ES2529442T3 - Proteína de fusión para la expresión de proteínas secretoras - Google Patents
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Abstract
Célula huésped que puede expresar más de un POI (polipéptido de interés), comprendiendo la célula huésped una proteína de fusión o un ácido nucleico que codifica para una proteína de fusión, comprendiendo dicha proteína de fusión dichos POI y i. un dominio pasajero que comprende un dominio de tallo beta de una proteína autotransportadora, en el que la secuencia que forma tallo beta del dominio pasajero está esencialmente intacta; ii. un dominio translocador de una proteína autotransportadora; y iii. un péptido señal que puede dirigir la proteína de fusión a la membrana interna de bacterias Gramnegativas; en la que el dominio pasajero del autotransportador en su forma nativa comprende al menos dos dominios laterales, y en la que al menos dos POI se insertan en, reemplazan o reemplazan parcialmente un dominio lateral separado.
Description
Proteína de fusión para la expresión de proteínas secretoras
La presente invención se refiere en general a una proteína de fusión novedosa y a un método para la expresión de proteínas secretoras.
La expresión de proteínas secretoras es la expresión de una proteína en una célula huésped, en la que la proteína se exporta a la membrana celular y o bien se libera de manera soluble al medio o bien permanece unida a la membrana celular. La expresión de proteínas secretoras está mediada por un péptido señal en el extremo N-terminal
15 de la proteína que dirige el polipéptido a la membrana.
Habitualmente, las proteínas recombinantes que se producen en huéspedes procariotas tales como E. coli se producen de manera intracelular. Cuando la proteína se recupera en un procedimiento de este tipo, las células tienen que lisarse lo que conduce a la contaminación de la proteína recombinante con el contenido celular. La proteína tiene que recuperarse entonces de extractos de células completas en procedimientos de purificación de múltiples etapas, lo que requiere mucho tiempo y da como resultado escasos rendimientos.
La secreción de proteínas recombinantes al medio es una mejor estrategia porque la purificación de proteínas a partir de medio gastado es más fácil y más compatible con el cultivo continuo. Sin embargo, los presentes sistemas
25 no tienen rendimientos eficaces.
La expresión de proteínas secretoras en la que la proteína permanece unida a la superficie celular tiene otros usos. Los ejemplos de uso para este tipo de expresión de proteínas incluyen el desarrollo de vacunas vivas, mapeo de epítopos, desarrollo de biosensores y biosorbentes y la selección de alto rendimiento de bibliotecas de proteínas y péptidos para el descubrimiento de fármacos.
Tanto en la presentación en superficie como en la secreción, las proteínas recombinantes se enfrentan al desafío de la translocación a través de la compleja envuelta de la célula E. coli que consiste en dos membranas lipídicas (la membrana interna y externa) con un compartimento similar a gel, el periplasma, entremedias. Se ha mostrado que
35 esto es muy difícil y los métodos usados previamente han tenido una baja eficacia.
Los autotransportadores son proteínas grandes que se secretan por bacterias Gram-negativas, tales como E. coli. El sistema de autotransportador es sencillo en el sentido de que el autotransportador, tal como implica su nombre, se sugiere que porta toda la información para la translocación a través del periplasma y la membrana externa dentro de la propia proteína. Sin embargo, el mecanismo mediante el cual se secretan los autotransportadores no se entiende todavía completamente.
Los autotransportadores se sintetizan como proteínas precursoras grandes que contienen tres dominios principales:
(i) un péptido señal N-terminal que dirige la proteína al translocón Sec e inicia la transferencia a través de la
45 membrana interna, (ii) un dominio pasajero que comprende la proteína de “cargamento” que va a secretarse y (iii) un dominio de formación de poros C-terminal (dominio translocador) que comprende una estructura de barril beta que se integra en la membrana externa y desempeña un papel crucial pero poco claro en la translocación del dominio pasajero a través de la membrana externa al espacio extracelular.
Tras la translocación, el dominio pasajero se escinde del dominio translocador y se libera al entorno extracelular. En algunos casos, el dominio pasajero permanece unido de manera no covalente a la superficie celular. La escisión puede lograrse mediante la acción de una proteasa (externa) en un motivo de proteasa situado entre el dominio translocador y el dominio pasajero. Alternativamente, la escisión tiene lugar a través de un acontecimiento autocatalítico intramolecular en un sitio específico entre el dominio translocador y el dominio pasajero.
55 El dominio pasajero de un autotransportador comprende una estructura de tallo beta y dominios laterales. El tallo beta es una estructura alargada formada por una hélice beta extendida. El extremo C-terminal del dominio pasajero comprende un dominio autochaperona que se ha implicado tanto en el plegado del pasajero como en la translocación a través de la membrana externa.
Hbp es una proteína autotransportadora que pertenece a la subfamilia de autotransportadores de serina proteasa de Enterobacteriaceae (SPATE). La estructura cristalina del dominio pasajero de Hbp se ha determinado recientemente (Otto et al. 2005 J Biol Chem 280(17): 17339-45) y se muestra como figura 11A. La estructura muestra que el polipéptido forma una estructura de hélice beta larga en el sentido de las agujas del reloj (“tallo beta”). El dominio 65 pasajero de la Hbp comprende dos dominios laterales más grandes, el dominio d1 y el dominio d2, de los cuales d1 comprende la actividad serina proteinasa de la proteína y d2 tiene una función desconocida. Hay también tres
dominios laterales más pequeños, el dominio 3 (d3), dominio 4 (d4) y dominio 5 (d5).
Se han mostrado también dominios de tallo beta similares para otros autotransportadores tales como pertactina (Emsley et al 1996 Nature 381: 90-92) e IgA proteasa (Johnson et al 2009 J Mol Biol 389(3): 559-74).
5 Ha habido intentos previos en el uso de autotransportadores para la expresión de proteínas secretoras en E. coli, principalmente usando variantes de la IgA proteasa de Neisseria (Pyo et al 2009 Vaccine 27 2030-2036) y el autotransportador de E. coli endógeno AIDA-I (Van Gerven et al 2009 Microbiology 155:468-476) que se modificaron por ingeniería genética para fines de presentación en superficie.
Los esfuerzos en el uso de IgA proteasa y AIDA-I para la secreción de proteínas recombinantes usaron constructos que dieron como resultado escasos rendimientos de proteína secretada y expuesta en la superficie (Pyo et al 2009 Vaccine 27 2030-2036; Van Gerven et al 2009 Microbiology 155:468-476). En la mayoría de tales estudios el dominio pasajero completo, o casi completo, endógeno se reemplazó por la proteína recombinante.
15 Hasta la fecha, los autotransportadores se han usado principalmente como plataforma de presentación en vez de para la secreción de proteínas heterólogas en forma soluble, cuando la proteína se secreta al medio.
La IgA proteasa requiere una proteasa auxiliar para el procesamiento mientras que AIDA-1 permanece unidad de manera no covalente a la membrana externa tras la escisión. Por tanto, estos autotransportadores sólo pueden usarse para la presentación en superficie de epítopos y proteínas.
Se ha mostrado previamente la secreción y presentación eficaces de calmodulina fusionada al pasajero de Hbp (Jong et al 2007 Molecular Microbiology 63:1524-1536). Con el fin de minimizar la perturbación del tallo nativo del
25 pasajero, la calmodulina reemplazó al dominio 2 del pasajero de Hbp.
Konieczky et al., FEMS immunology and medical microbiology, vol. 27, n.º 4, 1 de abril de 2000 (), páginas 321-332, describen la presentación en la superficie celular de (poli)péptidos recombinantes incluyendo epítopos de células T funcionales mediante el sistema de autotransportador de AIDA.
El documento WO 02/070645 A2 (MAX PLANCK GESELLSCHAFT [DE]; JOSE JOACHIM [DE]; HANNEMANN FRANCK [DE]) 12 de septiembre de 2002 () da a conocer la presentación de polipéptidos funcionales recombinantes sobre la superficie de una célula huésped usando el dominio de transporte de un autotransportador.
35 Jose J et al., microbiology and molecular biology reviews, American Society for Microbiology, EE.UU., resumen las características estructurales básicas del sistema de autopresentación de Escherichia coli y proporciona ejemplos para su aplicación satisfactoria en la presentación de enzimas, biocatálisis de células completas, presentación de inhibidores y examen de bibliotecas de diseño y desarrollo de vacunas vivas.
Jong W S et al., Current Opinion in Biotechnology, Londres, RU, dan a conocer el progreso reciente en el análisis estructural y mecanístico de la ruta de autotransportador de Escherichia coli y las implicaciones para el desarrollo futuro de una plataforma versátil para la secreción y presentación de proteínas heterólogas.
Para determinadas aplicaciones la posibilidad de secretar o presentar más de una proteína de interés (POI) a partir
45 de/sobre la superficie celular es muy útil. Tales aplicaciones incluyen vacunas, por ejemplo en las que dos o más epítopos se presentan sobre la misma superficie celular, presentación de enzimas, en la que más de una enzima se presenta sobre la superficie celular con el fin de llevar a cabo una gama de reacciones catalíticas en una serie de etapas, exposición de bibliotecas de péptidos y selección de inhibidores.
Para vacunas multivalentes es particularmente útil tener un sistema en el que una población de células huésped puede expresar y presentar o secretar múltiples antígenos, en vez de tener una mezcla de poblaciones celulares, cada una presentando o secretando sólo uno de los antígenos. Tener sólo una población celular que presenta o secreta múltiples antígenos tiene la ventaja de una producción más fácil y un mejor control del contenido de la vacuna.
55 En conclusión, hay una necesidad de sistemas de expresión secretores mejorados para la presentación de proteínas heterólogas así como la secreción de proteínas heterólogas en forma soluble al medio de cultivo. Hay también una necesidad de un sistema y un método que permita la expresión de proteínas secretoras de más de una proteína de interés sobre la superficie celular de una célula huésped o la secreción de más de una proteína al medio de cultivo.
Un objeto de la presente invención es proporcionar secreción eficaz de un polipéptido de interés (POI) a partir de una célula huésped.
65 Un segundo objeto de la invención es proporcionar presentación eficaz de un POI sobre la superficie de una célula
huésped.
Un tercer objeto de la invención es proporcionar secreción soluble eficaz de un POI en el medio en el que se cultiva una célula huésped.
5 Aún otro objeto de la invención es proporcionar un armazón para la secreción eficaz, es decir presentación o secreción soluble, de más de un POI.
Se proporciona una célula huésped que puede expresar más de una, tal como al menos dos, POI (proteínas de interés). Las POI están comprendidas en una proteína de fusión que también comprende un dominio pasajero que comprende un dominio de tallo beta de una proteína autotransportadora, un dominio translocador de una proteína autotransportadora y un péptido señal que puede dirigir la proteína de fusión a la membrana interna de bacterias
15 Gram-negativas. La secuencia que forma tallo beta del dominio pasajero está esencialmente intacta y las POI se fusionan al dominio pasajero.
Esta célula huésped para la expresión de proteínas secretoras tiene varias ventajas, incluyendo pero sin limitarse a secreción más eficaz de más de una POI, en comparación con otros sistemas. Además, cuando el objetivo es presentar la POI, el dominio de tallo beta permitirá una presentación más eficaz ya que las POI estarán además lejos de la superficie celular y serán más estables.
En la célula huésped, la forma nativa del dominio pasajero del autotransportador comprende al menos un dominio lateral que sobresale del dominio de tallo beta. Entonces, las POI pueden insertarse en, reemplazar o reemplazar
25 parcialmente tal dominio lateral.
En otra realización la forma nativa del dominio pasajero del autotransportador comprende al menos dos dominios laterales. Entonces, cada POI puede insertarse en, reemplazar o reemplazar parcialmente uno de tales dominios laterales separados, o las POI pueden insertarse en, reemplazar o reemplazar parcialmente el mismo dominio lateral.
Las POI también pueden fusionarse a un dominio pasajero, dominio translocador y péptido señal independientes de un autotransportador.
35 Se proporciona una proteína de fusión que comprende más de una, tal como al menos dos, POI (proteínas de interés), un dominio pasajero que comprende un dominio de tallo beta de una proteína autotransportadora, un dominio translocador de una proteína autotransportadora y, opcionalmente, un péptido señal que dirige la proteína de fusión a la membrana interna de bacterias Gram-negativas. La secuencia que forma tallo beta del dominio pasajero está esencialmente intacta y las POI se fusionan al dominio pasajero.
El dominio pasajero de la proteína de fusión puede comprender en su forma nativa al menos un dominio lateral que sobresale del dominio de tallo beta, y las POI pueden insertarse en, reemplazar o reemplazar parcialmente tal dominio lateral. El dominio pasajero de la proteína de fusión también puede comprender en su forma nativa al menos dos dominios laterales, y cada POI puede insertarse en, reemplazar o reemplazar parcialmente dominios
45 independientes de tales dominios laterales. Alternativamente las POI pueden insertarse en, reemplazar o reemplazar parcialmente el mismo dominio lateral.
Se proporciona un ácido nucleico dispuesto para la expresión de una proteína de fusión. El ácido nucleico puede comprender, en marco, una secuencia que codifica para un péptido señal de la proteína de fusión, que puede dirigir la proteína de fusión a la membrana interna de bacterias Gram-negativas, una secuencia que codifica para un dominio pasajero de la proteína de fusión, que comprende un dominio de tallo beta de una proteína autotransportadora, y una secuencia que codifica para un dominio translocador de la proteína de fusión, que se deriva de una proteína autotransportadora. La secuencia que codifica para el dominio pasajero comprende al menos dos tramos de secuencia de sitio de clonación que permiten la clonación en marco de al menos dos secuencias de
55 ADN que codifican para POI (proteínas de interés). Las secuencias de sitio de clonación están dispuestas de tal manera que la secuencia de proteína que forma tallo beta codificada del dominio pasajero está esencialmente intacta. También es posible insertar POI en un autotransportador simplemente fusionando dos trozos de ADN, por ejemplo mediante PCR, sin usar sitios de clonación creando de ese modo una proteína de fusión.
La secuencia que codifica para el dominio pasajero del autotransportador puede comprender en su forma nativa al menos dos tramos de secuencia que codifican para dominios laterales que sobresalen del dominio de tallo beta. Entonces, los al menos dos tramos de secuencia de sitio de clonación pueden insertarse en, reemplazar o reemplazar parcialmente tales tramos separados que codifican para dominios laterales.
65 El ácido nucleico puede comprender, en marco, una secuencia que codifica para un péptido señal de la proteína de fusión, que puede dirigir la proteína de fusión a la membrana interna de bacterias Gram-negativas, una secuencia
que codifica para un dominio pasajero de la proteína de fusión, que comprende un dominio de tallo beta de una proteína autotransportadora, una secuencia que codifica para un dominio translocador de la proteína de fusión, que se deriva de una proteína autotransportadora, y secuencias que codifican para al menos dos POI de la proteína de fusión. Las secuencias que codifican para las POI están fusionadas con la secuencia que codifica para el dominio
5 pasajero y están dispuestas de tal manera que la secuencia de proteína que forma tallo beta codificada del dominio pasajero está esencialmente intacta.
La secuencia que codifica para el dominio pasajero del autotransportador en su forma nativa puede comprender al menos dos tramos de secuencia que codifican para dominios laterales que sobresalen del dominio de tallo beta. Entonces, cada una de las al menos dos secuencias que codifican para POI puede insertarse en, reemplazar o reemplazar parcialmente cada uno de los tramos que codifican para dominios laterales.
La célula huésped, la proteína de fusión o el ácido nucleico pueden estar dispuestos de manera que la proteína de fusión, cuando se expresa, se secrete a partir de la superficie celular. Por ejemplo, la proteína de fusión puede
15 comprender un sitio de escisión que permite que la proteína de fusión se escinda y se secrete a partir de una célula huésped que expresa la proteína de fusión. Y el ácido nucleico que codifica para la proteína de fusión puede codificar para un sitio de escisión de este tipo.
Alternativamente, la célula huésped, la proteína de fusión o el ácido nucleico pueden estar dispuestos de tal manera que la proteína de fusión, cuando se expresa, se presente en la superficie celular. Por ejemplo la proteína de fusión puede no comprender ningún sitio de escisión de este tipo o puede comprender un sitio de escisión alterado. De manera similar el ácido nucleico que codifica para la proteína de fusión no codifica entonces para ningún sitio de escisión de este tipo o codifica para un sitio de escisión alterado. Alternativamente, la proteína de fusión y el ácido nucleico pueden comprender un sitio de escisión y la proteína de fusión resultante puede escindirse, pero sigue
25 estando unida de manera no covalente a, y por tanto presentada en, la superficie celular.
El dominio pasajero y el dominio translocador pueden derivarse de una proteína SPATE (autotransportadores de serina proteasa de Enterobacteriaceae), tal como proteasa de unión a hemoglobina (Hbp), serina proteasa extracelular (EspC) o hemaglutinina sensible a la temperatura (Tsh) de Escherichia coli.
En un aspecto de la invención se proporciona un vector que comprende un ácido nucleico de la invención.
En otro aspecto de la invención se proporciona una célula huésped que comprende un ácido nucleico o un vector de la invención.
35 En una realización la célula huésped de la invención es una bacteria Gram-negativa, que puede seleccionarse de la familia de Enterobacteriaceae, tal como Escherichia coli, Salmonella spp., Vibrio spp., Shigella spp., Pseudomonas spp., Burkholderia spp. o Bordetella spp.
En un aspecto se proporciona una vesícula de membrana externa que presenta una proteína de fusión según la invención. En otro aspecto se proporciona un fantasma bacteriano que presenta una proteína de fusión según la invención.
En un aspecto se proporciona un método para la expresión de proteínas secretoras de una proteína de fusión, que
45 comprende las etapas de proporcionar una célula huésped según la invención e inducir la expresión de la proteína de fusión.
En una realización el método comprende la etapa adicional de inhibir una enzima periplásmica, tal como DegP, con actividad proteasa en la célula huésped. DegP puede inhibirse por ejemplo por una mutación en su sitio catalítico.
En otra realización el método comprende la etapa adicional de regular por disminución al menos una enzima, tal como DsbA o DsbB, que cataliza la formación de enlaces disulfuro en proteínas en el espacio periplásmico de la célula huésped.
55 El método puede proporcionar secreción de la proteína de fusión de manera soluble. Alternativamente puede proporcionar presentación de la proteína de fusión sobre la superficie celular.
En una realización el método comprende la etapa adicional de inducir liberación de vesículas desde la membrana externa de la célula huésped, que es una bacteria Gram-negativa, formando así vesículas de membrana externa que presentan la proteína de fusión sobre su superficie.
En otra realización el método comprende la etapa adicional de lisar la bacteria Gram-negativa, formando así fantasmas bacterianos que presentan la proteína de fusión sobre su superficie. El lisado puede realizarse usando el gen E de lisis letal del bacteriófago PhiX174.
65 En una realización al menos una de las POI pueden comprender un antígeno, por ejemplo de un organismo
infeccioso. El antígeno es por ejemplo un antígeno de Mycobacterium tuberculosis, tal como ESAT-6, Ag85B, Rv2660c, TB10.4 y TB10.3, o una proteína que es similar a esas proteínas.
En un aspecto se proporciona una vacuna que comprende una célula huésped, una proteína de fusión, una vesícula 5 de membrana externa o un fantasma bacteriano según la invención.
La invención se describe ahora, a modo de ejemplo, con referencia a las figuras adjuntas, en las que:
Las figuras 1-10 muestran mapas de plásmido de plásmidos usados en los ejemplos.
Las figuras 11A-D muestran figuras de la estructura del dominio pasajero de Hbp en la que se indican determinados dominios.
15 La figura 11E muestra diversos constructos de proteínas de fusión usados en los ejemplos 1-15.
Las figuras 12-33 muestran datos experimentales de los ejemplos 1-19. Para detalles, véase la sección de ejemplos.
La figura 34 muestra un mapa de un plásmido usado en los ejemplos.
Definiciones
Tal como se usa en el presente documento, se proporcionan las siguientes definiciones para facilitar la comprensión 25 de la presente invención.
Un “autotransportador” es una proteína que pertenece a la familia de autotransportadores pfam (“autotransportador” PF03797) y que también se sabe o se predice que forma un motivo de tallo beta. Puede usarse el método BETAWRAPPRO para el análisis de secuencias para predecir si el dominio pasajero de un autotransportador formará un dominio de tallo beta (Junker et al 2006 Proc Natl Acad Sci USA 103(13): 4918-23).
Un “polipéptido de interés” (POI) es un polipéptido que el usuario de la invención desea que una célula huésped secrete en forma soluble al medio o que se presente sobre la superficie celular, o ambos. Normalmente, el POI es una proteína que el usuario estudia o desea que se exprese, mientras que las otras partes de la proteína de fusión
35 ayudan en el proceso de secreción. Normalmente, el POI también es heterólogo para los dominios de autotransportador con los que está fusionado. El POI tiene al menos 4 aminoácidos de longitud, al menos 10 aminoácidos de longitud o al menos 20 aminoácidos de longitud.
“Secuencia que forma tallo beta” se refiere a la secuencia de un dominio pasajero de un autotransportador que forma una estructura de tallo beta. La secuencia que forma tallo beta de un pasajero puede identificarse usando determinación de la estructura cristalina. Tal como se describió anteriormente la secuencia que forma tallo beta puede identificarse alternativamente usando el método de modelado por homología M4T (Rykunov et al 2009 J Struct Funct Genomics 10: 95-99) o métodos de predicción similar.
45 Un “dominio lateral” es un dominio que es parte del dominio pasajero pero no es parte del tallo beta. Normalmente, un dominio lateral está ubicado en el dominio pasajero entre dos tramos de secuencia que forma tallo beta. Un dominio lateral comienza en el primer aminoácido tras la hebra beta anterior y termina un aminoácido antes del aminoácido de partida de la hebra beta tras el dominio lateral. El dominio lateral también puede ubicarse en el extremo N-terminal del dominio pasajero. Los autotransportadores pueden tener varios dominios laterales.
“Proteína similar”, “secuencia similar” o una “proteína de tipo” se refiere a una proteína que tiene un alto grado de homología con otra proteína cuando se comparan las dos secuencias de aminoácidos. Preferiblemente, es al menos el 80%, más preferiblemente más del 90%, más preferiblemente más del 95%, incluso más preferiblemente más del 97% homóloga con la secuencia comparativa cuando se alinean las dos secuencias de manera óptima. La
55 homología de secuencia puede medirse fácilmente usando software disponible para el público tal como BLAST.
“Célula huésped” se refiere a una célula procariota en la que se han introducido uno o más vectores o secuencias de ácido nucleico aisladas y purificadas de la invención. Se entiende que el término se refiere no sólo a la célula objetivo particular sino también a la progenie o la posible progenie de tal célula. Ya que pueden producirse determinadas modificaciones en las generaciones posteriores debido a o bien mutaciones o bien influencias del entorno, tal progenie puede no ser, de hecho, idéntica a la célula original, pero todavía se incluye dentro del alcance del término tal como se usa en el presente documento.
“Presentada”: una proteína secretada se presenta sobre la superficie de la célula huésped secretora cuando
65 permanece asociada con la membrana externa de la célula huésped de tal manera que sobresale al menos parcialmente fuera de la célula. La proteína secretada puede unirse a la membrana celular o a un componente que
se encuentra en la misma (tal como el dominio translocador de un autotransportador) de manera covalente o no covalente.
“Secreción soluble” y “secreción de manera soluble” se refiere a secreción de una proteína en la que la proteína se
5 secreta al espacio extracelular de manera que no está asociada con la célula huésped al contrario que cuando la proteína permanece asociada a la membrana externa de la célula huésped, o una proteína que está integrada en la membrana externa de la célula huésped.
“Aproximadamente” indica una desviación de +/-10% del valor indicado, cuando sea aplicable.
Los inventores han encontrado que puede usarse una proteína autotransportadora para la expresión mejorada de proteínas secretoras si la secuencia que forma tallo beta del dominio pasajero del autotransportador está
15 esencialmente intacta. Mientras que la secuencia que forma tallo beta real es esencial para una secreción óptima, los dominios laterales del dominio pasajero de autotransportadores son sitios adecuados para la inserción de un POI. Los dominios laterales pueden reemplazarse por un POI que entonces se secretará. Alternativamente, el POI puede insertarse para reemplazar una parte del dominio lateral o para fusionarse con un dominio lateral.
Los inventores también han encontrado que puede usarse una proteína autotransportadora para la expresión mejorada de proteínas secretoras de más de uno, tal como al menos dos, POI si la secuencia que forma tallo beta del dominio pasajero del autotransportador está esencialmente intacta. Fusionando, es decir insertando, reemplazando o reemplazando parcialmente, los POI en uno o más dominios laterales del pasajero, mientras se mantiene la estructura de tallo beta intacta, se logra un sistema eficaz y relativamente fácil de usar para la
25 presentación o secreción soluble simultánea de dos o más POI.
Los dominios laterales que pueden reemplazarse según la invención son relativamente grandes, tal como de 20, 30, 40, 60, 80 o más residuos de aminoácido.
Por tanto, el dominio pasajero de un autotransportador puede considerarse como varias secciones de secuencia que forma tallo beta unidas entre sí por secuencias que no forman tallo beta. Estas secuencias que no forman tallo beta son sitios adecuados para la inserción de uno o más POI. Por tanto, el POI puede colocarse entre dos partes de secuencia que forma tallo beta. El POI también puede fusionarse al extremo N-terminal del dominio pasajero.
35 Los métodos adecuados para detectar una secuencia que forma tallo beta y dominios laterales de dominios pasajeros de autotransportadores incluyen métodos biofísicos tales como cristalografía de rayos X y software bioinformático tal como herramientas de predicción de la estructura.
Actualmente la cristalografía de rayos X es un procedimiento convencional que es altamente eficaz y está automatizado y lo conoce un experto en la técnica. Se encuentran ejemplos de estructuras de alta resolución de dominios pasajeros y métodos adecuados para la determinación de estructuras del dominio pasajero de autotransportadores en (Otto et al 2005 J Biol Chem 280(17):17339-45; Emsley et al 1996 Nature 381: 90-92; Johnson et al 2009 J Mol Biol 389(3): 559-74).
45 Un ejemplo de un método bioinformático que es adecuado para determinar la estructura de tallo beta es el método de modelado por homología M4T (Rykunov et al 2009 J Struct Funct Genomics 10: 95-99), que está disponible de manera gratuita en internet.
Cuando se usa un modelo tridimensional de la proteína para la identificación de dominios de tallo beta y dominios laterales, es adecuado que el modelo obtenido tenga una resolución mejor de 4 angstrom. Entonces serán visibles los dominios laterales como dominios que sobresalen del tallo beta. Mediante la observación de la estructura de los dominios pasajeros de autotransportadores puede observarse que partes de la secuencia no son parte del tallo beta sino que forman dominios que sobresalen del tallo beta.
55 Estos métodos pueden usarse para determinar qué dominios o aminoácidos de los dominios pasajeros son adecuados para la inserción de un POI y cuáles deberían mantenerse esencialmente intactos.
La secuencia que forma tallo beta está esencialmente intacta según la invención. Por tanto, debe eliminarse lo menos posible de la secuencia que forma tallo beta. El límite de dominio predicho sirve de ayuda para determinar dónde debería(n) insertarse el/los POI. Si se elimina demasiado de la secuencia que forma tallo beta, la secreción se verá afectada negativamente. Que la secuencia que forma tallo beta está esencialmente intacta significa que la eficacia de la función secretora de la proteína se mantiene a un nivel óptimo, en comparación con cuando se altera o se elimina completamente el tallo beta. También significa que se mantiene la estabilidad del pasajero tras la secreción. Un experto en la técnica puede usar métodos experimentales para determinar si un constructo particular
65 permite una secreción eficaz.
Los ejemplos de métodos adecuados para determinar la eficacia de secreción in vitro incluyen: análisis de la fracción de POI presente en el medio, marcaje de proteínas de superficie con biotina u otros marcadores, fraccionamiento celular, exposición de proteínas de superficie a proteasas (tales como proteinasa K) y estudios que usan anticuerpos contra el POI (tales como estudios de transferencia puntual, microscopía de inmunofluorescencia y microscopía
5 inmunoelectrónica).
Los ejemplos de métodos adecuados para determinar la estabilidad del pasajero tras la secreción incluyen SDS-PAGE, inmunotransferencia de tipo Western y todos los anteriores en el párrafo 76.
Por tanto, usando información estructural, un experto en la técnica puede predecir dónde puede realizarse en el dominio pasajero la inserción del POI para mantener una secreción óptima. La secreción real puede determinarse fácilmente con experimentos in vitro.
El POI está fusionado al dominio pasajero. Esto significa que el POI está fusionado al péptido que forma el dominio
15 pasajero de manera que forma un polipéptido continuo. Debido a que el diseño de la proteína de fusión se lleva a cabo a nivel del ADN, debe tenerse cuidado para que el marco de lectura del POI sea el mismo que el marco de lectura del dominio pasajero.
Preferiblemente el POI tiene un peso molecular de menos de 200 kD. Más preferiblemente el peso molecular es de menos de 200 kD tal como de 100, 80, 60, 40, 30, 20, 10 ó 5 kD.
La proteína de fusión puede comprender más de un POI. Por tanto, la proteína de fusión puede comprender dos, tres o más polipéptidos de interés. La proteína de fusión puede ser tal que tenga al menos dos POI que cada uno reemplaza o reemplaza parcialmente, o está fusionado a, un dominio lateral separado o independiente del dominio
25 pasajero. Alternativamente, dos o más POI pueden estar fusionados a, o reemplazan o reemplazan parcialmente el mismo dominio lateral.
La proteína de fusión está codificada por un ácido nucleico y se expresa en una célula huésped. El ácido nucleico puede construirse con el uso de técnicas de biología molecular convencionales que implican enzimas de restricción, ADN ligases, PCR, síntesis de oligonucleótidos, purificación de ADN y otros métodos bien conocidos por un experto en la técnica. Preferiblemente, el punto de partida es un marco de lectura de una proteína autotransportadora en el que se inserta un fragmento de ADN que codifica para el POI de manera que los marcos de lectura coinciden. Alternativamente, el marco de lectura para la proteína de fusión puede diseñarse in silico y sintetizarse usando síntesis de polinucleótidos.
35 El marco de lectura que codifica para la proteína de fusión se inserta preferiblemente en un vector de expresión para la expresión procariota que porta un promotor y otros componentes bien conocidos por un experto en la técnica.
La proteína de fusión comprende un péptido señal N-terminal que dirige la proteína para la secreción. Cuando la célula huésped es una bacteria Gram-negativa, el péptido señal adecuado es tal que dirige la translocación de la proteína a través de la membrana interna. El péptido señal puede derivarse de una proteína autotransportadora, adecuadamente el mismo autotransportador del que se deriva el dominio pasajero. El péptido señal puede comprender aproximadamente los aminoácidos 1 a 52 de SEQ ID NO 1, o una secuencia similar.
45 La proteína de fusión comprende adecuadamente un dominio autochaperona, adecuadamente a partir del dominio pasajero de la proteína autotransportadora usada para fusionar el POI. Un ejemplo de un dominio autochaperona comprende aproximadamente los aminoácidos 1002 a 1100 de SEQ ID NO 1.
La proteína de fusión puede comprender un dominio pasajero de un tipo de autotransportador y un dominio translocador de otro tipo de autotransportador.
El autotransportador usado en la invención puede ser un autotransportador con un dominio serina proteasa, tal como una serina proteasa.
55 El autotransportador puede ser una proteína SPATE (autotransportadores de serina proteasa de Enterobacteriaceae). Por tanto, el dominio translocador y el dominio pasajero pueden ser de una proteína SPATE. En una realización la proteína SPATE es una de proteasa de unión a hemoglobina (Hbp) (SwissProt 088093) y hemaglutinina sensible a la temperatura (Tsh) (SwissProt Q47692) de E. coli. La secuencia de Tsh es homóloga a la de Hbp.
Otras proteínas SPATE incluyen IgA proteasa de Neisseria gonorrhoeae y Haemophilus influenzae, EspC de E. coli, Pet de E. coli, EspP de E. coli, Pic de E. coli, PicU de E. coli, Sat de E. coli, Vat de E. coli, Espl de E. coli, EaaA de
E. coli, EaaC de E. coli, EatA de E. coli, EpeA de E. coli, PssA de E. coli, AidA_B7A de E. coli, Boa de Salmonella bongori, SepA de Shigella flexneri, SigA de Shigella flexneri, Pic de Shigella flexneri.
65 La proteína SPATE puede comprender el polipéptido de SEQ ID NO 1, que es Hbp, o SEQ ID NO 2, que es Hbp en
el que se ha alterado el sitio de escisión entre el dominio translocador y el dominio pasajero (Hbp delta-cleav) o una secuencia que es similar a esas secuencias. Preferiblemente la identidad es de más del 80%, incluso más preferiblemente más del 90%, incluso más preferiblemente más del 95% y lo más preferiblemente más del 97% con esas secuencias.
5 El grupo SPATE de proteínas tiene varias ventajas para su uso con la presente invención. En primer lugar, algunas de sus estructuras se conocen, lo que facilita la identificación de su tallo beta y dominios laterales. Este conocimiento también puede usarse para la predicción de dominios laterales y estructuras de tallo beta de SPATE relacionadas para las que no se conoce la estructura cristalina. Otra ventaja es su estructura de escisión que puede usarse para una secreción soluble eficaz y que se conserva dentro de la familia SPATE.
También pueden usarse otros autotransportadores, para los que se conoce la estructura, puede predecirse o se conocerá, de manera que puede determinarse su estructura de tallo beta y dominio lateral, con la presente invención. El autotransportador debe tener un tallo beta, un dominio lateral y opcionalmente un sistema de escisión
15 que es eficaz para la secreción soluble. Un ejemplo incluye el autotransportador Haps de H. influenzae, que no es un miembro de la familia SPATE. La estructura del pasajero de Haps se ha publicado recientemente (Meng et al 12 de agosto de 2011 The EMBO Journal, doi: 10,1038/emboj.2011.279 [publicación electrónica antes de la impresión]). La estructura es muy parecida a la de Hbp, que tiene un tallo beta con cuatro dominios laterales (SD1-4).
La figura 11A muestra la estructura cristalina del dominio pasajero del autotransportador Hbp (Otto et al 2005 J Biol Chem 280(17): 17339-45). El dominio 1 (d1), dominio 2 (d2) y el dominio autochaperona (ac) están en gris claro. El resto del dominio pasajero, incluyendo el dominio de tallo beta está coloreado en negro. Ambos dominios d1 y d2 son adecuados para la inserción de un POI. Además, el dominio d3 mostrado en la figura 11C y los dominios d4 y d5 mostrados en la figura 11D son adecuados para el remplazo o la inserción de un POI.
25 El dominio d1 comprende aproximadamente los aminoácidos 53 a 308, d2 comprende aproximadamente los aminoácidos 533-608, d3 comprende aproximadamente los aminoácidos 657-697, d4 comprende aproximadamente los aminoácidos 735 a 766 y d5 comprende aproximadamente los aminoácidos 898 a 922 de SEQ ID NO 1, que es la secuencia de Hbp.
La figura 11E muestra la composición de dominios de Hbp de tipo natural. Además, se muestran las proteínas de fusión usadas en los ejemplos presentados en el presente documento. En Hbp de tipo natural, se muestran el dominio pasajero que comprende el tallo beta (en negro) y los dominios laterales d1, d2, d3, d4 y d5. El dominio translocador se ubica en la parte C-terminal de la proteína y se indica como “dominio ”. “Ac” indica un dominio
35 autochaperona. El péptido señal se indica mediante “ss”. Los números indican el número de aminoácido desde el extremo N-terminal.
Puede usarse un dominio pasajero que comprende aproximadamente los aminoácidos 53-1100 de SEQ ID NO 1, o una secuencia similar.
Puede usarse un dominio translocador que comprende aproximadamente los aminoácidos 1101-1377 de SEQ ID NO 1, o una secuencia similar.
El POI puede ser una proteína fraccionada. Una proteína fraccionada es una proteína que en su forma nativa
45 comprende un único polipéptido o varios polipéptidos que están unidos por puentes disulfuro u otros enlaces intermoleculares, y que para la presente invención se ha fraccionado en dos o más partes. Cada una de tales partes se fusiona con el pasajero de manera que forman una estructura no nativa, por ejemplo a una distancia lejana. Las dos o más partes pueden fusionarse por ejemplo con diferentes dominios laterales o el mismo dominio lateral pero a una distancia lejana. Se considera que cada una de tales partes es un POI, de manera que se considera que la proteína fraccionada son dos o más POI. Esto podría ser ventajoso por ejemplo cuando la proteína nativa tiene una estructura grande o compleja, por ejemplo que comprende puentes disulfuro, que inhibe la secreción eficaz. El fraccionamiento de la proteína puede hacer que la secreción sea más eficaz.
El POI puede comprender al menos un antígeno, por ejemplo de un organismo infeccioso tal como Mycobacterium
55 tuberculosis. Los ejemplos de tales antígenos de Mycobacterium tubercolosis incluyen proteínas de tipo ESAT-6 (por ejemplo ESAT-6, TB10.4, TB10.3), una proteína de tipo Ag85B (por ejemplo Ag85B) y Rv 2660c. Dos o más de tales antígenos pueden fusionarse con el mismo pasajero, por ejemplo con dominios laterales separados.
ESAT-6 (diana antigénica secretora temprana de 6 kDa) es una proteína de 10 kDa que es un potente antígeno de células T y un importante factor de virulencia.
Rv2660c es una proteína intracelular de 7,6 kDa de función desconocida.
TB10.3 y TB10.4 son ambas proteínas de 96 aminoácidos.
65 Ag85B es una micoliltransferasa secretora de 35 kDa, que comprende tres cisteínas. También es un potente
antígeno de células T. Esta proteína bastante grande y que comprende cisteína es demasiado compleja, en su forma nativa, para la translocación óptima de la membrana externa usando el sistema de autotransportador.
En una realización el antígeno está fraccionado tal como se describió anteriormente. Por ejemplo, Ag85B, que es 5 una proteína grande y bastante compleja, puede fraccionarse en una parte N’ (Ag85B(N’)) y una parte C’ (Ag85B(C’)) para una secreción más eficaz.
En una realización el POI comprende un polipéptido con una secuencia que es similar al menos al 80%, más preferiblemente al 90%, más preferiblemente al 95% lo más preferiblemente al 97% a SEQ ID NO 39, que es la secuencia de ESAT-6. En una realización el POI comprende el polipéptido definido en SEQ ID NO 39.
En una realización el POI comprende un polipéptido con una secuencia que es similar al menos al 80%, más preferiblemente al 90%, más preferiblemente al 95% lo más preferiblemente al 97% a SEQ ID NO 41, que es la secuencia de Rv2660c. En una realización el POI comprende el polipéptido definido en SEQ ID NO 41.
15 En una realización el POI comprende un polipéptido con una secuencia que es similar al menos al 80%, más preferiblemente al 90%, más preferiblemente al 95% lo más preferiblemente al 97% a SEQ ID NO 42, que es la secuencia de TB10.4. En una realización el POI comprende el polipéptido definido en SEQ ID NO 42.
En una realización el POI comprende un polipéptido con una secuencia que es similar al menos al 80%, más preferiblemente al 90%, más preferiblemente al 95% lo más preferiblemente al 97% a SEQ ID NO 43, que es la secuencia de TB10.3. En una realización el POI comprende el polipéptido definido en SEQ ID NO 43.
En una realización el POI comprende un polipéptido con una secuencia que es similar al menos al 80%, más
25 preferiblemente al 90%, más preferiblemente al 95% lo más preferiblemente al 97% a al menos % de SEQ ID NO 40, que es la secuencia de Ag85B. En una realización el POI comprende el polipéptido definido por los aminoácidos 1126 ó 118-285 en SEQ ID NO 40.
El POI puede estar flanqueado por una o más regiones de ligador. Una región de ligador puede ser un péptido flexible de 1 a 20, o más, aminoácidos. La región de ligador puede insertarse adecuadamente en los extremos C-y N-terminales del POI. Una ventaja de un ligador es que puede permitir que los diversos dominios de la proteína de fusión se muevan más independientes entre sí. Un ligador puede diseñarse fácilmente por un experto en la técnica. Los ejemplos de ligadores adecuados incluyen SEQ ID NO 44 y 45.
35 La proteína de fusión puede comprender el polipéptido definido en cualquiera de SEQ ID NO 13 -19, SEQ ID NO 22 -26 o SEQ ID NO 38 o un polipéptido que es similar al menos al 80%, más preferiblemente al 90%, más preferiblemente al 95% y lo más preferiblemente al 97% a una cualquiera de esas secuencias.
SEQ ID NO 13 es la secuencia de Hbp en la que ESAT6 ha reemplazado el dominio d1 (Hbp(d1)-ESAT6, también denominada HbpSL-ESAT6). SEQ ID NO 14 es la misma proteína pero en la que se ha alterado el sitio de escisión entre el dominio translocador y el dominio pasajero (HbpD(d1)-ESAT6, también denominada HbpDL-ESAT6). SEQ ID NO 15 es la secuencia de Hbp en la que ESAT6 ha reemplazado el dominio d2 (Hbp(d2)-ESAT6). SEQ ID NO 16 es la secuencia de Hbp en la que ESAT6 ha reemplazado el dominio d2 (HbpD(d2)-ESAT6, también denominada HbpDD2-ESAT6) y en la que se ha alterado el sitio de escisión entre el dominio translocador y el
45 dominio pasajero. SEQ ID NO 17 es la secuencia de Hbp en la que ESAT6 ha reemplazado el dominio d3 (Hbp(d3)-ESAT6). SEQ ID NO 18 es la secuencia de Hbp en la que ESAT6 ha reemplazado el dominio d4 (Hbp(d4)-ESAT6). SEQ ID NO 19 es la secuencia de Hbp en la que ESAT6 ha reemplazado el dominio d5 (Hbp(d5)-ESAT6).
SEQ ID NO 22 es la secuencia de Hbp en la que Rv2660c ha reemplazado el dominio d3 (Hbp(d3)-Rv2660c). SEQ ID NO 23 es la secuencia de Hbp en la que Rv2660c ha reemplazado el dominio d4 (Hbp(d4)-Rv2660c). SEQ ID NO 24 es la secuencia de Hbp en la que Rv2660c ha reemplazado el dominio d5 (Hbp(d5)-Rv2660c). SEQ ID NO 25 es la secuencia de Hbp en la que TB10.4 ha reemplazado el dominio d1 (Hbp(d1)-TB10.4). SEQ ID NO 26 es la secuencia de Hbp en la que TB10.3 ha reemplazado el dominio d2 (Hbp(d2)-TB10.3).
55 SEQ ID NO 38 es la secuencia de EspC en la que ESAT6 ha reemplazado el dominio d1 (EspC(d1)-ESAT6).
La proteína de fusión puede comprender un polipéptido con más de un POI, tal como el polipéptido definido en cualquiera de SEQ ID NO 28 -35 o un polipéptido que es similar al menos al 80%, más preferiblemente al 90%, más preferiblemente al 95% y lo más preferiblemente al 97% a una cualquiera de esas secuencias.
SEQ ID NO 28 es la secuencia de Hbp en la que los residuos 1-126 de Ag85B han reemplazado el dominio d1 y los residuos 118-285 de Ag85B han reemplazado el dominio 2 (Hbp-Ag85B[N+C]). SEQ ID NO 29 es la secuencia de Hbp en la que los residuos 1-126 de Ag85B han reemplazado el dominio d1 y los residuos 118-285 de Ag85B han 65 reemplazado el dominio 2, y en la que se ha alterado el sitio de escisión entre el dominio translocador y el dominio
pasajero (HbpD-Ag85B[N+C]). SEQ ID NO 30 es la secuencia de Hbp en la que los residuos 1-126 de Ag85B han reemplazado el dominio d2 y los residuos 118-285 de Ag85B han reemplazado el dominio 1 (Hbp-Ag85B[C+N]). SEQ ID NO 31 es la secuencia de Hbp en la que los residuos 1-126 de Ag85B han reemplazado el dominio d2 y los residuos 118-285 de Ag85B han reemplazado el dominio 1, y en la que se ha alterado el sitio de escisión entre el
5 dominio translocador y el dominio pasajero (HbpD-Ag85B[C+N]).
SEQ ID NO 32 es la secuencia de Hbp en la que los residuos 1-126 de Ag85B han reemplazado el dominio d2, los residuos 118-285 de Ag85B han reemplazado el dominio 1 y ESAT6 ha reemplazado el dominio d4 (Hbp-Ag85B[C+N]-ESAT6). SEQ ID NO 33 es la misma proteína pero en la que se ha alterado el sitio de escisión entre el dominio translocador y el dominio pasajero (HbpD-Ag85B[C+N]-ESAT6). SEQ ID NO 34 es la secuencia de Hbp en la que los residuos 1-126 de Ag85B han reemplazado el dominio d2, los residuos 118-285 de Ag85B han reemplazado el dominio 1, ESAT6 ha reemplazado el dominio d4 y Rv2660c ha reemplazado el dominio 5 (Hbp-Ag85B[C+N]-ESAT6-Rv2660c). SEQ ID NO 35 es la misma proteína pero en la que se ha alterado el sitio de escisión entre el dominio translocador y el dominio pasajero (HbpD-Ag85B[C+N]-ESAT6-Rv2660c).
15 Preferiblemente, el orden de los dominios de la proteína de fusión es, desde el extremo N-terminal hasta el extremo C-terminal: péptido señal, dominio pasajero, dominio translocador.
En un segundo aspecto se proporciona una célula que expresa una proteína de fusión. La célula es preferiblemente una célula huésped que puede cultivarse y manipularse mediante métodos bien conocidos por un experto en la técnica y que puede expresar proteínas heterólogas. Preferiblemente la célula huésped es una bacteria Gramnegativa tal como E. coli, Salmonella spp., Vibrio spp., Shigella spp., Pseudomonas spp., Burkholderia spp. o Bordetella spp. Una amplia variedad de sistemas de expresión están disponibles y los conoce un experto en la técnica. La expresión puede ser de naturaleza estable o transitoria. El sistema de expresión puede ser inducible o no
25 inducible.
En una realización la proteína de fusión se secreta al menos de manera parcialmente soluble por la célula huésped. Esta realización puede usarse cuando la invención se usa para la producción de una proteína recombinante, que es, por ejemplo, una enzima o un componente comercial de un producto farmacéutico. El POI puede recogerse entonces de manera conveniente de los medios, sin romper las células huésped. La rotura de las células huésped provoca contaminación con residuos celulares y contenido celular. La secreción de la proteína de fusión puede lograrse cuando la proteína de fusión comprende un sitio de escisión de proteasa entre el dominio translocador y el dominio pasajero. Una actividad proteasa, que puede estar presente en la propia proteína de fusión, escinde la proteína de fusión cuando el dominio translocador se ha integrado en la membrana externa de manera que el
35 dominio pasajero se libera al medio. Alternativamente, la escisión puede tener lugar por medio de un mecanismo de escisión autocatalítico intramolecular que no está relacionado con la actividad proteasa descrita para el SPATE EspP de E. coli (Dautin et al 2007 EMBO J 26(7): 1942-1952) y AIDA-I de E. coli (Charbonneau et al 2009 J Biol Chem 284(25): 17340-17353).
Por motivos de claridad, en algunos casos el POI puede permanecer unido a la membrana celular incluso aunque se haya escindido el polipéptido. Tal unión habitualmente será de naturaleza no covalente.
En una realización el POI permanece unido covalentemente al dominio translocador. Cuando la secuencia del autotransportador alberga un sitio de escisión, esto puede lograrse mutando el sitio de escisión entre el dominio
45 translocador y el dominio pasajero, de manera que no tiene lugar el acontecimiento de escisión. Por tanto, la célula huésped presenta al menos una parte de la proteína de fusión que comprende al menos un POI sobre la superficie celular.
En determinados aspectos la invención proporciona vesículas de membrana externa (OMV) o fantasmas bacterianos que presentan una proteína de fusión según la invención sobre su superficie.
En determinadas condiciones puede inducirse que bacterias Gram-negativas comiencen a liberar vesículas desde su membrana externa. Se ha mostrado que tales vesículas de membrana externa (OMV) son por ejemplo útiles como plataformas para vacunas. Cuando portan antígenos, como los derivados de sus células madre, estas vesículas
55 madre pueden potenciar la inmunogenicidad de tal antígeno. Las OMV pueden derivarse fácilmente de bacterias Gram-negativas que presentan la proteína de fusión de la invención sobre su superficie. En la técnica se conocen métodos para la producción y el asilamiento de vesículas de membrana externa (Chen et al 2010 PNAS 107:30993104; Bernadac et al 1998 J Bacteriol 180: 4872-4878; Kesty y Kuehn 2004 J Biol Chem 279: 2069-2076); Kolling y Matthews 1999 App Env Microbiol 65: 1843-1848; Kitagawa et al 2010 J Bacteriol 192: 5645-5656).
De manera similar, los fantasmas bacterianos son una plataforma para vacunas no vivas. Los fantasmas bacterianos son envueltas de células bacterianas que se han vaciado de su citoplasma por medio de lisis, por ejemplo usando el gen E de lisis letal del bacteriófago PhiX174 (Langemann et al 2010 Bioeng Bugs 1:326-336; Young 1992 Microbiol rev 56: 430-481; Mayr et al 2005 Adv Drug Deliv rev 57: 1381-1391). Mantienen todas las características 65 morfológicas, estructurales y antigénicas de la célula madre y comprenden proteínas que se expresan y están ancladas a la envuelta celular antes de la lisis. La administración de por ejemplo proteínas antigénicas puede
facilitarse mediante el sistema de secreción y las proteínas de fusión de la invención.
Un aspecto de la invención es una vacuna que comprende una proteína de fusión, una célula, una vesícula de membrana externa o un fantasma bacteriano según la invención. La vacuna puede comprender una célula huésped
5 que presenta una proteína de fusión que comprende al menos un POI en la superficie celular. Preferiblemente el POI es entonces un antígeno tal como se describió anteriormente. La célula huésped puede ser una cepa de Salmonella atenuada, tal como las cepas descritas en Curtiss R 3rd et al 2010 Crit Rev Immunol 30(3): 255-70. La vacuna puede comprender células huésped de Salmonella vivas.
Un aspecto de la invención es un ácido nucleico que codifica para una proteína de fusión según la invención tal como se ha descrito anteriormente. Un aspecto adicional de la invención es un vector que porta un ácido nucleico según la invención.
El ácido nucleico o vector puede estar dispuesto para la expresión de más de un POI fusionado con el mismo
15 dominio pasajero. Por ejemplo, la secuencia que codifica para el dominio pasajero puede comprender al menos dos tramos de secuencia del sitio de clonación que permiten la clonación en marco de al menos dos secuencias que codifican para POI. Esto facilita la clonación y expresión sencillas de cualquier POI deseado. Alternativamente el ácido nucleico puede comprender más de una secuencia que codifica para POI, fusionados al dominio pasajero.
Un aspecto de la invención comprende un método para la expresión de proteínas secretoras de un POI que comprende la etapa de expresar una proteína de fusión según la invención en una célula huésped. Un experto en la técnica conoce bien vectores de expresión. Adecuadamente, el vector tiene un promotor adecuado para la célula huésped que está unido operativamente al ácido nucleico que codifica para la proteína de fusión según la invención.
25 El método puede comprender la etapa de identificación de dominios laterales adecuados sobre una proteína autotransportadora. Esto puede llevarse a cabo con los métodos biofísicos o los métodos bioinformáticos descritos anteriormente.
Un aspecto del método según la invención comprende la etapa de reemplazar un dominio lateral (o una parte del mismo) de un dominio pasajero de un autotransportador con un POI de manera que la secuencia que forma tallo beta del dominio pasajero del autotransportador está esencialmente intacta. Alternativamente, el método puede comprender la etapa de insertar el POI en el dominio pasajero de manera que la secuencia que forma tallo beta está esencialmente intacta.
35 El método comprende la etapa de cultivar la célula huésped en condiciones en las que el ácido nucleico que codifica para la proteína de fusión se traduce para dar una multitud de moléculas de proteína de fusión y la molécula de proteína de fusión entra en la ruta secretora.
En una realización, el método comprende la etapa adicional de inhibir una enzima periplásmica con actividad proteasa en la célula huésped, tal como DegP. La actividad proteasa de DegP puede inhibirse delecionando, interrumpiendo o inactivando el gen que codifica para DegP en el cromosoma de la célula huésped. La inactivación puede llevarse a cabo mediante la introducción de una mutación en el sitio catalítico de DegP. La inhibición de una proteasa tiene la ventaja de que puede mejorarse el rendimiento.
45 En una realización el método comprende la etapa adicional de regulación por disminución de al menos una enzima, tal como DsbA o DsbB, que cataliza la formación de enlaces disulfuro en proteínas en el espacio periplásmico de lacélula huésped. Ésto tiene la ventaja de que puede mejorarse el rendimiento, especialmente para proteínas que son propensas a formar puentes disulfuro, tales como proteínas de origen eucariota.
En una realización del método el POI se secreta de manera soluble. En una realización del método el POI permanece unido covalentemente a la superficie celular.
En una realización el método comprende la etapa adicional de inducir la liberación de vesículas de la membrana externa de la célula huésped, para producir vesículas de membrana externa que presentan la proteína de fusión de
55 la invención sobre su superficie.
En otra realización el método comprende la etapa adicional de lisar la bacteria Gram-negativa, por ejemplo usando el gen E de lisis letal del bacteriófago PhiX174, formando así fantasmas bacterianos que presentan la proteína de fusión sobre su superficie.
Un aspecto final de la invención comprende una proteína de fusión que puede obtenerse según el método de la invención
65 Métodos
Cepas y medios
La cepa de E. coli MC1061 (araD139 (araA-leu)7697 lacX74 galK16 galE15(GalS) -e14-mcrA0 relA1 5 rpsL150(strR) spoT1 mcrB1 hsdR2) se ha descrito previamente (Casadaban y Cohen 1980 J Mol Biol 138: 179-207). Se obtuvo la cepa TOP10F’ de Invitrogen.
Se hicieron crecer las células de manera rutinaria a 37ºC en medio LB complementado con glucosa al 0,2%. Se hicieron crecer cultivos durante la noche en presencia de glucosa al 0,4%. Se hicieron crecer las células en 10 presencia de cloranfenicol (30 g/ml) y estreptomicina (25 g/ml) o tetraciclina (6,25 g/ml), cuando sea apropiado.
Construcción de plásmidos
El plásmido pEH3-Hbp (figura 1) porta el gen hbp de longitud completa, cuya expresión está bajo el control de un 15 promotor LacUV5 inducible. La construcción de este plásmido se ha descrito en (Jong et al 2007 Mol Microbiol 63(5): 1524-1536).
En las figuras 1-10 el dominio translocador se denomina “dominio ”.
20 Tabla 1: Cebadores usados en este estudio
Nombre SEQ ID NO Secuencia (5’ a 3’)
Hbp944-962 dir 86 gaacatcggaaggtggtgc Hbp1123-1104 inv 87 gagaaaccgaatccttaagg Hbp2154-2137 inv 88 ggatggttgtgttcagtgtg pEH_Xbal_Hbp dir 89 taactttctagattacaaaacttaggagggtttttaccatgaacagaatttattctcttcg EcoRl_Hbp inv 90 cagtgaattctcagaatgaataacgaatattag Hbp(dom1/Cas) dir 91 gggagctcctgcggatccggcagcggtaatgatgccccggtcacgttc Hbp(dom1/Cas) inv 92 cggatccgcaggagctccccgcaagacttcctgcagag Hbp(dom2/Cas) dir 93 ctgggagctccgcaggatccggcagcggtaatactgcagggtatctgtttc Hbp(dom2/Cas) inv 94 ctgccggatcctgcggagctcccagaaccggcatagtccagcgtgatag Hbp(-stem/Cas) dir 95 gggagctcctgcggatccggcagcggtgcagacaaactggtgataaac Hbp 2838-2820 inv 96 gttcatcgaccactgggtg Hbp(dom3/Cas) dir 97 gggagcgggagctccgcaggatccggcagcggtaaccgcagttttacctttgac Hbp(dom3/Cas) inv 98 accgctgccggatcctgcggagctcccgctcccctgcagcgtcagacg Hbp 1859-1879 dir 99 gcaatctgaatgtggacaatc Hbp(dom4/Cas) dir 100 Gggagcgggagctccgcaggatccggcagcggtagtgtcttcaacggcaccg Hbp(dom4/Cas) inv 101 accgctgccggatcctgcggagctcccgctcccgtcgcccagcgtgacgctg Hbp(dom5/Cas) dir 102 gggagcgggagctccgcaggatccggcagcgGGTACCgcaatatctggagc Hbp(dom5/Cas) inv 103 gctgccggatcctgcggagctcccgctccctccgagggtgacagtc Hbp 3003-3021 inv 104 gtcatgacctgttgccgac Hbp(d4ins/Cas) dir 105 ctgggagctccgcaggatccggcagcggtaaaagtgtcttcaacggcacc Hbp(d4ins/Cas) inv 106 ctgccggatcctgcggagctcccagaacctgcaacagatgtgccttcttc Hbp(ins/Cas) dir 107 gggagcgggagctccgcaggatccggcagcggtaccgtcaacctggataatcagt Hbp(ins/Cas) inv 108 accgctgccggatcctgcggagctcccgctcccgccgttgaagacacttttatctg Cas/Rv2660c dir 109 cggggagctccgtgatagcgggcgtcgacc Cas/Rv2660c inv 110 tgccggatccgtgaaactggttcaatcccag Cas/TB10.4 dir 111 cggggagctccatgtcgcaaatcatgtacaac Cas/TB10.4 inv 112 tgccggatccgccgccccatttggcgg Cas/Ag85B dir 113 cggggagctccttctcccggccggggc Cas/Ag85B inv 114 tgccggatccgccggcgcctaacgaac
Cas/Ag85B(T118) dir 115 cggggagctccaccggcagcgctgcaatcg
Cas/Ag85B(S126) inv 116 tgccggatcccgacaagccgattgcagcg
pEH_Xbal_EspC_dir 117 taactttctagattacaaaacttaggagggtttttaccatgaataaaatatacgcattaaaata
EcoRl_EspC inv 118 gtcagaattctcagaaagaataacggaagttag
EspC(dom1/Cas) dir 119 gggagctccgcaggatccggcagcggtttaaaaaacaaatttactcaaaaagtc
EspC(dom1/Cas)inv 120 cggatcctgcggagctcccagcctgagatgcgcttaaaaaag
EspC (BgIII) inv 121 ccagagccaatgtttacgtc
p 15a dir 122 gtacgaattcgtgcgtaacggcaaaagcac
p15a inv 123 gtacgtcgacacatgagcagatcctctacg
El plásmido pEH3-Hbp[-cleav] (figura 2) es un derivado de pEH3-Hbp (Jong et al, 2007) que porta un mutante de hbp que codifica para una versión de Hbp en la que el sitio de escisión natural entre el dominio pasajero y el dominio translocador se ha alterado tras la sustitución de los residuos de aminoácido Asn1100 y Asn1101 por un residuo de Gly
5 y Ser, respectivamente. La construcción de pEH3-Hbp[-cleav] se ha descrito en (Jong et al 2007 Mol Microbiol 63(5): 1524-1536).
El plásmido pHbpD(d1), que es igual que pHbpDL, (figura 3) es un derivado de pEH3-Hbp[-cleav] (Jong et al 2007 Mol Microbiol 63(5): 1524-1536) que porta un mutante de hbp que codifica para una versión truncada de 10 Hbp[-cleav] (Jong et al 2007 Mol Microbiol 63(5): 1524-1536) en la que los residuos de aminoácido 54 -307 de la secuencia de aminoácidos de Hbp de longitud completa se han reemplazado por la secuencia de aminoácidos Ser-Ser-Cys-Gly-Ser-Gly-Ser-Gly (SEQ ID NO 45). La secuencia de ADN que codifica para esta última secuencia de aminoácidos contiene sitios de restricción Sacl y BamHI que permiten una clonación en marco fácil de secuencias de ADN que codifican para secuencias de aminoácidos heterólogas en la secuencia codificante de HbpD(d1). Para 15 crear pHbpD(d1), en primer lugar, se creó una variante de pEH3-Hbp[-cleav] (pEH3-Hbp[-cleav/BamHI]) que carecía de sitios de restricción BamHI dentro y fuera de la región codificante de Hbp[-cleav], respectivamente. De manera posterior, se llevó a cabo un procedimiento de “PCR de extensión por solapamiento” de tres etapas. En la primera etapa se amplificó un fragmento de ADN mediante PCR usando pEH3-Hbp (Jong et al 2007 Mol Microbiol 63(5): 1524-1536) como molde y los cebadores pEH_Xbat_Hbp dir y Hbp(dom1/Cas) inv. En la segunda etapa se
20 amplificó un fragmento de ADN mediante PCR usando pEH3-Hbp (Jong et al 2007 Mol Microbiol 63(5): 1524-1536) como molde y los cebadores Hbp(dom1/Cas) dir y Hbp1123-1104 inv. En la tercera etapa se amplificó un fragmento de ADN usando una mezcla de los productos de PCR de la etapa 1 y 2 como molde y los cebadores pEH_Xbal_Hbp dir y Hbp1123-1104 inv. Se clonó el producto de PCR de la etapa tres en pEH3-Hbp[-cleav/BamHI] usando los sitios de restricción Xbal y Ndel, produciendo el plásmido pHbpD(d1).
25 Para los cebadores usados en este estudio véase la tabla 1.
El plásmido pHbpD(d2), que es igual que pHbpDD2, (figura 5) se creó según el mismo procedimiento general que pHbpD(d1), pero con las siguientes modificaciones: se reemplazaron los residuos de aminoácido 534 -607 de la 30 secuencia de aminoácidos de Hbp de longitud completa por la secuencia de aminoácidos Gly-Ser-Gly-Ser-Ser-Ala-Gly-Ser-Gly-Ser-Gly (SEQ ID NO 44). La secuencia de ADN que codifica para la secuencia de aminoácidos también contiene sitios de restricción SacI y BamHI para una clonación en marco fácil de secuencias de ADN que codifican para secuencias de aminoácidos heterólogas. Para la primera etapa de amplificación por PCR se usaron los cebadores Hbp944-962 dir y Hbp(dom2/Cas) inv. Para la segunda etapa de amplificación por PCR se usaron los
35 cebadores Hbp(dom2/Cas) dir y Hbp 2154-2137 inv. Y para la tercera etapa se usaron los cebadores Hbp944-962 dir y Hbp2154-2137 inv. Se clonó el producto de PCR de la etapa tres en pEH3-Hbp[-cleav/BamHI] usando sitios de restricción Ndel y Nsil.
El plásmido pHbp(d1), que es igual que pHbpSL, (figura 7) es un derivado de pEH3-Hbp (Jong et al 2007 Mol
40 Microbiol 63(5): 1524-1536) que porta un mutante de hbp que codifica para una versión truncada de Hbp [pHbp(d1)] en la que los residuos de aminoácido 54 -307 de la secuencia de aminoácidos de Hbp de longitud completa se han reemplazado por la secuencia de aminoácidos Ser-Ser-Cys-Gly-Ser-Gly-Ser-Gly (SEQ ID NO 45). La secuencia de ADN que codifica para esta última secuencia de aminoácidos contiene sitios de restricción SacI y BamHI que permiten una clonación en marco fácil de secuencias de ADN que codifican para secuencias de
45 aminoácidos heterólogas en la secuencia codificante de Hbp(d1). Para construir pHbp(d1), en primer lugar se creó una variante de pEH3-Hbp (pEH3-Hbp/BamHI) que carecía de un sitio BamHI en el sentido de 3’ del ORF de hbp. Posteriormente, se llevó a cabo un procedimiento de “PCR de extensión por solapamiento” de tres etapas. En la primera etapa se amplificó un fragmento de ADN mediante PCR usando pEH3-Hbp (Jong et al 2007 Mol Microbiol 63(5): 1524-1536) como molde y los cebadores pEH_Xbal_Hbp dir y Hbp(dom1/Cas) inv. En la segunda etapa se
50 amplificó un fragmento de ADN mediante PCR usando pEH3-Hbp (Jong et al 2007 Mol Microbiol 63(5): 1524-1536) como molde y los cebadores Hbp(dom1/Cas) dir y Hbp1123-1104 inv. En la tercera etapa se amplificó un
fragmento de ADN usando una mezcla de los productos de PCR de la etapa 1 y 2 como molde y los cebadores pEH_Xbal_Hbp dir y Hbp1123-1104 inv. Se clonó el producto de PCR de la etapa tres en pEH3-Hbp[BamHI], un derivado de pEH3-Hbp que carecía de un sitio de restricción BamHI en el sentido de 3’ del gen de hbp, usando los sitios de restricción Xbal y Ndel, produciendo el plásmido pHbp(d1).
5 Se crearon los plásmidos pHbpSS (figura 9), pHbp(d2), pHbp(d3), pHbp(d4), pHbp(d5), pHbp(d4ins) y pHbp(ins) según el mismo procedimiento general que pHbpD(d1), pero con las siguientes modificaciones:
Para pHbpSS: Se reemplazaron los residuos de aminoácido 54 -993 de la secuencia de aminoácidos de Hbp de
10 longitud completa por la secuencia de aminoácidos Ser-Ser-Cys-Gly-Ser-Gly-Ser-Gly (SEQ ID NO 45). Para la primera etapa de amplificación por PCR se usaron los cebadores pEH_XbaI_Hbp dir y Hbp(dom1/Cas) inv. Para la segunda etapa de amplificación por PCR se usaron los cebadores Hbp(-stem/Cas) dir y EcoRI_Hbp inv. Y para la tercera etapa se usaron los cebadores pEH_Xbal_Hbp dir y EcoRI_Hbp inv. Se clonó el producto de PCR de la etapa tres en pEH3-Hbp[BamHI] usando los sitios de restricción Xbal y Ndel, produciendo el plásmido pHbpSS.
15 Para pHbp(d2): Se reemplazaron los residuos de aminoácido 534 -607 de la secuencia de aminoácidos de Hbp de longitud completa por la secuencia de aminoácidos Gly-Ser-Gly-Ser-Ser-Ala-Gly-Ser-Gly-Ser-Gly (SEQ ID NO 44), cuya secuencia de ADN correspondiente contiene sitios de restricción SacI y BamHI para la clonación en marco fácil de secuencias de ADN. Para la primera etapa de amplificación por PCR se usaron los cebadores Hbp944-962 dir y
20 Hbp(dom2/Cas) inv. Para la segunda etapa de amplificación por PCR se usaron los cebadores Hbp(dom2/Cas) dir y Hbp 2154-2137 inv. Y para la tercera etapa se usaron los cebadores Hbp944-962 dir y Hbp2154-2137 inv. Se clonó el producto de PCR de la etapa tres en pEH3-Hbp[BamHI] usando los sitios de restricción Ndel y Nsil, produciendo el plásmido pHbp(d2).
25 Para pHbp(d3): Se reemplazaron los residuos de aminoácido 659 -696 de la secuencia de aminoácidos de Hbp de longitud completa por la secuencia de aminoácidos Gly-Ser-Gly-Ser-Ser-Ala-Gly-Ser-Gly-Ser-Gly (SEQ ID NO 44). Para la primera etapa de amplificación por PCR se usaron los cebadores Hbp944-962 dir y Hbp(dom3/Cas) inv. Para la segunda etapa de amplificación por PCR se usaron los cebadores Hbp(dom3/Cas) dir y Hbp 2838-2820 inv. Y para la tercera etapa se usaron los cebadores Hbp944-962 dir y Hbp 2838-2820 inv. Se clonó el producto de PCR
30 de la etapa tres en pEH3-Hbp[BamHI] usando los sitios de restricción Ndel y Kpnl, produciendo el plásmido pHbp(d3). Para pHbp(d4): Se reemplazaron los residuos de aminoácido 736 -765 de la secuencia de aminoácidos de Hbp de longitud completa por la secuencia de aminoácidos Gly-Ser-Gly-Ser-Ser-Ala-Gly-Ser-Gly-Ser-Gly (SEQ ID NO 44). Para la primera etapa de amplificación por PCR se usaron los cebadores Hbp1859-1879 dir y Hbp(dom4/Cas) inv. Para la segunda etapa de amplificación por PCR se usaron los cebadores
35 Hbp(dom4/Cas) dir y Hbp 2838-2820 inv. Y para la tercera etapa se usaron los cebadores Hbp1859-1879 dir y Hbp2838-2820 inv. Se clonó el producto de PCR de la etapa tres en pEH3-Hbp[BamHI] usando los sitios de restricción Nsil y KpnI, produciendo el plásmido pHbp(d4).
Para pHbp(d5): Se reemplazaron los residuos de aminoácido 899 -920 de la secuencia de aminoácidos de Hbp de
40 longitud completa por la secuencia de aminoácidos Gly-Ser-Gly-Ser-Ser-Ala-Gly-Ser-Gly-Ser-Gly (SEQ ID NO 44). Para la primera etapa de amplificación por PCR se usaron los cebadores Hbp1859-1879 dir y Hbp(dom5/Cas) inv. Para la segunda etapa de amplificación por PCR se usaron los cebadores Hbp(dom5/Cas) dir y Hbp3003-3021 inv. Y para la tercera etapa se usaron los cebadores Hbp1859-1879 dir y Hbp3003-3021 inv. Se clonó el producto de PCR de la etapa tres en pEH3-Hbp[BamHI] usando los sitios de restricción Nsil y Kpnl, produciendo el plásmido
45 pHbp(d5).
Para pHbp(d4ins): Se reemplazaron los residuos de aminoácido 760 -764 de la secuencia de aminoácidos de Hbp de longitud completa por la secuencia de aminoácidos Gly-Ser-Gly-Ser-Ser-Ala-Gly-Ser-Gly-Ser-Gly (SEQ ID NO 44). Para la primera etapa de amplificación por PCR se usaron los cebadores Hbp1859-1879 dir y Hbp(d4ins/Cas)
50 inv. Para la segunda etapa de amplificación por PCR se usaron los cebadores Hbp(d4ins/Cas) dir y Hbp 2838-2820 inv. Y para la tercera etapa se usaron los cebadores Hbp1859-1879 dir y Hbp2838-2820 inv. Se clonó el producto de PCR de la etapa tres en pEH3-Hbp[BamHI] usando los sitios de restricción Nsil y Kpnl, produciendo el plásmido pHbp(d4ins).
55 Para pHbp(ins): Se insertó la secuencia de aminoácidos Gly-Ser-Gly-Ser-Ser-Ala-Gly-Ser-Gly-Ser-Gly (SEQ ID NO 44) entre los residuos 771 y 772 de la secuencia de aminoácidos de Hbp de longitud completa. Para la primera etapa de amplificación por PCR se usaron los cebadores Hbp1859-1879 dir y Hbp(ins/Cas) inv. Para la segunda etapa de amplificación por PCR se usaron los cebadores Hbp(ins/Cas) dir y Hbp 2838-2820 inv. Y para la tercera etapa se usaron los cebadores Hbp1859-1879 dir y Hbp2838-2820 inv. Se clonó el producto de PCR de la etapa tres
60 en pEH3-Hbp[BamHI] usando los sitios de restricción Nsil y Kpnl, produciendo el plásmido pHbp(ins).
Se derivaron derivados de ESAT6 de los plásmidos anteriores mediante una inserción heteróloga correspondiente a la proteína ESAT6 de Mycobacterium tuberculosis en los plásmidos respectivos. Para construir los derivados de ESAT6, se obtuvo una secuencia de ADN codificante de ESAT6 sintética de BaseClear B.V. (Leiden, Países Bajos),
cuyo uso de codones se optimizó para la expresión en E. coli. El fragmento de ADN sintético presentaba sitios SacI y BamHI en el lado 5’ y 3’ de la secuencia codificante de ESAT6, respectivamente. Esto permitió la clonación en los sitios Sacl y BamHI de pHbpD(d1), pHbpD(d2), pHbp(d1), pHbpSS, pHbp(d2), pHbp(d3), pHbp(d4), pHbp(d5), pHbp(d4ins) y pHbp(ins), produciendo pHbpD(d1)-ESAT6, que es igual que pHbpDL-ESAT6 (figura 4),
5 pHbpD(d2)-ESAT6, que es igual que pHbpDD2-ESAT6 (figura 6), pHbp(d1)-ESAT6, que es igual que pHbpSL-ESAT6 (figura 8), pHbpSS-ESAT6 (figura 10), pHbp(d2)-ESAT6, pHbp(d3)-ESAT6, pHbp(d4)-ESAT6, pHbp(d5)-ESAT6, pHbp(d4ins)-ESAT6 y pHbp(ins)-ESAT6, respectivamente.
Se derivaron derivados de Rv2660c de los plásmidos anteriores mediante una inserción heteróloga correspondiente
10 a la proteína Rv2660c de Mycobacterium tuberculosis en los plásmidos respectivos. Para construir los derivados de Rv2660c se amplificó el gen que codifica para Rv2660c con sitios SacI/BamHI flanqueantes mediante PCR usando ADN genómico de H37Rv de M. tuberculosis como molde. Los cebadores usados fueron Cas/Rv2660c dir y Cas/Rv2660c inv. Se clonó el producto de PCR en pHbp(d3), pHbp(d4) y pHbp(d5) usando los sitios SacI/BamHI, creando pHbp(d3)-Rv2660c, pHbp(d4)-Rv2660c y pHbp(d5)-Rv2660c, respectivamente.
15 Se derivaron derivados de TB10.3 y TB10.4 de los plásmidos anteriores mediante una inserción heteróloga correspondiente a las proteínas TB10.3 o TB10.4 de Mycobacterium tuberculosis en los plásmidos respectivos. Para construir los derivados de TB10.3 y TB10.4, se amplificó el gen que codifica para TB10.3 o TB10.4 con sitios SacI/BamHI flanqueantes mediante PCR usando ADN genómico de H37Rv de M. tuberculosis como molde. Los
20 cebadores usados para TB10.3 fueron Cas/TB10.3 dir y Cas/TB10.3 inv. Se clonó el producto de PCR en pHbp(Ad2) usando los sitios SacI/BamHI, creando pHbp(d2)-TB10.3. Los cebadores usados para TB10.4 fueron Cas/TB10.4 dir y Cas/TB10.4 inv. Se clonó el producto de PCR en pHbp(d1) usando los sitios SacI/BamHI, creando pHbp(d1)TB10.4.
25 El plásmido pHbp(d1)-hEGF(0ss) es un derivado de pHbp(d1) que expresa Hbp(d1) que contiene una inserción heteróloga correspondiente a una versión sin cisteína de la proteína hEGF de Homo sapiens. Para construir pHbp(d1)-hEGF(0ss) se obtuvo una secuencia de ADN codificante de hEGF(0ss) sintética que presentaba sitios Sacl y BamHI en el lado 5’ y 3’ de la secuencia codificante de hEGF(0ss), respectivamente, para permitir la clonación en los sitios Sacl y BamHI de pHbp(d1), produciendo pHbp(d1)-hEGF(0ss).
30 El plásmido pHbp-Ag85B(N+C) es un derivado de pEH3-Hbp/BamHI que expresa un mutante de Hbp en el que se insertó una secuencia de aminoácidos correspondiente a los residuos 1-126 de la región madura de la proteína Ag85B de Mycobacterium tuberculosis (Ag85B(N’)) en un ligador flexible que estaba ubicado tal como se describe para pHbp(d1). Además, se insertó una secuencia de aminoácidos correspondiente a los residuos 118-285 de la
35 región madura de la proteína Ag85B (Ag85B(C’)) en un ligador flexible que estaba ubicado tal como se describe para pHbp(d2). Para construir pHbp-Ag85B(N+C), se generaron fragmentos de fbpA que codificaban para Ag85B(N) y Ag85B(C) con sitios Sacl/BamH flanqueantes usando ADN genómico de H37Rv de M. tuberculosis como molde. Para Ag85B(N), los cebadores usados fueron Cas/Ag85B dir y Cas/Ag85B(S126) inv. Se clonó el fragmento de PCR resultante en pHbp(d1) usando los sitios de restricción SacI/BamHI, creando pHbp(d1)-Ag85B(N). Para Ag85B(C)
40 los cebadores usados fueron Cas/Ag85B(T118) dir y Cas/Ag85B inv. Se insertó el fragmento de PCR resultante en pHbp(d2) usando los sitios de restricción SacI/BamHI, creando pHbp(d2)-Ag85B(C). Posteriormente, se sustituyó el fragmento de Xbal/Ndel de pHbp(d2)-Ag85B(C) por el fragmento de Xbal/Ndel de pHbp(d1)-Ag85B(N), produciendo pHbp-Ag85B(N+C).
45 Se crearon los plásmidos pHbp-Ag85B(C+N), pHbpD-Ag85B(N+C) y pHbpD-Ag85B(C+N) según el mismo procedimiento general que pHbp-Ag85B(N+C), pero con las siguientes modificaciones:
Para pHbp-Ag85B(C+N) se insertó la parte N-terminal (residuos 1-126) de la región madura de la proteína Ag85B de Mycobacterium tuberculosis (Ag85B(N’)) en un ligador flexible que estaba ubicado tal como se describe para
50 pHbp(d2) y se insertó la parte C-terminal (residuos 118-285) en un ligador flexible que estaba ubicado tal como se describe para pHbp(d1). Tras la PCR, usando los mismos cebadores que anteriormente, se clonó el producto de PCR de Ag85B(N) en pHbp(d2) usando los sitios de restricción SacI/BamHI, y se clonó el producto de PCR de Ag85B(C) en pHbp(d1) usando los sitios de restricción SacI/BamHI, creando pHbp(d2)-Ag85B(N) y pHbp(d1)Ag85B(C) respectivamente. Posteriormente, se sustituyó el fragmento de Xbal/Ndel de pHbp(d2)-Ag85B(N) por el
55 fragmento de Xbal/Ndel de pHbp(d1)-Ag85B(C), produciendo pHbp-85B(C+N).
Para pHbpD-Ag85B(N+C) y pHbpD-Ag85B(C+N) se usaron los mismos procedimientos que para pHbpD-Ag85B(N+C) y pHbpDAg85B(C+N) respectivamente, excepto porque se usaron los plásmidos pHbpD(d1) y pHbpD(d2) en lugar de los plásmidos pHbp(d1) y pHbp(d2).
60 El plásmido pHbp-Ag85B[C+N]-ESAT6 es un derivado de pHbp-Ag85B[C+N] que codifica para una versión de Hbp-Ag85B[C+N] en la que se insertó una secuencia de aminoácidos correspondiente a ESAT6 en un ligador flexible que estaba ubicado tal como se describe para pHbp(d4ins). Para construir pHbp-Ag85B[C+N]-ESAT6, se sustituyó el fragmento de Nsil/Kpnl de pHbp-Ag85B[C+N] por el de pHbp(d4in)-ESAT6, creando pHbp-Ag85B[C+N]-ESAT6. Se creó
el plásmido pHbpD-Ag85B[C+N]-ESAT6 de manera correspondiente, excepto porque se sustituyó el fragmento de NsiI/KpnI de pHbpD-Ag85B[C+N] por el de pHbp(d4in)-ESAT6.
El plásmido pHbp-Ag85B[C+N]-ESAT6-Rv2660c es un derivado de pHbp-Ag85B[C+N]-ESAT6 que codifica para una
5 versión de Hbp-Ag85B[C+N]-ESAT6 en la que se insertó una secuencia de aminoácidos correspondiente a Rv2660c en un ligador flexible que estaba ubicado tal como se describe para pHbp(d5). Para construir pHbp-Ag85B[C+N]ESAT6-Rv2660c, se sustituyó el fragmento de BstZ17i/KpnI de pHbp-Ag85B(C+N)-ESAT6 por el de pHbp(d5)-Rv2660c, produciendo pHbp-Ag85B(C+N)-ESAT6-Rv2660c. Se creó el plásmido pHbpD-Ag85B(C+N)-ESAT6-Rv2660c de manera correspondiente, excepto porque se sustituyó el fragmento de BstZ17i/KpnI de pHbpD-Ag85B(C+N)-ESAT6 por el de pHbp(d5)-Rv2660c.
El plásmido pEH3-EspC porta el gen de espC de longitud completa, cuya expresión está bajo el control de un promotor LacUV5 inducible. Para construir pEH3-EspC, se amplificó el gen de espC mediante PCR usando pJLM174 (Dutta et al 2002 Infect. Immun. 70, 7105-7113) como molde y los cebadores pEHXbalEspC dir y
15 EcoRIEspC inv. Se clonó el producto de PCR resultante en los sitios XbaI/EcoRI de pEH3-Hbp. Esta etapa intercambió eficazmente el ORF de espC por el de hbp, dando como resultado pEH3-EspC.
El plásmido pEH3-EspC(d1) es un derivado de pEH3-EspC que porta un mutante de espC que codifica para una versión truncada de EspC en la que los residuos de aminoácido 54 -300 de la secuencia de aminoácidos de EspC de longitud completa se ha reemplazado por la secuencia de aminoácidos Gly-Ser-Ser-Ala-Gly-Ser-Gly-Ser-Gly (SEQ ID NO 46). La secuencia de ADN que codifica para esta última secuencia de aminoácidos contiene sitios de restricción SacI y BamHI que permiten la clonación en marco fácil de secuencias de ADN que codifican para secuencias de aminoácidos heterólogas en la secuencia codificante de EspC(d1). Para crear pEH3-EspC(d1), se llevó a cabo un procedimiento de “PCR de extensión por solapamiento” de tres etapas. En la primera etapa se
25 amplificó un fragmento de ADN mediante PCR usando pEH3-EspC como molde y los cebadores pEH_Xbal_EspC dir y EspC(dom1/Cas) inv. En la segunda etapa se amplificó un fragmento de ADN mediante PCR usando pEH3-EspC como molde y los cebadores EspC(dom1/Cas) dir y EspC(BgIII) inv. En la tercera etapa se amplificó un fragmento de ADN usando una mezcla de los productos de PCR de la etapa 1 y 2 como molde y los cebadores pEH_Xbal_EspC dir y EspC(BgIII) inv. Se clonó el producto de PCR de la etapa tres en pEH3-EspC usando los sitios de restricción Xbal y BgIII, produciendo el plásmido pEH3-EspC(d1).
El plásmido pEH3-EspC(d1)-ESAT6 es un derivado de pEH3-EspC(d1) que expresa EspC(d1) que contiene una inserción heteróloga correspondiente a la proteína ESAT6 de Mycobacterium tuberculosis. Para construir pEH3-EspC(d1)-ESAT6 se obtuvo una secuencia de ADN codificante de ESAT6 sintética que presentaba sitios SacI y
35 BamHI en el lado 5’ y 3’ tal como se describió anteriormente. Esto permitió la clonación de la secuencia de ADN codificante de ESAT6 sintética en los sitios Sacl y BamHI de pEH3-EspC(d1), produciendo pEH3-EspC(Ad1)-ESAT6.
El plásmido pEH3(p15a)-HbpD-Ag85B[C+N]-ESAT6 (figura 34) es idéntico al plásmido pHbpD-Ag85B[C+N]-ESAT6 excepto porque se ha reemplazado un fragmento de ADN que porta el origen de replicación pMB1 por un fragmento que porta un origen de replicación p15a. Para crear pEH3(p15a)-HbpD-Ag85B[C+N]-ESAT6, se creó en primer lugar el plásmido pEH3(p15a)-Hbp. Se generó este plásmido usando pBAD33 (Guzman et al 1995 Journal of Bacteriology 177:4121-4130) como molde y los cebadores p15a dir y p15a inv (véase la tabla 1). Se clonó el fragmento de PCR resultante, que porta el origen de replicación p15a, en pEH3-Hbp usando los sitios de restricción SalI/EcoRI,
45 produciendo pEH3(p15a)-Hbp. Posteriormente, se sustituyó el fragmento de XbaI/EcoRI de pEH3(p15a)-Hbp por el de pHbpD-Ag85B[C+N] ESAT6, creando pEH3(p15a)-HbpD-Ag85B[C+N]-ESAT6.
Descripción de los constructos usados en los ejemplos
Para descripciones más detalladas y cómo se prepararon los constructos, véase anteriormente bajo “Construcción de plásmidos”.
La figura 11A muestra la estructura cristalina del dominio pasajero del autotransportador Hbp (Otto et al 2005 J Biol Chem 280(17): 17339-45). El dominio 1 (d1), dominio 2 (d2) y el dominio autochaperona (ac) están en gris claro. El
55 resto del pasajero, incluyendo el dominio de tallo beta está coloreado en negro.
La figura 11B muestra la estructura cristalina del dominio pasajero del autotransportador Hbp (Otto et al 2005 J Biol Chem 280(17): 17339-45), girado alrededor del eje y (50º en sentido contrario de las agujas del reloj) en comparación con la situación representada en la figura 11A. Se creó la imagen usando MacPyMol.
La figura 11C muestra la estructura cristalina del dominio pasajero del autotransportador Hbp como en la figura 11B, pero los residuos que comprenden el dominio 1 están ocultos. El dominio 3 (d3) se representa en gris claro. El resto del pasajero está coloreado en negro. Se creó la imagen usando MacPyMol.
65 La figura 11D muestra la estructura cristalina del dominio pasajero del autotransportador Hbp como en la figura 11C.
El dominio 4 (d4) y un dominio lateral que corresponde a los residuos 898-922 (d5) de Hbp se representan en gris claro. El resto del pasajero está coloreado en negro. Se creó la imagen usando MacPyMol.
La figura 11E muestra representaciones esquemáticas de constructos derivados de Hbp usados en los ejemplos. 5 Para los ejemplos dados a conocer en el presente documento se clonaron los constructos derivados de Hbp mostrados en la figura 11E en los plásmidos pEH3-Hbp[BamHI] o pEH3-Hbp[-cleav/BamHI] formando así vectores de expresión correspondientes a los vectores mostrados en las figuras 3-10. La figura 23 muestra representaciones esquemáticas de constructos derivados de EspC usados en los ejemplos. Para las SEQ ID NO: de los constructos, véase la tabla 2. 10 Tabla 2: Constructos usados en este estudio
Nombre SEQ ID NO de proteína SEQ ID NO de ADN
Hbp (de tipo natural) 1 48 Hbp(-cleav) 2 49 HbpSS 3 50 Hbp(d1) (= HbpSL) 4 51 HbpD(d1) (= HbpDL) 5 52 Hbp(d2) 653 HbpD(d2) (= HbpDD2) 7 54 Hbp(d3) 855 Hbp(d4) 956 Hbp(d5) 10 57 Hbp(d4ins) 11 58 HbpSS-ESAT6 12 59 Hbp(d1)-ESAT6 (= HbpSL-ESAT6) 13 60 HbpD(d1)-ESAT6 (= HbpDL-ESAT6) 14 61 Hbp(d2)-ESAT6 15 62 HbpD(d2)-ESAT6 (= HbpDD2-ESAT6) 16 63 Hbp(d3)-ESAT6 17 64 Hbp(d4)-ESAT6 18 65 Hbp(d5)-ESAT6 19 66 Hbp(d4ins)-ESAT6 20 67 Hbp(ins)-ESAT6 21 68 Hbp(d3)-Rv2660c 22 69 Hbp(d4)-Rv2660c 23 70 Hbp(d5)-Rv2660c 24 71 Hbp(d1)-TB10.4 25 72 Hbp(d2)-TB10.3 26 73 Hbp(d1)-hEGF(0ss) 27 74 Hbp-Ag85B[N+C] 28 75 HbpD-Ag85B[N+C] 29 76 Hbp-Ag85B[C+N] 30 77 HbpD-Ag85B[C+N] 31 78 Hbp-Ag85B[C+N]-ESAT6 32 79 HbpD-Ag85B[C+N]-ESAT6 33 80 Hbp-Ag85B[C+N]-ESAT6-Rv2660c 34 81 HbpD-Ag85B[C+N]-ESAT6-Rv2660c 35 82
EspC (de tipo natural) 36 83 EspC(d1) 37 84 EspC(d1)-ESAT6 38 85
Se sintetiza Hbp (de tipo natural) como un precursor de 1377 aminoácidos (aa) que se organiza en tres dominios: (i) una secuencia señal escindible N-terminal (ss; aa 1-52), (ii) un dominio pasajero (aa 53-1100) y (iii) un dominio translocador C-terminal integrado en la membrana externa (dominio ; aa 1101-1377). El dominio 1 (d1), dominio 2 5(d2), dominio 3 (d3), dominio 4 (d4), dominio 5 (d5) y el dominio autochaperona (ac) del dominio pasajero están indicados. “FL” indica el ligador flexible. El resto del dominio pasajero, incluyendo el dominio de tallo beta está coloreado en negro. Tras el paso de la membrana externa se escinde el pasajero del dominio translocador por medio de un mecanismo autocatalítico que implica hidrólisis del enlace peptídico entre Asn1100 y Asn1101 del precursor de Hbp. Los números presentados por encima de los diagramas corresponden a las posiciones de aminoácido del
10 precursor de Hbp (de tipo natural) original, calculadas a partir del extremo N-terminal.
“E-6” indica ESAT6. “26” indica Rv2660c. “10.3” indica TB10.3 y “10.4” indica TB10.4”.”EGF” indica hEGF(0ss). “85[N]” indica Ag85B[N’] y “85[C]” indica Ag85B[C’].
15 Hbp(-cleav) representa un mutante de Hbp (de tipo natural) del que no puede escindirse el pasajero del dominio translocador debido a la alteración del sitio de escisión (cruz de color negro) mediante sustitución de Asn1100 y Asn1101 por un residuo de Gly y Ser, respectivamente.
HbpSS representa un mutante de Hbp en el que la gran mayoría del pasajero, excepto el dominio autochaperona se 20 ha sustituido por un ligador flexible (FL) que permite la inserción de secuencias de proteínas heterólogas.
Hbp(d1), Hbp(d2), Hbp(d3), Hbp(d4) y Hbp(d5) representan mutantes de Hbp en los que el dominio 1, 2, 3, 4 y 5, respectivamente, del pasajero se ha sustituido por un ligador flexible. Hbp(d1) es igual que HbpSL.
25 HbpD(d1) y HbpD(d2) son idénticos a Hbp(d1) y Hbp(d2), respectivamente, excepto porque el sitio de escisión entre el dominio pasajero y translocador se alteró tal como se describe para Hbp(-cleav). HbpD(d1) también se ha nombrado HbpDL y HbpD(d2) se ha nombrado HppDD2.
Hbp(d4ins) es un mutante de Hbp en el que los residuos 760-764, ubicados en el dominio 4, se han sustituido por un 30 ligador flexible.
HbpSS-ESAT6, Hbp(d1)-ESAT6, HbpD(d1)-ESAT6, Hbp(d2)-ESAT6, HbpD(d2)-ESAT6, Hbp(d3)-ESAT6, Hbp(d4)-ESAT6, Hbp(d5)-ESAT6 y Hbp(d4ins)-ESAT6 son derivados de HbpSS, Hbp(d1), HbpD(d1), Hbp(d2), HbpD(d2), Hbp(d3), Hbp(d4), Hbp(d5) y Hbp(d4ins), respectivamente. En estos derivados, se insertó
35 una secuencia de aminoácidos correspondiente a la proteína ESAT6 de Mycobacterium tuberculosis en el ligador flexible, dejando espaciadores flexibles cortos que comprenden residuos de Gly y Ser entre la secuencia de Hbp natural y los extremos N’ y C’ terminales de ESAT6.
Hbp(ins)-ESAT6 es un mutante de Hbp en el que se ha insertado una secuencia de aminoácidos correspondiente a
40 ESAT6 y espaciadores flexibles cortos, flanqueantes en N’ y C’ en una secuencia que forma hebra del dominio pasajero de Hbp: entre los residuos 771 y 772.
Hbp(d3)-Rv2660c, Hbp(d4)-Rv2660c y Hbp(d5)-Rv2660c son derivados de Hbp(d3), Hbp(d4) y Hbp(d5), respectivamente. En estos derivados, se insertó una secuencia de aminoácidos correspondiente a la proteína
45 Rv2660c de Mycobacterium tuberculosis en el ligador flexible tal como se describe para Hbp(d3), Hbp(d4) y Hbp(d5) respectivamente.
Hbp(d1)-TB10.4 es un derivado de Hbp(d1) en el que se insertó una secuencia de aminoácidos correspondiente a la proteína TB10.4 de Mycobacterium tuberculosis en el ligador flexible tal como se describe para Hbp(d1).
50 Hbp(d2)-TB10.3 es un derivado de Hbp(d2) en el que se insertó una secuencia de aminoácidos correspondiente a la proteína TB10.3 de Mycobacterium tuberculosis en el ligador flexible tal como se describe para Hbp(d2).
Hbp(d1)-hEGF(0ss) es un derivado de Hbp(d1) en el que se insertó una secuencia de aminoácidos
55 correspondiente a un mutante sin cisteína de la proteína hEGF de Homo sapiens en el ligador flexible tal como se describe para Hbp(d1).
Hbp-Ag85B[N+C] es un mutante de Hbp en el que se insertó una secuencia de aminoácidos correspondiente a los residuos 1-126 de la región madura de la proteína Ag85B de Mycobacterium tuberculosis (Ag85B[N’]) en un ligador 60 flexible que estaba ubicado tal como se describe para Hbp(d1). Además, se insertó una secuencia de aminoácidos
correspondiente a los residuos 118-285 de la región madura de la proteína Ag85B (Ag85B[C’]) en un ligador flexible que estaba ubicado tal como se describe para Hbp(d2).
Hbp-Ag85B[C+N] es un mutante de Hbp en el que se insertó una secuencia de aminoácidos correspondiente a los
5 residuos 1-126 de la región madura de la proteína Ag85B de Mycobacterium tuberculosis (Ag85B[N’]) en un ligador flexible que estaba ubicado tal como se describe para Hbp(d2). Además, se insertó una secuencia de aminoácidos correspondiente a los residuos 118-285 de la región madura de la proteína Ag85B (Ag85B[C’]) en un ligador flexible que estaba ubicado tal como se describe para Hbp(d1).
10 Hbp-Ag85B[C+N]-ESAT6 es un derivado de Hbp-Ag85B[C+N] en el que se insertó una secuencia de aminoácidos correspondiente a ESAT6 en un ligador flexible que estaba ubicado tal como se describe para Hbp(d4ins). Por tanto se inserta Ag85B[C’] en d1, se inserta Ag85B[N’] en d2 y se inserta ESAT6 en d4.
Hbp-Ag85B[C+N]-ESAT6-Rv2660c es un derivado de Hbp-Ag85B[C+N]-ESAT6 en el que se insertó una secuencia de
15 aminoácidos correspondiente a Rv2660c en un ligador flexible que estaba ubicado tal como se describe para Hbp(d5). Por tanto se inserta Ag85B[C’] en d1, se inserta Ag85B[N’] en d2, se inserta ESAT6 en d4 y se inserta Rv2660c en d5.
HbpD-Ag85B[C-N], HbpD-Ag85B[C+N]-ESAT6 y HbpD-Ag85B[C-N]-ESAT6-Rv2660c son derivados de Hbp-Ag85B[C+N],
20 Hbp-Ag85B[C+N]-ESAT6 y Hbp-Ag85B[C+N]-ESAT6-Rv2660c, respectivamente, excepto porque el sitio de escisión entre el pasajero y el dominio translocador se alteró tal como se describe para Hbp(-cleav).
Procedimientos generales
25 Se realizó SDS-PAGE usando geles de NuPAGE Bis-Tris al 4-12% (Invitrogen) con un tampón de ejecución de MES-SDS. Alternativamente, se realizó SDS-PAGE usando geles mini-Protean TGX al 10%, 4-15% o “cualquier kD” de Biorad, o geles de SDS-PAGE al 10% convencionales. Antes de someterlas a SDS-PAGE, se disolvieron las muestras de proteína en tampón de muestra de SDS-PAGE (TrisHCl 63 mM pH 6,8, SDS al 2% p/v, glicerol al 10%, azul de bromofenol al 0,01% p/v, DTT 41 mM) y se sometieron a ebullición durante 5 min. Se tiñeron los geles con
30 azul brillante de Coomassie G-250 y se capturaron usando un densitómetro calibrado Molecular Imager GS-800 (Biorad). Alternativamente, se sometieron los geles a inmunotransferencia de tipo Western. Cuando fuese apropiado, se incubaron las inmunotransferencias de tipo Western con anticuerpos policlonales de conejo dirigidos contra o bien el dominio pasajero de Hbp, el dominio translocador de Hbp o bien la proteína de membrana externa OmpA. Alternativamente, se incubaron las inmunotransferencias de tipo Western con anticuerpos monoclonales de ratón
35 dirigidos contra ESAT6 o Ag85B de Mycobacterium tuberculosis, o con un antisuero policlonal de rata dirigido contra Rv2660c. Posteriormente, se incubaron las inmunotransferencias de tipo Western con anticuerpos de cabra anticonejo conjugados con peroxidasa del rábano (HRP) (Rockland Immunochemicals), anticuerpos de conejo anti-ratón conjugados con HRP o anticuerpos de conejo anti-rata conjugados con HRP, cuando fuese apropiado. Se revelaron las inmunotransferencias de tipo Western usando sustrato de inmunotransferencia de tipo Western LumiLight
40 quimioluminiscente (Roche). Se detectaron las señales quimioluminiscentes y se digitalizaron usando un instrumento ChemiDoc XRS+ Molecular Imager (BioRad).
Ejemplo 1
45 Expresión y biogénesis de la secreción de Hbp y constructos de presentación (figura 12).
Este ejemplo ilustra la expresión y biogénesis apropiadas de constructos de Hbp diseñados para la secreción o presentación de secuencias de aminoácidos heterólogas. Se procesan apropiadamente constructos que portan un sitio de escisión intacto entre el pasajero y el dominio translocador (HbpSS y HbpSL) produciendo dominios
50 translocadores que se integran en la membrana externa y pasajeros que se secretan al medio. La expresión de constructos que portan un sitio de escisión alterado entre el pasajero y el dominio translocador (HbpDL y HbpDD2) produce pasajeros que permanecen unidos de manera covalente al dominio translocador y, por tanto, asociados a la célula.
55 Expresión y secreción de Hbp, Hbp(-cleav), HbpSS, HbpSL (también denominado Hbp(d1)), HbpDL (también denominado HbpD(d1)) y HbpDD2 (también denominado HbpD(d2)). Se subcultivaron células E. coli MC1061 que albergaban los constructos clonados en el vector de expresión pEH3 de cultivos durante la noche en medio nuevo y se continuó su crecimiento. Cuando los cultivos alcanzaron la fase logarítmica temprana (DO660 0,3), se indujo la expresión de Hbp (derivados) con 1 mM de IPTG. Se recogieron muestras de los cultivos 2 h tras la inducción y se
60 separaron las células (c) y el medio gastado (m) mediante centrifugación a baja velocidad. Se solubilizaron directamente las células en tampón de muestra de SDS-PAGE mientras que se sometieron muestras de medio a precipitación con TCA en primer lugar. Se analizaron muestras correspondientes a 0,03 unidades de DO660 de células mediante SDS-PAGE y tinción con Coomassie (A). Se analizaron muestras correspondientes a 0,003 unidades de DO660 de células mediante SDS-PAGE e inmunotransferencia de tipo Western usando o bien
65 anticuerpos policlonales dirigidos contra el dominio pasajero de Hbp de longitud completa (B) o bien anticuerpos
policlonales dirigidos contra un epítopo N-terminal del dominio translocador de Hbp (C). Se indican marcadores de masa molecular (kDa) en el lado izquierdo de los paneles. Se indican los dominios pasajeros procesados (>), los dominios translocadores procesados () y las proformas no procesadas que comprenden tanto un dominio pasajero como translocador (*) de los constructos.
5
Ejemplo 2
Expresión y biogénesis de constructos de secreción de Hbp que portan una proteína heteróloga (figura 13).
Este ejemplo ilustra que una proteína heteróloga ESAT6 se transporta eficazmente al entorno extracelular (medio de cultivo) por medio del sistema de autotransportador de Hbp cuando se fusiona al pasajero de Hbp en la posición de dominio 1 del pasajero (HbpSL-ESAT6). Este ejemplo también muestra que para la secreción de proteínas heterólogas es necesario mantener el tallo beta del dominio pasajero de Hbp intacto. Esto se deduce a partir de la observación de que la fusión de ESAT6 con un constructo de Hbp cuyo pasajero se ha truncado en N’ hasta el
15 dominio autochaperona (HbpSS-ESAT6) no da como resultado cantidades detectables de ESAT6 en el medio de cultivo.
Expresión y secreción de Hbp, HbpSS, HbpSS-ESAT6, HbpSL (Hbp(d1)) y HbpSL-ESAT6 (también denominado Hbp(d1)-ESAT6). Se subcultivaron células E. coli MC1061 que albergaban los constructos clonados en el vector de expresión pEH3 o un vector vacío (carril 1) de cultivos durante la noche en medio nuevo y se continuó su crecimiento. Cuando los cultivos alcanzaron la fase logarítmica temprana (DO660 0,3), se indujo la expresión de Hbp (derivados) con 1 mM de IPTG. Se recogieron muestras de los cultivos 2 h tras la inducción y se separaron las células (c) y el medio gastado (m) mediante centrifugación a baja velocidad. Se solubilizaron directamente las células en tampón de muestra de SDS-PAGE mientras que se sometieron muestras de medio a precipitación con
25 TCA en primer lugar. Se analizaron muestras correspondientes a 0,03 unidades de DO660 de células mediante SDS-PAGE y tinción con Coomassie (A). Se analizaron muestras correspondientes a 0,003 unidades de DO660 de células mediante SDS-PAGE e inmunotransferencia de tipo Western usando o bien anticuerpos policlonales dirigidos contra un epítopo N-terminal del dominio translocador de Hbp (B), anticuerpos policlonales dirigidos contra el dominio pasajero de Hbp de longitud completa (C) o bien anticuerpos monoclonales contra la proteína ESAT6 de Mycobacterium tuberculosis de 10 kDa (E6) (D). Se indican marcadores de masa molecular (kDa) en el lado izquierdo de los paneles. Se indican los dominios pasajeros procesados (>), los dominios translocadores procesados () y las proformas no procesadas que comprenden tanto un dominio pasajero como translocador (*) de los constructos.
35 Ejemplo 3
Expresión y biogénesis de constructos de presentación de Hbp que portan una proteína heteróloga (figura 14).
Este ejemplo ilustra que una proteína heteróloga ESAT6 se expresa de manera estable cuando se fusiona al pasajero de Hbp en la posición de dominio 1 (HbpDL-ESAT6) o dominio 2 (HbpDD2-ESAT6) en un derivado de Hbp que porta un sitio de escisión alterado entre el pasajero y el dominio translocador.
Expresión y secreción de Hbp(-cleav), HbpDL (HbpD(d1)), HbpDL-ESAT6 (Hbp(d1)-ESAT6), HbpDD2 (HbpD(d2) y HbpDD2-ESAT6 (HbpD(d2)-ESAT6). Se subcultivaron células E. coli MC1061 que albergaban los 45 constructos clonados en el vector de expresión pEH3 de cultivos durante la noche en medio nuevo y se continuó su crecimiento. Cuando los cultivos alcanzaron la fase logarítmica temprana (DO660 0,3), se indujo la expresión de derivados de Hbp con 1 mM de IPTG. Tras 2 horas de inducción se recogieron las células mediante centrifugación a baja velocidad y se solubilizaron en tampón de muestra de SDS-PAGE. Se analizaron muestras correspondientes a 0,03 unidades de DO660 de células mediante SDS-PAGE y tinción con Coomassie (A). Se analizaron muestras correspondientes a 0,003 unidades de DO660 de células mediante SDS-PAGE e inmunotransferencia de tipo Western usando o bien anticuerpos policlonales dirigidos contra un epítopo N-terminal del dominio translocador de Hbp (B), anticuerpos policlonales dirigidos contra el dominio pasajero de Hbp de longitud completa (C) o bien anticuerpos monoclonales contra la proteína ESAT6 de Mycobacterium tuberculosis de 10 kDa (E6) (D). Se indican marcadores de masa molecular (kDa) en el lado izquierdo de los paneles. Se indican las proformas no procesadas
55 que comprenden tanto un dominio pasajero como translocador (*) de los constructos.
Ejemplo 4
Accesibilidad a proteinasa k de las fusiones Hbp-ESAT6 presentadas en la superficie celular (figura 15).
Este ejemplo ilustra que los pasajeros de ESAT6 que porta HbpDL y HbpDD2 son accesibles y, por tanto, se degradan por proteinasa k añadida a células intactas, indicando que se exponen en la superficie celular.
Accesibilidad a proteinasa k de Hbp(-cleav), HbpDL (HbpD(d1)), HbpDL-ESAT6 (HbpD(d1)-ESAT6), HbpDD2 65 (HbpD(d2)) y HbpDD2-ESAT6 (HbpD(d2)-ESAT6). Se subcultivaron células E. coli MC1061 que albergaban los
constructos clonados en el vector de expresión pEH3 de cultivos durante la noche en medio nuevo y se continuó su crecimiento. Cuando los cultivos alcanzaron la fase logarítmica temprana (DO660 0,3), se indujo la expresión de derivados de Hbp con 1 mM de IPTG. Se recogieron células de los cultivos 2 h tras la inducción mediante centrifugación a baja velocidad y se resuspendieron en Tris-HCl 50 mM, pH 7,4, que contenía CaCl 1 mM. En el 5 caso de Hbp(-cleav) y HbpDL, se lisaron la mitad de las células mediante sonicación en hielo usando un sonicador de punta (Branson Sonifier 250). Posteriormente, se incubaron todas las muestras con proteinasa k (pk) (100 g/ml) a 37ºC durante 1 hora. Se detuvo la reacción mediante la adición de fluoruro de fenilmetilsulfonilo (PMSF) 0,1 mM e incubación en hielo durante 5 min. Se sometieron las muestras a precipitación con TCA antes de la solubilización en tampón de muestra de SDS-PAGE. Para monitorizar la accesibilidad de los constructos de Hbp 10 presentados sobre células intactas a proteinasa k, se analizaron muestras correspondientes a 0,03 unidades de DO660 de células mediante SDS-PAGE y tinción con Coomassie (A). Como control, se analizaron muestras correspondientes a 0,003 unidades de DO660 de células mediante SDS-PAGE e inmunotransferencia de tipo Western usando anticuerpos policlonales dirigidos contra la proteína de la membrana externa OmpA que es inaccesible de manera natural a proteinasa k a menos que las células se lisen mediante por ejemplo sonicación
15 (son) (B). Se indica un producto de degradación de OmpA que surge tras el tratamiento con proteinasa k (x). Se indican marcadores de masa molecular (kDa) en el lado izquierdo de los paneles. Se indican las proformas no procesadas que comprenden tanto un dominio pasajero como translocador (*) de los constructos. La posición de proteinasa K (pk) se indica en el lado a mano derecha de los paneles.
20 Ejemplo 5.
Presentación de ESAT6 en la superficie celular (figura 16).
Este ejemplo ilustra que la proteína heteróloga ESAT6 fusionada al pasajero de HbpDL o HbpDD2 es accesible a
25 anticuerpos específicos añadidos a células intactas, indicando una presentación eficaz de ESAT6 en la superficie celular.
Análisis de presentación en superficie de Hbp(-cleav), HbpDL (HbpD(d1)), HbpDL-ESAT6 (HbpD(d1)-ESAT6), HbpDD2 (HbpD(d2)) y HbpDD2-ESAT6 (HbpD(d2)-ESAT6) y Hbp(ssTorA) y Hbp(OMPLA) incompetentes para 30 secreción. Hbp(ssTorA) es un mutante de Hbp que tiene su péptido señal nativo reemplazado por el péptido señal de la proteína TorA. Debido a que el péptido señal de TorA no dirige Hbp al translocón Sec, no tiene lugar la translocación a través de la membrana interna y Hbp permanece en el citoplasma. Hbp(OMPLA) es un mutante de Hbp que tiene su dominio translocador nativo reemplazado por la proteína de la membrana externa OMPLA. OMPLA dirige el pasajero de Hbp a la membrana externa pero no media en su translocación a través de la membrana
35 externa. Por tanto, el pasajero de Hbp permanece orientado hacia el periplasma y no hacia el medio extracelular.
Se subcultivaron células E. coli MC1061 que albergaban los constructos clonados en el vector de expresión pEH3, o un vector vacío (EV), de cultivos durante la noche en medio nuevo y se continuó su crecimiento. Cuando los cultivos alcanzaron la fase logarítmica temprana (DO660 : 0,3), se indujo la expresión de derivados de Hbp con 1 mM de 40 IPTG. Se recogieron células 1 hora tras la inducción mediante centrifugación a baja velocidad, se lavaron en Tris-HCl 50 mM, pH 7,4 enfriado con hielo y finalmente se resuspendieron en Tris-HCl 50 mM, pH 7,4 enfriado con hielo y se dejaron en hielo. Se sometió la mitad de cada muestra a sonicación de punta en hielo (Branson Sonifier 250) para lisar las células, mientras que las células de la otra mitad se dejaron intactas. Posteriormente, se preparó una serie de dilución de cinco veces de cada muestra en Tris-HCl 50 mM, pH 7,4 enfriado con hielo. Se aplicaron 45 diluciones de cada muestra sobre membranas de nitrocelulosa empapadas previamente usando un aparato Bio-Dot basado en colector de vacío (Biorad). Se bloquearon las membranas tras incubación en una disolución de leche desnatada al 5% en TBS durante 20 min. Para detectar la expresión en superficie del pasajero de derivados de Hbp, se incubaron las membranas con anticuerpos policlonales de conejo dirigidos contra el pasajero de Hbp en TBS durante 1 h, se lavaron 3 veces con TBS, se incubaron con anticuerpos de cabra anti-conejo conjugados con HRP
50 en TBS durante 45 min, se lavaron 3 veces con TBS y se revelaron usando tinción con sulfosuccinato de dioctilsodio (DONS) (A). Esto confirmó la exposición en superficie de los pasajeros de Hbp(-cleav), HbpDL, HbpDL-ESAT6, HbpDD2 y HbpDD2-ESAT6 sobre células completas en contraposición a los pasajeros de los mutantes incompetentes para secreción Hbp(ssTorA) y Hbp(OMPLA) cuya expresión era evidente a partir de las muestras sonicadas.
55 Para demostrar la presentación de ESAT6 por HbpDL-ESAT6 y HbpDD2-ESAT6 sobre células completas, se siguió el mismo procedimiento que en A excepto porque se usaron anticuerpos monoclonales de ratón dirigidos contra ESAT6 y anticuerpos de conejo anti-ratón conjugados con HRP (B). Como control, se demostró que una proteína periplásmica OppA no podría detectarse eficazmente sobre células completas en contraposición a las muestras
60 sonicadas. Por esto, se usó el mismo procedimiento que se describió en A excepto porque se usó un antisuero policlonal de conejo contra OppA (C). En el lado a mano izquierda de los paneles se indica la cantidad de material (en unidades de DO660) aplicada.
Ejemplo 6 65
Biogénesis de Hbp tras la deleción (parcial) de dominios laterales (figura 17)
Este ejemplo ilustra la secreción satisfactoria de Hbp tras el reemplazo de cualquiera de los dominios laterales 1 a 5 por una secuencia de aminoácidos de ligador flexible (d1 -d5). Además, se muestra la secreción satisfactoria de 5 un mutante de inserción (d4ins) en el que sólo se reemplazan 4 aminoácidos del dominio 4 por un ligador flexible.
Expresión y secreción de Hbp, Hbp(d1), Hbp(d2), Hbp(d3), Hbp(d4), Hbp(d5) y Hbp(d4ins). Se subcultivaron células E. coli MC1061 que albergaban los constructos clonados en el vector de expresión pEH3 o un vector vacío (-) de cultivos durante la noche en medio nuevo y se continuó su crecimiento. Cuando los cultivos alcanzaron la fase logarítmica temprana (DO660 0,3), se indujo la expresión de Hbp (derivados) con 1 mM de IPTG. Se recogieron muestras de los cultivos 2 h tras la inducción y se separaron las células (c) y el medio gastado (m) mediante centrifugación a baja velocidad. Se solubilizaron directamente las células en tampón de muestra de SDS-PAGE mientras que se sometieron muestras de medio a precipitación con TCA en primer lugar. Se analizaron muestras correspondientes a 0,03 unidades de DO660 de células mediante SDS-PAGE y tinción con Coomassie.
15 Se deduce una secreción apropiada a partir de la aparición de dominio pasajero escindido (>) en la fracción de células (c) y el medio de cultivo (m), y dominio translocador escindido () en la fracción de células, similar Hbp de tipo natural (t.n.) (figura 17). Se indican marcadores de masa molecular (kDa) en el lado izquierdo del panel.
Ejemplo 7
Secreción de ESAT6 fusionada a la posición de cualquiera de los dominios d1 a d5 (figura 18)
Este ejemplo ilustra la secreción eficaz del antígeno ESAT6 de Mycobacterium tuberculosis tras la fusión al dominio 25 pasajero de Hbp en la posición de cualquiera de los dominios d1 a d5, o la inserción en el dominio 4 (d4ins).
Expresión y secreción de Hbp(d1)-ESAT6, Hbp(d2)-ESAT6, Hbp(d3)-ESAT6, Hbp(d4)-ESAT6, Hbp(d5)-ESAT6 y Hbp(d4ins)-ESAT6. (A) Se hicieron crecer, se indujeron y se analizaron células E. coli MC1061 que albergaban los constructos clonados en el vector de expresión pEH3 tal como se describe en el ejemplo 6. (B) Se analizaron muestras de A correspondientes a 0,003 unidades de DO660 de células mediante inmunotransferencia de tipo Western usando anticuerpos monoclonales dirigidos contra ESAT6.
Se deduce una secreción apropiada a partir de la aparición de dominio pasajero escindido (>) en la fracción de células (c) y el medio de cultivo (m), y dominio translocador escindido () en la fracción de células (figura 18 A). Se
35 confirma la presencia de ESAT6 en los dominios pasajeros respectivos mediante inmunotransferencia de tipo Western usando anticuerpos específicos frente a ESAT6 (figura 18 B). Se indican marcadores de masa molecular (kDa) en el lado izquierdo de los paneles.
Ejemplo 8
Secreción de TB10.3 y TB10.4 tras el reemplazo del dominio d1 o d2 (figura 19)
Este ejemplo ilustra la secreción eficaz de las proteínas de Mycobacterium tuberculosis TB10.3 y TB10.4 tras el reemplazo del dominio d2 y el dominio d1 del pasajero de Hbp, respectivamente.
45 Expresión y secreción de Hbp(d1)-TB10.4 y Hbp(d2)-TB10.3. Se hicieron crecer células E. coli TOP10F’ que albergaban los constructos clonados en el vector de expresión pEH3, o que portaban un plásmido de no expresión (-), y se indujeron tal como se describe en el ejemplo 6. Se retiraron muestras de los cultivos 2 h tras la inducción. Posteriormente, se aislaron las células mediante centrifugación, se solubilizaron en tampón de muestra de SDS-PAGE y se analizaron mediante SDS-PAGE teñida con Coomassie.
Se deduce una secreción apropiada a partir de la aparición de dominio pasajero escindido (>) en la fracción de células (c) y el medio de cultivo (m), y dominio translocador escindido () en la fracción de células (figura 19). Se indican marcadores de masa molecular (kDa) en el lado izquierdo del panel.
55 Ejemplo 9
Secreción de Rv2660c fusionado a la posición de cualquiera de los dominios d3, d4 o d5 (figura 20)
Este ejemplo ilustra la secreción eficaz del antígeno de Mycobacterium tuberculosis Rv2660c tras la fusión al dominio pasajero de Hbp en la posición de dominio 3, dominio 4 o dominio 5.
Expresión y secreción de Hbp(d3)/Rv2660c, Hbp(d4)/ Rv2660c, Hbp(d5)/ Rv2660c. Se hicieron crecer, se indujeron y se analizaron células E. coli MC1061 que albergaban los constructos clonados en el vector de expresión
65 pEH3 y se analizaron tal como se describe en el ejemplo 6.
Se deduce una secreción apropiada a partir de la aparición de dominio pasajero escindido (>) en la fracción de células (c) y el medio de cultivo (m), y dominio translocador escindido () en la fracción de células (figura 20). Se indican marcadores de masa molecular (kDa) en el lado izquierdo del panel.
5
Ejemplo 10
Secreción de hEGF sin cisteína (figura 21).
Este ejemplo ilustra la secreción eficaz de una versión sin cisteína (0ss) de la proteína de Homo sapiens hEGF (EGF) tras la fusión al dominio pasajero de Hbp en la posición de dominio 1.
Expresión y secreción de Hbp (de tipo natural), Hbp(d1) y Hbp(d1)-hEGF(0ss). Se hicieron crecer células E. coli MC1061 que albergaban los constructos clonados en el vector de expresión pEH3 durante la noche en medio M9
15 complementado con glucosa (0,4%), cloranfenicol (20 g/ml) y estreptomicina (30 g/ml) a 37ºC. La siguiente mañana se subcultivaron las células en medio nuevo y se continuó su crecimiento. Cuando los cultivos alcanzaron la fase logarítmica temprana (DO660 0,3), se indujo la expresión de Hbp (derivados) con 1 mM de IPTG. Se recogieron muestras de los cultivos 3 h tras la inducción y se separaron las células (c) y el medio gastado (m) mediante centrifugación a baja velocidad. Se solubilizaron directamente las células en tampón de muestra de SDS-PAGE mientras que se sometieron muestras de medio a precipitación con TCA en primer lugar. Se analizaron muestras de células correspondientes a 0,05 unidades de DO660 y muestras de medio correspondientes a 0,1 unidades de DO660 mediante SDS-PAGE y tinción con Coomassie.
Se deduce una secreción apropiada a partir de la aparición de dominio pasajero escindido (>) en la fracción de
25 células (c) y el medio de cultivo (m), y dominio translocador escindido () en la fracción de células (figura 21). Se indican marcadores de masa molecular (kDa) en el lado izquierdo del panel.
Ejemplo 11
Secreción alterada de ESAT6 tras la inserción en una secuencia que forma tallo (figura 22)
Este ejemplo ilustra que la inserción de ESAT6 en la secuencia que forma tallo del dominio pasajero de Hbp (ins-ESAT6) produce una secreción ineficaz en comparación con el reemplazo del dominio lateral d4 por ESAT6 (d4-ESAT6). Es de destacar que los sitios de fusión con ESAT6 en los constructos respectivos están separados sólo por
35 5 residuos de aminoácido.
Expresión y secreción de Hbp (de tipo natural), Hbp(d4)-ESAT6 y Hbp(ins)-ESAT6. Se hicieron crecer y se indujeron células E. coli MC1061 que albergaban los constructos clonados en el vector de expresión pEH3 tal como se describe en el ejemplo 6. Se retiraron muestras de los cultivos 2 h tras la inducción. Posteriormente, se aislaron las células mediante centrifugación, se solubilizaron en tampón de muestra de SDS-PAGE y se analizaron mediante SDS-PAGE teñida con Coomassie. Se indican marcadores de masa molecular (kDa) en el lado izquierdo de los paneles. Se indican especies de pasajeros de Hbp escindidos (>).
Ejemplo 12
45 Secreción de ESAT6 tras la fusión con un autotransportador alternativo (figura 23-24)
Este ejemplo ilustra que la metodología usada para secretar proteínas heterólogas por medio del sistema de secreción de Hbp puede aplicarse a un autotransportador alternativo (AT); EspC.
La figura 23A muestra un modelo de la estructura de dominios pasajeros de EspC. La estructura se predijo in silico usando el método de modelado por homología M4T (Rykunov et al 2009 J Struct Funct Genomics 10: 95-99). Se usó la secuencia de aminoácidos primara correspondiente al dominio pasajero de EspC (residuos 54-1028 de la proteína con número de registro Q9EZE7) como entrada. Se identificaron los dominios laterales que sobresalen del tallo . El
55 dominio 1 (d1) está en gris claro. El resto del dominio pasajero, incluyendo el dominio de tallo beta está coloreado en negro. El dominio d1 es adecuado para su reemplazo por una POI.
La figura 23B muestra representaciones esquemáticas de derivados de EspC usados en los ejemplos. EspC (de tipo natural) se sintetiza como un precursor de 1306 aminoácidos (aa) que se organiza en tres dominios: (i) una secuencia señal escindible N-terminal (ss; aa 1-53), (ii) un dominio pasajero (aa 54-1028) y (iii) un dominio translocador C-terminal integrado en la membrana externa (dominio ; aa 1029-1306). Se indica el dominio 1 predicho (d1). El resto del dominio pasajero, incluyendo el dominio de tallo beta, está coloreado en negro. “FL” indica el ligador flexible. “E-6” indica ESAT6. Tras el paso de la membrana externa, se escinde el pasajero del dominio translocador (dominio ) por medio de un mecanismo autocatalítico que implica hidrólisis del enlace peptídico entre 65 Asn1028 y Ass1029 del precursor de EspC. Los números presentados por encima de los diagramas corresponden a las
posiciones de aminoácido del precursor de EspC (de tipo natural) original, calculadas a partir del extremo N-terminal.
Expresión y secreción de EspC, EspC(d1) y EspC(d1)-ESAT6. (figura 24 A) Se hicieron crecer, se indujeron y se analizaron células E. coli MC1061 que albergaban los constructos clonados en el vector de expresión pEH3 tal como 5 se describe en el ejemplo 6. (figura 24 B) Se analizaron muestras de A correspondientes a 0,003 unidades de DO660 de células mediante inmunotransferencia de tipo Western usando anticuerpos monoclonales contra ESAT6.
En este caso, se muestra que tras el reemplazo del dom1 predicho del dominio pasajero por una secuencia de aminoácidos flexible (d1), la secreción del pasajero de EspC se realiza con la misma eficacia que EspC de tipo 10 natural (t.n.). Además, este ejemplo ilustra que ESAT6 puede secretarse eficazmente tras la fusión al pasajero de EspC en la posición del dominio d1 predicho (d1/ESAT6). Se deduce una secreción apropiada a partir de la aparición de dominio pasajero escindido (>) en la fracción de medio (m), y dominio translocador escindido en la fracción de células (x) (figura 24 A). Se confirma la presencia de ESAT6 en el dominio pasajero de EspC(d1/ESAT6) mediante inmunotransferencia de tipo Western usando anticuerpos específicos frente a ESAT6
15 (figura 24 B). Se indican marcadores de masa molecular (kDa) en el lado izquierdo de los paneles.
Ejemplo 13
Secreción de Ag85B y ESAT6 fraccionados (figura 25)
20 Este ejemplo ilustra la secreción simultánea de los tramos de aminoácidos Ag85B[N’] y Ag85B[C’], aproximadamente correspondientes a la mitad N’ y C’ terminal de la región madura del antígeno de Mycobacterium tuberculosis Ag85B, respectivamente. Se logró la secreción de los dos restos tras la fusión traduccional de Ag85B[N’] al pasajero de Hbp en la posición de dominio 1 y Ag85B[C’] en la posición de dominio 2 de la misma molécula de pasajero de Hbp
25 (85[N+C]). Alternativamente, se fusionó Ag85B[C’] en la posición de dominio 1 y Ag85B[N’] en la posición de dominio 2 (85[N+C])
Además, este ejemplo ilustra la secreción simultánea de Ag85B[N’], Ag85B[C’] y el antígeno micobacteriano ESAT6. Se logró esto tras la fusión de Ag85B[N’] en la posición de dominio 1, Ag85B[C’] en la posición de dominio 2 y la
30 inserción de ESAT6 en el dominio 4 de la misma molécula de pasajero de Hbp (85[N+C]/E6). Alternativamente, se fusionó Ag85B[C’] en la posición de dominio 1, se fusionó Ag85B[N’] en la posición de dominio 2 y se insertó ESAT6 en el dominio 4 (85[C+N/E6).
Expresión, secreción y accesibilidad de proteinasa K de Hbp, Hbp(-cleav), Hbp-Ag85B[N+C], Hbp-Ag85B[C+N], Hbp
35 Ag85B[N+C]/ESAT6, Hbp-Ag85B[C+N]/ESAT6. (figura 25 A) Se hicieron crecer, se indujeron y se analizaron células E. coli TOP10F’ que albergaban los constructos clonados en el vector de expresión pEH3 o un vector vacío (-) de cultivos durante la noche tal como se describe en el ejemplo 6. (figura 25 B) Se resuspendieron las células hechas crecer e inducidas en A en Tris-HCl 50 mM, pH 7,4, que contenía CaCl 1 mM. Posteriormente, se incubaron muestras a 37ºC durante 1 hora con (+) o sin (-) proteinasa k (pk) (100 g/ml). Se detuvo la reacción mediante la
40 adición de fluoruro de fenilmetilsulfonilo (PMSF) 0,1 mM e incubación en hielo durante 5 min. Se sometieron las muestras a precipitación con TCA antes de la solubilización en tampón de muestra de SDS-PAGE y análisis en SDS-PAGE teñida con Coomassie. Se indican marcadores de masa molecular (kDa) en el lado izquierdo de los paneles. Se indican pasajeros escindidos (>) y dominios translocadores (), la posición de proteinasa K (pk).
45 Se deduce una secreción apropiada a partir de la aparición de dominio pasajero escindido (>) y dominio translocador () en la fracción de células (c), similar a Hbp de tipo natural (A). Como control, se observa dominio translocador y pasajero no escindido para una versión no escindible, pero competente para translocación de Hbp (). Para confirmar su ubicación extracelular, se muestra la sensibilidad de los pasajeros hacia proteinasa K añadida a células intactas (B).
50 Ejemplo 14
Secreción simultánea de Ag85B, ESAT6 y Rv2660 fraccionados (figura 26)
55 Este ejemplo ilustra la secreción simultánea de Ag85B[N’], Ag85B[C’], ESAT6 y el antígeno micobacteriano Rv2660c cuando se fusionan a un único dominio pasajero de Hbp. Se logró la secreción de los restos tras la fusión traduccional de Ag85B[C’] al pasajero de Hbp en la posición de dominio 1, la fusión de Ag85B[N’] en la posición de dominio 2, la inserción de ESAT6 en el dominio 4 y la fusión de Rv2660c en la posición de dominio 5 (“85-E6-2660”). Para comparación, se analizó en paralelo la secreción de constructos que portan sólo Ag85B[C’] y Ag85B[N’] (“85”),
60 o Ag85B[C’], Ag85B[N’] y ESAT6 (“85-E6”).
Expresión y secreción de Hbp-Ag85B[C+N], Hbp-Ag85B[C+N]/ESAT6 y Hbp-Ag85B[C+N]/ESAT6/Rv2660c. Se hicieron crecer y se indujeron células E. coli MC1061 que albergaban los constructos clonados en el vector de expresión pEH3 tal como se describe en el ejemplo 6.
Se deduce una secreción apropiada a partir de la aparición de dominio pasajero escindido (>) y dominio translocador
(x) en la fracción de células (c) (figura 26). Se indican marcadores de masa molecular (kDa) en el lado izquierdo del panel.
5 Ejemplo 15
Presentación simultánea de Ag85B, ESAT6 y Rv2660c fraccionados (figura 27)
Este ejemplo ilustra la presentación simultánea de Ag85B[N’], Ag85B[C’], ESAT6 y Rv2660c cuando se fusionan a un único dominio pasajero de Hbp(cleav), una versión no escindible, aunque competente para translocación de Hbp. Se logró la presentación tras la fusión traduccional de Ag85B[C’] al pasajero de Hbp en la posición de dominio 1, la fusión de Ag85B[N’] en la posición de dominio 2, la inserción de ESAT6 en el dominio 4 y la fusión de Rv2660c en la posición de dominio 5 (85-E6-2660). Para comparación, se analizó en paralelo la presentación de constructos que portan sólo Ag85B[C’] y Ag85B[N’] (85), o Ag85B[C’], Ag85B[N’] y ESAT6 (85-E6). Además, se analizó la
15 presentación de Hbp(cleav) () (figura 27 A).
Se llevó a cabo inmunotransferencia de tipo Western usando anticuerpos específicos contra Ag85B[C’], ESAT6 y Rv2660c para confirmar la presencia de estos restos en los dominios pasajeros respectivos cuando fuese apropiado (figura 27 B).
Para confirmar la translocación de los dominios pasajeros respectivos a través de la envuelta celular, y su presentación en la superficie celular, se muestra la sensibilidad de los pasajeros hacia proteinasa K añadida a células intactas (figura 27 C).
25 En la figura 27 se indican marcadores de masa molecular (kDa) en el lado izquierdo de los paneles. Se indican especies de Hbp de proformas no escindidas (*).
Expresión y presentación de Hbp(cleav), HbpD-Ag85B[C+N], HbpD-Ag85B[C+N]/ESAT6 y HbpDAg85B[C+N]/ESAT6/Rv2660c. (A) Se hicieron crecer y se indujeron células E. coli MC1061 que albergaban los constructos clonados en el vector de expresión pEH3 tal como se describe en el ejemplo 6. Se retiraron muestras de los cultivos 2 h tras la inducción. Posteriormente, se aislaron las células mediante centrifugación, se solubilizaron en tampón de muestra de SDS-PAGE y se analizaron mediante SDS-PAGE teñida con Coomassie. (B) Se analizaron muestras de A correspondientes a 0,003 unidades de DO660 de células mediante inmunotransferencia de tipo Western usando o bien anticuerpos monoclonales dirigidos contra un epítopo de Ag85B[C], anticuerpos monoclonales
35 dirigidos contra ESAT6 o anticuerpos policlonales dirigidos contra Rv2660c. (C) Se resuspendieron las células hechas crecer e inducidas en A en Tris-HCl 50 mM, pH 7,4, que contenía CaCl 1 mM. Posteriormente, se incubaron las muestras a 0ºC durante 30 min con (+) o sin (-) proteinasa k (pk) (100 g/ml). Se detuvo la reacción mediante la adición de fluoruro de fenilmetilsulfonilo (PMSF) 0,1 mM e incubación en hielo durante 5 min. Se sometieron las muestras a precipitación con TCA antes de la solubilización en tampón de muestra de SDS-PAGE y análisis en SDS-PAGE teñida con Coomassie.
Ejemplo 16
Secreción simultánea de Ag85B, ESAT6 y Rv2660c por una cepa de Salmonella atenuada (figura 28)
45 Este ejemplo ilustra la secreción simultánea de Ag85B[N’], Ag85B[C’], ESAT6 y el antígeno micobacteriano Rv2660c, cuando se fusionan con un único dominio pasajero de Hbp, por Salmonella typhimurium atenuada. Se logró la secreción de los restos tras la fusión traduccional de Ag85B[C’] con el pasajero de Hbp en la posición de dominio 1, la fusión de Ag85B[N’] en la posición de dominio 2, la inserción de ESAT6 en el dominio 4 y la fusión de Rv2660c en la posición de dominio 5 (85[C+N]-E6-2660). Se deduce una secreción apropiada a partir de la aparición de dominio pasajero escindido (>) en la fracción de medio (m) (figura 28A).
Se llevó a cabo inmunotransferencia de tipo Western usando anticuerpos específicos contra Ag85B[C’], ESAT6 y Rv2660c para confirmar la presencia de estos restos en el dominio pasajero secretado. Además, la
55 inmunotransferencia de tipo Western usando un antisuero contra el dominio translocador de Hbp (barril ) confirmó la aparición de dominio translocador escindido en las células (figura 28B).
Expresión y secreción de Hbp-Ag85B[C+N]-ESAT6-Rv2660c por Salmonella typhimurium atenuada. (A) Se hicieron crecer la cepa SL3261 de Salmonella typhimurium (Hoiset y Stocker 1981 Nature 291: 281-282) y un derivado que porta una única copia del gen que codifica para Hbp-Ag85B[C+N]-ESAT6-Rv2660c en el genoma bajo el control de un promotor lacUV5 constitutivo durante la noche hasta saturación en medio LB a 37ºC. Para la construcción de cepas de Salmonella véase el ejemplo 21. A la mañana siguiente, se subcultivaron las células en medio nuevo y se continuó su crecimiento. Dos horas tras subcultivar, se recogieron muestras de los cultivos y se separaron las células (c) y el medio gastado (m) mediante centrifugación a baja velocidad. Se solubilizaron las células 65 directamente en tampón de muestra de SDS-PAGE mientras que se sometieron muestras de medio a precipitación
con TCA en primer lugar. Se analizaron muestras correspondientes a 0,03 unidades de DO660 de células mediante SDS-PAGE y tinción con Coomassie. (B) Se analizaron muestras de A correspondientes a 0,003 unidades de DO660 de células mediante inmunotransferencia de tipo Western usando o bien anticuerpos monoclonales dirigidos contra un epítopo de Ag85B[C], anticuerpos monoclonales dirigidos contra ESAT6, anticuerpos policlonales dirigidos contra
5 Rv2660c o bien anticuerpos policlonales dirigidos contra el dominio translocador de Hbp.
Se indica una banda de fondo de identidad desconocida (*). Se indican marcadores de masa molecular (kDa) en el lado izquierdo de los paneles.
Ejemplo 17
Presentación simultánea de Ag85B, ESAT6 y Rv2660c por una cepa de Salmonella atenuada (figura 29)
Este ejemplo ilustra la expresión y presentación simultánea de Ag85B[N’], Ag85B[C’], ESAT6 y Rv2660c en la
15 superficie celular de Salmonella typhimurium atenuada, cuando se fusiona con un único dominio pasajero de Hbp de dominio pasajero de Hbp(cleav), una versión no escindible, aún competente para translocación de Hbp (HbpDAg85B[C+N]-ESAT6-Rv2660c). También se muestra la presentación en superficie de una única unidad de ESAT6 usando la misma estrategia (HbpD-ESAT6).
Se deduce una expresión apropiada de los constructos a partir del análisis mediante SDS-PAGE y tinción con Coomassie que muestra la aparición de bandas de proteína con un peso molecular correspondiente al peso molecular calculado de HbpDAg85B[C+N]-ESAT6-Rv2660c y HbpD-ESAT6, respectivamente (*). Como control, estas bandas no están presentes en células control que no expresan (-).
25 Para confirmar la translocación de los respectivos dominios pasajeros a través de la envuelta celular y presentación en la superficie celular, se muestra su sensibilidad hacia la proteinasa K (pk) añadida a células intactas.
Expresión y presentación de HbpD-Ag85B[C+N]-ESAT6-Rv2660c y HbpD-ESAT6 sobre la superficie celular de Salmonella typhimurium atenuada. Se hicieron crecer la cepa SL3261 de Salmonella typhimurium (Hoiset y Stocker 1981 Nature 291: 281-282) (-) y un derivado que porta o bien una única copia del gen que codifica para HbpDAg85B[C+N]-ESAT6-Rv2660c o bien el gen que codifica para HbpD-ESAT6 en el genoma bajo el control de un promotor de lacUV5 constitutivo, durante la noche hasta saturación en medio LB a 37ºC. Para la construcción de cepas de Salmonella véase el ejemplo 21. A la mañana siguiente, se subcultivaron las células en medio nuevo y se continuó su crecimiento. Dos horas y 30 min tras subcultivar, se recogieron muestras de los cultivos y se
35 resuspendieron las células en Tris-HCl 50 mM, pH 7,4, que contenía CaCl 1 mM. Posteriormente, se incubaron las muestras a 37ºC durante 1 hora con (+) o sin (-) proteinasa k (pk) (100 g/ml). Se detuvo la reacción mediante la adición de fluoruro de fenilmetilsulfonilo (PMSF) 0,1 mM e incubación en hielo durante 5 min. Se sometieron las muestras a precipitación con TCA, se solubilizaron en tampón de muestra de SDS-PAGE y se analizaron en SDS-PAGE teñida con Coomassie. Se indican las proformas no procesadas de los constructos (*), que comprenden un dominio tanto pasajero como translocador. Se presentan marcadores del peso molecular (kDa) en el lado derecho de los paneles.
Ejemplo 18
45 Presentación simultánea de Ag85B, ESAT6 y Rv2660c fraccionados sobre vesículas de membrana externa (figura 30A-D).
Esta muestra ilustra la presentación simultánea de Ag85B[C’], Ag85B[N’] y ESAT6 sobre la superficie de vesículas de membrana externa (OMV) bacteriana tras la fusión con un único dominio pasajero de Hbp(cleav), una versión no escindible, aún competente para translocación de Hbp (85B-E6-2660). Además, se muestra la presentación combinada de Ag85B[C’], Ag85B[N’] y ESAT6 (85B-E6), así como una única unidad de ESAT6 (d1-E6). Como control, se analizó la presentación de HbpD(d1) que no porta una pareja heteróloga (d1). Para lograr la presentación sobre OMV, se expresaron las proteínas de fusión en una cepa de E. coli que porta mutaciones en los genes tol-pal que inducen un fenotipo hiper-vesiculante.
55 Se muestra la localización de las proteínas de fusión en OMV mediante su colocalización con proteínas porinas de membrana externa OmpA y OmpC en aislados de OMV derivados de fracciones de medio de cultivo filtradas y, por tanto, libres de células (figuras 30A y B). Se muestra la presentación satisfactoria de las proteínas de fusión en la superficie de OMV mediante su sensibilidad hacia proteinasa K añadida a las OMV de manera externa (figuras 30C y D). Para confirmar la integridad de las OMV, se muestra que no puede accederse al dominio intracelular sensible a proteinasa K de OmpA, a menos que las OMV se solubilicen usando el detergente Triton x-100 (tx-100).
Expresión y presentación de HbpD(d1), HbpD(d1)-ESAT6, HbpD-Ag85B[C+N]-ESAT6 y Ag85B[C+N]-ESAT6-Rv2660c sobre OMV. (A) Se subcultivaron células E. coli JC8031 (Barnadac et al 1998 Journal of Bacteriology 180: 65 4872-4878) que albergaban los constructos clonados en el vector de expresión pEH3 o un vector vacío (-) a partir de
cultivos durante la noche en medio nuevo y se continuó su crecimiento. Cuando los cultivos alcanzaron la fase logarítmica temprana (DO660 0,2), se indujo la expresión de Hbp (derivados) con 1 mM de IPTG. Tres horas tras la inducción, se centrifugaron 50 ml de muestras de cultivo (5000 rpm, 4ºC, 15 min) para separar las células del medio. Se solubilizaron las células (células totales) en tampón de muestra de SDS-PAGE mientras que se sometió el medio 5 de cultivo a centrifugación una vez más (5000 rpm, 4ºC, 15 min). Se filtró el sobrenadante resultante a través de filtros de 0,2 m de tamaño de poro y se sometió a centrifugación a alta velocidad (45.000 rpm, 4ºC, 1 h) usando un rotor TFT 70.38 de Kontron. Se resuspendió la fracción de sedimento, que contenía las OMV, en PBS. Se solubilizó una muestra correspondiente a 1 unidad de DO660 de células en tampón de muestra de SDS-PAGE y se analizó mediante SDS-PAGE teñida con Coomassie en paralelo a 0,02 unidades de DO660 de células totales. Se han indicado las proteínas de membrana externa OmpA y OmpC, cuya identidad se confirmó mediante análisis de espectrometría de masas, en el lado izquierdo del panel. (B) Para confirmar la identidad de las proteínas de fusión, se analizaron muestras preparadas en A mediante inmunotransferencia de tipo Western usando un antisuero policlonal contra el dominio translocador de Hbp (barril ) y anticuerpos monoclonales contra ESAT6. (C) Tratamiento con proteinasa K de OMV. Se resuspendieron las OMV aisladas en A en Tris-HCl 50 mM, pH 7,4, que 15 contenía CaCl 1 mM. Se fraccionaron las muestras en tres alícuotas iguales, que se incubaron con (+) o sin (-) proteinasa K (pk) (100 g/ml) tal como se indica. Antes de la adición de proteinasa k, se añadió Triton X-100 (tx-100) (al 1%) a una de las alícuotas. Se incubaron todas las alícuotas a 37ºC durante 30 min, tras lo que se detuvo la reacción mediante la adición de fluoruro de fenilmetilsulfonilo (PMSF) 0,1 mM e incubación en hielo durante 5 min. Se sometieron las muestras a precipitación con TCA, se solubilizaron en tampón de muestra de SDS-PAGE. Se sometieron muestras correspondientes a 1 unidad de DO660 de células a SDS-PAGE teñida con Coomassie. (D) Para confirmar la identidad de las proteínas de fusión, se analizaron muestras preparadas en C mediante inmunotransferencia de tipo Western usando un antisuero policlonal contra el dominio translocador de Hbp (barril ) y anticuerpos monoclonales contra ESAT6. Se indican las proformas no procesadas de los constructos (*), que comprenden un dominio tanto pasajero como translocador. Se presentan marcadores del peso molecular (kDa) en el
25 lado derecho de los paneles.
Ejemplo 19
Presentación de Ag85B y ESAT6 fraccionados sobre fantasmas (figura 31A-C)
En el presente ejemplo 19 se usó el plásmido pLargeRhaLysisE para convertir células de E. coli en fantasmas usando la metodología descrita en el presente documento. La construcción de pLargeRhaLysisE se describe en el ejemplo 20.
35 Esta muestra ilustra la presentación simultánea de Ag85B[C],Ag85B[N] y ESAT6 sobre la superficie de fantasmas bacterianos tras la fusión con un único dominio pasajero de Hbp(cleav). Para lograr la presentación en superficie sobre fantasmas, se expresó HbpD-Ag85B[C+N]-ESAT6 en células de E. coli transformadas con un plásmido que porta el gen que codifica para la proteína E de lisis del bacteriófago phiX174 bajo el control de un promotor inducible. Tras la expresión de HbpDAg85B[C+N]-ESAT6, se indujo la expresión de la proteína E de lisis, conduciendo a la liberación del contenido citoplasmático celular al medio de cultivo. Esto dio como resultado la aparición de envueltas de células bacterianas “vacías” (fantasmas) que presentan HbpD-Ag85B[C+N]-ESAT6 en la superficie.
Se muestra la formación satisfactoria de fantasmas mediada por proteína E de lisis mediante una disminución en la densidad celular aparente (DO600) tras la expresión de proteína E de lisis (figura 31A). Además, se muestra que se
45 liberan proteínas marcadoras citoplasmáticas (SecB, DnaK) al medio tras la expresión de proteína E de lisis y, por tanto, terminan en la fracción de sobrenadante tras la centrifugación. Por el contrario, una proteína marcadora periplásmica (SurA) y una proteína integral de membrana (Lep) se localizan (principalmente) en el sedimento de centrifugación que contiene las envueltas de células bacterianas (fantasmas) (figura 31 B). Se muestra la localización correcta de HbpD-Ag85B[C+N]-ESAT6 en los fantasmas mediante su colocalización con Lep en la fracción de sedimento (figura 31 B). Se muestra la presentación satisfactoria de HbpDAg85B[C+N]-ESAT6 en la superficie de fantasmas y células control por su sensibilidad hacia proteinasa K añadida a los fantasmas/células de manera externa (figura 31C).
Expresión y presentación de HbpD-Ag85B[C+N]-ESAT6 y la formación posterior de fantasmas. (A) Se hicieron crecer
55 células E. coli MC4100 co-transformadas con (i) un pEH3(p15a)-HbpD-Ag85B[C+N]-ESAT6, y (ii) pLargeRhaLysisE, que portan el gen que codifica para la proteína E de lisis del bacteriófago phiX174 bajo el control de un promotor inducible por ramnosa, en medio LB a 30ºC. Cuando el cultivo alcanzó una DO600 de 0,5, se añadieron 0,4 mM de IPTG para inducir la expresión de HbpD-Ag85B[C+N]-ESAT6 y se fraccionó el cultivo. Una hora tras la adición de IPTG, se añadió ramnosa al 0,2% a una mitad del cultivo original para inducir la expresión de proteína E de lisis, mientras que la otra mitad del cultivo se usó como control. Se monitorizó la DO600 de los cultivos a lo largo del tiempo. (B) Tres horas tras la inducción con IPTG, se aislaron las células control (cultivo no inducido) y los fantasmas (cultivo inducido) que se hicieron crecer en A mediante centrifugación. Se aisló el sobrenadante que contenía el medio de cultivo y se precipitó su contenido en proteínas con TCA. Entonces se solubilizaron sedimentos de células/fantasmas (P; sedimento de células/fantasmas) y material precipitado con TCA (S; sobrenadante) en
65 tampón de muestra de SDS-PAGE y se analizó mediante SDS-PAGE e inmunotransferencia de tipo Western. Se
detectó la presencia de HbpD-Ag85B[C+N]-ESAT6 usando anticuerpos policlonales dirigidos contra el dominio pasajero de Hbp (pas.) y translocador (barril), y anticuerpos monoclonales contra ESAT6. Se monitorizó la formación de fantasmas usando anticuerpos policlonales contra las proteínas citoplasmáticas DnaK y SecB, la proteína periplásmica SurA y la proteína integral de membrana Lep. (C) Tratamiento con proteinasa K de células control y 5 fantasmas. Se resuspendió parte de las células y los fantasmas aislados en B en Tris-HCl 50 mM, pH 7,4, que contenía CaCl 1 mM. Se añadió proteinasa K (100 g/ml) a la mitad de cada muestra (+) mientras que la otra mitad se dejó sin tratar (-). Se incubaron las muestras a 37ºC durante 1 h, tras lo que se detuvo la reacción mediante la adición de fluoruro de fenilmetilsulfonilo (PMSF) 0,1 mM e incubación en hielo durante 5 min. Se sometieron las muestras a precipitación con TCA, se solubilizaron en tampón de muestra de SDS-PAGE y se analizaron mediante
10 inmunotransferencia de tipo Western usando un antisuero contra el dominio pasajero de Hbp.
Ejemplo 20
El siguiente ejemplo se refiere a la construcción del plásmido pLargeRhaLysisE. La figura 32 muestra un mapa de
15 plásmido de pLargeRhaLysisE usado en el ejemplo 20. La tabla 3 y la tabla 4 a continuación muestran, respectivamente, las secuencias de cebador y los constructos usados en el ejemplo 20.
El plásmido pLargeRhaLysisE porta el gen que codifica para la proteína E de lisis del bacteriófago phiX174 bajo el control de un promotor rhaBAD inducible por ramnosa. Para construir pLargeRhaLysisE, en primer lugar se
20 construyó el plásmido pLarge, que se basa en pSB3398 (Wagner et al 2010 Proc Natl Acad Sci USA 107:1774517750) y pRha67K.
El plásmido Rha67K es un derivado de pRha67 (Giacalone et al. 2006 BioTechniques 40: 355-364) en el que el gen que codifica para el marcador de ampicilina se reemplaza desde el codón de iniciación hasta el de terminación por el 25 gen que codifica para el marcador de kanamicina de pET28(a+) (EMD Biosciences) usando el método de clonación USER (Bitinaite y Nichols 2009 Curr Protoc Mol Biol capítulo 3:unidad 3.21; Norholm 2010 BMC Biotechnol 10: 21). Se amplificó el gen que codifica para el marcador de resistencia a kanamicina de pET28(a+) usando pET28(a+) como molde y los cebadores que contienen desoxiuracilo (u) kanR y kanF. Se amplificó el ADN que codifica para pRha67 sin el gen que codifica para el marcador de ampicilina usando los cebadores que contienen desoxiuracilo
30 pRhakanF y pRhakanR. Se usó la PfuX7 polimerasa para amplificar el ADN usando cebadores que contienen desoxiuracilo (Nørholm 2010 BMC Biotechnol 10: 21). Posteriormente, se usó la enzima USER (New England Biolabs) según las instrucciones del fabricante para la construcción de pRha67K.
El plásmido pLarge es un derivado de pRha67K en el que se reemplazan el promotor de ramnosa (incluyendo
35 elementos reguladores), el sitio de clonación múltiple y el terminador por los de pSB3398 (Wagner et al 2010 Proc Natl Acad Sci USA 107:17745-17750) usando el método de clonación USER (Bitinaite y Nichols 2009 Curr Protoc Mol Biol Chapter 3:Unit 3,21; Nørholm 2010 BMC Biotechnol 10: 21). Se amplificaron los elementos reguladores (rhaR, rhaS PrhaBAD), y el sitio de clonación múltiple y el terminador de la transcripción rrnB usando pSB3398 como molde y los cebadores que contienen desoxiuracilo pSB3398 directo y pSB3398 inverso. Se usó pRha67K como
40 molde para amplificar la parte de pRha67K que cubre el marcador de resistencia a kanamicina (incluyendo su promotor y terminador) y el origen de replicación. Los cebadores que contienen desoxiuracilo usados fueron 67kF y pRhaR. Se usó la PfuX7 polimerasa para amplificar el ADN y, posteriormente, se usó la enzima USER (New England Biolabs) según las instrucciones del fabricante para construir pLarge.
45 Para construir pLargeRhaLysisE, se obtuvo una secuencia de ADN sintética que codifica para la proteína E de lisis del bacteriófago phiX174 de MWG. El fragmento de ADN sintético presentaba sitios EcoRI y BamHI en el lado 5’ y 3’ de la secuencia codificante, respectivamente. Esto permitió la clonación en los sitios EcoRI y BamHI de pLarge, proporcionando pLargeRhaLysisE.
Tabla 3. Cebadores usados en el ejemplo 20
- Nombre
- SEQ ID NO Secuencia (5’ a 3’)
- kanR
- 124 agaaaaacucatcgagcatcaaatg
- kanF
- 125 atgagccauattcaacgggaaac
- pRhakanF
- 126 agtttttcuaactgtcagaccaagtttactc
- pRhakanR
- 127 atggctcauactcttcctttttcaatattattgaagc
- pSB3398 dir
- 128 atctttcugcgaattgagatgac
- pSB3398 inv
- 129 aagcctaguctcatgagcgg
- 67kF
- 130 actaggctugtaatcatggtcatagctgtttc
- pRhaR
- 131 agaaagauagacgaaagggcctcgtgatac
NB: En la tabla 3 los uracilos se indican con u.
Tabla 4. Constructos usados en el ejemplo 20
Nombre SEQ ID NO de proteína SEQ ID NO de ADN
Proteína E de lisis 132 133
Ejemplo 21
El siguiente ejemplo 21 se refiere a la construcción de cepas de Salmonella. La figura 33 muestra una 5 representación esquemática de la ubicación de inserciones de mutantes de hbp en el cromosoma de Salmonella typhimurium SL3261. La tabla 5 a continuación muestra las secuencias de cebadores usados en el ejemplo 21.
Se construyeron cepas de Salmonella typhimurium que portaban una única copia de cualquiera de los genes que codifican para Hbp-Ag85B(C+N)-ESAT6-Rv2660c, HbpD-ESAT6 o HbpD-Ag85B(C+N)-ESAT6-Rv2660c en el 10 cromosoma, tal como sigue. Se insertaron los genes mutantes hbp en cuestión en el cromosoma de S. typhimurium mediante intercambio alélico a través de recombinación de homólogos de cruzamiento doble (Kaniga et al 1991 Gene 109: 137-141), que reemplazan las regiones de promotor malE y malK. En resumen, se amplificaron los mutantes de hbp que incluyen la región del promotor lacUV5 mediante PCR usando pHbp-Ag85B(C+N)-ESAT6-Rv2660c, pHbpD-ESAT6 o pHbpD-Ag85B(C+N)-ESAT6-Rv2660c como molde, respectivamente. Los cebadores
15 usados fueron lacUV5_ScaI_f y pEH3Hbpbeta_Scal_r. Se digirieron los productos de PCR con ScaI y se clonaron en un vector suicida derivado de pSB890 cortado con Smal (Palmer et al 1998 Molecular Microbiology 27: 953-965), justo entre regiones de homología de 1000 pb con malE y malK (figura 33).
Se transformaron los vectores suicidas de mutantes de hbp en la cepa donadora de E. coli SM10 pir (Miller y
20 Mekalanos 1998 Journal of Bacteriology 170: 2575-2583). Se apareó durante la noche SM10A pir en placa con la cepa receptora de S. typhimurium SL3261 (Hoiset y Stocker 1981 Nature 291: 281-282). Se seleccionaron transconjugantes de S. typhimurium resistentes a tetraciclina en placa.
Se lograron la resolución de merodiploides y el remplazo del locus de tipo natural con un gen mutante hbp mediante
25 selección según la resistencia de los mutantes de Salmonella a sacarosa (Kaniga et al 1991 Gene 109: 137-141). Se identificaron clones positivos mediante PCR de la región intergénica entre malE y malK usando los cebadores malE_insert_seq y malK_insert_seq, y secuenciado el alelo introducido.
Tabla 5. Cebadores usados en el ejemplo 21
Nombre SEQ ID NO Secuencia (5’ a 3’) IacUV5_ScaI_f 134 GCGC AGTACT TTG CGC CAT TCT ATG GTG TC pEH3Hbpbeta_ScaI_r 135 GCGCAGTACTCACAGCATCAGA ATGAATAACG malE_insert_seq 136 TAT AAC CCT TGT CGC CGT TG malK_insert_seq 137 ACG CAG CAA GGT CGA TTT AC
<110> Xbrane Bioscience AB
<120> Proteína de fusión para la expresión de proteínas secretoras 35
<130> IPQ2754
<150> Documento SE 1051000-6
<151> 40
<160> 137
<170> PatentIn versión 3.5 45 <210> 1
<211> 1377
<212> PRT
<213> Escherichia coli 50 <400> 1
<210> 2
<211> 1377
<212> PRT
<213> Escherichia coli
<400> 2
<210> 3
<211> 445
<212> PRT
<213> Escherichia coli
<400> 3
<210> 4
<211> 1131
<212> PRT
<213> Escherichia coli
<400> 4
<210> 5
<211> 1131
<212> PRT
<213> Escherichia coli
<400> 5
<210> 6
<211> 1314
<212> PRT
<213> Escherichia coli
<400> 6
<210> 7
<211> 1314
<212> PRT
<213> Escherichia coli
<400> 7
<210> 8
<211> 1350
<212> PRT
<213> Escherichia coli
<400> 8
<210> 9
<211> 1358
<212> PRT
<213> Escherichia coli
<400> 9
<210> 10
<211> 1366
<212> PRT
<213> Escherichia coli
<400> 10
<210> 11
<211> 1383
<212> PRT
<213> Escherichia coli
<400> 11
<210> 12
<211> 539
<212> PRT
<213> Escherichia coli/Mycobacterium tuberculosis
<400> 12
<210> 13
<211> 1225
<212> PRT
<213> Escherichia coli/Mycobacterium tuberculosis
<400> 13
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<211> 1225
<212> PRT
<213> Escherichia coli/Mycobacterium tuberculosis
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<212> PRT
<213> Escherichia coli/Mycobacterium tuberculosis
<400> 15
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<211> 1408
<212> PRT
<213> Escherichia coli/Mycobacterium tuberculosis
<400> 16
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<212> PRT
<213> Escherichia coli/Mycobacterium tuberculosis
<400> 17
<210> 18
<211> 1452
<212> PRT
<213> Escherichia coli/Mycobacterium tuberculosis
<400> 18
<210> 19
<211> 1460
<212> PRT
<213> Escherichia coli/Mycobacterium tuberculosis
<400> 19
<210> 20
<211> 1477
<212> PRT
<213> Escherichia coli/Mycobacterium tuberculosis
<400> 20
<210> 21
<211> 1482
<212> PRT
<213> Escherichia coli/Mycobacterium tuberculosis
<400> 21
<210> 22
<211> 1424
<212> PRT
<213> Escherichia coli/Mycobacterium tuberculosis
<400> 22
<210> 23
<211> 1432
<212> PRT
<213> Escherichia coli/Mycobacterium tuberculosis
<400> 23
<210> 24
<211> 1440
<212> PRT
<213> Escherichia coli/Mycobacterium tuberculosis
<400> 24
<210> 25
<211> 1226
<212> PRT
<213> Escherichia coli/Mycobacterium tuberculosis
<400> 25
<210> 26
<211> 1409
<212> PRT
<213> Escherichia coli/Mycobacterium tuberculosis
<400> 26
<210> 27
<211> 1183
<212> PRT
<213> Escherichia coli/Homo sapiens
<400> 27
<210> 28
<211> 1360
<212> PRT
<213> Escherichia coli/Mycobacterium tuberculosis
<400> 28
<210> 29
<211> 1360
<212> PRT
<213> Escherichia coli/Mycobacterium tuberculosis
<400> 29
<210> 30
<211> 1360
<212> PRT
<213> Escherichia coli/Mycobacterium tuberculosis
<400> 30
<210> 31 <211> 1360
<212> PRT
<213> Escherichia coli/Mycobacterium tuberculosis
<400> 31
<210> 32
<211> 1460
<212> PRT
<213> Escherichia coli/Mycobacterium tuberculosis
<400> 32
<210> 33
<211> 1460
<212> PRT
<213> Escherichia coli/Mycobacterium tuberculosis
<400> 33
<210> 34
<211> 1523
<212> PRT
<213> Escherichia coli/Mycobacterium tuberculosis
<400> 34
<210> 35
<211> 1523
<212> PRT
<213> Escherichia coli/Mycobacterium tuberculosis
<400> 35
<210> 36
<211> 1306
<212> PRT
<213> Escherichia coli
<400> 36
5 <210> 37
<211> 1068
<212> PRT
<213> Escherichia coli
10 <400> 37
<210> 38
<211> 1162
<212> PRT
<213> Escherichia coli/Mycobacterium tuberculosis
<400> 38
<210> 39
<211> 95
<212> PRT
<213> Mycobacterium tuberculosis
<400> 39
<210> 40
<211> 285
- <212>
- PRT 15 <213> Mycobacterium tuberculosis
<400> 40
<210> 41
<211> 75
<212> PRT
<213> Mycobacterium tuberculosis
<400> 41
<210> 42
<211> 96
<212> PRT
<213> Mycobacterium tuberculosis
<400> 42
<210> 43
<211> 96
- <212>
- PRT 15 <213> Mycobacterium tuberculosis
<400> 43
<210> 44
<211> 11
<212> PRT
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> Ligador artificial
<400> 44
<210> 45
<211> 8
<212> PRT
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> Ligador artificial
<400> 45
<210> 46
<211> 9
<212> PRT
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> Ligador artificial
<400> 46
<210> 47
<211> 7
<212> PRT
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> Ligador artificial
<400> 47
<210> 48
<211> 4134
- <212>
- ADN 10 <213> Escherichia coli
<400> 48
<210> 49
<211> 4134
<212> ADN
<213> Escherichia coli
<400> 49
<210> 50
<211> 1338
<212> ADN
<213> Escherichia coli
<400> 50
<210> 51
<211> 3396
<212> ADN
<213> Escherichia coli
<400> 51
<210> 52
<211> 3396
<212> ADN
<213> Escherichia coli
<400> 52
<210> 53
<211> 3945
<212> ADN
<213> Escherichia coli
<400> 53
<210> 54
<211> 3945
<212> ADN
<213> Escherichia coli
<400> 54
<210> 55
<211> 4053
<212> ADN
<213> Escherichia coli
<400> 55
<210> 56
<211> 4077
<212> ADN
<213> Escherichia coli
<400> 56
<210> 57
<211> 4101
<212> ADN
<213> Escherichia coli
<400> 57
<210> 58
<211> 4152
<212> ADN
<213> Escherichia coli
<400> 58
<210> 59
<211> 1620
<212> ADN
<213> Escherichia coli/Mycobacterium tuberculosis
<400> 59
<210> 60 10 <211> 3678
<212> ADN
<213> Escherichia coli/Mycobacterium tuberculosis
<400> 60 15
<210> 61
<211> 3678
<212> ADN
<213> Escherichia coli/Mycobacterium tuberculosis
<400> 61
<210> 62
<211> 4227
<212> ADN
<213> Escherichia coli/Mycobacterium tuberculosis
<400> 62
<210> 63
<211> 4227
<212> ADN
<213> Escherichia coli/Mycobacterium tuberculosis
<400> 63
<210> 64
<211> 4335
<212> ADN
<213> Escherichia coli/Mycobacterium tuberculosis
<400> 64
<210> 65
<211> 4359
<212> ADN
<213> Escherichia coli/Mycobacterium tuberculosis
<400> 65
<210> 66
<211> 4383
<212> ADN
<213> Escherichia coli/Mycobacterium tuberculosis
<400> 66
<210> 67
<211> 4434
<212> ADN
<213> Escherichia coli/Mycobacterium tuberculosis
<400> 67
<210> 68
<211> 4449
<212> ADN
<213> Escherichia coli/Mycobacterium tuberculosis
<400> 68
<210> 69
<211> 4275
<212> ADN
<213> Escherichia coli/Mycobacterium tuberculosis
<400> 69
<210> 70
<211> 4299
<212> ADN
<213> Escherichia coli/Mycobacterium tuberculosis
<400> 70
- 5
- <210> 71 <211> 4323 <212> ADN <213> Escherichia coli/Mycobacterium tuberculosis
- 10
- <400> 71
- 290
<210> 72
<211> 3681
<212> ADN
<213> Escherichia coli/Mycobacterium tuberculosis
<400> 72
<210> 73
<211> 4230
<212> ADN
<213> Escherichia coli/Mycobacterium tuberculosis
<400> 73
<210> 74
<211> 3552
<212> ADN
<213> Escherichia coli/Homo sapiens
<400> 74
<210> 75
<211> 4083
<212> ADN
<213> Escherichia coli/Mycobacterium tuberculosis
<400> 75
<210> 76
<211> 4083
<212> ADN
<213> Escherichia coli/Mycobacterium tuberculosis
<400> 76
<210> 77
<211> 4083
<212> ADN
<213> Escherichia coli/Mycobacterium tuberculosis
<400> 77
<210> 78
<211> 4083
<212> ADN
<213> Escherichia coli/Mycobacterium tuberculosis
<400> 78
<210> 79 <211> 4383
<212> ADN
<213> Escherichia coli/Mycobacterium tuberculosis
<400> 79
<210> 80
<211> 4383
<212> ADN
<213> Escherichia coli/Mycobacterium tuberculosis
<400> 80
- 5
- <210> 81 <211> 4572 <212> ADN <213> Escherichia coli/Mycobacterium tuberculosis
- 10
- <400> 81
- 313
<210> 82
<211> 4572
<212> ADN
<213> Escherichia coli/Mycobacterium tuberculosis
<400> 82
<210> 83
<211> 3921
<212> ADN
<213> Escherichia coli
<400> 83
<210> 84
<211> 3207
<212> ADN
<213> Escherichia coli
<400> 84
<210> 85
<211> 3489
<212> ADN
<213> Escherichia coli/Mycobacterium tuberculosis
<400> 85
<210> 86
<211> 19
<212> ADN
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> Cebador
<400> 86
gaacatcgga aggtggtgc 19
<210> 87
<211> 20
<212> ADN
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> Cebador
<400> 87
gagaaaccga atccttaagg 20
<210> 88
<211> 20
<212> ADN
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> Cebador
<400> 88
ggatggttgt gttcagtgtg 20
<210> 89
<211> 61
<212> ADN
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> Cebador
<400> 89
<210> 90
<211> 33
<212> ADN
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> Cebador
<400> 90
cagtgaattc tcagaatgaa taacgaatat tag 33
<210> 91
<211> 48
<212> ADN
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> Cebador
<400> 91 gggagctcct gcggatccgg cagcggtaat gatgccccgg tcacgttc 48
<210> 92
<211> 38
<212> ADN
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> Cebador
<400> 92 cggatccgca ggagctcccc gcaagacttc ctgcagag 38
<210> 93
<211> 51
<212> ADN
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> Cebador
<400> 93 ctgggagctc cgcaggatcc ggcagcggta atactgcagg gtatctgttt c 51
<210> 94
<211> 49
<212> ADN
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> Cebador
<400> 94 ctgccggatc ctgcggagct cccagaaccg gcatagtcca gcgtgatag 49
<210> 95
<211> 48
<212> ADN
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> Cebador
<400> 95 gggagctcct gcggatccgg cagcggtgca gacaaactgg tgataaac 48
<210> 96
<211> 19
<212> ADN
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> Cebador
<400> 96 gttcatcgac cactgggtg 19
<210> 97
<211> 54
<212> ADN
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> Cebador
<400> 97
gggagcggga gctccgcagg atccggcagc ggtaaccgca gttttacctt tgac 54
<210> 98
<211> 48
<212> ADN
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> Cebador
<400> 98
accgctgccg gatcctgcgg agctcccgct cccctgcagc gtcagacg 48
<210> 99
<211> 21
<212> ADN
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> Cebador
<400> 99
gcaatctgaa tgtggacaat c 21
<210> 100
<211> 52
<212> ADN
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> Cebador
<400> 100
gggagcggga gctccgcagg atccggcagc ggtagtgtct tcaacggcac cg 52
<210> 101
<211> 52
<212> ADN
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> Cebador
<400> 101
accgctgccg gatcctgcgg agctcccgct cccgtcgccc agcgtgacgc tg 52
<210> 102
<211> 51
<212> ADN
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> Cebador
<400> 102 gggagcggga gctccgcagg atccggcagc gggtaccgca atatctggag c 51
<210> 103
<211> 46
<212> ADN
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> Cebador
<400> 103 gctgccggat cctgcggagc tcccgctccc tccgagggtg acagtc 46
<210> 104
<211> 19
<212> ADN
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> Cebador
<400> 104 gtcatgacct gttgccgac 19
<210> 105
<211> 50
<212> ADN
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> Cebador
<400> 105 ctgggagctc cgcaggatcc ggcagcggta aaagtgtctt caacggcacc 50
<210> 106
<211> 50
<212> ADN
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> Cebador
<400> 106 ctgccggatc ctgcggagct cccagaacct gcaacagatg tgccttcttc 50
<210> 107
<211> 55
<212> ADN
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> Cebador
<400> 107
gggagcggga gctccgcagg atccggcagc ggtaccgtca acctggataa tcagt 55
<210> 108
<211> 56
<212> ADN
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> Cebador
<400> 108
accgctgccg gatcctgcgg agctcccgct cccgccgttg aagacacttt tatctg 56
<210> 109
<211> 30
<212> ADN
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> Cebador
<400> 109
cggggagctc cgtgatagcg ggcgtcgacc 30
<210> 110
<211> 31
<212> ADN
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> Cebador
<400> 110
tgccggatcc gtgaaactgg ttcaatccca g 31
<210> 111
<211> 32
<212> ADN
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> Cebador
<400> 111
cggggagctc catgtcgcaa atcatgtaca ac 32
<210> 112
<211> 27
<212> ADN
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> Cebador
<400> 112
tgccggatcc gccgccccat ttggcgg 27
<210> 113
<211> 27
<212> ADN <213> Secuencia artificial
<220>
<223> Cebador
<400> 113 cggggagctc cttctcccgg ccggggc 27
<210> 114
<211> 27
<212> ADN
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> Cebador
<400> 114 tgccggatcc gccggcgcct aacgaac 27
<210> 115
<211> 30
<212> ADN
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> Cebador
<400> 115 cggggagctc caccggcagc gctgcaatcg 30
<210> 116
<211> 29
<212> ADN
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> Cebador
<400> 116 tgccggatcc cgacaagccg attgcagcg 29
<210> 117
<211> 64
<212> ADN
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> Cebador
<400> 117
<210> 118
<211> 33
<212> ADN
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> Cebador
<400> 118 gtcagaattc tcagaaagaa taacggaagt tag 33
<210> 119
<211> 54
<212> ADN
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> Cebador
<400> 119 gggagctccg caggatccgg cagcggttta aaaaacaaat ttactcaaaa agtc 54
<210> 120
<211> 42
<212> ADN
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> Cebador
<400> 120 cggatcctgc ggagctccca gcctgagatg cgcttaaaaa ag 42
<210> 121
<211> 20
<212> ADN
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> Cebador
<400> 121 ccagagccaa tgtttacgtc 20
<210> 122
<211> 30
<212> ADN
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> Cebador
<400> 122 gtacgaattc gtgcgtaacg gcaaaagcac 30
<210> 123
<211> 30
<212> ADN
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> Cebador
<400> 123 gtacgtcgac acatgagcag atcctctacg 30
<210> 124
<211> 25
<212> ADN
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> Cebador
<400> 124
agaaaaacuc atcgagcatc aaatg 25
<210> 125
<211> 23
<212> ADN
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> Cebador
<400> 125
atgagccaua ttcaacggga aac 23
<210> 126
<211> 31
<212> ADN
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> Cebador
<400> 126
agtttttcua actgtcagac caagtttact c 31
<210> 127
<211> 37
<212> ADN
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> Cebador
<400> 127
atggctcaua ctcttccttt ttcaatatta ttgaagc 37
<210> 128
<211> 23
<212> ADN
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> Cebador
<400> 128
atctttcugc gaattgagat gac 23
<210> 129
<211> 20
<212> ADN
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> Cebador
- <400> 129
- 5 10
- aagcctaguc tcatgagcgg 20 <210> 130 <211> 32 <212> ADN <213> Secuencia artificial <220> <223> Cebador
- 15
- <400> 130 actaggctug taatcatggt catagctgtt tc 32
- 20
- <210> 131 <211> 30 <212> ADN <213> Secuencia artificial
- 25
- <220> <223> Cebador <400> 131
- agaaagauag acgaaagggc ctcgtgatac 30
- 30
- <210> 132 <211> 91 <212> PRT <213> bacteriófago phiX174
- 35
- <400> 132
<212> ADN
<213> Secuencia artificial
<220>
45 <223> Fragmento de ADN sintético que cosifica para la proteína E de lisis
<400> 133 <210> 134
<211> 30
<212> ADN
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> Cebador
<400> 134
gcgcagtact ttgcgccatt ctatggtgtc 30
<210> 135
<211> 32
<212> ADN
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> Cebador
<400> 135
gcgcagtact cacagcatca gaatgaataa cg 32
<210> 136
<211> 20
<212> ADN
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> Cebador
<400> 136
tataaccctt gtcgccgttg 20
<210> 137
<211> 20
<212> ADN
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> Cebador
<400> 137
acgcagcaag gtcgatttac 20
Claims (21)
- REIVINDICACIONES1. Célula huésped que puede expresar más de un POI (polipéptido de interés), comprendiendo la célula huésped una proteína de fusión o un ácido nucleico que codifica para una proteína de fusión, comprendiendo dicha proteína de fusión dichos POI yi. un dominio pasajero que comprende un dominio de tallo beta de una proteína autotransportadora, en el que la secuencia que forma tallo beta del dominio pasajero está esencialmente intacta;ii. un dominio translocador de una proteína autotransportadora; yiii. un péptido señal que puede dirigir la proteína de fusión a la membrana interna de bacterias Gramnegativas;en la que el dominio pasajero del autotransportador en su forma nativa comprende al menos dos dominios laterales, yen la que al menos dos POI se insertan en, reemplazan o reemplazan parcialmente un dominio lateral separado.
-
- 2.
- Célula huésped según la reivindicación 1, en la que la proteína de fusión, cuando se expresa, se presenta en la superficie celular.
-
- 3.
- Célula huésped según las reivindicaciones 1-2, en la que la proteína de fusión, cuando se expresa, se secreta y se libera desde la superficie celular.
-
- 4.
- Proteína de fusión que comprende
i. más de un POI (polipéptido de interés)ii. un dominio pasajero que comprende un dominio de tallo beta de una proteína autotransportadora, en el que la secuencia que forma tallo beta del dominio pasajero está esencialmente intacta;iii. un dominio translocador de una proteína autotransportadora; yiv. opcionalmente, un péptido señal que dirige la proteína de fusión a la membrana interna de una bacteria Gram-negativa,en la que el dominio pasajero del autotransportador en su forma nativa comprende al menos dos dominios laterales, yen la que al menos dos POI reemplazan o reemplazan parcialmente un dominio lateral separado. -
- 5.
- Célula huésped según las reivindicaciones 1-3 o proteína de fusión según la reivindicación 4, en la que el dominio pasajero en i) y el dominio translocador en ii) se derivan de una proteína SPATE (autotransportadores de serina proteasa de Enterobacteriaceae).
-
- 6.
- Ácido nucleico dispuesto para la expresión de una proteína de fusión, comprendiendo dicho ácido nucleico, en marco:
i. una secuencia que codifica para un péptido señal de dicha proteína de fusión, pudiendo el péptido señal dirigir la proteína de fusión a la membrana interna de bacterias Gram-negativas;ii. una secuencia que codifica para un dominio pasajero de dicha proteína de fusión, comprendiendo el dominio pasajero un dominio de tallo beta de una proteína autotransportadora; yiii. una secuencia que codifica para un dominio translocador de dicha proteína de fusión, derivándose el dominio translocador de una proteína autotransportadora,en el que la secuencia que codifica para el dominio pasajero del autotransportador en su forma nativa comprende al menos dos tramos de secuencia que codifican para dominios laterales que sobresalen del dominio de tallo beta, y en el que la secuencia que codifica para el dominio pasajero comprende al menos dos tramos de secuencia de sitio de clonación que permiten la clonación en marco de al menos dos secuencias de ADN que codifican para POI (polipéptidos de interés), dichos al menos dos tramos de secuencia de sitio de clonación insertándose en, reemplazando o reemplazando parcialmente tramos separados de dichos tramos de secuencia que codifican para dominios laterales y estando dichos tramos de secuencias de sitio de clonación dispuestos de tal manera que la secuencia de proteína que forma tallo beta codificada del dominio pasajero está esencialmente intacta. - 7. Ácido nucleico dispuesto para la expresión de una proteína de fusión, comprendiendo dicho ácido nucleico, en marco:i. una secuencia que codifica para un péptido señal de dicha proteína de fusión, pudiendo el péptido señal dirigir la proteína de fusión a la membrana interna de bacterias Gram-negativas;ii. una secuencia que codifica para un dominio pasajero de dicha proteína de fusión, comprendiendo el dominio pasajero un dominio de tallo beta de una proteína autotransportadora;iii. una secuencia que codifica para un dominio translocador de dicha proteína de fusión, derivándose el dominio translocador de una proteína autotransportadora; yiv. secuencias que codifican para más de un POI (polipéptido de interés) de dicha proteína de fusión,en el que las secuencias que codifican para los POI están fusionadas con la secuencia que codifica para el dominio pasajero y están dispuestas de tal manera que la secuencia de proteína que forma tallo beta codificada del dominio pasajero está esencialmente intacta, y en el que la secuencia que codifica para el dominio pasajero del autotransportador en su forma nativa comprende al menos dos tramos de secuencia que codifican para dominios laterales que sobresalen del dominio de tallo beta, y cada una de las secuencias que codifican para POI se insertan en, reemplazan o reemplazan parcialmente tramos separados de dichos tramos de secuencia que codifican para dominios laterales.
-
- 8.
- Ácido nucleico según cualquiera de las reivindicaciones 6-7, en el que las secuencias que codifican para el dominio pasajero en ii) y el dominio translocador en iii) se derivan de un gen que codifica para una proteína SPATE (autotransportadores de serina proteasa de Enterobacteriaceae).
-
- 9.
- Vector que comprende un ácido nucleico según cualquiera de las reivindicaciones 6-8.
-
- 10.
- Célula huésped que comprende un ácido nucleico o vector según cualquiera de las reivindicaciones 6-9.
-
- 11.
- Célula huésped según las reivindicaciones 1-3, 5 y 10, que es una bacteria Gram-negativa.
-
- 12.
- Vesícula de membrana externa que presenta una proteína de fusión según la reivindicación 4 ó 5 sobre su superficie.
-
- 13.
- Fantasma bacteriano que presenta una proteína de fusión según la reivindicación 4 ó 5 sobre su superficie.
-
- 14.
- Método para la expresión de proteínas secretoras de una proteína de fusión, que comprende las etapas de
i. proporcionar una célula huésped según cualquiera de las reivindicaciones 1-3, 5 ó 10;ii. inducir la expresión de la proteína de fusión. -
- 15.
- Método según la reivindicación 14, que comprende la etapa adicional de inhibir una enzima periplásmica con actividad proteasa en la célula huésped.
-
- 16.
- Método según cualquiera de las reivindicaciones 14-15, que comprende la etapa adicional de regular por disminución al menos una enzima que cataliza la formación de enlaces disulfuro en proteínas en el espacio periplásmico de la célula huésped.
-
- 17.
- Método según cualquiera de las reivindicaciones 14-16, en el que la proteína de fusión se secreta de manera soluble.
-
- 18.
- Método según cualquiera de las reivindicaciones 14-17, en el que la proteína de fusión se presenta sobre la superficie celular.
- 19. Célula huésped según las reivindicaciones 1-3, 5 ó 10, proteína de fusión según las reivindicaciones 4-5, ácido nucleico según las reivindicaciones 6-8, vector según la reivindicación 9, vesícula de membrana externa según la reivindicación 12, fantasma bacteriano según la reivindicación 13, en donde al menos uno de los POI comprende un antígeno, por ejemplo de un organismo infeccioso, por ejemplo un antígeno de Mycobacterium tuberculosis.
-
- 20.
- Método según las reivindicaciones 14-18, en el que al menos uno de los POI comprende un antígeno, por
ejemplo de un organismo infeccioso, por ejemplo un antígeno de Mycobacterium tuberculosis. -
- 21.
- Vacuna que comprende una célula huésped, una proteína de fusión, una vesícula de membrana externa o un fantasma bacteriano según la reivindicación 19.
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