ES2301262B1 - Generacion de adhesion especifica en bacterias gram negativas mediante el anclaje de monodominos de inmunoglobulinas en su superficie con autotransportadores. - Google Patents
Generacion de adhesion especifica en bacterias gram negativas mediante el anclaje de monodominos de inmunoglobulinas en su superficie con autotransportadores. Download PDFInfo
- Publication number
- ES2301262B1 ES2301262B1 ES200400073A ES200400073A ES2301262B1 ES 2301262 B1 ES2301262 B1 ES 2301262B1 ES 200400073 A ES200400073 A ES 200400073A ES 200400073 A ES200400073 A ES 200400073A ES 2301262 B1 ES2301262 B1 ES 2301262B1
- Authority
- ES
- Spain
- Prior art keywords
- domain
- monodomain
- recombinant
- baselineskip
- expression vector
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Expired - Fee Related
Links
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K16/00—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K16/00—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
- C07K16/46—Hybrid immunoglobulins
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K16/00—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
- C07K16/12—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from bacteria
- C07K16/1203—Gram-negative bacteria
- C07K16/1207—Gram-negative bacteria from Spirochaetales (O), e.g. Treponema, Leptospira
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
- C12N15/62—DNA sequences coding for fusion proteins
- C12N15/625—DNA sequences coding for fusion proteins containing a sequence coding for a signal sequence
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
- C12N15/65—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression using markers
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
- C12N9/14—Hydrolases (3)
- C12N9/48—Hydrolases (3) acting on peptide bonds (3.4)
- C12N9/50—Proteinases, e.g. Endopeptidases (3.4.21-3.4.25)
- C12N9/52—Proteinases, e.g. Endopeptidases (3.4.21-3.4.25) derived from bacteria or Archaea
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
- C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
- C07K2317/56—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments variable (Fv) region, i.e. VH and/or VL
- C07K2317/569—Single domain, e.g. dAb, sdAb, VHH, VNAR or nanobody®
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2319/00—Fusion polypeptide
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Zoology (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Immunology (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Plant Pathology (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
- Immobilizing And Processing Of Enzymes And Microorganisms (AREA)
Abstract
Generación de adhesión específica en bacterias
Gram negativas mediante el anclaje de monodominios de
inmunoglobulinas en su superficie con autotransportadores.
La presente invención se refiere a un vector de
expresión para bacterias Gram negativas que permite la producción de
proteínas híbridas entre anticuerpos recombinantes monodominio y un
dominio transportador de la familia de los autotransportadores,
caracterizado porque comprende un promotor de transcripción
bacteriana (P), un péptido señal (sp), la secuencia que codifica
para uno o varios anticuerpos recombinantes monodominio (V) y el
dominio C-terminal de un sistema transportador de la
familia de los autotransportadores (AT). Esta invención se refiere
también a un procedimiento para la expresión de dichas proteínas
híbridas en bacterias permitiendo el anclaje de anticuerpos
monodominio en la superficie de la membrana externa bacteriana y a
un método de adhesión bacteriana específica a una superficie que
contenga un antígeno concreto.
Description
Generación de adhesión específica en bacterias
Gram negativas mediante el anclaje de monodominios de
inmunoglobulinas en su superficie con autotransportadores.
La presente invención se refiere al empleo de
herramientas genéticas que permitan expresar distintas proteínas
sobre la superficie de bacterias Gram-negativas. En
particular la presente invención se refiere al empleo de
autotransportadores (AT) como vehículos para la presentación de
anticuerpos recombinantes con unión especifica hacía antígenos
conocidos y así redirigir la adhesión bacteriana.
Las proteínas localizadas sobre la superficie de
las bacterias, o secretadas al medio extracelular, son necesarias
para numerosos fenómenos biológicos, como el reconocimiento
celular, la adherencia e invasión de células hospedadoras, la
conjugación, el ensamblaje de bacteriófagos y la movilidad celular,
entre otros (Buttner y Bonas, Trends Microbiol 2002, 10,
186-192; Cabanes y col., Trends Microbiol 2002, 10,
238-245; Cao y Saier, Microbiology 2001, 147,
3201-3214; Christie, Mol Microbiol 2001, 40,
294-305; Fernández y Berenguer, FEMS Microbiol Rev
2000, 24, 21-44; Finlay y Falkow, Microbiology and
Molecular Biology Reviews 1997, 61, 136-169; Giron y
col., Mol Microbiol 2002, 44, 361-379; Hueck,
Microbiol Mol Biol Rev 1998, 62, 379-433; Lee y
Schneewind, Genes Dev 2001, 15, 1725-1752; Soto y
Hultgren, J Bacteriol 1999, 181, 1059-1071).
La secreción de proteínas es especialmente
compleja en las bacterias Gram-negativas, pues han
de atravesar dos membranas lipídicas. Para llevar a cabo esta
empresa las bacterias Gram-negativas han
desarrollado una batería de sistemas de secreción clasificados en
cinco grandes grupos dependiendo de la naturaleza molecular de la
maquinaria de transporte.
Además cabe destacar la existencia de sistemas
especializados en la secreción de fimbrias
(chaperona/usher). Mecanísticamente estos sistemas se
dividen en dos grandes grupos: aquellos en los que no existe un
intermediario periplásmico (sec-independientes), aquellos
con secreción con una etapa en el periplasma
(sec-dependientes).
Los autotransportadores (AT) se describieron
inicialmente como una familia de proteínas secretoras, toda la
información necesaria para su traslocación a través de la membrana
externa (ME) reside en el polipéptido que es exportado. La región
C-terminal de los AT actúa como maquinaria de
secreción traslocando el dominio N-terminal a
través de la ME sin la ayuda de ninguna otra proteína conocida
(Henderson, y col., Trends Microbiol 2000, 8 (12):
529-532.; Henderson, y col., Trends Microbiol 1998,
6 (9): 370-8; Holland, Trends Microbiol 1998, 6
(10): 388-9; Pohlner, y col., Nature 1987, 325
458-462). Los AT son una familia ampliamente
distribuida entre las bacterias Gram-negativas. Se
han identificado hasta la fecha unos 120 miembros pertenecientes a
20 géneros distintos de \alpha-, \beta-, \gamma-, y
\varepsilon-proteobacterias y clamidias (Yen, y
col., Biochim Biophys Acta 2002, 1562 (1-2):
6-31.).
Algunos ejemplos de AT como factores de
virulencia presentes en patógenos de humanos son las IgA proteasas
de N. gonorrhoeae, N. meningitidis y Haemophilus
influenzae (Pohlner, y col., Nature 1987, 325
458-462; Lomholt, y col., Mol. Microbiol. 1995, 15
495-506), el factor de polimerización de actina
IcsA de S. flexnerii (Suzuki, y col., J. Biol. Chem. 1995, 270
30874-30880), la adhesina AIDA-I de
cepas patógenas de E. coli (Benz y Schmidt, Mol Micriobiol
1992, 6, 1539-1546; Suhr y col., Mol Microbiol 1996,
22, 31-42), el factor de resistencia al complemento
BrkA de B. pertussis (Fernández y Weiss, Infect. Immun.
1994, 62 4727-4738), y la citotoxina VacA de H.
pylori (Schmitt y Haas, Mol. Microbiol. 1994, 12
307-319).
Todos los AT presentan la misma estructura
modular (ver Figura 1). Desde el N-terminal: I, un
péptido señal que dirige la translocación de la
pre-proteína hacia el periplásma a través de la
membrana interna (MI) (Henderson y col., Trends Microbiol 1998, 6,
370-378; Pohlner y col., Nature 1987, 325,
458-462; Sijbrandi y col., J Biol Chem 2002, 3, 3);
II, un dominio pasajero de tamaño variable (0->250 kDa), que es
translocado a través de la ME y es el responsable del papel
biológico extracelular; III, un dominio transportador (\beta)
situado en el C-terminal, conservado entre los
miembros de la familia, y que dirige la secreción a través de la
membrana externa (ME) del dominio pasajero (Pohlner, y col., Nature
1987, 325 458-462; Klauser, y col., J. Mol. Biol.
1993, 234 579-593; Maurer, y col., J Bacteriol
1999, 181 (22): 7014-20.).
El dominio pasajero puede ser procesado y
liberado al medio (IgA proteasa de N. gonorrhoeae), puede
procesarse y permanecer asociado a la ME (adhesina Ag43 de E.
coli) o puede no procesarse y permanecer expuesto hacia el
exterior (adhesina Hia de H. Influenzae).
Diferentes miembros de la familia de los
autotransportadores, han sido empleados para la exposición de
diversos polipéptidos fusionados al dominio \beta de estos, como
por ejemplo la metalotioneína de rata (Valls y col., Nat.
Biotechnol. 2000, 18: 661-5), la subunidad B de la
toxina del cólera (Maurer y col., J. Bacteriol. 1997,
794-804), \beta-lactamasa
(Lattemann y col., J. Bacteriol. 2000, 182:
3726-33), la adrenotoxina bovina (Jose y col., J.
Biotechnol. 2002, 95: 257-68), la carboxilesterasa
EstA de Burkholderia gladioli (J. Mol. Catal. B: Enzymatic
2002, 18: 89-97), la proteína fimbrial FimH
(Kjaergaard, y col., J. Bacteriol. 2002, 184:
4197-204), entre otros.
Los trabajos dirigidos hacia la exposición en la
superficie bacteriana de polipéptidos mediante el empleo de
diferentes miembros de la familia de los autotransportadores
indican la necesidad de evitar sistemas con puentes disulfuro
(Jose, J. y col., 1996, 178 (107-110); (Klauser, T.
y col., 1992, 11 (2327-2335)). Este hecho quedó
también claramente constatado en el trabajo de Veiga y col. (Mol.
Microbiol. 1999, 33(6): 1232-1243) donde se
describe la secreción y traslocación como dominio pasajero de un
scFV (el cual presenta dos puentes disulfuro intramoleculares que
estabilizan su estructura terciaria y son requeridos para que los
scFV sean funcionales), esta traslocación se consigue con una baja
tasa de eficiencia, presentando problemas de proteolisis de
\hbox{la fusión además de problemas de toxicidad para la
bacteria.}
Los minianticuerpos o anticuerpos recombinantes,
son fragmentos derivados de los anticuerpos construidos por
tecnología del ADN recombinante, y pese a su menor tamaño conservan
la capacidad de unión al antígeno ya que mantienen los dominios
variables (V) de inmunoglobulina (Ig), donde residen las zonas de
unión a los antígenos.
Un tipo de minianticuerpos son los llamados scFv
(Plückthun, y col., Antibody Engineering: A Practical Approach
1996, 203-252). Estos scFv son proteínas quiméricas
de \sim30 kDa resultado de la fusión en la misma cadena
polipeptídica de los dominios variables (V_{H} y V_{L}) de las
cadenas pesada (H) y ligera (L) de un anticuerpo a través de un
péptido flexible (usualmente repeticiones de glicinas y serinas de
20 aa) que permite que se conserven las interacciones cuaternarias
entre ambos dominios Ig. La capacidad de unión de estos scFV reside
en la superficie generada por la interacción de los dos dominios
variables. Estos scFV presentan dos puentes disulfuro
intramoleculares que estabilizan su estructura terciaria y son
requeridos para que los scFV sean funcionales.
Otros minianticuerpos expresados con éxito en
E. coli son los llamados V_{HH} (Nguyen, y col., Adv
Immunol 2001, 79 261-96.; Nguyen, y col., Embo J
2000, 19 (5): 921-30.; Sheriff y Constantine, Nat
Struct Biol 1996, 3 (9): 733-6.). En especies de
camélidos (camellos, dromedarios, llamas etc) una parte de sus
anticuerpos carece de cadena ligera
(Hamers-Casterman, y col., Nature 1993, 363 (6428):
446-8.; Muyldermans, y col., Protein Eng 1994, 7
(9): 1129-35.), estando la zona de reconocimiento
de los antígenos constituida únicamente por el dominio V_{H}
(Desmyter, y col., J Biol Chem 2001, 276 (28):
26285-90.; Desmyter, y col., J Biol Chem 2002, 277
(26): 23645-50; Desmyter, y col., Nat Struct Biol
1996, 3 (9): 803-11.). Este dominio V_{H} se
diferencia de los dominios V_{H} de otros anticuerpos en el
sentido que sus zonas de reconociendo del antígeno está formada por
bucles de mayor tamaño. Así, a los dominios V_{H} de anticuerpos
de camélidos se les denomina V_{HH}. Este dominio (V_{HH}) de
\sim15 kDa puede expresarse en el periplasma de E. coli
manteniendo la capacidad de unión a su antígeno. Los V_{HH} son
moléculas más estables que los scFv, y al contrario que estos
raramente agregan (J Immunol. Methods 1999, 231:
25-38).
Al igual que los dominios V_{L} y V_{H} de
ratón, los dominios V_{HH} poseen un S-S
intramolecular que estabiliza su estructura terciaria y es
necesario para su correcto plegamiento (Desmyter, y col., J Biol
Chem 2002, 277 (26): 23645-50; Desmyter, y col., Nat
Struct Biol 1996, 3 (9): 803-11.).
En Veiga y col. (Mol Microbiol 1999, 33:
1232-1243), se describe la secreción de un
minianticuerpo scFv (el cual presenta dos puentes disulfuro
intramoleculares que estabilizan su estructura terciaria) como
pasajero fusionado al dominio C-terminal de la IgA
proteasa de N. gonorroheae (C-IgAP) con una
eficiencia de aproximadamente 20%, presentando además problemas de
proteolisis de la fusión y de toxicidad para la bacteria.
De modo inesperado, de acuerdo con la presente
invención, se ha conseguido el anclaje y expresión de anticuerpos
recombinantes con un dominio único (monodominio) de inmunoglobulina
en la superficie bacteriana empleando un dominio transportador de
la familia de los autotransportadores, con una eficiencia
notablemente superior a lo esperado y disminuyendo los problemas
tanto de proteolisis de la fusión como de toxicidad para la
bacteria, a pesar de que dichos anticuerpos presenten en su
estructura terciaria puentes disulfuro.
Por lo tanto, de acuerdo con un primer aspecto
de la presente invención, se describe el anclaje y expresión de
anticuerpos recombinantes monodominio en la superficie bacteriana,
secretados por un dominio transportador de la familia de los
autotransportadores.
De acuerdo con un modo de realización particular
de la presente invención, se proporciona un vector de expresión
para bacterias Gram negativas que permite la producción de
proteínas híbridas entre anticuerpos recombinantes monodominio y un
dominio transportador de la familia de los autotransportadores.
De acuerdo con otra realización preferida de la
presente invención, se proporciona un vector de expresión para
bacterias Gram negativas que permite la producción de proteínas
híbridas entre anticuerpos recombinantes monodominio y el dominio
\beta-autotransportador de la proteasa IgA de
Neisseria gonorrhoeae.
De acuerdo con otro modo de realización
particular de la presente invención, la estructura de los vectores
de expresión derivados de la IgA proteasa de N. Gonorrhoeae
es la siguiente, empezando desde el N-terminal: un
promotor de transcripción bacteriana inducible o constitutivo, un
péptido señal (que es el que dirige el paso de las proteínas
híbridas hacia el periplasma), el anticuerpo recombinante
monodominio y/o dominio tipo inmunoglobulina con capacidad de unión
y reconocimiento independiente o mezcla de estos como dominio
pasajero y el dominio C-terminal del sistema
transportador de la IgA proteasa de N. Gonorrhoeae (que
dirige la secreción del dominio pasajero hacia el medio
extracelular). En la Figura 2 se representa la estructura de
éstos.
De acuerdo con otro modo de realización
preferido, los vectores de expresión presentan en su estructura un
epítopo que permita su inmunodetección.
De acuerdo con la presente invención, la
expresión de los vectores descritos en la membrana externa está
controlada por un promotor, que bien puede ser inducible (por
ejemplo el promotor tetA que es inducido por anhidrotetraciclina
(Skerra A., Gene 1994, 151 131-135); el promotor
P_{BAD} que es inducido por arabinosa (Guzman L.M. y col., J
Bacteriol 1995, 177(14) 4121-4130); el
promotor del operon lac de E. coli Plac, o su
derivado Ptac, ambos inducidos por IPTG, lactosa y otros análogos
de la lactosa (Miller, The Operon 1978); el promotor Pm que es
inducido por 3-metil-benzoato y
otros análogos de benzoato (Ramos, J.L. y col., Annu Rev Microbiol
1997, 51 (3) 341-73) o constitutivo (por ejemplo el
promotor de \beta-lactamasa de E. coli
(Klotsky, R.A. y col., Gene 1987, 55 (1) 141-6).
Según un modo de realización preferido, la
expresión de los vectores descritos en la presente invención en la
membrana externa está controlada por el promotor del operon
lac de E. coli (Plac), por lo que dicha
inducción puede conseguirse añadiendo IPTG
(isopropil-beta-D-tiogalactopiranosido),
lactosa u otro análogo de lactosa al medio de cultivo.
De acuerdo con la presente invención, el péptido
señal que dirige el paso del vector hacia el periplasma puede ser
el péptido señal de PelB (ss) (Keen, N.T. y col., J Bacteriol 1986,
168 (2) 595-606), de OmpA (Movva, N.R. y col., J
Biol Chem 1980, 255 (1) 27-9), de la proteína 3 del
bacteriofago M13 (Parmley, S.F. y col., Adv Exp Med Biol 1989, 251
(215-8), de la proteína de unión a maltosa (MBP)
(Bedouelle, H. y col., Eur J Biochem 1988, 171 (3)
541-9), o cualquier otro péptido señal de los
empleados habitualmente con sistemas autotransportadores.
En el marco de la presente invención, se
entiende por anticuerpos recombinantes monodominio y/o dominios
tipo inmunoglobulina con capacidad de unión y reconocimiento
independiente tanto a los dominios variables de cadena pesada (VH),
a los dominios variables de cadena ligera (VL), a los anticuerpos
recombinantes de camelidos (V_{HH}), los anticuerpos
recombinantes de camelidos humanizados, los anticuerpos
recombinantes de otras especies camelizados, los anticuerpos
monodominio IgNAR de peces cartilaginosos; es decir, que se
incluyen tanto dominios que de forma natural son monodominio (caso
de V_{HH} e IgNAR), como anticuerpos que por ingeniería se han
alterado para que por sí solos sean capaces de interaccionar con el
antígeno (VLMB10) y mejorar sus propiedades d estabilidad y
solubilidad.
solubilidad.
De acuerdo con un modo particular de realización
de la presente invención, se emplean uno o varios dominios
variables sencillos de inmunoglobulina simultaneamente, como
dominios pasajeros para ser secretados por el sistema
autotransportador de la IgA proteasa de N. Gonorroheae.
Según un modo particular de realización de la
presente invención, se emplea un único anticuerpo recombinante
monodominio o dominio tipo inmunoglobulina con capacidad de unión y
reconocimiento independiente como dominio pasajero del sistema
autotransportador.
De acuerdo con otro modo particular de
realización de la presente invención, se emplean hasta 3
repeticiones de anticuerpos recombinantes monodominio y/o dominios
tipo inmunoglobulina con capacidad de unión y reconocimiento
independiente como dominios pasajeros del sistema
autotransportador. En tal caso, es posible emplear combinaciones de
diferentes tipos de anticuerpos monodominio.
Se empleó un V_{HH} que reconoce
\alpha-amilasa (V_{amy}) como representativo de
anticuerpo recombinante monodominio natural, mientras que como
representativo de anticuerpo recombinante monodominio diseñado por
ingeniería para que por sí solo sea capaz de interaccionar con el
anticuerpo y mejorar sus propiedades de estabilidad y solubilidad,
se empleó un VL de origen humano (clon MB10) frente al marcador de
superficie celular B7.1 (van den Beucken y col., J. Mol. Biol.
(2001) 310, 591-601).
Se empleó un V_{HH} que reconoce
\alpha-amilasa (V_{amy}), el cual al contener
un solo dominio Ig su tamaño es la mitad (\sim15 kDa) del
correspondiente a los scFvs (\sim30 kDa). Al igual que los
dominios V_{L} y V_{H} de ratón, los dominios V_{HH} poseen
un S-S intramolecular que estabiliza su estructura
terciaria y es necesario para su correcto plegamiento (Desmyter, y
col., J Biol Chem 2002, 277 (26): 23645-50;
Desmyter, y col., Nat Struct Biol 1996, 3 (9):
803-11.).
A la proteína híbrida formada por el dominio
V_{amy} fusionado al dominio C-IgAP se le llamó
V_{amy}\beta. En la Figura 3 se muestra la organización modular
de V_{amy}\beta. El péptido señal de PelB dirige la secreción
de estas proteínas a través de la membrana interna (MI). Los
fragmentos de ADN que codifican estas proteínas híbridas, se
clonaron en pF11\beta (Cm^{R}) (Veiga, y col., Mol Microbiol
1999, 33 (6): 1232-43), bajo el control del
promotor Plac, dando lugar al plásmido pV_{amy}\beta (SEQ ID NO
1), y en el vector pVLT35 (SpR) (20 copias por célula) (de Lorenzo,
y col., Gene 1993, 123 (1): 17-24.), bajo el control
de Ptac, dando lugar a pVV_{amy}\beta, que se usó en los
experimentos que se describen a continuación. En el caso del
dominio VLMB10, se construyó el plásmido pVLMB10\beta (SEQ ID NO
2) el cual expresa el híbrido VLMB10\beta bajo el control del
promotor Plac.
En Veiga y col. (Mol Microbiol 1999, 33:
1232-1243) se describe la proteína híbrida formada
entre el scFv 3D5 que reconoce secuencias de polihistidinas en el
C-terminal de proteínas y el dominio
C-IgAP se le llamó FvH\beta, la cual contiene el
péptido señal de PelB que permite su secreción al periplasma.
FvH\beta contiene además dos epítopos para su detección en
inmunoensayos: el epítopo FLAG en el extremo
N-terminal del dominio V_{L} y el
E-Tag en la zona de unión entre el scFv y el
C-IgAP. La fusión FvH\beta esta bajo el control
de Plac, con lo que su expresión se puede inducir con IPTG.
Como control negativo empleado en algunos
experimentos, se empleó una proteína de fusión (HE\beta) la cual
consiste en un segmento de poli-His fusionado a un
dominio \beta de la proteasa IgA (Veiga, E. y col., 2002, 21 (9)
2122-31).
Figura 1. Representación de la organización
modular de los AT. Se indican los extremos N y C terminales, así
como el péptido señal (sp), el dominio pasajero translocado y el
dominio \beta.
Figura 2. Representación de la estructura básica
de un vector de expresión de fusiones entre dominios V de
inmunoglobulinas y dominios de autotransporte. El DNA codificante
del dominio V se encuentra entre secuencias codificantes de un
péptido señal (PS) y el dominio de autotransporte (AT). Idealmente
el dominio V se encuentra flanqueado por dos sitios de restricción
únicos (R1, R2) y la fusión V-AT contiene un epítopo
(E) para su detección mediante un anticuerpo específico. El vector
contiene, además, los siguientes elementos: un origen de
replicación (ori), un gen marcador (M) para su selección, y
secuencias promotoras (P) para la transcripción de la fusión
V-AT.
V-AT.
Figura 3. A. Representación de la
organización modular de V_{amy}\beta, se indican los extremos N
y C terminales, así como el péptido señal (sp), el dominio pasajero
translocado (V_{amy}\beta) y el dominio
C-terminal de la IgA proteasa de N.
gonorroheae (C-IgAP). B. Representación
de la organización modular de V_{LMB10}\beta, se indican los
extremos N y C terminales, así como el péptido señal (sp), el
dominio pasajero translocado (V_{LMB10}\beta) y el dominio
C-terminal de la IgA proteasa de N.
gonorroheae (C-IgAP).
Figura 4. A. Inmunodetección por
Western-blot usando el mAb
anti-E-Tag de las distintas
proteínas híbridas (V_{amy}\beta y FvH\beta) a partir de
extractos totales de células de E. coli UT5600. En el caso
de V_{amy}\beta se observa una única banda correspondiente a 66
kDa mientras que en el caso de FvH\beta se observan varias bandas
correspondientes a la proteolisis de la fusión. B.
Exposición sobre la superficie de E. coli UT5600 de los
híbridos V_{amy}\beta y FvH\beta. Cuando se indica (+) las
células se permeabilizaron con 10 mM EDTA, o se incubaron con
tripsina (1 \mug/ml) añadida externamente. La presencia en los
extractos crudos de las distintas proteínas híbridas se determinó
por Western-blot con el mAb
anti-E-Tag. La cantidad de OmpA en
los mismos extractos (determinada usando un suero policlonal de
conejo anti-OmpA) se muestra como control de carga.
Para detectar el fragmento de \sim24 kDa (T-OmpA)
correspondiente a la degradación tríptica del dominio periplásmico
de OmpA se sobreexpusieron las películas
fotográficas.
fotográficas.
Figura 5. Ensayo de funcionalidad/plegamiento de
los dominios pasajeros de las distintas construcciones derivadas
de C-IgAP expuestos hacia el medio extracelular. Se
cubrieron placas de ELISA con \alpha-amilasa (Amy)
y con albúmina de suero bovino (BSA) como antígeno control. Las
células de E. coli UT5600 que expresaban estas proteínas
híbridas se añadieron sobre las placas de ELISA y la unión de los
pasajeros expuestos sobre la superficie de estas células se detectó
con el mAb
anti-E-Tag-POD. Las
células de E. coli que expresaban la proteína HE\beta se
usaron como control negativo.
Figura 6. Exposición sobre la superficie de
E. coli UT5600 del híbrido V_{LMB10}\beta. Cuando se
indica (+) las células se permeabilizaron con 10 mM EDTA, o se
incubaron con tripsina (1 \mug/ml) añadida externamente. La
presencia en los extractos crudos de las distintas proteínas
híbridas se determinó por Western-blot con el mAb
anti-E-Tag. La cantidad de OmpA en
los mismos extractos (determinada usando un suero policlonal de
conejo anti-OmpA) se muestra como control de carga.
Se observa una exposición de más del 90% de la proteína de fusión
(banda de 65 kDa), apareciendo además una única banda de
degradación proteolítica de aproximadamente 55 kDa.
Figura 7. A. representa la organización
modular de 2V_{amy}\beta Y 3V_{amy}\beta. B. Se
representa la exposición sobre la superficie de E. coli
UT5600 de los híbridos 2V_{amy}\beta y 3V_{amy}\beta. Cuando
se indica (+) las células se incubaron con tripsina (1 \mug/ml)
añadida externamente. La presencia en los extractos crudos de las
distintas proteínas híbridas se determinó por
Western-blot con el mAb
anti-E-Tag. La cantidad de OmpA en
los mismos extractos (determinada usando un suero policlonal de
conejo anti-OmpA) se muestra como control de
carga.
Figura 8. Ensayo de accesibilidad del
peptidoglicano (PG) donde se incluyó las construcciones control
(pAKnot), V_{amy}\beta, 2V_{amy}\beta, 3V_{amy}\beta y
V_{LMB10}\beta. En todas ellas, sólo aparece un nivel de
accesibilidad del PG en torno a 5% máximo e indentico al observado
en la cepa control que no expresa ninguna proteína híbrida.
Figura 9. Adhesión específica de células de
E. coli a superficie que contiene un antígeno amilasa (Amy)
o antígeno control (BSA). La unión de las células de E. coli
a las placas se detectó con un suero policlonal anti-E.
coli generado en ratones. Las células de E. coli que
expresaban la proteína HE\beta se usaron como control
negativo.
La presente invención se ilustra mediante los
presentes ejemplos no limitativos.
\newpage
Ejemplo
1
Un fragmento de ADN de aproximadamente 0.4 kb
codificando un dominio V_{HH} que reconoce
\alpha-amilasa (V_{amy}) fue amplificado por
PCR utilizando como plantilla el fagemido A100R3A2 (Dyax Co.) y los
oligonucleótidos VHHA1 (5'-CTA TGC GGC CCA GCC GGC
CAT GGC TCA GGT GCA GCT GGT GGA GTC TT-3', SEQ ID
NO 3) y GEN III-Rev (5'-ACC CTC ATA
GTT AGC GTA ACG-3', SEQ ID NO 4) como cebadores. El
producto de ADN amplificado fue posteriormente digerido con SfiI y
NotI y clonado en un fragmento de aproximadamente 5.2 kb derivado
de la digestión con SfiI-NotI de pF11\beta
(Cm^{R}) (Veiga, y col., Mol Microbiol 1999, 33 (6):
1232-43), bajo el control del promotor pLac, dando
lugar al plásmido p_{Vamy}\beta (SEQ ID NO: 1). Dicho plásmido,
pV_{amy}\beta, fue digerido con XbaI-HindIII y
el fragmento de aproximadamente 1.9 kb conteniendo el híbrido
V_{amy}\beta fue clonado en el plásmido pVLT35 (Sp^{R}) (de
Lorenzo y col., Gene 1993, 123: 17-24), bajo el
control del promotor pTac, resultando el plásmido
pVV_{amy}\beta.
\vskip1.000000\baselineskip
Un fragmento de ADN de aproximadamente 0.4 kb
codificando V_{amy} fue amplificado por PCR utilizando los
cebadores Linker-A48-V_{amy}A (5'
GGC GGT CCG ACT GCT AAC TCT GGA CAG GTG CAG CTG GTG GAG TC 3' SEQ
ID NO 5) y Vamy-Not (5' GAG TCA TTC TGC GGC CGC TGA
GGA GAC GGT 3', SEQ ID NO 6) del fagémido A100R3A2 (ver 1.1
arriba). El fragmento V_{amy} fue unido al oligonucleótido
Linker-A48 (5' ACC CCG TCT CAC AAC TCC CAC CAG GTT
CCA TCC GCA GGC GGT CCG ACT GCT AAC TCT GGA 3', SEQ ID NO 7), el
cual codifica el péptido flexible de scFv A48III-1
(Proba y col., J. Mol. Biol. 1998, 275(2):
245-253), por una reacción de PCR sin cebadores dado
la homología entre las primeras 24 bases del
Linker-A48-V_{amy}A y
Linker-A48. Esta reacción fue utilizada para la
amplificación del producto de la fusión
Linker-V_{amy} usando los oligonucleótidos
V_{amy}-Not (SEQ ID NO 6, ver arriba) y Linker
-A48-V_{amy}-eag1 (5' ATT ACT CGC
CGG CCG GTA CCC CGT CTC ACA ACT CCC A 3', SEQ ID NO 8) como
cebadores. El producto de la PCR obtenido
(Linker-V_{amy}) fue digerido con NotI y clonado
en el plásmido pVV_{amy}\beta digerido con la misma enzima. El
nuevo plásmido p2V_{amy}\beta codifica para una proteína híbrida
compuesta por dos V_{HH} (V_{amy}\beta) unidas por un linker
flexible y fusionado al
C-IgAP.
C-IgAP.
\vskip1.000000\baselineskip
El producto de la PCR anterior
Linker-Vamy fue digerido en NotI y clonado en
p2V_{amy}\beta digerido con NotI. El nuevo plásmido, denominado
p3V_{amy}\beta codificó una proteína híbrida compuesta por tres
dominios V_{HH}(V_{amy}\beta) unida por linkers
flexibles y fusionados al C-IgAP.
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo
2
Se realizó una PCR con los oligos VL1 (5'-
gagtcatTCTAGAggagccttttttttggagat, SEQ ID NO 9) y VL2 (5'-
ctgagatgagtttttgttctgcggcc, SEQ ID NO 10) y empleando como molde el
clon pCES1-VLMB10 (van den Beucken y col. J. Mol.
Biol. 2001, 310:591-601). El fragmento de DNA de
0,47 kb amplificado, conteniendo el dominio VL, se digirió con XbaI
y NotI y se clonó en el plásmido pV_{amy}\beta, digerido con las
mismas enzimas, reemplazando al fragmento XbaI - NotI que contiene
el dominio V_{amy} en este plásmido. El clon construido
pVLMB10\beta (SEQ ID NO 2) que expresa la proteína híbrida
V_{LMB10}\beta bajo el control del promotor pLac, se comprobó
mediante secuenciación de ADN.
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo
3
La expresión del híbrido V_{amy}\beta en
células de E. coli UT5600 se analizó en
Western-blots usando el mAb
anti-E-Tag (Fig. 4).
V_{amy}\beta se expresó de forma estable como proteína de 66
kDa, correspondiente al tamaño esperado para la fusión (Figura 4A,
carril 1). Sin embargo, la expresión de FvH\beta (Veiga, y col.,
Mol Microbiol 1999, 33 (6): 1232-43) dio lugar no
sólo a la proteína completa de 80 kDa, sino a diferentes bandas de
menor tamaño correspondientes a la degradación proteolítica de la
proteína híbrida (Fig. 4A, carril 2).
\newpage
Ejemplo
4
La exposición en la superficie de los dominios
pasajeros V_{amy}\beta se comprobó mediante digestión con
tripsina de células de E. coli expresando V_{amy}\beta.
Las muestras se analizaron en Western-blot usando
el mAb anti-E-Tag, o un suero de
conejo anti-OmpA. En estos experimentos se comprobó
la proteólisis de los híbridos V_{amy}\beta en presencia de
tripsina (Figura 4B) lo que indica que estos pasajeros estaban
totalmente expuestos sobre la superficie de E. coli. Como se
describió anteriormente, el pasajero de la fusión FvH\beta fue
digerido muy débilmente por la acción de la tripsina (Figura 4B).
La presencia de la proteína OmpA en todos los carriles se muestra
como control interno de carga en el experimento. La ausencia de
proteolisis de OmpA (figura 4B, carriles 3 y 7) demuestra la
integridad de la membrana externa. Cuando la membrana externa se
permeabiliza artificialmente con EDTA aparece una banda de
aproximadamente 25 kDa de proteolisis de OmpA
(T-OmpA) (figura 4B, carriles 4 y 8).
Para conocer el estado de plegamiento de estos
dominios pasajeros quiméricos expuestos hacia el medio
extracelular, se empleó la capacidad de unión específica a su
antígeno de los dominios Ig. Para ensayar la actividad de unión, se
cubrieron placas de ELISA con antígenos reconocidos del dominio
pasajero de V_{amy}\beta (\alpha-amilasa). Se
usó BSA como antígeno control. Células de E. coli que
expresaban los híbridos a C-IgAP se incubaron en
placas de ELISA y se detectó la unión del pasajero Ig mediante el
mAb anti-E-Tag conjugado con POD.
Como se muestra en la Figura 5, el dominio Ig pasajero de
V_{amy}\beta expuesto hacia el medio extracelular exhibía
actividad específica de unión a su antígeno, lo que indica que
estaba correctamente plegado. Como control negativo de estos
experimentos se utilizaron células de E. coli que expresaban
el híbrido HE\beta.
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo
5
Se construyeron los híbridos 2V_{amy}\beta y
3V_{amy}\beta, tal y como se muestra en la figura 7A, mediante
ensayos de proteolisis con tripsina, se determinó la translocación
de los dominios pasajeros (2V_{amy} y 3V_{amy}). Encontrándose
que la translocación del dominio pasajero 2V_{amy}\beta y
3V_{amy}\beta fue completa.
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo
6
Se transformó células E. coli UT5600 con
pV_{LMB10}\beta y se crecieron a 30°C en placas
LB-agar (1,5% p/v) conteniendo cloranfenicol (40
\mug/ml) y glucosa (2% p/v). Se inocularon posteriormente
cultivos líquidos de LB conteniendo cloranfenicol (40 \mug/ml),
glucosa (2% p/v) con estos clones transformados y se crecieron a
30°C hasta que la DO_{600} \sim0.5. Entonces se recogieron las
células por centrifugación (4000xg, 5 m) y se resuspendieron en
medio líquido LB conteniendo cloranfenicol (40 \mug/ml) e IPTG
0.1 mM para la inducción del promotor lac. Tras 3 h de incubación a
30°C las células inducidas se recogieron por centrifugación y se
analizaron mediante proteolisis con tripsina y Western blot con
anti-E-tag-POD.
En la figura 6 se muestra una digestión con
Tripsina revelada con anti-Etag y OmpA (fijarse que
el carril tripsina es el 2). Se observó una exposición de más del
90% de la proteína de fusión VL-beta (de 65 kDa).
Apareciendo además una única banda de degradación proteolítica de
aprox 55 kDa.
También se realizó un ensayo de accesibilidad
del peptidoglicano (PG) donde se incluyeron las construcciones
control (pAKnot), Vamyb, 2Vamyb, 3Vamyb y VLMB10. En todas ellas,
sólo apareció un nivel de accesibilidad del PG en torno a 5% máximo
e indentico al observado en la cepa control (ver figura 8) sin
expresión de ninguna proteína híbrida.
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo
7
Para estudiar la capacidad de adhesión
específica de células de E. coli que expresaban los híbridos
a C-IgAP en placas de ELISA recubiertas con
antígenos reconocidos del dominio pasajero del híbrido a
C-IgAP, se incubaron células de E. coli
UT5600 que expresaban el híbrido V_{amy}\beta en placas de
ELISA que previamente se habían recubierto con antígeno amilasa o
antígeno control (BSA) y se reveló la unión de las células con un
antígeno policlonal anti-E. coli generado en ratones y se
detectó la unión de estos anticuerpos con un anticuerpo frente a
IgGs de ratón conjugado a la peroxidasa. Ver figura 9. Como control
negativo se utilizó células de E. coli que expresaban el
híbrido HE\beta.
<110> Consejo Superior de Investigaciones
Científicas
\vskip0.400000\baselineskip
<120> GENERACIÓN DE ADHESIÓN ESPECÍFICA EN
BACTERIAS GRAM NEGATIVAS MEDIANTE EL ANCLAJE DE MONODOMINIOS DE
INMUNOGLOBULINAS EN SU SUPERFICIE CON AUTOTRANSPORTADORES
\vskip0.400000\baselineskip
<160> 10
\vskip0.400000\baselineskip
<170> PatentIn version 3.1
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 1
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 5587
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Secuencia ADN del plásmido
pVamybeta
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 1
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 2
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 5563
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Secuencia ADN del plásmido
pVLMB10beta
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 2
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 3
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 47
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Cebador VHHA1
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 3
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipctatgcggcc cagccggcca tggctcaggt gcagctggtg gagtctt
\hfill47
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 4
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 21
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Cebador GEN
III-Rev
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 4
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipaccctcatag ttagcgtaac g
\hfill21
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 5
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 44
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Cebador
Linker-A48-VamyA
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 5
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipggcggtccga ctgctaactc tggacaggtg cagctggtgg agtc
\hfill44
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 6
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 30
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Cebador Vamy-Not
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 6
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipgagtcattct gcggccgctg aggagacggt
\hfill30
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 7
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 60
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Cebador
Linker-A48
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 7
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipaccccgtctc acaactccca ccaggttcca tccgcaggcg gtccgactgc taactctgga
\hfill60
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 8
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 37
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Cebador Linker
-A48-Vamy-eagl
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 8
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipattactcgcc ggccggtacc ccgtctcaca actccca
\hfill37
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 9
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 33
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Cebador VL1
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 9
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipgagtcattct agaggagcct tttttttgga gat
\hfill33
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 10
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 26
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Cebador VL2
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 10
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipctgagatgag tttttgttct gcggcc
\hfill26
\vskip1.000000\baselineskip
Claims (15)
1. Vector de expresión de anticuerpos
recombinantes monodominio en la superficie de la membrana externa
bacteriana, caracterizado porque comprende la secuencia que
codifica para un dominio transportador de la familia de los
autotransportadores.
2. Vector de expresión de acuerdo con la
reivindicación anterior caracterizado porque comprende
secuencias de anticuerpos recombinantes monodominio y el dominio
\beta-autotransportador de un autotransportador de
una bacteria Gram-negativa, que permite la
producción de proteínas híbridas entre dichos anticuerpos
recombinantes monodominio y dicho dominio transportador.
3. Vector de expresión de acuerdo con la
reivindicación anterior 2, caracterizado porque el dominio
\beta-autotransportador empleado es el dominio
\beta-autotransportador de la proteasa IgA de
Neisseria gonorrhoeae.
4. Vector de expresión de acuerdo con cualquiera
de las reivindicaciones anteriores 1 a 3, caracterizado
porque los anticuerpos recombinantes monodominio se seleccionan
entre el grupo formado por los dominios variables de cadena pesada
naturales o modificados (VH), los dominios variables de cadena
ligera naturales o modificados (VL), los anticuerpos recombinantes
de camelidos naturales o modificados (VHH), los anticuerpos
recombinantes de camélidos humanizados, los anticuerpos
recombinantes de otras especies camelizados y los anticuerpos
monodominio IgNAR de peces cartilaginosos.
5. Vector de expresión de acuerdo con cualquiera
de las reivindicaciones anteriores 1 a 4, caracterizado
porque comprende un promotor de transcripción bacteriana inducible
o constitutivo, un péptido señal, la secuencia que codifica para uno
o varios anticuerpos recombinantes monodominio y el dominio
C-terminal del sistema transportador de la familia
de los autotransportadores.
6. Vector de expresión de acuerdo con la
reivindicación anterior 5, caracterizado porque se emplea un
único anticuerpo recombinante monodominio, como dominio pasajero
para ser secretado por el sistema autotranspor-
tador.
tador.
7. Vector de expresión de acuerdo con la
reivindicación anterior 5, caracterizado porque se emplea
como dominio pasajero para ser secretado por el sistema
autotransportador una combinación de dos anticuerpos recombinantes
monodominio.
8. Vector de expresión de acuerdo con la
reivindicación anterior 5, caracterizado porque se emplea
como dominio pasajero para ser secretado por el sistema
autotransportador una combinación de tres anticuerpos recombinantes
monodominio.
9. Vector de expresión de acuerdo con cualquiera
de las reivindicaciones anteriores 5 a 8, caracterizado
porque los vectores de expresión presentan en su estructura un
epítopo que permita su inmunodetección.
10. Vector de expresión de acuerdo con
cualquiera de las reivindicaciones anteriores 5 a 9,
caracterizado porque la expresión de los vectores en la
membrana externa de la bacteria está controlada por el promotor
del operon lac de E. coli (Plac).
11. Vector de expresión de acuerdo con la
reivindicación anterior 10, caracterizado porque la
inducción del promotor puede conseguirse añadiendo IPTG
(isopropil-beta-D-tiogalactopiranosido),
lactosa u otro derivado de lactosa al medio de cultivo.
12. Vector de expresión de acuerdo con
cualquiera de las reivindicaciones anteriores 5 a 11,
caracterizado porque el péptido señal que dirige el paso del
vector hacia el periplasma es el péptido señal de PelB (ss).
13. Método de anclaje y expresión de anticuerpos
recombinantes monodominio en la superficie bacteriana,
caracterizado porque comprende las etapas de:
- a.
- disponer de un vector de expresión que comprende un promotor, un péptido señal, el anticuerpo recombinantes monodominio como dominio pasajero y el dominio C-terminal del sistema transportador de la familia de los autotransportadores;
- b.
- la inducción del promotor, en caso de tratarse de un promotor inducible.
14. Método de adhesión bacteriana específica a
una superficie que contenga un antígeno concreto,
caracterizado porque comprende las etapas de:
- a.
- modificar la bacteria para que contenga un vector de expresión de anticuerpos recombinantes monodominio que reconoce al antígeno;
- b.
- inducir la expresión de dicho vector, en el caso de que el promotor sea inducible;
15. Método de adhesión bacteriana específica de
acuerdo con la reivindicación anterior, caracterizado porque
se emplea un vector de expresión de acuerdo con cualquiera de las
reivindicaciones anteriores 1 a 12.
Priority Applications (7)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| ES200400073A ES2301262B1 (es) | 2004-01-14 | 2004-01-14 | Generacion de adhesion especifica en bacterias gram negativas mediante el anclaje de monodominos de inmunoglobulinas en su superficie con autotransportadores. |
| US10/586,245 US20090155849A1 (en) | 2004-01-14 | 2005-01-13 | Generation of specific adhesion in gram-negative bacteria by means of anchoring immunoglobulin single domains on their surface with autotransporters |
| CA002553807A CA2553807A1 (en) | 2004-01-14 | 2005-01-13 | Generation of specific adhesion in gram-negative bacteria by means of anchoring immunoglobulin single domains on their surface with autotransporters |
| DE602005019691T DE602005019691D1 (de) | 2004-01-14 | 2005-01-13 | Erzeugung spezifischer adhäsion bei gram- negativen bakterien mittels verankerung von einzeldomänen aus immunglobulinen auf deren oberfläche mit autotransportern |
| PCT/EP2005/000444 WO2005068619A1 (en) | 2004-01-14 | 2005-01-13 | Generation of specific adhesion in gram-negative bacteria by means of anchoring immunoglobulin single domains on their surface with autotransporters |
| AT05706913T ATE459711T1 (de) | 2004-01-14 | 2005-01-13 | Erzeugung spezifischer adhäsion bei gram- negativen bakterien mittels verankerung von einzeldomänen aus immunglobulinen auf deren oberfläche mit autotransportern |
| EP05706913A EP1709168B1 (en) | 2004-01-14 | 2005-01-13 | Generation of specific adhesion in gram-negative bacteria by means of anchoring immunoglobulin single domains on their surface with autotransporters |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| ES200400073A ES2301262B1 (es) | 2004-01-14 | 2004-01-14 | Generacion de adhesion especifica en bacterias gram negativas mediante el anclaje de monodominos de inmunoglobulinas en su superficie con autotransportadores. |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| ES2301262A1 ES2301262A1 (es) | 2008-06-16 |
| ES2301262B1 true ES2301262B1 (es) | 2009-05-29 |
Family
ID=34778266
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| ES200400073A Expired - Fee Related ES2301262B1 (es) | 2004-01-14 | 2004-01-14 | Generacion de adhesion especifica en bacterias gram negativas mediante el anclaje de monodominos de inmunoglobulinas en su superficie con autotransportadores. |
Country Status (7)
| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US20090155849A1 (es) |
| EP (1) | EP1709168B1 (es) |
| AT (1) | ATE459711T1 (es) |
| CA (1) | CA2553807A1 (es) |
| DE (1) | DE602005019691D1 (es) |
| ES (1) | ES2301262B1 (es) |
| WO (1) | WO2005068619A1 (es) |
Families Citing this family (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| DE102010035702A1 (de) * | 2010-08-27 | 2012-03-01 | Zyrus Beteiligungsgesellschaft Mbh & Co. Patente I Kg | Ganzzell-Biokatalysator |
| ES2529442T3 (es) * | 2010-09-28 | 2015-02-20 | Abera Bioscience Ab | Proteína de fusión para la expresión de proteínas secretoras |
| CN103550789B (zh) * | 2013-11-25 | 2015-04-22 | 苏州大学 | 以减毒沙门氏菌为载体的口服肿瘤疫苗的制备及其应用 |
| WO2017186784A1 (en) * | 2016-04-26 | 2017-11-02 | Autodisplay Biotech Gmbh | Autodisplay of antibodies |
-
2004
- 2004-01-14 ES ES200400073A patent/ES2301262B1/es not_active Expired - Fee Related
-
2005
- 2005-01-13 EP EP05706913A patent/EP1709168B1/en not_active Expired - Lifetime
- 2005-01-13 DE DE602005019691T patent/DE602005019691D1/de not_active Expired - Lifetime
- 2005-01-13 AT AT05706913T patent/ATE459711T1/de not_active IP Right Cessation
- 2005-01-13 US US10/586,245 patent/US20090155849A1/en not_active Abandoned
- 2005-01-13 CA CA002553807A patent/CA2553807A1/en not_active Abandoned
- 2005-01-13 WO PCT/EP2005/000444 patent/WO2005068619A1/en not_active Ceased
Non-Patent Citations (3)
| Title |
|---|
| CONRATH, K. E., LAUWEREYS, M., WYNS, L., MUYLDERMANS, S. Camel single-domain antibodies as modular building units in bispecific and bivalent antibody constructs. The Journal of Biological Chemistry. Marzo 2001, Vol. 276, N$^{o}$ 10, páginas 7346-7350. ISSN 0021-9258. * |
| VEIGA, E., DE LORENZO, V., FERNÁNDEZ, L. A. Autotransporters as scaffolds for novel bacterial adhesins: surface properties of Escherichia coli cells displaying Jun/Fos dimerization domains. Journal of Bacteriology. Septiembre 2003, Vol. 185, N$^{o}$ 18, páginas 5585-5590. ISSN 0021-9193. * |
| VEIGA, E., DE LORENZO, V., FERNÁNDEZ, L. A. Neutralization of enteric coronaviruses with Escherichia coli cells expressing single-chain Fv-autotransporter fusions. Journal of Virology. Diciembre 2003, Vol. 77, N$^{o}$ 24, páginas 13396-13398. ISSN 0022-538X. * |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| DE602005019691D1 (de) | 2010-04-15 |
| ES2301262A1 (es) | 2008-06-16 |
| EP1709168A1 (en) | 2006-10-11 |
| WO2005068619A1 (en) | 2005-07-28 |
| US20090155849A1 (en) | 2009-06-18 |
| EP1709168B1 (en) | 2010-03-03 |
| ATE459711T1 (de) | 2010-03-15 |
| CA2553807A1 (en) | 2005-07-28 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| Stader et al. | [15] Engineering Escherchia coli to secrete heterologous gene products | |
| Kaushik et al. | Bacterial signal peptides-navigating the journey of proteins | |
| Jose et al. | The autodisplay story, from discovery to biotechnical and biomedical applications | |
| Georgiou et al. | Preparative expression of secreted proteins in bacteria: status report and future prospects | |
| Oliver et al. | Identification of secretion determinants of the Bordetella pertussis BrkA autotransporter | |
| Pishesha et al. | Sortase A: a model for transpeptidation and its biological applications | |
| Cornelis | Expressing genes in different Escherichia coli compartments | |
| Lai et al. | The T-pilus of Agrobacterium tumefaciens | |
| Mori et al. | Post-translational protein translocation into thylakoids by the Sec and ΔpH-dependent pathways | |
| Maurer et al. | Characterization of the essential transport function of the AIDA-I autotransporter and evidence supporting structural predictions | |
| Desvaux et al. | The autotransporter secretion system | |
| Lory | Determinants of extracellular protein secretion in gram-negative bacteria | |
| Tjalsma et al. | Proteomics of protein secretion by Bacillus subtilis: separating the “secrets” of the secretome | |
| Nuttall et al. | A naturally occurring NAR variable domain binds the Kgp protease from Porphyromonas gingivalis | |
| Desvaux et al. | Type V protein secretion: simplicity gone awry? | |
| Blight et al. | Protein secretion pathways in Escherichia coli | |
| Ramesh et al. | Single-cell characterization of autotransporter-mediated Escherichia coli surface display of disulfide bond-containing proteins | |
| Jarmander et al. | A dual tag system for facilitated detection of surface expressed proteins in Escherichia coli | |
| Saurí et al. | Estimating the size of the active translocation pore of an autotransporter | |
| Newman et al. | Autotransporter and two-partner secretion: delivery of large-size virulence factors by gram-negative bacterial pathogens | |
| KR0185335B1 (ko) | 표면 발현 벡터 및 이를 이용한 단백질의 미생물 표면 발현 방법 | |
| US20080280346A1 (en) | System For the Production of Dimeric Proteins Based on the Transport System of Hemolysin of Escherichia Coli | |
| ES2301262A1 (es) | Generacion de adhesion especifica en bacterias gram negativas mediante el anclaje de monodomios de inmunoglobulinas en su superficie con autotransportadores. | |
| Frate et al. | Export and folding of signal‐sequenceless Bacillus licheniformisβ‐lactamase in Escherichia coli | |
| Puorger et al. | Elucidation of the recognition sequence of sortase B from Bacillus anthracis by using a newly developed liquid chromatography–mass spectrometry-based method |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| EC2A | Search report published |
Date of ref document: 20080616 Kind code of ref document: A1 |
|
| FD2A | Announcement of lapse in spain |
Effective date: 20180809 |