ES2301174T3 - Produccion y secrecion de xilanasas de actinomicetes en un hongo filamentoso de tricoderma. - Google Patents

Produccion y secrecion de xilanasas de actinomicetes en un hongo filamentoso de tricoderma. Download PDF

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Abstract

LA PRESENTE INVENCION SE REFIERE A UNA PRODUCCION MEJORADA DE PROTEINAS BACTERIANAS EN HONGOS FILAMENTOSOS, POR EJEMPLO EN TRICHODERMA Y ASPERGILLUS. LA MEJORA SE LOGRA CONSTRUYENDO VECTORES DE EXPRESION QUE COMPRENDEN LAS SECUENCIAS DE DNA QUE CODIFICAN PROTEINAS BACTERIANAS FUSIONADAS EN EL MISMO MARCO CON UNA SECUENCIA DE DNA QUE CODIFICA UNA PROTEINA SECRETABLE DE HONGOS FILAMENTOSOS O UNO O MAS DOMINIOS FUNCIONALES DE DICHAS PROTEINAS. LOS HOSPEDADORES DE HONGOS FILAMENTOSOS TRANSFORMADOS CON DICHOS VECTORES DE EXPRESION SECRETAN LAS PROTEINAS O ENZIMAS DESEADOS, ESPECIALMENTE XILANASAS O CELULASAS QUE SE ORIGINAN DE BACTERIAS, O MAS PREFERENTEMENTE A PARTIR DE ACTINOMICETOS EN EL MEDIO DE CULTIVO DEL HOSPEDADOR. LAS PROTEINAS O ENZIMAS DESEADOS PUEDEN SER UTILIZADOS DIRECTAMENTE A PARTIR DEL MEDIO DE CULTIVO TRAS LA SEPARACION DE LAS CELULAS HOSPEDADORAS, O RECUPERADOS Y TRATADOS EMPLEANDO PROCESOS CORRIENTE ABAJO, QUE SON ADECUADOS PARA LAS CORRESPONDIENTES APLICACIONES. LAS XILANASAS O CELULASAS DE LOS ACTINOMICETOS PRODUCIDOS EMPLEANDO LOS VECTORES DE EXPRESION CONVENIENTES SON MAS ADECUADOS PARA EL TRATAMIENTO DE MATERIALES DERIVADOS DE PLANTAS, POR EJEMPLO EN INDUSTRIAS DE PASTA Y PAPEL.

Description

Producción y secreción de xilanasas de actinomicetes en un hongo filamentoso de Trichoderma.
La presente invención proporciona vectores de expresión recombinante para producir xilanasas de actinomicetes en hongos filamentosos Trichoderma, transformando dichos huéspedes fúngicos filamentosos con un vector de expresión que contiene una secuencia de ADN que codifica uno o más dominios funcionales de una proteína fúngica secretable, en la que el dominio funcional es un dominio de cola de una celulasa fúngica secretable o un dominio central y de bisagra de una mananasa fúngica secretable derivada del huésped Trichoderma. También se proporcionan huéspedes transformados con dichos vectores de expresión. Dichos huéspedes transformados producen preparaciones de xilanasa útiles, por ejemplo, para modificar las propiedades de la biomasa vegetal, especialmente para reducir el contenido de lignina en blanqueado asistido con enzimas.
El objetivo del blanqueado de pulpa de papel kraft es retirar la lignina residual que queda en la pulpa después del cocido del papel kraft. Tradicionalmente, esto se ha hecho usando compuestos químicos que contienen cloro. Debido a los problemas medioambientales y las demandas del consumidor, se han deseado tecnologías de blanqueado alternativas.
El primer enfoque biotécnico para este problema fue atacar la lignina directamente con enzimas que degradan la lignina. Sin embargo, la química de la degradación enzimática de la lignina parece ser muy complicada y difícil de controlar.
La lignina puede degradarse, si se usa el microorganismo completo que produce enzimas ligninolíticas. Sin embargo, los tiempos de tratamiento son relativamente largos. Por ejemplo, los tiempos de tratamiento pueden llevar días, y los microorganismos necesitan nutrientes suplementarios para que funcionen. También puede ser difícil controlar el crecimiento de otros microbios indeseados. El uso de la degradación de lignina por enzimas ligninolíticas aisladas o por microorganismos es objeto de mucha investigación (véase, por ejemplo, Farrell, R.L. y col., Lignocellulosics 305-315 (1992); Jurasek, L., Lignocellulosics 317-325 (1992)).
Además de celulosa y lignina, la pulpa de madera contiene hemicelulosa. Otro enfoque para reducir el contenido de lignina de la pulpa es atacar la hemicelulosa - el tercer componente principal de la madera. La hemicelulosa en madera noble nativa es principalmente xilano, mientras que en madera blanda la hemicelulosa es principalmente glucomananos y algún xilano. Durante el cocido del papel kraft, parte del xilano se disuelve en el agua de cocido. Hacia el final del periodo de cocido, cuando la concentración de álcali disminuye, parte del xilano disuelto y modificado precipita de nuevo sobre la fibra de celulosa.
En 1986, se observó que el pretratamiento con xilanasa de pulpa de papel kraft provoca una necesidad disminuida de compuestos químicos en el proceso de blanqueado (Viikari, L. y col. Proceedings of the 3rd Int. Conf. on Biotechnology in the Pulp Paper Ind., Stockholm (1986), pág. 67-69). El pretratamiento con xilanasa de la pulpa de papel kraft hidroliza parcialmente el xilano en pulpa de papel kraft. El mecanismo de cómo la hidrólisis de xilano provoca una mejor retirada de la lignina no está completamente entendido. Una posibilidad frecuentemente sugerida es que la estructura de la pulpa llega a ser más porosa y esto posibilita una retirada más eficaz de los fragmentos de lignina en las posteriores fases de blanqueado y extracción. También la hidrólisis del xilano localizado en las partes internas de la fibra y posiblemente unidas a la lignina puede tener una tarea. Después, en varios laboratorios, se informó de que el pretratamiento con xilanasa era útil junto con secuencias de blanqueado que constan de Cl_{2}, ClO_{2}, H_{2}O_{2}, O_{2} y O_{3}. Véanse las revisiones en Viikari, L. y col., FEMS Microbiol. Rev. 13: 335-350 (1994); Viikari, L. y col., en: Saddler, J.N., ed., Bioconversion of Forest and Agricultural Plant Residues, C-A-B International (1993), pág. 131-182; Grant, R., Pulp and Paper Int. (Sept. 1993), pág. 56-57; Senior & Hamilton, J. Pulp & Paper: 111-114 (Sept. 1992); Bajpai & Bajpai, Process Biochem. 27:319-325 (1992); Onysko, A., Biotech. Adv. 11:179-198 (1993); y Viikari, L. y col., J. Paper y Timber 73:384-389 (1991).
Como resultado directo de la mejor capacidad de blanqueado de la pulpa después de dicho tratamiento con xilanasa, hay una reducción del posterior consumo de compuestos químicos de blanqueado, que cuando se usan compuestos químicos que contienen cloro, conduce a una formación reducida de compuestos de organo-cloro medioambientalmente indeseados. También, como resultado directo de la mejor capacidad de blanqueado de la pulpa después de un tratamiento con xilanasa, es posible producir un producto con un mayor brillo final donde dicho brillo sería de otro modo difícil de conseguir (tal como blanqueado totalmente libre de cloro (TCF) usando peróxido). A causa de la especificidad de sustrato de la enzima xilanasa, las fibras de celulosa no se dañan y las propiedades de resistencia del producto están dentro de los límites aceptables.
Una xilanasa que es activa a un pH alcalino disminuiría la necesidad de acidificar la pulpa antes del tratamiento con xilanasa. Además, las temperaturas de muchos procedimientos modernos de cocido y blanqueado de papel kraft son relativamente elevadas, bastante por encima de 50ºC que es adecuado para muchas de las enzimas de blanqueado comerciales. Por consiguiente, existe una necesidad de preparaciones de xilanasa termoestables que sean estables a valores de pH alcalino para su uso en procedimientos de blanqueado de pulpa de madera.
Se sabe que los actinomicetes, por ejemplo (Microtetraspora flexuosa ATCC35864 y Thermomonospora fusca KW3), producen xilanasas termoestables y estables a condiciones alcalinas (documentos US 5.437.992 y EP 473 545). Se ha informado de que la clonación de xilanasas a partir de varias bacterias (por ejemplo, Ghangas, G.S. y col., J. Bacteriol. 171:2963-2969 (1989); Lin, L.-L., Thomson, J.A., Mol. Gen. Genet. 228:55-61 (1991); Shareck, F. y col., Gene 107:75-82 (1991); Scheirlinck, T. y col., Appl. Microbiol. Biotechnol. 33:534-541 (1990); Whitehead, T.R., Lee, DA, Curr. Microbiol. 23:15-19 (1991)); y también a partir de Actinomadura sp. FC7 (Etier, J.-F. y col., en: Industrial Microorganisms: Basic and Applied Molecular Genetics, R. Baltz y col., Eds, (Proc. 5th ASM Conf. Gen. Mol. Biol, Indust. Microorg., Oct 11-15, 1992, Bloomington, Indiana, póster C25)). Se ha propuesto por algunos investigadores que el primer género Actinomadura debe dividirse en dos géneros, Actinomadura y Microtetraspora, incluyendo el último, por ejemplo el anterior A. flexuosa (Kroppenstedt y col., System. Appl. Microbiol. 13: 148-160 (1990)).
El uso de enzimas que hidrolizan la hemicelulosa en diferentes secuencias de blanqueado se analiza en los documentos WO 89/08738, EP 383 999, WO 91/02791, EP 395 792, EP 386 888, EP 473 545, EP 489 104 y WO 91/05908, WO 95/34662, WO 95/18219, WO 95/27779, WO 95/34662, WO 95/18219, WO 92/04664 y WO 92/03540. El uso de enzimas hemicelulolíticas para la retirada mejorada de agua de la pulpa mecánica se analiza en los documentos EP 262 040, EP 334 739 y EP 351 655, DE 4.000.558, WO 92/04664, WO 92/03540, WO 94/21785 y EP 513 140. Cuando se considera la hidrólisis de la biomasa en combustibles líquidos o compuestos químicos, la conversión tanto de celulosa como de hemicelulosa es esencial para obtener un elevado rendimiento (Viikari y col., "Hemicellulases for Industrial Applications", En: Bioconversion of Forest and Agricultural Wastes, Saddler, J., ed., CAB International, USA (1993)). Además, en la industria alimentaria, hay una necesidad de usar una combinación adecuada de actividades enzimáticas para degradar el sustrato que contiene elevado contenido de \beta-glucano y hemicelulosa.
La producción eficaz y rentable de xilanasas termoestables es un problema, porque las xilanasas termoestables se originan principalmente a partir de bacterias relativamente no estudiadas, que a menudo producen solamente cantidades mínimas o muy pequeñas de xilanasa. Además, hay poca o ninguna experiencia del cultivo de estos microbios en un fermentador o no hay procesos de fermentación disponibles. Además, estos microbios pueden ser inadecuados para producción a escala industrial. Por otro lado, se sabe que los hongos filamentosos como Aspergillus y Trichoderma producen grandes cantidades de proteínas, en una escala industrial. En particular, estos hongos han demostrado ser adecuados para la producción de proteínas homólogas o heterólogas de origen fúngico.
Hay muy pocos informes relacionados con la producción de proteínas o enzimas de origen bacteriano en hongos filamentosos: se ha informado de la producción de endoglucanasa a partir de Cellulomonas fimi (Gwynne y col., Bio/Technology 5: 713-719 (1987); y \beta-glucuronidasa a partir de E. coli (Punt y col., J. Biotechnol. 17:19-34 (1991) en A. nidulans. De estas enzimas, la endoglucanasa se secretó en el medio de cultivo por Aspergillus nidulans en elintervalo de10-15 mg de proteína por litro, la \beta-glucuronidasa fue solamente detectable de forma intracelular.
Muchos de los estudios sobre la expresión génica heteróloga se han referido a genes de mamíferos (van den Hondel y col., Heterologus gene expression in filamentous fungi, Ed. Bennett y Lasure. More Gene Manipulations in Fungi Academic Press, San Diego, U.S.A., pág. 396-428 (1991); Gouka y col., efficient production of secreted proteins by Aspergillus: progress, limitations and prospects, Appl. Microbiol. Biotechnol. 47:1-11(1997)). Hasta ahora, los rendimientos iniciales de enzimas eucariotas en hongos filamentosos han estado en un intervalo de decenas de mg por litro en cultivos de matraz en agitación. En la publicación de patente internacional WO 90/15860 se describió la secreción de quimiosina por A. niger var. awamori usando una fusión al gen homólogo de glucoamilasa. Nyyssönen y col., Bio/Technology 11:591-595 (1993) y Nyyssönen y col., Can. J. Bot. 73 (Supl.1): S885-S890 describen la producción de fragmentos de anticuerpos en Trichoderma reesei. El mejor rendimiento de fragmentos de anticuerpos cuando se produjeron como una fusión al gen de la celobiohidrolasa 1 de T. reesei estuvo en el intervalo de 40 mg por litro en un cultivo de matraz en agitación.
La invención se refiere, entre otros, a vectores de expresión recombinante para producir, es decir, expresar y secretar, xilanasas que se originan a partir de bacterias, especialmente de actinomicetes. El propósito principal de la invención es proporcionar un vector de expresión alternativo para producir xilanasas que se originan a partir de actinomicetes en hongos filamentosos, Trichoderma.
Las características de la presente invención son como se exponen en las reivindicaciones.
La presente invención se refiere a un vector de expresión recombinante para la producción de proteínas o enzimas bacterianas, especialmente xilanasas de actinomicetes en un huésped fúngico filamentoso Trichoderma, más preferiblemente en T. reesei. Dicho vector comprende un promotor unido de forma funcional a una secuencia de ADN que codifica uno o más dominios funcionales de una proteína secretable de hongo filamentoso, preferiblemente un dominio de cola de una celulasa o un dominio central y de bisagra de una mananasa derivada de Trichoderma,que a su vez abarca la secuencia de ADN, por ejemplo, la SEC ID Nº 1 o SEC ID Nº 3, o equivalentes de las mismas, que codifican una proteína bacteriana, preferiblemente una xilanasa de actinomicetes, más preferiblemente xilanasade 35 kD (AM35) o de 50 kD (AM50) de Actinomadura flexuosa, es decir la SEC ID Nº 2 o la SEC ID Nº 4 o equivalentes de las mismas.
También se proporcionan secuencias peptídicas de proteína de 35 kDa y 50 kDa de A. flexuosa usadas para identificar y caracterizar las secuencias proteicas. Dichos péptidos se designan SEC ID Nº 6, SEC ID Nº 7, SEC ID Nº 8, SEC ID Nº 9 y SEC ID Nº 10.
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Los promotores preferidos de la presente invención son promotores de una proteína secretable de hongo filamentoso, más preferiblemente un promotor de cbh1 de T reesei.
Ejemplos de vectores de expresión recombinantes son los plásmidos pALK945, pALK948, pALK1021 y
pALK1022, que se construyen como se muestra en la figura 17 y contienen la SEC ID Nº 11, SEC ID Nº 13, SEC ID Nº 15 y SEC ID Nº 17, respectivamente y que codifican las secuencias de aminoácidos que comprenden la SEC ID Nº 12, SEC ID Nº 14, SEC ID Nº 16, y SEC ID Nº 18 como se muestra en la Figura 19.
Todas las proteínas que comprenden la SEC ID Nº 12, SEC ID Nº 14, SEC ID Nº 16, y SEC ID Nº 18 tienen una secuencia de ADN N-terminal SEC ID Nº 5, que es idéntica a la secuencia N-terminal de la xilanasa de A. flexuosa de tipo silvestre (D-T-T-I-T-Q).
La presente invención proporciona adicionalmente una preparación que contiene una o más proteínas o enzimas, preferiblemente xilanasas que se originan a partir de bacterias, especialmente de actinomicetes en un medio de cultivo esencialmente sin células, que puede someterse a procedimientos de procesamiento descendente adecuados.
La preparación que contiene enzimas, especialmente xilanasas que se originan a partir de actinomicetes, se puede obtener cultivando huéspedes transformados con los vectores de expresión de la presente invención. Estas preparaciones son útiles, por ejemplo, para blanqueado asistido con enzimas, porque las enzimas son estables a las temperaturas de procesamiento, cuando las temperaturas de procesamiento están en los intervalos de 50-90ºC, preferiblemente 60-85ºC, más preferiblemente 70-80ºC.
Especialmente, dichas preparaciones son útiles para tratar pulpa para la fabricación de papel y para el tratamiento enzimático de biomasa vegetal.
Por lo tanto, el objetivo principal de esta invención es producir de forma más eficaz xilanasas de origen bacteriano en hongos filamentosos tales como Trichoderma. Preferiblemente, el huésped es Trichoderma reesei y las xilanasas se originan a partir de actinomicetes.
La Figura 1 muestra el efecto del pH sobre la actividad de la xilanasa de Actinomadura flexuosa DSM43186 (sobrenadante de cultivo) a 50ºC.
Las Figuras 2A, 2B y 2C muestran el efecto de la temperatura sobre la actividad xilanasa de A. flexuosa DSM43186 (sobrenadante de cultivo) a valores de pH de 6,9, 7,8 y 9,0 y en los momentos puntuales de 0, 30, 60 y 120 minutos. La mayor actividad xilanasa del experimento completo se describe como el 100% y todos los demás valores de actividad son proporcionales al mismo.
La Figura 2A muestra las actividades en una temperatura de 60ºC.
La Figura 2B muestra las actividades en una temperatura de 70ºC.
La Figura 2C muestra las actividades en una temperatura de 80ºC.
La Figura 3 muestra el perfil de elución de cromatografía en DEAE Sepharose CL-6B de xilanasas de A. flexuosa DSM43186.
La Figura 4A muestra el perfil de elución de cromatografía en Fenil Sepharose CL-4B de la combinación I de DEAE de la Figura 3. Se indican las fracciones que se combinaron para proporcionar la muestra DEPS 1/1.
La Figura 4B muestra el perfil de elución de cromatografía en Fenil Sepharose CL-4B de la combinación II de DEAE de la Figura 3. Se indican las fracciones que se combinaron para proporcionar la muestra DEPS II/1 y DEPS II/2.
La Figura 4C muestra el perfil de elución de cromatografía en Fenil Sepharose CL-4B de la combinación III de DEAE de la Figura 3. Se indican las fracciones que se combinaron para proporcionar la muestra DEPS III/1 y DEPS III/2.
La Figura 5A muestra el patrón de tinción proteica con Azul Brillante de Coomassie de las diversas combinaciones cromatográficas. Carril 1: marcadores de peso molecular; carril 2: medio; carril 3: DEPS (Combinación I/1); carriles 4 y 5: DEPS (Combinación II/1 y ll/2, respectivamente); carril 6: vacío; carriles 7 y 8: DEPS (Combinación III/1 y III/2, respectivamente). DEPS: Fracciones después de la cromatografía en DEAE mostrada en la Figura 3 y la cromatografía en Fenil Sepharose mostrada en las Figuras 4A-4C.
La Figura 5B muestra el análisis de transferencia de Western de las diversas combinaciones cromatográficas teñidas en la Figura 5A. Se usó antisuero policlonal producido contra la xilanasa XynA de Thermomonospora fusca para la detección. Carril 1: marcadores de peso molecular; carril 2: medio; carril 3: DEPS (Combinación I/1); carriles 4 y 5: DEPS (Combinación II/1 y II/2, respectivamente); carril 6: vacío; carriles 7 y 8: DEPS (Combinación III/1 y III/2, respectivamente). DEPS: Fracciones después de la cromatografía en DEAE mostrada en la Figura 3 y la cromatografía en Fenil Sepharose mostrada en las Figuras 4A-4C.
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La Figura 6A muestra el perfil de elución de cromatografía en Fenil Sepharose FF del permeado del flujo de DEAE. Se indican los tubos que se combinaron para proporcionar la muestra PF1 y PF2.
La Figura 6B muestra el perfil de elución de cromatografía en Fenil Sepharose FF del concentrado del flujo de DEAE. Se indican los tubos que se combinaron para proporcionar la muestra KF1, KF2 y KF3.
La Figura 7A muestra el patrón de tinción proteica con Azul Brillante de Coomassie de las diversas combinaciones cromatográficas. Las abreviaturas son como en las Figuras 6A y 6B. Carriles 1 y 10: marcadores de peso molecular; carril 2: medio; carril 3: PF1; carril 4: PF2; carril 5: KF1; carril 6: KF2; carril 7: KF3; carril 8: concentrado del flujo de DEAE; carril 9: vacío.
La Figura 7B muestra el análisis de transferencia de Western de las diversas combinaciones cromatográficas teñidas para proteínas en la Figura 7A. Se usó antisuero policlonal producido contra la xilanasa XynA de T. fusca para la detección. Las abreviaturas son como en las Figuras 6A y 6B. Carriles 1 y 10: marcadores de peso molecular; carril 2: medio; carril 3: PF1; carril 4: PF2; carril 5: KF1; carril 6: KF2; carril 7: KF3; carril 8: concentrado del flujo de DEAE; carril 9: vacío.
La Figura 8 muestra la termoestabilidad de la xilanasa de 35 kDa de A. flexuosa (AM35) purificada a 70ºC, pH 6 con y sin albúmina de suero bovino (BSA) añadida. La muestra enzimática se incubó en tampón de McIlvain +/-BSA (100 \mug/ml). Las muestras se recogieron después de 0, 2, 6, y 24 horas de incubación y el ensayo de actividad enzimática se hizo a pH 6,5, 60ºC.
La Figura 9 muestra la termoestabilidad de la xilanasa de 50 kDa de A. flexuosa (AM50) purificada a 70ºC, pH 6 con y sin BSA añadida. La muestra enzimática se incubó en tampón de McIlvain +/- BSA (100 \mug/ml). Las muestras se recogieron después de 0, 2, 6 y 24 horas de incubación y el ensayo de actividad enzimática se hizo a pH 6,5, 60ºC.
La Figura 10A muestra el efecto del pH sobre la actividad de la xilanasa de 35 kDa a 80ºC.
La Figura 10B muestra el efecto del pH sobre la actividad de la xilanasa de 50 kDa a 60ºC (cuadrados cerrados), 70ºC (cuadrados abiertos) y 80ºC (círculos cerrados).
La Figura 10C muestra el efecto del pH sobre la actividad de las xilanasas de 35 kDa (cuadrados cerrados) y de 50 kDa (cuadrados abiertos) a 60ºC con incubaciones de 60 minutos.
La Figura 11 muestra el efecto de la temperatura sobre la actividad de las xilanasas de 35 kDa (cuadrados cerrados) y de 50 kDa (cuadrados abiertos) a pH 7 con incubaciones de 60 minutos.
La Figura 12 es un mapa del plásmido pALK185 (4,5 kb), que contiene el gen de la xilanasa de T. fusca (xynA).
La Figura 13 muestra la secuencia de ADN y la secuencia de aminoácidos de 1375 pb de la xilanasa de 35 kDa de A. flexuosa DSM43186.
La Figura 14 muestra la secuencia de ADN y la secuencia de aminoácidos de 1864 pb de la xilanasa de 50 kDa de A. flexuosa DSM43186.
La Figura 15A muestra una comparación de homología a nivel de aminoácidos entre el péptido AM50 derivado del inserto de 1864 pb y el gen de la xilanasa II de Actinomadura sp. FC7 (Nº de acceso U08894). La figura muestra que había una identidad del 70,7% en un solapamiento de 434 aminoácidos.
La Figura 15B muestra una comparación de homología a nivel de aminoácidos entre el péptido AM50 derivado del inserto de 1864 pb y el gen de la xilanasa A de Streptomyces lividans (xlnA) (Nº de acceso M64551). La figura muestra que había una identidad del 70,3% en un solapamiento de 489 aminoácidos.
La Figura 16 muestra el casete de expresión pALK193 (12 kb) que contiene el casete de expresión para la producción de la xilanasa XynA de T. fusca en T. reesei.
La Figura 17 es un mapa del plásmido pALK1022 (13 kb) que contiene el casete de expresión para la producción de la xilanasa de35 kDa de A. flexuosa en T. reesei.
La Figura 18 es un mapa del plásmido pALK1055 (4,5 kb) que contiene el gen para la xilanasa de 35 kDa de A. flexuosa.
La Figura 19 muestra la secuencia de ADN de la SEC ID Nº 11, SEC ID Nº 13, SEC ID Nº 15 y SEC ID Nº 17 así como las secuencias de aminoácidos correspondientes SEC ID Nº 12, SEC ID Nº 14, SEC ID Nº 16 y SEC ID Nº 18, que comprenden las fusiones entre el núcleo/bisagra de man1 y el gen am35 para pALK945, pALK948, pALK1021 y pALK1022.
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La Figura 20 muestra la estabilidad térmica de la actividad xilanasa a partir de los sobrenadantes de cultivo de A. flexuosa DSM43186 y transformantes de T. reesei elegidos que producen xilanasa de 35 kDa de A. flexuosa. Las muestras de los sobrenadantes de cultivo se incubaron a 70ºC, pH 7 en tampón de McIlvain (se añadió BSA a 100 \mug/ml) durante 0, 15, 30, 60 y 120 minutos después de que se determinaran las actividades xilanasa a partir de la muestra a 70ºC, pH 7 (5 minutos de incubación).
La Figura 21 muestra un análisis de transferencia de Western de los sobrenadantes de cultivo a partir de los transformantes que producen la xilanasa AM35 de A. flexuosa. Se usó antisuero policlonal producido contra la \beta-mananasa purificada (pI 5,4) de T. reesei RutC30 para la detección. Carril 1: marcador de peso molecular preteñido (Bio-Rad, U.S.A.); carriles 2-3: muestra proteica de \beta-mananasa purificada de 53 kDa; carril 4: medio de cultivo de la cepa que produce el núcleo de MANI, ALKO 3620/pALK1010/24; carril 5: medio de cultivo de la cepa huésped de transformación ALKO3620; carriles 6-10: medios de cultivo de los transformantes ALKO3620/pALK945/8, ALKO3620/pALK945/6, ALKO3620/pALK948/7, ALKO3620/pALK1022/29 y ALKO3620/pALK1021/4, respectivamente.
La Figura 22 muestra un análisis de transferencia de Western de sobrenadantes de cultivo de transformantes que producen xilanasa de A. flexuosa. Se usó antisuero policlonal producido contra la xilanasa de 35 kDa purificada de A. flexuosa para la detección. Carril 1: marcador de peso molecular preteñido (Bio-Rad, U.S.A.); carril 2: xilanasa de 35 kDa purificada de A. flexuosa DSM43186; carril 3: muestra proteica de \beta-mananasa de 53 kDa; carril 4: medio de cultivo de la cepa que produce el núcleo de MANI, ALKO36207pALK1010/24; carril 5: medio de cultivo del huésped de transformación ALKO3620; carriles 6-10: medios de cultivo de los transformantes ALKO3620/pALK945/8, ALKO3620/pALK945/6, ALKO3620/pALK948/27, ALKO3620/pALK1022/29 y ALKO3620/pALK1021/4, respectivamente.
Figura 23A: transferencia de Western de muestras de medio de cultivo de una fermentación discontinua de ALKO3620/pALK945/8. Anticuerpo policlonal producido contra la xilanasa de 35 kDa purificada de de A. flexuosa. Carril 1 y 9: patrones de masa molecular preteñidos (LMW, Bio-Rad); carriles 3 a 8: muestras de medio de cultivo después de 7, 6, 5, 4, 3 y 2 días de tiempos de fermentación, respectivamente; carril 2: muestra final después de 7,3 días de fermentación.
Figura 23B: transferencia de Western de muestras de medio de cultivo de una fermentación de laboratorio de ALKO3620/pALK945/6. Anticuerpo policlonal producido contra la xilanasa de 35 kDa purificada de A. flexuosa. Carril 1: patrones de masa molecular preteñidos (LMW, Bio-Rad); carriles 2 a 6: muestras de medio de cultivo después de 1, 2, 3, 4 y 5 días de tiempos de fermentación, respectivamente.
Figura 24: SDS-PAGE de xilanasas purificadas recombinantes de 35 kDa de A. flexuosa y xilanasa de 35 kDa de tipo silvestre de A. flexuosa. Carriles 1 y 8: patrones de masa molecular preteñidos (Bio-Rad); carril 3: xilanasa purificada de tipo silvestre de 35 kDa; carril 4: xilanasa purificada de 33,4 kDa; carril 5: xilanasa purificada de 23,8 kDa; carril 6: xilanasa purificada de 22 kDa; carriles 2 y 7: vacíos.
Figura 25: Dependencia de la temperatura y el pH de xilanasas recombinantes de 35 kDa de A. flexuosa purificadas y de tipo silvestre. Las incubaciones se realizaron a las temperaturas y valores de pH indicados durante 60 min. con xilano de abedul al 1% (p/v) (Roth 7500) como sustrato.
Depósitos
Los plásmidos pALK923, pALK938, pALK939, pALK940, pALK941 y pALK1056 se depositaron en el Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH, Mascheroder Weg 1 b, D-38124 Braunschweig, Alemania con los números de acceso asignados DSM9322, DSM9899, DSM9900, DSM9901, DSM9902 y DSM9903, respectivamente. pALK923 se depositó el 27 de julio de 1994, y pALK938-941 y pALK1056 se depositaron el 3 de abril de 1995.
Los plásmidos pALK927 y pALK928 se depositaron en el DSM el 27 de septiembre de 1994, y con los números de acceso asignados DSM9447 y DSM9448, respectivamente.
Descripción Detallada de las Realizaciones Preferidas I. Definiciones
En la siguiente descripción, se utilizan extensivamente varios términos usados en la tecnología de ADN recombinante. Para proporcionar un entendimiento más claro y coherente de la memoria descriptiva y las reivindicaciones, incluyendo el alcance a dar a dichos términos, se proporcionan las siguientes definiciones.
Vehículo de clonación. Un ADN plasmídico o fágico u otra secuencia de ADN (tal como un ADN lineal) que proporciona un entorno de ácido nucleico apropiado para la transferencia de un gen de interés en un célula huésped. Los vehículos de clonación de la invención pueden diseñarse para que se repliquen de forma autónoma en huéspedes procariotas y eucariotas. En huéspedes fúngicos tales como Trichoderma, los vehículos de clonación generalmente no se replican de forma autónoma y en su lugar, simplemente proporcionan un vehículo para el transporte del gen de interés en el huésped Trichoderma para la inserción posterior en el genoma de Trichoderma. El vehículo de clonación puede caracterizarse adicionalmente por uno o una pequeña cantidad de sitios de reconocimiento de endonucleasas en los que dichas secuencias de ADN pueden cortarse de un modo determinable sin pérdida de una función biológica esencial del vehículo, y en los que el ADN puede sufrir corte y empalme para provocar la replicación y clonación de dicho ADN. El vehículo de clonación puede contener adicionalmente un marcador adecuado para su uso en la identificación de células transformadas con el vehículo de clonación. Los genes marcadores adecuados son, por ejemplo, genes marcadores que proporcionan resistencia a antibióticos, pero también existen otros marcadores útiles, por ejemplo, genes que proporcionan resistencia a biocidas así como a metales pesados, tales como genes que proporcionan resistencia al cobre. Como alternativa, dichos marcadores puede proporcionarse en un vehículo de clonación que es diferente del que suministra el gen de interés usando el llamado sistema de cotransformación. La palabra "vector" a veces se usa para "vehículo de clonación".
Vehículo de expresión. Un vehículo o vector de expresión es similar a un vehículo de clonación pero es capaz de expresar un gen de interés, después de la introducción por transformación en un huésped deseado. Cuando se usa un huésped fúngico, el gen de interés se proporciona preferiblemente a un huésped fúngico como parte de un vehículo de clonación o expresión que se integra en el cromosoma fúngico. Las secuencias que derivan del vehículo de clonación o el vehículo de expresión también pueden integrarse con el gen de interés durante el proceso de integración. Por ejemplo, en T. reesei, el gen de interés puede dirigirse al locus cbh1.
El gen de interés puede colocarse preferiblemente bajo el control de (es decir, unido de forma funcional a) ciertas secuencias de control tales como secuencias promotoras proporcionadas por el vector (que se integran con el gen de interés), si se desea, dichas secuencias de control pueden proporcionarse por el cromosoma del huésped como resultado del locus de inserción.
Las secuencias de control de la expresión en un vector de expresión variarán dependiendo de si el vector está diseñado para expresar un cierto gen en un huésped procariota o eucariota (por ejemplo, un vector lanzadera, puede proporcionar un gen para la selección en diferentes huéspedes microbianos) y pueden contener adicionalmente elementos transcripcionales tales como elementos potenciadores, secuencias de terminación, y/o sitios de inicio y terminación de la traducción.
Homólogo. Por una enzima "homóloga" a un huésped de la invención se entiende que una cepa no transformada de la misma especie que la especie huésped produce de forma natural alguna cantidad de la proteína nativa; por un gen "homólogo" a un huésped de la invención se entiende un gen encontrado en el genoma de una cepa transformada de la misma especie que la especie huésped. Por una enzima "heteróloga" a un huésped de la invención se entiende que una cepa no transformada de la misma especie que la especie huésped no produce de forma natural alguna cantidad de la proteína nativa; por un gen "heterólogo" a un huésped de la invención se entiende un gen no encontrado en el genoma de una cepa no transformada de la misma especie que la especie huésped.
Xilanasa. Como se usa en este documento, una xilanasa es una hemicelulasa que corta los enlaces \beta-1,4 en la cadena xilósica del xilano (el xilano es un polímero de restos D-xilosa que están unidos a través de enlaces \beta-1,4). La actividad xilanasa es sinónima de la actividad xilanolítica. Más específicamente, la actividad xilanolítica significa una actividad similar o idéntica a la actividad xilanolítica de A. flexuosa de 35 kDa (AM35) y A. flexuosa de 50 kDa (AM50), las características, por ejemplo la termoestabilidad se describen más específicamente y se definen en la descripción detallada y los ejemplos.
Por una secuencia de aminoácidos que es un "equivalente" de una secuencia de aminoácidos específica se entiende una secuencia de aminoácidos que no es idéntica a la secuencia de aminoácidos específica, pero en su lugar contiene al menos algunos cambios de aminoácidos (deleción, sustituciones, inversiones, inserciones, etc.) que no afectan de forma esencial a la actividad biológica de la proteína en comparación con una actividad similar de la secuencia de aminoácidos específica, cuando se usa para un propósito deseado. Preferiblemente, una secuencia de aminoácidos "equivalente" contiene una identidad de al menos el 85%-99% a nivel de aminoácidos con la secuencia de aminoácidos específica, más preferiblemente al menos el 90% y en una realización muy preferible especialmente, una identidad de al menos el 95%, a nivel de aminoácidos. En el caso de deleciones mayores, por ejemplo, la retirada de la región de cola, la comparación se realiza con la secuencia de aminoácidos del área correspondiente en la secuencia original.
Dominios Funcionales. La expresión en relación a una proteína fúngica secretable incluye, por ejemplo, la secuencia de señal de secreción o una secuencia señal y prosecuencia de la proteína secretable o parte de la proteína, que contiene secuencias que permiten que las proteínas o construcciones de fusión se secreten. En otras palabras, la expresión "dominio funcional" significa una región de una secuencia de ADN que codifica una región específica de una proteína. En esta invención la expresión "dominio funcional" significa las regiones de la secuencia de ADN que codifica la secuencia de aminoácidos responsable de la función catalítica o enzimática (el dominio central) o la función de unión (el dominio de cola). La función de unión es responsable de la unión de la proteína o enzima respectiva, por ejemplo a xilano o celulosa. El dominio específico también puede ser un dominio de plegamiento, que es responsable de la estructura terciaria de la proteína, por ejemplo, codifica una estructura de \alpha-hélice o lámina \beta de una proteína o una combinación de las mismas. El dominio funcional también puede ser responsable de la actividad inmunológica de la proteína. Por tanto, el "dominio funcional" puede comprender una señal de secreción o la secuencia central o una secuencia responsable del plegamiento de la proteína expuesta anteriormente. Dichos dominios funcionales pueden estar totalmente separados entre sí y ser responsables de la actividad "biológica" de la proteína. Por actividad "biológica" de una secuencia de aminoácidos de la invención se entiende la actividad enzimática, funcional, de plegamiento o unión o una combinación de dichas actividades de la proteína fúngica secretable. En esta invención la expresión "dominio funcional" se refiere específicamente a un dominio de cola de una celulasa o un dominio central y de bisagra de una mananasa, derivando dichos dominios de Trichoderma.
Preparación o preparación enzimática. Por "preparación o preparación enzimática" se entiende una composición que contiene proteínas o enzimas que están presentes en el medio de cultivo y de la que se han retirado las células huésped después de que se haya completado el cultivo o la fermentación. La preparación o preparación enzimática puede procesarse adicionalmente por procedimientos de procesamiento descendente, que son apropiados para la aplicación de la proteína o enzima. Las proteínas o enzimas pueden estar parcial o completamente aisladas y purificadas. Para uso a granel, la preparación o preparación enzimática habitualmente se somete a filtración y/o centrifugación para retirar las células huésped del medio de cultivo usado. Por tanto, la expresión "preparación o preparación enzimática" en la presente invención significa preparaciones enzimáticas sin refinar para su uso a granel, pero también xilanasas de actinomicetes, que pueden estar altamente purificadas por razones especiales.
Por un huésped que es "sustancialmente incapaz" de sintetizar una o más enzimas se entiende un huésped en el que la actividad de una o más de las enzimas enumeradas está deprimida, reprimida, deficiente, o ausente en comparación con el tipo silvestre.
Blanqueado asistido con enzimas. Por "blanqueado asistido con enzimas" se entiende la extracción de lignina residual de la pulpa de fabricación de papel después de la acción de las enzimas de degradación de hemicelulosa con o sin enzimas de degradación de lignina. La retirada o extracción de lignina puede estar restringirse por hemicelulosas físicamente (a través de reprecipitación sobre la superficie de la fibra durante el cocido) o químicamente (a través de complejos lignina-carbohidrato). La actividad hemicelulasa degrada parcialmente la hemicelulosa, que potencia la capacidad de extracción de ligninas por compuestos químicos de blanqueado convencionales (como cloro, dióxido de cloro, peróxido, etc.) (Viikari y col., "Bleaching with Enzymes" en Biotechnology in the Pulp and Paper industry, Proc. 3rd Int. Conf., Stockholm, pág. 67-69 (1986); Viikari y col., "Applications of Enzymes in Bleaching" en Proc. 4th Int. Symp. Wood and Pulping Chemistry, Paris, Vol. 1, pág. 151-154 (1987); Kantelinen y col., "Hemicellulases and their Potential Role in Bleaching" en International Pulp Bleaching Conference, Tappi Proceedings, pág. 1-9 (1988)). La ventaja de esta capacidad de blanqueado mejorada es un menor consumo de compuestos químicos de blanqueado y menores cargas medioambientales o mayores valores de brillo final. En el pasado, esto a menudo se ha conocido como bioblanqueado.
II. Modificación Genética de los Huéspedes de la Invención
El problema de producir proteínas bacterianas, preferiblemente xilanasas de actinomicetes de un modo rentable a gran escala se resuelve produciendo las proteínas en hongos filamentosos, Trichoderma. El procedimiento para producir de forma eficaz proteínas bacterianas en hongos filamentosos se facilita a través de la clonación de secuencias genéticas que codifican la actividad proteica deseada y a través de la expresión de dichas secuencias genéticas en hongos filamentosos. Como se usa en este documento, la expresión "secuencias genéticas" pretende hacer referencia a una molécula de ácido nucleico (preferiblemente ADN). Las secuencias genéticas que codifican las proteínas deseadas incluyen ADN de actinomicetes, ADNc, ADN sintético y combinaciones de los mismos, preferiblemente ADN de actinomicetes, ADNc, ADN sintético y combinaciones de los mismos que codifican xilanasa, más preferiblemente ADN genómico de Actinomadura, ADNc, ADN sintético y combinaciones de los mismos. Pueden usarse sistemas de vector para producir huéspedes para la producción de las preparaciones enzimáticas de la invención. Dicha construcción de vector (a) puede proporcionar adicionalmente una construcción de vector diferente (b) que codifique al menos un gen deseado a integrar en el genoma del huésped y (c) un marcador de selección acoplado a (a) o (b). Como alternativa, puede usarse un vector diferente para el marcador.
Una molécula de ácido nucleico, tal como ADN, se dice que es "capaz de expresar" un polipéptido si contiene secuencias de control de la expresión que contienen información reguladora de la transcripción y dichas secuencias están "unidas de forma funcional" a la secuencia de nucleótidos que codifica el polipéptido.
Un enlace funcional es un enlace en el que una secuencia está conectada a una secuencia (o secuencias) reguladora de tal modo que se coloque la expresión de la secuencia bajo la influencia o control de la secuencia reguladora. Se dice que dos secuencias de ADN (tal como una secuencia que codifica una proteína y una secuencia de la región promotora unida al extremo 5' de la secuencia codificante) están unidas de forma funcional si la inducción de la función promotora provoca la transcripción del ARNm de la secuencia que codifica la proteína y si la naturaleza del enlace entre las dos secuencias de ADN (1) no provoca la introducción de una mutación de cambio de fase, (2) no interfiere con la capacidad de las secuencias reguladoras de la expresión para dirigir la expresión del ARNm, ARN antisentido, o proteína, o (3) no interfiere con la capacidad del molde de transcribirse por la secuencia de la región promotora. Por tanto, una región promotora estaría unida de forma funcional a una secuencia de ADN si el promotor fuera capaz de realizar la transcripción de esa secuencia de ADN.
La naturaleza precisa de las regiones reguladoras necesarias para la expresión génica puede variar entre especies o tipos celulares, pero en general incluirán, según sea necesario, secuencias 5' no transcritas y 5' no traducidas (no codificantes) implicadas en el inicio de la transcripción y la traducción respectivamente.
La expresión de la proteína en los huéspedes transformados requiere el uso de regiones reguladoras funcionales en dichos huéspedes. Puede emplearse una amplia diversidad de secuencias reguladoras de la transcripción y la traducción. En eucariotas, donde la transcripción no está unida a la traducción, dichas regiones de control pueden o no proporcionar un codón de metionina iniciador (AUG), dependiendo de si la secuencia clonada contiene dicha metionina. Dichas regiones, en general, incluirán una región promotora suficiente para dirigir el inicio de la síntesis de ARN en la célula huésped.
Como se sabe ampliamente, la traducción de ARNm eucariota se inicia en el codón que codifica la primera metionina. Por esta razón, es preferible asegurar que el enlace entre un promotor eucariota y una secuencia de ADN que codifica la proteína, o un derivado funcional del mismo, no contiene ningún codón intermedio que sea capaz de codificar una metionina. La presencia de dichos codones provoca la formación de una proteína de fusión (si el codón AUG está en la misma fase de lectura que la secuencia de ADN que codifica la proteína) o una mutación de cambio de fase (si el codón AUG no está en la misma fase de lectura que la secuencia que codifica la proteína).
En una realización preferida, se secreta una proteína deseada en el medio adyacente debido a la presencia de una secuencia señal de secreción. Si una proteína deseada no tiene su propia secuencia señal, o si dicha secuencia no funciona bien en el huésped, entonces la secuencia que codifica la proteína puede unirse de forma funcional a una secuencia señal homóloga o heteróloga al huésped. La secuencia codificante deseada puede unirse a cualquier secuencia señal que permita la secreción de la proteína desde el huésped. Dichas secuencias señal pueden diseñarse con o sin sitios de proteasa específicos de modo que la secuencia peptídica señal sea susceptible a posterior retirada. Como alternativa,
puede usarse un huésped que filtre la proteína en el medio, por ejemplo un huésped con una mutación en su membrana.
Si se desea, las regiones no transcritas y/o no traducidas 3' a la secuencia que codifica una proteína pueden obtenerse por los procedimientos de clonación descritos anteriormente. La región 3' no transcrita puede retenerse por sus elementos de la secuencia reguladora de la terminación de la transcripción; la región 3' no traducida puede retenerse por sus elementos de la secuencia reguladora de la terminación de la traducción, o por los elementos que dirigen la poliadenilación en células eucariotas.
Los vectores de la invención pueden comprender adicionalmente otros elementos reguladores unidos de forma funcional tales como secuencias potenciadoras.
En una realización preferida, se construyen transformantes genéticamente estables por lo cual se integra un ADN proteico deseado en el cromosoma del huésped. Dicha integración puede suceder de novo en la célula o, en una realización más preferida, puede estar ayudada por introducción por transformación de un vector que se inserta funcionalmente por sí mismo en el cromosoma del huésped, por ejemplo, elementos de ADN que promueven la integración de las secuencias de ADN en cromosomas.
Las células que han integrado de forma estable el ADN introducido en sus cromosomas se seleccionan también introduciendo uno o más marcadores que permiten la selección de las células huésped que contienen el vector de expresión en el cromosoma, por ejemplo, el marcador puede proporcionar resistencia a biocidas, por ejemplo, resistencia a antibióticos, o metales pesados, tales como cobre, o similares. El gen marcador de selección puede unirse directamente a las secuencias génicas de ADN a expresar, o introducirse en la misma célula por co-transfección.
Los factores de importancia en la selección de un plásmido particular o vector viral incluyen: la facilidad con que las células receptoras que contienen el vector pueden reconocerse y seleccionarse de aquellas células receptoras que no contienen el vector; la cantidad de copias del vector que se desea en un huésped particular; y si es deseable que sea capaz de "lanzar" el vector entre células huésped de diferentes especies.
Una vez que el vector o la secuencia de ADN que contiene la(s) construcción(es) se ha preparado para la expresión, la(s) construcción(es) de ADN se introduce(n) en una célula huésped apropiada por cualquiera de una diversidad de medios adecuados, incluyendo la transformación como se ha descrito anteriormente. Después de la introducción del vector, las células receptoras se cultivan en un medio selectivo, que selecciona el crecimiento de células transformadas. La expresión de la(s) secuencia(s) clonada(s) provoca la producción de la proteína deseada, o la producción de un fragmento de esta proteína. Esta expresión puede tener lugar de un modo continuo en las células transformadas, o de un modo controlado.
Por consiguiente, las secuencias que codifican proteínas bacterianas pueden unirse de forma funcional a cualquier vector deseado e introducirse por transformación en un huésped fúngico filamentoso seleccionado, preferiblemente un huésped Trichoderma, para proporcionar la expresión de dichas proteínas en ese huésped.
Para facilitar la secreción de la proteína bacteriana, las secuencias que codifican las proteínas bacterianas pueden fusionarse en fase a otras secuencias para construir ADN que codifique una proteína de fusión. Por ejemplo, se fusiona un vector recombinante que codifica un gen de xilanasa de origen actinomicete con la secuencia de uno o más dominios funcionales de celulasa o mananasa de Trichoderma como se describe en los documentos US 5.298.405, WO 93/24622 y en Stalbrand y col., Appl. Environ. Microbiol. 61:1090-1097 (1995). Los dominios funcionales se seleccionan entre el grupo constituido por celobiohidrolasas (CBHI y CBHII), endoglucanasas (EGI y EGII) y mananasa (MANI). MANI tiene la misma estructura de dominio que la de las celulasas: un dominio central, que contiene el sitio activo, un dominio de bisagra que contiene una región rica en serina-treonina, y una cola, que contiene el dominio de unión.
Pueden construirse péptidos de fusión que contengan un dominio central y de bisagra de mananasa N-terminal fusionado con la secuencia de xilanasa de Actinomadura. El resultado es una proteína que contiene las regiones central y de bisagra de mananasa N-terminales, y una xilanasa de Actinomadura C-terminal. La proteína de fusión contiene tanto actividad mananasa como xilanasa de los diversos dominios proporcionados en la construcción de fusión. Una alternativa adicional es usar un gen que codifique un dominio central y de bisagra de mananasa modificado o inactivo fusionado a secuencias de xilanasa de Actinomadura. La proteína de fusión resultante entonces contiene el dominio enzimático modificado o inactivo fusionado a una secuencia bacteriana deseada.
También pueden construirse proteínas de fusión de modo que se incluya la cola de celobiohidrolasa o endoglucanasa, colocada antes de la secuencia de xilanasa de Actinomadura, especialmente para permitir el uso de un sitio de proteasa no específico en la cola como un sitio de proteasa para la recuperación de la secuencia de xilanasa a partir de la proteína de fusión expresada. Como alternativa, pueden construirse proteínas de fusión que proporcionen un sitio de proteasa en un engarce que se coloca antes de la secuencia de xilanasa de Actinomadura.
Por consiguiente, esta invención provoca la producción y secreción de xilanasas de actinomicetes, en huéspedes Trichoderma. La xilanasa de actinomicetes está codificada como una fusión a una secuencia de ADN que codifica un dominio de cola de una celulasa de Trichoderma, o un dominio central y de bisagra de una mananasa de Trichoderma, provocando de este modo un elevado nivel de expresión y secreción. La mejora en la secreción de xilanasas de actinomicetes es más de diez veces en comparación con la producción y secreción de xilanasas de actinomicetes sin una fusión del gen que codifica la xilanasa de actinomicetes a una secuencia de ADN fúngico que codifica un dominio de una proteína secretable. Cuando se produce una proteína de mamífero tipo quimiosina como una proteína de fusión en Aspergillus, el nivel de producción ha sido solamente el 10-20% de los niveles de producción de esta invención (documento WO 90/15860). Asimismo, el nivel de producción de inmunoglobulinas en Trichoderma ha sido solamente el 10-20% de los niveles de producción de esta invención (documento WO 92/01797).
Hay muy pocos informes relacionados con la producción de proteínas o enzimas de origen bacteriano en hongos filamentosos: se ha informado de la producción de endoglucanasa de Cellulomonas fimi (Gwynne y col., Bio/Technology 5: 713-719 (1987)); y \beta-glucuronidasa de E. coli (Punt y col., J. Biotechnol. 17: 19-34(1991)) en A. nidulans. De estas enzimas, la endoglucanasa se secretó en el medio de cultivo en el intervalo de 10-15 mg de proteína por litro, la \beta-glucuronidasa solamente fue detectable de forma intracelular.
Muchos de los estudios sobre expresión de genes heterólogos se han referido a genes de mamíferos (van den Hondel y col., Heterologous gene expression in filamentous fungi, Ed. Bennett y Lasure. More Gene Manipulations in Fungi Academic Press, San Diego, U.S.A., pág. 396-428 (1991)). Hasta ahora, los rendimientos iniciales de enzimas eucariotas en hongos filamentosos han estado en un intervalo de decenas de mg por litro en cultivos de matraz en agitación. En la publicación de patente internacional WO 90/15860 se describió la secreción de quimiosina por A. niger var. awamori usando una fusión al gen homólogo de la glucoamilasa. Nyyssönen y col., Bio/Technology 11:591-595 (1993) describen la producción de fragmentos de anticuerpo en Trichoderma reesei. El mejor rendimiento de fragmentos de anticuerpo es cuando se producen como una fusión al gen de la celobiohidrolasa I de T. reesei en el intervalo de40 mg por litro en un cultivo de matraz en agitación.
III. Las preparaciones enzimáticas de la invención
De acuerdo con la invención, se proporciona un vector de expresión recombinante para producir xilanasas de actinomicetes. Estas enzimas se sintetizan como proteínas de fusión. La proteína vehículo en la fusión es un dominio de cola de una celulasa homóloga, o un dominio central y de bisagra de una mananasa homóloga que se secreta fácilmente desde el huésped Trichoderma.
Las composiciones enzimáticas de la invención satisfacen, por ejemplo, los requisitos de las necesidades específicas en diversas aplicaciones en la industria de la pulpa y el papel. Estas aplicaciones incluyen, por ejemplo, blanqueado potenciado por enzimas de pulpa de fabricación del papel, tratamiento enzimático de las fibras durante la agitación, aumento enzimático de las velocidades de drenaje y retirada de tinta de fibras secundarias así como retirada de depósitos enzimáticos.
La invención se aplica para producir una preparación enzimática parcial o totalmente deficiente en actividad celulolítica (es decir, en la capacidad de degradar la celulosa) y enriquecida en xilanasas deseable para el blanqueado potenciado por enzimas de pulpa química. Por deficiente en actividad celulolítica se entiende una capacidad reducida, disminuida, deprimida, o reprimida de degradar la celulosa. Dichas preparaciones deficientes celulolíticas, y la fabricación de las mismas por procedimientos de ADN recombinante, se describen en el documento US 5.298.405, incorporado en este documento por referencia. Como se describe en este documento, las xilanasas pueden proporcionarse directamente por los huéspedes de la invención (los propios huéspedes se colocan en el medio de procesamiento de la madera). Como alternativa, puede usarse medio usado del cultivo de los huéspedes, o enzimas purificadas del mismo. Además, si desea que estén presentes actividades en más de un huésped recombinante, dichas preparaciones pueden aislarse de los huéspedes apropiados y combinarse para su uso en el procedimiento de la invención.
Para obtener las preparaciones enzimáticas de la invención, los huéspedes recombinantes Trichoderma descritos anteriormente que tienen las propiedades deseadas (es decir, por ejemplo, huéspedes capaces de expresar grandes cantidades de las enzimas xilanasa de actinomicetes y opcionalmente, aquellos que son sustancialmente incapaces de secretar una o más enzimas celulasa) se cultivan en condiciones adecuadas, las xilanasas de actinomicetes deseadas se secretan desde los huéspedes Trichoderma en el medio de cultivo, y la preparación enzimática se recupera de dicho medio de cultivo por procedimientos conocidos en la técnica.
La preparación enzimática es el medio de cultivo con o sin las células huésped nativas o transformadas, o se recupera del mismo por la aplicación de procedimientos conocidos en la técnica. Sin embargo, como las enzimas xilanasa se secretan en los medios de cultivo y presentan actividad en las condiciones ambiente del licor hemicelulolítico, es una ventaja de la invención que las preparaciones enzimáticas de la invención puedan utilizarse directamente del medio de cultivo sin purificación adicional. Si se desea, dichas preparaciones pueden liofilizarse o la actividad enzimática puede concentrarse de otro modo y/o estabilizarse para su almacenamiento. Las preparaciones enzimáticas de la invención son muy económicas de proporcionar y usar porque
(1) las enzimas pueden usarse en una forma sin refinar; es innecesario el aislamiento de una enzima específica del fluido de cultivo y
(2) como las enzimas se secretan en el medio de cultivo, solamente necesita recuperarse el medio de cultivo para obtener la preparación enzimática deseada; no hay necesidad de extraer una enzima de los huéspedes.
Si se desea, puede purificarse adicionalmente una xilanasa expresada de acuerdo con condiciones convencionales, tales como extracción, precipitación, cromatografía, cromatografía de afinidad, electroforesis, o similares.
IV. Identificación y Aislamiento de Xilanasas de Actinomadura flexuosa
Se han identificado, purificado y clonado dos xilanasas de Actinomadura flexuosa. Estas dos xilanasas tienen un pH óptimo y termoestabilidad que son deseables para el blanqueado asistido con enzimas de la pulpa de madera. Una de estas xilanasas tiene un peso molecular de aproximadamente 35 kDa (AM35) y la otra tiene un peso molecular de aproximadamente 50 kDa (AM50).
El intervalo de temperatura óptima para las xilanasas de A. flexuosa en preparaciones sin refinar es de 70-80ºC a pH 6-7. A pH 8, el intervalo de temperatura óptimo de esta preparación de xilanasa es de 60-70ºC. Esto es útil en el blanqueado de pulpa de papel kraft porque después del cocido de papel kraft, el pH de la pulpa es alcalino.
En preparaciones purificadas, AM35 retiene el 80% de su actividad, y AM50 retiene el 90% de su actividad después de 24 horas cuando se incuba en presencia de BSA a pH 6,0 y 70ºC. A 80ºC, tanto AM35 como AM50 son más activas a pH 6 pero ambas muestran una amplia actividad basal entre pH 5 - pH 7, en el que se retiene aproximadamente el 80% de la actividad.
Para el aislamiento de AM35 y AM50, el huésped A. flexuosa está disponible como el número de acceso de depósito DSM43186 de Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH, Mascheroder Weg 1b, D-38124 Braunschweig, Alemania. Ambas formas pueden purificarse por pases a través de una serie de columnas cromatográficas. Una primera etapa de purificación por DEAE Sepharose CL-4B retiene aproximadamente la mitad de la actividad xilanasa cuando la muestra se aplica a pH 8,6-9 en Na_{2}HPO_{4} 12,5 mM; la otra mitad se encuentra en el flujo.
La elución de la actividad xilanasa unida con un gradiente salino provoca una elución de un pico de actividad marcado que eluye antes y un amplio pico de actividad que eluye después. El pico marcado que eluye antes retiene su homogeneidad cuando se somete a cromatografía en Fenil Sepharose CL-4B. Las muestras tomadas del amplio pico de actividad posterior se separan en al menos dos picos cuando se someten a cromatografía en Fenil Sepharose CL-4B. Hay solamente una débil reactividad cruzada de éstas últimas xilanasas que eluyen después con un anticuerpo policlonal dirigido contra la xilanasa de Thermomonospora fusca.
Por SDS-PAGE, el peso molecular de la xilanasa en estas combinaciones de este retenido de DEAE era aproximadamente 50 kDa, mientras que los pesos moleculares de las xilanasas en el flujo de DEAE eran de 30, 35, 40 y 50 kDa. Por tanto, A. flexuosa contiene de cuatro a cinco bandas de proteína xilanasa.
V. Blanqueado Asistido con Enzimas usando las Xilanasas de Actinomadura flexuosa
La presente invención comprende un procedimiento para tratar enzimáticamente biomasa vegetal en condiciones de elevada temperatura de 50-90ºC y pH 5-8, y especialmente 60-85ºC, pH 6-7 y más preferiblemente 70-80ºC y pH 7,0 durante una a dos horas. En una realización preferida, la biomasa vegetal se trata con xilanasas que son capaces de hidrolizar cadenas de xilano en pulpa de madera a pH neutro o moderadamente alcalino y elevada temperatura. Como alternativa, el tratamiento enzimático puede combinarse con fases quelantes (fases de retirada de metal) en las que típicamente se usan elevadas temperaturas pero bajos valores de pH (4-6).
La pulpa de madera es un material compuesto que consta principalmente de una matriz de celulosa, hemicelulosa, y lignina. Un procedimiento común para la producción de pulpa de madera es el pulpeo químico. Un modo típico de pulpeo químico es cocido en sulfato alcalino, llamado cocido de papel kraft. En las condiciones de procesamiento (elevadas temperaturas y elevada alcalinidad), los compuestos químicos de cocido extraen la lignina de la pulpa. Sin embargo, no toda la lignina se retira durante el cocido, sino que parte de ella (aproximadamente el 5%) permanece en la pulpa. Esta lignina residual tiene que retirarse para obtener pulpa adecuada para la producción de papel.
Se han desarrollado muchos procedimientos para la retirada de lignina residual. Típicamente, la pulpa de madera se trata con cloro u otros compuestos químicos tóxicos para retirar el componente de lignina y proporcionar una pulpa blanqueada. Sin embargo, los sub-productos tóxicos de este tratamiento químico tienen un impacto negativo sobre la salud y estabilidad del entorno en que se liberan. Por consiguiente, existe una gran necesidad de desarrollar técnicas alternativas, más protectoras con el medio ambiente para el blanqueado de la pulpa. El tratamiento de la pulpa cocida con enzimas que degradan parcialmente la hemicelulosa, por ejemplo, xilano, en la pulpa, modifica la pulpa de modo que la lignina llega a ser más fácil de extraer o retirar. Esto conduce a una capacidad de blanqueado mejorada que a su vez da las ventajas de menor consumo de compuestos químicos blanqueantes y menores cargas ambientales y/o mayor brillo final.
El uso del vector de expresión recombinante de la presente invención para la producción de xilanasas de actinomicetes proporciona una técnica de blanqueado asistido con enzimas por la cual pueden usarse xilanasas termoestables y neutras en condiciones tales que se disminuye o elimina la necesidad de ajustar el pH y la temperatura después de la etapa de cocido.
En una realización preferida, dicha técnica se realiza in vitro enpulpa de madera. La técnica implica colocar la preparación enzimática, medio de cultivo, o mezcla concentrada que contiene xilanasa en contacto con la pulpa de madera. Los cálculos de rutina posibilitan que los especialistas en la técnica determinen la dosificación de la enzima xilanasa usada, pH y temperatura de tratamiento y otros parámetros variables.
Dicha técnica de blanqueado asistido con enzimas puede aplicarse sola o como un suplemento a otros tratamientos que mejoran la retirada de lignina de la pulpa de madera. En una realización preferida, la presente invención se usa para potenciar la capacidad de blanqueado de pulpas de madera, especialmente pulpas químicas.
En una realización preferida, las xilanasas usadas en dicho blanqueado asistido con enzimas son preferiblemente aquellas de A. flexuosa, y especialmente las xilanasas de 35 kDa y/o 50 kDa de A. flexuosa. Es especialmente útil el medio de cultivo que puede proporcionarse por un huésped recombinante que se ha transformado con los vectores de expresión de la invención.
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VI. Realizaciones Preferidas y Adicionales y Aplicabilidad de la Invención
La invención describe un procedimiento mejorado para expresar y secretar xilanasas originadas por bacterias, especialmente por actinomicetes, en hongos filamentosos usando técnicas de proteínas de fusión. Se han obtenido niveles de producción y secreción más de 50 veces mayores que los observados en las cepas de actinomicetes originales. Los niveles de producción y secreción eran más 10 veces mayores que los previamente observados cuando se producen enzimas heterólogas (de mamífero o bacterianas) en hongos filamentosos. El propósito principal de la invención es proporcionar un procedimiento para producir xilanasas originadas por bacterias, especialmente actinomicetes, en hongos filamentosos, Trichoderma.
Por tanto, la invención se refiere a un vector de expresión recombinante para la producción de xilanasas de actinomicetes en un huésped Trichoderma. Dicho vector comprende un promotor unido de forma funcional a una secuencia de ADN de uno o más dominios funcionales de una proteína de hongo filamentoso secretable, que se fusiona en fase con una secuencia de ADN que codifica una xilanasa de actinomicetes.
Generalmente, la secuencia de ADN que codifica la proteína de hongo filamentoso secretable codifica una enzima, tal como celulasas o hemicelulasas. Las enzimas son homólogas al hongo filamentoso secretor, por ejemplo Trichoderma. En las realizaciones más preferidas de la invención, la secuencia de ADN que codifica la proteína de hongo filamentoso secretable es una enzima, que se sabe que se secreta en cantidades significativas en T. reesei.
Las proteínas o enzimas útiles para proporcionar los objetivos de la invención son celulasas de Trichoderma y mananasas de Trichoderma pero las proteínas de hongo filamentoso secretables más preferidas son las siguientes enzimas, que son homólogas a Trichoderma, es decir celobiohidrolasas (CBHI y CBHII), endoglucanasas (EGI y EGII), y mananasa (MANI). Es especialmente útil para la invención un dominio de cola de una celulasa de Trichoderma, o un dominio central y de bisagra de una mananasa de Trichoderma.
Las secuencias de aminoácidos y ADN de las enzimas y dominios mencionados anteriormente son bien conocidos a partir de la bibliografía y algunos se describen a continuación en los ejemplos de la presente invención. Los especialistas en la técnica pueden, usando dichas secuencias, construir una multitud de vectores de expresión útiles alternativos de acuerdo con los principios expuestos en esta solicitud.
Como el objetivo principal de la invención es la producción de xilanasas originadas por actinomicetes, el vector de expresión recombinante de la presente invención comprende una secuencia de ADN que codifica una xilanasa originada por un actinomicete.
Los ejemplos de dichas secuencias de ADN útiles son aquellas que pueden obtenerse de la secuencia de ADN de A. flexuosa SEC ID Nº 1 que codifica la secuencia de aminoácidos de la SEC ID Nº 2 o la secuencia de ADN SEC ID Nº 3 que codifica la secuencia de aminoácidos de la SEC ID Nº 4 o equivalentes de dichas secuencias de aminoácidos, donde dichos equivalentes tienen una identidad de al menos el 85% a nivel de aminoácidos con la SEC ID Nº 2 o la SEC ID Nº 4 y una actividad xilanolítica similar a la de la SEC ID Nº 2 o la SEC ID Nº 4. También se describen a continuación las secuencias de aminoácidos llamadas SEC ID Nº 12, SEC ID Nº 14, SEC ID Nº 16, y SEC ID Nº 18 en los ejemplos, representando las secuencias las fusiones entre la región central y de bisagra de MANI y el gen de xilanasa de A. flexuosa.
Las secuencias de ADN útiles pueden encontrarse, por ejemplo, en los plásmidos pALK923 (DSM9322), pALK938 (DSM9899), pALK939 (DSM9900, pALK940 (DSM9901), pALK941 (DSM9902) y pALK1056 (DSM9903) que codifican la xilanasa AM35 de Actinomadura flexuosa y el plásmido pALK927 (DSM9447) y el plásmido pALK928 (DSM9448) que codifican la xilanasa AM50 de Actinomadura flexuosa.
Los promotores preferidos en los vectores de expresión de ADN recombinantes de la presente invención son los de una proteína de hongo filamentoso secretable, más preferiblemente un promotor de cbh1 de T. reesei.
Ejemplos de vectores de expresión recombinantes preferidos son los plásmidos pALK945, pALK948, pALK1021 y pALK1022. El plásmido pALK1022 se muestra en la Figura 17. Las construcciones de los otros tres plásmidos son esencialmente iguales al plásmido pALK1022 con la excepción de que las secuencias de engarce son como las descritas con detalle en los ejemplos, por ejemplo, la SEC ID Nº 11, SEC ID Nº 13, SEC ID Nº 15 y SEC ID Nº 17. Dichos vectores de expresión se usan para transformar hongos filamentosos, tales como Trichoderma, más preferiblemente T. reesei.
Los huéspedes transformados con dichos vectores de expresión producen xilanasas que tienen toda la secuencia de aminoácidos N-terminal SEC ID Nº 5, que es idéntica a la secuencia N-terminal (D-T-T-T-I-T-Q) de la xilanasa de A. flexuosa de tipo silvestre.
Los huéspedes transformados son capaces de expresar y secretar una o más proteínas o enzimas, preferiblemente xilanasas originadas por actinomicetes en el medio de cultivo durante el cultivo o fermentación.
Después del cultivo y retirada de las células huésped por filtración, centrifugación etc., el medio de cultivo como tal o concentrado proporciona una proteína útil o preparación enzimática, que puede someterse a procedimientos de procesamiento descendente adicionales para estabilidad y capacidad de almacenamiento mejorados. Como alternativa, la preparación puede someterse a aislamiento y purificación para obtener la proteína o enzima deseada originada por bacterias o actinomicetes en forma más purificada.
Ejemplos de procedimientos descendentes útiles del medio de cultivo usado son, por ejemplo, filtración, ultrafiltración, precipitación, centrifugación, secado, evaporación, inmovilización, granulación, etc.
La preparación que contiene enzimas, especialmente xilanasas originadas por actinomicetes y que se pueden obtener cultivando huéspedes transformados con los vectores de expresión de la presente invención son útiles, por ejemplo, para el blanqueado asistido con enzimas porque las enzimas son estables a las temperaturas de procesamiento, cuando las temperaturas de procesamiento están en los intervalos de 50-90ºC, preferiblemente 60-85ºC, más preferiblemente 70-80ºC.
Dichas preparaciones también son útiles para tratar pulpa de papel y para tratar enzimáticamente biomasa vegetal.
Por tanto, la presente invención proporciona un vector de expresión recombinante para producir una preparación que contiene xilanasa de origen actinomcete en un huésped fúngico filamentoso Trichoderma, uniendo de forma funcional en dichosvectores de expresión recombinante un promotor a una secuencia de ADN que codifica un dominio de cola de una celulasa de Trichoderma o un dominio central y de bisagra de una mananasa de Trichoderma, que a su vez contiene, fusionada en fase, una secuencia de ADN que codifica una xilanasa de actinomicetes; después transformando un huésped Trichoderma con los vectores construidos de este modo y cultivando dichos huéspedes transformados en un medio de cultivo y en condiciones de cultivo, que son óptimas para la secreción de la enzima. Después del cultivo, las células huésped se separan del medio de cultivo, que puede usarse como una preparación enzimática como tal o en forma concentrada o después de someterse a procedimientos de procesamiento descendente adecuados.
La invención se describe con mayor detalle en los siguientes ejemplos. Estos ejemplos muestran solamente unas pocas aplicaciones concretas de la invención. Es evidente para los especialistas en la técnica que se pueden crear varias aplicaciones similares.
Ejemplos Ejemplo 1 Cultivos de Matraz en Agitación y Fermentador de Actinomadura flexuosa DSM43186
La cepa A. flexuosa DSM43186 se sembró en estrías en placa de medio mineral de hojuelas de avena (Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH [Colección alemana de microorganismos y cultivos celulares] DSM Catalogue of strains, 3rd ed., Braunschweig, Alemania (1983); 1 litro contiene 20 g de agar, 20 g hojuelas de avena, 1 ml de solución de elementos traza que contienen 100 mg de FeSO_{4} x 7H_{2}O,100 mg de MnCl_{2} x 4H_{2}O, 100 mg de ZnSO_{4} x 7H_{2}O/100 ml; pH 9,0) y se incubó a 50ºC hasta la esporulación. Se inoculó una colonia esporulante en 10 ml de medio XPYB (Greiner-Mai, E. y col., System. Appl. Microbiol. 9:97-109 (1987); Holtz, C. y col., Antonie van Leeuwenhoek 59:1-7 (1991)); 1 litro contiene 5 g de xilano de espelta de avena, 5 g peptona de caseína, 5 g de extracto de levadura, 5 g extracto de carne, 0,74 g de CaCl_{2} x 2H_{2}O; pH 9,0) y se incubó a 55ºC en un agitador rotatorio (250 rpm) durante dos a tres días. Después se transfirió un inóculo de 5 ml a 250 ml del mismo medio y se incubó en las mismas condiciones durante tres días. La actividad xilanasa obtenida fue de 17 nkat/ml.
El procedimiento para dos fermentaciones de 1 l (Biostat M, B. Braun, Alemania) se preparó como anteriormente. Se usó inóculo al 10% (v/v) para las fermentaciones. El pH se mantuvo a pH 7,8 \pm 0,2 por la adición de amoniaco (12,5% (v/v)) y ácido fosfórico (17% (v/v)), la temperatura de fermentación fue 50ºC. El fermentador se agitó a 400 rpm y el flujo de aire fue 1 l/min. Las actividades xilanasa obtenidas fueron 32 y 58 nkat/ml (medidas a pH 6,0 y 60ºC con 5 minutos de tiempo de incubación). Los medios de cultivo de los cultivos se usaron en purificación de proteínas y experimentos de blanqueado.
Las actividades xilanasa en todos los ejemplos se midieron de acuerdo con Bailey, M.J. y col., J. Biotechnol. 23: 257-270 (1992) usando xilano de abedul al 1% (p/v) (Roth nº 7500) como sustrato. Las condiciones de ensayo fueron, si no se indica otra cosa, pH 5,3 y 50ºC con un tiempo de incubación de 5 minutos. Una unidad xilanasa (1 nkat) se define como la cantidad de enzima que produce la reducción de carbohidratos que tienen una fuerza de reducción correspondiente a un nmol de xilosa en un segundo a partir de xilano de abedul en condiciones de ensayo. La Unidad Internacional (UI) se define como la cantidad de enzima que produce un micromol de producto final medido en un minuto a partir del sustrato polimérico, entonces 1 UI = 16,67 nkat.
Ejemplo 2 Determinación del pH y Dependencias de la Temperatura de la Actividad Xilanasa de Actinomadura flexuosa a partir del Medio de Cultivo
Para determinar la dependencia del pH para la actividad xilanasa de A. flexuosa, las muestras del medio de cultivo del cultivo de matraz en agitación (Ejemplo 1) se diluyeron en tampones de McIlvain 50 mM (ácido cítrico 50 mM - Na_{2}HPO_{4} 100 mM) del intervalo de pH 3,0-11,0. Los valores de pH finales de las mezclas de tampón y enzima fueron 3,5, 4,5, 5,4, 6,4, 7,2, 8,0, 8,5, 9,7 y 11,2. La actividad xilanasa se midió en cada pH a 50ºC, 5 min. de reacción. La actividad xilanasa mostró un 80-100% de su actividad máxima en el intervalo de pH de aproximadamente 5,4-8,0, que muestra actividad máxima a aproximadamente pH 6,4 (Figura 1).
Para la determinación de la estabilidad térmica, las muestras del sobrenadante de cultivo se diluyeron en tampón de McIlvain 50 mM. Se añadió albúmina de suero bovino (BSA) a una concentración de 100 \mug/ml y se añadieron 10 \mug/ml de pepstatina A así como 174 \mug/ml de fluoruro de fenil metil sulfonilo (PMSF) como inhibidores de proteasa. Los valores de pH final de las mezclas de tampón y enzima fueron 6,9, 7,8 y 9,0. Las muestras se incubaron en ausencia del sustrato a 60ºC, 70ºC y 80ºC. Las muestras se tomaron a intervalos de 0, 30, 60 y 120 minutos y se enfriaron inmediatamente en hielo antes de la determinación de la actividad xilanasa residual a 50ºC (5 min. de reacción en el pH correspondiente). La enzima era muy estable cuando se incubaba a 60ºC y 70ºC; después de 120 minutos de incubación a 70ºC a pH 9 se retenía más del 60% de la actividad xilanasa (Figura 2A, 2B y 2C).
Ejemplo 3 Purificación de Xilanasas de Actinomadura flexuosa
La purificación de xilanasas de medio de cultivo de A. flexuosa se realizó a +4ºC con columnas cromatográficas acopladas a un aparato de FPLC (Pharmacia). Las mediciones de actividad xilanasa se realizaron a 50ºC y a pH 6,5. La proteína se controló a 280 nm en toda la purificación. Las muestras se procesaron en geles de bloque de poliacrilamida que contenían SDS al 0,1% en un sistema de electroforesis Bio-Rad Mini Protean II y se tiñeron con Azul Brillante de Coomassie. Se usó un anticuerpo policlonal preparado contra la xilanasa A XynAde Thermomonospora fusca, obtenido del Prof. David Wilson, (Cornell University, Nueva York) para detectar la(s) xilanasa(s) de A. flexuosa en transferencias de Western. En la detección, se usó un Sistema ProtoBlot AP de Promega.
Se combinó un medio de cultivo de las dos fermentaciones de 1 l descritas en el Ejemplo 1 y se centrifugó a 8.000 g durante 30 min. El sobrenadante (1.500 ml) se diluyó 1 + 2 con Na_{2}HPO_{4} 12,5 mM pH 9 y se ajustó a pH 8,6 con NaOH 1 M. Esta muestra se aplicó, en dos series, en un intercambiador de iones de DEAE Sepharose CL-6B (Pharmacia) (2,5 x 29 cm) equilibrado con Na_{2}HPO_{4} 12,5 mM, pH 9, a 100 ml/h. El flujo de las dos realizaciones se combinó y se procesó por separado como se describe a continuación.
La elución de las proteínas unidas de la columna de DEAE (Figura 3) se consiguió por un gradiente lineal (400 ml + 400 ml) de Na_{2}HPO_{4} 25 mM pH 9, a Na_{2}HPO_{4} 25 mM, pH 9 que contenía NaCl 1 M a un caudal de 105 ml/h y se recogieron fracciones de 10 ml. Pudieron recogerse dos picos que contenían actividad xilanasa (combinación I y II), así como una larga "línea" del segundo pico (combinación III).
Las tres combinaciones (cada una combinada a partir de dos realizaciones con DEAE) se ajustaron para que contuvieran cloruro sódico 2 M cada una y se aplicaron por separado en una columna de Fenil Sepharose CL-4B (Pharmacia) (2,5 x 15 cm) equilibrada con Na_{2}HPO_{4} 25 mM, pH 9 que contenía NaCl 2 M. La elución se realizó a 100 ml/h con un gradiente de dos etapas de tampón A al 100% (Na_{2}HPO_{4} 25 mM, pH 9) a tampón B al 35% (Na_{2}HPO_{4} 25 mM que contenía etilenglicol al 60%) en 60 min. seguido de un gradiente más brusco de B al 35% a B al 100% en 60 min. Se recogieron fracciones de 7 ml (combinación I) o 5 ml (combinaciones II y III). Las fracciones que contenían actividad xilanasa de la combinación I obtenidas se combinaron y llamaron DEPS I (Figura 4A). Ambas combinaciones de DEAE II y III produjeron dos picos que contenían actividad xilanasa llamados DEPS II/1, DEPS II/2 (Figura 4B) y DEPS III/1, DEPS III/2 (Figura 4C), respectivamente.
Las muestras de estas combinaciones se dializaron frente a Na_{2}PO_{4} 25 mM, pH 9, durante una noche y se procesaron en SDS-PAGE y se tiñeron para las proteínas con Azul de Coomassie (Figura 5A) así como se analizaron por transferencias de Western con anticuerpo contra T. fusca (Figura 5B). El anticuerpo reaccionó solamente con dos a tres bandas de masa molecular más pequeña (35 kDa o inferior) a partir del medio de cultivo y ligeramente con las proteínas en estas combinaciones. Las masas moleculares aparentes de las proteínas en estas combinaciones fueron de 50 kDa estimadas de SDS-PAGE con patrones de masa molecular. Las combinaciones DEPS II/2, DEPS III/1 y DEPS III/2 fueron las más puras.
El flujo del intercambiador de iones de DEAE (véase anteriormente) se concentró con una membrana de límite de 30 kDa. Casi la mitad de la actividad xilanasa se encontró en el concentrado y la mitad en el permeado. Ambos se ajustaron para que contuvieran NaCl 2 M y se aplicaron en una columna de Fenil Sepharose 6 FastFlow (bajo sub; Pharmacia) (2,5 x 34 cm) equilibrada con Na_{2}HPO_{4} 25 mM, pH 9, que contenía NaCl 2 M. La elución se consiguió a 300 mlh^{-1} con el mismo gradiente que se usó para las combinaciones de DEAE en Fenil Sepharose CL-6B y se recogieron fracciones de 10 ml. Los picos que contenían actividad xilanasa obtenidos se llamaron KF1, KF2 y KF3 (Figura 6B). El permeado de la concentración se sometió a una realización idéntica en Fenil Sepharose 6 FastFlow (bajo sub), y las fracciones que contenían actividad xilanasa se llamaron PF1 y PF2 (Figura 6A). Estos picos se dializaron durante una noche frente a Na_{2}HPO_{4} 25 mM, pH 9, y se analizaron en SDS-PAGE así como en transferencias de Western (Figura 7A y 7B). El primer pico, KF_{1}, del concentrado mostró una banda de masa molecular aparente de 40 kDa en SDS-PAGE, pero no mostró reacción en transferencias de Western. Sin embargo, este pico tenía la mayor actividad xilanasa. KF2 mostró una banda de 50 kDa en SDS-PAGE que reaccionaba débilmente con el anticuerpo, pero podía verse una clara banda de 30 kDa en transferencias de Western. El tercer pico, KF3, mostró una banda de 35 kDa en transferencias de Western. El concentrado contenía xilanasas con pesos moleculares aparentes de 50, 40, 35 así como 30 kDa. El primer pico, PF1, del permeado reaccionó con anticuerpo contra A. fusca que mostró dos bandas de 35 kDa y 30 kDa,
respectivamente. PF2, por otro lado, mostró solamente una banda de 35 kDa en transferencias de Western.
Como resumen, el medio de cultivo de A. flexuosa sp. DSM43186 contiene xilanasas con masa molecular de aproximadamente 50 kDa (representada por las combinaciones DEPSII/2, DEPSIII/1 y DEPSIII/2), 40 kDa (representada por la combinación KF1), 35 kDa (representada por las combinaciones PF2 y KF3) y 30 kDa (representada por la combinación KF2). De éstas, las proteínas de 35 kDa y 50 kDa aparecen con las bandas de xilanasa principales (en SDS-PAGE). Es posible que la banda de xilanasa de 40 kDa en SDS-PAGE sea un producto de degradación de la banda de 50 kDa en SDS-PAGE y que la banda de 30 kDa en SDS-PAGE sea un producto de degradación de la banda de xilanasa de 35 kDa en SDS-PAGE.
Ejemplo 4 Producción y Secuenciación de Péptidos de las Xilanasas de 35 kDa y 50 kDa Purificadas
Una muestra (12 ml) de la combinación I de la realización de DEAE Sepharose CL-6B (Fig. 3) se sometió a cromatografía de exclusión en gel sobre una columna HighLoad 26/60 Superdex G75 (Pharmacia) equilibrada con Na_{2}HPO_{4} 25 mM, pH 9 a 120 ml/h. Una muestra (25 ml) de la fracción del pico que contiene actividad xilanasa obtenida se diluyó (1 + 1) con agua y se aplicó en un intercambiador de iones mono Q (Pharmacia) con Na_{2}HPO_{4} 12,5 mM, pH 9. La elución se realizó a 30 ml/h con un gradiente lineal de Na_{2}HPO_{4} 12,5 mM, pH 9 a Na_{2}HPO_{4} 12,5 mM, pH 9 que contenía NaCl 0,5 M en 50 min. El pico que contenía actividad xilanasa (1 ml) se concentró en un micro concentrador Centricon (límite 30 kDa) y se eluyó con bicarbonato de amonio al 1%. Esta muestra concentrada que contenía una única banda de proteína de 50 kDa en SDS-PAGE se evaporó y se alquiló con vinilpiridina. La muestra alquilada se digirió con tripsina (tripsina modificada, sequenal grade, Promega V5111). La digestión se aplicó en una columna de fase inversa acoplada a una HPLC, y se recogieron manualmente los picos que absorbían a 214 nm. Cada fracción recogida se sometió a degradación de Edman en un secuenciador de fase líquida con pulsos de gas (Kalkkinen & Tilgmann, J. Protein Chem. 7:242-243 (1988)) y los aminoácidos PTH liberados se analizaron en línea usando HPLC de orificio estrecho de fase inversa.
Una muestra de xilanasa de 35 kDa purificada (esencialmente purificada como se ha descrito en el Ejemplo 3) se sometió a Degradación de Edman como anteriormente.
Los péptidos obtenidos de la xilanasa de 50 kDa purificada y la secuencia N-terminal de la xilanasa de 35 kDa purificada se enumeran en la Tabla 1.
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TABLA 1 Péptidos de xilanasa de 50 kDa purificada y la secuencia N-terminal de la xilanasa de 35 kDa purificada
1
La combinación de las secuencias peptídicas de xilanasa de 50 kDa Nº 1696 (SEC ID Nº 6), Nº 1697 (SEC ID Nº 7), Nº 1698 (SEC ID Nº 8) y Nº 1704 (SEC ID Nº 10) corresponde con una similitud del 75% a los aminoácidos 42-89 de laxilanasa A de Streptomyces lividans (número de acceso M64551). El péptido Nº 1703 no tiene asignada ninguna SEC ID Nº, a causa de la multitud de alternativas presentes en la secuencia y porque no está reivindicada. Además, el péptido Nº 1699 (SEC ID Nº 9) muestra una similitud del 78% con los aminoácidos 301-309 de XlnA de S. lividans:
2
Las secuencias de S. lividans están presentes solamente para comparación.
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Ejemplo 5 Las Propiedades de pH y Estabilidad a la Temperatura de las Xilanasas de 35 kDa y 50 kDa Purificadas
La estabilidad a la temperatura de las enzimas de 35 y 50 kDa purificadas con o sin 100 \mug/ml de BSA se determinó incubando las muestras enzimáticas a 70ºC, pH 6,0 durante un periodo de 0, 2, 6 y 24 horas después de que se hubiera determinado la actividad xilanasa de las muestras (a pH 6,5, 60ºC, 20 min. de reacción). En las muestras en las que se había añadido BSA, podía medirse más del 80% de la actividad original incluso después de 24 h de incubación (Figuras 8 y 9 para las xilanasas de 35 kDa y 50 kDa, respectivamente). Cuando no se añadía BSA, aún podía medirse aproximadamente el 60% (35 kDa) o el 70% (50 kDa) de la actividad original después de 24 h de incubación (Figuras 8 y 9).
La dependencia del pH se determinó incubando las muestras enzimáticas a diferentes valores de pH (pH 4-8) y a temperaturas de 80ºC (35 kDa) y 60, 70 y 80ºC (50 kDa) durante 20 minutos (35 kDa) o 10 minutos (50 kDa). A 80ºC, la xilanasa de 35 kDa mostró un pH óptimo de aproximadamente pH 6 que tiene casi un 90% de su actividad de aproximadamente pH 5 a 7 (Figura 10A). A 60ºC y 70ºC, la xilanasa de 50 kDa mostró un pH óptimo de pH 5-7 y a 80ºC, un pH óptimo de pH 6-7. La enzima fue muy estable de pH 5-7 en estas condiciones (Figura 10B). La incubación de ambas xilanasas de 35 kDa y 50 kDa a 60ºC durante 60 minutos a valores de pH de 4,2 a 8,7 mostró una estabilidad similar a la encontrada en el experimento anterior, excepto en que la xilanasa de 50 kDa parece ser menos estable a pH 4,2 en estas condiciones (Figura 10C). Los experimentos de dependencia de la temperatura a pH 7 con incubaciones de 60 minutos de las xilanasas de 35 kDa y 50 kDa con sustrato a temperaturas de 50, 60, 70 y 80ºC mostraron actividad máxima a 70ºC para ambas enzimas (Figura 11). La xilanasa de 50 kDa pareció ser, a partir de estos resultados, ligeramente más estable a 80ºC y pH 7 que la xilanasa de 35 kDa. Por otro lado, la xilanasa de 35 kDa mostró más actividad y estabilidad en el intervalo de pH de 4-5 (Figuras 10A-10C).
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Ejemplo 6 Experimentos de Blanqueado Usando Medio de Cultivo de Actinomadura flexuosa
Los experimentos de blanqueado se hicieron para determinar la utilidad de la actividad xilanasa de A. flexuosa en blanqueado tanto ECF (libre de cloro elemental) como TCF (totalmente libre de cloro) de pulpa de papel kraft.
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Blanqueado ECF
El medio de cultivo que contenía actividad xilanasa de A. flexuosa (Ejemplo 1) se añadió a pulpa de papel kraft de madera blanda deslignificada con oxígeno acabada (número kappa 15) en la cantidad de 50 ó 100 nkat/g de materia seca de pulpa. La actividad xilanasa se midió a pH 6 y 60ºC con 5 minutos de tiempo de incubación. La actividad celulasa del medio de cultivo fue muy baja. Los tratamientos enzimáticos se hicieron a pH 7 y 70ºC durante una hora. La pulpa de referencia se mantuvo en las mismas condiciones sin adición de enzimas.
Después de los tratamientos enzimáticos, las pulpas se blanquearon en dos fases: fase de dióxido de cloro y extracción alcalina. La absorbancia del filtrado a 280 nm se determinó para estimar la cantidad de lignina disuelta.
Como puede observarse en la Tabla 2, después del pretratamiento con la preparación de xilanasa se retiró más lignina residual de las pulpas que la evidenciada por el aumento de A_{280} de los filtrados y la reducción de números kappa en las pulpas finales. Las pulpas finales tenían también 3-4 unidades de mayor brillo en comparación con la referencia. La resistencia de las pulpas no se vio afectada, porque los valores de viscosidad permanecieron dentro de la variación normal del procedimiento.
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(Tabla pasa a página siguiente)
TABLA 2
3 
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Blanqueado TCF
La pulpa de papel kraft de madera blanda deslignificada con oxígeno acabada (número kappa 15) se trató con preparación de xilanasa de A. flexuosa usando dosificaciones enzimáticas de 50 y 100 nkat/g de materia seca de pulpa. La actividad xilanasa se midió a pH 6 y 60ºC con 5 minutos de tiempo de incubación. La actividad celulasa de la preparación fue muy baja. Los tratamientos enzimáticos se hicieron a pH 7 y 70ºC durante una hora. La pulpa de referencia se mantuvo en las mismas condiciones sin adición de enzima.
Después de los tratamientos enzimáticos las pulpas se blanquearon usando la secuencia QP. Primero se retiraron los metales quelando con EDTA al 0,2% (fase quelante, Q) y después se blanquearon las pulpas con peróxido de hidrógeno (fase de peróxido, P). Los compuestos químicos blanqueantes fueron los siguientes: H_{2}O_{2} al 3%, NaOH al 3%, DPTA al 0,2% (ácido dietilen triamina pentaacético) y MgSO_{4} al 0,5%. La absorbancia del filtrado a 280 nm se determinó para estimar la cantidad de lignina disuelta. Los resultados se muestran en la Tabla 3.
TABLA 3
5 
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La Tabla 3 muestra que, de acuerdo con los valores de A_{280} medidos y los números kappa, se retiró significativamente más lignina después de los tratamientos con xilanasa en comparación con la referencia. Los valores de viscosidad de las pulpas permanecieron dentro de la variación normal del procedimiento, que significa que la resistencia de las pulpas no se vio afectada. También los valores de brillo fueron mayores que la referencia, pero como se esperaba, el aumento fue más ligero que en blanqueado con dióxido de cloro.
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Ejemplo 7 Experimentos de Blanqueado Usando las Xilanasas de 35 kDa y 50 kDa Purificadas
La xilanasa mayor de 50 kDa (AM50) y la más pequeña de 35 kDa (AM35) purificadas (incluyendo también la xilanasa de 30 kDa) se ensayaron en un blanqueado con peróxido de tres fases. Las preparaciones enzimáticas purificadas fueron iguales que las usadas en la determinación del pH y las propiedades térmicas de las enzimas purificadas (Ejemplo 5).
Las preparaciones enzimáticas purificadas se añadieron a la pulpa de papel kraft de madera blanda deslignificada con oxígeno acabada (número kappa 13,5 y brillo del 37%) en la cantidad de 100 nkat/g de materia seca de pulpa. La actividad xilanasa se midió a pH 6,5 y 60ºC con 5 minutos de tiempo de incubación. Los tratamientos enzimáticos se hicieron a pH 6,5 y 60ºC durante una hora. La pulpa de referencia se trató en las mismas condiciones pero sin adición de enzimas. El blanqueado se realizó con la secuencia QP_{1}P_{2}P_{3}. La fase quelante (Q) se realizó añadiendo EDTA al 0,2% de materia seca de pulpa. Las tres fases de peróxido de hidrógeno (P_{1}P_{2}P_{3}) se realizaron todas del mismo modo. Los resultados se muestran en la Tabla 4.
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TABLA 4
7
8
El uso de AM50 y AM35 aumentó claramente el brillo sin aumentar significativamente la cantidad de peróxido que se consumió. También se redujo el contenido de lignina de las pulpas que se evidencia por la reducción de los números kappa de las pulpas tratadas con estas enzimas.
Ejemplo 8 Aislamiento del ADN Cromosómico y Construcción de la biblioteca Genómica
Se cultivó Actinomadura flexuosa DSM43186 en 50 ml de medio que constaba de sacarosa al 10% (p/v), xilano de hojuelas de avena al 0,5% (p/v), peptona de caseína al 0,5% (p/v), extracto de levadura al 0,5% (p/v), extracto de carne al 0,5% (p/v), CaCl_{2} x 2H_{2}O al 0,074% (p/v), pH 7,4-7,5, en matraz en agitación aislado durante 2,5 días a 52ºC con agitación a 200 rpm. Se transfirieron 2,5 ml de este cultivo a 50 ml de medio fresco suplementado con glicina al 0,8%, y se cultivó durante 2 días a 50ºC, 200 rpm. Las células se sedimentaron por centrifugación y se lavaron con sacarosa al 10%-Tris-HCl 25 mM (pH 8,0)-EDTA 25 mM.
El ADN cromosómico se aisló de acuerdo con Hopwood y col., Genetic manipulation of Streptomyces: A laboratory manual, The John Innes Foundation, Norwich, UK (1985). En resumen, el micelio se lisó con lisozima y mezcla Kirby 2 x (2 g de triisopropilnaftaleno sulfonato sódico, 12 g de 4-amino-salicilato sódico, 5 ml de Tris-HCl 2 M (pH 8,0), 6 ml de fenol saturado con Tris-HCl, compuesta hasta 100 ml con agua). El ADN se precipitó con isopropanol y se disolvió en TE (Tris-HCl 10 mM, EDTA 1 mM, pH 8,0). El ARN se digirió con RNasa.
El ADN cromosómico se digirió parcialmente con Sau3A (Boehringer, Alemania) y se fraccionó por tamaño en gradiente de sacarosa (sacarosa al 10-40% (p/v) en NaCl 1 M, Tris-HCl 20 mM, pH 8,0, EDTA 5 mM) procesado a 55.000 rpm durante 6 h a 22ºC en la ultracentrífuga Beckman TL-100 en el rotor TLS-55. El gradiente se dividió en fracciones, y aquellas que contenían ADN de principalmente 7-10 kb de tamaño se usaron para construir una biblioteca genómica de Actinomadura.
Se usó el Kit de Clonación de Vector BamHI/ClAP ZAP Express^{TM} predigerido (Stratagene; U.S.A.) para construir la biblioteca y se siguieron las instrucciones del fabricante en todas las etapas posteriores. En resumen, se ligaron aproximadamente 200 ng de ADN fraccionado por tamaño en 1 \mugde brazos preparados ZAP Express^{TM}, y se compactaron usando extracto de compactación Gigapack II (Stratagene, U.S.A.). El título de la biblioteca se determinó infectando células de E. coli XL1-Blue MRF con diluciones seriadas del fago de compactación y sembrando en placas NZY. El título total de la mezcla de ligamiento fue aproximadamente 3 x 10^{7} pfu/ml, con una frecuencia de inserción de más del 96%. La biblioteca se usó para explorar sin amplificación.
Ejemplo 9A Aislamiento del Gen que Codifica la Xilanasa de 35 kDa en Base a la Actividad de Hidrólisis en Placas de RBB-Xilano
La biblioteca genómica de ADN de Actinomadura flexuosa DSM43186 en el vector ZAP Express^{TM} se exploró para la actividad xilanolítica, del siguiente modo. El huésped, células Stratagene de E. coli XL-Blue MRF' se cultivaron en LB + maltosa al 0,2% (p/v) + MgSO_{4} 10 mM y se ajustó a DO_{600}=0,5. Las células se infectaron con la biblioteca recombinante durante 15 min. a 37ºC y se sembraron con agar NZY sobre las placas NZY. Las placas se incubaron durante 4 horas a 42ºC, revestidas con filtros de nitrocelulosa saturados con IPTG 10 mM para inducir la expresión de la proteína lacZ, y se incubaron durante una noche a temperatura ambiente.
Los filtros se lavaron con tampón fosfato K 50 mM (pH 6,8), y se transfirieron en placas de RBB-xilano + kanamicina (Km). La placa tiene dos capas; la capa inferior de 15 ml de LB regular + Km (40 \mug/ml) y la capa superior de 5 ml de RBB xilano (RBB xilano al 0,5% (p/v), xilano de hojuelas de avena al 1% (p/v) en LB + Km, tamponado con fosfato K 50 mM, pH 6,8). Las placas se transfirieron a 50ºC durante una segunda noche para determinar la actividad xilanolítica. Los filtros se retiraron, y el halo transparente en las placas de RBB-xilano + Km reveló los clones que tenían actividad xilanasa. Se cogieron 22 placas positivas de las placas NZY originales en tampón SM/cloroformo.
El vector ZAP Express^{TM} se ha diseñado para permitir la escisión y recircularización in vivo simple y eficaz de cualquier inserto clonado contenido en el vector lambda para formar un fagómido que contenga el inserto clonado. En resumen, los clones positivos se incubaron con células XL1 Blue MRF con el fago auxiliar ExAssist. Después de desnaturalización por calor (70ºC, 15 min.), y centrifugación, el fagómido escindido pBK-CMV se compactó como partículas de fago filamentoso en el sobrenadante. El fagómido rescatado se mezcló con células XLOLR, y se sembró en LB/kanamicina (50 \mug/ml) de acuerdo con el fabricante.
Se volvieron a ensayar las células de E. coli XLOLR transformadas con los ADN del fagómido rescatado en RBB-xilano + Km. De los 22 clones originalmente positivos, 12 retuvieron la actividad xilanasa. Los ADN del fagómido se digirieron con EcoRI-PstI, se sometieron a electroforesis, se transfirieron a una membrana de nylon, y se hibridaron con un fragmento de xilanasa de T. fusca de 1,15 kb marcado con digoxigenina de pALK185 (Fig. 12). El plásmido pALK185 contiene el gen xynA de T. fusca de pTX101 (Ghangas, G.S. y col., J. Bact. 171:2963-2969 (1994)). Cuatro fagómidos hibridaron con la sonda de ADN de T. fusca, lo que indica que llevaban genes(s) que comparte(n) alguna homología con el fragmento de T. fusca. Estos fagómidos se denominaron pALK938, pALK939, pALK940 y pALK941. Del ADN cromosómico de A. flexuosa DSM43186, la sonda de xynA de T. fusca hibridó con un fragmento EcoRI-PstI de aproximadamente 4 kb.
Ejemplo 9B Aislamiento del Gen que Codifica la Xilanasa de 35 kDa en Base a la Hibridación con el gen xynA de Thermomonospora fusca
La biblioteca genómica de ADN de Actinomadura flexuosa DSM43186 en el vector ZAP Express se exploró con un fragmento de xilanasa de T. fusca de 1,15 kb marcado con digoxigenina de pALK185 (Fig. 12), de acuerdo con las instrucciones del proveedor. Se cogieron 17 clones positivos. Los fagómidos se escindieron in vivo, como se ha descrito anteriormente en el ejemplo 9A. Los clones de E. coli que albergaban los fagómidos positivos se ensayaron para la actividad xilanolítica en RBB-xilano, como se ha descrito anteriormente en el ejemplo 9A. Mostraron actividad xilanolítica 11 clones. Se eligió uno de los clones, y el plásmido se llamó pALK1056.
Ejemplo 10 Aislamiento del Gen que Codifica la Xilanasa de 35 kDa en Base a la Producción de Polipéptido reconocido por el Anticuerpo contra XynA de Thermomonospora fusca
Se usó el anticuerpo policlonal contra la xilanasa de T. fusca de32 kDa, XynA (Véase el Ejemplo 3), para explorar la biblioteca genómica de Actinomadura flexuosa DSM 43186. Se cultivaron células Stratagene XL1-Blue MRF' en LB + maltosa al 0,2% + MgSO_{4} 10 mM y se diluyeron a DO_{600}=0,5. Las células se infectaron con la biblioteca recombinante durante 15 min. a 37ºC y se sembraron con agar superior NZY en las placas NZY. Las placas se incubaron durante 3,5 horas a 42ºC, se revistieron con filtros de nitrocelulosa saturados con IPTG 10 mM, y se incubaron durante una noche a temperatura ambiente. La detección se realizó con el anticuerpo contra XynA de T. fusca diluido 1:1500 usando el Sistema ProtoBlot AP de Promega. Doce clones positivos, de los que el clon 1.1 dio claramente la señal más fuerte, se cogieron en tampón SM/cloroformo, y se purificaron con una segunda ronda de exploración.
Los fagómidos se escindieron in vivo, como se ha descrito anteriormente en el ejemplo 9A. Los fagómidos después se digirieron con EcoRI y PstI, se sometieron a electroforesis, se transfirieron en una membrana de nylon y se hibridaron con un fragmento de xilanasa de T. fusca de 1,15 kb marcado con digoxigenina de pALK185 (Fig. 12). Del ADN cromosómico de A. flexuosa DSM43186, la sonda de xynA de T. fusca hibridó con un fragmento EcoRI-PstI de aproximadamente 4 kb. Los clones también se ensayaron para la actividad xilanolítica en RBB-xilano, como se ha descrito anteriormente en el ejemplo 9A. Un clon (clon 1.1) fue positivo en ambas exploraciones. El fagómido transportado por este clon se llamó pALK923.
Ejemplo 11 Análisis de Enzimas de Restricción y Secuenciación del Gen de Xilanasa que Codifica la Proteína de 35 kDa
Los plásmidos pALK938 (DSM9399), pALK939 (DSM9900), pALK940 (DSM9901), pALK941 (DSM9902), pALK1056 (DSM9903) y pALK923 (DSM9322) se analizaron por análisis de enzimas de restricción, y se usaron para la secuenciación del gen de la xilanasa. El ADN se secuenció usando kits ABI (Applied Biosystems, U.S.A.) basados en los cebadores T3 y T7 marcados con fluorescencia, o cebadores específicos de secuencia con didesoxinucleótidos marcados con fluorescencia, por el protocolo de secuenciación de ciclo de cebador con colorante Taq de acuerdo con las instrucciones del proveedor. A causa del elevado contenido de GC en el ADN de A. flexuosa, las reacciones de secuenciación se realizaron con DMSO al 10% (v/v) a la temperatura de hibridación de 58-60ºC. Las reacciones de secuenciación se analizaron en el secuenciador ABI 373A, y las secuencias obtenidas se caracterizaron usando el Paquete de Software de Análisis de Secuencia de Genetics Computer Group, versión 7.2. La secuencia de ADN que codifica la xilanasa de 35 kDa se presenta en la Figura 13. La secuencia muestra una ORF (fase de lectura abierta) de 1035 pb, que predice un polipéptido de 344 aminoácidos, y que corresponde a una proteína con un peso molecular de aproximadamente 37,5 kDa. Se encuentra un supuesto sitio de procesamiento de señales después de la alanina 43, y la proteína madura predicha tiene un peso molecular calculado de aproximadamente 32,9 kDa. Los datos de secuencia, por tanto, están de acuerdo con los resultados de purificación y secuenciación de la xilanasa de 35 kDa descritos en los Ejemplos 3 y 4. La secuencia del gen de 35 kDa parecía idéntica en todos los clones ensayados, excepto en el ADN de pALK923. pALK923 contenía 93 pb de secuencia desconocida en el extremo N-terminal del inserto, después de la cual comenzaba la secuencia del gen de la xilanasa de 35 kDa de A. flexuosa en la localización correspondiente al par de bases 411 en la Figura 13.
La secuencia muestra elevada homología con xilanasas de diferentes organismos. A nivel aminoacídico, el gen muestra una identidad del 76% con la XynA de T. fusca. Además, la xilanasa de 35 kDa de A. flexuosa muestra una identidad del 81% con el dominio de unión a xilano de la XynA de T. fusca (Irwing y col., Appl. Env. Microbiol.60:763-770 (1995)). Por tanto, la xilanasa de 35 kDa de A. flexuosa contiene un dominio de unión a xilano diferente separado del dominio catalítico por una región de engarce que muestra una identidad de sólo aproximadamente el 40% con la región de engarce de XynA de T. fusca.
Ejemplo 12 Aislamiento del Gen de Xilanasa de 50 kDa de Actinomadura flexuosa
La biblioteca genómica de ADN de A. flexuosa DSM43186 en el vector ZAP Express^{TM} se exploró usando una sonda de ADN.
Se diseñaron cebadores oligonucleotídicos en base a las secuencias peptídicas derivadas de la proteína de 50 kDa purificada. Las secuencias cebadoras se presentan en la Tabla 5. Como la combinación de las secuencias peptídicas Nº 1696 (SEC ID Nº 6), Nº 1697 (SEC ID Nº 7), Nº 1698 (SEC ID Nº 8) y Nº 1704 (SEC ID Nº 10) corresponde con una similitud del 75% a los aminoácidos 42-89 de la xilanasa A de Streptomyces lividans, se sintetizó un oligo antisentido de 39 pb, de las bases 331 a 369 en la secuencia de xlnA de S. lividans. La sonda de xlnA de331-369as de S. lividans y los cebadores Nº 1704 (SEC ID Nº 10), Nº 1703as y Nº 1696s se marcaron con digoxigenina y la transferasa terminal, y se usaron como sondas en hibridación a 50ºC de acuerdo con Boehringer, DIG DNA Labeling and Detection Nonradioactive, Applications Manual.
La sonda Nº 1704as y la sonda de xlnA de331-339as de S. lividans reconocieron el mismo fragmento EcoRI-PstI de 1,0 kb en el ADN de A. flexuosa. El fragmento es diferente del fragmento de 4 kb reconocido por la sonda de xynA de T. fusca (Véase el Ejemplo 9A). En base a estos resultados, se usó la sonda de xlnA de 331-369as de S. lividans para explorar la biblioteca de A. flexuosa para el gen que codifica la xilanasa de 50 kDa.
Se cogieron tres placas positivas después de una detección de una noche. Estos clones se llamaron Act.xyl.50/13, Act.xyl.50/14 y Act.xyl.50/15.
Los fagómidos que contienen el inserto de A. flexuosa clonado se escindieron como se ha descrito en el Ejemplo 9A. Para determinar la actividad xilanasa, se sembraron en estrías los clones de E. coli en placas de RBB-xilano + Km como se ha descrito en el Ejemplo 9A, usando la cepa que produce la xilanasa de 35 kDa de A. flexuosa (del plásmido pALK923) como control positivo. Los clones Act.xyl.50/13 y Act.xyl.50/14 mostraron actividad xilanasa, lo que da un halo transparente alrededor de la colonia.
TABLA 5 Cebadores oligonucleotídicos usados en la detección del gen que codifica la xilanasa de 50 kDa de A. flexuosa
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Ejemplo 13 Secuenciación del Gen para la Proteína Xilanasa de 50 kDa de Actinomadura flexuosa
Los ADN de fagómido del Act.xyl.50/13 y Act.xyl.50/14 se llamaron pALK927 y pALK928, respectivamente. El oligómero de 331-369as de xlnA de S. lividans se usó para secuenciar el inserto de A. flexuosa. Además, se sintetizaron dos oligómeros correspondientes a los nucleótidos 257-284 y 530-561 en la secuencia de xlnA de S. lividans, así como cebadores específicos de secuencia, para obtener la secuencia del inserto clonado. Las reacciones de secuenciación se realizaron con DMSO al 10% (v/v), a la temperatura de hibridación de 58ºC. La secuenciación se realizó como se ha descrito en el Ejemplo 11. La secuencia de las 1864 pb del gen de la xilanasa de 50 kDa de A. flexuosa DSM43186 se presenta en la Figura 14. Las secuencias peptídicas de la proteína de 50 kDa purificada se indican por subrayado de la secuencia de aminoácidos derivada. La secuencia peptídica derivada muestra una identidad del 70-71% con las proteínas xilanasa II de Actinomadura sp. FC7 (Figura 15A) y la xilanasa A de S. lividans (Figura 15B). La secuencia muestra una ORF de 1479 pb, que predice un polipéptido de 492 aminoácidos, que corresponde a una proteína con un peso molecular de aproximadamente 53,5 kDa.
Ejemplo 14 Producción de Enzimas Bacterianas (Actinomicetes) en Trichoderma reesei: Producción de Xilanasa de Thermomonospora fusca sin una Fusión
Se construyó el casete de expresión pALK193 (Fig. 16) para la expresión del gen de xilanasa de T. fusca, xynA (Ghangas y col., J. Bacteriol. 171:2963-2969 (1989); Irwin y col., Appl. & Environ. Microbiol. 60:763-770 (1994)) en T. reesei. En el casete de expresión, se fusionó el gen de xilanasa de T. fusca con la secuencia señal de la celobiohidrolasa 1 (cbh1)de T. reesei que está precedida por el promotor de cbh1. El casete de expresión de 9,4 kb pALK193 se cortó de la estructura del vector por la enzima de restricción EcoRI. Después se aisló, se purificó y se introdujo por transformación en la cepa T. reesei ALKO2221.
El fragmento de expresión pALK193 contiene:
*El promotor de cbh1 y la secuencia señal de T. reesei: La secuencia promotora de aproximadamente 2,2 kb se obtuvo del plásmido pAMH110 (documento EP 244 234 - Fig. 15) y se aisló originalmente de T. reesei cepa VTT-D-80133 (Teeri y col., Bio/Technol. 1: 696-699 (1983)). La secuencia de la secuencia señal y el área promotora que precede el ATG se publicó por Shoemaker y col., Bio/Technology 1: 691-696 (1983). En T. reesei cepa VTT-D-80133 la secuencia que precede el ATG es CCG CGGACTGCGCATC (está subrayado un sitio SacII, está en negrita una citosina adicional en la secuencia de ADN, en comparación con la secuencia de Shoemaker y col. Bio/Technology 1:691-696 (1983)).
Para hacer una fusión exacta del gen xynA de T. fusca con la secuencia señal cbh1, se sintetizaron los 12 nucleótidos después del sitio SfiIen la secuencia señal cbh1 y el extremo 5' del gen de xilanasa de T. fusca (al sitio MluI interno, véanse las Fig. 12 y 16) usando reacción en cadena de la polimerasa (PCR).
*El gen de xilanasa de T. fusca (xynA): La clonación del gen xynA está publicada en Ghangas y col., J. Bacteriol. 171: 2963-2969 (1989), y la secuencia del gen está publicada en Irwin y col., Appl. & Environ. Microbiol. 60:763-770 (1994). La secuencia que codifica la enzima madura se fusionó (fusión exacta) con la secuencia señal cbh1. Una región de terminación de xynA de aproximadamente 0,7 kb, para el sitio SmaI después de codón STOP de la región codificante de xynA, precede el fragmento de terminación de cbh1 en la construcción.
* El terminador cbh1 de T. reesei: El fragmento de terminación AvaII de 0,7 kb que comienza 113 pb antes del codón STOP del gen cbh1 se añadió después del gen xynA de T. fusca, para asegurar la terminación de la transcripción. El fragmento terminador derivaba del plásmido pAMH110 (originalmente aislado de T. reesei cepa VTT-D-80133; Teeri y col., Bio/Technol. 1: 696-699 (1983)) y contiene tres codones TAA en todas las fases de lectura precediendo el fragmento terminador (desde el sitio NdeI, véase el documento EP 244 234).
El gen amdS de A. nidulans: El gen se ha aislado de Aspergillus nidulans VH1-TRSX6. Codifica la acetamidasa (Hynes y col., Mol. Cell. Biol. 3:1430-1439 (1983)). La acetamidasa posibilita que la cepa crezca usando acetamida como la única fuente de nitrógeno y esta característica se usó para seleccionar los transformantes. El fragmento de 3,1 kb (SpeI- XbaI)del plásmido p3SR2 (Kelly y Hynes, EMBO J. 4: 475-479 (1985)) se usa en los plásmidos. El fragmento contiene 1007 pb del área promotora, 1897 pb de la región codificante (intrones incluidos) y el área terminadora de 183 pb del gen amdS.
El fragmento 3' de cbh1 de T. reesei: El fragmento se aisló de T. reesei ALKO2466 usando rescate de plásmido (1,7 kb, BamHI- EcoRI, que comienza 1,4 kb después del codón STOP del gen, Suominen y col., "High frequency one-step gene replacement in Trichoderma reesei II. Effects of deletions of individual cellulase genes", Mol. Gen Genet. 241: 523-530 (1993)).
La cepa ALKO2466 deriva de la cepa ALKO233 (Harkki y col., Enzyme Microb. Technol. 13: 227-233 (1991)). El fragmento 3' se usa junto con el área promotora (descrita anteriormente) para dirigir el gen xynA de T. fusca al locus cbh1 por recombinación homóloga.
Se usaron procedimientos de ADN convencionales para la construcción de los vectores (Sambrook y col., "Molecular Cloning: A Laboratory Manual", 2nd ed. Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y., 1989). Las enzimas de restricción, ADN ligasa T4, fragmento Klenow de la ADN polimerasa I, ADN polimerasa T4, polinucleótido quinasa y la polimerasa Taq eran de Boehringer (Alemania) y New England Biolabs (U.S.A.). Cada enzima se usó de acuerdo con las instrucciones del proveedor. El ADN plasmídico se aisló usando columnas Qiagen (Qiagen GmbH, Alemania) o Promega Magic Minipreps (Promega, U.S.A.) de acuerdo con los protocolos del fabricante. Los oligonucleótidos usados en las reacciones de PCR y en reacciones de secuenciación se sintetizaron por un Sintetizador de ADN 381A de ABI (Applied Biosystems, U.S.A.). La secuenciación de ADN se hizo usando kits ABI basados en cebadores marcados con fluorescencia, o cuando se usaron cebadores específicos de secuencia, sobre didesoxinucleótidos marcados con fluorescencia, por el procedimiento de secuenciación de ciclo Taq de acuerdo con las instrucciones del proveedor. Las reacciones de secuenciación se analizaron en un secuenciador ABI 373A.
Los fragmentos de ADN para clonar o transformaciones se aislaron de geles de agarosa de bajo punto de fusión (FMC Bio-products, U.S.A.) por el procedimiento de congelación-descongelación de fenol (Benson, Biotechniques 2:66-58 1984) o usando el Qiaex II Gel Extraction Kit (Qiagen GmbH, Alemania), los GeneClean^{R} o Mermaid Kits^{TM} (Bio 101 Inc., U.S.A.) de acuerdo con las instrucciones del proveedor.
T. reesei ALKO2221 se transformó con el casete de expresión EcoRI de 9,4 kb aislado de pALK193 (Fig. 16) como se describe por Penttilä y col., Gene 61:155-164 (1987) con las modificaciones descritas en Karhunen y col., Mol. Gen. Genet 241; 515-522 (1993). Los transformantes de T. reesei se transfirieron en un medio selectivo y se purificaron a través de los conidios. Los transformantes se estabilizaron cultivándolos en medios selectivos durante dos generaciones antes de la esporulación en agar de dextrosa de patata.
Los sobrenadantes de cultivo de los transformantes se analizaron midiendo la actividad xilanasa producida, procesando las muestras en SDS-PAGE y realizando transferencias de Western. El anticuerpo policlonal contra la xilanasa de T. fusca y la xilanasa de T. fusca purificada usado en las transferencias de Western se obtuvieron del Prof. David Wilson (Cornell University, Nueva York).
La actividad xilanasa de los sobrenadantes de cultivo se midió a 6,5, 60ºC y con 5 minutos de tiempo de incubación. Antes del ensayo, los sobrenadantes se incubaron a 60ºC durante 20 horas en tampón de McIlvain 50 mM con 200 \mug/ml de BSA para destruir la propia actividad xilanasade T. reesei. La actividad xilanasa del sobrenadante de T. fusca estuvo inalterable en la incubación de 20 horas usada antes de la reacción pero la incubación usada destruyó la actividad xilanasa del huésped. La actividad xilanasa producida por los mejores transformantes pALK193 fue de aproximadamente 900 nkat/ml.
La xilanasa de T. fusca producida por los transformantes de T. reesei no fue detectable en SDS-PAGE pero se detectó en las transferencias de Western. La cantidad de xilanasa de T. fusca producida por los transformantes, en base a la estimación de las transferencias de Western cuando se purificó la xilanasa de T. fusca usada como control, fue de aproximadamente 50-100 mg/l.
Ejemplo 15 Producción de Enzimas Bacterianas (Actinomicetes) en Trichoderma reesei: Producción de Fusiones de \beta-mananasa de Trichoderma reesei y Xilanasa de Actinomadura flexuosa
Las cepas de Trichoderma reesei se construyeron para la producción de xilanasa de Actinomadura flexuosa (xilanasa de 35 kDa, AM35). Las cepas producen en exceso xilanasa de A. flexuosa y son incapaces de producir endoglucanasa II y celobiohidrolasa I de T. reesei. Dichas preparaciones deficientes en actividad celulolítica, y la preparación de las mismas por procedimientos de ADN recombinante, se describen en el documento US 5.298.405 o Suominen y col., Mol. Gen. Genet. 241:523-530 (1993). Para la sobreproducción de xilanasa de A. flexuosa, se fusionó el gen am35 a la región central/bisagra del gen de la mananasa 1 de T. reesei y la fusión génica se expresó a partir del promotor fuerte de cbh1. Se añadieron diferentes sitios de escisión de proteasas entre las secuencias codificantes de la mananasa y la xilanasa.
Los plásmidos pALK945, pALK948, pALK1021 y pALK1022 (Fig. 17) contienen las secuencias SEC ID Nº 11, SEC ID Nº 13, SEC ID Nº 15 y SEC ID Nº 17, respectivamente. Los plásmidos se usaron en la construcción de las cepas superproductoras de xilanasa de A. flexuosa y son por lo demás idénticos entre sí, excepto en que difiere la fusión entre las secuencias central/bisagra de man1 y am35 (véase la Fig. 19, y a continuación).
Los plásmidos pALK945, pALK948, pALK1021 y pALK1022 contienen los siguientes elementos:
* el promotor de cbh1 (celobiohidrolasa 1): El promotor es de Trichoderma reesei VTT-D-80133 (Teeri y col., Bio/Technology 1: 696-699 (1983)). Se usa el fragmento EcoRI- SacII de 2,2 kb (Karhunen y col., Mol. Gen. Genet. 241: 515-522 (1993)) en las construcciones. La secuencia que precede el ATG se publicó por Shoemaker y col., Bio/Technology 1: 691-696 (1983)). En la cepa de T. reesei VTT-D-80133 la secuencia que precede el ATG es CCG CGGACTGCGCATC (el sitio Sacll está subrayado, una citosina adicional en la secuencia de ADN, en comparación con la secuencia de Shoemaker y col. Bio/Technology 1: 691-696 (1983), está en negrita).
Para hacer una fusión exacta, se sintetizaron los 10 nucleótidos del promotor, desde el sitio Sacll hasta el ATG, y el extremo 5' del gen man1 (hasta el sitio ClaI interno, véase la Fig. 17) usando reacción en cadena de la polimerasa (PCR).
* la región central/bisagra del gen man1: El gen man1 codifica la \beta-mananasa que degrada mananos/glucomananos (St\ring{a}lbrand y col., Appl. Environ. Microbiol. 61:1090-1097 (1995)). El gen se ha aislado de T. reesei QM6a y se conoce su secuencia (St\ring{a}lbrand y col., 1995). El fragmento de ADN de 1,35 kb de los nucleótidos 1 a 1346 que codifica la región central/bisagra de man1 (aminoácidos 1 a 379) se usó en los plásmidos pALK945 y pALK948. El fragmento de ADN de los nucleótidos 1 a 1359 (aminoácidos 1 a 383) se usó en los plásmidos pALK1021 y pALK1022. La región central/bisagra de man1 se unió, a partir de su extremo C-terminal, al gen am35 usando el procedimiento de PCR para obtener cuatro fusiones diferentes.
* el gen am35: La secuencia de nucleótidos y la secuencia de aminoácidos deducida del gen am35 que codifica una xilanasa de 35 kDa se presenta en la Fig. 13. El gen se clonó a partir de una biblioteca genómica de Actinomadura flexuosa DSM43186 usando un ensayo de actividad de placa (Ejemplo 9A). Se usó un fragmento de 1,3 kb del nucleótido 542 (la Asp44 N-terminal) al sitio MluI aproximadamente 250 pb después del extremo del gen (pALK1055, Fig. 18) en todos los plásmidos. El gen se unió, a partir de su extremo N-terminal, a la secuencia central/bisagra de man1 usando cuatro fusiones diferentes.
* las fusiones central/bisagra de man1 - am35: se fusionó la región central/bisagra de man1 a la AM35 con o sin una secuencia engarzadora KEX, marcada como ...KR..., que representa ...Lys-Arg... en la siguiente lista. La fusión se hizo por PCR y se formaron las siguientes secuencias de aminoácidos (véase la Fig. 19 para las secuencias de ADN):
central/bisagra man1 + secuencia sintética + secuencia am35
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Se introdujo un sitio de restricción NruI(TCGCGA) en los engarces pALK945 y pALK948 para ayudar a la construcción del enlace entre las dos secuencias. Esto se hizo cambiando el codón nativo que codifica la glicina 379 en la región central/bisagra de man1 (GGC) con un codón sintético (GGT) y seleccionando el codón CGC para arginina. La Asp44 N-terminal del am35 está codificada por GAC.
Las secuencias de fusión se secuenciaron para asegurar que no hubieran tenido lugar alteraciones no deseadas.
La secuencia engarce usada en el plásmido pALK945 se ha usado en la producción del anticuerpo IgG1 murino anti-2-feniloxazolona a partir de T. reesei como una fusión con la región central/bisagra de la celobiohidrolasa I (documento WO 92/01797; Nyyssönen y col., Bio/Technology 11: 591-595 (1993)). Las fusiones se escindieron a una baja frecuencia por una proteasa extracelular de T. reesei, hasta ahora no caracterizada. La escisión se hizo después del resto de tirosina en la región engarce CBHI, dos aminoácidos antes del auténtico extremo N-terminal de la cadena Fd de cadena pesada.
Las secuencias engarzadoras en los plásmidos pALK948 y pALK1022 llevaban un péptido espaciador sintético, que contenía una señal de procesamiento de proteínas tipo KEX2, que precede la xilanasa de Actinomadura madura.
* el terminador de cbh1: El fragmento AvaII de 739 pb (Karhunen y col., Mol. Gen. Genet. 241:515-522 (1993)) que comienza 113 pb antes del STOP del gen cbh1 se añadió después del gen am35 para asegurar la terminación de la transcripción.
* el gen amdS: El fragmento que contiene el gen amdS era igual al usado en la construcción del plásmido de expresión de xynA de T. fusca, véase el Ejemplo 14.
* el fragmento 3' de cbh1: El fragmento era igual que el usado en la construcción del plásmido de expresión de xynA de T. fusca, véase el Ejemplo 14. El fragmento 3' se usa junto con el área promotora (descrita anteriormente) para dirigir la fusión génica man1-am35 al locus cbh1 por recombinación homóloga.
Se describen procedimientos de ADN convencionales usados en la construcción de los vectores pALK945,
pALK948, pALK1021 y pALK1022 en el Ejemplo 16. El casete de expresión de 10,3 kb se cortó de la estructura del vector por restricción con EcoRI. Los casetes de expresión después se aislaron, se purificaron y se transformaron en ALKO3620 como se describe en el Ejemplo 16, pero pueden usarse otras cepas de Trichoderma como huéspedes también.
En la cepa huésped ALKO3620 se ha remplazado el gen de la endoglucanasa 2 (egl2)por el fragmento BglII - XbaI de 3,3 kb del plásmido pAN8-1 (Mattern y col., Fungal Genet. Newlett. 35: 25 (1988)). Este fragmento contiene un gen marcador de transformación, ble de Streptoalloteichus hindustanus (Drocourt y col., Nucl. Acids Res. 18:4009 (1990)). El gen ble confiere resistencia a varios antibióticos, por ejemplo bleomicina y, en la construcción, se expresa a partir del promotor de gpdA (gliceraldehído-3-fosfato-deshidrogenasa) de Aspergillus nidulans, se usa el terminador de trpC de A. nidulans para terminar la transcripción. El reemplazo se hizo usando los procedimientos de ADN recombinante descritos en el documento US 5.298.405.
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Ejemplo 16 Características de los Transformantes Productores de Xilanasa de Actinomadura flexuosa
Se cultivaron varios transformantes amdS purificados en matraces de agitación en un medio que contenía suero al 4%, fuente de nitrógeno compleja al 1,5% derivada de cereal, KH_{2}PO_{4} al 1,5% y (NH_{4})_{2}SO_{4} al 0,5%. Los cultivos se mantuvieron a 30ºC y 250 rpm durante 7 días. Se cultivó A. flexuosa en un fermentador de 1 l como se ha descrito en el Ejemplo 1.
Los sobrenadantes de cultivo se sometieron a electroforesis en gel de SDS-poliacrilamida (PAGE). Se detectó CHBI por transferencia de Western e inmunotinción usando un anticuerpo monoclonal específico para CBHI (CI-258 (Aho y col., Eur. J. Biochem. 200: 643-649 (1991)) y el sistema AP de transferencia de Western ProtoBlot (Promega, U.S.A.) de acuerdo con las recomendaciones del fabricante.
Algunos de los transformantes CBHI negativos se eligieron para caracterización adicional: por ejemplo las cepas de T. reesei recombinantes ALKO3620/pALK945/8, ALKO3620/pALK945/6, ALKO3620/pALK948/27, ALKO3620/pALK1021/4 y ALKO3620/pALK1022/29 no contienen el gen cbh1. El gen cbh1 se remplaza por el gen marcador amdS y la construcción de fusión man1-am35 en los casetes de expresión pALK945, pALK948, pALK1021, pALK1022. El reemplazo del gen cbh1 se verificó en hibridaciones de Southern. La cepa huésped ALKO3620 usada en las transformaciones es deficiente del gen egl2 (véase el Ejemplo 15) Por tanto, las cepas no producen los componentes EGII y CBHI de la celulasa de Trichoderma.
Las actividades xilanasa se midieron a pH 5,3 y 50ºC, con un tiempo de incubación de 5 minutos en tampón Na_{2}HPO_{4} 50 mM y pH 7 y 70ºC, con un tiempo de incubación de 5 minutos en tampón de McIlvain 50 mM, que contiene 100 \mug/ml de BSA. La actividad xilanasa de un transformante por cada transformación se presenta en la Tabla 6. Los niveles de producción correspondientes de los transformantes estimados a partir de la actividad específica de la xilanasa AM35 de A. flexuosa purificada(18.000 BXU/mg a pH 7,0 y 70ºC) se muestran en la Tabla 6. Se realizó otro cultivo en matraz de agitación que contenía dos transformantes cbh1 negativos obtenidos a partir de la transformación pALK945. Las actividades xilanasa se midieron a pH 7, 70ºC con un tiempo de incubación de 60 minutos. Los resultados se presentan en la Tabla 6.
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(Tabla pasa a página siguiente)
TABLA 6 La actividad xilanasa y nivel de producción estimado de transformantes de T. reesei que producen la xilanasa de 35 kDa de A. flexuosa
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La actividad xilanasa de la cepa huésped de T. reesei ALKO3620 es aproximadamente diez veces inferior en condiciones óptimas para la proteína AM35 (pH 7 y 70ºC) que en las condiciones óptimas para la xilanasa de T. reesei (pH 5,3, 50ºC). La actividad y nivel de producción más bajos se obtuvieron con un transformante que contenía una construcción de fusión sin ningún sitio de procesamiento para proteasas (ALO3620/pALK1021/4).
Para la determinación de la estabilidad térmica, las muestras de los sobrenadantes de cultivo se diluyeron en tampón de McIlvain 50 mM. Se añadió BSA como proteína vehículo a la concentración de 100 \mug/ml. La actividad xilanasa se midió incubando las muestras enzimáticas a 70ºC, pH 7,0 durante un periodo de 0, 15, 30 y 120 minutos después de que se determinara la actividad xilanasa de las muestras a pH 7, 70ºC, usando un tiempo de reacción de 5 minutos. Los resultados se muestran en la Figura 20. La estabilidad térmica de la proteína AM35 producida por las cepas recombinantes de T. reesei transformadas con los plásmidos pALK945 y pALK1022 fue idéntica a la xilanasa de A. flexuosa. La proteína AM35 producida por los transformantes pALK948 y pALK1021 fue menos estable
(Figura 20).
Las muestras de los sobrenadantes de cultivo se procesaron en geles de bloque de poliacrilamida que contenían SDS al 0,1% en el sistema de electroforesis Bio-Rad Mini Protean II. Se usó un anticuerpo policlonal preparado contra la \beta-mananasa purificada (pI 5,4) de T. reesei RutC30 (Stalbrand y col., Appl. Environ. Microbiol. 61:1090-1097 (1995)) para detectar la mananasa en transferencias de Western. En la detección, se usó el Sistema ProtoBlot AP de Promega. El resultado de Western se muestra en la Fig. 21. El peso molecular de la proteína \beta-mananasa en el medio de cultivo de la cepa huésped ALKO3620 (carril 5) y de todos los transformantes (carriles 6-10) es algo mayor que el de la muestra proteica de \beta-mananasa de 53 kDa purificada (Stalbrand y col., J. Biotechnol. 29: 229-242 (1993)), (carriles 2 y 3). Además de la \beta-mananasa nativa, los transformantes ALKO3620/pALK945/8, ALKO3620/pALK945/6, ALKO3620/pALK948/27 y ALKO3620/pALK1022/29 (carriles 6-9) producen una proteína más pequeña (de aproximadamente 50 kDa) que reacciona con el anticuerpo policlonal contra mananasa. Esta banda representa la proteína mananasa acortada obtenida de las construcciones de fusión, y muestra que las proteasas extracelulares han procesado la fusión. En la cepa ALKO3620/pALK1021/4 (carril 10) se obtienen dos bandas con pesos moleculares de aproximadamente 70 y 80 kDa. Estas bandas se originan de la proteína de fusión no procesada (central/bisagra de MANI + proteína madura AM35).
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Los sobrenadantes de cultivo se analizaron también con un anticuerpo policlonal producido contra la xilanasa de 35 kDa purificada de A. flexuosa (Ejemplo 18). El resultado se presenta en la Figura 22. Los transformantes ALKO3620/pALK945/6, ALKO3620/pALK948/27 y ALKO3620/pALK10 22/29 mostraron de una a dos bandas principales en las transferencias de Western. Se estimó que estas bandas eran de 37-39 kDa y migraban paralelas a la xilanasa de 35 kDa purificada de A. flexuosa. En otro transformante obtenido de la transformación con el casete de expresión pALK945, la banda principal tenía un peso molecular de 31 kDa. El transformante ALKO3620/pALK1021/4 mostró dos bandas de proteína de aproximadamente 70-80 kDa que se correlacionaban con el peso molecular de la proteína de fusión no procesada. El transformante también producía la forma procesada de la proteína de fusión.
Cuando se expresa la xilanasa de actinomicetes sencilla en T. reesei como una fusión de un gen homólogo, pueden conseguirse elevados niveles de producción de la proteína heteróloga. Cuando se expresaba el gen am35 de Actinomadura bajo el promotor de cbh1 como una fusión con mananasa, el nivel de xilanasa producida era aproximadamente de 500-800 mg/l. Cuando se expresaba xynA de T. fusca en T. reesei uniéndola al mismo promotor (cbh1),sin fusión a un gen homólogo, se producían solamente 50-100 mg/l de xilanasa. La identidad entre las dos xilanasas de actinomicetes, xilanasa AM35 de Actinomadura y xilanasa A de T. fusca es del 76% a nivel de aminoácidos.
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Ejemplo 17 Experimentos de Blanqueado Usando la Xilanasa de Actinomadura flexuosa Sintetizada en Trichoderma reesei como una Proteína de Fusión con Mananasa
Los experimentos de blanqueado se hicieron para determinar la utilidad de la actividad xilanasa AM35 de A. flexuosa sintetizada en Trichoderma reesei como una proteína de fusión con mananasa en blanqueado TCF (totalmente libre de cloro) de pulpa de papel kraft.
Los medios de cultivo de los transformantes ALKO3620/pALK945/8, ALKO3620/pALK948/27 y ALKO3620/
pALK1022/29 (Ejemplo 16) se añadieron a pulpa de papel kraft de madera blanda deslignificada con oxígeno acabada (número kappa 16) en la cantidad de 100 nkat/g de materia seca de pulpa. La actividad xilanasa se midió a pH 7 y 70ºC con 60 minutos de tiempo de incubación. Los tratamientos enzimáticos se hicieron a pH 7 y 80ºC durante una hora. La pulpa de referencia se trató del mismo modo pero sin adición de enzimas. El blanqueado se realizó usando la secuencia QP. Primero se retiraron los metales por quelación con EDTA (fase quelante, Q) y las pulpas después se blanquearon con peróxido de hidrógeno (fase de peróxido, P). Los resultados se muestran en la Tabla 7.
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TABLA 7
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15
El uso de los medios de cultivo que contienen actividad xilanasa de A. flexuosa de los transformantes ALKO3620/
pALK945/8, ALKO3620/pALK948/27 y ALKO3620/pALK1022/29 como pretratamiento de pulpa en blanqueado con peróxido a 80ºC aumentó el brillo (2 unidades como mucho) de las pulpas obtenidas sin aumentar la cantidad de peróxido que se consumió. La viscosidad de las pulpas no se redujo a causa de la baja actividad celulasa contaminante en los medios de cultivo.
El experimento de blanqueado también se realizó a pH 7 y 70ºC durante una hora usando los mismos medios de cultivo que antes. Los valores de brillo de las pulpas finales fueron similares (1,2 unidades como mucho) que cuando los pretratamientos enzimáticos se realizaron a pH 7 y 80ºC.
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Ejemplo de Referencia 18
Purificación y Caracterización de la Xilanasa de 35 kDa Recombinante de Actinomadura flexuosa
Se envió una muestra de 0,5 mg de xilanasa purificada de 35 kDa de A. flexuosa DSM43186 a Diabor Ltd (Kiviharjuntie 11 A 4, FIN-90220 Oulu, Finlandia) para producir anticuerpos policlonales en conejos. El título del anticuerpo producido fue bueno, y fue adecuada una dilución de 1:10.000 para transferencias de Western.
Los productos proteicos del gen de xilanasa de 35 kDa de A. flexuosa DSM43186 en T. reesei tanto en ALKO3620/
pALK945/8 como en ALKO3620/pALK945/6 se identificaron procesando muestras del medio de cultivo obtenido de cultivos en fermentador en SDS-PAGE seguido de transferencia de Western con el anticuerpo contra la xilanasa de 35 kDa de tipo silvestre. La transferencia de Western se realizó con el sistema ProtoBlot Western blot AP (Promega, U.S.A) de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Se usaron proteínas patrón Bio-Rad (patrones LMW) preteñidas como patrones de masa molecular.
Las diferentes bandas identificadas a partir de ALKO3620/pALK945/8 dependen de las condiciones de cultivo y el tiempo de crecimiento. Como conjunto, cinco bandas diferentes reaccionaron con el anticuerpo contra la xilanasa de 35 kDa (Figura 23A). Se estimó que la banda superior era una proteína de 80 kDa. Se estimó que las otras cuatro bandas eran de 27, 30, 31 y 34 kDa. Se estimó que la xilanasa de 35 kDa de A. flexuosa (tipo silvestre) que estaba en el gel era de 39 kDa. Por tanto, el gen de ALKO3620/pALK945/8 no producía una banda de xilanasa del mismo tamaño que la xilanasa de tipo silvestre. La masa de la banda superior, 80 kDa, se correlaciona bien con la proteína de fusión intacta. ALKO3620/pALK945/6 mostró de dos a tres bandas en las transferencias de western, también dependiendo de las condiciones de cultivo (Figura 23B). La banda superior se estimó a aproximadamente 80 kDa y por tanto probablemente la proteína de fusión intacta. La banda principal en las transferencias de ALKO3620/pALK945/6 se estimó a 39 kDa y migraba paralela a la xilanasa de 35 kDa de tipo silvestre. Las muestras de medio de cultivo después de cultivo prolongado de la cepa ALKO3620/pALK945/6 mostraron también una débil banda de 31 kDa en transferencias de Western. La existencia de xilanasas de tamaño más pequeño después de cultivo prolongado del hongo sugiere que están presentes modificaciones post-traduccionales, por ejemplo proteolisis.
Las muestras de ALKO3620/pALK945/8 y ALKO3620/pALK945/6 anteriores se volvieron a procesar en SDS-PAGE y se transfirieron en membrana de PVDF. Las bandas obtenidas se cortaron de la transferencia en PVDF y se sometieron a degradación de Edman como se ha descrito en el Ejemplo 4. Todas las bandas mostraron la misma secuencia amino terminal, es decir, la SEC ID Nº 5, que la xilanasa de 35 kDa de tipo silvestre (D-T-T-I-T-Q-). Por tanto, las modificaciones C-terminales deben suponer las diferencias observadas en las masas moleculares.
Para caracterizar adicionalmente los productos génicos de la xilanasa de 35 kDa recombinante de A. flexuosa, se purificaron las xilanasas de diferente masa molecular a partir de medios de cultivo adecuados de ALKO3620/pALK945/8 y ALKO3620/pALK945/6. La purificación se realizó esencialmente como se ha descrito en el Ejemplo 3. Muestras de 40 a 150 ml de medio de cultivo, dependiendo del contenido de xilanasa estimado, se ajustaron a pH 9,1 con NaOH 1 M. Las muestras se centrifugaron a 11.000 g (+4ºC durante 20 min.). Los sobrenadantes se ajustaron a 3,7 mS/cm y se aplicaron por separado en una columna de 5 x 18 cm de DEAE-Sepharose FF (Pharmacia) equilibrada con Na_{2}HPO_{4} 20 mM, pH 8,6, a un caudal de 30 ml/min. La mayoría de las proteínas de T. reesei se unieron al DEAE, pero la actividad xilanasa se encontró en el flujo.
El flujo de las fracciones que contenían actividad xilanasa se combinó y se añadió NaCl a 2 M. La combinación se aplicó en una columna de a 5 x 13 cm de Fenil-Sepharose FF (Pharmacia) equilibrada a un caudal de 20 ml/min con Na_{2}HPO_{4} 40 mM, pH 8,6, que contenía NaCl 2 M. La elución se realizó a un caudal de 20 ml/min con un gradiente de tampón de equilibrado al 100% a Na_{2}HPO_{4} 40 mM al 100%, pH 8,6, en 20 min. La columna se lavó adicionalmente con este tampón durante 10 min. La elución se continuó durante 30 min. con un gradiente de Na_{2}HPO_{4} 40 mM al 100%, pH 8,6, a Na_{2}HPO_{4} 40 mM al 100%, pH 8,6, que contenía etilenglicol al 60%. Se recogieron fracciones de 10 ml y se ensayaron para la actividad xilanasa, en SDS-PAGE así como en transferencias de Western. Las fracciones que contenían xilanasas purificadas se combinaron y almacenaron a -20ºC. La xilanasa de 35 kDa de tipo silvestre se purificó como anteriormente a partir de una muestra de medio de cultivo de 840 ml de A. flexuosa (DSM43186).
Las xilanasas recombinantes de A. flexuosa purificadas y la xilanasa de 35 kDa de tipo silvestre se procesaron en SDS-PAGE (Figura. 24). A partir de ALKO3620/pALK945/6 se obtuvo una xilanasa de 39 kDa purificada y a partir de ALKO3620/pALK945/8 una xilanasa de 30 kDa y una 27 kDa. Éstas, así como la xilanasa de 35 kDa de tipo silvestre, se sometieron a análisis espectrométrico de masas en un espectrómetro de masas Brucker Biflex Reflector MALDI-TODF (Brucker-Franzeen GmbH. Alemania). La xilanasa de 35 kDa de tipo silvestre mostró una masa de 32.857, que está de acuerdo con la masa calculada a partir del gen de 35 kDa de A. flexuosa (32.876), Ejemplo 11. Por tanto, la xilanasa de 35 kDa de tipo silvestre parece estar no glicosilada. La xilanasa de 39 kDa de ALKO3620/pALK945/6 dio una masa de 33.429 por espectrometría de masas. Como el extremo N-terminal de esta muestra era idéntico a la xilanasa de tipo silvestre, probablemente una extensión o glicosilación C-terminal justifique la diferencia de 572 Da en la masa. No hay codones de stop en la secuencia génica, después del codón de stop de tipo silvestre, que podría explicar la mayor masa de la xilanasa recombinante. Por tanto, probablemente se ha glicosilado uno o más de los cinco sitios potenciales de N-glicosilación (Asn-X-Ser/Thr, X=/Pro) en T. reesei. Las dos xilanasas de 30 y 27 kDa purificadas a partir de ALKO3620/pALK945/8 tenían la misma secuencia N-terminal que la xilanasa de 35 kDa de tipo silvestre. En el espectrómetro de masas sus masas se determinaron a 23.974 y 21.974 respectivamente. Las masas moleculares estimadas a partir de SDS-PAGE por tanto eran mayores que las masas determinadas por espectrometría de masas. La xilanasa de 39 kDa de SDS-PAGE se volvió a designar a 33,4 kDa y la xilanasa de 30 kDa a 23,8 kDa y la xilanasa de 27 kDa a 22 kDa. La designación de la xilanasa de A. flexuosa de tipo silvestre se mantuvo como xilanasa de 35 kDa.
La concentración proteica de las xilanasas purificadas se determinó a A_{205} por el procedimiento de Scopes (Scopes, Anal, biochem. 59: 277-287,1974). Los valores K_{m} y los valores k_{cat} (basados en la concentración proteica y la masa molecular) de las xilanasas purificadas se determinaron a pH 7 y 70ºC en el intervalo de sustrato de 2 a 25 mg/ml (xilano de abedul, Roth 7 500). Los valores k_{cat} obtenidos fueron ligeramente más pequeños tanto para la xilanasa de 35 como la de 33,4 kDa en comparación con las xilanasas de 22 y 23,8 kDa (Tabla 8). Sin embargo, los valores K_{m} para las xilanasas de 22 y 23,8 kDa (aproximadamente 10 mg/ml) fueron 2,5 veces mayores que los valores Km correspondientes de las xilanasas de 33,4 y 35 kDa (aproximadamente 4 mg/ml). Como se considera a partir de la secuencia proteica del gen de 35 kDa, los productos de xilanasa de 22 y 23,8 kDa pierden el dominio de unión a xilano C-terminal (véase el Ejemplo 11) que provoca una unión menos eficaz a xilano. La forma de 22 kDa aproximadamente estimada contiene solamente un dominio central sin la región engarzadora. La forma de 23,8 kDa contiene, además, parte de la región engarzadora.
La determinación del pI de las xilanasas purificadas se realizó procesando las muestras en una columna de cromatoenfoque de 0,5 x 20 cm de mono P (Pharmacia) equilibrada con Tris-HCl 0,075 mM pH 9,3. La elución se realizó con politampón (10 ml de politampón en 100 ml de agua y ajustado a pH 6 con ácido acético 1 M) a un caudal de 0,5 ml/min y se recogieron fracciones de 0,5 ml. Se determinaron el pH y la actividad xilanasa de las fracciones, y la actividad xilanasa se encontró en la fracción correspondiente a su pI (Tabla 8).
TABLA 8
16
La dependencia de la temperatura y el pH de las xilanasas purificadas se determinaron incubando las muestras durante 60 min. con sustrato en el intervalo de pH de 5,1 a 7,9 y a temperaturas de 60, 70 y 80ºC, esencialmente como se ha descrito en el Ejemplo 5. A partir de estos resultados, parece que las xilanasas de longitud completa, de 35 y 33,4 kDa, son ligeramente más activas a temperaturas y pH mayores que las xilanasas más cortas, de 22 y 23,8 kDa (Figura 25).
Las xilanasas purificadas se ensayaron para la estabilidad térmica incubando las muestras a 80ºC y tanto a pH 5 como a pH 7 (en tampón de McIlvain 50 mM). Las muestras se extrajeron a intervalos de tiempo adecuados, y la actividad residual se midió a pH 7 y 70ºC (5 min. de tiempo de incubación). Las semi-vidas de las xilanasas se muestran en la Tabla 9. Las dos xilanasas, de 22 y 23,8 kDa, mostraron una semi-vida más larga que las xilanasas de longitud completa de 33,4 y de 35 kDa en las condiciones ensayadas. Esta diferencia de estabilidad podría ser un resultado de la presencia del dominio de unión separado en las xilanasas de longitud completa, que desestabiliza la estructura a elevadas temperaturas en ausencia de sustrato. En los experimentos de dependencia de la temperatura (de dan resultados ligeramente diferentes), la presencia de sustrato que se une al dominio de unión a xilano puede, por el contrario, estabilizar las xilanasas de longitud completa.
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TABLA 9
17 
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Aparentemente los truncamientos de la xilanasa de 35 kDa desde el extremo C-terminal tienen algunos, aunque no graves, efectos en las características cinéticas de esta xilanasa. Un fragmento de 22 kDa de la xilanasa de 35 kDa aún es activo y muestra cinética similar que sus equivalentes más largos.
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Ejemplo de Referencia 19
Experimentos de Blanqueado Usando las Formas Purificadas de 22,0 kDa, 23,8 kDa y 33,4 kDa de la Xilanasa AM35 de Actinomadura flexuosa
El efecto de refuerzo blanqueante de las formas purificadas de 22,0 kDa, 23,8 kDa y 33,4 kDa de la xilanasa AM35 (Ejemplo 18) se ensayó en blanqueado con peróxido de una fase.
Las formas purificadas se añadieron a pulpa de papel kraft de madera blanda deslignificada con oxígeno acabada en la cantidad de 100 nkat/materia seca de pulpa como tal sin un agente protector (resultados en la Tabla 10) y con medio de cultivo de T. reesei adecuado para el fondo protector (resultados en la Tabla 11). La actividad xilanasa de las formas purificadas así como el medio de cultivo de T. reesei se midieron a pH 7, 70ºC con 5 minutos de tiempo de incubación. Los tratamientos enzimáticos se hicieron a pH 8, 80ºC durante una hora. Las pulpas de referencia se trataron del mismo modo sin adición de enzimas. Los blanqueados se realizaron usando la secuencia QP. Primero se retiraron los iones metálicos añadiendo EDTA al 0,2% de materia seca de pulpa (fase quelante, Q). Las pulpas después se blanquearon con peróxido de hidrógeno (P) usando los siguientes compuestos químicos: H_{2}O_{2} al 3%, NaOH al 3%, DTPA al 0,2% y MgSO_{4} al 0,5%. Las condiciones de las fases Q y P se muestran en las Tablas 10 y 11.
TABLA 10
18 
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Las formas de 33,4 kDa y 23,8 kDa de la xilanasa AM35 parecieron reforzar el efecto blanqueante en blanqueado con peróxido cuando el pH era 8, la temperatura 80ºC, el tiempo una hora y la dosificación enzimática 100 nkat/g de pulpa seca. La forma de 22,0 kDa no potenció la capacidad de blanqueado probablemente a causa de la pérdida del dominio de unión a sustrato y la región engarzadora incompleta. Generalmente el aumento de brillo fue bastante pequeño, 0,9 unidades como mucho. Esto puede deberse al hecho de que las enzimas purificadas se añadieron como tales a 80ºC sin que la pulpa tuviera ningún agente protector o proteína vehículo, tal como medio de cultivo de T. reesei o BSA.
El segundo experimento de blanqueado se realizó del mismo modo que el primero. Solamente las formas enzimáticas purificadas se mezclaron primero con un medio de cultivo de T. reesei y después se añadieron a las pulpas. Este medio de cultivo fue similar al medio de cultivo del que se purificaron las formas enzimáticas. Los resultados se muestran en la Tabla 11.
El resultado del segundo experimento de blanqueado fue similar al primero. Los tratamientos con las formas de 33,4 kDa y 23,8 kDa aumentaron el brillo aproximadamente 1,5 unidades en comparación con el tratamiento en el que solamente se usó medio de cultivo de T. reesei. También la forma de 22 kDa dio un aumento de aproximadamente 1 unidad de brillo. Los resultados muestran que el medio de cultivo de T. reesei funcionaba como un fondo protector y las formas proteicas de 33,4 kDa y 23,8 kDa, cuyas regiones engarzadores entre los dominios catalítico y de unión están intactos, aumentaron los valores de brillo más que la forma de 22 kDa.
TABLA 11
19
Ejemplo de Referencia 20
Producción de la forma de 23,8 kDa de la xilanasa de 35 kDa de Actinomadura flexuosa en Trichoderma reesei
Se construyen cepas de T. reesei para la producción de fragmentos xilanolíticamente activos pero acortados, aún catalíticamente activos de las enzimas de actinomicetes de longitud completa. Especialmente, se construyen cepas de T. reesei para la producción de la forma de 23,8 kDa (véase el ejemplo 18) de la xilanasa de 35 kDa de A. flexuosa. La expresión de la forma acortada puede conducir a actividad xilanasa potenciada en el medio de cultivo.
Se prepara un vector recombinante que codifica una xilanasa o un dominio deseado de la misma fusionando la secuencia que codifica la xilanasa o un dominio deseado de la misma con la secuencia de una proteína fúngica secretable o uno o más dominios funcionales de dicha proteína. Especialmente, la secuencia que codifica la forma de 23,8 kDa de la xilanasa de 35 kDa de A. flexuosa se fusiona a la celulasa o hemicelulasa de T. reesei como se describe en el documento US 5.298.405, el documento WO 93/24621 y Stalbrand y col., Appl. Environ. Microbiol. 61: 1090-1097 (1995). Especialmente, la enzima se selecciona entre el grupo constituido por CBHI, CBHII, EGI, EGII, XYLI, XYLII y MANI, o un dominio funcional de las mismas.
Pueden construirse proteínas de fusión que contengan un dominio central N-terminal de mananasa, xilanasa, celobiohidrolasa o endoglucanasa o los dominios central y de bisagra de las mismas, fusionado a la secuencia de xilanasa de A. flexuosa que codifica la forma de 23,8 kDa. El resultado es una proteína que contiene regiones centrales o centrales y de bisagra N-terminales de mananasa, xilanasa, celobiohidrolasa o endoglucanasa y una forma C-terminal de 23,8 kDa de A. flexuosa. La proteína de fusión contiene las actividades mananasa, xilanasa, celobiohidrolasa o endoglucanasa y xilanasa de diversos dominios proporcionados en la construcción de fusión.
También pueden construirse proteínas de fusión de tal modo que se incluya la cola de mananasa o celobiohidrolasa o endoglucanasa o un fragmento deseado de las mismas, colocado antes de la secuencia de xilanasa de A. flexuosa, especialmente para permitir el uso de un sitio de proteasa no específico en la cola como un sitio de proteasa para la recuperación de la secuencia de celulasa a partir de la proteína de fusión expresada. Como alternativa, pueden construirse proteínas de fusión que proporcionen un sitio de proteasa en un engarce que está colocado antes de la celulasa xilanasa de A. flexuosa, con o sin secuencias de cola.
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Ejemplo de Referencia 21
Producción de Celulasas de Thermomonospora fusca en Trichoderma reesei
T. fusca produce al menos seis enzimas degradantes celulasa, cuatro endoglucanasas E1, E2, E4 y E5 y dos exocelulasas E3 y E6 (Irwin y col., Biotechnol. and Bioeng. 42:1002-1013 (1993)). Se construyen cepas de T. reesei para la producción eficaz de celulasasde T. fusca. Especialmente, se construyen cepas de T. reesei que expresan la endocelulasa de T. fusca, E5. La clonación del gen de E5 se describe en Lao y col., J. Bacteriol. 173: 3397-3407 (1991).
Se prepara un vector recombinante que codifica una celulasa fusionando la secuencia que codifica un polipéptido con actividad celulolítica con la secuencia de una proteína fúngica secretable o al menos un dominio funcional de dicha proteína. Especialmente la secuencia que codifica la celulasa de T. fusca se fusiona a la celulasa o hemicelulasa de T. reesei o uno o más dominios funcionales de dicha celulasa o hemicelulasa, como se describe en el documento US 5.298.405, el documento WO 93/24621 y Stalbrand y col., Appl. Environ. Microbiol. 61:1090-1097 (1995). Especialmente, la enzima se selecciona entre el grupo constituido por CBHI, CBHII, EGI, EGII, XYLI, XYLII y MANI, o un dominio de las mismas, tal como la señal de secreción o la secuencia central.
Pueden construirse proteínas de fusión que contengan un dominio central N-terminal de mananasa, xilanasa, celobiohidrolasa o endoglucanasa o dominios central y de bisagra de las mismas, fusionados a la secuencia de celulasa de T. fusca. El resultado es una proteína que contiene regiones centrales o centrales y de bisagra N-terminales de mananasa, xilanasa, celobiohidrolasa o endoglucanasa y una celulasa C-terminal de T. fusca. La proteína de fusión contiene actividades mananasa, xilanasa, celobiohidrolasa o endoglucanasa y celulasa de diversos dominios proporcionados en la construcción de fusión.
También pueden construirse proteínas de fusión de modo que se incluya la cola mananasa o celobiohidrolasa o endoglucanasa o un fragmento deseado de las mismas, colocada antes de la secuencia de celulasa de T. fusca, especialmente para permitir el uso de un sitio de proteasa no específico en la cola como sitio de proteasa para la recuperación de la secuencia de celulasa a partir de la proteína de fusión expresada. Como alternativa, pueden construirse proteínas de fusión que proporcionen un sitio de proteasa en un engarce que se coloca antes de la celulasa de T. fusca, con o sin secuencias de cola.
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Ejemplo de Referencia 22
Proteína Bacteriana Expresada en Aspergillus
Se prepara un vector recombinante que codifica una enzima bacteriana fusionando la secuencia que codifica la enzima a una proteína secretable de Aspergillus. La proteína es preferiblemente glucoamilasa o \alpha-amilasa de A. niger o A. niger var. awamori; o uno o más dominios funcionales de las mismas. (Stoffer y col., Biochem. J. 292:197-202 (1993); Svensson y col., Structure-Function relationship in amilases, Ed. R.B. Friedman. Biotechnology of Amylodextrin Oligosaccharides. ACS Symposium Serium 458:28-43 (1991); Boel y col., EMBO J. 3:1581-1585(1984), Boel y col., EMBO J. 3:1097-1102 (1984), Korman y col., Curr. Genet 17: 203-212, (1990).)
Pueden construirse proteínas de fusión que contengan una glucoamilasa o \alpha-amilasa N-terminal o uno o más dominios funcionales de las mismas, fusionada a una secuencia que codifique una proteína bacteriana tal como xilanasa de Actinomadura. El resultado es una proteína que contiene glucoamilasa o \alpha-amilasa N-terminal o parte de las mismas, y una xilanasa C-terminal de Actinomadura. La proteína de fusión contiene las actividades mananasa o glucoamilasa o \alpha-amilasa y xilanasa de los diversos dominios proporcionados en la construcción de fusión.
También pueden construirse proteínas de fusión de modo que, por ejemplo, se incluya una cola glucoamilasa o un fragmento deseado de la misma, colocada antes de la secuencia de xilanasa de Actinomadura, especialmente para permitir el uso de un sitio de proteasa no específico en la cola como sitio de proteasa para la recuperación de la secuencia de xilanasa a partir de la proteína de fusión expresada. Como alternativa, pueden construirse proteínas de fusión que proporcionen un sitio de proteasa en un engarce que se coloca antes de la xilanasa de Actinomadura, con o sin secuencias de cola.
El vector de expresión usa, por ejemplo, el promotor de glucoamilasa de A. niger. (Boel y col., EMBO J. 3:1581-1585 (1984)). El huésped de transformación puede ser alguna cepa de Aspergillus niger (Kelly y Hynes, EMBO J. 4:475-479 (1985)) o, por ejemplo, alguna cepa de Aspergillus niger var. awamori (por ejemplo, ATCC 38854). La cepa de Aspergillus elegida se transforma de forma similar a la descrita por Kelly y Hynes, EMBO J. 4:475-479 (1985)).
Los transformantes que producen la xilanasa de Actinomadura después se caracterizan de forma similar al Ejemplo 16 con modificaciones obvias para los especialistas en la técnica. El medio de cultivo usado puede ser medio completo de Aspergillus. (Rowlands y col., Mol. Gen. Genet. 126: 201-216 (1973).)
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(1) INFORMACIÓN GENERAL:
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(i)
SOLICITANTE:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
NOMBRE: Primalco Ltd
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(B)
CALLE: Valta-akseli
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(C)
CIUDAD: Nurmijarvi
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(E)
PAÍS: Finlandia
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(F)
CÓDIGO POSTAL (ZIP): FIN-05200
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(G)
TELÉFONO: +358 9 133 11
\vskip0.500000\baselineskip
(H)
TELEFAX: +358 9133 1546
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(ii)
TÍTULO DE LA INVENCIÓN: Producción y Secreción de Proteínas de Origen Bacteriano en Hongos Filamentosos
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(iii)
NÚMERO DE SECUENCIAS: 18
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(iv)
FORMA LEGIBLE EN ORDENADOR:
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(A)
TIPO DE MEDIO: Disco flexible
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(B)
ORDENADOR: PC IBM compatible
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(C)
SISTEMA OPERATIVO: PC-DOS/MS-DOS
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(D)
SOFTWARE: Patent In Release Nº 1.0, Versión Nº 1.30 (EPO)
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(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº 1
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 1375 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
CADENA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico)
\vskip0.800000\baselineskip
(vi)
FUENTE ORIGINAL:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
ORGANISMO: Actinomadura flexuosa 
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
CEPA: DSM43186
\vskip0.800000\baselineskip
(ix)
CARACTERÍSTICA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
NOMBRE/CLAVE: CDS
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
LOCALIZACIÓN: 303..1337
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
OTRA INFORMACIÓN:/producto= "xilanasa AM35"
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE SECUENCIA: SEC ID Nº 1
21
22 
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº 2
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 345 aminoácidos
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(B)
TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: proteína
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE SECUENCIA: SEC ID Nº 2
23
24 
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº 3
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 1864 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
CADENA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico)
\vskip0.800000\baselineskip
(vi)
FUENTE ORIGINAL:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
ORGANISMO: Actinomadura flexuosa 
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
CEPA: DSM43186
\vskip0.800000\baselineskip
(ix)
CARACTERÍSTICA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
NOMBRE/CLAVE: CDS
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
LOCALIZACIÓN: 194..1672
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
OTRA INFORMACIÓN:/producto= "AM50 xilanasa"
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE SECUENCIA: SEC ID Nº 3
\vskip1.000000\baselineskip
25
26
27
28 
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº 4
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 493 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: proteína
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE SECUENCIA: SEC ID Nº 4
\vskip1.000000\baselineskip
29
30
31 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº 5
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 6 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
CADENA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: péptido
\vskip0.800000\baselineskip
(v)
TIPO DE FRAGMENTO: N-terminal
\vskip0.800000\baselineskip
(vi)
FUENTE ORIGINAL:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
ORGANISMO: Actinomadura flexuosa 
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
CEPA: DSM43186
\vskip0.800000\baselineskip
(ix)
CARACTERÍSTICA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
NOMBRE/CLAVE: Péptido
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
LOCALIZACIÓN: 1..6
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
OTRA INFORMACIÓN:/marcador= AM35_N-term
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE SECUENCIA: SEC ID Nº 5
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip0.5cm
32 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº 6
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 14 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
CADENA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: péptido
\vskip0.800000\baselineskip
(v)
TIPO DE FRAGMENTO: N-terminal
\vskip0.800000\baselineskip
(vi)
FUENTE ORIGINAL:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
ORGANISMO: Actinomadura flexuosa 
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
CEPA: DSM43186
\vskip0.800000\baselineskip
(ix)
CARACTERÍSTICA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
NOMBRE/CLAVE: Péptido
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
LOCALIZACIÓN:1..14
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
OTRA INFORMACIÓN:/marcador= AM50_1696_pep
\newpage
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE SECUENCIA: SEC ID Nº 6
\hskip0.5cm
33 
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº 7
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 10 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
CADENA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: péptido
\vskip0.800000\baselineskip
(v)
TIPO DE FRAGMENTO: interno
\vskip0.800000\baselineskip
(vi)
FUENTE ORIGINAL:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
ORGANISMO: Actinomadura flexuosa 
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
CEPA: DSM43186
\vskip0.800000\baselineskip
(ix)
CARACTERÍSTICA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
NOMBRE/CLAVE: Péptido
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
LOCALIZACIÓN:1..10
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
OTRA INFORMACIÓN:/marcador= AMSO_1697_pep
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE SECUENCIA: SEC ID Nº 7
\hskip0.5cm
34 
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº 8
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 12 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
CADENA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: péptido
\vskip0.800000\baselineskip
(v)
TIPO DE FRAGMENTO: interno
\vskip0.800000\baselineskip
(vi)
FUENTE ORIGINAL:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
ORGANISMO: Actinomadura flexuosa 
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
CEPA: DSM43186
\vskip0.800000\baselineskip
(ix)
CARACTERÍSTICA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
NOMBRE/CLAVE: Péptido
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
LOCALIZACIÓN:1..12
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
OTRA INFORMACIÓN:/marcador= AM50_1698_pep
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE SECUENCIA: SEC ID Nº 8
\hskip0.5cm
35 
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº 9
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 9 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
CADENA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: péptido
\vskip0.800000\baselineskip
(v)
TIPO DE FRAGMENTO: interno
\vskip0.800000\baselineskip
(vi)
FUENTE ORIGINAL:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
ORGANISMO: Actinomadura flexuosa 
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
CEPA: DSM43186
\vskip0.800000\baselineskip
(ix)
CARACTERÍSTICA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
NOMBRE/CLAVE: Péptido
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
LOCALIZACIÓN:1..9
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
OTRA INFORMACIÓN:/marcador= AM50_1699_pep
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE SECUENCIA: SEC ID Nº 9
\hskip0.5cm
36 
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº 10
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 11 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
CADENA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: péptido
\vskip0.800000\baselineskip
(v)
TIPO DE FRAGMENTO: interno
\vskip0.800000\baselineskip
(vi)
FUENTE ORIGINAL:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
ORGANISMO: Actinomadura flexuosa 
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
CEPA: DSM43186
\vskip0.800000\baselineskip
(ix)
CARACTERÍSTICA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
NOMBRE/CLAVE: Péptido
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
LOCALIZACIÓN:1..11
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
OTRA INFORMACIÓN:/marcador= AM50_1704_pep
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE SECUENCIA: SEC ID Nº 10
\hskip0.5cm
37 
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº 11
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 18 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
CADENA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico)
\vskip0.800000\baselineskip
(vi)
FUENTE ORIGINAL:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
ORGANISMO: Trichoderma reesei y Actinomadura flexuosa 
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
CEPA: QM6a y DSM43186
\vskip0.800000\baselineskip
(ix)
CARACTERÍSTICA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
NOMBRE/CLAVE: CDS
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
LOCALIZACIÓN:1..18
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
OTRA INFORMACIÓN:/producto= "Proteína de fusión mananasa-xilanasa" /nota= "Secuencia parcial de la fusión en pALK945. Las bases 1-5 son las bases 1342-1346 de la secuencia man1 de T. reesei, las bases 6-9 son sintéticas y las bases 10-18 son las bases 432-440 de la secuencia de AM35 de A. flexuosa."
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE SECUENCIA: SEC ID Nº 11
\hskip0.5cm
38 
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº 12
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 6 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: proteína
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE SECUENCIA: SEC ID Nº 12
\hskip0.5cm
39 
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº 13
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 27 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
CADENA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico)
\vskip0.800000\baselineskip
(vi)
FUENTE ORIGINAL:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
ORGANISMO: Trichoderma reesei y Actinomadura flexuosa 
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
CEPA: QM6a y DSM43186
\vskip0.800000\baselineskip
(ix)
CARACTERÍSTICA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
NOMBRE/CLAVE: CDS
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
LOCALIZACIÓN:1..27
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
OTRA INFORMACIÓN:/producto= "Proteína de fusión mananasa-xilanasa" /nota= "Secuencia parcial de la fusión en pALK948. Las bases 1-5 son las bases 1342-1346 de la secuencia de man1 de T. reesei, las bases 6-18 son el engarce KEX2 sintético, las bases 19-27 son las bases 432-440 de la secuencia de AM35 de A. flexuosa."
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE SECUENCIA: SEC ID Nº 13
\hskip0.5cm
40 
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº 14
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 9 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: proteína
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE SECUENCIA: SEC ID Nº 14
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip0.5cm
41 
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº 15
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 39 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
CADENA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico)
\vskip0.800000\baselineskip
(vi)
FUENTE ORIGINAL:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
ORGANISMO: Trichoderma reesei y Actinomadura flexuosa 
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
CEPA: QM6a y DSM43186
\vskip0.800000\baselineskip
(ix)
CARACTERÍSTICA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
NOMBRE/CLAVE: CDS
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
LOCALIZACIÓN:1..39
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
OTRA INFORMACIÓN:/producto= "Proteína de fusión mananasa-xilanasa" /nota= "Secuencia parcial de la fusión en pALK1021. Las bases 1-18 son las bases 1342-1359 de la secuencia de man1 de T. reesei, y las bases 19-39 son las bases 432-52 de la secuencia de AM35 de A. flexuosa."
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE SECUENCIA: SEC ID Nº 15
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip0.5cm
42 
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº 16
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 13 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: proteína
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE SECUENCIA: SEC ID Nº 16
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip0.5cm
43 
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº 17
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 39 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
CADENA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico)
\vskip0.800000\baselineskip
(vi)
FUENTE ORIGINAL:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
ORGANISMO: Trichoderma reesei y Actinomadura flexuosa 
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
CEPA: QM6a y DSM43186
\vskip0.800000\baselineskip
(ix)
CARACTERÍSTICA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
NOMBRE/CLAVE: CDS
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
LOCALIZACIÓN:1..39
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
OTRA INFORMACIÓN:/producto= "Proteína de fusión mananasa-xilanasa" /nota= "Secuencia parcial de la fusión en pALK1022. Las bases 1-18 son las bases 1342-1359 de la secuencia de man1 de T. reesei, las bases 19-30 son el engarce KEX2 sintético, las bases 31-39 son las bases 432-440 de la secuencia de AM35 de A. flexuosa."
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE SECUENCIA: SEC ID Nº 17
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip0.5cm
44 
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº 18
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 13 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: proteína
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE SECUENCIA: SEC ID Nº 18
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip0.5cm
45

Claims (18)

1. Un vector de expresión recombinante para la producción de proteínas bacterianas secretadas en el medio de cultivo de un huésped fúngico filamentoso que comprende un promotor unido de forma funcional a una secuencia de ADN, que codifica una secuencia señal y un dominio funcional de una proteína secretable de hongo filamentoso, siendo dicho dominio funcional un dominio de cola o un dominio central y de bisagra, en el que el dominio central contiene un sitio activo, el dominio de bisagra una región rica en serina-treonina y la cola un sitio de unión a sustrato, y que está fusionado en fase con una secuencia de ADN que codifica dicha proteína bacteriana, caracterizado porque el dominio funcional es un dominio de cola de una celulasa, o un dominio central y de bisagra de una mananasa, en el que la celulasa o mananasa son homólogas al huésped Trichoderma, y la proteína bacteriana es una xilanasa de actinomicetes.
2. El vector de expresión recombinante de la reivindicación 1, caracterizado porque el huésped es Trichoderma reesei.
3. El vector de expresión recombinante de la reivindicación 1, caracterizado porque la celulasa es una celobiohidrolasa o una endoglucanasa.
4. El vector de expresión recombinante de la reivindicación 1 o la reivindicación 3, caracterizado porque la celulasa es CBHI.
5. El vector de expresión recombinante de la reivindicación 1 o la reivindicación 3, caracterizado porque la celulasa es CBHII.
6. El vector de expresión recombinante de la reivindicación 1 o la reivindicación 3, caracterizado porque la celulasa es EGI.
7. El vector de expresión recombinante de la reivindicación 1 o la reivindicación 3, caracterizado porque la celulasa es EGII.
8. El vector de expresión recombinante de la reivindicación 1, caracterizado porque la mananasa es MANI.
9. El vector de expresión recombinante de la reivindicación 1, caracterizado porque el promotor es un promotor de hongo filamentoso.
10. El vector de expresión recombinante de la reivindicación 1, caracterizado porque el promotor es un promotor de cbh1 de Trichoderma reesei.
11. El vector de expresión recombinante de la reivindicación 1, caracterizado porque dicho vector de expresión comprende las construcciones plasmídicas de la Figura 17, en el que el plásmido pALK1022 lleva la SEC ID Nº 17, el plásmido pALK945 lleva la SEC ID Nº 11, el plásmido pALK948 lleva la SEC ID Nº 13, y el plásmido pALK1021 lleva la SEC ID Nº 15, o un equivalente de los mismos, que codifican las secuencias de aminoácidos SEC ID Nº 12, SEC ID Nº 14, SEC ID Nº 16, y SEC ID Nº 18, respectivamente.
12. El vector de expresión recombinante de la reivindicación 1, caracterizado porque la secuencia de ADN que codifica una xilanasa de actinomicetes comprende la secuencia de ADN SEC ID Nº 1 que codifica la secuencia de aminoácidos de la SEC ID Nº 2 o una secuencia de ADN que codifica una secuencia de aminoácidos que tiene una identidad de al menos el 85% a nivel de aminoácidos con la SEC ID Nº 2 y actividad xilanolítica, o la secuencia de ADN SEC ID Nº 3 que codifica la secuencia de aminoácidos de la SEC ID Nº 4 o una secuencia de ADN que codifica una secuencia de aminoácidos que tiene una identidad de al menos el 85% a nivel de aminoácidos con la SEC ID Nº 4 y actividad xilanolítica.
13. El vector de expresión recombinante de la reivindicación 1, caracterizado porque la secuencia de ADN que codifica una xilanasa de actinomicetes está comprendida en un plásmido seleccionado entre el grupo constituido por pALK923 (DSM9322), pALK938 (DSM9899), pALK939 (DSM9900), pALK940 (DSM9901), pALK941 (DSM9902) y pALK1056 (DSM9903) que codifica la xilanasa AM35 de Actinomadura flexuosa, o en un plásmido seleccionado entre un grupo constituido por el plásmido pALK927 (DSM9447) o el plásmido pALK928 (DSM9448) que codifica la xilanasa AM50 de Actinomadura flexuosa.
14. Un huésped fúngico filamentoso, caracterizado porque está transformado con al menos uno de los vectores de expresión de las reivindicaciones 1-13.
15. El uso del vector de expresión recombinante de las reivindicaciones 1-13 para la producción de una preparación que comprende una xilanasa de actinomicetes, que se secreta en un medio de cultivo durante el cultivo del huésped fúngico filamentoso.
\newpage
16. El uso de acuerdo con la reivindicación 15, caracterizado porque la preparación es un medio de cultivo usado esencialmente libre de células huésped.
17. El uso de las preparación producida en las reivindicaciones 15 ó 16 para el blanqueado asistido con enzimas en una temperatura de procesamiento de 50-90ºC, o 70-80ºC.
18. El uso de la preparación producida en las reivindicaciones 15 ó 16 para el tratamiento enzimático de biomasa vegetal, o pulpa en la fabricación del papel.
ES97901640T 1996-01-26 1997-01-24 Produccion y secrecion de xilanasas de actinomicetes en un hongo filamentoso de tricoderma. Expired - Lifetime ES2301174T3 (es)

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US08/590,563 US6300114B1 (en) 1994-07-29 1996-01-26 Sequences of xylanase and xylanase expression vectors
US590563 1996-01-26

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ES2301174T3 true ES2301174T3 (es) 2008-06-16

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