineskip
(ix)
CARACTERÍSTICA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
NOMBRE/CLAVE: intrón
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
LOCALIZACIÓN:802..854
\vskip0.800000\baselineskip
(ix)
CARACTERÍSTICA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
NOMBRE/CLAVE: intrón
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
LOCALIZACIÓN:1821..1868
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID NO: 1:
\vskip1.000000\baselineskip
1
2 
\vskip1.000000\baselineskip
INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº: 2:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 388 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
TIPO DE CADENA: único
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: proteína
\vskip0.800000\baselineskip
(vi)
FUENTE ORIGINAL:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
ORGANISMO: Fusarium oxysporum 
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
CEPA: DSM 2672
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
AISLAMIENTO INDIVIDUAL: p45
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID NO: 2:
\vskip1.000000\baselineskip
3
4 
\vskip1.000000\baselineskip
INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº: 3:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 14 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
TIPO DE CADENA: único
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: péptido
\vskip0.800000\baselineskip
(v)
TIPO DE FRAGMENTO: N-terminal
\vskip0.800000\baselineskip
(vi)
FUENTE ORIGINAL:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
ORGANISMO: Fusarium oxysporum 
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
CEPA: DSM 2672
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
AISLAMIENTO INDIVIDUAL: p45
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID NO: 3:
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Ala Thr Tyr Lys Val Tyr Pro Trp Gly Val Asn Asp Pro Ser}
\vskip1.000000\baselineskip
INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº: 4:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 747 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
TIPO DE CADENA: único
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico)
\vskip0.800000\baselineskip
(vi)
FUENTE ORIGINAL:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
ORGANISMO: Aspergillus oryzae 
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
CEPA: IFO 4177
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
AISLAMIENTO INDIVIDUAL: Npl
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID NO: 4:
\vskip1.000000\baselineskip
5 
\vskip1.000000\baselineskip
INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº: 5:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 32 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
TIPO DE CADENA: único
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: ADNc
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
descripción de la secuencia: SEC ID NO: 5:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
GGAGGAAGATCTCTCTGGTACTCTTCGATCTC 
\hfill
\vskip1.000000\baselineskip
INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº: 6:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 41 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
TIPO DE CADENA: único
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: ADNc
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID NO: 6:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
GGAGGAGAATTCAAGCTTCTTCTACATCACAGTTTGAAAGC 
\hfill
\vskip1.000000\baselineskip
INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº: 7:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 36 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
TIPO DE CADENA: único
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: ADNc
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID NO: 7:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
CTAGGATCCA AGGCATTTAT GCGTGTCACT ACTCTC 
\hfill
36 
\vskip1.000000\baselineskip
INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº: 8:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 30 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
TIPO DE CADENA: único
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: ADNc
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID NO: 8:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
CTACTCGAGT TAGCACTTGA GCTCGATAGC 
\hfill
30 
\vskip1.000000\baselineskip
INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº: 9:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 17 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
TIPO DE CADENA: único
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: ADNc
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID NO: 9:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
CCCTTCTTTC CAAACCG 
\hfill
17 
\vskip1.000000\baselineskip
INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº: 10:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 17 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
TIPO DE CADENA: único
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: ADNc
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID NO: 10:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
GGGTGAGCCA CTGCCTC 
\hfill
17 
\vskip1.000000\baselineskip

Claims (18)

1. Célula huésped de Aspergillus útil para la expresión de un producto proteico heterólogo, célula que ha sido modificada genéticamente para expresar niveles significativamente reducidos de una metaloproteasa neutra de Aspergillus, NplI, con actividad proteolítica óptima en la gama de pH 6-8, en comparación con una célula parental.
2. Célula huésped según la reivindicación 1, que es una cepa seleccionada del grupo que consiste en Aspergillus otyzae, Aspergillus niger, Aspergillus nidulans, Aspergillus awamori, Aspergillus phoenicis, Aspergillus japonicus, Aspergillus foetus.
3. Célula huésped según cualquiera de las reivindicaciones 1-2, que ha sido modificada genéticamente en las regiones estructurales o reguladoras de codificación de la metaloproteasa.
4. Célula huésped según la reivindicación 3, que ha sido modificada genéticamente por mutagénesis específica o aleatoria. mutagénesis generada por PCR, deleción, inserción y/o sustitución del ADN sitio específico, técnicas interrupción génica o de sustitución génica, técnicas antisentido, o una combinación de éstas.
5. Célula huésped según cualquiera de las reivindicaciones 1-4, en la cual el nivel de metaloproteasa expresada es reducido más de aproximadamente el 50%, preferiblemente más de aproximadamente el 85%, más preferido más de aproximadamente el 90%, aún más preferido más de aproximadamente el 95%.
6. Célula huésped según cualquiera de las reivindicaciones 1-4, la cual está esencialmente libre de cualquier actividad metaloproteasa.
7. Método para producir un producto proteico heterólogo en la célula huésped según la reivindicación 1, dicho método comprendiendo,
(a) introducir en dicha célula huésped una secuencia de ácidos nucleicos que codifica dicho producto proteico;
(b) cultivar en un medio de crecimiento adecuado, la célula huésped de la fase (a); y
(c) aislar dicho producto proteico heterólogo.
8. Método según la reivindicación 7, donde la célula huésped es una cepa seleccionada del grupo que consiste en Aspergillus oryzae, Aspergillus niger, Aspergillus nidulans, Aspergillus awamori, Aspergillus phoenicis, Aspergillus japonicus, Aspergillus foetus.
9. Método según cualquiera de las reivindicaciones 7-8, donde la célula huésped ha sido modificada genéticamente en las regiones estructurales o reguladoras de codificación de la metaloproteasa.
10. Método según la reivindicación 9, donde la célula huésped ha sido modificada genéticamente por mutagénesis específica o aleatoria; mutagénesis generada por PCR, deleción, inserción y/o sustitución del ADN sitio específico, técnicas de interrupción génica o de sustitución génica, técnicas antisentido, o una combinación de éstas.
11. Método según cualquiera de las reivindicaciones 7-10, donde el nivel de metaloproteasa expresado por la célula huésped es reducido más del 50%, preferiblemente más del 85%, más preferido más del 90%, aun más preferido más del 95%.
12. Método según cualquiera de las reivindicaciones 7-10, donde el producto expresado por la célula huésped está esencialmente libre de cualquier actividad metaloproteasa.
13. Método según cualquiera de las reivindicaciones 7-12, donde el producto proteico es una enzima eucariótica, tal como insulina, hormona del crecimiento, glucagón, somatostatina, interferón. PDGF, factor VII, factor VIII, uroquinasa, EPO, quimosina, activador del tejido plasminógeno, o albúmina de suero.
14. Método según cualquiera de las reivindicaciones 7-13. donde el producto proteico es una proteína de origen fúngico.
15. Método según la reivindicación 14, donde el producto proteico es una enzima fúngica, en particular una enzima amilolítica, tal como una alfa-amilasa, una beta-amilasa, una glucoamilasa, una beta-galactosidasa, una enzima celulítica, una enzima lipolítica, una enzima xilanolítica, una enzima proteolítica, una oxidorreductasa, tal como una peroxidasa o una lacasa, una pectinasa, o una cutinasa.
16. Método según cualquiera de las reivindicaciones 7-15, donde el producto proteico es una proteína bacteriana.
17. Método según la reivindicación 16, donde el producto proteico es una enzima bacteriana, en particular una enzima amilolítica, tal como una alfa-amilasa, una beta-amilasa, una glucoamilasa, una beta-galactosidasa, una enzima celulítica, una enzima lipolítica, una enzima xilanolítica, una enzima proteolítica, una oxidorreductasa, tal como una peroxidasa o una lacasa, una pectinasa, o una cutinasa.
18. Método según cualquiera de las reivindicaciones 7-17, donde el producto proteico es una proteína precursora, es decir un zimógeno, una proteína híbrida, una proteína obtenida como una secuencia pro o secuencia pre-pro, o en forma no madurada.
ES96905768T 1995-03-20 1996-03-20 Celula huesped que expresa niveles reducidos de metaloproteasa y metodos de utilizacion de la celula huesped para la produccion de proteinas. Expired - Lifetime ES2281079T3 (es)

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