ES2301268B1 - Empleo del gen slug, o de sus productos de replicacion, transcripcion o expresion, en la identificacion, diagnostico, prevencion o tratamiento de la diseminacion del cancer y/o desarrollo de metastasis. - Google Patents
Empleo del gen slug, o de sus productos de replicacion, transcripcion o expresion, en la identificacion, diagnostico, prevencion o tratamiento de la diseminacion del cancer y/o desarrollo de metastasis. Download PDFInfo
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Abstract
Empleo del gen Slug, o de sus productos
de replicación, transcripción o expresión, en la identificación,
diagnóstico, prevención o tratamiento de la diseminación del cáncer
y/o desarrollo de metástasis.
El gen Slug, sus productos de
replicación, transcripción o expresión, así como productos
relacionados con la regulación de dicho gen Slug o con la
regulación, eliminación o degradación de sus productos de expresión
o traducción, puede ser utilizado en la identificación, prevención
o tratamiento de la diseminación o el desarrollo de metástasis en
sujetos con cáncer, tal como un sujeto que padece un cáncer cuyas
células cancerosas expresan el gen Slug.
Description
Empleo del gen Slug, o de sus productos
de replicación, transcripción o expresión, en la identificación,
diagnóstico, prevención o tratamiento de la diseminación del cáncer
y/o desarrollo de metástasis.
La invención se relaciona con el empleo del gen
Slug, sus productos de replicación, transcripción o
expresión, así como de productos relacionados con la regulación de
dicho gen Slug o con la eliminación o degradación de sus
productos de expresión o traducción, en la identificación,
diagnóstico, prevención o tratamiento de la diseminación o el
desarrollo de metástasis en sujetos con cáncer, tal como un sujeto
que padece un cáncer cuyas células cancerosas expresan el gen
Slug.
Los recientes avances en el tratamiento del
cáncer han puesto de manifiesto que para planificar un tratamiento
adecuado del cáncer y determinar un pronóstico preciso es necesario
disponer de métodos sensibles para detectar la existencia de cáncer,
el tipo de cáncer y el estadio del mismo con el fin de conocer su
localización concreta y su posible extensión a otros tejidos. Un
diagnóstico preciso del cáncer puede contribuir a reducir el número
de fallecimientos por esta causa y a mejorar la calidad de vida de
los pacientes ya que permite seleccionar el tratamiento más
adecuado (quimioterapia, resección quirúrgica, etc.) y reducir las
incomodidades al paciente al definir el punto final del tratamiento
terapéutico.
Los marcadores de pronóstico proporcionan
información importante para el tratamiento y desarrollo del cáncer
en los pacientes. De hecho, para la aplicación de terapia sistémica
adyuvante en el tratamiento de algunos tipos de cánceres primarios,
la identificación de los pacientes de alto y bajo riesgo constituye
uno de los hitos principales. Se conocen diversos marcadores de
pronóstico, tanto clásicos, por ejemplo, tamaño del tumor, estado
del nódulo linfático, histopatología, estado del receptor de
esteroides, como de segunda generación, por ejemplo, velocidad de
proliferación, ploidía del ADN, oncogenes, receptores de los
factores de crecimiento y algunas glicoproteínas, que resultan muy
útiles para tomar decisiones terapéuticas (McGuire, W.L., Pronostic
Factors for Recurrence and Survival, en "Educational Booklet
American Society of Clinical Oncology", 25th Annual Meeting,
89-92 (1989); Contesso et al., Eur. J. Clin.
Oncol., 25:403-409 (1989)). Aunque ninguno de los
marcadores de pronóstico conocidos satisface completamente el
objetivo de distinguir entre pacientes de alto y bajo riesgo, la
combinación de distintos marcadores puede mejorar la predicción del
pronóstico de un paciente, por lo que continúa la búsqueda de
nuevos marcadores de pronóstico que puedan añadirse a los
existentes actualmente para colaborar en el pronóstico del cáncer,
de su progresión y de la enfermedad residual tras tratamiento. No
obstante, tan importante es el pronóstico del cáncer como el
diagnóstico de la posible metástasis en aquellos pacientes que ya
han desarrollado cáncer, determinar el estadio de severidad de la
enfermedad de un sujeto con cáncer, ó monitorizar el efecto de la
terapia administrada a un sujeto con cáncer.
Los elementos génicos responsables de la
invasión y la metástasis del cáncer continúan siendo desconocidos.
Seria conveniente, por tanto, identificar marcadores de diagnóstico
de invasividad que pudieran ser analizados de forma sencilla.
Ahora se ha encontrado, sorprendentemente, que
en diferentes células cancerosas, tanto en células tumorales
mesenquimales como carcinomatosas, se expresan niveles
significativamente elevados del gen Slug y/o de sus productos
de replicación, transcripción o traducción (ADNg, ARNm o proteína),
cuando se comparan con células normales, lo que proporciona una
alternativa a los métodos actuales de diagnóstico, pues posibilita
el empleo del gen Slug y/o de sus productos relacionados
como marcador diagnóstico de invasividad (diseminación del cáncer
y/o invasión tumoral) y como diana terapéutica para modular dicha
actividad invasora de las células cancerosas. Por tanto, la
expresión o represión del gen Slug, sus productos de
replicación, transcripción o expresión, así como de productos
relacionados con la regulación de dicho gen Slug o con la
eliminación o degradación de sus productos de expresión o
traducción, puede ser utilizada para evaluar el riesgo de un sujeto
que padece cáncer a desarrollar metástasis.
La expresión o represión del gen Slug,
sus productos de replicación, transcripción o expresión, así como
de productos relacionados con la regulación de dicho gen Slug
o con la eliminación o degradación de sus productos de expresión o
traducción, puede ser utilizada para evaluar la predisposición de
un sujeto que padece cáncer, en particular, de un sujeto que padece
un cáncer cuyas células cancerosas son Slug+ (es decir, cuyas
células cancerosas expresan el gen Slug), a desarrollar
metástasis, o para evaluar la malignidad de un tumor, así como para
evaluar el estadio de severidad de la enfermedad de un sujeto que
padece cáncer y/o para monitorizar el efecto de la terapia
administrada a un sujeto que padece cáncer.
Por tanto, en un aspecto, la invención se
relaciona con un método in vitro (i) para evaluar la
predisposición de un sujeto con cáncer, tal como un sujeto que
padece un cáncer cuyas células cancerosas son Slug+, a
desarrollar metástasis, ó (ii) para determinar el estadio de
severidad de la enfermedad de dicho sujeto con cáncer, ó (iii) para
monitorizar el efecto de la terapia administrada a dicho sujeto con
cáncer, que comprende analizar en una muestra de sangre, o de un
derivado de la misma, de dicho sujeto, al menos, un producto de
replicación, transcripción o traducción del gen Slug
específico de la especie de dicho sujeto y/o un producto
relacionado con la regulación de dicho gen Slug o con la
regulación, eliminación o degradación de sus productos de expresión
o traducción.
En otro aspecto, la invención se relaciona con
un inhibidor de Slug o de su función, en la elaboración de
una composición farmacéutica para tratar, impedir o minimizar el
desarrollo de metástasis en un sujeto con cáncer, tal como un sujeto
que padece un cáncer cuyas células cancerosas son Slug+.
Aspectos adicionales resultarán evidentes para
el experto en la materia a la vista de la descripción.
La Figura 1 ilustra la construcción del transgén
CombitTA-Slug así como la expresión y efecto de
Slug en la supervivencia de células Ba/F3 privadas del factor
de crecimiento. La Figura 1A es una representación esquemática del
vector CombitTA-Slug. La Figura 1B muestra el
resultado del análisis de la expresión de Slug dependiente de
tetraciclina, mediante RT-PCR para
CombitTA-Slug en células Ba/F3 (-tet, +tet en el
medio). Los productos de la PCR se transfirieron a una membrana de
nylon y se analizaron con una sonda específica para Slug. Se
usó la actina para asegurar la integridad del ADN y la homogeneidad
de carga. La Figura 1C muestra los resultados de la supervivencia de
células Ba/F3 que expresan Slug en ausencia de
IL-3. Células que crecían exponencialmente en medio
suplementado con IL-3 se llevaron a 5 x 10^{5}
células/ml el día 0, se retiró la IL-3 y se
cultivaron. Se indica el número de células viables, de las células
Ba/F3+p190, de las células Ba/F3 crecidas en presencia de
IL-3 y de las células Ba/F3 transfectadas con
Slug crecidas en ausencia de IL-3. La Figura
ID pone de manifiesto que la muerte celular cursa con nucleosomas en
escalera tras la privación de IL-3. Veinticuatro
horas después de la retirada de IL-3 se aisló el ADN
de bajo peso molecular procedente de células Ba/F3+
BCR-ABL^{p190} (calle 1), BaJF3 crecidas en
presencia de IL-3 (calle 2),
Ba/F3-Combi-Slug crecidas en
ausencia de IL-3 y doxiciclina (-tet) (calle 3), y
Ba/F3-Combi-Slug crecidas en
ausencia de IL-3 y en presencia de doxiciclina
(+tet) (calle 4). El ADN se marcó terminalmente con
a^{32}P-dCTP, se resolvió por electroforesis en
gel de agarosa al 2% y se visualizó por autoradiografía.
La Figura 2 muestra la expresión del transgén en
ratones transgénicos CombitTA-Slug. La Figura 2A
muestra la identificación de los ratones transgénicos por análisis
Southern del ADN de un pequeño fragmento de la cola tras digestión
con EcoRI, se utilizó el ADNc de Slug de ratón para la
detección del transgén. La expresión del transgén se demostró por
RT-PCR (Figura 2B); se analizó la expresión de
CombitTA-Slug y de Slug endógeno mediante
RT-PCR de muestras tisulares procedentes de ratones
CombitTA-Slug y control. Los productos de PCR se
transfirieron a una membrana de nylon y se analizaron por
hibridación con una sonda específica. Se usó actina para asegurar la
integridad del ADN y la homogeneidad de carga. La Figura 2C muestra
los resultados del análisis de la expresión de Slug
dependiente de tetraciclina, mediante RT-PCR para
CombitTA-Slug, de muestras de médula ósea de
ratones
Slug -/- (-tet, +tet en el medio).
Slug -/- (-tet, +tet en el medio).
La Figura 3 pone de manifiesto la presencia de
cáncer mesenquimal en los ratones transgénicos
CombitTA-Slug. La Figura 3A muestra el aspecto
macroscópico de los cortes tisulares teñidos con
hematoxilina/eosina del bazo de ratones de la cepa salvaje y
CombitTA-Slug. El bazo de los ratones
CombitTA-Slug muestra alteración de la arquitectura
esplénica normal. La Figura 3B muestra el aspecto histológico de un
tumor sólido desarrollado en ratones CombitTA-Slug,
tras tinción con hematoxilina/eosina. La Figura 3C muestra el
aspecto histológico de diferentes tejidos de los ratones
CombitTA-Slug; las células que expresan Slug
(células Slug+) desobedecen el orden social de los límites
de órgano, migran individualmente y producen metástasis en
diferentes zonas. La Figura 3D muestra las características
fenotípicas de las leucemias de los ratones
CombitTA-Slug; las células de la sangre de los
ratones CombitTA-Slug se analizaron por citometría
de flujo; las distintas células fueron identificadas con
combinaciones específicas de anticuerpos; se analizaron 10.000
células de cada muestra y las células muertas se excluyeron
mediante el análisis de la tinción por yoduro de propidio.
La Figura 4 muestra el fenotipo de los ratones
CombitTA-Slug tras supresión de la expresión de
Slug mediante tratamiento con tetraciclina. La Figura 4A
muestra el resultado del análisis de la expresión de Slug
dependiente de tetraciclina en sangre de los ratones transgénicos
CombitTA-Slug (-tet, +tet en el agua), mediante
RT-PCR. Se usó actina para asegurar la integridad
del ADN y la homogeneidad de carga. La Figura 4B muestra las
características fenotípicas (según el estudio de citometría de
flujo) de las células de la sangre analizada y cortes de tejido
teñidos con hematoxilina/eosina de ratones
CombitTA-Slug tras la supresión de la expresión de
Slug mediante tratamiento con tetraciclina (4 g/l) durante 4
semanas.
La Figura 5 ilustra la expresión de Slug
en células que expresan BCR-ABL. La
expresión de Slug de humano (hSlug) y de Slug
de ratón (mSlug) se analizó por RT-PCR y los
productos de la amplificación se transfirieron a una membrana de
nylon y se analizaron por hibridación con una sonda específica. Se
usó actina o ABL para asegurar la integridad del ADN y la
homogeneidad de carga. La Figura 5A muestra el resultado del
análisis de la expresión de Slug en células Ba/F3 que
expresan BCR-ABL, tanto Ba/F3+p190 (calle 1)
como Ba/F3+p210 (calle 2), y en células Ba/F3 (calle 3). La Figura
5B muestra los resultados de la expresión de Slug en sangre
de los ratones transgénicos BCR-ABL^{p190} y
BCR-ABL^{p210}; se recogen los resultados de la
sangre de los ratones control (calle 1) y transgénicos
BCR-ABL^{p190} (calles 2 a 4) y
BCR-ABL^{p210} (calles 5 y 6). La Figura 5C pone
de manifiesto que Slug está presente en líneas celulares
leucémicas humanas y en muestras de pacientes con t(9;22):
sangre humana control (calle 1), la línea celular leucémica
mieloide U937 (calle 2), las líneas leucémicas T
ALL-SIL (calle 3) y KOPTI-KI (calle
4), la línea celular leucémica pre-B 697 (calle 5),
sangre de pacientes con t(9;22) (calles 6 a 8; los pacientes
1 y 3 presentaban Ph-B-ALL, y el
paciente 2 una crisis mieloblástica), y las líneas celulares
leucémicas t(9;22)-positivas K562 (calle 9),
TOM-1 (calle 10) y Nalm-1 (calle
11).
La Figura 6 muestra que Slug es necesario
para la génesis de tumores en ratones que expresan
BCR-ABL. La Figura 6A muestra el aspecto
histológico de frotis sanguíneos (tinción Giemsa) y de tejidos
(cortes teñidos con hematoxilinaleosina). La Figura 6B muestra el
resultado de un análisis por citometría de flujo de la médula ósea
(bm, por sus siglas en inglés) y de la sangre (pb, por sus siglas
en inglés) con combinaciones específicas de anticuerpos. Los
ratones de los genotipos que se indican se cruzaron y se determinó
el genotipo de su descendencia. Cabe destacar que los ratones
BCR-ABL^{p190} sufrieron leucemia linfoblástica
aguda (B-ALL), característica por la presencia de
blastocitos que coexpresan Mac-1 y B220. Este tipo
de leucemia se caracteriza también por la infiltración del bazo,
hígado y los pulmones, y por la presencia de linfoblastocitos en los
frotis sanguíneos. Sin embargo, los ratones
BCR-ABL^{p190} no desarrollan leucemia en ausencia
de Slug (Slug -/-).
La Figura 7 muestra el resultado del análisis de
la expresión de hSlug en líneas celulares y tejidos de
cáncer de mama. La expresión de Slug se analizó mediante
RT-PCR. Carril 1: control positivo (línea humana
que expresa Slug, K562); carril 3: control sin ADNc;
carriles 4-7: tejidos primarios de cáncer de mama;
carril 8: línea celular MCF-7.
La Figura 8 muestra el resultado del análisis de
la expresión de hSlug en la sangre de individuos (humanos)
sanos. Carril 1: control sin cDNA; carriles 2-3:
sangre de individuos con cáncer de mama como control positivo;
carriles 4-8: sangre de individuos sanos.
La Figura 9 muestra el resultado del análisis de
la expresión de hSlug en la sangre de individuos (humanos)
con cáncer de mama metastatizados. La expresión de hSlug se
analizó mediante RT-PCR. Carril 1: línea celular
K562 como control positivo; carril 3: control sin cDNA; carriles
4-9: pacientes con cáncer de mama metastatizado.
La Figura 10 muestra el resultado del análisis
de la expresión de hSlug en pacientes (humanos) con cáncer
de mama en estadio TNMO. La expresión de hSlug se analizó
mediante RT-PCR. Carril 1: K562 como control
positivo; carril 3: control sin ADNc; carril 4: cáncer de mama
metastatizado; carriles 5-6: cáncer de mama estadios
TNMO.
La invención se relaciona, en general, con el
descubrimiento de que la expresión del gen Slug está
relacionada con la diseminación del cáncer y/o con la invasión
tumoral en un sujeto. Por tanto, la expresión o represión del gen
Slug, sus productos de replicación, transcripción o
expresión, así como de productos relacionados con la regulación de
dicho gen Slug o con la eliminación o degradación de sus
productos de expresión o traducción, puede ser utilizada para
evaluar el riesgo de un sujeto que padece cáncer, tal como un
sujeto que padece un cáncer cuyas células cancerosas son
Slug+, a desarrollar metástasis, por lo que dicho gen, sus
productos de replicación, transcripción y/o expresión, así como
productos relacionados con la regulación de dicho gen Slug o
con la eliminación o degradación de sus productos de expresión o
traducción, son marcadores de la malignidad del cáncer y
constituyen una diana muy atractiva para el tratamiento del
cáncer.
El gen Slug es un gen presente en los
vertebrados que codifica un factor de transcripción del tipo
"dedos de zinc" (Slug) implicado en las transiciones
epiteliales-mesenquimales (Nieto et al.,
Science 264:835-849 (1994)). Previamente se ha
descrito el empleo del gen Slug, o de sus productos de
transcripción o expresión, en la detección y/o tratamiento de
células cancerosas [WO 02/059361]. También se ha descrito el empleo
del gen Slug y de su producto de expresión (Slug) en la
movilización de células madre hematopoyéticas para transplante o
terapia génica, en la expansión ex vivo de células madre
hematopoyéticas, y/o en el tratamiento de problemas de esterilidad
masculina [W003/046181].
Ahora se ha descubierto, sorprendentemente, que
dicho gen Slug no se expresa en sangre de individuos sanos,
pero sí en células cancerosas o tumorales. Aparentemente, el gen
Slug inhibe la producción de E-cadherina,
impidiendo que la célula cancerosa se adhiera a las células
adyacentes. En este proceso la célula maligna invade otros tejidos y
órganos, dando lugar a metástasis, por lo que la expresión o
represión del gen Slug, sus productos de replicación,
transcripción o expresión, así como de productos relacionados , con
la regulación de dicho gen Slug o con la eliminación o
degradación de sus productos de expresión o traducción, puede ser
utilizada para evaluar la predisposición de un sujeto que padece
cáncer, tal como un sujeto que padece un cáncer cuyas células
cancerosas son Slug+, a desarrollar metástasis, o para
evaluar la malignidad de un tumor, así como para evaluar el estadio
de severidad de la enfermedad de un sujeto que padece cáncer y/o
para monitorizar el efecto de la terapia administrada a un sujeto
que padece cáncer.
Por tanto, en un aspecto, la invención se
relaciona con un método in vitro (i) para evaluar la
predisposición de un sujeto con cáncer, tal como un sujeto que
padece un cáncer cuyas células cancerosas son Slug+, a
desarrollar metástasis, ó (ii) para determinar el estadio de
severidad de la enfermedad de dicho sujeto con cáncer, ó (iii) para
monitorizar el efecto de la terapia administrada a dicho sujeto con
cáncer, en adelante método de la invención, que comprende analizar
en una muestra de sangre, o de un derivado de la misma, de dicho
sujeto, al menos, un producto de replicación, transcripción o
traducción del gen Slug específico de la especie de dicho
sujeto y/o un producto relacionado con la regulación de dicho gen
Slug o con la regulación, eliminación o degradación de sus
productos de expresión o traducción.
Tal como se utiliza en esta descripción, el
término "analizar" incluye "medir y/o detectar y/o
identificar y/o cuantificar".
Asimismo, el término "sujeto", tal como se
utiliza, el término "sujeto" incluye a cualquier animal
vertebrado, tal como un mamífero, incluido el ser humano.
El método de la invención puede ser aplicado a
cualquier sujeto con cáncer, es decir, un sujeto que padece cáncer
o que se sospecha que padece cáncer cuyas células cancerosas o
tumorales expresan el gen Slug (células cancerosas
Slug+). Ejemplos ilustrativos de células cancerosas que
expresan el gen Slug incluyen, entre otras, células de
cánceres mesenquimáticos o epiteliales, tales como células de
leucemias y de tumores sólidos, por ejemplo, leucemias mieloides
agudas, células leucémicas con la translocación t(17;19),
linfomas, sarcomas, por ejemplo, células de rabdomiosarcoma que
expresan la traslocación PAX3-FKHR, células que
expresan BCR-ABL, cáncer de pulmón, por
ejemplo, cáncer de pulmón de células pequeñas, tumores
ginecológicos, cáncer de ovario, carcinomas de mama, cáncer de
colon, por ejemplo, tumores colónicos derivados de células
intersticiales de Cajal (un tipo de células dependiente del SCF),
etc. En una realización particular, dicho sujeto es un ser humano,
que padece un cáncer mesenquimático o epitelial, tal como un cáncer
de mama, cáncer de colón, cáncer de pulmón, cáncer de ovario, un
sarcoma, un linfoma, una leucemia o cualquier otro cáncer cuyas
células sean Slug+.
La presencia, en una muestra de sangre, o de un
derivado de la misma, procedente de un sujeto con cáncer, de
productos de replicación, transcripción o traducción del gen
Slug específico de la especie de dicho sujeto y/o de
productos relacionados con la regulación de dicho gen Slug o
con la eliminación o degradación de sus productos de expresión o
traducción, es indicativa de una predisposición de dicho sujeto con
cáncer a desarrollar metástasis. Asimismo, la presencia y cantidad
de dichos productos puede ser indicativa del estadio de severidad
de la enfermedad de dicho sujeto con cáncer y/o del efecto de la
terapia administrada a dicho sujeto con cáncer con el fin de valorar
la eficacia del tratamiento aplicado al sujeto y, si este fuera
ineficiente, proceder a modificar el régimen terapéutico a aplicar
al sujeto y controlar su eficacia.
El método de la invención puede llevarse a cabo
a partir de una muestra de sangre, o de un derivado de la misma, de
un sujeto a analizar, que contiene, al menos, un producto de
replicación, transcripción o traducción del gen Slug
específico de la especie de dicho sujeto y/o un producto
relacionado con la regulación de dicho gen Slug o con la
eliminación o degradación de sus productos de expresión o
traducción. El término "sangre" tal como aquí se utiliza
incluye sangre completa o una fracción de la misma. La extracción
de la sangre del sujeto se realiza por métodos convencionales.
Derivados de la sangre incluyen plasma, suero, fracción celular,
etc., los cuales pueden obtenerse por métodos convencionales
conocidos por los expertos en la materia. La extracción de la sangre
del sujeto se realiza por métodos convencionales.
En una realización particular, el método de la
invención comprende el análisis, en dicha muestra de sangre, o de
un derivado de la misma, de un sujeto con cáncer, tal como un
sujeto con un cáncer cuyas células sean Slug+, de un producto
de replicación del gen Slug específico de la especie de
dicho sujeto, tal como, por ejemplo, ADN genómico (ADNg) de dicho
gen Slug o un fragmento del mismo.
En otra realización particular, el método de la
invención comprende el análisis, en dicha muestra de sangre, o de
un derivado de la misma, de un sujeto que padece cáncer, tal como
un sujeto con un cáncer cuyas células sean Slug+, de un
producto de transcripción del gen Slug específico de la
especie de dicho sujeto, tal como, por ejemplo, ARN mensajero
(ARNm) del gen Slug, un fragmento de dicho ARNm, ADN
complementario (ADNc) al ARN que codifica para el producto de
transcripción o de expresión de dicho gen Slug, un fragmento
de dicho ADNc, o mezclas de los mismos.
El análisis de dichos productos de replicación o
de transcripción del gen Slug, indicativos de la expresión o
represión de dicho gen, puede llevarse a cabo mediante cualquier
ensayo apropiado para detectar, identificar y/o cuantificar ácidos
nucleicos. En general, dichos ensayos se basan en reacciones de
mapeo, secuenciación, hibridación, amplificación, etc. y
visualización de los productos de la reacción por cualquier técnica
apropiada, tanto radiactiva como no radiactiva, por ejemplo,
mediante técnicas colorimétricas, fluorimétricas, luminiscentes
(por ejemplo, bioluminiscentes, quimioluminiscentes, etc.), etc.
Ejemplos ilustrativos de dichos ensayos incluyen secuenciación,
mapeo con la nucleasa S1, reacción en cadena de la polimerasa (PCR),
retrotranscripción en combinación con la reacción en cadena de la
polimerasa (RT-PCR), PCR cuantitativa, PCR a tiempo
real, hibridación, Southern blot, Northern blot, RNA Protection
Assay, etc. A modo ilustrativo, el análisis de dichos productos de
replicación o de transcripción del gen Slug se lleva a cabo
mediante un ensayo que comprende la amplificación enzimática de la
totalidad o un fragmento de dicho producto de replicación o
transcripción del gen Slug, por ejemplo, mediante
RT-PCR, e hibridación con una sonda específica de
Slug, opcionalmente marcada con un marcador apropiado, por
ejemplo, nucleótidos radiactivos, haptenos, enzimas, etc.
En una realización particular, la expresión (o
represión) del gen Slug puede ser evaluada determinando el
nivel de ARNm correspondiente al gen Slug, o bien
determinando el número de copias del gen Slug producidas. En
el sentido utilizado en esta descripción, "determinar el nivel de
ARNm" incluye cualquier método que permite medir o estimar
cualitativa o cuantitativamente el nivel de ARNm que se puede
traducir en la proteína Slug en las células de una muestra de
ensayo bien directamente o bien relativamente comparándolo con el
nivel de ARNm de Slug en las células de una muestra de
control. Asimismo, "determinar el número de copias de gen
Slug producidas" incluye cualquier método que permite
medir o estimar cualitativa o cuantitativamente el número de copias
producidas del gen Slug en células de una muestra de ensayo
bien directamente o bien relativamente comparándolo con el número
de copias del gen Slug producidas en células de una muestra
de control. La determinación del número de copias del gen
Slug puede realizarse por cualquier método convencional
apropiado, por ejemplo, visualizando fragmentos dobles
extracromosómicos [extrachromosomal double minutes (dmin)] o
regiones de tinción homogéneamente integradas [integrated
homogeneously staining regions (hsrs)] (Gebhart et al.,
Breast Cancer Res. Treat. 8:125 (1986); Dutrillaux et al.,
Cancer Genet. Cytogenet. 49:203 (1990)), mediante técnicas de
hibridación utilizando sondas apropiadas obtenidas por métodos
convencionales a la vista de la secuencia de nucleótidos del gen
Slug, etc. Adicionalmente, el nivel de ARNm de Slug
puede determinarse por otros métodos convencionales apropiados, por
ejemplo, mediante análisis Northern blot, mapeo con la nucleasa S1,
PCR, RT-PCR, técnicas de hibridación, arrays,
etc.
En otra realización particular, el método de la
invención comprende el análisis, en dicha muestra de sangre, o de
un derivado de la misma, de un sujeto con cáncer, tal como un
sujeto con un cáncer cuyas células sean Slug+, de un producto
de traducción del gen Slug específico de la especie de dicho
sujeto, tal como, por ejemplo, la proteína Slug o un fragmento de
la misma.
El análisis de dicho producto de traducción del
gen Slug puede llevarse a cabo mediante cualquier ensayo
apropiado para detectar, identificar y/o cuantificar proteínas, por
ejemplo, mediante técnicas basadas en el empleo de anticuerpos,
citometría de flujo, proteómica, etc. A modo ilustrativo, la
expresión de la proteína Slug puede ser analizada mediante un ensayo
Western blot o dot/slot (Jalkanen et al., J. Cell. Biol.
101:976-985 (1985); Jalkanen et al., J.
Cell. Biol. 105:3087-3096 (1987)), o bien mediante
inmunoensayos basados en la formación de complejos mediante
reacciones cruzadas, de tipo antígeno-anticuerpo,
en los que el reconocimiento específico es proporcionado por un
anticuerpo frente a la proteína Slug o frente a un fragmento de la
misma, por ejemplo un fragmento antigénico de la misma, y
visualización de los complejos formados por cualquier técnica
apropiada, tanto radiactiva como no radiactiva, por ejemplo,
mediante técnicas colorimétricas, fluorimétricas, luminiscentes
(por ejemplo, bioluminiscentes, quimioluminiscentes, etc.), etc.,
utilizando para ello, en su caso, unos anticuerpos secundarios
marcados con marcadores apropiados; ejemplos de dichos inmunoensayos
incluyen ELISA (ensayo inmunoabsorbente ligado a enzima), RIA
(radioinmunoensayo), ensayos inmunohistoquímicos,
inmunofluorescentes, de inmunoprecipitación, etc. Los anticuerpos a
utilizar son anticuerpos frente a la proteína Slug o frente a un
fragmento de la misma, por ejemplo, un fragmento antigénico de la
proteína Slug, opcionalmente conjugados a un portador. Los
anticuerpos pueden ser policlonales o, preferentemente,
monoclonales, los cuales pueden obtenerse por métodos
convencionales, por ejemplo, mediante la tecnología del hibridoma
(Kohler et al., Nature 256:495 (1975)). Alternativamente se
pueden utilizar fragmentos de anticuerpos, por ejemplo Fab,
F(ab')_{2}, etc.
Otros métodos para determinar la expresión de
Slug incluyen la citometría de flujo (Ward M.S., Pathology
31:382-392 (1999), proteómica (Pandey M. & Mann
M., Nature 405:837-846 (2000); Chambers et
al., J. Pathol. 192:280-288 (2000), etc.
En una realización particular, el análisis de
dicho producto de traducción del gen Slug se lleva a cabo
mediante un ensayo que comprende el empleo de un anticuerpo, por
ejemplo, un anticuerpo policlonal o, preferentemente, un anticuerpo
monoclonal, específico de la proteína Slug o de un fragmento de la
misma, que reconoce un epítopo de dicha proteína o fragmento, y la
visualización del complejo formado por métodos convencionales.
Además, la expresión del producto de traducción
del gen Slug puede ser detectada in vivo mediante
técnicas de diagnóstico por imagen in vivo basadas en el
empleo de anticuerpos anti-Slug unidos a marcadores
apropiados, por ejemplo, marcadores detectables por rayos X,
resonancia magnética nuclear (RMN), etc. Una revisión del
diagnóstico por imagen de tumores puede encontrarse en Tumor
Imaging: The Radiochemical Detection of Cancer (S.W. Burchiel &
B.A. Rhodes, eds., Masson Publishing Inc. (1982)).
En otra realización particular, el método de la
invención comprende el análisis, en dicha muestra de sangre, o de
un derivado de la misma, de un sujeto con cáncer, tal como un
sujeto con un cáncer cuyas células sean Slug+, de un producto
relacionado con la regulación del gen Slug específico de la
especie de dicho sujeto. Tal como aquí se utiliza, la expresión
"producto relacionado con la regulación del gen Slug" se
refiere a cualquier producto implicado directa o indirectamente en
la regulación del gen Slug, tanto a nivel de ácido nucleico
como de proteína. En una realización particular, dicho producto
relacionado con la regulación del gen Slug es un factor de
transcripción que interviene en la regulación de dicho gen.
Ejemplos ilustrativos de dicho producto relacionado con la
regulación del gen Slug incluyen el factor de células madre
[SCF (stem cell factor)], la citocina c-kit,
etc.
En otra realización particular, el método de la
invención comprende el análisis, en dicha muestra de sangre, o de
un derivado de la misma, de un sujeto con cáncer, tal como un
sujeto con un cáncer cuyas células sean Slug+, de un producto
relacionado con la regulación, eliminación o degradación de sus
productos de expresión o traducción del gen Slug específico
de la especie de dicho sujeto. Tal como aquí se utiliza, la
expresión "producto relacionado con la eliminación o degradación
de sus productos de expresión o traducción del gen Slug"
se refiere a cualquier producto implicado directa o indirectamente
en la regulación, eliminación o degradación de los productos de
expresión o traducción del gen Slug, tanto a nivel de ácido
nucleico como de proteína. En una realización particular, dicho
producto relacionado con la regulación, eliminación o degradación de
los productos de expresión o traducción del gen Slug es una
proteína o un anticuerpo que directa o indirectamente provoca la
regulación, eliminación o degradación de los productos de expresión
o traducción del gen Slug, tanto a nivel de ácido nucleico
como de proteína.
Dichos productos relacionados con la regulación
del gen Slug así como dichos productos relacionados con la
regulación, eliminación o degradación de los productos de expresión
o traducción del gen Slug, dependiendo de su naturaleza
(nucleotídica o peptídica), pueden ser analizados por métodos
convencionales.
En una realización particular, cuando dichos
productos relacionados con la regulación del gen Slug o
dichos productos relacionados con la regulación, eliminación o
degradación de los productos de expresión o traducción del gen
Slug son de naturaleza nucleotídica, dichos productos podrán
ser analizados mediante cualquier ensayo apropiado para detectar,
identificar y/o cuantificar ácidos nucleicos, tales como los
mencionados previamente en relación con dichos productos de
replicación o de transcripción del gen Slug pero utilizando los
reactivos (iniciadores, sondas, etc.) apropiados.
Asimismo, en otra realización particular, cuando
dichos productos relacionados con la regulación del gen Slug
o dichos productos relacionados con la regulación, eliminación o
degradación de los productos de expresión o traducción del gen
Slug son de naturaleza peptídica o proteica, dichos
productos podrán ser analizados mediante cualquier ensayo apropiado
para detectar, identificar y/o cuantificar proteínas, tales como los
mencionados previamente en relación con dichos productos de
traducción del gen Slug.
Como se ha mencionado previamente, la presencia
de productos de replicación, transcripción o traducción del gen
Slug específico de la especie de dicho sujeto y/o de
productos relacionados con la regulación de dicho gen Slug o
con la regulación, eliminación o degradación de sus productos de
expresión o traducción, en una muestra de sangre, o de un derivado
de la misma, procedente de un sujeto con cáncer, tal como un sujeto
con un cáncer cuyas células sean Slug+, es indicativa de una
predisposición de dicho sujeto con cáncer a que se produzca la
diseminación del cáncer y/o desarrollar metástasis, o del estadio
de severidad de la enfermedad de dicho sujeto con cáncer o del
efecto de la terapia administrada a dicho sujeto con cáncer con el
fin de valorar la eficacia del tratamiento aplicado a dicho
sujeto.
Por tanto, la represión, total o parcial, de la
expresión del gen Slug o de la actividad de la proteína
Slug, podría ser útil para tratar, impedir o minimizar el
riesgo o predisposición de un sujeto con cáncer a desarrollar
metástasis.
Consecuentemente, la invención se relaciona,
además, con la reducción, inhibición o represión del gen
Slug, sus productos de replicación, transcripción o
traducción, para tratar, impedir o minimizar el desarrollo de
metástasis en un sujeto con cáncer, tal como un sujeto con un
cáncer cuyas células sean Slug+. La reducción, inhibición o
represión del gen Slug, sus productos de replicación,
transcripción o traducción, puede conseguirse mediante el empleo de
inhibidores de Slug o de su función. El gen Slug, sus
productos de replicación, transcripción o traducción, así como
dichos productos relacionados con la regulación del gen Slug
o con la regulación, eliminación o degradación de los productos de
expresión o traducción del gen Slug pueden ser utilizados en
la búsqueda de inhibidores de Slug o de su función, los
cuales pueden ser utilizados en el tratamiento o prevención del
desarrollo de metástasis en sujetos con cáncer.
Por tanto, en otro aspecto, la invención se
relaciona con el empleo de un inhibidor de Slug o de su
función, en la elaboración de una composición farmacéutica para
tratar, impedir o minimizar el desarrollo de metástasis en un
sujeto con cáncer, tal como un sujeto con un cáncer cuyas células
sean Slug+.
Tal como se utiliza en esta descripción, el
término "inhibidor de Slug o de su función" incluye a
cualquier compuesto que interfiere, reduce, anula o reprime la
expresión del gen Slug así como a cualquier compuesto capaz
de interferir en la función de la proteína Slug o del gen
Slug, o que inhiba o reduzca los efectos regulados por el gen
Slug y sus productos de replicación, transcripción o
traducción, por ejemplo, un compuesto con capacidad para interferir
con Slug a nivel de ácido nucleico (ADNg, ADNc, ARN) o
proteína (Slug). Entre los efectos regulados por el gen Slug
y sus productos de replicación, transcripción o traducción, se
encuentran la migración celular, por ejemplo, en las transiciones
epiteliales-mesenquimales, el desarrollo y
supervivencia de líneas de melanocitos y de líneas hematopoyéticas,
la migración y/o supervivencia de células de Leydig, la movilización
de células madre hematopoyéticas, la resistencia a daño en el ADN,
la resistencia celular a la irradiación, etc. Los efectos regulados
por el gen Slug y/o sus productos de replicación,
transcripción o traducción, podrían ser inhibidos o reducidos por
diferentes mecanismos, por ejemplo, inhibiendo la producción
endógena de Slug. Ejemplos ilustrativos compuestos potencialmente
útiles como inhibidores de Slug incluyen factores de
transcripción del tipo "dedos de zinc" no funcionales.
En general, la interferencia con la función del
gen Slug se puede hacer a nivel del ADN impidiendo su
expresión, inactivando el ARNm que se genera mediante
oligonucléotidos antisentido o ribozimas, inactivando la proteína
mediante el empleo de anticuerpos o compitiendo el efecto de dicha
proteína con dominantes negativos [Choo Y et al. J. Mol.
Biol., 1997, 273:525-532; Cobaleda C and
Sánchez-García I. Blood, 2000,
95:731-737] y/o, en general, mediante el empleo de
cualquier compuesto que reprima la expresión del gen Slug o
reprima o inhiba la formación o la actividad de sus productos de
transcripción o traducción. A modo ilustrativo, dicho inhibidor de
Slug o de su función puede ser una proteína, un péptido, un
factor de transcripción del tipo "dedos de zinc" no funcional,
un oligonucleótido antisentido, una ribozima, un anticuerpo o un
fragmento de anticuerpo.
En una realización particular, dicho inhibidor
de Slug es un oligonucleótido antisentido, es decir, un
compuesto que, cuando se administra a una célula que expresa el gen
Slug, por ejemplo, una célula tumoral que expresa la proteína
Slug, es capaz de, por ejemplo, reducir, anular, o reprimir la
expresión del gen Slug, reduciendo de este modo los niveles
de la proteína Slug o anulándolos completamente, o bien de reprimir
o inhibir la formación o la actividad de los productos de
transcripción o traducción del gen Slug. Dicho
oligonucleótido antisentido podría unirse específicamente, por
ejemplo, al ARNm del gen Slug evitando de ese modo su traducción en
la proteína Slug. Información sobre ADNg, ADNc o ARNm del gen
Slug y/o de la proteína Slug, en particular, del gen
Slug de humanos (hSlug) o de la proteína Slug de humanos
(hSlug) puede encontrarse en WO 02/059361 así como en las
referencias bibliográficas contenidas en dicho documento; asimismo,
información sobre el gen Slug de ratón (mSlug) o de la
proteína Slug de ratón (mSlug) puede encontrarse en Nieto et
al. (Nieto et al., Science 264:835-849
(1994)). Dicho oligonucleótido antisentido comprende una secuencia
de nucleótidos y una longitud adecuados para su hibridación con la
secuencia de nucleótidos del gen Slug o de su producto de
replicación o transcripción, bajo condiciones de alta astringencia.
A modo ilustrativo, dicho oligonucleótido antisentido comprende, al
menos 8, nucleótidos consecutivos, preferentemente, al menos, 12,
16 ó 20 nucleótidos consecutivos de la secuencia de nucleótidos del
gen Slug o capaces de hibridar con la secuencia de
nucleótidos del gen Slug bajo condiciones de alta
astringencia, tales como, por ejemplo, SSPE 5x y SDS al 0,5%, a
65ºC o condiciones equivalentes. Ejemplos de oligonucleótidos
antisentido que pueden utilizarse para evitar la expresión del gen
Slug pueden encontrarse en WO 02/059361.
En otra realización particular dicho inhibidor
de Slug o de su función es un anticuerpo
anti-Slug, tal como un anticuerpo que reconoce a la
proteína Slug intacta o a un fragmento de la misma, tal como un
fragmento antigénico de la misma, opcionalmente conjugado a un
portador. Los anticuerpos anti-Slug pueden ser
policlonales o, preferentemente, monoclonales, los cuales pueden
obtenerse por métodos convencionales, por ejemplo, mediante la
tecnología del hibridoma. Alternativamente se pueden utilizar
fragmentos de anticuerpos, por ejemplo Fab, F(ab')_{2},
etc., los cuales pueden obtenerse por métodos convencionales, que
reconocen a la proteína Slug o un fragmento antigénico de la
misma.
La composición farmacéutica proporcionada por
esta invención comprende, al menos, un inhibidor de Slug o
de su función, en una cantidad terapéuticamente eficaz, y un
excipiente farmacéuticamente aceptable. Dicha composición
farmacéutica puede contener uno o más inhibidores de Slug o
de su función, es decir, uno o más compuestos capaces de reducir,
anular o reprimir la expresión del gen Slug por lo que es
útil para prevenir o tratar el desarrollo de metástasis en sujetos
con cáncer, en particular, en sujetos que padecen cánceres cuyas
células cancerosas son Slug+. Ejemplos ilustrativos de
células tumorales o cancerosas Slug+ incluyen, entre otras,
células de cánceres mesenquimáticos o epiteliales, tales como
células de leucemias y de tumores sólidos, por ejemplo, leucemias
mieloides agudas, células leucémicas con la translocación
t(17;19), linfomas, sarcomas, por ejemplo, células de
rabdomiosarcoma que expresan la traslocación
PAX3-FKHR, células que expresan
BCR-ABL, cáncer de pulmón, por ejemplo,
cáncer de pulmón de células pequeñas, tumores ginecológicos, cáncer
de ovario, carcinomas de mama, cáncer de colon, por ejemplo,
tumores colónicos derivados de células intersticiales de Cajal (un
tipo de células dependiente del SCF), etc.
Por tanto, dicho inhibidor de Slug o de
su función podría ser utilizado, además, en el tratamiento, como
coadyuvante o tratamiento principal, de dichos tumores y
cánceres.
Los excipientes que pueden utilizarse en la
elaboración de la composición farmacéutica proporcionada por esta
invención dependerán, entre otras cosas, de la forma de
administración de dicha composición farmacéutica. Una revisión de
las distintas formas de administración de principios activos, de
los excipientes a utilizar y de sus procedimientos de fabricación
puede encontrarse en el Tratado de Farmacia Galénica, C. Faulí i
Trillo, Luzán 5, S.A. de Ediciones, 1993.
En una realización particular, la composición
farmacéutica proporcionada por esta invención es una composición
destinada a su administración por vía intravenosa (i.v.) o
intraperitoneal (i.p.). En otra realización particular, la
composición farmacéutica proporcionada por esta invención es una
composición destinada para su empleo en terapia génica que
comprende un vector, viral o no viral, y un inhibidor de Slug o de
su función. A modo ilustrativo, dichos vectores pueden ser vectores
virales, por ejemplo, basados en retrovirus, adenovirus, etc., o no
virales tales como los complejos ADN-liposoma,
ADN-polímero,
ADN-polímero-liposoma, etc. [véase
"Nonviral Vectors for Gene Therapy", editado por Huang, Hung y
Wagner, Academic Press (1999)].
Los siguientes ejemplos ilustran la invención y
no deben ser considerados en sentido limitativo de la misma.
Cultivos celulares. Las líneas celulares
utilizadas incluyen la línea celular precursora hematopoyética
Ba/F3 [Palacios y Steinmetz, Cell 41:727 (1985)] y células Ba/F3
que expresan las proteínas humanas BCR-ABL^{p190}
(Ba/F3 + p190) y BCR-ABL^{p210} (Ba/F3 + p210)
[Sánchez-García y Grütz, Proc. Natl. Acad. Sci. USA,
92:5287-5291 (1995)]. Las células se mantuvieron en
medio de Eagle modificado de Dulbecco (DMEM) suplementado con un
10% de suero fetal bovino (SFB). Cuando fue necesario, se añadió un
10% de medio acondicionado con WEHI-3B como fuente
de IL-3 (interleucina-3).
Transfección celular y Ensayo de
supervivencia. Las células Ba/F3 se transfectaron por
electroporación (960 \muF, 220 V) con 20 \mug de plásmido
CombitTA-Slug. La población de células resistentes
a neomicina (Ba/F3 + CombitTA-Slug) se analizó por
RT-PCR (retrotranscripción-reacción
en cadena de la polimerasa) para detectar la expresión de
CombitTA-Slug en presencia y en ausencia de
tetraciclina (20 ng/ml). Estas células eran resistentes a la
retirada de IL-3 cuando se crecían en ausencia de
tetraciclina. Se confirmó la resistencia de las células a la
retirada de IL-3 y la viabilidad celular se
determinó por exclusión de azul tripano.
RT-PCR. Para analizar la
expresión de CombitTA-Slug y de Slug endógeno
en líneas celulares de ratón y en ratones, se realizó una
RT-PCR siguiendo las instrucciones del fabricante
en un volumen de reacción de 20 \mul que contenía 50 ng de
hexámeros aleatorios, 3 \mug de RNA total, y 200 unidades de
transcriptasa inversa Superscript II RNase H- (GIBCO/BRL). Se
realizaron 30 ciclos a 94ºC durante 1 minuto, 56ºC durante 1 minuto
y 72ºC durante 2 minutos, utilizando las secuencias de los cebadores
específicos que se indican a continuación:
- -
- Combi-polyA-B 1: 5'-TTGAGTGCATTCTAGTTGTG-3';
- -
- mSlug directo: 5'-GTTTCAGTGCAATTTATGCAA-3';
- -
- mSlug reverso: 5'-TTATACATACTATTTGGTTG-3'.
La amplificación del ARN de la
\beta-actina sirvió de control para garantizar la
calidad de las muestras de ARN.
Asimismo, para analizar la expresión de
hSlug en las líneas celulares humanas y en muestras de
sangre de pacientes Ph^{1}-positivos, los
parámetros de los ciclos usados en las reacciones de PCR, y las
secuencias de los cebadores específicos fueron las siguientes:
hSlug: 30 ciclos a 94ºC durante 1 minuto,
56ºC durante 1 minuto y 72ºC durante 2 minutos, cebador directo
5'-GCCTCCAAAAAGCCAAACTA-3' y cebador
inverso
5'-CACAGTGATGGGGCTGTATG-3';
c-ABL: 30 ciclos a 94ºC
durante 1 minuto, 56ºC durante 1 minuto y 72ºC durante 2 minutos,
cebador directo
5'-GTATCATCTGACTTTGAGCC-3' y cebador
inverso
5'-GTACCAGGAGTGTTTCTCCA-3'.
La amplificación del ARNm de
c-ABL sirvió como control de calidad de las
muestras.
Análisis Southern. ADN procedente de
fragmentos de las colas de los ratones se digirió con endonucleasas
de restricción tal como se ha descrito previamente [García
Hernández et al., (1997). Proc. Natl. Acad. Sci.
U.S.A., 94, 13239-13244], se separó por
electroforesis en un gel de agarosa al 0,8% y se transfirió a un
filtro Hybond-N (Amersham). El ADN se fijó a los
filtros mediante exposición a radiación ultravioleta. Los filtros
se hibridaron con una sonda de ADNc de la secuencia completa de
Slug, correspondiente al ADNc completo de Slug [Pérez
Losada et al., (2002). Blood,
100(4):1274-1286], marcada radiactivamente
con ^{32}P [García Hernández et al., (1997). citado
supra].
Ratones CombitTA-Slug. El
ADNc de Slug de ratón (mSlug) [Nieto et al.,
Science 264:835-849 (1994)] se clonó en el vector
Combi-tTA [Schultze et al. (1996) Nature
Biotechnology, 14: 499-503]. El conjunto se cortó
para hacerlo lineal por digestión con NotI, y se inyectó en óvulos
fecundados de ratonas CBAxC57B/J6 [Jackson Laboratory]. Se
identificaron los ratones transgénicos mediante análisis Southern
del ADN de un pequeño fragmento de la cola, tras digestión con
EcoRI. Se usó el ADNc de mSlug para la detección del
transgén.
Ratones con la mutación Slug^{\Delta
1} . Los ratones horno y heterocigóticos para la mutación
Slug^{\Delta 1}, generada mediante la supresión de la
secuencia génica total que codifica la proteína Slug (ratones
mutantes Slug^{\Delta 1} o ratones deficientes de Slug),
han sido descritos previamente [Jiang et al., (1998).
Developmental Biology. 198; 277-2855].
Ratones heterocigóticos Slug +/-
(ratones Slug^{\Delta 1} ) se cruzaron con ratones
transgénicos CombitTA-Slug y ratones transgénicos
BCR-ABL^{p190} (EP 1354962) para dar lugar a
ratones heterocigóticos compuestos. Los animales de la primera
generación (F1) se cruzaron para obtener los ratones sin Slug
(Slug -/-), heterocigóticos para Combi-tTA y
BCR-ABL^{p190}.
Análisis histológico. Los animales
incluidos en este estudio fueron sometidos a necropsia estándar.
Todos los órganos mayores se sometieron a examen bajo el
microscopio de disección, se incluyeron muestras de cada uno de
ellos en parafina, se prepararon cortes y se examinaron
histológicamente. Todas las muestras fueron obtenidas de partes
viables y homogéneas del tejido disecado y se fijaron en los
siguientes 2-5 minutos. Posteriormente se revisaron
los cortes
de tejido, teñidos con hematoxilina y eosina. Para los estudios comparativos se usaron ratones de la misma edad.
de tejido, teñidos con hematoxilina y eosina. Para los estudios comparativos se usaron ratones de la misma edad.
Análisis fenotípico. Para la citometría
de flujo se utilizaron los siguientes anticuerpos monoclonales:
CD45R/B220, IgM, Macl, Gr-1 (Pharmingen).
Suspensiones de células únicas procedentes de diferentes muestras
titulares obtenidas por técnicas rutinarias, fueron incubadas con
un anticuerpo purificado contra CD32/CD16 de ratón para bloquear la
unión a los receptores Fc, y con una dilución apropiada de los
diferentes anticuerpos, a temperatura ambiente o a 4ºC,
respectivamente. Las muestras se lavaron dos veces con solución
salina tamponada con fosfato (PBS) y se resuspendieron en PBS. Las
células muertas de las muestras se excluyeron mediante tinción con
yoduro de propidio. Las muestras y los datos se analizaron con un
citómetro de flujo FACScan y con el programa informático CellQuest
(Becton Dickinson).
Análisis del ADN de bajo peso molecular.
El ADN de bajo peso molecular se aisló como se describe a
continuación. Se recogieron las células en 1,5 ml de medio de
cultivo, se centrifugaron durante 1 minuto a 1.500 rpm (400 x g), y
el "pellet" se resuspendió en 300 \mul de tampón de
proteinasa K. Tras incubarse durante la noche a 55ºC, se precipitó
el ADN con etanol, se resuspendió en 200 \mul de tampón TE
(Tris-EDTA (ácido
etilendiamino-tetraacético)) que contenía 50
\mug/ml de ARNasa A, y se incubó a 37ºC durante 2 horas. El ADN
se extrajo con fenol/cloroformo y se precipitó con etanol. Se
marcaron terminalmente alícuotas de ADN (2 \mug) con
\alpha^{32}P-dCTP y se sometieron a
electroforesis en geles de agarosa al 2%. Tras la electroforesis, el
ADN del gel se transfirió a una membrana Hybond-N
(Amersham) y se sometió a autoradiografia durante 2 horas a
-70ºC.
Ensayo de la capacidad formadora de
tumores. Para estudiar la capacidad de formación de tumores de
varios cánceres, 10^{6} células suspendidas en 200 \mul de PBS
se inyectaron vía subcutánea en cada uno de los dos flancos de
ratones macho atímicos (desnudos). Se hizo un seguimiento de los
animales y del crecimiento de los tumores durante 3 semanas.
Generación de los ratones
CombitTA-Slug. Para determinar si la
desregulación de la expresión de Slug es necesaria para el
desarrollo de cáncer, se generaron unos ratones transgénicos
(CombitTA-Slug) en los que la expresión del gen
Slug podía ser regulada exógenamente. Para ello se utilizó
el sistema Combi-tTA, que posee en un único plásmido
el transactivador y el promotor mínimo tet-operador
(tetO) para dirigir la expresión génica. Este procedimiento asegura
la integración del mismo número de copias del transactivador que
del gen reportero en configuración cis directa, en el mismo punto
del mismo cromosoma, e impide la segregación genética de los
elementos de control durante el cruce. La inserción del gen
mSlug bajo el control del promotor mínimo tetO produjo el
plásmido CombitTA-Slug (Figura 1A), que se probó en
la línea celular precursora hematopoyética Ba/F3. La proteína
represora tet, fusionada al dominio de transactivación viral de VP16
(dentro de tTA) se une, en ausencia de tetraciclina, a un promotor
mínimo tet de diseño genético y activa la transcripción de
CombitTA-Slug. En presencia de la molécula efectora,
este gen no se expresa y el promotor queda silenciado (Figura 1B).
Tras dos días en cultivo, tanto en presencia como en ausencia de
tetraciclina, se midió la expresión de
CombitTA-Slug. En este sentido, se detectó la
presencia de CombitTA-Slug en células Ba/F3 en
ausencia, pero no en presencia, de tetraciclina (20 ng/ml). Estos
datos indican que la tetraciclina reprime completamente la
inducción de CombitTA-Slug. El hecho de que la
expresión de Slug protege a las células Ba/F3 de la apoptosis
inducida por la retirada de IL-3 ya ha sido
demostrado [Inukai et al. (1999). Molecular Cell.
4:343-352]. Así pues, a continuación se estudió la
supervivencia de células Ba/F3 que expresaban
CombitTA-Slug, 24 horas después de la retirada de
IL-3. La expresión de Slug fue suficiente
para que todas las células Ba/F3 que expresaban
CombitTA-Slug resistiesen la muerte inducida por la
retirada de IL-3. El tratamiento con tetraciclina
restauró la sensibilidad de las células Ba/F3 a la retirada de
IL-3 (Figuras 1C y ID).
Se crearon dos líneas transgénicas de ratones
CombitTA-Slug (Figura 2A). En ambas, la expresión
de CombitTA-SLUG se pudo detectar de forma
reproducible en todos los tejidos analizados (Figura 2B). La
relevancia fisiológica de dichos ratones
CombitTA-Slug se analizó mediante el cruce con
ratones deficientes de Slug (ratones mutantes
Slug^{\Delta 1}). La anemia y los defectos de pigmentación
característicos de los ratones homocigóticos con Slug
mutante no se produjeron en ratones de este tipo cruzados con
ratones transgénicos CombitTA-Slug. La expresión de
CombitTA-Slug se produjo por transactivación, ya
que en aquellos ratones a los que se administró tetraciclina (4
mg/mL) en el agua, la transactivación cayó hasta niveles
indetectables (Figura 2C).
Desarrollo de cáncer en ratones transgénicos
CombitTA-Slug. En humanos, Slug está
vinculado a células cancerosas mesenquimales que expresan genes de
fusión como consecuencia de anomalías cromosómicas (leucemias o
sarcomas). Por ese motivo, se estudió si los ratones transgénicos
CombitTA-Slug desarrollan cánceres mesenquimales,
observándose que todos los ratones transgénicos
CombitTA-Slug mostraron signos claros de falta de
salud a partir de los 9 meses de edad. El cuadro clínico de estos
ratones fue empeorando rápidamente y se convirtió en cánceres
mesenquimales (el 90% desarrollaron leucemia y el 10% sarcomas)
(Figuras 3A y 3B), que se caracterizaron clínicamente por un
descenso de la movilidad en la jaula, aumento del ritmo
respiratorio, piloerección, temblor y pérdida de peso sustancial.
Esta condición persistió y los animales se sacrificaron. El examen
macroscópico mostró esplenomegalias (Figura 3A) o sarcomas (Figura
3B). Los timos, en general, eran normales. Estas observaciones son
consistentes con cánceres mesenquimales. Sin embargo, no se
observaron ni alteraciones epiteliales ni carcinomas en ninguno de
los 77 ratones CombitTA-Slug analizados a pesar de
la extensa expresión de CombitTA-SLUG. El examen
histológico de estos animales reveló una marcada filtración
leucémica de los tejidos hematopoyéticos y no hematopoyéticos
(Figura 3C). Las células mononucleares de la sangre de los ratones
leucémicos analizados permitieron diagnosticar las leucemias
generadas como leucemia linfoblástica aguda en células B o leucemia
mieloide aguda (Figura 3D).
Las células transplantadas subcutáneamente en
ratones sanos procedentes de ratones transgénicos
CombitTA-Slug, desarrollaron el mismo tipo de tumor
tal y como se deduce del análisis histológico. Además, se comprobó
que las células que formaban el tumor provenían del donante
mediante PCR, que reveló la presencia del producto de
CombitTA-Slug. Estos datos permiten definir los
tumores desarrollados en ratones transgénicos
CombitTA-Slug como malignos, demuestran que
Slug causa cáncer mesenquimal e indican que Slug no
requiere formación previa de un tumor para que ocurra la
diseminación.
Irreversibilidad de las alteraciones
inducidas por Slug . Los resultados anteriores
proporcionan evidencia de que la expresión de Slug dota a las
células con la capacidad de migrar. Como tal, Slug (ácido
nucleico o producto de expresión) podría convertirse en una
atractiva diana terapéutica para controlar la capacidad invasiva de
los cánceres humanos. Si esto es así, cabria esperar que las
células que sobreexpresan Slug presenten modificaciones en
los patrones de crecimiento y diseminación al modificarles el nivel
de expresión de Slug. Por tanto, se evaluaron las
consecuencias de la supresión de Slug mediante el examen
fenotípico de 10 ratones transgénicos CombitTA-Slug,
en los que se había confirmado previamente la presencia de leucemia
mediante análisis de su sangre I antes del tratamiento con
tetraciclina. La administración a los ratones transgénicos
CombitTA-Slug de tetraciclina (4 g/l) en el agua se
llevó a cabo durante 2 semanas provocó la supresión de la expresión
de Slug (Figura 4A). Sin embargo, no se observó ninguna
modificación fenotípica en ninguno de los 10 ratones
CombitTA-Slug analizados a pesar de la supresión de
la expresión de Slug tras el tratamiento con tetraciclina. El
análisis por citometría de flujo de los animales tratados con
tetraciclina puso de manifiesto la persistencia de células
leucémicas en la sangre (Figura 4B), y el análisis histológico
confirmó la infiltración de los tejidos no hematopoyéticos (Figura
4B).
La supresión de Slug bloquea in
vivo el desarrollo de leucemia
BCR-ABL^{190}. Un paso crítico para el
entendimiento de la transformación maligna mediada por oncogenes
asociados al cáncer mesenquimal, es la identificación de los genes
modulados por estas oncoproteínas, que permiten a las células
crecer fuera de su entorno normal. Aunque se ha demostrado que
Slug es suficiente para generar leucemias y sarcomas, y para
que el crecimiento de estas células se haga independiente de la
expresión del propio Slug, estos resultados no implican que
los oncogenes asociados a cánceres mesenquimales necesiten
Slug para producir transformación maligna. Para estudiar este
asunto se utilizaron los oncogenes BCR-ABL
[Sánchez-García & Grütz, PNAS (1995),
92:5287-5291] como modelo. Los oncogenes
BCR-ABL activan la expresión de Slug
en células Ba/F3 y en blastocitos procedentes de ratones
transgénicos que expresan BCR-ABL (Figuras
5A y 5B). La expresión de Slug también se produce en
blastocitos procedentes de pacientes con leucemias humanas
Ph^{1}-positivas, mientras que el producto del gen
Slug estaba ausente en las células de muestras humanas
normales (Figura 5C, carril 1). Por el contrario, Slug está
presente en líneas celulares
t(9;22)-positivas derivadas de pacientes con
leucemia crónica mieloide (LMC) y con leucemia linfocítica aguda
(ALL, por sus siglas en inglés), en células de pacientes
Ph^{1}-positivos, y en otras líneas celulares
leucémicas carentes de t(9;22), incluyendo el linaje B
temprano 697, la mieloide U937, y las líneas celulares T
ALL-SIL y KOPTI-KI (Figura 5C).
Estas y otras observaciones previas muestran que la expresión de
Slug es una característica común en los tumores
mesenquimales.
Con objeto de demostrar si Slug es
necesario para la génesis de la leucemia inducida por
BCR-ABL, se estudió la capacidad inductora de
leucemia de BCR-ABL^{p190} en presencia y en
ausencia de Slug. En humanos, este oncogén está vinculado a
células B leucémicas que coexpresan marcadores mieloides. Así pues,
se generaron ratones transgénicos de
BCR-ABL^{p190}. El examen histológico y fenotípico
de los ratones transgénicos de BCR-ABL^{p190} de
entre 7 y 9 meses de edad confirmó la presencia de blastocitos en
tejidos hematopoyéticos y no hematopoyéticos (Figura 6A). De forma
muy parecida a lo que ocurre en humanos, estos blastocitos
coexpresan marcadores mieloides y de células B (Figura 6B).
Seguidamente se procedió al estudio biológico de
BCR-ABL^{p190}-B-ALL
[ratones transgénicos con leucemia linfoblástica aguda tipo B (EP
1354962)] en ausencia de Slug. Se generaron 12 ratones
transgénicos BCR-ABL^{p190} homocigóticos para la
mutación específica del gen Slug. Entre los 6 y los 9 meses
de edad, se analizó periódicamente la sangre de esos ratones
BCR-ABL^{p190} x Slug -/- y no se detectó
ningún blastocito. A los 12 meses de edad se sacrificó a los
ratones y la autopsia mostró que no existían anomalías morfológicas
significativas de los tejidos hematopoyéticos y no hematopoyéticos.
A pesar de realizar un análisis extenso tanto histológico como
fenotípico, no se observó ningún signo de leucemia en dichos
ratones BCR-ABL^{p190} x Slug -/- (Figura
6). Estos resultados demuestran que Slug desempeña un papel
fundamental en la génesis de células cancerosas
BCR-ABL^{p190}.
Se ha estudiado con precisión la importancia de
Slug en cada uno de los aspectos de los fenotipos generados
por los ratones que expresan Slug. Para ello se ha utilizado
un sistema que, en un único plásmido, contiene los elementos
reguladores y de expresión del sistema binario de tetraciclina
original, que permite una elevada inducción y un gran control de la
expresión génica por tetraciclina en el ratón. En el ratón,
Slug no está involucrado en las transiciones
epitelio-mesenquimales. De acuerdo con esa idea, no
se observaron ni alteraciones epiteliales ni carcinomas en ninguno
de los ratones transgénicos CombitTA-Slug
analizados. El análisis de todos los aspectos de los fenotipos
humanos relacionados con la expresión de Slug en los ratones
que expresan Slug, puso de manifiesto que estos ratones
presentaban cánceres mesenquimales, fundamentalmente leucemias.
En el sistema hematopoyético, las células
progenitoras normales no comprometidas se diferencian en células
maduras. Durante esta transición, la expresión de Slug está
inactivada. En situaciones fisiológicas, cuando estas células
progenitoras normales no comprometidas migran, Slug favorece
su supervivencia y les permite llevar a cabo su función. Si esto no
se consigue en un periodo concreto de tiempo, estas células sufren
apoptosis como respuesta a la ausencia de señales externas
específicas. Por ello, los cánceres mesenquimales que se observan en
los ratones transgénicos CombitTA-Slug suponen una
demostración in vivo de la idea de que la transformación
depende de cambios genéticos que permiten a las células no
diferenciadas crecer fuera de su entorno normal (Figura 3). Estos
resultados proporcionan evidencia de que la expresión de Slug dota a
las células con capacidad migratoria. Como tal, Slug podría
convertirse en una diana terapéutica atractiva para el control de
la capacidad invasiva de los cánceres humanos. Sin embargo, aunque
la supervivencia conferida por Slug es reversible in
vitro (Figura 1), las alteraciones inducidas por Slug se
hacen independientes de su propia expresión in vivo.
Estos hallazgos también sitúan la función
biológica de Slug en el contexto de la transformación
celular dependiente de los oncogenes BCR-ABL.
Los datos que se presentan aquí demuestran que los oncogenes
BCR-ABL inducen la expresión de Slug.
De hecho, la expresión de Slug no es rara en los tumores
mesenquimales (tanto leucemias como sarcomas) en los que la
transformación se ha producido por otras alteraciones genéticas.
Esto sugiere que Slug podría participar en la invasión
tumoral, no solamente en leucemias
BCR-ABL-positivas, sino también,
posiblemente, en otros cánceres mesenquimales.
Con el fin de demostrar si Slug es
necesario para la génesis de la leucemia inducida por
BCR-ABL, se estudió la capacidad inductora de
leucemia del oncogén BCR-ABL^{p190} en presencia
y en ausencia de Slug. Los resultados obtenidos demuestran
que Slug tiene un papel fundamental en la biología de los
cánceres BCR-ABL. Estos datos son consistentes con
un modelo en el que las células tumorales que contienen la proteína
de fusión BCR-ABL expresan constitutivamente
Slug, que promueve la supervivencia y la migración
aberrantes de las células defectuosas en diferentes entornos (Figura
3). Dado que es frecuente encontrar Slug en células de
tumores mesenquimales, es posible que Slug tenga un papel
más general en la biología del cáncer que el específicamente
asociado a la transformación por BCR-ABL.
Así pues, la expresión de Slug podría constituir una vía de
invasión común de leucemias y sarcomas asociados a otras proteínas.
En conclusión, Slug podría representar un mecanismo de
invasión tumoral ampliamente distribuido en los tumores
mesenquimales. Como tal, Slug podría ser una diana
terapéutica atractiva para el control de la capacidad invasiva
tumoral, y puede ser considerado como marcador de malignidad.
Se seleccionaron 124 pacientes con diagnóstico
de carcinoma de mama (81 pacientes con cáncer de mama
metastatizados y 43 pacientes con cáncer de mama en estadio TNM0),
a los que se extrajeron 10 ml de sangre antes de administrarles el
primer ciclo de quimioterapia y la misma cantidad antes de recibir
el último ciclo. Finalizado el tratamiento con quimioterapia
adyuvante, se realizó un seguimiento de los pacientes a los 3 meses
durante los 2 primeros años, y cada 6 meses los siguientes 3 años
hasta un total de 5 años.
La metodología utilizada para la determinación
de la expresión del gen Slug en sangre fue:
- \bullet
- Extracción de ARN de la sangre periférica mediante el uso del kit QIAamp® siguiendo las instrucciones del fabricante.
- \bullet
- Eliminación del ADN contaminante mediante tratamiento de las muestras con DNAsa I siguiendo las instrucciones del fabricante.
- \bullet
- Obtención de ADNc a partir del RNA tratado con DNAsa mediante el uso del kit Promega® siguiendo las instrucciones del fabricante.
- \bullet
- La integridad del ADNc se comprobó mediante amplificación de la actina con los oligos apropiados:
- Actin-F: 5'-TAG GAA TCC ATG GCC ACT GCC GCA TCC TCT TCC-3'
- Actin-B: 5'-CAC GAT GGA GGG GCC GGA CTC ATC-3'
- 35 ciclos a 95ºC durante 1 minuto/55ºC durante 1 minuto/72ºC durante 1 minuto y 30 segundos.
- \bullet
- RT-PCR para detectar la expresión del gen Slug. Se utilizaron oligos con las siguientes características
- hSlug-F: 5'-AGC GAA CTG GAC ACA CAT A-3'
- hSlug-B: 5'-AAT GCT CTG TTG CAG TGA G-3'
- 35 ciclos a 95ºC durante 1 minuto/55ºC durante 1 minuto/72ºC durante 1 minuto y 30 segundos.
- \bullet
- Electroforesis en gel de agarosa al 1%, a 55 v durante 1 hora, para ver el resultado de la RT-PCR [García-Hernández et al., (1997) PNAS, 94:13239-13244].
- \bullet
- Transferencia a membranas de nylon e hibridación con sonda Slug [García-Hernández et al., (1997) PNAS, 94:13239-13244].
Inicialmente se estudió la expresión de
Slug en líneas celulares y tejidos tumorales de cáncer de
mama. Como se muestra en la Figura 7, tanto la línea celular
MCF-7 (Figura 7, carril 8) derivada de un
adenocarcinoma de mama, como los carcinomas de mama primarios
(Figura 7, carriles 4-7) expresan Slug.
Tras confirmar la presencia de Slug en
cánceres de mama, se procedió a estudiar la expresión de
Slug en la sangre de pacientes con cáncer de mama. Como
muestra la Figura 8, Slug no se expresa en la sangre de individuos
sanos; sin embargo, la expresión de Slug se detectó en el
58% de los casos de cáncer de mama metastatizados y que llevaban un
tratamiento quimioterapéutico variable (Figura 9).
Una vez detectada la expresión de Slug en
una amplia mayoría de cánceres de mama metastatizados, se procedió
a estudiar pacientes diagnosticados de cáncer de mama en estadio
TNM0. Como se muestra en la Figura 10, la presencia de Slug
se detectó en el 65% de los pacientes con cáncer de mama en estadio
TNM0.
Los resultados obtenidos indican que Slug
puede servir como un marcador de diseminación temprano de cáncer de
mama y de otros tipos de cáncer tanto epitelial como mesenquimal.
Por tanto, el estudio de la expresión de Slug en sangre puede
ser usado para monitorizar el diagnóstico, el beneficio terapéutico
y la recaída en pacientes con cáncer.
<110> Centro de Investigación Biomolecular
Aplicada Salamanca, S.L.
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<120> Empleo del gen Slug, o sus produtos
de replicación, transcripcion, o expresión, en la identificación,
diagnóstico o tratamiento de la diseminación del cáncer y/o
desarrollo de metástasis
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<130> P044360ES
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<140> P200402559
\vskip0.400000\baselineskip
<141>
2004-10-25
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<160> 11
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<170> SeqWin99, version 1.02
\vskip1.000000\baselineskip
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<210> 1
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 20
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<212> ADN
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<213> Secuencia artificial
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<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223>
Combi-polyA-B1
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<400> 1
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\hskip-.1em\dddseqskipttgagtgcat tctagttgtg
\hfill20
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<210> 2
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<211> 21
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<212> ADN
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<213> Secuencia artificial
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<220>
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<223> mslug directo
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<400> 2
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\hskip-.1em\dddseqskipgtttcagtgc aatttatgca a
\hfill21
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<210> 3
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<211> 20
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<212> ADN
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<213> Secuencia artificial
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<220>
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<223> mSlug reverso
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<210> 4
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<212> ADN
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<213> Secuencia artificial
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<212> ADN
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<213> secuencia artificial
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<223> hSlug reverso
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<223> c-ABL reverso
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<400> 7
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\hfill20
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<220>
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<223> Actina-F
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\hfill33
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<210> 9
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<212> ADN
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<220>
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<223> Actina-B
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<400> 9
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\hfill24
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<210> 10
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<223> hSlug-F
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\hskip-.1em\dddseqskipagcgaactgg acacacata
\hfill19
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<210> 11
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 19
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<212> ADN
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<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> hSlug-B
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 11
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipaatgctctgt tgcagtgag
\hfill19
Claims (16)
1. Método in vitro (i) para evaluar la
predisposición de un sujeto con cáncer a desarrollar metástasis, ó
(ii) para determinar el estadio de severidad de la enfermedad de un
sujeto con cáncer, ó (iii) para monitorizar el efecto de la terapia
administrada a un sujeto con cáncer. que comprende analizar en una
muestra de sangre, o de un derivado de la misma, de dicho sujeto,
al menos, un producto de replicación, transcripción o traducción
del gen Slug específico de la especie de dicho sujeto.
2. Método según la reivindicación 1, en donde
dicho producto de replicación del gen Slug comprende la
totalidad o un fragmento del ADN genómico (ADNg) del gen
Slug.
3. Método según la reivindicación 1, en donde
dicho producto de transcripción se selecciona entre ARN mensajero
(ARNm) del gen Slug, un fragmento de dicho ARNm, ADN
complementario (ADNc) al ARN que codifica para el producto de
transcripción o de expresión de dicho gen Slug, un fragmento
de dicho ADNc, y sus mezclas.
4. Método según la reivindicación 2 ó 3 en el
que el análisis de dicho producto de replicación o dicho producto
de transcripción del gen Slug se lleva a cabo mediante un
ensayo para detectar, identificar y/o cuantificar ácidos
nucleicos.
5. Método según la reivindicación 1, en donde
dicho producto de traducción es la proteína Slug o un fragmento de
la misma.
6. Método según la reivindicación 5, que
comprende analizar dicha proteína Slug o fragmento de la misma
mediante un ensayo para detectar, identificar y/o cuantificar
proteínas.
7. Método según la reivindicación 1, que
comprende, además, analizar un producto relacionado con la
regulación del dicho gen Slug, o con la regulación, eliminación o
degradación de sus productos de expresión o traducción.
8. Método según la reivindicación 7, en el que
el análisis de dicho producto relacionado con la regulación del gen
Slug se lleva a cabo mediante un ensayo para detectar,
identificar y/o cuantificar ácidos nucleicos o proteínas, en función
de su naturaleza.
9. Método según la reivindicación 7, en donde
dicho producto relacionado con la regulación del gen Slug es
un factor de transcripción que interviene en la regulación de dicho
gen.
10. Método según la reivindicación 7, en el que
el análisis de dicho producto relacionado con la regulación.
eliminación o degradación de los productos de expresión o
traducción del gen Slug se lleva a cabo mediante un ensayo
para detectar, identificar y/o cuantificar ácidos nucleicos o
proteínas, en función de su naturaleza.
11. Método según la reivindicación 1, en donde
dicho sujeto es un ser humano.
12. Método según la reivindicación 1 ó 11, en
donde dicho sujeto padece un cáncer cuyas células cancerosas son
Slug+.
13. Método según la reivindicación 12, en donde
dicho sujeto padece un cáncer mesenquimático o epitelial.
14. Método según la reivindicación 1 ó 12, en
donde dicho sujeto padece leucemia, linfoma, sarcoma, cáncer de
pulmón, tumores ginecológicos, cáncer de ovario, carcinoma de mama,
o cáncer de colon.
15. Empleo de un inhibidor de Slug o de su
función, donde dicho inhibidor se selecciona entre una proteína, un
péptido, un factor de transcripción del tipo "dedos de zinc"
no funcional, un oligonucleótido antisentido, una ribozima, un
anticuerpo y un fragmento de anticuerpo, en la elaboración de una
composición farmacéutica para tratar, impedir o minimizar el
desarrollo de metástasis en un sujeto con cáncer.
16. Empleo según la reivindicación 15, en donde
dicho inhibidor de Slug o de su función es una proteína, un
péptido, un factor de transcripción del tipo "dedos de zinc"
no funcional, un oligonucleótido antisentido, una ribozima, un
anticuerpo o un fragmento de anticuerpo capaz de interferir en la
replicación, transcripción o traducción del gen Slug, una proteína,
un péptido, un factor de transcripción del tipo "dedos de
zinc" no funcional, un oligonucleótido antisentido, una ribozima,
un anticuerpo y un fragmento de anticuerpo capaz de interferir en
la función de la proteína Slug, o del gen Slug, o una proteína, un
péptido, un factor de transcripción del tipo "dedos de zinc"
no funcional, un oligonucleótido antisentido, una ribozima, un
anticuerpo y un fragmento de anticuerpo que inhibe o reduce los
efectos regulados por el gen Slug o sus productos de
replicación. transcripción o traducción.
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