ES2356080T3 - Moesina, caveolina y proteina 1 asociada a yes como marcadores de respuesta a dasatinib en canceres de mama. - Google Patents

Moesina, caveolina y proteina 1 asociada a yes como marcadores de respuesta a dasatinib en canceres de mama. Download PDF

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Abstract

Un procedimiento para determinar la capacidad de respuesta de una célula de tumor de mama de mamífero al tratamiento con N-(2-cloro-6-metilfenil)-2-[[6-[4-(2-hidroxietil)-1-piperazinil]-2-metil-4-pirimidinil]amino]-5tiazolcarboxamida o una sal, solvato o hidrato farmacéuticamente aceptable de la misma, comprendiendo el procedimiento determinar en una muestra biológica el nivel de expresión de al menos un gen seleccionado de moesina, caveolina 1 o proteína 1 asociada a yes en dicha célula tumoral, siendo indicativa la expresión o la expresión elevada de que es probable que la célula responda o sea sensible al tratamiento.

Description

CAMPO DE LA INVENCIÓN
La invención descrita en el presente documento se refiere a procedimientos y composiciones útiles en el diagnóstico, tratamiento y gestión de cánceres que expresan genes particulares.
ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN 5
El cáncer es la segunda causa principal de muerte en seres humanos después de la enfermedad coronaria. En todo el mundo, millones de personas mueren de cáncer cada año. Solo en los Estados Unidos, el cáncer produce la muerte de más de medio millón de personas al año, diagnosticándose unos 1,4 millones de casos nuevos al año. Aunque las muertes por enfermedad cardiaca se han ido reduciendo significativamente, las debidas a cáncer en general están aumentando. 10
En todo el mundo, varios cánceres destacan como los principales asesinos. En particular, los carcinomas de mama, pulmón, próstata, colon, páncreas y ovario representan las causas principales de muerte por cáncer. Éstos y prácticamente todos los demás carcinomas comparten una característica letal común. Con muy pocas excepciones, la enfermedad metastásica de un carcinoma es fatal. Además, incluso para los pacientes de cáncer que inicialmente sobreviven a sus cánceres primarios, la experiencia común ha demostrado que sus vidas se alteran radicalmente y 15 muchos pacientes de cáncer experimentan una recurrencia.
El cáncer de mama afecta a más de un millón de mujeres en todo el mundo cada año (véase, por ejemplo, Jemal A y col., 2002. CA Cancer J. Clin. Enero-Febrero 2002; 52(1):23-47; Jensen OM, y col., Eur. J. Cancer. 1990; 26(11-12): 1167-256; y National Cancer Institute of Canada: Canadian Cancer Statistics 1996. Toronto, Canada. 1996; 21-23). El cáncer de mama también es una de las causas principales de muerte entre las mujeres, estando estimado el 20 riesgo acumulativo a lo largo de la vida de una mujer que desarrolla cáncer de mama en 1 de cada 9. La comprensión de los orígenes y subtipos de estas malignidades así como los modelos para la identificación de nuevas modalidades de diagnóstico y terapéuticas tiene un interés significativo para los profesionales sanitarios. La mayoría de las mujeres que mueren por cáncer de mama no sucumben a la enfermedad primaria original, que normalmente es susceptible de tratamiento por diversas terapias, sino más bien a la propagación metastásica del cáncer de mama a sitios distantes. 25 Este hecho recalca la necesidad de desarrollar métodos de diagnóstico adicionales así como nuevos agentes anticancerosos o formas más agresivas de terapia dirigidas específicamente contra subtipos de tumores de mama.
Los avances en la compresión de la biología de esta enfermedad, sin embargo, han llevado a una mejor supervivencia del paciente con la incorporación de nuevos agentes anti-hormonales en el tratamiento de la enfermedad positiva a receptores hormonales y la adición de terapias dirigidas a HER2 para el 25% de las mujeres con amplificación 30 de HER2 (véase, por ejemplo, Fossati R, y col., J. Clin. Oncol. 1998 Oct; 16(10): 3439-60 y Slamon DJ, y col., N Engl J Med. 2001 Mar 15; 344(11): 783-92).
Sin embargo, sigue existiendo una subserie de mujeres para las que estos enfoques no son una opción eficaz y la quimioterapia ofrece sólo efectos beneficiosos limitados. Este grupo se ha descrito como "triple negativo" (es decir, negativo para el receptor de estrógenos (SEC ID Nº: 7), negativo para el receptor de progesterona (SEC ID Nº: 8) y 35 negativo para HER2 (SEC ID Nº: 9)) y representa un subgrupo clínico y molecular distinto de la enfermedad.
Estudios recientes que usan el perfilado de la expresión génica han identificado este grupo como un grupo que expresa citoqueratinas únicas que lo diferencian de otros tipos de cáncer de mama y como un grupo que tiene un mal diagnóstico similar al grupo positivo para HER-2 antes de la introducción de trastuzumab (véase, por ejemplo, Sorlie T y col., Proc Natl Acad Sci USA. 11 Sep 2001; 98: 10869-74; Sotiriou C, y col., Proc Natl Acad. Sci USA. 2 Sep 2003; 40 100(18): 10393-8; y Perou CM, y col., Nature. 17 Agosto 2000; 406(6796): 747-52). Los datos del perfilado han subagrupado la enfermedad en "luminal", que expresa citoqueratinas específicas (CK8, CK18) asociadas con la capa luminal del epitelio de la mama normal, o el grupo "basal" basado en la expresión de citoqueratinas (CK5, CK17) que se encuentran en la capa basal del epitelio de la mama. La enfermedad ER+ y con HER2 amplificado puede aparecer en los dos subtipos, mientras que los cánceres de mama "triple negativos" generalmente son del subtipo basal (véase, por 45 ejemplo, Sorlie T y col., Proc Natl Acad Sci USA. 11 Sep 2001; 98: 10869-74; Sotiriou C, y col., Proc Natl Acad Sci USA. 2 Sep 2003; 100(18): 10393-8; Perou CM, y col., Nature. 17 Agosto 2000; 406(6796): 747-52; y Wilson Ca y col., Breast Cancer Res. 2004; 6(5): 192-200). Además, existe una subserie de cánceres de mama "triple negativos" que también expresan vimentina. Se cree que este grupo representa un grupo de cánceres de mama que ha experimentado una transición de epitelial a mesenquimática (EMT) y se ha asociado con la enfermedad clínica que es más invasiva, tiene 50 un mayor índice mitótico y también tiene peores consecuencias clínicas (véase, por ejemplo, Thomas PA, y col., Clin Cancer Res. Oct 1999; 5(10): 2698-703 y Laakso M, y col., Clin Cancer Res. 15 Jul 2006; 12(14 Pt 1): 4185-91). Considerados conjuntamente, estos datos demuestran que la identificación de nuevas terapias con actividad en el subtipo basal del cáncer de mama es una prioridad clínica.
SUMARIO DE LA INVENCIÓN 55
Los presentes inventores han descubierto que ciertos genes se expresan de forma diferencial en subtipos de cáncer de mama que son sensibles a la terapia con inhibidores de la quinasa src. En particular, los presentes inventores
han descubierto que los genes de moesina, caveolina 1 y proteína 1 asociada a yes se expresan de forma diferencial en subtipos de cáncer de mama que son sensibles a la terapia con N-(2-cloro-6-metilfenil)-2-(6-(4-(2-hidroxietil)piperazin-1-il)-2-metilpirimidin-4-ilamino)tiazol-5-carboxamida.
Como también se sabe en la técnica, N-(2-cloro-6-metilfenil)-2-[[6-[4-(2-hidroxietil)-1-piperazinil]-2-metil-4-pirimidinil]amino]-5-tiazolcarboxamida se refiere a un compuesto que tiene la siguiente estructura (1): 5
El compuesto (I) también puede denominarse N-(2-cloro-6-metilfenil)-2-((6-(4-(2-hidroxietil)-1-piperazinil)-2-metil-4-pirimidinil)amino)-1,3-tiazol-5-carboxamida de acuerdo con la nomenclatura IUPAC. El uso del término incluye (a menos que se indique otra cosa) solvatos (incluyendo hidratos) y formas polimórficas del compuesto (I) o sus sales (tal como la forma monohidrato de (I) descrita en el documento USSN 11/051.208, presentado el 4 de febrero de 2005. 10
Las composiciones farmacéuticas de N-(2-cloro-6-metilfenil)-2-[[6-[4-(2-hidroxietil)-1-piperazinil]-2-metil-4-pirimidinil]amino]-5-tiazolcarboxamida incluyen todas las composiciones farmacéuticamente aceptables que comprenden N-(2-cloro-6-metilfenil)-2-[[6-[4-(2-hidroxietil)-1-piperazinil]-2-metil-4-pirimidinil]amino]-5-tiazolcarboxamida y uno o más diluyentes, vehículos y/o excipientes, tales como las composiciones descritas en el documento USSN 11/402.502, presentado el 12 de abril de 2006. Un ejemplo de una composición farmacéutica que comprende N-(2-cloro-6-metilfenil)-15 2-[[6-[4-(2-hidroxietil)-1-piperazinil]-2-metil-4-pirimidinil]amino]-5-tiazolcarboxamida es SPRYCEL™ (Bristol-Myers Squibb Company). SPRYCEL™ comprende N-(2-cloro-6-metilfenil)-2-[[6-[4-(2-hidroxietil)-1-piperazinil]-2-metil-4-pirimidinil] amino]-5-tiazolcarboxamida como principio activo, también denominado dasatinib, y como ingredientes inactivos o excipientes lactosa monohidrato, celulosa microcristalina, croscarmelosa sódica, hidroxipropil celulosa y estearato de magnesio en un comprimido que comprende hipromelosa, dióxido de titanio y polietilenglicol. 20
La N-(2-cloro-6-metilfenil)-2-[[6-[4-(2-hidroxietil)-1-piperazinil]-2-metil-4-pirimidinil]amino]-5-tiazolcarboxamida, también conocida como dasatinib (BMS-354825), es un inhibidor de quinasa multidirigido, oral, muy potente, que se dirige a las quinasas BCR-ABL y SRC con valores de CI50 para las quinasas aisladas de 0,55 y 3,0 nM, respectivamente. El dasatinib es un inhibidor de quinasa de molécula pequeña activo por vía oral, tanto de la proteína src como de la proteína abl. Es un inhibidor de quinasa SFK/Ab1 basado en tiazol y pirimidina (véase, por ejemplo, 25 Nam, Sangkil y col., Cancer Research 65, 9185-9189, 15 Oct, 2005; Lombardo LJ y col., J Med Chem, 30 Dic 2004; 47(27): 6658-61; y NDA 21-986, documento ODAC bricfmg). El dasatinib también inhibe otras quinasas oncogénicas tales como c KIT, el receptor del factor de crecimiento derivado de plaquetas y quinasas receptoras de efrina A). A diferencia de imatinib, que se une sólo a la conformación inactiva, el dasatinib se une tanto a la conformación activa o "abierta" como a la conformación inactiva o "cerrada" del dominio quinasa ABL de BCR-ABL. 30
La estructura y uso de N-(2-cloro-6-metilfenil)-2-[[6-[4-(2-hidroxietil)-1-piperazinil]-2-metil-4-pirimidinil]amino]-5-tiazolcarboxamida como agente anticanceroso se describe en Lombardo, L. J., y col., J. Med. Chem., 47: 6658-6661 (2004) y se describe en la siguientes patentes de Estados Unidos y solicitudes en trámite: Patente de Estados Unidos Nº 6.596.746, concedida el 22 de julio de 2003; número de Serie de Estados Unidos 10/395.503, presentada el 24 de marzo de 2003. 35
Los genes de moesina, caveolina 1 y proteína 1 asociada a yes se denominan en el presente documento serie de genes MCY. MCY es un término usado en el presente documento para hacer referencia a la moesina, caveolina 1 o proteína 1 asociada a yes o cualquier combinación de las mismas. Los polinucleótidos de MCY se refrieren a polinucleótidos de moesina, caveolina 1 o proteína 1 asociada a yes o cualquier combinación de los mismos (es decir, polinucleótidos de moesina; polinucleótidos de caveolina 1; polinucleótidos de proteína 1 asociada a yes; polinucleótidos 40 de moesina y caveolina 1; polinucleótidos de moesina y proteína 1 asociada a yes; polinucleótidos de caveolina 1 y proteína 1 asociada a yes; y polinucleótidos de moesina, caveolina 1 y proteína 1 asociada a yes) y polipéptidos de MCY se refiere a polipéptidos de moesina, caveolina 1 o proteína 1 asociada a yes o cualquier combinación de los mismos (es decir, polipéptidos de moesina; polipéptidos de caveolina 1; polipéptidos de proteína 1 asociada a yes; polipéptidos de moesina y caveolina 1; polipéptidos de moesina y proteína 1 asociada a yes; polipéptidos de caveolina 1 45 y proteína 1 asociada a yes; y polipéptidos de moesina, caveolina 1 y proteína 1 asociada a yes).
Se ha descubierto que la mayoría de las líneas celulares de cáncer de mama sensibles a la molécula quimioterapéutica dasatinib representan el subtipo "no luminal" de cáncer de mama ("basal" y "mesenquimático"). Pueden usarse procedimientos para examinar la expresión de las series de genes proporcionadas en el presente
documento para predecir la respuesta a agentes tales como N-(2-cloro-6-metilfenil)-2-[[6-[4-(2-hidroxietil)-1-piperazinil]-2-metil-4-pirimidinil]amino]-5-tiazolcarboxamida, o una sal, solvato o hidrato farmacéuticamente aceptable de la misma en células de cáncer de mama humano.
La presente invención proporciona procedimientos para identificar células e individuos que probablemente responden o son sensibles a la terapia con N-(2-cloro-6-metilfenil)-2-[[6-[4-(2-hidroxietil)-1-piperazinil]-2-metil-4-5 pirimidinil]amino]-5-tiazolcarboxamida, o una sal o hidrato farmacéuticamente aceptable de la misma.
En el presente documento se proporcionan procedimientos para identificar una célula que es probable que responda o sea sensible a la terapia con N-(2-cloro-6-metilfenil)-2-[[6-[4-(2-hidroxietil)-1-piperazinil]-2-metil-4-pirimidinil]amino]-5-tiazolcarboxamida, o una sal o hidrato farmacéuticamente aceptable de la misma. Estos procedimientos pueden comprender determinar en una muestra biológica el nivel de expresión de al menos un gen 10 seleccionado entre moesina, caveolina 1 o proteína 1 asociada a yes, siendo el nivel de expresión indicativo de si la célula es sensible a la terapia con N-(2-cloro-6-metilfenil)-2-[[6-[4-(2-hidroxietil)-1-piperazinil]-2-metil-4-pirimidinil]amino]-5-tiazolcarboxamida, o una sal o hidrato farmacéuticamente aceptable de la misma. Los procedimientos incluyen determinar en una muestra biológica el nivel de expresión de dos genes seleccionados entre moesina, caveolina 1 o proteína 1 asociada a yes (es decir, moesina y caveolina 1, moesina y proteína 1 asociada a yes y caveolina 1 y 15 proteína asociada a yes) y determinar el nivel de expresión de los tres genes. En ciertas realizaciones preferidas, los niveles elevados de polipéptidos y/o polinucleótidos de MCY son indicativos de sensibilidad a la terapia con N-(2-cloro-6-metilfenil)-2-[[6-[4-(2-hidroxietil)-1-piperazinil]-2-metil-4-pirimidinil]amino]-5-tiazolcarboxamida o una sal o hidrato farmacéuticamente aceptable de la misma.
La invención proporciona procedimientos para detectar la expresión de al menos un gen, al menos dos genes o 20 los tres genes de la serie de genes MCY. Los procedimientos incluyen la detección de la expresión de los polinucleótidos y proteínas codificados por los polinucleótidos presentes en diversas muestras biológicas (por ejemplo, biopsias de cáncer de mama), así como procedimientos para identificar células que expresan al menos un gen, al menos dos genes o los tres genes en la serie de genes MCY.
En el presente documento se proporcionan procedimientos para determinar el nivel de polipéptidos o 25 polinucleótidos de MCY en una muestra de tejido que tiene o que se sospecha que tiene alguna forma de desregulación del crecimiento, tal como la encontrada en diversos cánceres de mama, por ejemplo, los subtipos basales descritos en Sorlie y col., PNAS (2001), 98(19): 10869-10874. Dichos procedimientos pueden usarse para predecir la sensibilidad a la N-(2-cloro-6-metilfenil)-2-[[6-[4-(2-hidroxietil)-1-piperazinil]-2-metil-4-pirimidinil]amino]-5-tiazolcarboxamida, o una sal o hidrato farmacéuticamente aceptable de la misma. 30
También se proporcionan en el presente documento procedimientos para examinar una muestra biológica de ensayo que comprende una célula de mama humana con respecto a los indicios de expresión génica indicativa de sensibilidad al tratamiento con N-(2-cloro-6-metilfenil)-2-[[6-[4-(2-hidroxietil)-1-piperazinil]-2-metil-4-pirimidinil]amino]-5-tiazolcarboxamida, o una sal o hidrato farmacéuticamente aceptable de la misma mediante la determinación de los niveles de polinucleótidos de moesina, caveolina 1 y/o proteína 1 asociada a yes (polinucleótidos de MCY) que codifican 35 los polipéptidos de MCY, en la muestra biológica, siendo los niveles de al menos uno de los polinucleótidos de MCY en la muestra de ensayo indicativos de sensibilidad al tratamiento. En ciertas realizaciones, los niveles de polinucleótidos de MCY en la célula se determinan poniendo en contacto la muestra con un polinucleótido complementario que hibrida con una secuencia de nucleótidos mostrada en la Tabla 1 (o una secuencia de nucleótidos que tiene una identidad sustancial con una secuencia mostrada en la Tabla 1), o un complemento de la misma, y evaluando la presencia de un 40 complejo de hibridación formado por la hibridación del polinucleótido de MCY con el polinucleótido complementario en la muestra biológica de ensayo. De esta manera, pueden determinarse los niveles de uno, dos o los tres polinucleótidos de MCY. En ciertas realizaciones de la invención, el cáncer de mama es de un subtipo no luminal. En ciertos aspectos, el cáncer de mama es de subtipo mesenquimático o basal. En ciertas realizaciones preferidas, los niveles elevados de polinucleótidos de MCY son indicativos de sensibilidad a la terapia con N-(2-cloro-6-metilfenil)-2-[[6-[4-(2-hidroxietil)-1-45 piperazinil]-2-metil-4-pirimidinil]amino]-5-tiazolcarboxamida, o una sal o hidrato farmacéuticamente aceptable de la misma.
Una realización relacionada es un procedimiento para examinar una célula de mama humana con respecto a los indicios de expresión génica indicativa de sensibilidad al tratamiento con N-(2-cloro-6-metilfenil)-2-[[6-[4-(2-hidroxietil)-1-piperazinil]-2-metil-4-pirimidinil]amino]-5-tiazolcarboxamida, o una sal o hidrato farmacéuticamente 50 aceptable de la misma mediante la determinación en una muestra biológica de los niveles de polinucleótido de moesina y/o caveolina 1 y/o proteína 1 asociada a yes (incluyendo cualquier combinación de las mismas) que codifica un polipéptido de MCY (por ejemplo, el polipéptido mostrado en la Tabla 1) en la célula de mama humana, siendo la expresión de un polinucleótido de MCY en la muestra de ensayo indicativa de sensibilidad al tratamiento. En ciertas realizaciones, la expresión de un polinucleótido de MCY en la célula de mama humana se determina poniendo en 55 contacto al menos una de las secuencias polinucleotídicas de MCY endógenas en la célula de mama humana con un polinucleótido complementario (por ejemplo, una sonda marcada con un marcador de detección o un cebador de PCR) que hibrida específicamente con una secuencia de nucleótidos de MCY (por ejemplo, una secuencia de nucleótidos mostrada en la Tabla 1 o que tiene una identidad sustancial con una secuencia de nucleótidos de la Tabla 1) y evaluando la presencia de un complejo de hibridación formado por la hibridación del polinucleótido complementario de 60 MCY con el polinucleótido de MCY en la muestra (por ejemplo, por análisis de Northern o PCR), de forma que se
examinan los indicios de sensibilidad a N-(2-cloro-6-metilfenil)-2-[[6-[4-(2-hidroxietil)-1-piperazinil]-2-metil-4-pirimidinil]amino]-5-tiazolcarboxamida, o una sal o hidrato farmacéuticamente aceptable de la misma. De esta manera pueden determinarse los niveles de uno, dos o los tres polinucleótidos de MCY. Ciertas realizaciones de la invención incluyen además la etapa de examinar la expresión de otros genes tales como examinar los niveles de los polinucleótidos proporcionados en las Tablas 5a-h, Her-2 (SEC ID Nº: 9), receptor de estrógenos (SEC ID Nº: 7), 5 receptor de progesterona (SEC ID Nº: 8), BRCA1 y/o BRCA2 o similares en la muestra biológica de ensayo.
Una realización relacionada de la invención es un procedimiento para examinar una célula de mama humana (por ejemplo, de una biopsia) con respecto a los indicios de expresión génica indicativa de sensibilidad a N-(2-cloro-6-metilfenil)-2-[[6-[4-(2-hidroxietil)-1-piperazinil]-2-metil-4-pirimidinil]amino]-5-tiazolcarboxamida, o una sal o hidrato farmacéuticamente aceptable de la misma, comprendiendo el procedimiento determinar en una muestra biológica los 10 niveles de polipéptido de moesina, y/o caveolina 1 y/o proteína 1 asociada a yes (incluyendo cualquier combinación de las mismas) (por ejemplo, un polipéptido que tiene una secuencia mostrada en la Tabla 1 o una identidad sustancial con una secuencia como la mostrada en la Tabla 1) en la célula de mama, proporcionando el nivel del polipéptido de MCY en la célula de mama humana indicios de sensibilidad. En ciertas realizaciones, los niveles del polipéptido de MCY en la célula se determinan poniendo en contacto la muestra con un anticuerpo (por ejemplo, uno marcado con un marcador 15 de detección) que se une de forma inmunoespecífica a una secuencia del polipéptido de MCY (por ejemplo, una secuencia mostrada en la Tabla 1 o que tiene una identidad sustancial con una secuencia mostrada en la Tabla 1) y evaluando la presencia de un complejo formado por la unión del anticuerpo con el polipéptido de MCY en la muestra. De esta manera pueden determinarse los niveles de uno, dos o los tres polipéptidos de MCY. En ciertos aspectos, la presencia de un complejo se evalúa por un procedimiento seleccionado del grupo que consiste en análisis ELISA, 20 análisis de Western e inmunohistoquímica. En ciertas realizaciones de la invención, el cáncer de mama es de tipo no luminal. En ciertos aspectos, el cáncer de mama es de tipo mesenquimático o basal. Cierta realización de la invención incluye además la etapa de examinar la expresión y/o secuencias de otros polipéptidos tales como uno o más polipéptidos identificados en la Tabla 5a-h, Her-2, receptor de estrógenos, receptor de progesterona, BRCA1 y/o BRCA2 o similares en la muestra biológica de ensayo. En ciertas realizaciones preferidas, los niveles elevados de polipéptidos 25 de MCY son indicativos de sensibilidad a la terapia con N-(2-cloro-6-metilfenil)-2-[[6-[4-(2-hidroxietil)-1-piperazinil]-2-metil-4-pirimidinil]amino]-5-tiazolcarboxamida, o una sal o hidrato farmacéuticamente aceptable de la misma.
También se proporcionan en el presente documento procedimientos para determinar la capacidad de respuesta de un individuo con cáncer a la terapia con N-(2-cloro-6-metilfenil)-2-[[6-[4-(2-hidroxietil)-1-piperazinil]-2-metil-4-pirimidinil]amino]-5-tiazolcarboxamida, o una sal o hidrato farmacéuticamente aceptable de la misma. Estos 30 procedimientos pueden comprender determinar el nivel de polinucleótidos o polipéptidos de MCY, siendo el nivel indicativo de si el individuo es sensible a la terapia. Estos procedimientos incluyen determinar el nivel de un polinucleótido y/o polipéptido de MCY (es decir, determinar el nivel de polipéptidos de moesina o polinucleótidos de moesina), determinar el nivel de dos polinucleótidos y/o polipéptidos de MCY (es decir, determinar el nivel de polinucleótidos y/o polipéptidos de moesina y caveolina 1; polinucleótidos y/o polipéptidos de moesina y proteína 1 35 asociada a yes; y/o polinucleótidos y/o polipéptidos de caveolina 1 y proteína asociada a yes) y/o determinar el nivel de los tres polinucleótidos y/o polipéptidos de MCY. En ciertas realizaciones preferidas, los niveles elevados de polipéptidos y/o polinucleótidos de MCY son indicativos de que el individuo responde a la terapia con N-(2-cloro-6-metilfenil)-2-[[6-[4-(2-hidroxietil)-1-piperazinil]-2-metil-4-pirimidinil] amino]-5-tiazolcarboxamida, o una sal o hidrato farmacéuticamente aceptable de la misma. 40
La presente invención proporciona procedimientos para explorar una muestra biológica, por ejemplo, una muestra biológica que comprende células que no responden, o que han dejado de responder, o que tienen una respuesta disminuida, a la terapia con N-(2-cloro-6-metilfenil)-2-[[6-[4-(2-hidroxietil)-1-piperazinil]-2-metil-4-pirimidinil]amino]-5-tiazolcarboxamida, o una sal o hidrato farmacéuticamente aceptable de la misma o terapias alternativas para el cáncer. Por ejemplo, la presente invención proporciona un procedimiento para explorar células de un 45 individuo que padece cáncer que se está tratando con N-(2-cloro-6-metilfenil)-2-[[6-[4-(2-hidroxietil)-1-piperazinil]-2-metil-4-pirimidinil]amino]-5-tiazolcarboxamida, o una sal o hidrato farmacéuticamente aceptable de la misma u otra terapia, y cuyas células no responden o han dejado de responder o han disminuido la respuesta a cualquiera de los fármacos, con respecto al nivel de polinucleótidos y/o polipéptidos de MCY. Estos procedimientos incluyen determinar en una muestra biológica el nivel de un polinucleótido y/o polipéptido de MCY (es decir, determinar el nivel de polipéptidos de moesina o 50 polinucleótidos de moesina), determinar el nivel de dos polinucleótidos y/o polipéptidos de MCY (es decir, determinar el nivel de polinucleótidos y/o polipéptidos de moesina y caveolina 1; polinucleótidos y/o polipéptidos de moesina y proteína 1 asociada a yes; y/o polinucleótidos y/o polipéptidos de caveolina 1 y proteína asociada a yes) y/o determinar el nivel de los tres polinucleótidos y/o polipéptidos de MCY.
La presente invención también proporciona procedimientos para establecer un régimen de tratamiento para un 55 individuo que tiene cáncer, y en particular cáncer de mama. El régimen de tratamiento puede comprender la administración de N-(2-cloro-6-metilfenil)-2-[[6-[4-(2-hidroxietil)-1-piperazinil]-2-metil-4-pirimidinil]amino]-5-tiazolcarboxamida, o una sal o hidrato farmacéuticamente aceptable de la misma a dosis diferentes dependiendo del nivel de polipéptidos y/o polinucleótidos de MCY en una muestra biológica obtenida del individuo. Estos procedimientos incluyen determinar el nivel de un polinucleótido y/o polipéptido de MCY (es decir, determinar el nivel de polipéptidos de 60 moesina o polinucleótidos de moesina), determinar el nivel de dos polinucleótidos y/o polipéptidos de MCY (es decir, determinar el nivel de polinucleótidos y/o polipéptidos de moesina y caveolina 1; polinucleótidos y/o polipéptidos de moesina y proteína 1 asociada a yes; y/o polinucleótidos y/o polipéptidos de caveolina 1 y proteína asociada a yes) y/o
determinar el nivel de los tres polinucleótidos y/o polipéptidos de MCY.
La presente invención también proporciona N-(2-cloro-6-metilfenil)-2-[[6-[4-(2-hidroxietil)-1-piperazinil]-2-metil-4-pirimidinil]amino]-5-tiazolcarboxamida, o una sal o hidrato farmacéuticamente aceptable de la misma para su uso en el tratamiento de un individuo que padece cáncer (por ejemplo, cáncer de mama, incluyendo cáncer de mama de cualquier tipo descrito en el presente documento), estando el nivel de polinucleótidos y/o polipéptidos de MCY en una muestra 5 biológica obtenida del individuo aumentado en comparación con una muestra de control. Esto puede incluir la etapa de determinar el nivel de un polinucleótido y/o polipéptido de MCY (es decir, determinar el nivel de polipéptidos de moesina o polinucleótidos de moesina), determinar el nivel de dos polinucleótidos y/o polipéptidos de MCY (es decir, determinar el nivel de polinucleótidos y/o polipéptidos de moesina y caveolina 1; polinucleótidos y/o polipéptidos de moesina y proteína 1 asociada a yes; y/o polinucleótidos y/o polipéptidos de caveolina 1 y proteína asociada a yes) y/o determinar 10 el nivel de los tres polinucleótidos y/o polipéptidos de MCY.
La presente invención también proporciona N-(2-cloro-6-metilfenil)-2-[[6-[4-(2-hidroxietil)-1-piperazinil]-2-metil-4-pirimidinil]amino]-5-tiazolcarboxamida, o una sal, solvato o hidrato farmacéuticamente aceptable de la misma para su uso en el tratamiento de un individuo que tiene cáncer que es particularmente agresivo y puede caracterizarse como triple negativo o de subtipo basal. Un mayor nivel de expresión de al menos uno, dos o tres genes seleccionados de 15 moesina, caveolina 1 o proteína 1 asociada a yes es indicativo de que el cáncer es particularmente agresivo, triple negativo y/o de subtipo basal. Puede determinarse el nivel de expresión de cualquier combinación de los tres genes. En ciertas realizaciones, si el individuo se identifica como un individuo que tiene un cáncer particularmente agresivo (es decir cáncer triple negativo, cáncer de subtipo basal), esto puede comprender además la etapa de administrar N-(2-cloro-6-metilfenil)-2-[[6-[4-(2-hidroxietil)-1-piperazinil]-2-metil-4-pirimidinil] amino]-5-tiazolcarboxamida, o una sal, solvato 20 o hidrato farmacéuticamente aceptable de la misma al individuo.
La presente invención también proporciona kits para caracterizar células de mamífero y determinar la capacidad de respuesta de un individuo a la terapia con N-(2-cloro-6-metilfenil)-2-[[6-[4-(2-hidroxietil)-1-piperazinil]-2-metil-4-pirimidinil]amino]-5-tiazolcarboxamida, o una sal o hidrato farmacéuticamente aceptable de la misma. El kit puede comprender un recipiente, una etiqueta sobre dicho recipiente y una composición contenida dentro de dicho 25 recipiente; en el que la composición incluye anticuerpos específicos del polipéptido de MCY (y/o uno o más polinucleótidos identificados en las Tablas a-b) y/o polinucleótidos que hibridan con un complemento de un polinucleótido de MCY (por ejemplo un polinucleótido mostrado en la Tabla 1) en condiciones rigurosas o se une a un polipéptido de MCY codificado por el polinucleótido de MCY (por ejemplo, tal como el mostrado en la Tabla 1). En ciertos aspectos, la etiqueta en dicho recipiente indicará que la composición puede usarse para determinar el nivel de 30 proteína, ARN o ADN de MCY al menos en un tipo de célula de mamífero, e instrucciones para usar el anticuerpo y/o polinucleótido de la serie de genes MCY para evaluar la presencia de proteína, ARN o ADN de MCY en al menos un tipo de célula de mamífero.
Aunque la serie de genes MCY se proporciona como un ejemplo ilustrativo de una serie de genes cuya expresión puede correlacionarse con la sensibilidad a fármacos tales como la N-(2-cloro-6-metilfenil)-2-[[6-[4-(2-35 hidroxietil)-1-piperazinil]-2-metil-4-pirimidinil]amino]-5-tiazolcarboxamida, o una sal o hidrato farmacéuticamente aceptable de la misma, los expertos en la materia apreciarán que los datos proporcionados en el presente documento en relación con otros genes, por ejemplo los genes que tienen productos de expresión identificados en las Tablas 5(a-h), se proporcionan para demostrar que esta divulgación se va a usar para seleccionar otros grupos de genes cuya expresión también se correlaciona con la sensibilidad a fármacos tales como la N-(2-cloro-6-metilfenil)-2-[[6-[4-(2-40 hidroxietil)-1-piperazinil]-2-metil-4-pirimidinil]amino]-5-tiazolcarboxamida, o una sal o hidrato farmacéuticamente aceptable de la misma. Por consiguiente, los análisis en el presente documento en relación con el uso de la serie MCY simplemente se proporcionan como un ejemplo típico y esta divulgación es aplicable adicionalmente a los datos proporcionados que se refieren a polinucleótidos y polipéptidos adicionales (por ejemplo, los identificados en las Tablas 5(a-h) que pueden examinarse para predecir la sensibilidad a fármacos tales como la N-(2-cloro-6-metilfenil)-2-[[6-[4-(2-45 hidroxietil)-1-piperazinil]-2-metil-4-pirimidinil]amino]-5-tiazolcarboxamida, o una sal o hidrato farmacéuticamente aceptable de la misma.
BREVE DESCRIPCIÓN DE LOS DIBUJOS
La Figura 1 proporciona un diagrama de grupos de la expresión relativa de genes de marcadores luminales y basales incluyendo las citoqueratinas (KRT) 5, 17 y 8, 18 respectivamente, así como vimentina (VIM). 50
La Figura 2 muestra 39 líneas celulares de cáncer de mama con expresión relativa de moesina (MSN), caveolina 1 (CAV 1) y proteína 1 asociada a yes (YAP1) basada en perfiles de expresión Agilent basales. A cada línea celular se le asigna una respuesta basada en la Tabla 2 (R=resistente, M=moderadamente sensible, S=muy sensible).
DESCRIPCIÓN DETALLADA DE REALIZACIONES ILUSTRATIVAS
I. Introducción 55
Los presentes inventores han descubierto ciertos genes que se expresan diferencialmente en células cancerosas que son sensibles a la terapia con la N-(2-cloro-6-metilfenil)-2-[[6-[4-(2-hidroxietil)-1-piperazinil]-2-metil-4-pirimidinil]amino]-5-tiazolcarboxamida. La presente invención, por lo tanto, proporciona, entre otras cosas,
procedimientos para usar los productos de expresión de los genes para identificar células cancerosas que responderán a la terapia con N-(2-cloro-6-metilfenil)-2-[[6-[4-(2-hidroxietil)-1-piperazinil]-2-metil-4-pirimidinil] amino]-5-tiazolcarboxamida, o una sal, solvato o hidrato farmacéuticamente aceptable de la misma, así como procedimientos para identificar sujetos que tienen cáncer que serán respondedores positivos a la terapia con N-(2-cloro-6-metilfenil)-2-[[6-[4-(2-hidroxietil)-1-piperazinil]-2-metil-4-pirimidinil]amino]-5-tiazolcarboxamida, o una sal, solvato o hidrato 5 farmacéuticamente aceptable de la misma. Los inventores han descubierto, en particular, que niveles elevados de los productos de expresión de los genes son indicativos de sensibilidad a la terapia con N-(2-cloro-6-metilfenil)-2-[[6-[4-(2-hidroxietil)-1-piperazinil]-2-metil-4-pirimidinil]amino]-5-tiazolcarboxamida.
Un biomarcador es una biomolécula orgánica que está presente de forma diferencial en una muestra tomada de un sujeto de un estado fenotípico (por ejemplo, que tiene una enfermedad sensible a la terapia con dasatinib) en 10 comparación con otro estado fenotípico (por ejemplo, que tiene una enfermedad resistente a la terapia con dasatinib). Un biomarcador está presente diferencialmente entre diferentes estados fenotípicos si la media o mediana del nivel de expresión del biomarcador en los diferentes grupos, según se calcula, es estadísticamente significativa. Los ensayos comunes para significado estadístico incluyen, entre otros, el ensayo t, ANOVA, Kruskal-Wallis, Wilcoxon, Mann-Whitney y razón de posibilidades (odds ratio). Los biomarcadores, solos o en combinación, pueden proporcionar 15 medidas del riesgo relativo de que un sujeto pertenezca a un estado fenotípico u otro. Por lo tanto, son útiles como marcadores de enfermedad (diagnóstico), de eficacia terapéutica de un fármaco (teranóstico) y de toxicidad de un fármaco. El polinucleótido y los polipéptidos descritos en el presente documento pueden usarse como biomarcadores para ciertos cánceres descritos en el presente documento. En particular, los presentes inventores han identificado tres genes, moesina ("MSN"), caveolina 1 ("CAV 1") y proteína 1 asociada a yes ("YAP1") que se expresan diferencialmente 20 en células cancerosas que son sensibles en la terapia con N-(2-cloro-6-metilfenil)-2-[[6-[4-(2-hidroxietil)-1-piperazinil]-2-metil-4-pirimidinil]amino]-5-tiazolcarboxamida. En ciertas realizaciones, estos tres genes se expresan diferencialmente en líneas de células de cáncer de mama de tipo basal/"triple negativo".
A menos que se definan de otra manera, todos los términos de la técnica, notaciones y otra terminología científica usada en el presente documento pretenden tener los significados entendidos comúnmente por los expertos en 25 la materia a la que pertenece la presente invención. En algunos casos, términos con significados entendidos comúnmente se definen en el presente documento por claridad y para facilitar la referencia, y no debe considerarse necesariamente que la inclusión de dichas definiciones en el presente documento represente una diferencia sustancial de lo que generalmente se entiende en la técnica. Las técnicas y procedimientos descritos o mencionados en el presente documento generalmente se entienden bien y se emplean comúnmente usando la metodología convencional 30 por los expertos en la materia, tales como, por ejemplo, las metodologías de clonación molecular utilizadas ampliamente descritas en Ausubel y col., eds., 1995, Current Protocols in Molecular Biology, Wiley and Sons). Cuando es apropiado, generalmente se realizan procedimientos que implican el uso de kits y reactivos disponibles en el mercado de acuerdo con protocolos y/o parámetros definidos por el fabricante a menos que se indique otra cosa.
Debe entenderse que la presente invención no se limita a procedimientos, reactivos, compuestos, 35 composiciones o sistemas biológicos particulares que, por supuesto, pueden variar. También debe entenderse que la terminología usada en el presente documento únicamente tiene el objetivo de describir aspectos particulares y no debe considerarse limitante. Como se usa en esta memoria descriptiva y las reivindicaciones adjuntas, las formas singulares "un", "una" y "el", "la" incluyen los referentes plurales a menos que el contexto dicte claramente otra cosa. De esta manera, por ejemplo, la referencia a "un péptido" incluye una combinación de dos o más péptidos, y similares. 40
"Aproximadamente", como se usa en el presente documento cuando hace referencia a un valor medible tal como una cantidad, una duración temporal y similar, se entiende que incluye variaciones de  20% o  10%, más preferentemente  5%, incluso más preferentemente  1% y aún más preferentemente  0,1% del valor especificado, ya que dichas variaciones son apropiadas para realizar los procedimientos desvelados.
Como se usa en el presente documento, la expresión "polinucleótido" significa una forma polimérica de 45 nucleótidos de al menos aproximadamente 10 bases o pares de bases de longitud, ribonucleótidos o desoxinucleótidos o una forma modificada de cualquier tipo de nucleótido, y se entiende que incluye formas mono- y bicatenarias de ADN.
Como se usan en el presente documento, los términos "polipéptido", "péptido" y "proteína" se usan indistintamente en el presente documento para hacer referencia a un polímero de al menos aproximadamente 6 aminoácidos. A lo largo de la memoria descriptiva, se usan las designaciones de aminoácidos convencionales de tres 50 letras o de una sola letra. Los términos se aplican a polímeros de aminoácidos en los que uno o más restos de aminoácidos son un mimético químico artificial de un aminoácido natural correspondiente, así como a polímeros de aminoácidos naturales y polímeros de aminoácidos no naturales.
Un gen de moesina de tipo silvestre se refiere a un gen de moesina natural. Un polipéptido de moesina de tipo silvestre se refiere a un polipéptido de moesina natural, es decir, un polipéptido de moesina que tiene la misma 55 secuencia de aminoácidos que puede encontrarse en la naturaleza. Un polinucleótido de moesina de tipo silvestre se refiere a un polinucleótido de moesina natural, es decir, un polinucleótido de moesina que tiene la misma secuencia de ácido nucleico que puede encontrarse en la naturaleza. El término incluye específicamente, por ejemplo, formas truncadas naturales de moesina, formas variantes naturales (por ejemplo, formas de corte y empalme alternativas) y variantes alélicas naturales. Se sabe que la moesina es una proteína de unión del citoesqueleto submembranoso que 60
juega un papel clave en el control de la morfología, adhesión y motilidad celular (Kobayashi y col., Clinical Cancer Research, 10, 572-580, 2004, y se ha descrito como marcador de adenocarcinomas de colon y ovario (Nishizuka y col., Cancer Research, 63: 5243-5250, 2003).
Un gen de caveolina 1 de tipo silvestre se refiere a un gen de caveolina 1 natural. Un polipéptido de caveolina 1 de tipo silvestre se refiere a un polipéptido de caveolina 1 natural, es decir, un polipéptido de caveolina 1 que tiene la 5 misma secuencia de aminoácidos que puede encontrarse en la naturaleza. Un polinucleótido de caveolina 1 de tipo silvestre se refiere a un polinucleótido de caveolina 1 natural, es decir un polinucleótido de caveolina 1 que tiene la misma secuencia de ácido nucleico que puede encontrase en la naturaleza. El término incluye específicamente, por ejemplo, formas truncadas naturales de caveolina 1, formas variantes naturales (por ejemplo, formas de corte y empalme alternativo) y variantes alélicas naturales. Se sabe que la caveolina 1 es un constituyente estructural esencial 10 de las caveolas que se ha implicado en la señalización miogénica (Fiucci y col., Oncogene, 2002 4; 21(15) 2365-2375, incorporado en el presente documento como referencia en su totalidad y para todos los fines) y se ha descrito como un marcador de carcinoma renal de células claras (Joo y col., BJU International, 93: 291-296).
Un gen de la proteína 1 asociada a yes de tipo silvestre se refiere a un gen de la proteína 1 asociada a yes natural. Un polipéptido de la proteína 1 asociada a yes de tipo silvestre se refiere a un polipéptido de la proteína 1 15 asociada a yes natural, es decir, un polipéptido de la proteína 1 asociada a yes que tiene la misma secuencia de aminoácidos que puede encontrarse en la naturaleza. Un polinucleótido de la proteína 1 asociada a yes de tipo silvestre se refiere a un polinucleótido de la proteína 1 asociada a yes natural, es decir, un polinucleótido de la proteína 1 asociada a yes que tiene la misma secuencia de ácido nucleico que puede encontrarse en la naturaleza. El término específicamente incluye, por ejemplo, formas truncadas naturales de caveolina 1, formas variantes naturales (formas de 20 corte y empalme alternativo) y variantes alélicas naturales. Se sabe que la proteína 1 asociada a yes es una fosfoproteína rica en prolina que se une al dominio SH3 del producto del proto-oncogén Yes (Sudol, Oncogene, 1994, 9(8) 2145-2152).
La frase "se une específicamente a" se refiere a una reacción de unión que es determinativa de la presencia de una diana en presencia de una población heterogénea de otros productos biológicos. De esta manera, en las 25 condiciones de ensayo diseñadas, la región de unión especificada se une preferentemente a una diana particular y no se une en una cantidad significativa a otros componentes presentes en una muestra de ensayo. La unión específica a una diana en estas condiciones puede requerir un resto de unión que se selecciona por su especificidad por una diana particular. Puede usarse una diversidad de formatos de ensayo para seleccionar regiones de unión que sean específicamente reactivas con un analito particular. Típicamente, una reacción específica o selectiva será al menos dos 30 veces la señal de fondo o las interferencias y más típicamente más de 10 veces la señal de fondo. Para los fines de la presente invención, pueden considerarse compuestos, por ejemplo moléculas pequeñas, por su capacidad de unirse específicamente a mutantes descritos en el presente documento.
Como se usa en el presente documento, "cáncer" se refiere a cualquiera de varias enfermedades que se caracterizan por una proliferación anormal, incontrolada, de células, la capacidad de las células afectadas de extenderse 35 localmente o a través de la corriente sanguínea y el sistema linfático a otras partes del cuerpo (es decir, metastatizar) así como cualquiera de varios rasgos estructurales y/o moleculares característicos. El término cáncer incluye, pero sin limitación, cánceres de los órganos reproductores femeninos que incluyen, pero sin limitación, cáncer de ovario, cáncer cervical y cáncer uterino; cáncer pulmonar; cáncer de mama; carcinoma de células renales; linfoma de Hodgkin; linfoma no Hodgkin; cánceres del sistema genitourinario que incluyen, pero sin limitación, cáncer de riñón, cáncer de próstata, 40 cáncer de vejiga y cáncer uretral; cánceres de cabeza y cuello; cáncer de hígado; cánceres del sistema gastrointestinal que incluyen, pero sin limitación, cáncer de estómago, cáncer esofágico, cáncer del intestino delgado o cáncer de colon; cánceres del árbol biliar; cáncer pancreático; cánceres del sistema reproductivo masculino incluyendo, pero sin limitación, cáncer testicular; enfermedad trofoblástica gestacional; cánceres del sistema endocrino incluyendo, pero sin limitación, cáncer de tiroides, cáncer de paratiroides, cáncer de glándula suprarrenal, tumores carcinoides, insulinomas y 45 tumores PNET; sarcomas, incluyendo, pero sin limitación, sarcoma de Ewing, osteosarcoma, liposarcoma, leiomiosarcoma y rabdomiosarcoma; mesoteliomas; cánceres de la piel; melanomas; cánceres del sistema nervioso central; cánceres pediátricos; y cánceres del sistema hematopoyético incluyendo, pero sin limitación, todas las formas de leucemia, síndromes mielodisplásicos, trastornos mieloproliferativos y mieloma múltiple. Un cáncer triple negativo es uno que ha reducido la expresión o no tiene expresión del receptor de estrógenos, receptor de progesterona y HER2. 50
Como se usa en el presente documento, se entiende que los términos "hibridar", "hibridación", "hibrida" y similares, usados en el contexto de polinucleótidos, se refieren a condiciones de hibridación convencionales, preferentemente tales como hibridación en formamida al 50%/SSC6X/SDS al 0,1%/ADNmc 100 g/ml, en las que las temperaturas de hibridación están por encima de los 37°C y las temperaturas para el lavado en SSC 0,1X/SDS al 0,1% están por encima de 55°C, y más preferentemente a condiciones de hibridación rigurosas. 55
La "rigurosidad" de las reacciones de hibridación se puede determinar fácilmente por un experto habitual en la materia, y generalmente es un cálculo empírico dependiente de la longitud de la sonda, la temperatura de lavado y la concentración de sal. En general, las sondas más largas requieren mayores temperaturas para un templado apropiado, mientras que las sondas más cortas necesitan menores temperaturas. La hibridación generalmente depende de la capacidad del ADN desnaturalizado de volverse a emparejar cuando están presentes cadenas complementarias en un 60 entorno por debajo de su temperatura de fusión. Cuanto mayor es el grado de homología deseada entre la sonda y la
secuencia hibridable, mayor es la temperatura relativa que puede usarse. Como resultado, se deduce que las mayores temperaturas relativas tenderían a hacer las condiciones de reacción más rigurosas, mientras que las temperaturas menores menos. Para detalles adicionales y la explicación de rigurosidad de las reacciones de hibridación, véase Current Protocols in Molecular Biology, Wiley Interscience Publishers, (1995).
"Condición rigurosa" o "condiciones de alta rigurosidad", como se definen en el presente documento, pueden 5 identificarse como las que: (1) emplean baja intensidad iónica y alta temperatura para el lavado, por ejemplo, cloruro sódico 0,015 M/citrato sódico 0,0015 M/dodecil sulfato sódico al 0,1% a 50°C; (2) emplean durante la hibridación un agente desnaturalizante, tal como formamida, por ejemplo, formamida al 50% (v/v) con albúmina de suero bovino al 0,1%/Ficoll al 0,1%/polivinilpirrolidona al 0,1%/tampón fosfato sódico 50 mM a pH 6,5 con cloruro sódico 750 mM, citrato sódico 75 mM a 42°C; o (3) emplean formamida al 50%, SSC 5 x (NaCl 0,75 M, citrato sódico al 0,075 M), fosfato sódico 50 mM (pH 6,8), 10 pirofosfato sódico al 0,1%, solución de Denhardt 5 x, ADN de esperma de salmón sonicado (50 g/ml), SDS al 0,1% y sulfato de dextrano al 10% a 42°C, con lavados a 42°C en SSC 0,2 x (cloruro sódico/citrato sódico) y formamida al 50% a 55°C, seguido de un lavado de alta rigurosidad que consiste en SSC 0,1 x que contiene EDTA a 55°C.
Las condiciones de alta rigurosidad o de hibridación rigurosa ejemplares incluyen: formamida al 50%; SSC 5x y SDS al 1% incubado a 42°C o SSC 5x y SDS al 1% incubado a 65°C, con un lavado en SSC 0,2x y SDS al 1% a 65°C. 15
Las "condiciones moderadamente rigurosas" pueden identificarse como se describe por Sambrook y col. 1989, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, New York: Cold Spring Harbor Press, e incluyen el uso de solución de lavado y condiciones de hibridación (por ejemplo, temperatura, intensidad iónica y % de SDS) menos rigurosas que las descritas anteriormente. Un ejemplo de condiciones moderadamente rigurosas es incubación durante una noche a 37°C en una solución que comprende: formamida al 20%, SSC 5 x (NaCl 150 mM, citrato trisódico 15 mM), fosfato sódico 50 mM (pH 20 7,6), solución de Denhardt 5 x, sulfato de dextrano al 10%, y ADN de esperma de salmón cortado desnaturalizado a 20 mg/ml, seguido de lavado de los filtros en SSC 1x a aproximadamente 37-50ºC. El experto en la materia reconocerá cómo ajustar la temperatura, la intensidad iónica etc. cuando sea necesario para adaptarse a factores tales como la longitud de la sonda y similares.
Como se usa en el presente documento, "identidad substancial" con una secuencia especificada se refiere a 25 una identidad del 80% o mayor, es decir, un 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 91%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 99,5% o 99,9% de identidad con la secuencia especificada.
En el contexto de comparaciones de secuencias de aminoácidos, el término "identidad" se usa para expresar el porcentaje de restos de aminoácidos en las mismas posiciones relativas que son iguales. También en este contexto, el término "homología" se usa para expresar el porcentaje de restos de aminoácidos en las mismas posiciones relativas que 30 son idénticas o similares, usando los criterios de aminoácidos conservados del análisis BLAST, como se entiende generalmente en la técnica. Por ejemplo, pueden generarse valores de identidad en % por WU-BLAST-2 (Altschul y col., 1996, Methods in Enzymology 266:460-480; blast.wustl/edu/blast/README.html). A continuación se proporcionan detalles adicionales en relación con las sustituciones de aminoácidos que se consideran conservativas según estos criterios.
El término "ADNc" se refiere a ADN complementario, que son moléculas de ARNm presentes en una célula u 35 organismo que se han transformado en ADNc con una enzima tal como la transcriptasa inversa. Una "biblioteca de ADNc" es una colección de todas las moléculas de ARNm presentes en una célula u organismo, todas transformadas en moléculas de ADNc con la enzima transcriptasa inversa o un equivalente, y después insertadas en "vectores" (otras moléculas de ADN que pueden continuar replicándose después de la adición del ADN extraño). Los vectores ejemplares para las bibliotecas incluyen bacteriófagos (también conocidos como "fagos"), virus que infectan bacterias, por ejemplo fago lambda. La 40 biblioteca después puede tratarse con una sonda para el ADNc (y, por lo tanto, el ARN) específico de interés.
Como se usa en el presente documento, "expresión" se refiere al procedimiento por medio del cual los polinucleótidos se transcriben en ARNm y/o el procedimiento mediante el cual el ARNm transcrito posteriormente se traduce en polipéptidos. Si el polinucleótido procede del ADN genómico, la expresión puede incluir el corte y empalme del ARNm en una célula eucariota. "Expresado diferencialmente", cuando se aplica un gen, se refiere a la producción diferencial del ARNm 45 transcrito y/o traducido a partir del gen o el producto proteico codificado por el gen. Un gen expresado diferencialmente puede sobreexpresarse o infraexpresarse en comparación con el nivel de expresión de una célula normal o de control. En un aspecto, se refiere a un diferencial que es 1,2, 1,3, 1,4, 1,5, 2 veces, 2,5 veces, 3 veces, 4 veces, 5 veces e incluso 10 veces mayor o menor que el nivel de expresión detectado en una muestra de control. La expresión "expresado diferencialmente" también se refiere a secuencias de nucleótidos en una célula o tejido que se expresan cuando están silenciosas en una 50 célula de control o no se expresan cuando se expresan en una célula de control. El nivel de expresión de un gen MCY puede determinarse, por ejemplo, determinando el nivel de polinucleótidos y/o polipéptidos de MCY.
La frase "determinación del nivel" o "detección del nivel" o "evaluación del nivel" significa la detección de la presencia o ausencia de un analito en una muestra o la cuantificación de la cantidad en términos relativos o absolutos. Una cantidad relativa podría ser, por ejemplo, alta media o baja. Una cantidad absoluta podría reflejar la intensidad medida de 55 una señal o la traducción de esta intensidad de señal en otro formato cuantitativo, tal como microgramos/ml.
A lo largo de las subsecciones que se muestran a continuación se proporcionan definiciones adicionales.
Las siguientes secciones describen procedimientos y materiales útiles en la práctica de diversas realizaciones de la
invención desvelada en el presente documento. Las figuras y tablas proporcionadas en el presente documento incluyen la divulgación que permite la caracterización adicional del significado de genes tales como el gen de la serie de genes MCY en subtipos de cáncer de mama. La serie de genes MCY se proporciona simplemente como un ejemplo ilustrativo de una serie de genes cuya expresión puede correlacionarse con la sensibilidad a fármacos tales como N-(2-cloro-6-metilfenil)-2-[[6-[4-(2-hidroxietil)-1-piperazinil]-2-metil-4-pirimidinil]amino]-5-tiazolcarboxamida o una sal, solvato o hidrato farmacéuticamente 5 aceptable de la misma. Los expertos en la materia apreciarán que los datos proporcionados en el presente documento en relación con la expresión de otros genes, en particular los productos de expresión y la divulgación asociada que se proporciona en las Tablas 5(a-h), demuestra que esta divulgación debe usarse para seleccionar otros grupos de genes cuya expresión también se correlaciona con sensibilidad a fármacos tales como la N-(2-cloro-6-metilfenil)-2-[[6-[4-(2-hidroxietil)-1-piperazinil]-2-metil-4-pirimidinil]amino]-5-tiazolcarboxamida o una sal, solvato, o hidrato farmacéuticamente aceptable de la 10 misma. Por consiguiente, un experto en la materia entiende que pueden identificarse otros grupos de genes usando esta divulgación y examinarse como la serie de genes MCY que se proporciona como ejemplo ilustrativo. Véase también Wilson y col., Breast Cancer Res. 2004; 6(5):192-200 (2004).
II. Polinucleótidos de MCY
Un aspecto de la invención proporciona polinucleótidos correspondientes o complementarios a todo o parte de los 15 genes, ARNm y/o secuencias codificantes de moesina, caveolina 1 o proteína 1 asociada a yes (MCY), preferentemente en forma aislada, incluyendo polinucleótidos que codifican la proteína de MCY y fragmentos de la misma, ADN, ARN, híbridos ADN/ARN y moléculas relacionadas, polinucleótidos u oligonucleótidos complementarios al gen MCY o secuencia de ARNm o una parte de la misma, y polinucleótidos u oligonucleótidos que hibridan con el gen MCY, ARNm o con un polinucleótido que codifica MCY (colectivamente, "polinucleótidos de serie de genes MCY" o "polinucleótidos de MCY"). Como se usa en el 20 presente documento, se entiende que el polinucleótido y la proteína de la serie de genes MCY incluye los polinucleótidos y proteínas de MCY descritos específicamente en el presente documento, moesina, caveolina 1 y proteína 1 asociada a yes (véanse, por ejemplo, las SEC ID Nº:1, SEC ID Nº: 2, SEC ID Nº: 3, SEC ID Nº: 4, SEC ID Nº:5 y SEC ID Nº: 6) y los polinucleótidos y proteínas correspondientes a otros polinucleótidos y proteínas de MCY y variantes estructuralmente similares de los anteriores. Dichos otros polinucleótidos y variantes de MCY generalmente tendrán secuencias codificantes 25 que son muy homólogas (es decir, sustancialmente idénticas) a las secuencias codificantes de la serie de genes MCY proporcionadas en el presente documento, y dichos otros polipéptidos y variantes de MCY preferentemente tendrán una identidad sustancial con los polipéptidos de MCY proporcionados en el presente documento, es decir, compartirán al menos aproximadamente un 80% de identidad de aminoácidos y al menos aproximadamente un 90% de homología de aminoácidos (usando el criterio BLAST), más preferentemente compartiendo un 95% o más de homología (usando el criterio BLAST). 30
En ciertas realizaciones, un polinucleótido de MCY es un polinucleótido de MCY que tiene la secuencia mostrada en la TABLA 1. Un polinucleótido de MCY puede comprender, por ejemplo, un polinucleótido que tiene la secuencia de nucleótidos del polinucleótido de MCY humano mostrada en la TABLA 1, en la que T puede ser también U; un polinucleótido que codifica toda o parte de la proteína de MCY; una secuencia complementaria a la anterior; o un fragmento de polinucleótido de cualquiera de los anteriores. En ciertas realizaciones, un polinucleótido de MCY es un polinucleótido que es 35 capaz de hibridar en condiciones de hibridación rigurosas con un ADNc de MCY humano mostrado la TABLA 1 o con un fragmento de polinucleotídico del mismo.
En el presente documento se proporcionan polinucleótidos de MCY que contienen partes específicas de la secuencia de ARNm de MCY (y los que son complementarios a dichas secuencias) tales como los que codifican la proteína y fragmentos de la misma. Por ejemplo, realizaciones representativas de la invención desvelada en el presente documento 40 incluyen: polinucleótidos que codifican de aproximadamente el aminoácido 1 a aproximadamente el aminoácido 10 de las proteínas de MCY mostradas en la TABLA 1, polinucleótidos que codifican desde aproximadamente el aminoácido 20 a aproximadamente el aminoácido 30 de las proteínas de MCY mostradas en la TABLA 1, polinucleótidos que codifican desde aproximadamente el aminoácido 30 a aproximadamente el aminoácido 40 de las proteínas de MCY mostradas en la TABLA 1, polinucleótidos que codifican desde aproximadamente el aminoácido 40 a aproximadamente el aminoácido 50 de las 45 proteínas de MCY mostradas en la TABLA 1, polinucleótidos que codifican desde aproximadamente el aminoácido 50 a aproximadamente el aminoácido 60 de las proteínas de MCY mostradas en la TABLA 1, polinucleótidos que codifican desde aproximadamente el aminoácido 60 a aproximadamente el aminoácido 70 de las proteínas de MCY mostradas en la TABLA 1, polinucleótidos que codifican desde aproximadamente el aminoácido 70 a aproximadamente el aminoácido 80 de las proteínas de MCY mostradas en la TABLA 1, polinucleótidos que codifican desde aproximadamente el aminoácido 80 a 50 aproximadamente el aminoácido 90 de las proteínas de MCY mostradas en la TABLA 1 y polinucleótidos que codifican desde aproximadamente el aminoácido 90 a aproximadamente el aminoácido 100 de las proteínas de MCY mostradas en la TABLA 1, etc. Siguiendo este esquema, son realizaciones típicas de la invención polinucleótidos que codifican al menos 10 aminoácidos de las proteínas de MCY. También se contemplan polinucleótidos que codifican partes mayores de las proteínas de MCY. Por ejemplo, pueden generarse polinucleótidos que codifican desde aproximadamente el aminoácido 1 (ó 55 20 ó 30 ó 40 etc.) a aproximadamente el aminoácido 20 (ó 30 ó 40 ó 50 etc.) de las proteínas de MCY mostradas en la TABLA 1 por una diversidad de técnicas bien conocidas en este campo.
Otras realizaciones ilustrativas de polinucleótidos de MCY incluyen realizaciones que consisten en un polinucleótido que tiene la secuencia mostrada en la TABLA 1 desde aproximadamente el resto de nucleótido número 1 hasta aproximadamente el resto de nucleótido número 500, desde aproximadamente el resto de nucleótido número 500 hasta 60 aproximadamente el resto de nucleótido número 1000, desde aproximadamente el resto de nucleótido número 1000 hasta aproximadamente el resto de nucleótido número 1500, desde aproximadamente el resto de nucleótido número 1500 hasta
aproximadamente el resto de nucleótido número 2000, desde aproximadamente el resto de nucleótido número 2000 hasta aproximadamente el resto de nucleótido número 2500 y desde aproximadamente el resto de nucleótido número 2500 hasta aproximadamente el resto de nucleótido número 3000 etc. Estos fragmentos de polinucleótidos pueden incluir cualquier parte de las secuencias de MCY mostradas la TABLA 1, por ejemplo, un polinucleótido que tiene al menos 10 nucleótidos de las secuencias mostradas en la TABLA 1. Los polinucleótidos de MCY también incluyen polinucleótidos que tienen una 5 identidad sustancial con las secuencias mostradas en la Tabla 1.
Como alternativa, como se muestra que los genes de la serie de genes MCY se expresan en un subtipo especifico de cánceres de mama, en particular el subtipo basal, los polinucleótidos desvelados en el presente documento pueden usarse en procedimientos para evaluar el estado de una serie de genes MCY para caracterizar subtipos de cáncer de mama. Típicamente, pueden usarse polinucleótidos que codifican regiones específicas de la proteína de MCY para evaluar los 10 niveles de ARNm de MCY en una célula, así como la presencia de perturbaciones (tales como deleciones, inserciones, mutaciones puntuales etc.) en regiones específicas de los productos del gen MCY. Los ensayos ejemplares incluyen ensayos RT-PCR así como análisis de polimorfismos de conformación de cadena sencilla (SSCP) (véase, por ejemplo, Marrogi y col., 1999, J. Cutan. Pathol. 26(8): 369-378) utilizando ambos ensayos polinucleótidos que codifican regiones específicas de una proteína para examinar esas regiones dentro de la proteína. 15
También se proporcionan en el presente documento ADN genómico, ADNc, ribozimas y moléculas antisentido, así como moléculas de ácido nucleico basadas en un esqueleto alternativo o que incluyen bases alternativas, procedentes de fuentes naturales o sintéticas. Por ejemplo, las moléculas antisentido pueden ser ARN u otras moléculas, incluyendo ácidos péptido nucleicos (APN) o moléculas de ácidos no nucleicos tales como derivados de fosforotioato, que se unen específicamente al ADN o ARN de una manera dependiente de pares de bases. Un experto en la materia puede obtener 20 fácilmente estas clases de moléculas de ácido nucleico usando, por ejemplo, las secuencias polinucleotídicas de MCY desveladas en el presente documento.
La tecnología antisentido implica la administración de oligonucleótidos exógenos que se unen a un polinucleótido diana localizado dentro de las células. El término "antisentido" se refiere al hecho de que dichos oligonucleótidos son complementarios a sus dianas intracelulares, por ejemplo, polinucleótidos de MCY. Véase, por ejemplo, Jack Cohen, 1988, 25 OLIGODEOXYNUCLEOTIDES, Antisense Inhibitors of Gene Expression, CRC Press; y Synthesis 1:1-5 (1988). Los oligonucleótidos antisentido de polinucleótidos de MCY de la presente invención incluyen derivados tales como S-oligonucleótidos (derivados de fosforotioato o S-oligos, véase, Jack Cohen, supra) que presentan una mayor acción inhibidora del crecimiento de células cancerosas. Los S-oligos (nucleósido fosforotioatos) son análogos isoelectrónicos de un oligonucleótido (O-oligo) en los que un átomo de oxígeno que no está unido del grupo fosfato está remplazado por un átomo 30 de azufre. Los S-oligos de la presente invención pueden prepararse por tratamiento de los O-oligos correspondientes con 1,1 dióxido de 3H-1,2 benzoditiol-3-ona, que es un reactivo de transferencia de azufre. Véase Iyer, R. P. y col., 1990, J. Org. Chem. 55:4693-4698; y Iyer, R. P. y col., 1990, J. Am. Chem. Soc. 112:1253-1254. Otros oligonucleótidos antisentido de polinucleótidos de MCY de la presente invención incluyen oligonucleótidos antisentido de morfolino conocidos en la técnica (véase, por ejemplo, Partridge y col., 1996, Antisense & Nucleic Acid Drug Development 6: 169-175). 35
Los oligonucleótidos antisentido de polinucleótidos de MCY de la presente invención pueden ser, por ejemplo, ARN o ADN que es complementario e hibrida de forma estable con los primeros 100 codones N-terminales o los últimos 100 codones C-terminales de la secuencia genómica de MCY o el ARNm correspondiente. Aunque no se requiere una complementariedad absoluta, son deseables altos grados de complementariedad. El uso de un oligonucleótido complementario a esta región permite la hibridación selectiva con el ARNm de MCY y no con el ARNm que especifica otras 40 subunidades reguladoras de proteína quinasa. Preferentemente, los oligonucleótidos antisentido de polinucleótido de MCY de la presente invención son un fragmento de 15 a 30 unidades de la molécula de ADN antisentido que tiene una secuencia que hibrida con el ARNm de la serie de genes MCY. Opcionalmente, un oligonucleótido antisentido de polinucleótido de MCY es un oligonucleótido de 30 unidades que es complementario a una región en los primeros 10 codones N-terminales y en los últimos 10 codones C-terminales de polinucleótidos de MCY. Como alternativa, las moléculas antisentido pueden 45 modificarse para emplear ribozimas en la inhibición de la expresión de genes MCY (L. A. Couture & D. T. Stinchcomb, 1996, Trends Genet. 12: 510-515).
Otras realizaciones específicas de este aspecto de la invención incluyen cebadores y pares de cebadores, que permiten la amplificación específica de los polinucleótidos de la invención o de cualquier parte específica de los mismos, y sondas que hibridan selectiva o específicamente con moléculas de ácido nucleico de la invención o cualquier parte de las 50 mismas. Las sondas pueden marcarse con un marcador de detección tal como, por ejemplo, un radioisótopo, compuesto fluorescente, compuesto bioluminiscente, compuesto quimioluminiscente, quelante de metales o enzima. Dichas sondas y cebadores pueden usarse para detectar la presencia de un polinucleótido de MCY en una muestra y como medio para detectar una célula que expresa una proteína de MCY.
Los ejemplos de dichas sondas incluyen polinucleótidos que comprenden todo o parte de las secuencias de ADNc 55 de MCY humanas mostradas en la TABLA 1. Los ejemplos de pares de cebadores capaces de amplificar específicamente ARNm de MCY se fabrican fácilmente por los expertos en la materia. Como entenderá el experto en la materia, pueden prepararse muchos cebadores y sondas diferentes basándose en las secuencias proporcionadas en el presente documento y usarse eficazmente para amplificar y/o detectar un ARNm de MCY.
Como se usa en el presente documento, se dice que un polinucleótido se "aísla" cuando se separa sustancialmente 60
de polinucleótidos contaminantes que corresponden o son complementarios a polinucleótidos distintos de los polinucleótidos de MCY o que codifican polipéptidos distintos de los polipéptidos de MCY, incluyendo fragmentos de los mismos. Un experto en la materia puede emplear fácilmente procedimientos de aislamiento de ácido nucleico para obtener el polinucleótido de MCY aislado.
Los polinucleótidos de MCY de la invención son útiles para una diversidad de fines, incluyendo pero sin limitación 5 su uso como sondas y cebadores para la amplificación y/o detección del gen o genes MCY, ARNm o fragmentos de los mismos; como reactivos para el diagnóstico y/o pronostico de cáncer de mama (por ejemplo, subtipos específicos de cáncer de mama) y otros cánceres; como secuencias codificantes capaces de dirigir la expresión de polipéptidos de MCY; como herramientas para modular o inhibir la expresión del gen o genes MCY y/o traducción del transcrito o transcritos de MCY; y como agentes terapéuticos. 10
III. Aislamiento de moléculas de ácido nucleico de MCY
Las secuencias de ADNc de MCY descritas en el presente documento permiten el aislamiento de otros polinucleótidos que codifican uno o más productos de genes MCY, así como el aislamiento de polinucleótidos que codifican homólogos de productos de genes MCY, isoformas de corte y empalme alternativo, variantes alélicas y formas mutantes de productos génicos de la serie de genes MCY. Son bien conocidos diversos procedimientos de clonación molecular que 15 pueden emplearse para aislar ADNc de longitud completa que codifican una proteína de MCY (véase, por ejemplo, Sambrook, J. y col., 1989, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2d ed., Cold Spring Harbor Press, New York; Ausubel y col., eds., 1995, Current Protocols in Molecular Biology, Wiley and Sons). Por ejemplo, pueden emplearse convenientemente metodologías de clonación del fago lambda, usando sistemas de clonación disponibles en el mercado (por ejemplo, Lambda ZAP Express, Stratagene). Pueden identificarse clones de fagos que contienen ADNc de MCY por sondeo con un ADNc de 20 MCY marcado o un fragmento del mismo. Por ejemplo, en ciertas realizaciones, puede sintetizarse el ADNc de MCY (TABLA 1) o una parte del mismo y usarse como sonda para recuperar ADNc solapantes y de longitud completa correspondientes a un polinucleótido de MCY. Los miembros de MCY pueden aislarse, por ejemplo, por exploración de bibliotecas de ADN genómico, bibliotecas de cromosomas artificiales bacterianos (BAC), bibliotecas de cromosomas artificiales de levadura (YAC) y similares, con sondas o cebadores de ADN de MCY. 25
IV. Moléculas de ADN recombinante y sistemas de huésped-vector
La invención también proporciona moléculas de ADN o ARN recombinante que comprenden un polinucleótido de MCY que incluye, pero sin limitación, fagos, plásmidos, fagémidos, cósmidos, YAC, BAC, así como diversos vectores virales y no virales bien conocidos en la técnica, y células transformadas o transfectadas con dichas moléculas de ADN o ARN recombinante. Como se usa en el presente documento, una molécula de ADN o ARN recombinante es una 30 molécula de ADN o ARN que se ha sometido a manipulación molecular in vitro. Son bien conocidos procedimientos para generar dichas moléculas (véase, por ejemplo, Sambrook y col, 1989, supra).
La invención proporciona además un sistema huésped-vector que comprende una molécula de ADN recombinante que contiene un polinucleótido de MCY dentro de una célula huésped procarioata o eucariota adecuada. Los ejemplos de células huésped eucariotas adecuadas incluyen, por ejemplo, una célula de levadura, una célula 35 vegetal, o una célula animal, tal como una célula de mamífero o una célula de insecto (por ejemplo, una célula que puede infectarse por baculovirus tal como una célula Sf9 o HighFive). Los ejemplos de células de mamífero adecuadas incluyen, por ejemplo, diversas líneas celulares de cáncer de mama tales como MDA 231, MCF-7, otras líneas celulares de cáncer de mama transfectables o transducibles, así como varias células de mamífero usadas rutinariamente para la expresión de proteínas recombinantes (por ejemplo, células COS, CHO, MCF-7). Más particularmente, puede usarse un 40 polinucleótido que comprende la secuencia codificante de un gen MCY para generar proteínas de MCY o fragmentos de las mismas usando cualquier número de sistemas de huésped-vector usados rutinariamente y conocidos ampliamente en la técnica.
Se dispone de una amplia serie de sistemas de huésped-vector adecuados para la expresión de proteínas de MCY o fragmentos de las mismas (véase, por ejemplo, Sambrook y col., 1989, supra; Current Protocols in Molecular Biology, 45 1995, supra). Los vectores comunes para la expresión en mamíferos incluyen, pero sin limitación, pcDNA 3.1 myc-marcador-His (Invitrogen) y el vector retroviral pSRtkneo (Muller y col., 1991, MCB 11:1785). Usando estos vectores de expresión, la serie de genes MCY puede expresarse preferentemente en varios cánceres de mama y líneas celulares que no son de mama incluyendo, por ejemplo, MCF-7, rat-1, NIH 3T3 y TsuPrl. Los sistemas de huésped-vector de la invención son útiles para la producción de una proteína de MCY o un fragmento de la misma. Dichos sistemas de huésped-vector pueden 50 emplearse para estudiar las propiedades funcionales de la serie de genes MCY y mutaciones de la serie de genes MCY.
Puede producirse una proteína de MCY humana recombinante por células de mamífero transfectadas con una construcción que codifica la serie de genes MCY. En una realización ilustrativa, pueden transfectarse células MCF-7 con un plásmido de expresión que codifica la proteína de MCY, la proteína de MCY se expresa en las células MCF-7 y la proteína de MCY recombinante puede aislarse usando procedimientos de purificación convencionales (por ejemplo, purificación por 55 afinidad usando anticuerpos anti-serie de genes MCY). En otra realización, la secuencia codificante de MCY se subclona en el vector retroviral pSRMSVtkneo y se usa para infectar diversas líneas de células de mamífero, tales como NIH 3T3, MCF-7 y rat-1 para establecer líneas celulares que expresen la serie de genes MCY. También pueden emplearse otros diversos sistemas de expresión bien conocidos en la técnica. Pueden usarse construcciones de expresión que codifican
un péptido líder unido en fase a la secuencia codificante de MCY para la generación de una forma secretada de proteína de MCY recombinante.
Las proteínas codificadas por los genes MCY, o por fragmentos de los mismos, tienen una diversidad de usos incluyendo, por ejemplo, la generación de anticuerpos y en procedimientos para identificar ligandos y otros agentes y constituyentes celulares que se unen a un producto génico de la serie de genes MCY. Hay anticuerpos inducidos contra 5 una proteína de MCY o un fragmento de la misma en ensayos de diagnóstico y pronóstico, y hay metodologías de formación de imágenes en el tratamiento de cánceres humanos caracterizados por la expresión de la proteína de MCY, incluyendo, por ejemplo, cánceres de mama. Dichos anticuerpos pueden expresarse intracelularmente y usarse en procedimientos para el tratamiento de pacientes con dichos cánceres. Se contemplan diversos ensayos inmunológicos útiles para la detección de proteínas de MCY, incluyendo pero sin limitación diversos tipos de radioinmunoensayos, 10 ensayos inmunoabsorbentes ligados a enzima (ELISA), ensayos inmunofluorescentes ligados a enzima (ELIFA), procedimientos inmunocitoquímicos y similares. Dichos anticuerpos pueden marcarse y usarse como reactivos inmunológicos de formación de imágenes capaces de detectar células que expresan la serie de genes MCY (por ejemplo, en procedimientos de formación de imágenes radioescintigráficas). Las proteínas de MCY también son particularmente útiles para generar vacunas para cánceres, como se describe adicionalmente más adelante. 15
V. Polipéptidos de MCY
En el presente documento se proporciona proteínas de MCY y fragmentos polipeptídicos de las mismas. Las proteínas de MCY de la invención incluyen las identificadas específicamente en el presente documento, así como variantes alélicas, variantes de sustitución conservativa y homólogos que pueden aislarse/generarse y caracterizarse sin experimentación indebida siguiendo procedimientos conocidos en la técnica y procedimientos indicados más adelante. 20 También se incluyen en la presente invención proteínas de fusión que combinan partes de diferentes proteínas de MCY o fragmentos de las mismas, así como proteínas de fusión de una proteína de MCY y un polipéptido heterólogo. Dichas proteínas de MCY pueden denominarse colectivamente proteínas de MCY, polipéptidos de MCY, las proteínas de la invención o proteínas de serie de genes MCY.
Las realizaciones específicas de proteínas de MCY comprenden un polipéptido que tiene la secuencia de 25 aminoácidos de polipéptidos de MCY humanos mostrados en la TABLA 1. Como alternativa, las realizaciones de proteínas de MCY comprenden polipéptidos variantes que tienen alteraciones en la secuencia de aminoácidos de polipéptidos de MCY humanos mostrados en la TABLA 1, incluyendo polipéptidos que tienen secuencias con una identidad sustancial a los proporcionados en la TABLA 1.
En general, las variantes alélicas naturales de las proteínas de MCY humanas compartirán un alto grado de 30 identidad y homología estructural (por ejemplo, un 90% o más de identidad). Típicamente, las variantes alélicas de las proteínas de MCY contendrán sustituciones de aminoácidos conservativas dentro de las secuencias de MCY descritas en el presente documento o contendrán una sustitución de un aminoácido de una posición correspondiente en un homólogo de MCY. Una clase de variantes alélicas de proteína de MCY serán proteínas que comparten un alto grado de homología con al menos una región pequeña de una secuencia de aminoácidos de MCY particular, pero además contendrán una desviación 35 radical de la secuencia, tal como una sustitución no conservativa, truncamiento, inserción o cambio de fase.
Las sustituciones de aminoácidos conservativas con frecuencia pueden realizarse en una proteína sin alterar la conformación o la función de la proteína. Dichos cambios incluyen la sustitución de cualquiera de isoleucina (I), valina (V) y leucina (L) por cualquier otro de estos aminoácidos hidrófobos; ácido aspártico (D) por ácido glutámico (E) y viceversa; glutamina (Q) por asparagina (N) y viceversa; y serina (S) por treonina (T) y viceversa. Otras sustituciones también pueden 40 considerarse conservativas, dependiendo del entorno del aminoácido particular y su papel en la estructura tridimensional de la proteína. Por ejemplo, la glicina (G) y la alanina (A) con frecuencia pueden ser intercambiables, así como la alanina (A) y valina (V). La metionina (M), que es relativamente hidrófoba, con frecuencia puede cambiarse por leucina e isoleucina, y algunas veces por valina. La lisina (K) y la arginina (R) con frecuencia son intercambiables en localizaciones en las que la característica significativa del resto de aminoácido es su carga y los diferentes valores de pK de estos dos restos de 45 aminoácidos no son significativos. Otros cambios más pueden considerarse "conservativos" en entornos particulares.
Las realizaciones de la invención desveladas en el presente documento incluyen una amplia diversidad de variantes aceptadas en la técnica de proteínas de MCY tales como polipéptidos que tienen inserciones, deleciones y sustituciones de aminoácidos. Pueden obtenerse variantes de proteína de MCY usando procedimientos conocidos en la técnica, tales como mutagénesis dirigida, mutagénesis mediante y mutagénesis por PCR. Pueden realizarse mutagénesis 50 dirigida (Carter y col., 1986, Nucl. Acids Res. 13:4331; Zoller y col., 1987, Nucl. Acids Res. 10:6487), mutagénesis por casete (Wells y col., 1985, Gene 34:315), mutagénesis de selección de restricción (Wells y col., 1986, Philos. Trans. R. Soc. London Ser. A, 317:415) u otras técnicas conocidas en el ADN clonado para producir el ADN de la variante de serie de genes MCY. También puede emplearse el análisis de exploración de aminoácidos para identificar uno o más aminoácidos a lo largo de una secuencia contigua. Entre los aminoácidos de exploración comunes se encuentran aminoácidos neutros, relativamente 55 pequeños. Estos aminoácidos incluyen alanina, glicina, serina y cisteína. La alanina típicamente es un aminoácido de exploración común dentro de este grupo porque elimina la cadena lateral más allá del carbono beta y es menos probable que altere la conformación de la cadena principal de la variante. Típicamente también se usa alanina porque es el aminoácido más común. Además, con frecuencia se observa tanto en posiciones ocultas como expuestas (Creighton, The Proteins, (W.H. Freeman & Co., N.Y.); Chothia, 1976, J. Mol. Biol., 150:1). Si la sustitución de alanina no produce cantidades 60
adecuadas de variante, puede usarse un aminoácido isostérico.
Las realizaciones de la invención reivindicada incluyen polipéptidos que contienen menos que la secuencia de aminoácidos completa de la proteína de MCY mostrada en la TABLA 1 (y los polinucleótidos que codifican dichos polipéptidos). Por ejemplo, las realizaciones representativas de la invención desveladas en el presente documento incluyen polipéptidos que consisten en aproximadamente desde el aminoácido 1 a aproximadamente el aminoácido 10 de la proteína 5 de MCY mostrada en la TABLA 1, polipéptidos que consisten en aproximadamente desde el aminoácido 20 a aproximadamente el aminoácido 30 de la proteína de MCY mostrada en la TABLA 1, polipéptidos que consisten en aproximadamente desde el aminoácido 30 a aproximadamente el aminoácido 40 de la proteína de MCY mostrada en la TABLA 1, polipéptidos que consisten en aproximadamente desde el aminoácido 40 a aproximadamente el aminoácido 50 de la proteína de MCY mostrada en la TABLA 1, polipéptidos que consisten en aproximadamente desde el aminoácido 50 a 10 aproximadamente el aminoácido 60 de la proteína de MCY mostrada en la TABLA 1, polipéptidos que consisten en aproximadamente desde el aminoácido 60 a aproximadamente el aminoácido 70 de la proteína de MCY mostrada en la TABLA 1, polipéptidos que consisten en aproximadamente desde el aminoácido 70 a aproximadamente el aminoácido 80 de la proteína de MCY mostrada en la TABLA 1, polipéptidos que consisten en aproximadamente desde el aminoácido 80 a aproximadamente el aminoácido 90 de la proteína de MCY mostrada en la TABLA 1 y polipéptidos que consisten en 15 aproximadamente desde el aminoácido 90 a aproximadamente el aminoácido 100 de la proteína de MCY mostrada en la TABLA 1, etc. También se contemplan polipéptidos que consisten en partes de mayor tamaño de la proteína de MCY. Por ejemplo, pueden generarse polipéptidos que consisten en aproximadamente desde el aminoácido 1 (o 20 o 30 o 40 etc.) a aproximadamente el aminoácido 20 (o 30 o 40 o 50 etc.) de la proteína de MCY mostrada en la TABLA 1, por una diversidad de técnicas bien conocidas en este campo. 20
Los polipéptidos de los párrafos anteriores tienen varios usos específicos diferentes. Estos polipéptidos pueden usarse en procedimientos para evaluar el estado de productos génicos MCY en tejidos normales frente a cancerosos y esclarecer el fenotipo maligno. Típicamente, pueden usarse polinucleótidos que codifican regiones específicas de la proteína de MCY para evaluar la presencia de perturbaciones (tales como deleciones, inserciones, mutaciones puntuales etc.) en regiones específicas de los productos de los genes MCY. Los ensayos ejemplares pueden utilizar anticuerpos que se dirigen 25 a un polipéptido de MCY que contiene los restos de aminoácidos de uno o más de los motivos biológicos contenidos dentro de la secuencia del polipéptido de MCY para evaluar las características de esta región en tejidos normales frente a cancerosos. Como alternativa, pueden usarse polipéptidos de MCY que contienen los restos de aminoácidos de uno o más de los motivos biológicos contenidos dentro de la secuencia del polipéptido de MCY para seleccionar factores que interaccionan con esa región de los polipéptidos de MCY. 30
La redundancia en el código genético permite variación en las secuencias de MCY. En particular, un experto en la materia reconocerá preferencias de codones específicos por especies específicas de huésped y puede adaptar la secuencia desvelada como preferida para un huésped deseado. Por ejemplo, ciertas secuencias de codones típicamente tienen codones raros (es decir, codones que tienen una frecuencia de uso menor de aproximadamente un 20% en secuencias conocidas del huésped deseado) reemplazados por codones de mayor frecuencia. Las preferencias de codones para un 35 organismo específico pueden calcularse, por ejemplo, utilizando tablas de uso de codones disponibles en Internet en la siguiente dirección:
www.dna.affirc.go.jp/~nakamura/codon.html. Las secuencias de nucleótidos que se han optimizado para una especie de huésped particular reemplazando cualquier cordón que tenga una frecuencia de uso menor de aproximadamente un 20% se denominan en el presente documento "secuencias de codones optimizados". 40
Se conocen modificaciones de secuencia adicionales para mejorar la expresión de proteínas en un huésped celular. Éstas incluyen la eliminación de secuencias que codifican señales de poliadenilación falsas, señales de sitio de corte y empalme de exones/intrones, repeticiones de tipo transposón y/u otras secuencias bien caracterizadas que pueden ser perjudiciales para la expresión génica. El contenido de GC de la secuencia puede ajustarse a niveles medios para un huésped celular dado, calculado por referencia a genes conocidos expresados en la célula huésped. Cuando sea posible, la 45 secuencia también puede modificarse para evitar estructuras de ARNm secundarias de horquilla previstas. Otras modificaciones útiles incluyen la adicción de una secuencia consenso de inicio de la traducción en el principio de la fase de lectura abierta, como se describe en Kozak, 1989, Mol. Cell Biol., 9:5073-5080. Las secuencias de nucleótidos que se han optimizado para la expresión en una especie de huésped dada por eliminación de secuencias de poliadenilación falsas, eliminación de señales de corte y empalme de exones/intrones, eliminación de repeticiones de tipo transposón y/u 50 optimización del contenido de GC además de la optimización de codones se denominan en el presente documento "secuencias de expresión mejorada".
Las proteínas de MCY pueden incorporarse en muchas formas, preferentemente en forma aislada. Como se usa en el presente documento, se dice que una proteína está "aislada" cuando se emplean procedimientos físicos, mecánicos o químicos para retirar la proteína de MCY de los constituyentes celulares que normalmente están asociados con la proteína. 55 Un experto en la materia puede emplear fácilmente procedimientos de purificación convencionales para obtener una proteína de MCY aislada. Una molécula de proteína de MCY purificada carecerá sustancialmente de otras proteínas o moléculas que perjudiquen a la unión de la proteína de MCY a un anticuerpo u otro ligando. La naturaleza y grado de aislamiento y purificación dependerán del uso deseado. Las realizaciones de una proteína de MCY incluyen, por ejemplo, una proteína de MCY purificada y una proteína de MCY funcional, soluble. En una forma, dichas proteínas de MCY funcionales, solubles, o 60 fragmentos de las mismas conservan la capacidad de unirse a un anticuerpo u otro ligando.
La invención también proporciona polipéptidos de MCY que comprenden fragmentos biológicamente activos de la secuencia de aminoácidos de MCY, tales como un polipéptido que corresponde a parte de la secuencia de aminoácidos para MCY como se muestra en la TABLA 1. Dichos polipéptidos de la invención presentan propiedades de la proteína de MCY, tales como la capacidad de inducir la generación de anticuerpos que se unen específicamente a un epítopo asociado con la proteína de MCY. 5
Los polipéptidos de MCY pueden generarse usando la tecnología de síntesis de péptidos convencional o usando procedimientos de escisión química bien conocidos en la técnica basándose en las secuencias de aminoácidos de las proteínas de MCY humanas desveladas en el presente documento. Como alternativa, pueden usarse procedimientos recombinantes para generar moléculas de ácido nucleico que codifican un fragmento polipeptídico de una proteína de MCY. A este respecto, las moléculas de ácido nucleico que codifican proteínas de MCY descritas en el presente documento 10 proporcionan medios para generar fragmentos definidos de proteínas de MCY. Los polipéptidos de MCY son particularmente útiles para generar y caracterizar anticuerpos específicos de dominio (por ejemplo, anticuerpos que reconocen un epítopo extracelular o intracelular de una proteína de una serie de genes MCY), para identificar agentes o factores celulares que se unen a proteínas de MCY o un dominio estructural particular de las mismas y, en diversos contextos terapéuticos, incluyendo pero sin limitación vacunas para cáncer. 15
Los polipéptidos de MCY que contienen estructuras particularmente interesantes pueden predecirse y/o identificarse usando diversas técnicas analíticas bien conocidas en este campo incluyendo, por ejemplo, los procedimientos de análisis de Chou-Fasman, Garnier-Robson, Kyte-Doolittle, Eisenberg, Karplus-Schultz o Jarneson-Wolf, o basándose en la inmunogenicidad. Los fragmentos que contienen dichas estructuras son particularmente útiles para generar anticuerpos anti-MCY específicos de subunidad o para identificar factores celulares que se unen a un polipéptido de MCY. 20
En ciertas realizaciones, los polipéptidos de MCY pueden expresarse convenientemente en células (tales como células MCF-7) transfectadas con un vector de expresión disponible en el mercado, tal como un vector de expresión dirigido por CMV que codifica proteína de MCY con un marcador MYC y His 6X C-terminal (pcDNA3.1/mycHIS, Invitrogen o Tag5, GenHunter Corporation, NashvilleTN). El vector Tag5 proporciona una señal de secreción de IgGK que puede usarse para facilitar la producción de una proteína de serie de genes MCY secretada en células transfectadas. La proteína de MCY 25 marcada con HIS secretada en el medio de cultivo puede purificarse usando una columna de níquel y usando técnicas convencionales.
Los polipéptidos de MCY de la presente invención también pueden modificarse de tal manera que formen una molécula quimérica que comprende polipéptidos de MCY fusionados a otro polipéptido heterólogo o secuencia de aminoácidos. En una realización, dicha molécula quimérica comprende una fusión de un polipéptido de MCY con un 30 marcador de epítopo de polihistidina, que proporciona un epítopo al que puede unirse selectivamente níquel inmovilizado. El marcador de epítopo generalmente se pone en el extremo amino o carboxilo de la serie de genes MCY. En una realización alternativa, la molécula quimérica puede comprender una fusión de un polipéptido de MCY con una inmunoglobulina o una región particular de una inmunoglobulina. Para una forma bivalente de la molécula quimérica (también denominada "inmunoadhesina"), dicha fusión podría ser con la región Fc de una molécula de IgG. Las fusiones de Ig preferentemente 35 incluyen la sustitución de una forma soluble (dominio trasmembrana delecionado o inactivado) de un polipéptido de MCY en lugar de al menos una región variable dentro de una molécula de Ig. En realizaciones particulares, la fusión de inmunoglobulina incluye la bisagra, CH2 y CH3, o las regiones de bisagra, CH1, CH2 y CH3 de una molécula de IgG1. Para la producción de fusiones de inmunoglobulina, véase también la Patente de Estados Unidos Nº 5.428.130, expedida el 27 junio de 1995. 40
VI. Anticuerpos contra MCY
El término "anticuerpo" se usa en el sentido más amplio e incluye específicamente anticuerpos monoclonales individuales anti-proteína de MCY (incluyendo agonistas, antagonistas y anticuerpos neutralizadores) y composiciones de anticuerpos anti-proteína de MCY con especificidad poliepitópica. También incluye, por ejemplo, anticuerpos policlonales, anticuerpos biespecíficos, diacuerpos, anticuerpos quiméricos, monocatenarios y humanizados, así como 45 fragmentos de anticuerpo (por ejemplo Fab, F(ab’)2 y Fv) siempre que presenten la actividad biológica deseada.
La expresión "anticuerpo monoclonal" (mAb), como se usa en el presente documento, hace referencia a un anticuerpo obtenido de una población de anticuerpos sustancialmente homogéneos, es decir, los anticuerpos que comprenden la población individual son idénticos excepto por posibles mutaciones naturales que pueden estar presentes en cantidades minoritarias. 50
Otro aspecto de la invención proporciona anticuerpos que se unen a polipéptidos de MCY. Los anticuerpos más comunes se unirán específicamente a una proteína de MCY y no se unirán (o se unirán débilmente) a proteínas no MCY. Los anticuerpos anti-MCY que se contemplan particularmente incluyen anticuerpos monoclonales y policlonales, así como fragmentos que contienen el dominio de unión a antígeno y/o una o más regiones determinantes de complementariedad de estos anticuerpos. Como se usa en el presente documento, un fragmento de anticuerpo se 55 define como al menos una parte de la región variable de la molécula de inmunoglobulina que se une a su diana, es decir, la región de unión a antígeno.
Los anticuerpos anti-MCY de la invención son particularmente útiles en ensayos de diagnóstico y pronóstico de
cáncer de mama, y en metodologías de formación de imágenes. Los anticuerpos expresados intracelularmente (por ejemplo, anticuerpos monocatenarios) pueden ser terapéuticamente útiles para tratar cánceres en los que está implicada la expresión de la serie de genes MCY, tales como, por ejemplo, cánceres de mama metastásico y avanzado. Dichos anticuerpos pueden ser útiles en el tratamiento, diagnóstico y/o pronóstico de otros cánceres, en la medida en la que la serie de genes MCY también se expresa o sobreexpresa en otros tipos de cánceres tales como cánceres de 5 mama.
La invención también proporciona diversos ensayos inmunológicos útiles para la detección y cuantificación de proteínas y polipéptidos de MCY incluyendo proteínas y polipéptidos de MCY mutantes. Dichos ensayos pueden comprender uno o más anticuerpos de la serie de genes MCY capaces de reconocer y de unirse a una proteína de MCY incluyendo una proteína de MCY mutante, cuando sea apropiado, y pueden realizarse dentro de diversos formatos de 10 ensayo inmunológico bien conocidos en la técnica, incluyendo, pero sin limitación, los diversos tipos de radioinmunoensayos, ensayos inmunoabsorbentes ligados a enzima (ELISA), ensayos inmunofluorescentes ligados a enzima (ELIFA) y similares. Además, la invención también proporciona procedimientos inmunológicos de formación de imágenes capaces de detectar cáncer de mama y otros cánceres que expresan proteínas de MCY, incluyendo, pero sin limitación procedimientos de formación de imágenes radioescintigráficas usando anticuerpos de series de genes MCY 15 marcados. Estos ensayos pueden ser clínicamente útiles en la detección, control y pronóstico de cánceres que expresan la serie de genes MCY tales como cáncer de mama.
Los anticuerpos de MCY también pueden usarse en procedimientos para purificar proteínas de MCY incluyendo proteínas mutantes de MCY y para aislar homólogos de MCY y moléculas relacionadas. Por ejemplo, en ciertas realizaciones, el procedimiento para purificar una proteína de MCY comprende incubar un anticuerpo de MCY, 20 que se ha acoplado a una matriz sólida, con un lisado u otra solución que contiene la serie de genes MCY en condiciones que permitan que el anticuerpo de MCY se una a la proteína de MCY; lavar la matriz sólida para eliminar impurezas; y eluir la proteína de MCY del anticuerpo acoplado. Otros usos de los anticuerpos de MCY de la invención incluyen la generación de anticuerpos anti-idiotípicos que imitan a la proteína de MCY.
En la técnica son bien conocidos diversos procedimientos para la preparación de anticuerpos. Por ejemplo, 25 pueden prepararse anticuerpos inmunizando un huésped mamífero adecuado usando una proteína, péptido o fragmento de MCY, en forma inmunoconjugada o aislada (Harlow, and Lane, eds., 1988, Antibodies: A Laboratory Manual, CSH Press; Harlow, 1989, Antibodies, Gold Spring Harbor Press, NY). Además, también pueden usarse proteínas de fusión de MCY, tales como una proteína de fusión MCY GST. En una realización particular, puede producirse una proteína de fusión de GST que comprende toda o la mayor parte de la secuencia de aminoácidos de la fase de lectura abierta de la 30 Tabla 1 y usarse como un inmunógeno para generar anticuerpos apropiados. En otra realización, puede sintetizarse y usarse un péptido de MCY como inmunógeno.
Además, pueden usarse técnicas de inmunización de ADN desnudo conocidas en este campo (con y sin proteína de MCY purificada o células que expresan MCY) para generar una respuesta inmune al inmunógeno codificado (como revisión, véase Donnelly y col., 1997, Ann. Rev. Immunol. 15:617-648). 35
La secuencia de aminoácidos de la proteína de MCY como se muestra en la TABLA 1 puede usarse para seleccionar regiones específicas de la proteína de MCY para generar anticuerpos. Por ejemplo, pueden usarse análisis de hidrofobia e hidrofilia de la secuencia de aminoácidos de MCY para identificar regiones hidrófilas en la estructura de la serie de genes MCY. Las regiones de la proteína de MCY que muestran estructura inmunogénica, así como otras regiones y dominios, pueden identificarse fácilmente usando otros diversos procedimientos conocidos en la técnica tales 40 como análisis de Chou-Fasman, Garnier-Robson, Kyte-Doolittle, Eisenberg, Karplus-Schultz o Jarneson-Wolf.
En la técnica son bien conocidos procedimientos para preparar una proteína o polipéptido para su uso común inmunógeno y para preparar conjugados inmunogénicos de una proteína con un soporte tal como BSA, KLH u otras proteínas de soporte. En algunas circunstancias, puede usarse conjugación directa usando, por ejemplo, reactivos de carbodiimida; en otros casos pueden ser eficaces reactivos de unión tales como los suministrados por Pierce Chemical 45 Co., Rockford, IL. La administración de un inmunógeno de la serie de genes MCY puede realizarse por inyección durante un periodo de tiempo adecuado y con el uso de un adyuvante adecuado, como se entiende generalmente en la técnica. Durante el programa de inmunización, pueden tomarse títulos de anticuerpos para determinar la adecuación de la formación de anticuerpos.
Pueden producirse anticuerpos monoclonales MCY por diversos medios bien conocidos en la técnica. Por 50 ejemplo, pueden prepararse líneas celulares inmortalizadas que secretan un anticuerpo monoclonal deseado usando la tecnología de hibridoma convencional de Kohler y Milstein o modificaciones que inmortalizan la producción de células B, como se conoce generalmente. Las líneas celulares inmortalizadas que secretan los anticuerpos deseados se exploran por inmunoensayo en el que el antígeno es la proteína de MCY o un fragmento de MCY. Cuando se identifica el cultivo de células inmortalizadas apropiado que secreta el anticuerpo deseado, las células pueden expandirse y los anticuerpos 55 producirse a partir de cultivos in vitro o a partir de líquido ascítico.
Los anticuerpos o fragmentos también pueden producirse, usando la tecnología actual, por medios recombinantes. También pueden producirse regiones que se unen específicamente a las regiones deseadas de la proteína de MCY en el contexto de anticuerpos quiméricos o con CDR injertadas de múltiples orígenes de especie.
También pueden producirse anticuerpos de MCY humanizados o humanos para su uso en contextos terapéuticos. Los procedimientos para humanizar anticuerpos murinos y otros anticuerpos no humanos sustituyendo una o más de las CDR de los anticuerpos no humanos por secuencias de anticuerpo humano correspondientes son bien conocidos (véase, por ejemplo, Jones y col., 1986, Nature 321:522-525; Riechmann y col., 1988, Nature 332: 323-327; Verhoeyen y col., 1988, Science 239: 1534-1536). Véase también Carter y col., 1993, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89: 4285 y Sims y 5 col., 1993, J. Immunol. 151: 2296. Los procedimientos para producir anticuerpos monoclonales completamente humanos incluyen presentación en fagos y procedimientos transgénicos (como revisión, véase Vaughan y col., 1998, Nature Biotechnology 16: 535-539).
Pueden generarse anticuerpos monoclonales de la serie de genes MCY completamente humanos usando tecnologías de clonación que emplean bibliotecas combinatorias grandes de genes de Ig humana (es decir presentación 10 en fagos) (Griffiths y Hoogenboom, Building an in vitro immune system: human antibodies from phage display libraries. En: Clark, M., ed., 1993, Protein Engineering of Antibody Molecules for Prophylactic and Therapeutic Applications in Man, Nottingham Academic, págs. 45-64; Burton y Barbas, Human Antibodies from combinatorial libraries. Id., págs. 65-82). También pueden producirse anticuerpos monoclonales de MCY completamente humanos usando ratones transgénicos modificados por ingeniería genética para que contengan loci de genes de inmunoglobulina humana como 15 se describe en la Solicitud de Patente PCT WO98/24893, Kucherlapati y Jakobovits y col., publicado el 3 de diciembre de 1997 (véase también, Jakobovits, 1998, Exp. Opin. Invest. Drugs 7(4): 607-614). Este procedimiento evita la manipulación in vitro necesaria con la tecnología de presentación en fagos y produce eficazmente anticuerpos humanos auténticos de alta afinidad.
La reactividad de anticuerpos de MCY con una proteína de MCY puede establecerse por varios medios bien 20 conocidos, incluyendo transferencia de Western, inmunoprecipitación, ELISA y análisis FACS usando, cuando sea apropiado, proteínas de MCY, péptidos, células que expresan MCY o extractos de las mismas.
Un anticuerpo contra MCY o un fragmento del mismo de la invención puede marcarse con un marcador detectable o conjugarse con una segunda molécula. Los marcadores detectables adecuados incluyen, pero sin limitación, un radioisótopo, un compuesto fluorescente, un compuesto bioluminiscente, un compuesto 25 quimioluminiscente, un quelante metálico o una enzima. Una segunda molécula para conjugación con el anticuerpo de la serie de genes MCY puede seleccionarse de acuerdo con el uso deseado. Por ejemplo, para su uso terapéutico, la segunda molécula puede ser una toxina o agente terapéutico. Además, pueden generarse anticuerpos bi-específicos con especificidad por dos o más epítopos de MCY usando procedimientos generalmente conocidos en la técnica. También pueden generarse anticuerpos homodiméricos por técnicas de entrecruzamiento conocidas en este campo (por 30 ejemplo, Wolff y col., 1993, Cancer Res. 53: 2560-2565).
VII. Animales transgénicos
También pueden usarse ácidos nucleicos que codifican un polipéptido de MCY o sus formas modificadas para generar animales transgénicos o animales "knock out" que, a su vez, son útiles en el desarrollo y selección de reactivos terapéuticamente útiles. Un animal transgénico (por ejemplo, un ratón o rata) es un animal que tiene células que 35 contienen un transgén, habiéndose introducido dicho transgén en el animal o un antepasado del animal en una fase prenatal, por ejemplo, en una fase embrionaria. Un transgén es un ADN que se integra en el genoma de una célula a partir de la cual se desarrolla un animal transgénico. En ciertas realizaciones, puede usarse un ADNc que codifica polipéptidos de MCY para clonar ADN genómico que codifica polipéptidos de MCY de acuerdo con técnicas establecidas y las secuencias genómicas pueden usarse para generar animales transgénicos que contienen células que 40 expresan ADN que codifica polipéptidos de MCY. Los procedimientos para generar animales transgénicos, particularmente animales tales como ratones o ratas, se han hecho convencionales en la técnica y se describen, por ejemplo, en las Patentes de Estados Unidos Nº 4.736.866 y 4.870.009. Típicamente, ciertas células particulares se fijarán como diana para la incorporación de transgenes MCY con potenciadores específicos de tejido. Los animales transgénicos que incluyen una copia de un transgén que codifica polipéptidos de MCY introducidos en la línea germinal 45 del animal en la fase embrionaria pueden usarse para examinar el efecto de la mayor expresión del ADN que codifica polipéptidos de MCY. Dichos animales pueden usarse como animales de ensayo para reactivos que se considera que confieren protección, por ejemplo, de afecciones patológicas asociadas con su sobreexpresión. De acuerdo con ciertas realizaciones de la invención, un animal se trata con el reactivo y una menor incidencia del estado patológico, en comparación con animales no tratados que llevan el transgén, indicaría una intervención terapéutica potencial para la 50 afección patológica.
Como alternativa, pueden usarse homólogos no humanos de polinucleótidos de MCY para construir un animal "knock out" para la serie de genes MCY que tiene un gen defectuoso o alterado como resultado de la recombinación homóloga entre el gen endógeno y el ADN genómico alterado introducido en una célula embrionaria del animal. Por ejemplo, puede usarse ADNc para clonar ADN genómico de acuerdo con técnicas establecidas. Una parte del ADN 55 genómico puede delecionarse o remplazarse por otro gen, tal como un gen que codifica un marcador de selección que puede usarse para supervisar la integración. Típicamente, en el vector se incluyen varias kilobases de ADN flanqueante no alterado (tanto en el extremo 5’ como en el extremo 3’) (véase, por ejemplo, Thomas y Capecchi, 1987, Cell 51: 503 en relación con una descripción de vectores de recombinación homóloga). El vector se introduce en una línea de células madre embrionarias (por ejemplo, por electroporación) y se seleccionan células en las que el ADN introducido se ha 60 recombinado de forma homóloga con el ADN endógeno (véase, por ejemplo, Li y col., 1992, Cell 69:975). Las células
seleccionadas después se inyectan en un blastocisto de un animal (por ejemplo, un ratón o rata) para formar quimeras de agregación (véase, por ejemplo, Bradley, en Robertson, ed., 1987, Teratocarcinomas and Embryonic Stem Cells: A Practical Approach, (IRL, Oxford), págs. 113-152). Después puede implantarse un embrión quimérico en una animal hembra pseudopreñada de acogida adecuada y el embrión puede llevarse a término para crear un animal "knock out". La descendencia que lleva el ADN recombinado de forma homóloga en sus células germinales puede identificarse por 5 técnicas convencionales y usarse para criar animales en los que todas las células del animal contienen el ADN recombinado de forma homóloga. Los animales knock out pueden caracterizarse, por ejemplo, por su capacidad de defenderse contra ciertas afecciones patológicas y por su desarrollo de afecciones patológicas debido a la ausencia del polipéptido de MCY.
VIII. Procedimientos para la detección de polinucleótidos o polipéptidos de MCY 10
Otro aspecto de la presente invención se refiere a procedimientos para detectar polinucleótidos de MCY y proteínas de MCY incluyendo variantes de las mismas, así como procedimientos para identificar una célula que expresa polinucleótidos y polipéptidos de MCY. El perfil de expresión de una serie de genes MCY hace que sea un marcador de diagnóstico para cáncer de mama y subtipos de cáncer de mama. En este contexto, el estado de polinucleótidos y proteínas de MCY proporciona información útil para predecir una diversidad de factores que incluyen la propensión a 15 padecer la enfermedad en fase avanzada, la velocidad de progresión y/o la agresividad del tumor. Como se analiza con detalle más adelante, el estado de los polinucleótidos y proteínas de MCY en muestras de pacientes puede analizarse por una diversidad de protocolos que son bien conocidos en la técnica, incluyendo análisis inmunohistoquímico, la diversidad de técnicas de transferencia de Northern que incluyen hibridación in situ, análisis de RT-PCR (por ejemplo, en muestras de micro-disección de captura láser), análisis de transferencia de Western y análisis en matrices de tejidos. 20
Más particularmente, la invención proporciona ensayos para la detección de polinucleótidos de MCY en una muestra biológica, tal como una biopsia de mama y similares. Los polinucleótidos de MCY detectables incluyen, por ejemplo, un gen MCY o fragmentos del mismo, ARNm de MCY, ARNm de MCY de variantes de corte y empalme alternativo, y moléculas de ADN o ARN recombinantes que contienen un polinucleótido de MCY. En la técnica se conocen varios procedimientos para amplificar y/o detectar la presencia de polinucleótidos de MCY y pueden emplearse 25 en la práctica de este aspecto de la invención.
En ciertos aspectos, los procedimientos para detectar ARNm de MCY en una muestra biológica comprenden producir ADNc a partir de la muestra por transcripción inversa. En ciertas realizaciones, el ADNc se amplifica usando polinucleótidos de MCY como cebadores con sentido y antisentido para amplificar ADNc de MCY y se detecta la presencia del ADNc de MCY amplificado. En ciertas realizaciones, se determina la secuencia del ADNc de MCY 30 amplificado. En ciertas otras realizaciones, los procedimientos para detectar un gen MCY en una muestra biológica comprenden aislar primero el ADN genómico de la muestra; amplificar el ADN genómico aislado usando polinucleótidos de MCY como cebadores con sentido y antisentido para amplificar el gen MCY; y detectar la presencia del gen MCY amplificado. Puede diseñarse cualquier número de combinaciones de sondas con sentido y antisentido apropiadas a partir de las secuencias de nucleótidos proporcionadas para los polinucleótidos de MCY (TABLA 1) y usarse para este 35 fin.
La invención también proporciona ensayos para detectar la presencia de una proteína de MCY en un tejido de otra muestra biológica tal como preparaciones de células de mama, y similares. También son bien conocidos procedimientos para detectar una proteína de MCY e incluyen, por ejemplo, inmunoprecipitación, análisis inmunohistoquímico, análisis de transferencia de Western, ensayos de unión molecular, ELISA, ELIFA y similares. Por 40 ejemplo, en ciertas realizaciones, los procedimientos para detectar la presencia de una proteína de MCY en una muestra biológica comprenden primero poner en contacto la muestra con un anticuerpo de MCY, un fragmento reactivo con MCY del mismo, o una proteína recombinante que contiene una región de unión a antígeno de un anticuerpo de MCY; y después detectar la unión de la proteína de MCY presente en la muestra al mismo.
En algunas realizaciones de la invención, la expresión de proteínas de MCY en una muestra se examina 45 usando protocolos de tinción inmunohistoquímica. Se ha demostrado que la tinción inmunohistoquímica de secciones de tejidos es un procedimiento fiable para evaluar la alteración de proteínas en un tejido heterogéneo. Las técnicas de inmunohistoquímica (IHQ) utilizan un anticuerpo para sondar y visualizar antígenos celulares in situ, generalmente por procedimientos cromogénicos o fluorescentes. Esta técnica destaca porque evita los efectos indeseados de la disgregación y permite la evaluación de células individuales en el contexto de la morfología. Además, la proteína diana 50 no se altera por el procedimiento de congelación.
Ciertos protocolos que examinan la expresión de proteínas de MCY en una muestra típicamente implican la preparación de una muestra de tejidos seguida de inmunohistoquímica. A continuación se proporcionan protocolos ilustrativos. Para la preparación de muestras, puede usarse cualquier muestra de tejido de un sujeto. Los ejemplos de muestras de tejidos que pueden usarse incluyen, por ejemplo, tejido de mama. La muestra de tejido puede obtenerse 55 por una diversidad de procedimientos que incluyen, por ejemplo, escisión quirúrgica, aspiración o biopsia. El tejido puede estar fresco o congelado. En una realización, la muestra de tejido se fija y se incluye en parafina o similares. La muestra de tejido puede fijarse (es decir, conservarse) por la metodología convencional (véase, por ejemplo, "Manual of Histological Staining Method of the Armed Forces Institute of Pathology," 3ª edición (1960) Lee G. Luna, HT (ASCP) Editor, The Blakston Division McGraw-Hill Book Company, New York; The Armed Forces Institute of Pathology 60
Advanced Laboratory Methods in Histology and Pathology (1994) Ulreka V. Mikel, Editor, Armed Forces Institute of Pathology, American Registry of Pathology, Washington, D.C.). Un experto en la materia apreciará que la elección del agente de fijación se determina por el objetivo para el que el tejido se va a teñir histológicamente o analizarse de otra manera. Un experto en la materia también apreciará que la longitud de la fijación depende del tamaño de la muestra de tejido y del agente de fijación usado. A modo de ejemplo, puede usarse formalina tamponada neutra, Bouin o 5 paraformaldehído para fijar una muestra de tejido.
Generalmente, la muestra de tejido primero se fija y después se deshidrata a través de una serie ascendente de alcoholes, se infiltra y se incluye en parafina u otro medio de seccionamiento de forma que la muestra de tejido pueda seccionarse. Como alternativa, se puede seccionar el tejido y fijar las secciones obtenidas. A modo de ejemplo, la muestra de tejido puede incluirse y procesarse en parafina por la metodología convencional (véase, por ejemplo, 10 "Manual of Histological Staining Method of the Armed Forces Institute of Pathology", supra). Los ejemplos de parafinas que pueden usarse incluyen, pero sin limitación, Paraplast, Broloid y Tissuemay. Una vez que la muestra de tejidos se ha incluido, la muestra puede seccionarse por un microtomo o similar (véase, por ejemplo, "Manual of Histological Staining Method of the Armed Forces Institute of Pathology", supra). A modo de ejemplo para este procedimiento, las secciones pueden variar de aproximadamente tres micrómetros a aproximadamente 5 micrómetros de espesor. Una vez 15 seccionadas, las secciones pueden unirse a portaobjetos por varios procedimientos convencionales. Los ejemplos de adhesivos de portaobjetos incluyen, pero sin limitación, silano, gelatina, poli-L-lisina y similares. A modo de ejemplo, las secciones incluidas en parafina pueden unirse a portaobjetos cargados positivamente y/o a portaobjetos recubiertos con poli-L-lisina.
Si la parafina se ha usado como material de inclusión, las secciones de tejido generalmente se desparafinan y 20 se rehidratan con agua. Las secciones de tejido pueden desparafinarse por varias metodologías convencionales estándar. Por ejemplo, pueden usarse xilenos y una serie gradualmente descendiente de alcoholes (véase, por ejemplo, "Manual of Histological Staining Method of the Armed Forces Institute of Pathology", supra). Como alternativa, pueden usarse agentes no orgánicos de desparafinado disponibles en el mercado tales como Hemo-De7 (CMS, Houston, Texas). 25
Después de la preparación del tejido, una sección de tejido puede someterse a inmunohistoquímica (IHQ). La IHQ puede realizarse en combinación con técnicas adicionales tales como tinción morfológica y/o hibridación in situ con fluorescencia. Se dispone de dos procedimientos generales de IHQ; ensayos directos e indirectos. De acuerdo con el primer ensayo, se determina directamente la unión del anticuerpo al antígeno diana. Este ensayo directo usa un reactivo marcado, tal como un marcador fluorescente o un anticuerpo primario marcado con enzima, que puede visualizarse sin 30 interacción adicional con anticuerpos. En un ensayo indirecto típico, el anticuerpo primario no conjugado se une al antígeno y después un anticuerpo secundario marcado se une al anticuerpo primario. Cuando el anticuerpo secundario se conjuga con un marcador enzimático, puede añadirse un sustrato cromogénico o fluorogénico para proporcionar visualización del antígeno. Se produce amplificación de señal porque varios anticuerpos secundarios pueden reaccionar con diferentes epítopos en el anticuerpo primario. 35
El anticuerpo primario y/o secundario usado para inmunohistoquímica típicamente se marcará con un resto detectable. Se dispone de numerosos marcadores que generalmente pueden agruparse en las siguientes categorías:
(a) Radioisótopos tales como 35S, 14C, 125I, 3H y 131I. El anticuerpo puede marcarse con el radioisótopo usando las técnicas descritas en Current Protocols in Immunologgy, Volúmenes 1 y 2, Coligen y col., Ed. Wiley-Interscience, New York, New York, Pubs. (1991) por ejemplo, y la radioactividad puede medirse usando recuento de centelleo. 40
(b) Partículas de oro coloidal.
(c) Marcadores fluorescentes incluyendo, por ejemplo, quelatos de tierras raras (quelatos de europio), Rojo Texas, rodamina, fluoresceína, dansilo, lisamina, umbeliferona, ficoeritrina, ficocianina o fluoróforos disponibles en el mercado tales como SPECTRUM ORANGE7 y SPECTRUM GREEN7 y/o derivados de uno cualquiera o más de los anteriores. Los marcadores fluorescentes pueden conjugarse con el anticuerpo usando las técnicas desveladas 45 en Current Protocols in Immunology, supra, por ejemplo. La fluorescencia puede cuantificarse usando un fluorímetro.
(d) Se dispone de diversos marcadores de enzima-sustrato y la Patente de Estados Unidos Nº 4.275.149 proporciona una revisión de algunos de ellos. La enzima generalmente cataliza una alteración química del sustrato cromogénico que puede medirse usando diversas técnicas. Por ejemplo, la enzima puede catalizar un cambio de 50 color en un sustrato, que puede medirse espectrofotométricamente. Como alternativa, la enzima puede alterar la fluorescencia o quimioluminiscencia del sustrato. Más adelante se describen técnicas para cuantificar un cambio en fluorescencia. El sustrato quimioluminiscente se excita electrónicamente por una reacción química y después puede emitir luz que puede medirse (usando un quimioluminómetro, por ejemplo) o dona energía a un aceptor fluorescente. Los ejemplos de marcadores enzimáticos incluyen luciferasas (por ejemplo, luciferasa de luciérnaga y 55 luciferasa bacteriana; Patente de Estados Unidos Nº 4.737.456), luciferina, 2,3-dihidroftalazinadionas, malato deshidrogenasa, ureasa, peroxidasa tal como peroxidasa de rábano picante (HRPO), fosfatasa alcalina, -galactosidasa, glucoamilasa, lisozima, sacárido oxidasas (por ejemplo, glucosa oxidasa, galactosa oxidasa y glucosa-6-fosfato deshidrogenasa), oxidasas heterocíclicas (tales como uricasa y oxidasa xantínica),
lactoperoxidasa, microperoxidasa y similares. Se describen técnicas para conjugar enzimas con anticuerpos en O’Sullivan y col., Methods for the Preparation of Enzyme-Antibody Conjugates for use in Enzyme Immunoassay, en Methods in Enzym. (ed. J. Langone & H. Van Vunakis), Academic press, New York, 73: 147-166 (1981).
Los ejemplos de combinaciones de enzima-sustrato incluyen, por ejemplo:
(i) Peroxidasa de rábano picante (HRPO) con hidrógeno peroxidasa como sustrato, donde la hidrógeno 5 peroxidasa oxida un precursor de colorante (por ejemplo, ortofenilendiamina (OPD) o clorhidrato de 3,3’,5,5’-tetrametil bencidina (TMB));
(ii) Fosfatasa alcalina (AP) con para-Nitrofenil fosfato como sustrato cromogénico; y
(iii) -D-galactosidasa (-D-Gal) con un sustrato cromogénico (por ejemplo p-nitrofenil--D-galactosidasa) o sustrato fluorogénico (por ejemplo 4-metilumbeliferil--D-galactosidasa). 10
Están disponibles para los expertos en la materia otras numerosas combinaciones de enzima-sustrato. Como revisión general de éstas, véanse las Patentes de Estados Unidos Nº 4.275.149 y 4.318.980. Algunas veces, el marcador se conjuga indirectamente con el anticuerpo. El experto en la materia será consciente de las diversas técnicas para conseguir esto. Por ejemplo, el anticuerpo puede conjugarse con biotina y cualquiera de las cuatro categorías amplias de marcadores mencionadas anteriormente puede conjugarse con avidina, o viceversa. La biotina se une 15 selectivamente a avidina y, por lo tanto, el marcador puede conjugarse con el anticuerpo de esta manera indirecta. Como alternativa, para conseguir conjugación indirecta del marcador con el anticuerpo, el anticuerpo se conjuga con un pequeño hapteno y uno de los diferentes tipos de marcadores mencionados anteriormente se conjuga con un anticuerpo anti-hapteno. De esta manera, puede conseguirse la conjugación indirecta del marcador con el anticuerpo.
Aparte de los procedimientos de preparación de muestra analizados anteriormente, puede desearse un 20 tratamiento adicional de la sección de tejido antes, durante o después de IHQ. Por ejemplo, pueden realizarse procedimientos de recuperación de epítopo, tales como calentamiento de la muestra de tejido en tampón citrato (véase, por ejemplo, Leong y col. Appl. Immunohistochem. 4(3): 201 (1996)).
Después de una etapa de bloqueo opcional, la sección de tejido se expone a anticuerpos primarios durante un periodo de tiempo suficiente y en condiciones adecuadas de tal forma que el anticuerpo primario se una al antígeno de 25 la proteína diana en la muestra de tejido. Las condiciones apropiadas para conseguir esto pueden determinarse por experimentación rutinaria. El grado de unión de anticuerpo a la muestra se determina usando uno cualquiera de los marcadores de detección analizados anteriormente. Preferentemente, el marcador es un marcador enzimático (por ejemplo, HRPO) que cataliza una alteración química del sustrato cromogénico tal como cromógeno de 3,3’-diaminobenzidina. Preferentemente, el marcador enzimático se conjuga con un anticuerpo que se une específicamente 30 al anticuerpo primario (por ejemplo, el anticuerpo primario es anticuerpo policlonal de conejo y el anticuerpo secundario es anticuerpo de cabra anti-conejo).
Las muestras preparadas de esta manera pueden montarse y cubrirse con un cubreobjetos. Después se determina la evaluación del portaobjetos, por ejemplo, usando un microscopio.
Aunque sin limitarse por los siguientes parámetros, los criterios de intensidad de tinción de proteínas pueden 35 evaluarse como se ilustra en el siguiente diagrama.
IX. Criterios de Intensidad de Tinción de Proteínas
Patrón de Tinción
puntuación
No se observa tinción en las células tumorales
0
Se detecta una tinción tenue/apenas perceptible en las células tumorales
1+
Se observa una tinción completa de débil a moderada en las células tumorales
2+
Se observa una tinción completa de moderada a fuerte en las células tumorales
3+
Se observa una tinción completa de fuerte a muy fuerte en las células tumorales
4+
En ciertas realizaciones, el nivel de expresión de los polipéptidos de MCY se mide por un inmunoensayo. Los expertos en la materia saben que un "inmunoensayo" típicamente comprende incubar una muestra de ensayo con una o 40 más moléculas inmunointeractivas específicas para una diana durante un tiempo y en condiciones suficientes para su unión y detectar dicha unión. Como se usa en el presente documento, el término "diana" se refiere al analito para el que se ha diseñado la sonda. En ciertas realizaciones, la molécula inmunointeractiva será un anticuerpo. Las condiciones para incubar un anticuerpo con una muestra de ensayo varían, dependiendo del formato empleado en el ensayo, los procedimientos de detección empleados y el tipo y naturaleza de la molécula de anticuerpo usada en el ensayo. Los 45
expertos en la materia reconocerán que uno cualquiera de los formatos de ensayo inmunológicos disponibles en el mercado, por ejemplo radioinmunoensayos, ensayos inmunoabsorbentes ligados a enzima (ELISA), Ouchterlony basado en difusión, inmunoelectroforesis en gel en cohete o inmunoensayos in situ pueden adaptarse fácilmente al presente fin.
Los inmunoensayos son útiles en la cuantificación de un polipéptido en una muestra de ensayo, en particular 5 para determinar si el nivel de un polipéptido de MCY está alterado en comparación con los niveles normales detectables en individuos no enfermos o en individuos que tienen un tipo diferente de enfermedad o incluso diferente tipo de cáncer de mama. Los inmunoensayos pueden tener también otros usos tales como, por ejemplo, el uso en la supervisión de la progresión de la enfermedad o la supervisión de la respuesta a intervenciones terapéuticas. La invención descrita en el presente documento se extiende a todos estos usos de moléculas inmunointeractivas y ensayos de diagnóstico que 10 requieren dichos inmunoensayos para su realización.
A modo de ejemplo únicamente, en ciertas realizaciones, un anticuerpo inducido contra un polipéptido de MCY se inmoviliza sobre un sustrato sólido para formar un primer complejo y una muestra biológica de ensayo de un paciente se pone en contacto con la molécula unida. Después de un periodo de incubación adecuado, durante un periodo de tiempo suficiente para permitir la formación de un complejo secundario de anticuerpo, se añade un segundo anticuerpo 15 marcado con una molécula indicadora capaz de producir una señal detectable y se incuba, dejando suficiente tiempo para la formación de un complejo terciario. Cualquier material que no haya reaccionado se retira por lavado y se determina la presencia del complejo terciario por la observación de una señal producía por la molécula indicadora. Los resultados pueden ser cualitativos, por medio de la simple observación de la señal visible, o pueden cuantificarse por comparación con una muestra de control que contiene cantidades conocidas de hapteno. Las variaciones de este 20 ensayo incluyen un ensayo simultáneo, en el que se añaden simultáneamente tanto la muestra como el anticuerpo marcado al anticuerpo unido, o un ensayo inverso en el que primero se combinan el anticuerpo marcado y la muestra a ensayar, se incuban y después se añaden simultáneamente al anticuerpo unido. Estas técnicas son bien conocidas para los expertos en la materia y será evidente fácilmente la posibilidad de variaciones.
Por "molécula indicadora" como se usa en la presente memoria descriptiva, se entiende una molécula que, por 25 su estructura química, produce una señal identificable analíticamente que permite la detección del anticuerpo unido al antígeno. La detección puede ser cualitativa o cuantitativa. La molécula indicadora usada más comúnmente en este tipo de ensayo son enzimas, fluoróforos o moléculas que contienen radionúclidos (es decir radioisótopos).
El sustrato sólido típicamente es vidrio o un polímero, siendo los polímeros usados más comúnmente celulosa, poliacrilamida, nylon, poliestireno, poli(cloruro de vinilo) o polipropileno. Los soportes sólidos pueden estar en forma de 30 tubos, perlas, discos o microplacas, o cualquier otra superficie adecuada para realizar un inmunoensayo. Los procedimientos de unión son bien conocidos en la técnica y generalmente consisten en la unión covalente por entrecruzamiento o la adsorción física de la molécula al soporte insoluble.
En los procedimientos de la invención puede usarse una diversidad de formatos de inmunoensayo incluyendo, por ejemplo, formatos de inmunoensayo competitivos y no competitivos, ensayos de captura de antígenos y ensayos 35 tipo sándwich de dos anticuerpos (Self y Cook, Curr. Opin. Biotechnol. 7:60-65 (1996)). En un ensayo de captura de antígeno, el anticuerpo se une a una fase sólida y se añade muestra de tal forma que un antígeno polipeptídico de MCY se una por el anticuerpo. Después de haber retirado por lavado las proteínas no unidas, la cantidad de antígeno unido puede cuantificarse, si se desea, usando, por ejemplo, un radioensayo (Harlow y Lane, Antibodies A Laboratory Manual Cold Spring Harbor Laboratory: New York, 1988)). Los inmunoensayos pueden realizarse en condiciones de exceso de 40 anticuerpo, o como competiciones de antígeno, para cuantificar la cantidad de antígeno y, de esta manera, determinar el nivel de expresión de un polipéptido de la serie de genes MCY.
Los ensayos inmunoabsorbentes ligados a enzima (ELISA) pueden ser útiles en ciertos procedimientos de la invención. En el caso de un inmunoensayo enzimático, una enzima se conjuga con el segundo anticuerpo, generalmente por medio de glutaraldehído o peryodato. Sin embargo, como se reconocerá fácilmente, existe una amplia 45 diversidad de técnicas de conjugación diferentes que están disponibles fácilmente para un experto en la materia. Las enzimas usadas comúnmente incluyen, por ejemplo, peroxidasa de rábano picante, glucosa oxidasa, -galactosidasa y fosfatasa alcalina, entre otras. Los sustratos a usar con las enzimas específicas generalmente se eligen para la producción, tras la hidrólisis por la enzima correspondiente, de un cambio de color detectable. También es posible emplear sustratos fluorogénicos, por ejemplo, que producen un producto fluorescente. Una enzima tal como peroxidasa 50 de rábano picante (HRP), fosfatasa alcalina (AP), -galactosidasa o ureasa puede unirse, por ejemplo, a un fragmento C terminal del receptor anti-adiponectina o a un anticuerpo secundario para su uso en un procedimiento de la invención. Puede usarse un sistema de detección de peroxidasa de rábano picante, por ejemplo, con el sustrato cromogénico tetrametilbencidina (TMB), que produce un producto soluble en presencia de peróxido de hidrógeno que es detectable a 450 nm. Otros sistemas ligados a enzima convenientes incluyen, por ejemplo, el sistema de detección de fosfatasa 55 alcalina, que puede usarse, por ejemplo, con el sustrato cromogénico p-nitrofenil fosfato para producir un producto soluble fácilmente detectable a 405 nm. De forma similar, puede usarse un sistema de detección de -galactosidasa, por ejemplo, con el sustrato cromogénico o-nitrofenil--D-galactopiranósido (ONPG) para producir un producto soluble detectable a 410 nm, o puede usarse un sistema de detección de ureasa, por ejemplo, con un sustrato tal como urea-púrpura de bromocresol (Sigma Immunochemicals, St. Louis, Mo.). Pueden obtenerse anticuerpos primarios y 60 secundarios ligados a enzima útiles a partir de varias fuentes comerciales tales como Jackson Immuno-Research (West
Grove, Pa.).
En ciertas realizaciones, un polipéptido de MCY puede detectarse y medirse usando detección quimioluminiscente. Por ejemplo, en ciertas realizaciones, se usan anticuerpos específicos para el polipéptido de MCY para capturar los polipéptidos presentes en la muestra biológica y se usa un anticuerpo específico para los anticuerpos específicos y marcado con un marcador quimioluminiscente para detectar los polipéptidos presentes en la muestra. En 5 los presentes procedimientos puede usarse cualquier marcador quimioluminiscente y sistema de detección. Los anticuerpos secundarios quimioluminiscentes pueden obtenerse comercialmente de diversas fuentes tales como Amersham. En la técnica se conocen procedimientos para detectar anticuerpos secundarios quimioluminiscentes y no se analizan con detalle en el presente documento.
La detección fluorescente también puede ser útil para detectar los fragmentos de receptor de adiponectina en 10 ciertos procedimientos de la invención. Los fluorocromos útiles incluyen, por ejemplo, DAPI, fluoresceína, metales lantánidos, Hoechst 33258, R-ficocianina, B-ficoeritrina, R-ficoeritrina, rodamina, rojo Texas y lisamina. En la invención pueden ser útiles agentes de unión específica a 2-MG, HA, TIMP-1 o YKL-40 marcados con fluoresceína o rodamina tales como anticuerpos anti-2-MG, anti-HA, anti-TIMP-1 o anti-YKL-40, o anticuerpos secundarios marcados con fluoresceína o rodamina. Pueden obtenerse anticuerpos fluorescentes útiles en el mercado, por ejemplo, en Tago 15 Inmunologicals (Burlingame, Calif.) como se describe adicionalmente más adelante. Los compuestos fluorescentes pueden acoplarse químicamente a anticuerpos sin alterar su capacidad biológica. Cuando se activan por iluminación con luz de una longitud de onda particular, el anticuerpo marcado con fluorocromo adsorbe la energía luminosa, induciendo un estado de excitabilidad en la molécula, seguido de emisión de la luz a un color característico detectable visualmente con un microscopio óptico. 20
Los radioinmunoensayos (RIA) también pueden ser útiles en ciertos procedimientos de la invención. Dichos ensayos son bien conocidos en la técnica. Los radioinmunoensayos pueden realizarse, por ejemplo, con anticuerpo primario o secundario marcado con 125I (Harlow y Lane, supra, 1988).
Una señal de un reactivo detectable puede analizarse, por ejemplo, usando un espectrofotómetro para detectar color de un sustrato cromogénico; un contador de radiación para detectar radiación, tal como un contador gamma para 25 la detección de 125I; o un fluorómetro para detectar fluorescencia en presencia de luz de una cierta longitud de onda. Cuando se usa un ensayo ligado a enzima, el análisis cuantitativo de la cantidad de fragmentos de receptor de adiponectina soluble puede realizarse usando un espectrofotómetro tal como un Lector de Microplacas EMAX (Molecular Devices; Menlo Park, Calif.) de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Los ensayos de la invención pueden ser automáticos o realizarse robóticamente, si se desea, y la señal de múltiples muestras puede detectarse 30 simultáneamente.
Los procedimientos de la invención también incluyen el uso de inmunoensayos basados en electroforesis capilar (CEIA), que pueden ser automáticos, si se desea. También pueden usarse inmunoensayos junto con fluorescencia inducida por láser como se describe, por ejemplo, en Schmalzing y Nashabeh, Electrophoresis 18:2184-93 (1997), y Bao, J. Chromatogr. B. Biomed. Sci. 699: 463-80 (1997). También pueden usarse inmunoensayos de 35 liposomas, tales como inmunoensayos de liposomas de inyección de flujo e inmunosensores de liposomas, para detectar polipéptidos de la serie de genes MCY o para determinar el nivel de un polipéptido de la serie de genes MCY de acuerdo con ciertos procedimientos de la invención (Rongen y col., J. Immunol. Methods 204:105-133 (1997)).
Los inmunoensayos enzimáticos tipo sándwich también pueden ser útiles en ciertos procedimientos de la invención. En un ensayo tipo sándwich de dos anticuerpos, un primer anticuerpo se une a un soporte sólido y se deja 40 que el antígeno se una al primer anticuerpo. La cantidad de un polipéptido de la serie de genes MCY puede cuantificarse midiendo la cantidad de segundo anticuerpo que se une al mismo.
También puede usarse transferencia de Western cuantitativa para determinar el nivel de polipéptido de MCY en un procedimiento de la invención. Las transferencias de Western pueden cuantificarse por procedimientos bien conocidos tales como densitometría de exploración. Como ejemplo, las muestras de proteínas se someten a 45 electroforesis en geles Laemmli de SDS-PAGE al 10%. Los anticuerpos monoclonales murinos primarios se hacen reaccionar con la mancha de transferencia y se confirma que la unión del anticuerpo es lineal usando un experimento de transferencia por ranuras (slot blot) preliminar. Como anticuerpo secundario se usan anticuerpos acoplados con peroxidasa de rábano picante de cabra anti-ratón (BioRad), y la detección de señal se realiza usando quimioluminiscencia, por ejemplo, con el kit de quimioluminiscencia Renaissance (New England Nuclear; Boston, Mass.) 50 de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Las autorradiografías de las manchas de transferencia se analizan usando un densitómetro de exploración (Molecular Dynamics; Sunnyvale, Calif.) y se normalizan con respecto a un control positivo. Los valores se presentan, por ejemplo, como la relación entre el valor real y el control positivo (índice densitométrico). Dichos procedimientos son bien conocidos en la técnica como se describe, por ejemplo, en Parra y col., J. Vasc. Surg. 28: 669-675 (1998). 55
Los niveles de un polipéptido de MCY también pueden determinarse usando micromatrices de proteínas. En la técnica se describen procedimientos para producir micromatrices de proteínas que pueden adaptarse para detectar niveles de proteína en una muestra clínica (véase, por ejemplo, Xiao y col. (2005) Mol Cell Endocrinol.; 230(1-2): 95-10; Protein Microarrays (2004) Mark Schena (Ed) Jones y Bartlett Publishers, Inc.). La Publicación de Patente de Estados
Unidos 2003/0153013 describe procedimientos para detectar proteínas, por ejemplo, antígenos o anticuerpos, inmovilizando anticuerpos en una micromatriz de proteínas en una membrana y poniendo en contacto la micromatriz con proteínas de detección que pueden unirse a las proteínas para formar complejos de proteína. De forma similar, la Publicación de Patente de Estados Unidos Nº 2004/0038428 describe procedimientos para construir micromatrices de proteína. 5
En ciertas realizaciones preferidas, se analiza una muestra biológica, es decir una célula tumoral, por medio de un biochip. Los biochips generalmente comprenden sustratos sólidos y tienen una superficie generalmente plana, a la que se une un reactivo de captura (también denominado reactivo adsorbente o de afinidad). Con frecuencia, la superficie de un biochip comprende una pluralidad de localizaciones dirigibles, teniendo cada una de ellas el reactivo de captura unido. 10
Los biochips de proteínas son biochips adaptados para la captura de péptidos. En la técnica se describen muchos biochips de proteína. Éstos incluyen, por ejemplo, biochips de proteínas producidos por Ciphergen Biosystems, Inc. (Fremont, CA), Packard BioScience Company (Meriden CT), Zyomyx (Hayward, CA); Phylos (Lexington, MA) y Biacore (Uppsala, Suecia). En las siguientes patentes o solicitudes de patente publicadas se describen ejemplos de dichos biochips de proteínas: Patente de Estados Unidos Nº 6.225.047; Publicación Internacional PCT Nº WO 15 99151773; Patente de Estados Unidos Nº 6.329.209, Publicación Internacional PCT Nº WO 00/56934 y Patente de Estados Unidos Nº 5.242.828.
Para su uso en el presente documento, los procedimientos de ensayo pueden implicar la captura de polipéptidos de MCY en un sustrato sólido. Típicamente, se capturarán usando un reactivo de captura bioespecífico tal como un anticuerpo y, en particular, un anticuerpo usado en un inmunoensayo. Los reactivos de captura bioespecíficos 20 incluyen las moléculas que se unen a un analito diana con un afinidad de al menos 10-9 M, 10-10 M, 10-11 M o 10-12 M. Estas moléculas también pueden capturarse con procedimientos no específicos tales como materiales cromatográficos.
En ciertas realizaciones de la presente invención, un polipéptido de MCY puede detectarse por espectrometría de masas. Los ejemplos de espectrómetros de masas son de tiempo de vuelo, sector magnético, filtro cuadrupolo, trampa de iones, resonancia del ciclotrón del ion, analizador de sector electrostático e híbridos de éstos. 25
Otros procedimientos para identificar una célula que expresa polipéptidos o polinucleótidos de MCY también están disponibles para el experto en la materia. En ciertas realizaciones, un ensayo para identificar una célula que expresa un gen MCY comprende detectar la presencia del ARNm de MCY en la célula. Los procedimientos para la detección de ARNm particulares en las células son bien conocidos e incluyen, por ejemplo, ensayos de hibridación que usan sondas de ADN complementarias (tales como hibridación in situ usando ribosondas de series de genes MCY 30 marcadas, transferencia de Northern y técnicas relacionadas) y diversos ensayos de amplificación de ácidos nucleicos (tales como RT-PCR usando cebadores complementarios específicos para la serie de genes MCY, y otros procedimientos de detección de tipo amplificación tales como, por ejemplo, ADN ramificado, SISBA, TMA y similares). Como alternativa, un ensayo para identificar una célula que expresa un gen MCY comprende detectar la presencia de la proteína de la serie de genes MCY en la célula o secretada por la célula. En la técnica se conocen diversos 35 procedimientos para la detección de proteínas y pueden emplearse para la detección de proteínas de la serie de genes MCY y de células que expresan la serie de genes MCY.
El análisis de la expresión de series de genes MCY también puede ser útil como herramienta para identificar y evaluar agentes que modulan la expresión de genes MCY. Por ejemplo, la expresión de la serie de genes MCY se regula positivamente de manera significativa en el cáncer de mama, y también se expresa de forma aberrante en otros 40 cánceres. La identificación de una molécula o agente biológico que pueda inhibir la expresión de la serie de genes MCY o la sobreexpresión en células cancerosas puede tener valor terapéutico. Dicho agente puede identificarse, por ejemplo, usando una selección que cuantifique la expresión de la serie de genes MCY por RT-PCR, hibridación de ácidos nucleicos o unión de anticuerpos.
X. Control de la expresión de la serie de genes MCY 45
Para ciertos de los procedimientos descritos en el presente documento, se determina el nivel de expresión de al menos un gen seleccionado entre moesina, caveolina 1 o proteína 1 asociada a yes o cualquier combinación de las mismas en diferentes muestras de pacientes para los que se desea información de diagnóstico o pronóstico, para proporcionar perfiles (es decir, detectar el nivel de polinucleótidos de moesina; polinucleótidos que caveolina 1; polinucleótidos de proteína 1 asociada yes; polinucleótidos de moesina y caveolina 1; polinucleótidos de moesina y 50 proteína 1 asociada a yes; polinucleótidos de caveolina 1 y proteína 1 asociada a yes; o polinucleótidos de moesina, caveolina 1 y proteína 1 asociada a yes). Un perfil de una muestra particular es esencialmente una "huella digital" del estado de la muestra. Un estado normal puede distinguirse de un estado de enfermedad y, dentro de los estados de enfermedad, pueden determinarse diferentes tipos de enfermedad y diferentes estados de pronóstico (buen y mal prospecto de supervivencia a largo plazo, por ejemplo). El diagnóstico puede realizarse o confirmarse comparando 55 muestras de pacientes con los perfiles conocidos. Por medio de la evaluación de la evolución de los diferentes tiempos de expresión durante la progresión de la enfermedad, puede determinarse el estadio de la enfermedad así como al pronóstico probable.
Un principio del ensayo de diagnóstico es la correlación de los resultados de un procedimiento con parámetros clínicos particulares. La correlación necesariamente implica una comparación entre dos o más grupos distinguidos por el parámetro clínico. Un parámetro clínico podría ser, por ejemplo, la presencia o ausencia de enfermedad, riesgo de enfermedad, estadio de enfermedad, gravedad de enfermedad, clase de enfermedad o respuesta al tratamiento de la enfermedad. Por consiguiente, el médico a cargo del diagnóstico usa esta correlación para cualificar el estado de un 5 sujeto con respecto al parámetro clínico. Es decir, el médico a cargo del diagnóstico usa los resultados de un procedimiento sobre un sujeto para clasificar o diagnosticar el estado de un sujeto con respecto a un parámetro clínico, estando relacionada la confianza del diagnóstico/clasificación con el poder de clasificación o división de los signos o síntomas usados en el ensayo.
Los procedimientos descritos en el presente documento para cualificar o cuantificar la expresión de 10 polipéptidos y polinucleótidos de MCY proporcionan información que puede correlacionarse con afecciones patológicas, predisposición a enfermedades, supervisión terapéutica y estratificación de riesgos, entre otros.
Los presentes procedimientos son particularmente útiles para diagnosticar afecciones, evaluar si ciertos fármacos tendrán un efecto deseado, es decir, determinar la capacidad de respuesta a un fármaco y determinar el pronóstico. Los presentes procedimientos pueden usarse para una detección precoz de enfermedades así como para la 15 optimización de protocolos de tratamiento.
Para su uso en el presente documento, "diagnosticar una afección" se refiere a determinar si un sujeto tiene o no una mayor probabilidad de tener una afección específica. Es posible que los ensayos que se usan para diagnosticar una afección, tales como los ensayos descritos en el presente documento, en ciertos casos no puedan diagnosticar una afección por sí mismos, pero se usan en combinación con otros ensayos para diagnosticar una afección. Por 20 consiguiente, se entiende que "diagnosticar una afección" incluye cualquier procedimiento que también ayuda en el diagnóstico de una afección. La presente invención puede usarse, por ejemplo, para determinar si un sujeto tiene una mayor probabilidad de tener un cierto tipo de cáncer y/o un cierto tipo de cáncer de mama, es decir, cáncer de mama triple negativo o cáncer de mama de subtipo basal.
Ciertas realizaciones de la invención proporcionan procedimientos para examinar la expresión de genes MCY 25 para predecir la sensibilidad de un cáncer de mama a N-(2-cloro-6-metilfenil)-2-[[6-[4-(2-hidroxietil)-1-piperazinil]-2-metil-4-pirimidinil]amino]-5-tiazolcarboxamida o una sal, solvato o hidrato farmacéuticamente aceptable de la misma. Una realización típica de la presente invención proporciona procedimientos para examinar la expresión de genes MCY en diversos cánceres de mama, por ejemplo, el subtipo basal de cáncer de mama, estando la expresión de esta serie de genes en las células cancerosas correlacionada con la sensibilidad de las células a la N-(2-cloro-6-metilfenil)-2-[[6-[4-(2-30 hidroxietil)-1-piperazinil]-2-metil-4-pirimidinil]amino]-5-tiazolcarboxamida o una sal, solvato o hidrato farmacéuticamente aceptable de la misma. Como se ha indicado en el presente documento, esta divulgación proporciona un enfoque farmacogenómico que identifica un fenotipo de cáncer específico (caracterizado por la expresión de la serie de genes MCY) que responde a N-(2-cloro-6-metilfenil)-2-[[6-[4-(2-hidroxietil)-1-piperazinil]-2-metil-4-pirimidinil]amino]-5-tiazolcarboxamida o una sal, solvato o hidrato farmacéuticamente aceptable de la misma. Los expertos en la materia 35 observarán que este fenotipo también es probable que responda a análogos de dasatinib, es decir, los compuestos relacionados con dasatinib por estructura y/o por modulación de la función de la misma diana biológica (quinasas BCR-ABL y SRC) de esta molécula.
Los ensayos que evalúan el estado de los polinucleótidos y polipéptidos de MCY en un individuo pueden proporcionar información sobre el crecimiento o potencial oncogénico de una muestra biológica de este individuo. Por 40 ejemplo, como el ARNm de MCY se expresa de forma elevada en ciertas células de cáncer de mama en comparación con el tejido de mama normal, pueden usarse ensayos que evalúen los niveles relativos de transcritos de ARNm de MCY o proteínas en una muestra biológica para diagnosticar una enfermedad asociada con la desregulación de la serie de genes MCY tal como cáncer y pueden proporcionar información de pronóstico que puede ser útil, por ejemplo, para definir opciones terapéuticas apropiadas. De forma similar, también pueden usarse en este contexto ensayos que 45 evalúan la integridad de secuencias de nucleótidos y aminoácidos de MCY en una muestra biológica.
El descubrimiento de que el ARNm de MCY también se expresa de forma elevada en ciertos subtipos de cáncer de mama proporciona indicios de que este gen está asociado con el crecimiento celular desregulado y, por lo tanto, identifica a este gen y sus productos como dianas que el experto en la materia puede usar para evaluar muestras biológicas de individuos que se sospecha que tienen una enfermedad asociada con la desregulación de MCY. En este 50 contexto, la evaluación del estado de polinucleótidos y/o polipéptidos de MCY puede usarse para conseguir información sobre el potencial de enfermedad de una muestra de tejido.
En este contexto, el término "estado" se usa de acuerdo con su significado aceptado en la técnica y se refiere a la condición de un gen y sus productos incluyendo, pero sin limitación, la integridad y/o metilación de un gen, incluyendo sus secuencias reguladoras, la localización de productos génicos expresados (incluyendo la localización de células que 55 expresan la serie de genes MCY), la presencia, nivel y actividad biológica de productos génicos expresados (tales como polinucleótidos, polipéptidos y ARN de MCY), la presencia o ausencia de modificaciones transcripcionales y traduccionales en los productos génicos expresados así como asociaciones de productos génicos expresados con otras moléculas biológicas tales como compañeros de unión de proteínas. Las alteraciones en el estado de la serie de genes MCY pueden evaluarse por una amplia diversidad de metodologías bien conocidas en la técnica, típicamente las 60
analizadas más adelante. Típicamente, una alteración en el estado de la serie de genes MCY comprende un cambio en la localización de las células que expresan la serie de genes MCY, un aumento en el ARNm y/o la expresión de proteínas de MCY y/o la asociación o disociación del polipéptido de MCY con una molécula de unión.
El perfil de expresión de la serie de genes MCY hace que sea un marcador de diagnóstico para el cáncer de mama local y/o con metástasis. En particular, el estado de la serie de genes MCY proporciona información útil para 5 predecir la susceptibilidad a un estadio o subtipo de enfermedad particular, progresión y/o agresividad tumoral. La invención proporciona procedimientos y ensayos para determinar el estado de la serie de genes MCY y caracterizar cánceres que expresan la serie de genes MCY, tales como cánceres de mama. El estado de la serie de genes MCY en muestras de pacientes pueden analizarse por varios medios bien conocidos en la técnica incluyendo, sin limitación, análisis inmunohistoquímico, hibridación in situ, análisis RT-PCR sobre muestras de microdisección de captura con 10 láser, análisis de transferencia de Western de muestras clínicas y líneas celulares, y análisis en matrices de tejidos. Pueden encontrarse protocolos típicos para evaluar el estado del gen y los productos génicos de la serie de genes MCY, por ejemplo, en Ausubul y col. eds., 1995, Current Protocols In Molecular Biology, Units 2 [Northern Blotting], 4 [Southern Blotting], 15 [Immunoblotting] y 18 [PCR Analysis].
Como se ha descrito anteriormente, el estado de la serie de genes MCY en una muestra biológica puede 15 examinarse por varios procedimientos bien conocidos en la técnica. Por ejemplo, el estado de la serie de genes MCY en una muestra biológica tomada de una localización específica del cuerpo puede examinarse determinando el nivel de células que expresan la serie de genes MCY (por ejemplo, las que expresan polinucleótidos de MCY (por ejemplo, ARNm o proteínas)). Este examen puede proporcionar indicios de un crecimiento celular desregulado, por ejemplo, cuando se encuentran células de mama que expresan la serie de genes MCY en una muestra biológica que 20 normalmente no contiene dichas células (tales como un ganglio linfático, hueso o bazo) o las contiene pero a un nivel diferente. Dichas alteraciones en el estado de la serie de genes MCY en una muestra biológica con frecuencia están asociadas con un crecimiento celular desregulado. Específicamente, un indicador de crecimiento celular desregulado es la metástasis de células cancerosas de un órgano de origen (tal como la glándula mamaria) a un área diferente del cuerpo (tal como un ganglio linfático). En este contexto, la evidencia de un crecimiento celular desregulado es 25 importante, por ejemplo, porque pueden detectarse metástasis de ganglios linfáticos ocultas en una proporción sustancial de pacientes con cáncer de mama, y estas metástasis están asociadas con indicadores conocidos de la progresión de la enfermedad (véase, por ejemplo, Gipponni y col al., J Surg Oncol. 2004 Mar 1; 85(3):102-111).
En ciertos aspectos, la invención proporciona procedimientos para supervisar productos de genes MCY determinando el estado de polinucleótidos y/o polipéptidos de MCY expresados por células en una muestra de tejido de 30 ensayo de un individuo que se sospecha que tiene una enfermedad asociada con un crecimiento celular desregulado (tal como hiperplasia o cáncer) y después comparando el estado determinado de esta manera con el estado de polinucleótidos y/o polipéptidos de MCY en una muestra normal correspondiente, proporcionando la presencia de polinucleótidos y/o polipéptidos de MCY aberrantes en la muestra de ensayo con respecto a la muestra normal, una indicación de la presencia de un crecimiento celular desregulado dentro de las células del individuo. 35
En otro aspecto, la invención proporciona ensayos útiles para determinar la presencia de cáncer en un individuo, que comprenden detectar un aumento significativo en el ARNm o la expresión de proteína de MCY en una muestra de tejido o célula de ensayo con respecto a los niveles de expresión en el tejido o célula normal correspondiente. La presencia de ARNm de MCY puede evaluarse, por ejemplo, en muestras de tejido que incluyen, pero sin limitación, subtipos de cáncer de mama tales como los subtipos de cáncer de mama basal y BRCA 1 (véase, 40 por ejemplo, Sorlie y col., PNAS (2001), 98(19): 10869-10874). La presencia de una serie de genes MCY significativa en cualquiera de estos tejidos es útil para indicar la aparición, presencia y/o gravedad de estos cánceres, ya que los tejidos normales correspondientes no expresan ARNm de MCY o lo expresan a menores niveles.
En una realización relacionada, puede determinarse el estado de la serie de genes MCY a nivel de proteínas en lugar de a nivel de ácidos nucleicos. Por ejemplo, dicho procedimiento o ensayo puede comprender determinar el 45 nivel de proteína de MCY expresada por células en una muestra de tejido de ensayo y comparar el nivel determinado de esta manera con el nivel de expresión de proteína de MCY en una muestra de control, es decir, una muestra normal correspondiente. En una realización, se evalúa la presencia de proteína de MCY, por ejemplo, usando procedimientos inmunohistoquímicos. Los anticuerpos contra MCY o compañeros de unión capaces de detectar la expresión de proteínas de MCY pueden usarse en una diversidad de formatos de ensayo bien conocidos en la técnica para este fin. 50
En otras realizaciones relacionadas, se puede evaluar la integridad de las secuencias de nucleótidos y aminoácidos de MCY en una muestra biológica para identificar perturbaciones en la estructura de estas moléculas tales como inserciones, deleciones, sustituciones y similares. Dicha realizaciones son útiles porque se observan perturbaciones en las secuencias de nucleótidos y aminoácidos en un gran número de proteínas asociadas por un fenotipo de crecimiento desregulado (véase, por ejemplo, Marrogi y col., 1999, J. Cutan. Pathol. 26(8):369-378). En este 55 contexto, en la técnica son bien conocidas una amplia diversidad de ensayos para observar perturbaciones en las secuencias de nucleótidos y aminoácidos. Por ejemplo, el tamaño y estructura de las secuencias de ácido nucleico o de aminoácidos de productos de genes MCY pueden observarse por protocolos de secuenciación de Northern, Southern, Western, PCR and ADN analizados en el presente documento. Además, en la técnica son bien conocidos otros procedimientos para observar perturbaciones en secuencias de nucleótidos y de aminoácidos tales como análisis de 60 polimorfismos de conformación de una sola cadena (véanse, por ejemplo, las Patentes de Estados Unidos Nº 5.382.510
y 5.952.170).
En ciertas realizaciones adicionales, se puede examinar el estado de metilación del gen MCY en una muestra biológica. Con frecuencia se produce una desmetilación aberrante y/o hipermetilación de islas CpG en regiones reguladoras 5’ de genes en células inmortalizadas y transformadas y puede dar como resultado una expresión alterada de diversos genes. Por ejemplo, la hipermetilación del promotor de la glutatión S-transferasa de clase pi (una proteína 5 expresada en próstata normal pero no expresada en > 90% de los carcinomas de próstata) parece silenciar permanentemente la transcripción de este gen y es la alteración genómica detectada con más frecuencia en los carcinomas de próstata (De Marzo y col., Am. J. Pathol. 155(6): 1985-1992 (1999)). Además, esta alteración está presente en al menos el 70% de los casos de neoplasia intraepitelial prostática de alto grado (PIN) (Brooks y col, Cancer Epidemiol. Biomarkers Prev., 1998, 7:531-536). En otro ejemplo, la expresión del gen específico de tumor LAGE-I (que 10 no se expresa en próstata normal pero se expresa en el 25-50% de los cánceres de próstata) se induce por desoxiazacitidina en células linfoblastoides, lo que sugiere que la expresión tumoral se debe a desmetilación (Lethe y col., Int. J. Cancer 76(6): 903-908 (1998)). En este contexto, son bien conocidos en la técnica una diversidad de ensayos para examinar el estado de metilación de un gen. Por ejemplo, se pueden utilizar en enfoques de hibridación de Southern enzimas de restricción sensibles a la metilación que no pueden escindir secuencias que contienen sitios 15 CpG metilados para evaluar el estado de metilación global de islas CpG. Además, la MSP (PCR específica de metilación) puede perfilar rápidamente el estado de metilación de todos los sitios CpG presentes en una isla CpG de un gen dado. Este procedimiento implica la modificación inicial del ADN por bisulfito sódico (que convertirá todas las citosinas desmetiladas en uracilo) seguida de la amplificación usando cebadores específicos para el ADN metilado frente al no metilado. También pueden encontrarse protocolos que implican interferencia de metilación, por ejemplo, en 20 Current Protocols In Molecular Biology, Units 12, Frederick M. Ausubul y col. eds., 1995.
Además de los tejidos analizados anteriormente, puede ensayarse convenientemente sangre periférica con respecto a la presencia de células cancerosas, incluyendo pero sin limitación cánceres de mama, usando, por ejemplo, análisis de Northern o RT-PCR para detectar la expresión de la serie de genes MCY. La presencia de ARNm de MCY amplificable por RT-PCR proporciona una indicación de la presencia del cáncer. Los ensayos de detección de RT-PCR 25 para células tumorales en sangre periférica actualmente se están evaluando para su uso en el diagnóstico y tratamiento de varios tumores sólidos humanos.
Un aspecto relacionado de la invención se refiere a predecir la susceptibilidad a desarrollar cáncer en un individuo. En una realización, un procedimiento para predecir la susceptibilidad al cáncer comprende detectar ARNm de MCY o proteína de MCY en una muestra de tejido, indicando su presencia la susceptibilidad al cáncer, siendo el grado 30 de expresión de ARNm de MCY presente proporcional al grado de susceptibilidad. En una realización específica, se examina la presencia de los polinucleótidos y/o polipéptidos de MCY en tejido de mama, proporcionando la presencia de los polinucleótidos y/o polipéptidos de MCY en la muestra una indicación de la susceptibilidad del cáncer de mama a N-(2-cloro-6-metilfenil)-2-[[6-[4-(2-hidroxietil)-1-piperazinil]-2-metil-4-pirimidinil]amino]-5-tiazolcarboxamida o una sal, solvato o hidrato farmacéuticamente aceptable de la misma (o la aparición o existencia de un tumor de mama y/o la 35 aparición o existencia de un subtipo de tumor de mama específico).
Otro aspecto relacionado se refiere a procedimientos para evaluar la agresividad del tumor. En una realización, un procedimiento para evaluar la agresividad de un tumor comprende determinar el nivel de polinucleótidos de MCY, por ejemplo, el ARNm o la proteína de MCY expresada por células en una muestra del tumor, comparar el nivel determinado de esta manera con el nivel de polinucleótidos de MCY, por ejemplo, ARNm o la proteína de la serie de genes MCY 40 expresada en un control, es decir, correspondiente al tejido normal tomado del mismo individuo o una muestra de referencia de tejido normal, indicando el grado de expresión de ARNm de MCY o proteína de MCY en la muestra de tumor con respecto a la muestra normal el grado de agresividad. En una realización específica, la agresividad de un tumor se evalúa determinando el grado en el que se expresa la serie de genes MCY en las células tumorales, indicando los mayores niveles de expresión tumores más agresivos. En una realización muy relacionada, se puede evaluar la 45 integridad del nucleótido de MCY y las secuencias de aminoácidos en una muestra biológica para identificar perturbaciones en la estructura de estas moléculas tales como inserciones, deleciones, sustituciones y similares, indicando la presencia de una o más perturbaciones tumores más agresivos.
En el presente documento se describen procedimientos para detectar y cuantificar la expresión de polinucleótidos de MCY, por ejemplo, ARNm o proteínas, y el uso de tecnologías de cuantificación y detección de 50 proteínas y ácidos nucleicos convencionales es bien conocido en la técnica. Los procedimientos convencionales para la detección y cuantificación de ARNm y MCY incluyen hibridación in situ usando ribosondas de la serie de genes MCY marcadas, transferencia de Northern y técnicas relacionadas usando sondas polinucleotídicas de MCY, análisis de RT-PCR usando cebadores específicos para la serie de genes MCY, y otros procedimientos de detección de tipo amplificación, tales como, por ejemplo, ADN ramificado, SISBA, TMA y similares. En una realización específica, puede 55 usarse RT-PCR para detectar y cuantificar la expresión del ARNm de MCY como se describe en los Ejemplos. Para este fin puede usarse cualquier número de cebadores capaces de amplificar el ARNm de MCY. Para este fin pueden usarse procedimientos convencionales para la detección y cuantificación de proteínas. En una realización específica, pueden usarse anticuerpos policlonales o monoclonales específicamente reactivos con la proteína de MCY de tipo silvestre en un ensayo inmunohistoquímico de tejido de biopsia. 60
La presente invención proporciona procedimientos para examinar una muestra biológica de ensayo que
comprende una célula de mama humana con respecto al indicio de expresión génica que indica sensibilidad a la terapia con N-(2-cloro-6-metilfenil)-2-[[6-[4-(2-hidroxietil)-1-piperazinil]-2-metil-4-pirimidinil]amino]-5-tiazolcarboxamida o una sal, solvato o hidrato farmacéuticamente aceptable de la misma mediante la evaluación de los niveles de al menos uno de un polinucleótido de MCY (incluyendo cualquier combinación de los mismos, por ejemplo, polinucleótidos de moesina; polinucleótidos de caveolina 1; polinucleótidos de proteína 1 asociada a yes; polinucleótidos de moesina y caveolina 1; 5 polinucleótidos de moesina y proteína 1 asociada a yes; polinucleótidos de caveolina 1 y proteína 1 asociada a yes y polinucleótidos de moesina, caveolina 1 y proteína 1 asociada a yes), donde el nivel de expresión de al menos uno de los polinucleótidos de MCY en la muestra de ensayo es indicativo de un cáncer de mama que es sensible a la terapia con N-(2-cloro-6-metilfenil)-2-[[6-[4-(2-hidroxietil)-1-piperazinil]-2-metil-4-pirimidinil]amino]-5-tiazolcarboxamida o una sal, solvato o hidrato farmacéuticamente aceptable de la misma. En ciertas realizaciones, los niveles de los polinucleótidos 10 de MCY en la célula se evalúan poniendo en contacto la célula con un polinucleótido complementario a MCY que hibrida con una secuencia de nucleótidos de MCY mostrada en la Tabla 1, o un complemento de la misma, y evaluando la presencia de un complejo de hibridación formado por la hibridación del polinucleótido complementario a MCY con los polinucleótidos de MCY en la muestra biológica de ensayo. En ciertas realizaciones preferidas, los niveles elevados de al menos uno, al menos dos o los tres polinucleótidos de MCY en la muestra de ensayo son indicativos de un cáncer de 15 mama que es sensible a la terapia.
Una realización relacionada es un procedimiento para examinar una célula de mama humana con respecto al indicio de expresión génica indicativa de sensibilidad a la terapia con N-(2-cloro-6-metilfenil)-2-[[6-[4-(2-hidroxietil)-1-piperazinil]-2-metil-4-pirimidinil]amino]-5-tiazolcarboxamida o una sal, solvato o hidrato farmacéuticamente aceptable de la misma, mediante la evaluación de los niveles de polinucleótidos de moesina (por ejemplo SEC ID Nº: 1 o una 20 secuencia que tiene una identidad sustancial con la SEC ID Nº: 1), caveolina 1 (SEC ID Nº: 2 o una secuencia que tiene una identidad sustancial con la SEC ID Nº: 2) y/o proteína 1 asociada a yes (SEC ID Nº: 3 o una secuencia que tiene una identidad sustancial con la SEC ID Nº: 3) (serie de genes MCY) que codifican el polipéptido de serie de genes MCY mostrado en la Tabla 1 en la célula de mama humana, proporcionando la expresión de los polinucleótidos de la serie de genes MCY (por ejemplo, secuencias de ARNm y genómicas) en la célula de mama humana indicios de sensibilidad a 25 N-(2-cloro-6-metilfenil)-2-[[6-[4-(2-hidroxietil)-1-piperazinil]-2-metil-4-pirimidinil]amino]-5-tiazolcarboxamida o una sal, solvato o hidrato farmacéuticamente aceptable de la misma. En ciertas realizaciones, los niveles de los polinucleótidos de MCY en la célula de mama humana se evalúan poniendo en contacto las secuencias polinucleotídicas de MCY endógenas en la célula de mama humana con un polinucleótido complementario de MCY (por ejemplo, una sonda marcada con un marcador de detección o un cebador de PCR) y que hibrida específicamente con una secuencia de 30 nucleótidos de MCY mostrada en la Tabla 1 y evaluando la presencia de un complejo de hibridación formado por la hibridación del polinucleótido complementario a MCY con los polinucleótidos de MCY en la muestra (por ejemplo, mediante análisis de Northern o PCR) de forma que se examina el indicio de un crecimiento celular alterado que está asociado o que proporciona indicios de un cáncer de mama.
En algunas realizaciones de la invención, se cuantifica el aumento de los niveles de polinucleótidos y/o 35 polipéptidos de MCY en la célula de mama humana con respecto a una célula de mama humana normal. Un patrón normalizado que puede usarse como referencia comparativa de la expresión de la serie de genes MCY puede obtenerse, por ejemplo, a partir del tejido de mama normal tomado del mismo individuo, o una muestra de referencia de tejido normal tomada de un individuo sano. Como alternativa, un patrón normalizado puede ser un intervalo numérico de expresión de la serie de genes MCY normal que se obtiene por un muestreo estadístico de células normales de una 40 población de individuos. En ciertas realizaciones de la invención, el patrón normalizado se obtiene comparando la expresión de la serie de genes MCY con un gen de control que se expresa en el mismo entorno celular a niveles relativamente estables (por ejemplo, un gen de expresión constante (housekeeping) tal como actina).
En ciertas realizaciones de la invención, el cáncer de mama es de subtipo basal. Como se conoce en la técnica, los cánceres de mama pueden agruparse en varios subtipos distintos, incluyendo el subtipo basal (véase, por 45 ejemplo, Sorlie y col., PNAS (2001), 98(19): 10869-10874).
En particular, los conductos mamarios son estructuras biestratificadas compuestas de una capa luminal y una capa mioepitelial que se adhiere a la membrana basal. La expresión subtipo basal es un término aceptado en la técnica que se refiere a ciertos cánceres que surgen de la capa basal del epitelio estratificado (véase, por ejemplo, la Figura 1 en Wilson y col., Breast Cancer Research Vol 6 Nº 5: 192-200 (2004)). Los carcinomas de mama de subtipo basal 50 residen en la capa basal del epitelio ductal de la mama en lugar de en las capas apical o luminal. Estos cánceres tienen características citológicas y perfiles de expresión génica distintos tales como un perfil de filamentos intermedios (citoqueratinas) observado por primera vez en las células basales de la piel. En particular, se sabe que las células basales de la piel expresan ciertas citoqueratinas (es decir, K5/6, K7, K17, K14) (véanse, por ejemplo, las SEC ID Nº: 10, SEC ID Nº: 11, SEC ID Nº: 12, SEC ID Nº: 13 y SEC ID Nº: 14) que se encuentran en el epitelio complejo a 55 diferencia de K8, K18 y K19 que se encuentran en el epitelio simple o glandular.
En ciertas realizaciones de la invención, el cáncer de mama es de subtipo mesenquimático. Para el análisis de este tipo de cáncer de mama, véase, por ejemplo, Tsuda y col., Cancer Sci. Enero 2005; 96 (1): 48-53; Ulusoy y col, Breast J. Sep-Oct 2005; 11 (5): 358-9; Reis-Filho, JJ. J Pathol. Nov 2005; 207(3): 367-369; Korsching y col., J Pathol. Agosto 2005; 206 (4): 451-7; y Strizzi y col., J Cell Physiol. Nov 2004; 201(2): 266-76. 60
El subtipo de cáncer de mama (por ejemplo, uno con propiedades de células basales) puede determinarse
fácilmente mediante datos de patología-IHQ y/o los datos del perfilado de tumores de mama de Stanford desvelados en el presente documento. Por ejemplo, Wetzels y col, Am J Path. (1991) 138: págs. 751-63, que se incorpora en el presente documento por referencia, describe queratinas específicas de las células basales y relacionadas con hiperproliferaciones en cáncer de mama humano. Este estudio descubrió que un 15% (n = 115) de cánceres de mama invasivos eran positivos para las citoqueratinas basales 14 y 17. Además, Bartek y col., Int. J. Cancer (1985) 36:299-306 5 enseñan la caracterización de subtipos de cáncer de mama usando patrones de expresión de K19 en tejidos de mama y tumores humanos. Por el contrario, la mayoría de los carcinomas ductales poco diferenciados y medulares eran negativos para la citoqueratina 19, mientras que los carcinomas ductales moderadamente y bien diferenciados, lobulares invasivos, tubulares y la mayoría de los carcinomas mucinosos eran positivos para los dos Ac K19. Además, se expresan P-cadherina (CDH3) y cadherinas desmosómicas en la capa basal de los conductos mamarios y se 10 sobreexpresa ARNm de P-cadherina en los subtipos basal y BRCA2. Esto proporciona indicios confirmatorios de que los grupos de tumores BRCA1 y del Grupo 4 comparten muchas propiedades moleculares asociadas con el origen del tipo celular.
Paredes y col., Pathol. Res Pract. 2002: 198(12): 795-801 investiga la expresión de la P-cadherina en subtipos de carcinoma de mama y la correlaciona con el estado del receptor de estrógenos (ER) (véase, por ejemplo, la SEC ID 15 Nº: 7). Se seleccionaron 73 carcinomas ductales in situ (DCIS) y 149 carcinomas invasivos de la mama y se examinaron con respecto a la expresión de P-cadherina así como otros marcadores biológicos. La expresión de P-cadherina mostró una fuerte correlación inversa con la expresión del receptor de estrógenos (ER) en los dos tipos de carcinoma de mama (in situ e invasivo). Los tumores positivos para P-cadherina y negativos para ER se relacionaron con un mayor grado histológico, una alta tasa de proliferación y la expresión de c-erbB-2. Esto demuestra que la P-cadherina identifica un 20 subgrupo de carcinomas de mama que carecen de la expresión de ER y se correlaciona con mayores tasas de proliferación y otros indicadores de comportamiento agresivo. Véase también Gamallo y col., Mod. Pathol. 2001: 14 (7): 650-4; Kovacs y col., J Clin Pathol 2003 Feb; 56(2): 139-41; y Peralta y col., Cancer 1999 Oct 1; 86 (7): 1263-72.
En ciertas realizaciones de la invención, el cáncer de mama es del subtipo BRCA1. En particular, como se conoce en la técnica, los cánceres de mama pueden agruparse en varios subtipos distintos, incluyendo el subtipo 25 BRCA1 (véase, por ejemplo, Sorlie y col., PNAS (2001), 98(19): 10869-10874). En este contexto, un cáncer de mama del subtipo BRCA1 se caracteriza porque tiene una mutación en el gen BRCA1. Se sabe que se producen una diversidad de mutaciones de BRCA1 distintas en múltiples tejidos e incluyen sustituciones, deleciones y mutaciones de sentido erróneo (véase, por ejemplo, Wagner y col., Int J Cancer. 1998 Jul 29; 77 (3): 354-60; Chang y col., Breast Cancer Res Treat. Sep 2001; 69 (2): 101-13; y Foulkes y col., Cancer Res. 1 Feb 2004; 64 (3): 830-5; y Aghmesheh y 30 col., Gynecol Oncol. Abril 2005; 97 (1): 16-25. Los cánceres basal y BRCA1 están relacionados por el origen celular y la patogénesis molecular y la sobreexpresión de la serie de genes MCY es una alteración importante implicada en la patogénesis de estos dos grupos de tumores.
La presente invención también proporciona procedimientos para examinar una muestra biológica de ensayo que comprende una célula de mama humana con respecto al indicio de una expresión génica indicativa de sensibilidad 35 a la terapia con N-(2-cloro-6-metilfenil)-2-[[6-[4-(2-hidroxietil)-1-piperazinil]-2-metil-4-pirimidinil]amino]-5-tiazolcarboxamida o una sal, solvato o hidrato farmacéuticamente aceptable de la misma, comprendiendo el procedimiento evaluar los niveles de al menos uno de un polipéptido de moesina (por ejemplo, SEC ID Nº: 4 o una secuencia que tiene una identidad sustancial con la SEC ID Nº:4), caveolina 1 (por ejemplo, SEC ID Nº: 5 o una secuencia que tiene una identidad sustancial con la SEC ID Nº:5) y proteína 1 asociada a yes (por ejemplo, SEC ID Nº: 40 6 o una secuencia que tiene una identidad sustancial con la SEC ID Nº: 6) (serie de genes MCY) (por ejemplo, que tiene la secuencia mostrada en la Tabla 1 o que tiene una identidad sustancial con una secuencia mostrada en la Tabla 1) en la muestra biológica, proporcionando un aumento en los niveles del polipéptido MCY en la muestra de ensayo con respecto a una muestra de tejido de mama normal indicios de sensibilidad a la terapia con N-(2-cloro-6-metilfenil)-2-[[6-[4-(2-hidroxietil)-1-piperazinil]-2-metil-4-pirimidinil]amino]-5-tiazolcarboxamida o una sal, solvato o hidrato 45 farmacéuticamente aceptable de la misma. En ciertas realizaciones, los niveles de los polipéptidos MCY en la célula se evalúan poniendo en contacto la muestra con un anticuerpo que se une inmunoespecíficamente con una secuencia de polipéptido de MCY mostrada en la Tabla 1 y evaluando la presencia de un complejo formado por la unión del anticuerpo con los polipéptidos de MCY en la muestra.
Una realización relacionada de la invención es un procedimiento para examinar una célula de mama humana 50 (por ejemplo, de una biopsia) con respecto al indicio de una expresión génica indicativa de sensibilidad a la terapia con N-(2-cloro-6-metilfenil)-2-[[6-[4-(2-hidroxietil)-1-piperazinil]-2-metil-4-pirimidinil]amino]-5-tiazolcarboxamida o una sal, solvato o hidrato farmacéuticamente aceptable de la misma que es indicativa de cáncer de mama, comprendiendo el procedimiento evaluar los niveles de al menos uno de un polipéptido de moesina, caveolina 1 y proteína 1 asociada a yes (o cualquier combinación de los mismos) (por ejemplo, que tiene la secuencia mostrada en la Tabla 1 o secuencias 55 que tienen una identidad sustancial con las mostradas en la Tabla 1) en la célula de mama, proporcionando el nivel de expresión de los polipéptidos de MCY en la célula de mama humana indicios de sensibilidad a la terapia con N-(2-cloro-6-metilfenil)-2-[[6-[4-(2-hidroxietil)-1-piperazinil]-2-metil-4-pirimidinil]amino]-5-tiazolcarboxamida o una sal, solvato o hidrato farmacéuticamente aceptable de la misma. En ciertas realizaciones, los niveles de polipéptidos de MCY en la célula se evalúan poniendo en contacto la muestra con un anticuerpo (por ejemplo, uno marcado con un marcador de 60 detección) que se une inmunoespecíficamente a una secuencia de polipéptido de MCY mostrada en la Tabla 1 y evaluando la presencia de un complejo formado por la unión del anticuerpo con los polipéptidos de la serie de genes MCY en la muestra. En ciertas realizaciones, la presencia de un complejo se evalúa por un procedimiento seleccionado
del grupo que consiste en análisis ELISA, análisis de Western e inmunohistoquímica. Típicamente, el cáncer de mama es de subtipo basal.
XI. Regímenes de Tratamiento
La invención incluye N-(2-cloro-6-metilfenil)-2-[[6-[4-(2-hidroxietil)-1-piperazinil]-2-metil-4-pirimidinil]amino]-5-tiazolcarboxamida o una sal, solvato o hidrato farmacéuticamente aceptable de la misma para su uso en procedimientos 5 de tratamiento basados en la demostración de que pacientes que tienen diferentes niveles de expresión del gen de moesina, caveolina 1 y/o proteína 1 asociada a yes tienen grados variables de resistencia y/o sensibilidad a la terapia con dicho compuesto. De esta manera, los procedimientos de la presente invención pueden usarse, por ejemplo, para determinar si un individuo se trata o no con N-(2-cloro-6-metilfenil)-2-[[6-[4-(2-hidroxietil)-1-piperazinil]-2-metil-4-pirimidinil]amino]-5-tiazolcarboxamida o una sal, solvato o hidrato farmacéuticamente aceptable de la misma; si un 10 individuo se trata o no con regímenes de dosificación más agresivos de N-(2-cloro-6-metilfenil)-2-[[6-[4-(2-hidroxietil)-1-piperazinil]-2-metil-4-pirimidinil]amino]-5-tiazolcarboxamida o una sal, solvato o hidrato farmacéuticamente aceptable de la misma; o si un individuo se trata o no con una terapia de combinación, es decir, una combinación de N-(2-cloro-6-metilfenil)-2-[[6-[4-(2-hidroxietil)-1-piperazinil]-2-metil-4-pirimidinil]amino]-5-tiazolcarboxamida o una sal, solvato o hidrato farmacéuticamente aceptable de la misma con una terapia anticancerosa adicional. Los términos "tratar", "tratamiento" y 15 "terapia", como se usan en el presente documento, se refieren a la terapia curativa, terapia profiláctica, terapia preventiva y terapia para mitigar enfermedades.
La dosificación real empleada de N-(2-cloro-6-metilfenil)-2-[[6-[4-(2-hidroxietil)-1-piperazinil]-2-metil-4-pirimidinil]amino]-5-tiazolcarboxamida o una sal, solvato o hidrato farmacéuticamente aceptable de la misma puede variar dependiendo de los requisitos del paciente y la gravedad de afección a tratar. La determinación de la dosificación 20 apropiada para una situación particular está dentro de la experiencia de la técnica. La cantidad eficaz de N-(2-cloro-6-metilfenil)-2-[[6-[4-(2-hidroxietil)-1-piperazinil]-2-metil-4-pirimidinil]amino]-5-tiazolcarboxamida o una sal, solvato o hidrato farmacéuticamente aceptable de la misma puede determinarse por un experto habitual en la materia, e incluye cantidades de dosificación ejemplares para un ser humano adulto de aproximadamente 0,05 a aproximadamente 100 mg/kg de peso corporal de N-(2-cloro-6-metilfenil)-2-[[6-[4-(2-hidroxietil)-1-piperazinil]-2-metil-4-pirimidinil]amino]-5-25 tiazolcarboxamida o una sal, solvato o hidrato farmacéuticamente aceptable de la misma, al día, que puede administrarse en una sola dosis o en forma de dosis divididas individuales, tales como 1, 2, 3 o 4 veces al día. Se entenderá que el nivel de dosificación específico y la frecuencia de dosificación para cualquier sujeto particular pueden variarse y dependerán de una diversidad de factores que incluyen la actividad del compuesto específico empleado, la estabilidad metabólica y la duración de la acción de ese compuesto, la especie, edad, peso corporal, salud general, 30 sexo y dieta del sujeto, modo y tiempo de administración, velocidad de excreción, combinación de fármacos y gravedad de la afección particular.
Un régimen de tratamiento es un curso de terapia administrado a un individuo que padece una enfermedad descrita en el presente documento que puede incluir el tratamiento con N-(2-cloro-6-metilfenil)-2-[[6-[4-(2-hidroxietil)-1-piperazinil]-2-metil-4-pirimidinil]amino]-5-tiazolcarboxamida o una sal, solvato o hidrato farmacéuticamente aceptable de 35 la misma y/u otra terapia contra el cáncer. Cuando se administra más de una terapia, las terapias pueden administrarse concurrentemente o de forma consecutiva. La administración de más de una terapia puede realizarse a diferentes tiempos (es decir, de forma consecutiva) y aún ser parte del mismo régimen de tratamiento.
Por consiguiente, en un aspecto de la invención, si al menos un miembro, al menos dos miembros o al menos tres miembros de la serie de polinucleótidos o polipéptidos de MCY se expresan en células de cáncer de mama como se 40 indica en el presente documento, el régimen de tratamiento puede requerir únicamente la administración de N-(2-cloro-6-metilfenil)-2-[[6-[4-(2-hidroxietil)-1-piperazinil]-2-metil-4-pirimidinil]amino]-5-tiazolcarboxamida o una sal, solvato o hidrato farmacéuticamente aceptable de la misma para destruir o inhibir la proliferación de dicho cáncer. Dicha administración puede incluir una cantidad farmacéuticamente aceptable de N-(2-cloro-6-metilfenil)-2-[[6-[4-(2-hidroxietil)-1-piperazinil]-2-metil-4-pirimidinil]amino]-5-tiazolcarboxamida o una sal, hidrato o solvato de la misma, o de una 45 combinación de N-(2-cloro-6-metilfenil)-2-[[6-[4-(2-hidroxietil)-1-piperazinil]-2-metil-4-pirimidinil]amino]-5-tiazolcarboxamida o una sal, hidrato o solvato farmacéuticamente aceptable de la misma.
Como alternativa, si al menos un miembro, al menos dos miembros o los tres miembros de la serie de polinucleótidos o polipéptidos de MCY no se expresan en células de cáncer de mama, o si se observan niveles menores que los óptimos (por ejemplo, niveles que son suficientemente elevados para predecir la sensibilidad a dasatinib) de un 50 miembro de la serie de polinucleótidos indicadores de MCY, el régimen de tratamiento puede requerir una mayor frecuencia de dosificación o una mayor dosis de N-(2-cloro-6-metilfenil)-2-[[6-[4-(2-hidroxietil)-1-piperazinil]-2-metil-4-pirimidinil]amino]-5-tiazolcarboxamida o una sal, solvato o hidrato farmacéuticamente aceptable de la misma; y/o una combinación de N-(2-cloro-6-metilfenil)-2-[[6-[4-(2-hidroxietil)-1-piperazinil]-2-metil-4-pirimidinil]amino]-5-tiazolcarboxamida o una sal, solvato o hidrato farmacéuticamente aceptable de la misma con otro agente 55 farmacéuticamente aceptable, incluyendo otro agente anticanceroso tal como un fármaco inhibidor de quinasa tal como imatinib, AMN107, PD180970, GGP76030, AP23464, SKI 606 y/o AZD0530; una combinación de N-(2-cloro-6-metilfenil)-2-[[6-[4-(2-hidroxietil)-1-piperazinil]-2-metil-4-pirimidinil]amino]-5-tiazolcarboxamida y un agente estabilizador de tubulina (por ejemplo, pacitaxol, epotilona, taxano y similares); una combinación de N-(2-cloro-6-metilfenil)-2-[[6-[4-(2-hidroxietil)-1-piperazinil]-2-metil-4-pirimidinil]amino]-5-tiazolcarboxamida y un inhibidor de farnesil transferasa 60 (incluyendo (R)-2,3,4,5-tetrahidro-1-(1H-imidazol-4-ilmetil)-3-(fenilmetil)-4-(2-tienilsulfonil)-1H-1,4-benzodiazepina-7-
carbonitrilo, sal clorhidrato, descrito en la Patente de Estados Unidos Nº 6.011.029); y cualquier otra combinación o régimen de dosificación que comprenda N-(2-cloro-6-metilfenil)-2-[[6-[4-(2-hidroxietil)-1-piperazinil]-2-metil-4-pirimidinil]amino]-5-tiazolcarboxamida. En un aspecto, una dosis aumentada de N-(2-cloro-6-metilfenil)-2-[[6-[4-(2-hidroxietil)-1-piperazinil]-2-metil-4-pirimidinil]amino]-5-tiazolcarboxamida sería aproximadamente un 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90 ó 95% mayor que la dosis típica de N-(2-cloro-6-metilfenil)-2-[[6-[4-(2-hidroxietil)-1-piperazinil]-2-metil-4-5 pirimidinil]amino]-5-tiazolcarboxamida para una indicación particular o para un individuo, o aproximadamente 1,5 veces, 2 veces, 2,5 veces, 3 veces, 3,5 veces, 4 veces, 4,5 veces, 5 veces, 6 veces, 7 veces, 8 veces, 9 veces o 10 veces más de N-(2-cloro-6-metilfenil)-2-[[6-[4-(2-hidroxietil)-1-piperazinil]-2-metil-4-pirimidinil]amino]-5-tiazolcarboxamida que la dosis típica de N-(2-cloro-6-metilfenil)-2-[[6-[4-(2-hidroxietil)-1-piperazinil]-2-metil-4-pirimidinil]amino]-5-tiazolcarboxamida para una indicación particular o para un individuo. En particular, la N-(2-cloro-6-metilfenil)-2-[[6-[4-(2-hidroxietil)-1-10 piperazinil]-2-metil-4-pirimidinil]amino]-5-tiazolcarboxamida o una sal, hidrato o solvato farmacéuticamente aceptable de la misma puede administrarse típicamente 2 veces al día a 70 mg, sin embargo, puede dosificarse en otras cantidades, por ejemplo, 50, 70, 90, 100, 110 ó 120 BID, o 100, 140 ó 180 una vez al día, dos veces al día o tres veces al día.
En la puesta en práctica de los numerosos aspectos de la invención del presente documento, pueden seleccionarse muestras biológicas a partir de muchas fuentes tales como biopsias de tejidos (incluyendo muestras de 15 células o células cultivadas a partir de las mismas; biopsias de tejidos sólidos, por ejemplo células de un tumor sólido), sangre, células sanguíneas (glóbulos rojos o glóbulos blancos), suero, plasma, linfa, líquido ascítico, líquido quístico, orina, esputos, deposiciones, saliva, aspirado bronquial, CSF o pelo. Pueden usarse células de una muestra o puede usarse un lisado de una muestra celular. En ciertas realizaciones, la muestra biológica es una muestra de células de biopsia de un tejido o células cultivadas a partir del mismo, por ejemplo, células extraídas de un tumor sólido o un lisado 20 de la muestra de células. En ciertas realizaciones, la muestra biológica comprende células sanguíneas.
XII. Kits
Para su uso en las aplicaciones de diagnóstico y terapéuticas descritas o sugeridas anteriormente, también se proporcionan kits por la invención. Estos kits pueden comprender un medio de soporte que está compartimentalizado para recibir en confinamiento uno o más medios recipientes tales como viales, tubos y similares, comprendiendo cada 25 uno de los medios recipientes uno de los elementos separados a usar en el procedimiento. Por ejemplo, uno de los medios recipientes puede comprender una sonda que está o que puede marcarse de forma detectable. Dicha sonda puede ser un anticuerpo o polinucleótido específico para una proteína de MCY (por ejemplo, SEC ID Nº: 4, SEC ID Nº: 5 y SEC ID Nº: 6) o un polinucleótido de MCY (por ejemplo, SEC ID Nº: 1, SEC ID Nº: 2 y SEC ID Nº: 3) respectivamente. Cuando el kit utiliza hibridación de ácidos nucleicos para detectar el ácido nucleico diana, el kit también puede tener 30 recipientes que contienen uno o más nucleótidos para la amplificación de la secuencia de ácido nucleico diana y/o un recipiente que comprende un medio indicador, tal como una proteína de unión a biotina, tal como avidina o estreptavidina, unida a una molécula indicadora, tal como un marcador enzimático, fluorescente o radioisótopo.
Una realización típica de la invención es un kit que comprende un recipiente, una etiqueta sobre dicho recipiente y una composición contenida dentro de dicho recipiente; en el que la composición incluye un anticuerpo 35 específico para la serie de genes MCY y/o un polinucleótido que híbrida con un complemento del polinucleótido de MCY mostrado en la Tabla 1 en condiciones rigurosas (o se une a un polipéptido de MCY codificado por el polinucleótido mostrado en la Tabla 1). En ciertos aspectos, la etiqueta en dicho recipiente indica que la composición puede usarse para evaluar la presencia de proteína, ARN o ADN de MCY en al menos un tipo de células de mamífero, e incluye instrucciones para usar el anticuerpo y/o polinucleótido de MCY para evaluar la presencia de proteína, ARN o ADN de 40 MCY en al menos un tipo de célula de mamífero.
El kit de la invención típicamente comprenderá el recipiente descrito anteriormente y uno o más recipientes distintos que comprenden materiales deseables desde un punto de vista comercial y de usuario, incluyendo tampones, diluyentes, filtros, agujas, jeringas y prospectos con instrucciones de uso. Una etiqueta puede estar presente en el recipiente para indicar que la composición se usa para una terapia específica o una aplicación no terapéutica, y también 45 puede indicar instrucciones para su uso in vivo o in vitro, tales como las descritas anteriormente.
Ejemplos
Ejemplo 1: Procedimiento general para la identificación de marcadores de predicción de respuesta a dasatinib
Se cultivaron células usando técnicas convencionales y medios específicos. Se generaron curvas de dosis-respuesta usando recuentos directos de células. Se cultivaron aproximadamente 10-20.000 células por pocillo en placas 50 de 24 pocillos el día 0. El día 1 se diluyó dasatinib a lo largo de la placa en diluciones ½, a partir de 10 M hacia abajo. Para cada línea celular, también se usaron controles sin tratar como controles. Las células se incubaron durante 7 días, después de los cuales los pocillos se aclararon con PBS, las células se tripsinizaron y se contaron usando un contador Coulter. Se generaron curvas de dosis-respuesta como % de inhibición del control. Los perfiles de micromatrices se generaron como se ha descrito (Wilson CA y col., Breast Cancer Research 7 (suppl 2): 4.25). Las líneas celulares se 55 separaron en resistentes y sensibles basándose en sus curvas de dosis-respuesta. Se usaron matrices de datos para encontrar genes de discriminación para predecir la sensibilidad al dasatinib.
Ejemplo 2: Líneas celulares, cultivo celular y reactivos.
Los efectos del dasatinib sobre el crecimiento celular se estudiaron en líneas de células de cáncer de mama humano cultivadas in vitro. Las líneas celulares MDA-MB-415, MDA-MB-134, HCC-1500, ZR-75-30, HCC-202, HCC-1419, HCC-38, HCC-70, HCC-1187, HCC-1806, HCC-1937, HCC-1954, MDA-MB-436, HCC-1569, Hs578t, HCC-1143, MDA-MB-175, BT-474, SK-BR-3, MDA-MB-361, UAC-893, UACC-812, UACC-732, T-47D, MDA-MB-453, MDA-MB-468, 5 CAMA-1, MDA-MB-157, MCF-7, MDA-MB-435, ZR-75-1, BT-20 y MDA-MB-231 se obtuvieron en la Colección Americana de Cultivos Tipo (Rockville, MD). Las líneas celulares EFM-192A, KPL-1, EFM-19 y CAL-51 se obtuvieron en el Depósito Alemán de Tejidos DSMZ (Braunschweig, Alemania) y las líneas celulares SUM-190 y SUM-225 se obtuvieron en la Universidad de Michigan (Ann Arbor, MI). Las células MDA-MB-134, MDA-MB415, MDA-MB-436, MDA-MB-175, UACC-893, UACC-812 y MDA-MB-157 se cultivaron en medio L15 suplementado con suero bovino fetal (FBS) 10 inactivado térmicamente al 10%, glutamina a 2 mmol/l y solución al 1% de penicilina G-estreptomicina-fungizona (PSF, Irvine Scientific, Santa Ana, CA). Las células CAL-51, KPL-1, Hs578t se cultivaron en DMEM suplementado con FBS inactivado térmicamente al 10% y PSF, como se ha indicado anteriormente. Las células SUM-190 y SUM-225 se cultivaron en F12 de HAM suplementado con FBS inactivado térmicamente al 5%, PSF, insulina a 5 mg/ml e hidrocortisona a 1 mg/ml. Las demás líneas celulares se cultivaron en RPMI 1640 suplementado con FBS inactivado 15 térmicamente al 10%, glutamina 2 mmol/l y PSF.
Ejemplo 3: Análisis de micromatriz de líneas celulares
Se crearon análisis de micromatriz Agilent para cada línea celular (véase, por ejemplo, Wilson CA, y col., Breast Cancer Research. 2005, 7 Suppl 2:S 4.25). En resumen, las células se cultivaron hasta la fase logarítmica y después se extrajo el ARN usando el kit RNeasy (Qiagen). El ARN purificado se eluyó en 30-60 ul de agua DEPC y la 20 cantidad de ARN se midió por análisis espectral usando el espectrofotómetro Nanodrop. La calidad del ARN se determinó por separación del ARN por electroforesis capilar usando el Bioanalizador Agilent 2000. Después se realizaron micromatrices de líneas de células de cáncer de mama en la microplaca Agilent Human 1A V1. La caracterización de las líneas de células de cáncer de mama individuales por comparación con un conjunto de referencia mixto de líneas de células de mama se realizó en un solo portaobjetos en el que el ARN del conjunto mixto se marcó 25 con cianina-3 y las líneas celulares individuales con cianina-5. El conjunto de referencia mixto consistía en cantidades iguales de ARNc de diez líneas de células de cáncer de mama que se seleccionaron como representativas de una serie de los diversos subtipos de cáncer de mama conocidos basándose en su expresión de marcadores moleculares específicos, por ejemplo, ESR1, HER2, EGFR, así como características de crecimiento. La referencia incluye las siguientes líneas celulares: 184B5, MDA-MB-468, MDA-MB-157, MDA-MB-231, MDA-MB-175, CAMA-1, MCF-7, MDA-30 MB-361, SK-BR-3 y DU4475. Se leyeron portaobjetos de micromatrices usando un Agilent Scanner y se usó el software Agilent Feature Extraction versión 7.5 para calcular los valores de expresión de genes. Los datos extraídos se importaron a Rosetta Resolver 5.1 para crear perfiles de expresión para cada experimento de línea celular de mama individual. El análisis de agrupamiento se realizó en Resolver y los perfiles de líneas celulares se exportaron a Excel (Microsoft) para un análisis adicional de la distribución de los cambios de expresión génica a través de los diversos 35 subtipos y los datos de las respuestas de líneas celulares individuales.
Ejemplo 4: Ensayos de proliferación.
Se sembraron células por duplicado a 5.000 a 10.000 células por pocillo en placas de 24 pocillos. El día después del cultivo, se añadió dasatinib a una concentración final de 1 M. También se sembraron pocillos de control sin fármaco. Se contaron tanto la fracción adherente como la fracción flotante de las células los días 2, 5 y 7 en los 40 pocillos de tratamiento y de control. Después de la tripsinización, las células se pusieron en solución de Isotone y se contaron inmediatamente usando un contador de partículas Coulter Z2 (Beckman Coulter Inc, Fullerton, CA).
Se calculó la inhibición del crecimiento [(1-valor experimental/valor de control) x 100] para cada día añadiendo los valores obtenidos tanto para las células flotantes como para las células adherentes. Se realizó un análisis Chi-cuadrado de Pearson para identificar una correlación entre el subtipo y la sensibilidad a dasatinib. El dasatinib fue una 45 donación de Frank Lee en Bristol-Meyers-Squibb.
Ejemplo 5: Procedimientos estadísticos
Se realizaron ensayos chi cuadrado de Pearson usando Statistica 7.1 (Statsoft Inc) para determinar la relación (si la hay) entre el subtipo y la respuesta al dasatinib. Se determinaron genes potencialmente relacionados con la respuesta analizando la distribución de muestras con cambios de expresión significativos a lo largo de los grupos de 50 línea celular definidos por subtipo y respuesta para cada gen. El umbral para la regulación positiva se fijó a log (relación) > 0,13 con un valor p < 0,01 y la regulación negativa se definió como log (relación) < - 0,13 con un valor p < 0,01. Los valores p se determinaron de acuerdo con el modelo de error Agilent cuando se importaron los datos extraídos de características a Resolver. Se usó información de ontología génica y de ruta para limitar adicionalmente la serie de marcadores candidatos. Después se uso agrupamiento para visualizar la expresión de marcadores candidatos a través 55 de todas las líneas celulares ensayadas con respecto a la respuesta a dasatinib para desarrollar una "serie marcadora de predicción de respuesta" potencialmente sensible y específica de genes.
Ejemplo 6: Dasatinib inhibe el crecimiento del cáncer de mama "de tipo basal"
Un total de 39 líneas celulares de cáncer de mama se clasificaron como representantes de subtipos de cáncer de mama luminal o basal basándose en la expresión génica relativa de citoqueratina (CK) 8 / CK18 y CK5/CK17, respectivamente. Además, varias líneas celulares se clasificaron como representantes de cánceres de mama que habían experimentado una transición de epitelial a mesenquimática (post-EMT) basándose en su expresión de 5 vimentina y la pérdida de expresión de citoqueratinas. Se desarrolló un diagrama de agrupamiento de las 39 de líneas de células de cáncer de mama frente a 5 marcadores de subtipo. Las líneas celulares que mostraron una expresión de citoqueratina mixta se clasificaron como principalmente basales por la ausencia de expresión de varios otros marcadores adicionales luminales bien caracterizados: por ejemplo, el receptor de estrógenos, E-cadherina (CDH1) y GATA3. La expresión relativa de los marcadores anteriores, así como del receptor de estrógenos y los niveles de 10 expresión de HER-2 se usaron para asignar las diversas líneas celulares a subtipos definidos clínicamente con anterioridad (véase, por ejemplo, Sorlie T y col., Proc Natl Acad Sci USA 11 Sep 2001; 98: 10869-74; Sotiriou C, y col., Proc Natl Acad Sci USA. 2 Sep 2003; 100(18): 10393-8; Perou CM, y col., Naturale. 17 Agosto 2000; 406 (6796): 747-52). Después se asignó la respuesta a dasatinib a cada línea celular junto con el subtipo de cáncer de mama que representa como se proporciona en la Tabla 2 que se muestra a continuación. 15
Tabla 2
Línea celular
Subtipo de Cáncer de Mama Estado de ER Estado de HER-2 Respuesta a Dasatinib in vitro
MDA-MB-453
Luminal Negativo Amplificado Resistente
SK-BR-3
Luminal Negativo Amplificado Resistente
SUM-190
Luminal Negativo Amplificado Resistente
SUM-225
Luminal Negativo Amplificado Resistente
UACC-893
Luminal Negativo Amplificado Resistente
EFM-192A
Luminal Positivo Amplificado Resistente
HCC-202
Luminal Positivo Amplificado Resistente
UACC-732
Luminal Positivo Amplificado Resistente
UACC-812
Luminal Positivo Amplificado Resistente
ZR-75-30
Luminal Positivo Amplificado Resistente
HCC-1500
Luminal Positivo Normal Resistente
KPL-1
Luminal Positivo Normal Resistente
MDA-MB-134
Luminal Positivo Normal Resistente
MDA-MB-175
Luminal Positivo Normal Resistente
MDA-MB-415
Luminal Positivo Normal Resistente
ZR-75-1
Luminal Positivo Normal Resistente
CAMA-1
Luminal Positivo Normal Resistente
BT-474
Luminal Positivo Amplificado Moderadamente sensible
(cont.)
Línea celular
Subtipo de Cáncer de Mama Estado de ER Estado de HER-2 Respuesta a Dasatinib in vitro
HCC-1419
Luminal Positivo Amplificado Moderadamente sensible
MDA-MB-361
Luminal Positivo Amplificado Moderadamente sensible
EFM-19
Luminal Positivo Normal Moderadamente sensible
MCF-7
Luminal Positivo Normal Moderadamente sensible
T-47D
Luminal Positivo Normal Moderadamente sensible
BT-20
Basal Negativo Normal Resistente
HCC 38
Basal Negativo Normal Resistente
MDA-MB-468
Basal Negativo Normal Resistente
HCC-1954
Basal Negativo Amplificado Moderadamente sensible
HCC-1143
Basal Negativo Normal Moderadamente sensible
HCC-1187
Basal Negativo Normal Moderadamente sensible
HCC-1937
Basal Negativo Normal Moderadamente sensible
HCC-1806
Basal Negativo Normal Muy sensible
HCC-70
Basal Negativo Normal Muy sensible
CAL-51
Post-EMT Negativo Normal Muy sensible
Hs578t
Post-EMT Negativo Normal Muy sensible
MDA-MB-157
Post-EMT Negativo Normal Muy sensible
MDA-MB-231
Post-EMT Negativo Normal Muy sensible
MDA-MB-435
Post-EMT Negativo Normal Muy sensible
MDA-MB-436
Post-EMT Negativo Normal Muy sensible
HCC-1569
Post-EMT Negativo Amplificado Resistente
Las respuestas de proliferación se basaron en el nivel de inhibición a una concentración 1 M de dasatinib asignándose las líneas celulares que tenían inhibición mayor del 60% al grupo de alta sensibilidad, las que tenían una inhibición del 40-59% al grupo de sensibilidad moderada y las que tenían una inhibición < 40% a 1 M al grupo resistente. Las líneas celulares moderadamente sensibles y muy sensibles se agruparon como "sensibles" en el ensayo chi cuadrado y 5 demuestran una relación muy significativa entre la sensibilidad al dasatinib y el subtipo basal de líneas celulares de cáncer de mama con 2 = 9,66 y P = 0,008 (véase la Tabla 2).
Tabla 3
Cáncer de mama luminal Cáncer de mama basal Cáncer de mama post EMT Total
Resistente a Dasatinib
17 3 1 21
Sensible a Dasatinib
6 6 6 18
Total
23 9 7 39
Ejemplo 7: La expresión de una subserie de tres genes predice respuesta a dasatinib con una especificidad y sensibilidad del 88 y el 86% respectivamente en los subtipos
Algunas líneas de células luminales demostraron una sensibilidad moderada a dasatinib (Tabla 2). Se crearon matrices de datos de genes expresados diferencialmente con la intención de identificar marcadores de predicción 5 potenciales de la respuesta a dasatinib. Inicialmente, se buscaron genes que diferenciaran las líneas celulares basales sensibles de líneas celulares luminales y basales resistentes. Este análisis produjo tanto moesina como caveolina 1 como posibles discriminadores. A continuación, usando una técnica similar, se identificaron genes que discriminaban entre las líneas celulares luminales que eran sensibles (moderadas) y resistentes. Se identificó la proteína 1 asociada a yes (YAP-1) basándose en su expresión diferencial entre los dos grupos y el posible significado biológico, ya que YAP-1 10 es una proteína con relevancia para la señalización de src. Es una proteína de 65 kD que se une al producto génico de la familia src de quinasas yes. Los niveles de expresión relativa de estos tres genes en el panel de líneas celulares y su respuesta asociada a dasatinib in vitro fueron evidentes (Figura 2B). La detección de uno de estos tres marcadores predice una respuesta in vitro a dasatinib con una sensibilidad y especificidad del 88 y 86%, respectivamente (véase la Tabla 4). 15
Tabla 4
Expresión génica [Log(relación)]
Respuesta sensible y moderada a dasatinib Respuesta resistente a dasatinib
Moesina, caveolina 1 o proteína 1 asociada a yes > 0 P < 0,01
(verdadero positivo) 15 (Falso positivo) 3
Moesina, caveolina 1 o proteína 1 asociada a yes > 0 P < 0,01
(Falso negativo) 2 (Verdadero negativo) 19
Total
17 22
Se caracterizó molecularmente un gran panel de líneas celulares de cáncer de mama humano usando perfiles de expresión génica para identificar un subgrupo de cánceres de mama que es más probable que respondan al tratamiento con dasatinib. Usando dicho panel grande se incluye mejor la heterogeneidad molecular de los cánceres de 20 mama clínicos, incluyendo la enfermedad dirigida hormonalmente, la enfermedad amplificada por HER2 y los cánceres de mama "triple negativos". Este enfoque se usó después para ensayar los efectos biológicos del inhibidor de quinasa multi-dirigido dasatinib. Ciertos informes recientes describen un enfoque adicional para identificar firmas de rutas oncogénicas mediante el uso de micromatrices de ADN de cultivos epiteliales mamarios transfectados con genes de interés, incluyendo src (véase, por ejemplo, Bild AH, y col., Nature. 19 Enero 2006; 439 (7074): 353-7). 25
Aunque en el cáncer de mama se ha implicado una activación y expresión aberrante de src, su papel crítico no se ha asociado con ningún fenotipo molecular característico. En este estudio se encontró una fuerte asociación entre la sensibilidad in vitro a dasatinib y el subtipo basal ("triple negativo") del cáncer de mama humano. Dada la gran cantidad de datos en relación con el papel de src en la señalización de HER2, la hipótesis inicial fue que dasatinib podría ser el más activo en líneas celulares con amplificación de HER2, sin embargo, la mayoría de estas líneas celulares eran 30 relativamente resistentes a la monoterapia con dasatinib (11 de 15). Además, la mayoría de las líneas celulares que son sensibles son bajas o negativas con respecto al receptor de hormonas esteroideas. Estas características solas definen, en parte, el grupo "triple negativo" del cáncer de mama.
Usando las matrices de expresión basales, se discriminaron adicionalmente líneas celulares "de respuesta" usando la expresión diferencial de tres genes: moesina, caveolina y proteína 1 asociada a yes con una alta sensibilidad 35 y especificidad (88 y 86%, respectivamente). Aunque pueden obtenerse otros genes del análisis de series de datos de micromatriz grandes, la relevancia biológica de estos genes hace que sean marcadores de predicción para definir una población de cánceres de mama que de forma similar a los positivos para RE responderán a un agente terapéutico dirigido a src tal como dasatinib. La caveolina 1 interacciona estrechamente con el SFK, fyn, en la asociación de integrinas con la señalización ras-ERK en la ruta de adhesión focal así como otras SFK (28-29) (véase, por ejemplo; 40 Wary KK, y col., Cell. 4 Sep 1998; 94 (5): 625-34 y Williams TM, y col., Am J Cell Physiol. Mar 2005; 288 (3): C494-C506) y, como se ha indicado anteriormente, YAP-1 interacciona con src y otro proto-oncogén SFK yes, posiblemente en la unión estrecha y en las rutas de adherencia (véase, por ejemplo, Sudol M., Oncogene. Agosto 1994; 9(8): 2145-52
y Playford MP, y col., Oncogene. 18 Oct 2004; 23 (48): 7928-46).
c-src (véase, por ejemplo, la SEC ID Nº: 15) es el homólogo celular del oncogén viral v-src y es el miembro prototipo de una familia de tirosina quinasas no receptoras que juegan un papel clave en muchas rutas de señalización celular que implican la proliferación, diferenciación, supervivencia, motilidad y angiogénesis. La expresión aberrante y la activación de quinasas de la familia src (SFK) se han implicado en varias malignidades humanas, pero hasta ahora no 5 han demostrado ser dianas clínicas eficaces (véase, por ejemplo, Irby RB y col., Oncogene. 20 Nov 2000; 19 (49): 5636-42 e Ishizawar R y col., Cancer Cell. Sep 2004; 6 (3): 209-14). A pesar de esto, los estudios moleculares continúan demostrando que src juega un papel potencial en rutas clínicamente importantes en el cáncer de mama incluyendo la ruta de señalización de hormonas peptídicas y esteroideas (véase, por ejemplo, Bromann PA, y col., Oncogene. 10 Oct 2004; 23 (48): 7957-68 y Shupnik MA y col., Oncogene. 18 Oct 2004; 23 (48): 7979-89). 10
El oncogén src fue el primer gen de transformación descrito, sin embargo, hasta hace poco no se persiguió agresivamente como diana en oncología. A diferencia de -src, se observó que el homólogo celular humano c-src era sólo débilmente tumorigénico y, por lo tanto, no parecía jugar un papel importante en la patogénesis de malignidades humanas (véase, por ejemplo, Ishizawar R y col., Cancer Cell. Sep 2004; 6 (3): 209-14). Sin embargo, hace poco se ha asociado una activación y expresión aberrante de c-src con la enfermedad humana, incluyendo malignidades de 15 pulmón, piel, colon, ovario, endometrio, área de cabeza y cuello y mama (véase, por ejemplo, Irby RB y col., Oncogene. 20 Nov 2000; 19(49): 5636-42). Esto ha llevado a la hipótesis actual de que c-src puede facilitar la acción de otras proteínas de señalización, en lugar de ser un agente de transformación dominante. Por sí mismo, c-src interacciona con varios factores celulares que incluyen receptores de la superficie celular de la familia EGFR, CSFR-l, PDGFR y FGFR así como integrinas, moléculas de adhesión célula-célula, receptores de hormonas esteroideas, componentes de rutas 20 reguladas por receptores acoplados a proteína G y quinasas de adhesión focal (fak), así como proteínas adaptadoras tales como shc y muchas otras (véase, por ejemplo, Irby RB y col., Oncogene. 20 Nov 2000; 19 (49): 5636-42). Como resultado de su papel en estas rutas críticas, probablemente c-src juega un papel clave en la regulación de la proliferación, diferenciación, supervivencia, motilidad, angiogénesis y funciones de células diferenciadas (véase, por ejemplo, Irby RB y col., Oncogene. 20 Nov 2000; 19 (49): 5636-42). Se sabe que las alteraciones en varios de estos 25 procesos son características del fenotipo maligno (véase, por ejemplo, Hanahan D, y col., Cell. 7 Enero 2000; 100 (1): 57-70). Los datos actuales del grupo de los presentes inventores así como los datos generados independientemente por Clark y col., indican alguna dependencia de las rutas de señalización de src en el subgrupo basal de cánceres mama in vitro (véase, por ejemplo, Clark E, y col., Proceedings of the Am Soc Clin Oncol Abstract 3010, 2005). Otra investigación reciente ha confirmado el papel de la inhibición de src con dasatinib en modelos de cáncer de cabeza y cuello, 30 pancreático y también de pulmón (véase, por ejemplo, Johnson FM, y col., Clin Cancer Res 1 Oct 2005; 11(19 Pt1):6924-32; Trevino JG, y col., Am J Pathol. Mar 2006; 168(3): 962-72; y Song L, y col., Cancer Res 66 (11): 5542-8, 2006).
Las mutaciones en la quinasa abl (véase, por ejemplo, la SEC ID Nº: 16) son la alteración de definición en la leucemia mielógena crónica y han sido la base del direccionamiento molecular de esta enfermedad inicialmente con 35 imatinib y ahora dasatinib. Una explicación alternativa de los resultados actuales podría basarse en nuevos datos que implican abl en cáncer de mama. La evaluación de la activación de abl en un panel de 8 líneas celulares de cáncer de mama ha mostrado una activación constitutiva de abl en "células de cáncer de mama agresivas" sin aumentos en la expresión del gen abl (véase, por ejemplo, Srinivasan D, y col., Cancer Res. 1 Jun 2006; 66(11): 5648-55). Estas líneas celulares incluían muchas líneas celulares que se evaluaron en el panel, incluyendo MDA-MB-468, MCF-7, BT-474, SK-40 BR-3, MDA-MB-231, MDA-MB-453 y UACC-893. De forma interesente, estos autores describieron una actividad abl significativamente aumentada en las células MDA-MB-231 y MDA-MB-435. Estas líneas celulares se encuentran entre las presentadas como más sensibles a dasatinib y se clasifican como post-EMT debido a su expresión de altos niveles de vimentina. También es de interés la observación de que la línea celular basal MDA-MB-468 era una de sólo 3 líneas celulares basales que se descubrió que eran resistentes a dasatinib y en el estudio que implicaba abl esta línea celular 45 tenía un bajo nivel de activación de abl (véase, por ejemplo, Srinivasan D, y col., Cancer Res 1 Jun 2006; 66(11): 5648-55). Por lo tanto, la inhibición de abl puede ser otro mecanismo potencial de actividad de dasatinib en líneas celulares de cáncer de mama basal.
Usando un enfoque farmocogenómico in vitro, se ha identificado esta única serie de genes que predice la respuesta a dasatinib. La mayoría de estas líneas celulares también representan la subserie "triple negativa" (ER-, PR-, 50 HER2-) (es decir, que carecen o que tienen una expresión reducida de, por ejemplo, ER (SEC ID Nº: 7), PR (SEC ID Nº: 8) y HER2 (SEC ID Nº: 9) de cánceres de mama, que actualmente carece de tratamiento eficaz. Esta divulgación proporciona indicios de que esta serie de genes puede usarse como un indicador de la respuesta a dasatinib (así como otros compuestos relacionados). De forma importante, estos datos proporcionan una base científica para el desarrollo clínico de dasatinib en el tratamiento de mujeres con cáncer de mama "triple-negativo", un subtipo que se clasifica como 55 agresivo y que carece de tratamientos eficaces (es decir, manipulación hormonal o trastuzumab).
Ciertos procedimientos y materiales en esta solicitud son análogos a los encontrados en las Patentes de Estados Unidos Nº 6.767.541, 6.165.464, 5.772.997, 5.677.171, 5.770.195, 6.399.063, 5.725.856 y 5.720.954.
TABLA 1
TABLA 1A: SECUENCIAS POLINUCLEOTÍDICAS DE MCY
Moesina (véase, por ejemplo, Nº de Acceso NM_002444) (SEC ID Nº: 1)
Caveolina 1 (véase, por ejemplo, Nº de Acceso NM_001753) (SEC ID Nº: 2)
Proteína 1 asociada a Yes (véase, por ejemplo, Nº de Acceso NM_006106) (SEC ID Nº: 3)
TABLA 1B: SECUENCIAS DE POLIPÉPTIDO DE MCY
Moesina (véase, por ejemplo, Nº de Acceso NM_002435) (SEC ID Nº: 4)
Caveolina 1 (véase, por ejemplo, Nº de Acceso AAH82246) (SEC ID Nº: 5)
Proteína 1 asociada a Yes (véase, por ejemplo Nº de Acceso NP_006097) (SEC ID Nº: 6)
TABLA 1C: SECUENCIA POLINUCLEOTÍDICA DE RECEPTOR DE ESTRÓGENOS 5
(véase, por ejemplo, Nº de Acceso NM_000125) (SEC ID Nº: 7)
TABLA 1D. SECUENCIA POLINUCLEOTÍDICA DE RECEPTOR DE PROGESTERONA DE HOMO SAPIENS
(véase, por ejemplo, Nº de Acceso NM_000926) (SEC ID Nº: 8)
TABLA 1E: SECUENCIA POLINUCLEOTÍDICA DE HER2 DE HOMO SAPIENS
(véase, por ejemplo, Nº de Acceso NM_004448) (SEC ID Nº: 9)
TABLA 1F SECUENCIA POLINUCLEOTÍDICA DE VIMENTINA DE HOMO SAPIENS
(véase, por ejemplo, Nº de Acceso NM_003380) (SEC ID Nº: 10)
TABLA 1G: SECUENCIA POLINUCLEOTÍDICA DE CITOQUERATINA 5 DE HOMO SAPIENS
(véase, por ejemplo, Nº de Acceso NM_000424) (SEC ID Nº: 11)
TABLA 1H: SECUENCIA POLINUCLEOTÍDICA DE CITOQUERATINA 17 DE HOMO SAPIENS 5
(véase, por ejemplo, Nº de Acceso NM_000422) (SEC ID Nº: 12)
TABLA 1I: SECUENCIA POLINUCLEOTÍDICA DE CITOQUERATINA 8 DE HOMO SAPIENS
(véase, por ejemplo, Nº de Acceso NM_002273) (SEC ID Nº: 13)
TABLA 1J: SECUENCIA POLINUCLEOTÍDICA DE CITOQUERATINA 18 DE HOMO SAPIENS 5
(véase, por ejemplo, Nº de Acceso NM_199187) (SEC ID Nº: 14)
TABLA 1K: SECUENCIA POLINUCLEOTÍDICA DE c-SRC DE HOMO SAPIENS
(véase, por ejemplo, Nº de Acceso NM_004383) (SEC ID Nº: 15)
5
TABLA 1L: SECUENCIA POLINUCLEOTÍDICA DE c-ab1 DE HOMO SAPIENS
(véase, por ejemplo, Nº de Acceso X16416) (SEC ID Nº: 16)
LISTA DE SECUENCIAS
<110> Bristol-Myers Squibb Pharma company
The Regents of the University of California
Finn, Richard 5
Dering, Judy
Slamon, Dennis
Ginther, Charles
Clark, Edwin
<120> MOESINA, CAVEOLINA 1 Y PROTEÍNA 1 ASOCIADA A YES COMO MARCADORES DE 10 PREDICCIÓN DE LA RESPUESTA A DASATINIB EN CÁNCERES DE MAMA
<130> BMS-2815
<140> PCT/US2006/060776
<141> 10-11-2006
<150> US 60/737.475 15
<151> 10-11-2005
<160> 16
<170> PatentIn versión 3.3
<210> 1
<211> 3981 20
<212> ADN
<213> Homo sapiens
<400> 1
<210> 2
<211> 2704
<212> ADN
<213> Homo sapiens 5
<400> 2
<210> 3
<211> 5128
<212> ADN
<213> Homo sapiens 5
<400> 3
<210> 4
<211> 577
<212> PRT
<213> Homo sapiens 5
<400> 4
<210> 5
<211> 178
<212> PRT
<213> Homo sapiens 5
<400> 5
<210> 6
<211> 454
<212> PRT
<213> Homo sapiens 5
<400> 6
<210> 7
<211> 6456
<212> ADN
<213> Homo sapiens 5
<400> 7
<210> 8
<211> 5000
<212> ADN
<213> Homo sapiens 5
<400> 8
<210> 9
<211> 4624
<212> ADN
<213> Homo sapiens 5
<400> 9
<210> 10
<211> 1847
<212> ADN
<213> Homo sapiens 5
<400> 10
<210> 11
<211> 2301
<212> ADN
<213> Homo sapiens 5
<400> 11
<210> 12
<211> 1512
<212> ADN
<213> Homo sapiens 5
<400> 12
<210> 13
<211> 1788
<212> ADN 5
<213> Homo sapiens
<400> 13
<210> 14
<211> 1439
<212> ADN
<213> Homo sapiens 5
<400> 14
<210> 15
<211> 2420
<212> ADN 5
<213> Homo sapiens
<400> 15
<210> 16
<211> 5527
<212> ADN
<213> Homo sapiens 5
<400> 16

Claims (13)

  1. REIVINDICACIONES
    1. Un procedimiento para determinar la capacidad de respuesta de una célula de tumor de mama de mamífero al tratamiento con N-(2-cloro-6-metilfenil)-2-[[6-[4-(2-hidroxietil)-1-piperazinil]-2-metil-4-pirimidinil]amino]-5-tiazolcarboxamida o una sal, solvato o hidrato farmacéuticamente aceptable de la misma, comprendiendo el procedimiento determinar en una muestra biológica el nivel de expresión de al menos un gen seleccionado de moesina, 5 caveolina 1 o proteína 1 asociada a yes en dicha célula tumoral, siendo indicativa la expresión o la expresión elevada de que es probable que la célula responda o sea sensible al tratamiento.
  2. 2. El procedimiento de la reivindicación 1, en el que la célula de tumor de mama es una célula basal, una célula luminal, una célula mesenquimática, una célula BRCA-1, una célula que ha experimentado una transición de epitelial a mesenquimática o una célula que tiene expresión reducida de un receptor de estrógenos, progesterona y HER2. 10
  3. 3. Un procedimiento in vitro para reducir la capacidad de proliferar de una célula de cáncer de mama triple negativa, que comprende exponer la célula a N-(2-cloro-6-metilfenil)-2-[[6-[4-(2-hidroxietil)-1-piperazinil]-2-metil-4-pirimidinil]amino]-5-tiazolcarboxamida o una sal, solvato o hidrato farmacéuticamente aceptable de la misma.
  4. 4. El procedimiento de la reivindicación 1, en el que la muestra biológica es un material biológico obtenido de un individuo con cáncer de mama y en el que la expresión o la expresión elevada indica capacidad de respuesta del 15 individuo al tratamiento con N-(2-cloro-6-metilfenil)-2-[[6-[4-(2-hidroxietil)-1-piperazinil]-2-metil-4-pirimidinil]amino]-5-tiazolcarboxamida o una sal, solvato o hidrato farmacéuticamente aceptable de la misma.
  5. 5. El procedimiento de la reivindicación 1 ó 4, en el que se determina el nivel de expresión de al menos dos genes seleccionados entre moesina, caveolina 1 o proteína 1 asociada a yes en la muestra biológica.
  6. 6. El procedimiento de la reivindicación 1 ó 4, en el que se determina el nivel de expresión del gen de la proteína 20 1 asociada a yes, el gen de la caveolina 1 y el gen de la moesina.
  7. 7. N-(2-cloro-6-metilfenil)-2-[[6-[4-(2-hidroxietil)-1-piperazinil]-2-metil-4-pirimidinil]amino]-5-tiazolcarboxamida o una sal, solvato o hidrato farmacéuticamente aceptable de la misma para su uso en el tratamiento de un individuo que padece un cáncer de mama,
    en la que el nivel de expresión de al menos un gen seleccionado de moesina, caveolina 1 o proteína 1 asociada a yes 25 en una muestra biológica obtenida a partir del individuo está aumentado en comparación con una muestra de control.
  8. 8. N-(2-cloro-6-metilfenil)-2-[[6-[4-(2-hidroxietil)-1-piperazinil]-2-metil-4-pirimidinil]amino]-5-tiazolcarboxamida o una sal, solvato o hidrato farmacéuticamente aceptable de la misma para su uso de acuerdo con la reivindicación 7, en la que el nivel de expresión de al menos dos genes seleccionados entre moesina, caveolina 1 o proteína 1 asociada a yes está aumentado en comparación con una muestra de control. 30
  9. 9. N-(2-cloro-6-metilfenil)-2-[[6-[4-(2-hidroxietil)-1-piperazinil]-2-metil-4-pirimidinil]amino]-5-tiazolcarboxamida o una sal, solvato o hidrato farmacéuticamente aceptable de la misma para su uso de acuerdo con la reivindicación 7, en la que el nivel de expresión del gen de la proteína 1 asociada a yes, el gen de caveolina 1 y el gen de moesina está aumentado en comparación con una muestra de control.
  10. 10. El procedimiento de la reivindicación 1 ó 4, o N-(2-cloro-6-metilfenil)-2-[[6-[4-(2-hidroxietil)-1-piperazinil]-2-metil-35 4-pirimidinil]amino]-5-tiazolcarboxamida o una sal, solvato o hidrato farmacéuticamente aceptable de la misma para su uso de acuerdo con la reivindicación 7, en el que el nivel de expresión está determinado por la detección del nivel de ARNm transcrito a partir de dicho al menos un gen.
  11. 11. El procedimiento de la reivindicación 1 ó 4, o N-(2-cloro-6-metilfenil)-2-[[6-[4-(2-hidroxietil)-1-piperazinil]-2-metil-4-pirimidinil]amino]-5-tiazolcarboxamida o una sal, solvato o hidrato farmacéuticamente aceptable de la misma para su 40 uso de acuerdo con la reivindicación 7, en el que el nivel de expresión está determindado por la detección del nivel de ADNc producido por transcripción inversa del ARNm transcrito a partir de dicho al menos un gen.
  12. 12. El procedimiento de la reivindicación 1 ó 4, o N-(2-cloro-6-metilfenil)-2-[[6-[4-(2-hidroxietil)-1-piperazinil]-2-metil-4-pirimidinil]amino]-5-tiazolcarboxamida o una sal, solvato o hidrato farmacéuticamente aceptable de la misma para su uso de acuerdo con la reivindicación 7, en el que el nivel de expresión está determinado por la detección del nivel del 45 polipéptido codificado por dicho al menos un gen.
  13. 13. N-(2-cloro-6-metilfenil)-2-[[6-[4-(2-hidroxietil)-1-piperazinil]-2-metil-4-pirimidinil]amino]-5-tiazolcarboxamida o una sal, solvato o hidrato farmacéuticamente aceptable de la misma para su uso en el tratamiento en un individuo que tiene un cáncer de mama que puede ser caracterizado como triple negativo.
    50
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