ES2301706T3 - Metodo de videomicroscopia cuantitativa y sistema asociado asi como el producto de programa informatico de sofware. - Google Patents
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Abstract
Un método de determinación de una magnitud de al menos una especie molecular que comprende una muestra (500), en donde cada especie molecular está indicada por un colorante, en un sistema de videomicroscopía (100), comprendiendo el mencionado método: capturar una imagen (450) de la muestra como datos de la imagen con un dispositivo de adquisición de imágenes de banda ancha; determinar una densidad óptica de la muestra a partir de los datos de la imagen, en cada uno de los canales del rojo, verde y azul (550, 600, 650) en un píxel en la imagen, de forma tal que se FOME una matriz de densidades ópticas correspondientes para el píxel; y multiplicar la matriz de densidades ópticas por el inverso de la matriz de coeficientes de absorción relativa, con el fin de formar una matriz resultante para el píxel, en donde la matriz de coeficientes de absorción relativa comprende un coeficiente de absorción relativa para cada colorante, independientemente de la muestra, en cada uno de los canales del rojo, verde y azul, comprendiendo la matriz resultante la magnitud de cada especie molecular, según lo indicado por el colorante respectivo para el píxel.
Description
Método de videomicroscopía cuantitativa y
sistema asociado así como el producto de programa informático de
software.
La presente invención está relacionada con el
análisis de imágenes, y más en particular con un método de
videomicroscopía cuantitativa en biología celular y en aplicaciones
de patología, y un sistema asociado así como un producto de un
programa de software por ordenador.
El análisis efectivo de imágenes de microscopia
es esencial en biología celular y en patología, particularmente
para la detección y cuantificación de materiales genéticos, tales
como por ejemplo, los genes o RNA mensajero, o la expresión de
esta información genética en la forma de proteínas a través, por
ejemplo, de la amplificación de genes, delección de de genes,
mutación de genes, cuantificación de la molécula de RNA mensajero, o
bien los análisis de expresión de proteínas. La amplificación de
genes es la presencia de demasiadas copias del mismo gen en una
célula, en donde una célula contiene usualmente dos copias,
conocidas por otra parte como alelos del mismo gen. La delección de
genes indica que pueden encontrarse en una célula un número inferior
a dos copias de un gen. La mutación de genes indica la presencia de
genes incompletos o no funcionales. Los RNA mensajeros (mRNA) son
moléculas de información genética, sintetizadas a partir de un
proceso de lectura de los genes, que sirven como plantillas para la
síntesis de las proteínas. La expresión de proteína es la
producción de una proteína dada por una célula. Si la codificación
de los genes para la proteína dada, determinada a partir de un
proceso de expresión de la proteína, se realza o bien están
presentes unas copias excesivas del gen o del mRNA, la proteína
puede estar sobre-expresada. Al revés, si la
codificación del gen se suprime o está ausente, la proteína puede
estar infra-expresada o ausente.
Los comportamientos celulares normales están
controlados con precisión por los mecanismos moleculares que
incluyen un gran número de proteínas, mRNA, y genes. Es conocido que
la amplificación del gen, la eliminación del gen, y la mutación del
gen tienen un papel predominante en los comportamientos celulares
anormales, a través de la expresión de la proteína anormal. El
rango de los comportamientos celulares al respecto incluye los
comportamientos tan diversos como, por ejemplo, la proliferación o
la regulación de la diferenciación. En consecuencia, la detección
efectiva y la cuantificación en la amplificación, eliminación y
mutación, cuantificación del mRNA, o los análisis de expresión de
las proteínas, son necesarios con el fin de facilitar la
investigación útil, el diagnóstico y las herramientas de
pronósticos.
Existen numerosas técnicas de laboratorio
dirigidas a la detección y cuantificación de la amplificación,
eliminación y mutación, cuantificación del mRNA, de los genes, o
los análisis de expresión de las proteínas. Por ejemplo, tales
técnicas incluyen los blogs de transferencia Western, Northern y
Southern, la reacción en las cadenas de polimerasa ("PCR"),
ensayo de inmunoseparación enlazada por enzimas ("ELISA"), y
las técnicas de hibridización genómica comparativa ("CGH"). No
obstante, la microscopia se utiliza en forma rutinaria porque es
una técnica informativa, que permite las investigaciones rápidas a
niveles celulares y sub-celulares, mientras que es
capaz de poderse implementar fácilmente a un costo relativamente
bajo.
Cuando la microscopía es la técnica elegida para
el laboratorio, las muestras biológicas tienen que someterse a una
detección específica y a preparaciones de revelado. Una vez
preparadas las muestras, un humano experto analiza típicamente las
muestras con un microscopio solo en un estudio cuantitativo, o con
un microscopio acoplado a una cámara y a un ordenador en un estudio
cuantitativo y generalmente estandarizado. En algunos casos, el
microscopio puede estar configurado para análisis totalmente
automáticos, en donde el microscopio está automatizado con una
etapa motorizada y con intercambiadores de enfoque y objetivos
motorizados, y con controles de intensidad luminosa automáticos y
similares.
La preparación de las muestras para la detección
puede incluir distintos tipos de técnicas de preparación que están
adecuadas para el análisis de imágenes microscópicas, tales como por
ejemplo, las técnicas de preparación basadas en la hibridación y en
el inmunomarcaje. Tales técnicas de detección pueden estar acopladas
con técnicas de revelado apropiadas, tales como por ejemplo las
técnicas basadas en la fluorescencia y en la reacción a los colores
visibles.
La Hibridización in situ ("ISH") y
la Hibridización in situ Fluorescente ("FISH" son las
técnicas de detección y revelado utilizadas, por ejemplo, para la
detección y la cuantificación en los análisis de información
genética de la amplificación y mutación. Tanto la ISH y la FISH
pueden aplicarse a las muestras histológicas o citológicas. Estas
técnicas utilizan unas sondas complementarias específicas para
reconocer las correspondientes secuencias exactas. Dependiendo de
la técnica utilizada, la sonda específica puede incluir un marcador
químico (ISH) o un marcador fluorescente (FISH), en donde las
muestras se analizan entonces utilizando un microscopio de
transmisión o un microscopio de fluorescencia, respectivamente. El
uso de un marcador químico o un marcador fluorescente depende del
objetivo perseguido por el usuario, teniendo cada tipo de marcador
las ventajas correspondientes sobre la demás en casos en
particular.
\newpage
En los análisis de expresión de las proteínas,
las técnicas de inmunohistoquímica ("IHC") e inmunocitoquímica
("ICC"), por ejemplo, pueden ser utilizadas. La IHC es la
aplicación de la inmunoquímica a las secciones del tejido, mientras
que la ICC es la aplicación de la inmunoquímica a las células
cultivadas o a las impresiones de tejidos después de que hayan sido
sometidas a preparaciones citológicas específicas, tales como por
ejemplo, preparaciones basadas en líquidos. La inmunoquímica es una
familia de técnicas basadas en el uso de un anticuerpo específico,
en donde los anticuerpos se utilizan para hacer diana en las
moléculas especificas dentro o sobre la superficie de las células.
El anticuerpo contiene típicamente un marcador que se someterá a una
reacción bioquímica, y que por tanto experimentará un color
cambiante, al confrontarse con las moléculas dianas. En algunos
casos, la amplificación de la señal puede estar integrada en el
protocolo en particular, en donde un anticuerpo secundario, que
incluye un colorante marcador, sigue la aplicación de un anticuerpo
específico primario.
En ambos estudios de la hibridización y la
inmunomarcaje, se utilizan los cromogenes de distintos colores para
distinguir entre los distintos marcadores. No obstante, el número
máximo de marcadores que pueden utilizarse en un estudio está
restringido por varios factores. Por ejemplo, el solapado espectral
de los colores utilizados para revelar los respectivos marcadores
puede ser un factor limitante, porque los colorantes pueden absorber
en su totalidad la parte mayor del espectro visible. En
consecuencia, cuando más alto sea el numero de colorantes en un
estudio, mayor será el riesgo de solapado espectral. Además de ello,
la resolución espectral del dispositivo de adquisición puede ser un
factor limitante, y tiene que considerarse el desplazamiento del
color que el dispositivo sea capaz de detectar.
Además de ello, la inmunoquímica, así como
también la química en ISH, se consideran en general que muestran
una deficiente sensibilidad cuando tiene que conseguirse una
cuantificación del marcador. No obstante, la precisión de la
cuantificación de estas técnicas puede ser dependiente de varios
factores. Por ejemplo, el tipo de reacción utilizada puede jugar un
papel en la precisión de la técnica, puesto que la linealidad de la
relación entre la concentración del ligando y el grado de la
reacción del colorante inmunoquímico puede depender notablemente
del tipo de reacción. Más en particular, un método de
peroxidasa/anti-peroxidasa puede ser más lineal que
el método de biotina-avidin. La localización celular
de los marcadores puede afectar a la precisión, en donde por
ejemplo si los marcadores de la membrana y núcleo se solapan
espacialmente, el color resultante es una mezcla de los respectivos
colores. En consecuencia, puesto que la cuantificación
correspondiente es subjetiva, la precisión de la determinación
puede quedar afectada. Además de ello, un estándar de calibración
tal como por ejemplo unas células con características conocidas, o
geles con concentraciones dadas del marcador, o similares, pueden
ser necesarios al aplicar un modelo de análisis desarrollado a un
caso nuevo y diferente. Los kits de coloración están en general
disponibles, los cuales incorporan estándares de calibración. No
obstante, el estándar de calibración es usualmente aplicable solo a
un espécimen en particular, tal como una célula especifica o una
estructura de un tipo específico, el cual sea conocido para poder
mostrar las características constantes con respecto al estándar, y
que puede ser de una utilidad limitada al aplicarse a una muestra de
una naturaleza diferente.
En términos generales, los estudios de
"colorimetría" descritos presentan la información del análisis
de las muestras en color, y facilitan el procesamiento y la
cuantificación de la información, para ayudar por tanto a
proporcionar un diagnóstico o para formar un pronóstico del caso en
particular. A modo de ilustración, la detección y la cuantificación
de la expresión de la proteína HER2 y/o la amplificación de los
genes pueden estar evaluadas por distinta soluciones utilizadas en
la microscopía cuantitativa. La HER2 es una proteína de membrana
que se ha demostrado que tiene un diagnóstico y una significancia
del pronóstico en el cáncer de mama metastático. Debido a que los
pacientes de HER2 positivo se mostraron como más sensibles al
tratamiento, incluyendo Herceptin® (un tratamiento de diana
desarrollado por Genentech, la definición del estado HERN2 de los
cánceres de mama metastáticos ha probado ser de primera importancia
en la selección del protocolo de tratamiento apropiado. Esta
definición del estado HERN2 estuvo basada en un estudio de muestras
tratadas con cualquiera de las técnicas de hibridización (FISH, ISH)
o inmunomarcaje.
En tales estudios, utilizando la técnica FISH,
por ejemplo, con un kit aprobado por FDA tal como el PathVysion®
fabricado por Vysis, se requiere un protocolo de análisis de
imágenes para contar el numero de copias del gen HER2 presente en
cada célula. En un caso normal, se han encontrado dos copias del gen
en cada célula, mientras que más de tres copias del gen en una
célula indicaría que el gen esta amplificado. Alternativamente,
utilizando la técnica IHC, por ejemplo con un kit aprobado por FDA,
tal como el Herceptest® fabricado por Dako, requiere un protocolo
de análisis de imágenes que clasifica los casos en cuatro
categorías, dependiendo de la intensidad y localización de la
coloración de la membrana específica del HER2. Los estudios actuales
tienden a mostrar que estas dos técnicas de investigación
(hibridización e inmunomarcaje) pueden ser complementarias y que
pueden ayudar a los patólogos en la diagnosis de los
sub-tipos de tumores al estar combinadas.
No obstante, tales estudios de colorimetría
requieren una preparación de muestras extensiva y un control del
procedimiento. Así pues, al disponer de protocolos de coloración
adaptados, es crítico poder verificar que la coloración de la
muestra coincida con el modelo en particular utilizado en la
adquisición de imágenes y el dispositivo de procesamiento, de forma
tal que se obtengan unos resultados útiles y precisos a partir de
la información reunida. De lo contrario, el análisis puede tener que
ser repetido, comenzando de nuevo a partir de la etapa de
preparación de la muestra, dando lugar posiblemente por tanto a un
proceso costoso y con exigencia de mucho tiempo.
En un dispositivo de microscopía típico basado
en la adquisición y procesamiento de imágenes, la imagen amplificada
de la muestra tiene que ser capturada primeramente, y digitalizada
con una cámara. En general, las cámaras digitales de dispositivo
de carga acoplada (CCD) se utilizan en la microscopía cuantitativa
luminosa o fluorescente. Excluyendo a los espectrofotómetros, se
utilizan en general dos técnicas diferentes, para la ejecución de
los estudios de microscopía colorimétrica. En una técnica, puede
utilizarse una cámara CCD de blanco y negro (BW). En tal caso, se
puede obtener una imagen de niveles de grises de la muestra,
correspondiente a la luz monocromática que tenga una longitud de
onda específica con la coloración de la muestra a analizar. La
longitud de onda especifica de la luz se obtiene bien mediante el
filtrado de una fuente de luz blanca a través de un filtro
especifico de ancho de banda estrecho, o bien directamente mediante
el control de la longitud de onda de la fuente luminosa, utilizando
controles manuales o electrónicos. En consecuencia, utilizando esta
técnica, el tiempo del análisis se incrementa conforme aumenta el
número de colores, porque tiene que seleccionarse una fuente
luminosa o un filtro para cada coloración distinta de la muestra o
para cada longitud de onda distinta. En consecuencia, muchas
imágenes distintas de la muestra, mostrando la respuesta espectral
de la muestra a distintas longitudes de onda, tienen que se
capturada individualmente en un orden secuencial para facilitar el
análisis. Cuando tienen que analizarse múltiples escenas o campos de
visión, el protocolo típico es automatizar la secuencia en un modo
por lotes para conservar el tiempo de procesamiento.
De acuerdo con una segunda técnica, se utiliza
una cámara CCD digital de color, en donde se capturan y se obtienen
simultáneamente tres imágenes de niveles de grises de la muestra.
Cada imagen de nivel de gris corresponde a los canales del Rojo,
Verde y Azul (RGB) de la cámara de color CCD. Las imágenes se
analizan directamente en el espacio de color RGB mediante la
restricción del análisis a los píxeles localizados en una zona
específica del cubo RGB, en donde la zona específica incluye
también los píxeles de una base de datos de entrenamiento
correspondiente. Alternativamente, las imágenes se analizan después
de la transformada matemática del espacio de color RGB, en uno de
muchos espacios de color definido por la CIE (Comisión Internacional
de la Iluminación), tal como por ejemplo, el espacio HLS (Matiz,
Luminancia o Saturación). Alternativamente, algunos fabricantes de
cámaras fabrican cámaras CCD específicas, en donde los filtros de
ancho de banda estrecha para seleccionar longitudes de onda
específicas pueden reemplazar a los filtros usuales de Rojo, Verde y
Azul. En tal caso, la cámara permite la captura de una imagen
rápida de los tres componentes espectrales de una escena de una
forma paralela. No obstante, las cámaras modificadas de esta forma
tienen que estar limitadas a los parámetros del análisis espectral
especifico, debido a que los filtros no pueden cambiarse, y por
tanto no pueden ser adaptados para estar dirigidos a una única
combinación de colorantes utilizados para la muestra. Así pues, la
segunda técnica se basa en general sobre la detección del contraste
entre la especie/especies y el resto de la muestra o el análisis de
la muestra a través de un ancho de banda estrecho.
Los espectrómetros, tales como el descrito en la
patente de los EE.UU. número 6007996, de McNamara y otros, puede
implementar una combinación en particular de colorante y un
interferómetro para reunir los datos de la imagen necesarios para
el análisis. La patente 6007996 expone una técnica de producción de
imágenes que requiere colorantes fluorescentes a seleccionar de
acuerdo con un método en particular, para proporcionar una
combinación específica de colorantes. Se requiere entonces un
interferómetro configurado para examina un ancho de banda estrecho
(un rango de longitudes de onda predefinido o un conjunto
predeterminado de combinaciones lineales de la intensidad
espectral), para analizar el espécimen, en donde el dispositivo de
recogida de datos espectrales y la selección de los colorantes
tiene que ser tal que los componentes espectrales con cada uno de
los colorantes puedan ser recogidos. En consecuencia, el
interferómetro requiere que una pluralidad de cuadros de la muestra
pueda adquirirse en incrementos de medida sucesivos, a través de un
rango de longitudes de onda a examinar, en donde cada cuadro pueda
cubrir la revolución espectral del ancho de banda estrecho del
dispositivo del interferómetro. Así pues, la pluralidad de tramas
para cada muestra podrán reunirse a través del rango de longitudes
de onda, en donde las imágenes se separan de acuerdo con cada
colorante, mediante la integración de la pluralidad de tramas que
componen la señal óptica a través del rango espectral
(longitud de onda) de la matriz CCD, utilizando un algoritmo RGB para proporcionar una imagen RGB convertida.
(longitud de onda) de la matriz CCD, utilizando un algoritmo RGB para proporcionar una imagen RGB convertida.
El documento WO98/55026 de Youvan y otros,
expone un hardware y software de producción de imágenes, calibres y
métodos de visualización, y la cuantificación de la cantidad de
Transferencia de Energía Resonante Fluorescente (FRET) que tiene
lugar entre las moléculas donadoras y aceptoras en la microscopía
epifluorescente, y utiliza algoritmos que pseudocoloran la imagen,
para visualizar los píxeles que muestran una emisión de
fluorescencia corregida radiométricamente desde el donador (azul),
aceptor (verde) y FRET (rojo), en donde se utiliza la
transformación de ortonormalización (ecuación de Föster) para
convertir las señales del donador, aceptor y FRET en los canales
únicos del rojo, verde y azul.
Al llevar a cabo dichos análisis colorimétricos,
las características de las imágenes tienen que tenerse en cuenta,
con el fin de corregir, por ejemplo, las aberraciones cromáticas y
otras. A este respecto, muchas soluciones están dirigidas a
soluciones de hardware, las cuales pueden no ser ventajosas con
respecto al costo, o bien pueden no proporcionar una solución
completa para el problema. Por ejemplo, la patente de los EE.UU.
número 5717518 de Shafer y otros, corrige las aberraciones
cromáticas utilizando ópticas de imágenes catadióptricas,
utilizando una combinación de una o más elementos de lentes, y uno o
más elementos reflectantes (espejos) en serie. Un sistema óptico
que utilice imágenes catadióptricas incluye un grupo de lentes de
enfoque con una pluralidad de elementos de lentes de un material
único con superficies de refracción que tengan curvaturas y
posiciones seleccionadas para enfocar la luz hasta una imagen
intermedia con unos altos niveles de coerción en la imagen final de
las aberraciones de la imagen y la variación cromática de las
aberraciones. El grupo del campo de lentes se posiciona cerca de la
imagen intermedia para corregir las aberraciones cromáticas. El
grupo catadióptrico incluye un reflector esférico cóncavo y un
reflector plano o cuasiplano (un elemento de lente recubierta en
forma reflectante) cerca de la imagen final, en donde ambos
elementos reflectantes tienen unas aberturas ópticas centrales.
El grupo catadióptrico enfoca la luz desde la imagen intermedia
hasta una imagen final. En la práctica, el sistema de imágenes
catadióptrico puede ser incorporado a un objetivo del microscopio,
el cual conforma la luz recogida de una muestra enana imagen
amplificada que es transferida a través de una lente intermedia o
sistema de lentes en una abertura de una cámara de vídeo o matriz
CCD para proporcionar la salid de los datos de la imagen.
La patente de los EE.UU. número 5734498 de
Krasieva y otros, expone de igual forma un elemento iluminador para
los microscopios de iluminación convencional, que comprende
cromóforos y/o cuerpos de dispersión luminosa en una matriz estable
que reemplaza completamente a un conjunto infinito de condensadores
para un microscopio óptico, y que proporciona una iluminación
totalmente comparable con la iluminación Koehler. Los filtros de
contraste de color pueden ser utilizados también para controlar el
contraste dentro de fotografías en blanco y negro, y en donde el
filtro de contraste de color más utilizado comúnmente es el verde,
porque las aberraciones del objetivo se compensan mejor en las
longitudes de onda más cercanas al verde, y la pérdida de la
claridad de la imagen debida a la aberración cromática se evita o al
menos se mejora mediante un filtro verde.
Además de ello, la patente de los EE.UU. numero
5016173, de Kenet y otros, expone un aparato y un método para
monitorizar en directo las superficies accesibles visualmente del
cuerpo y que sintetiza métodos de identificación de los sistemas, y
visión por ordenador para cuantificar y/o clasificar las
características de la anatomía de superficie o
sub-superficie, de la fisiología, o estructuras
patológicas o procesos. Las superficies anatómicas se estimulan
con luz (visible, infrarroja, y/o ultravioleta, estructurada o
uniforme), seguido por el análisis cuantitativo de las imágenes
digitales (multiresolución, multivisión, y/o multiespectral) de luz
reflejada o emitida desde la superficie de interés.
El documento US-6007996 expone
un método de un análisis in situ de una muestra biológica que
comprende las etapas de (a) colorear la muestra biológica con
colorantes; y (b) utilizando un dispositivo de recogida de datos
espectrales, para recoger los datos espectrales a partir de la
muestra biológica, en donde el dispositivo de recogida de datos
espectrales y los colorantes se seleccionan de forma tal que los
componentes espectrales asociados con cada uno de los colorantes
puedan ser recogidos.
El documento WO 98/55026 expone un método para
calibrar la transferencia de energía de resonancia fluorescente en
microscopía, incluyendo un procedimiento de ortonormalización.
El documento US-5717518 expone
un sistema de imágenes catadióptricas de ultravioleta (UV), con
corrección espectral ancha de las aberraciones de tipo primario y
residual, longitudinal y lateral, y cromáticas para la longitudes de
onda que se extiendan dentro de la zona profunda de UV.
El documento US-5734498 expone
un elemento iluminador, que está compuesto por cromóforos,
particularmente fluoroforos, y/o cuerpos de dispersión de la luz, en
una matriz estable, típicamente un plástico de un polímero.
El documento US-5016173 expone
un aparato y un método para monitorizar en directo las superficies
accesibles visualmente del cuerpo.
En consecuencia, las técnicas utilizadas en los
análisis colorimétricos de muestras preparadas son de un uso
limitado en la detección y cuantificación de las especies de
interés, debido a varios factores, tales como por ejemplo el
solapado espectral, mezcla de colores debido al solapado espacial de
la membrana, citoplasma, y marcadores nucleares, aberraciones
cromáticas en el trayecto óptico, resolución espectral limitada del
dispositivo de adquisición, particularidades de calibración,
subjetividad de la detección y proceso de cuantificación, e
inconsistencias entre los operadores humanos. La parte del
procesamiento de imágenes de las técnicas de análisis colorimétrico
ha estado dirigida históricamente a la detección del contraste
dentro de la muestra preparada o en un complejo y voluminoso
análisis para distintas longitudes de onda especificas de la luz,
utilizando una combinación de fuentes luminosas y filtros. En
consecuencia, existe la necesidad de una técnica de análisis
colorimétrico más efectivo que solucione las limitaciones de la
detección y cuantificación encontradas en las técnicas de análisis
del arte previo. Dicha técnica deberá ser también capaz de
proporcionar los datos de alta calidad, comprendiendo la
información del análisis necesario sobre la muestra, reduciendo
subjetivamente la inconsistencia en el análisis de las muestras.
Las necesidades anteriores y otras se solucionan
mediante las realizaciones de la presente invención.
La presente invención proporciona un método de
determinación de una magnitud de al menos una especie molecular que
comprende una muestra, en donde cada especie molecular está indicada
por un colorante, en un sistema de videomicroscopía, en donde el
mencionado método comprende: capturar una imagen de la muestra como
los datos de la imagen con un dispositivo de adquisición de
imágenes de color de banda ancha; determinar una densidad óptica de
la muestra a partir de los datos de la imagen en cada uno de los
canales del rojo, verde y azul, con un nivel de píxeles en la
imagen tal que se pueda formar una matriz de la densidad óptica
correspondiente para el píxel; y multiplicando la matriz de la
densidad óptica por el inverso de una matriz de coeficientes de
absorción, para formar una matriz resultante para el píxel, en
donde la matriz de coeficiente de absorción relativa comprende un
coeficiente de absorción relativa para cada colorante,
independientemente de la muestra, en cada uno de los canales del
rojo, verde y azul, comprendiendo la matriz resultante la cantidad
de especie molecular, según lo indicado por el colorante respectivo,
para el píxel.
La presente invención proporciona un sistema de
videomicroscopía para determinar una cantidad de al menos una
especie molecular que comprende una muestra, en donde cada especie
molecular está indicada por un colorante, a partir de una imagen de
la muestra, en donde el mencionado sistema comprende: un dispositivo
de adquisición de imágenes de color de banda ancha, configurado
para que sea capaz de capturar una imagen de la muestra como datos
de la imagen; y un dispositivo por ordenador capaz de acoplarse
operativamente con el dispositivo de adquisición de imágenes, y que
comprende: una primera parte de procesamiento configurada para
determinar una densidad óptica de la muestra a partir de los datos
de la imagen en cada uno de los canales del rojo, verde y azul en
un píxel en la imagen, con tal de formar una matriz de densidad
óptica correspondiente para el píxel; y una segunda parte de
procesamiento configurada para multiplicar la matriz de densidad
óptica por el inverso de una matriz de coeficientes de absorción
relativa, para formar una matriz resultante para el píxel de la
imagen, en donde la matriz de coeficientes de absorción relativa
comprende un coeficiente de absorción relativa para cada colorante,
independientemente de la muestra, en cada uno de los canales del
rojo, verde y azul, en donde la matriz resultante comprende la
cantidad de cada especie molecular, según lo indicado por el
colorante respectivo, para el píxel.
Dichas técnicas de producción de imágenes se
encuentran descritas aquí, conocidas por otra parte como técnicas
de imágenes multiespectrales, que al estar adaptadas a las imágenes
de color, permiten el proceso en un tiempo substancialmente real, a
nivel de vídeo, con el procesamiento y visionado de la muestra. El
uso, por ejemplo, de una cámara CCD de color RGB permite la
adquisición y el tiempo de procesado para que las imágenes de la
muestra puedan ejecutarse a una velocidad de un vídeo, típicamente
de 40 milisegundos por trama, lo cual proporciona una ventaja
considerable según se compara con las técnicas de imágenes del arte
previo, las cuales muestran en general un campo de adquisición de
visualización y unos tiempos de procesado de más de 1 segundo. Al
utilizar una cámara RGB por el sistema, se ejecuta la adquisición
de la imagen a través de distintos canales en paralelo y pudiendo
generar tablas de consulta (LUT), de forma que se correspondan los
posibles valores de entrada de color RGB con las concentraciones
predeterminadas y/o la transmitancia de cada uno de los distintos
colorantes. Así pues, dichas capacidades pueden, por ejemplo,
realzar la velocidad del procesamiento, y facilitar el proceso en
tiempo real para los fine de su visualización.
En consecuencia, puede ejecutarse una
evaluación posterior de la imagen para evaluar la eficiencia de unas
combinaciones de colorantes conocidas a priori, utilizadas
para resolver las ecuaciones lineales para cada píxel. Es decir,
una evaluación según lo detallado aquí proporcionará también una
evaluación fiable para cada píxel, porque el color y la intensidad
medidos en el píxel dado pueden ser justificados por una combinación
de los colorantes a priori. Dicha evaluación fiable puede
ser expresada como la inversa de la coincidencia más cercana en el
modelo teórico. En una situación en la que existen menos colorantes
a evaluar que canales de entrada (menos parámetros desconocidos que
ecuaciones, por ejemplo, un colorante contador + un marcador (= 2
colorantes) cuando estén disponibles 3 canales de entrada (RGB), la
información redundante puede ser utilizada para minimizar los
errores potenciales y por tanto maximizar la precisión del sistema
de detección y cuantificación.
Así pues, las realizaciones de la presente
invención comprenden una técnica de análisis colorimétrico para
muestras preparadas que proporciona una detección efectiva y la
cuantificación de las especies de interés, que solucione los
factores limitantes de las técnicas del arte previo, tales como por
ejemplo el solapado espectral, la mezcla de colores debido al
solapado espacial de los marcadores de la membrana y el núcleo, la
resolución limitada espectral del dispositivo de adquisición,
particularidades de la calibración, la subjetividad de la detección
y del proceso de cuantificación, y las inconsistencias entre los
operadores humanos del equipo de análisis. Las realizaciones de la
presente invención proporcionan además una técnica de procesado de
imágenes, que no se basa en la detección subjetiva de contraste
dentro de la muestra preparada, o un complejo y análisis voluminoso
de la muestra para longitudes de onda específicas de la luz,
utilizando una combinación de fuentes luminosas y filtros. En
consecuencia, las realizaciones de la presente invención
proporcionan una técnica más simple y una técnica de análisis
colorimétrico más efectiva, la cual soluciona las limitaciones de la
detección y la cuantificación de las técnicas de análisis,
reduciendo la subjetividad e inconsistencia en el análisis de la
muestra, y que es capaz de proporcionar la información del análisis
necesario sobre la muestra, una vez que se capture la imagen de la
muestra, sin confiar en el examen adicional de la muestra para
completar el análisis. Estas y otras ventajas se realizan a través
de las técnicas de análisis colorimétrico del arte previo, tal como
se describen aquí.
Habiendo descrito por tanto la invención en
términos generales, se hace referencia ahora a los dibujos adjuntos,
los cuales no están dibujados necesariamente a escala, y en
donde:
La figura 1 es una representación esquemática
general de un sistema de microscopía cuantitativa de acuerdo con una
realización de la presente invención.
La figura 2 es una representación esquemática de
la realización práctica en una configuración ampliada de un sistema
de videomicroscopía cuantitativa, de acuerdo con una realización de
la presente invención.
La presente invención se describirá ahora a
continuación más en su totalidad, con referencia a los dibujos
adjuntos, en los cuales se muestran las realizaciones preferidas de
la invención. Esta invención puede, no obstante, realizarse de
muchas formas, y no deberá considerarse como limitada a las
realizaciones expuestas aquí; más bien, estas realizaciones se
proporcionan de forma que esta exposición sea integra y completa, y
que cubrirá totalmente el alcance de la invención para aquellos
técnicos especializados en el arte. Los números iguales se refieren
a los elementos iguales en su totalidad.
La plataforma para la evaluación de las muestras
biológicas por medio del análisis de la imagen se está desplazando
en aumento progresivo desde un analizador de imágenes de propósito
general a una "estación de trabajo de patología" dedicada más
altamente especializada. Dichas estaciones de trabajo están
diseñadas típicamente para facilitar el trabajo rutinario,
combinando con frecuencia muchas de las herramientas necesarias para
proporcionar al patólogo la información necesaria para determinar
los mejores resultados posibles. Un ejemplo de dicha estación de
trabajo se muestra en la figura 1, como un sistema de
videomicroscopía cuantitativa, indicado por el numeral 100, de
acuerdo con una realización de la presente invención. El sistema 100
comprende generalmente un microscopio 150 que tiene una fuente
luminosa 200 y un objetivo de amplificación 250, una cámara 300, un
dispositivo de ordenador 350, y un enlace de transmisión de datos
400 en la cámara 300.
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La plataforma para la evaluación de las muestras
biológicas por medio del análisis de la imagen se está desplazando
en aumento progresivo desde un analizador de imágenes de propósito
general a una "estación de trabajo de patología" dedicada más
altamente especializada. Dichas estaciones de trabajo están
diseñadas típicamente para facilitar el trabajo rutinario,
combinando con frecuencia muchas de las herramientas necesarias para
proporcionar al patólogo la información necesaria para determinar
los mejores resultados posibles. Un ejemplo de dicha estación de
trabajo se muestra en la figura 1, como un sistema de
videomicroscopía cuantitativa, indicado por el numeral 100, de
acuerdo con una realización de la presente invención. El sistema 100
comprende generalmente un microscopio 150 que tiene una fuente
luminosa 200 y un objetivo de amplificación 250, una cámara 300, un
dispositivo de ordenador 350, y un enlace de transmisión de datos
400 entre la cámara 300 el dispositivo de ordenador 350. El
microscopio 150 puede comprender, por ejemplo, un microscopio
Axioplant (o Axiovert) fabricado por ZEISS de Alemania o un
microscopio similar que tenga una fuente luminosa de campo
brillante. La cámara 300 está acoplada operativamente al
microscopio 150, y en una realización comprende una cámara RGB 3CCD,
tal como por ejemplo el modelo DC-330E
Dege-MTI RGB 3CCD, fabricada por
Dage-MTI, Inc, de Michigan City, IN, o una cámara
RGB similar. Típicamente, dicha cámara 300 incluye también un
registrador visualizador de tramas (no mostrado), para facilitar la
captura de las imágenes, en donde tanto la cámara 300 como el
registrados visualizador de tramas se denominan aquí como la
"cámara 300" por conveniencia. En algunos casos, la cámara 300
puede ser reemplazada por ejemplo por un escáner plano lineal que
tenga el chip 3CCD o equivalente. Por ejemplo, el modelo No. Super
CoolScan 4000 ED fabricado por Nikon Corporation podría utilizarse
para el tratamiento de imágenes de baja resolución. Se observará
que aunque se contemplan otras configuraciones distintas del sistema
necesario 100 para la presente invención, la presente invención se
describirá aquí en términos de una cámara 300 y el microscopio
asociado 150. En consecuencia, el técnico especializado en el arte
comprenderá y apreciará las capacidades y las metodologías
asociadas con estas configuraciones diferentes, para la realización
de la presente invención tal como aquí se expone.
La cámara 300 está configurada en general para
capturar una imagen 450 de una muestra 500 a través del objetivo de
amplificación 250, en donde la imagen 450 puede comprender además
una imagen digital correspondiente a los datos de la imagen
(colectivamente denominados aquí como la "imagen 450"). La
imagen 450 es capturada en general como un conjunto, en donde los
datos de la imagen correspondiente comprenden una canal del rojo
550, un canal del verde 600, y un canal de azul 650 de la imagen del
campo de visión. El enlace 400 de transmisión de los datos está
configurado para que sea capaz de transmitir la imagen 450 al
dispositivo de ordenador 350, en donde el dispositivo de ordenador
350 está además configurado para que sea capaz de analizar la imagen
450 con respecto a cada uno de los canales correspondientes al rojo
550, verde 600 y azul 650.
De acuerdo con un aspecto particularmente
ventajoso de la presente invención, el sistema 100 está configurado
para analizar la muestra, de acuerdo con la ley de
Lambert-Beer. La ley de Lambert-Beer
describe en general una proporcionalidad que puede ser observada
entre la concentración de las moléculas en una disolución (la
concentración de la "especie molecular" de la "muestra") y
la intensidad de la luz medida a través de la disolución. La ley de
Lambert-Beer se expresa típicamente como:
en donde OD es la densidad óptica
de la disolución, \varepsilon es la constante de proporcionalidad
denominada como el coeficiente de extinción o absorción molar, I
es el grosor de la muestra, y C es la concentración de la especie
molecular. El coeficiente de absorción \varepsilon es específico
de la especie molecular y se expresa típicamente en unidades de
L.mol^{-1}.cm^{-1}.
Esta relación de proporcionalidad definida por
la ley de Lambert-Beer ha sido verificada bajo
condiciones extremas incluyendo, por ejemplo, la iluminación con
luz monocromática de la muestra, con una baja concentración
molecular dentro de la muestra, generalmente sin respuesta
heterogénea de fluorescencia o luminosidad (fluorescencia y
difusión despreciables) de la muestra, y con una falta de
fotosensibilidad química de la muestra. Además de ello, otro
requisito para un análisis de acuerdo con la ley de
Lambert-Beer incluye, por ejemplo, la iluminación
Koehler correcta de la muestra bajo el microscopio. La iluminación
Koehler está disponible en muchos microscopios modernos,
proporcionando una iluminación uniforme de la muestra en el plano de
la imagen, y permitiendo un control efectivo del contraste. La
iluminación Koehler es crítica para ciertos procesos tales como,
por ejemplo, el análisis densitométrico. La iluminación Koehler
correcta se proporciona típicamente, por ejemplo, mediante un
sistema de iluminación de dos etapas para el microscopio, en donde
la fuente se convierte en imagen en la apertura del condensador de
la subetapa mediante un condensador auxiliar. El condensador de la
subetapa, a su vez, forma una imagen del condensador auxiliar sobre
el objeto. Puede colocarse también un diafragma de iris en cada
condensador, en donde el primer iris controla la zona del objeto a
iluminar, y el segundo iris varía la abertura numérica del haz de
iluminación.
\global\parskip1.000000\baselineskip
La ley de Lambert-Beer tiene una
propiedad adicional, tal que si la muestra comprende varias especies
moleculares de absorción de la luz, por ejemplo, s_{1} y s_{2},
que tienen unas concentraciones respectivas de C_{1} y C_{2},
la densidad OD de una muestra de grosor I (en donde I_{1} =
I_{2} = I para la muestra, según lo indicado en la disolución a
partir de ahora) puede expresarse como:
Esta situación puede tener lugar, por ejemplo,
en un análisis biológico en donde una "escena", un campo de
visión, o una parte de la muestra se hayan teñido con dos
colorantes, comprendiendo un colorante marcador para marcar la
especie molecular de interés y un contra-colorante
para teñir el resto de la muestra.
Con el fin de medir con precisión la
concentración de unas especies dadas con sus imágenes bajo un
microscopio, las medidas de las densidades ópticas realizadas a
diferentes longitudes de onda tienen que corresponderse
específicamente con la parte observada de la muestra. Es decir, el
sistema de microscopía tiene que estar corregido para la aberración
cromática, en donde dicha corrección o compensación puede ser
realizada mediante hardware, o bien una combinación de software y
hardware. En general, el cristal tiende a dispersar la luz, el cual
provoca típicamente una lente de cristal sencillo para enfocar, por
ejemplo, la luz azul a una distancia más corta que la luz roja. Es
decir, una lente de cristal sencillo mostrará distintas longitudes
focales para la luz compuesta por distintas longitudes de onda.
Esta característica de dispersión del cristal da lugar a los dos
efectos observados. En primer lugar, la aberración cromátida
longitudinal, o la diferencia posicional de los puntos focales para
distintas longitudes de onda de la luz a lo largo del eje vertical,
se observa en donde al enfocar la imagen para las longitudes de
onda seleccionadas correspondientes a un color en particular, la
imagen tenderá a estar ligeramente fuera del foco al observarse bajo
las longitudes de onda de la luz correspondientes a los demás
colores. Por ejemplo, en un espacio de color RGB, si la imagen se
enfoca para las longitudes de onda del verde de la luz, la misma
imagen tenderá a estar fuera del foco al observarse bajo las
longitudes de onda del azul o del rojo de la luz. En segundo lugar,
la aberración cromática lateral se observa como una diferencia en
la amplificación de la luz de distintas longitudes de onda, debido a
las distintas longitudes de la distancia focal. Por ejemplo, en un
espacio de color RGB, una imagen vista bajo las longitudes de onda
del azul, relativamente cortas, aparecerá más grande que la misma
imagen vista bajo unas longitudes de onda del rojo relativamente
mayores.
En los sistemas de los microscopios que tienen
objetivos de alta calidad, tal como por ejemplo unos objetivos
apocromáticos, podrá corregirse una gran parte de la aberración
cromática aparente. No obstante, seguirá permaneciendo alguna
aberración cromática lateral residual, dando lugar a diferencias en
la amplificación a través de las longitudes de onda de la luz. La
aberración cromática lateral puede ser difícil de observar, puesto
que un observador humano tiende a concentrarse en el centro del
campo de visión, en donde la aberración lateral está típicamente
ausente. No obstante, al generar una imagen del campo de visión,
por ejemplo, con una cámara CCD, la aberración cromática lateral
muy pequeña, que dará lugar por ejemplo, incluso a un valor
inferior al 1% de diferencia en amplificación entre las longitudes
de onda, dará por resultado unos desplazamientos ligeros del color
en torno a los bordes de los objetos en el campo de visión, pero
localizados en forma alejada del centro óptico del objetivo. En
consecuencia, un píxel situado en una posición dada (x, y) en la
imagen no mostrará exactamente la parte correspondiente del objeto
bajo la investigación dependiendo de las longitudes de onda de la
luz utilizadas para iluminar el objeto y la posición del objeto
dentro del campo de visión. No obstante, con el fin de resolver
las ecuaciones de separación de los cromagenes, derivadas de la ley
de Lambert-Beer, una premisa básica es que tendrá
que examinarse la misma parte del objeto en el campo de visión. En
consecuencia, las imágenes obtenidas para distintas longitudes de
onda de la luz tendrán que ajustarse para proporcionar una
correlación con respecto a las zonas del campo de visión en donde
tengan que resolverse las ecuaciones de separación de los
cromogenes.
En consecuencia, un aspecto ventajoso de la
presente invención, incluye un método de corrección de la aberración
cromática lateral dentro de un sistema de microscopio. En primer
lugar, las coordenadas del centro del objetivo amplificador 250 se
determinan con respecto al centro del dispositivo electrónico o
chip, que comprende el componente de la generación de la imagen de
la cámara 300. Se determina entonces un factor de amplificación
observado, para cada longitud de onda y se compara con el factor de
amplificación para una longitud de onda arbitraria seleccionada.
Por ejemplo, en un espacio de color RGB, la longitud de onda
central, es decir el canal del verde 600 podría comprender la
longitud de onda seleccionada para la cual se compararía el factor
de amplificación para cada uno de los canales del rojo 550 y azul
650. La imagen para cada longitud de onda se ajustaría de acuerdo
con un factor de amplificación relativo determinado y con las
coordenadas relativas del centro del objetivo de amplificación
250.
Con el fin de facilitar las dos primeras etapas
del método descrito, se utiliza un portaobjeto de calibración
específico, en donde el portaobjeto se configura con una red de
agujeros finos espaciados regularmente a través de un medio de
bloqueo de la luz. Se toma una imagen de la red para cada longitud
de onda de la luz utilizada para iluminar la muestra. Por ejemplo,
puede producirse una imagen para cada uno de los canales del rojo
550, verde 600, y azul 650. El centro de cada agujero se calcula,
por ejemplo, para las coordenada x, y. La imagen correspondiente,
a la longitud de onda más cercana al promedio de las longitudes de
onda de la luz bajo consideración (el canal del verde 600, por
ejemplo), se designa entonces como la imagen de referencia.
Posteriormente, cada una de las imágenes para las demás longitudes
de onda bajo consideración se comparan entonces con la imagen de
referencia. Para cada agujero en la red, se determina la diferencia
en la dirección x (\deltax) y la diferencia en la dirección y
(\deltay), para el agujero correspondiente en la imagen de
referencia y en la imagen que se esté comparando. Se determinan las
ecuaciones, tales como por ejemplo las ecuaciones lineales que
minimizan el error de reconstrucción para \deltax en función de x
y \deltay en función de y. A partir de estas dos ecuaciones, se
determina el centro del objetivo (x_{o}, y_{o}), en donde
x_{o} comprende la solución de la primera ecuación en x cuando
\deltax es 0, e y_{o} comprende la solución de la segunda
ecuación en y cuando \deltay es 0. Se determina entonces una
ecuación lineal que minimiza el error de reconstrucción de
\deltad = (\deltax^{2} + \deltay^{2})^{1/2}, en
función de la distancia al centro del objetivo, en donde la
pendiente de dicha ecuación proporciona el factor de amplificación
de la longitud de onda en particular con respecto a la longitud de
onda de referencia. Esta imagen para la longitud de onda en
particular se ajusta entonces espacialmente, de forma tal que el
origen de la imagen corresponda con el centro del objetivo, y en
donde la amplificación de la imagen corresponda con la amplificación
de la imagen de referencia.
Una vez que el microscopio 150 se haya
configurado para proporcionar la iluminación Keohler para la
adquisición de imágenes y se han solucionado las aberraciones
cromáticas, puede aplicarse la propiedad aditiva de la ley de
Lambert-Beer a la separación de los cromogenes. Por
ejemplo, la propiedad aditiva de la ley de
Lambert-Beer puede ampliarse a una situación en la
que la escena se analice en un entorno de color, generado por
ejemplo con una cámara RGB, con la separación de los canales del
rojo, verde y azul. En tal caso, el colorante marcador (o "tinte
1") mostrará los coeficientes de absorción, \varepsilon_{1r},
\varepsilon_{1g}, y \varepsilon_{1b}, en los canales del
rojo, verde y azul, respectivamente. Se observará que, en algunos
casos, el análisis de la imagen en cada uno de los canales del
rojo, verde y azul es equivalente al análisis de un representación
del rojo de la imagen a través de los espectros del rojo, de una
representación de la imagen a través de los espectros del verde, y
una representación del azul de la imagen a través de los espectros
del azul. En consecuencia, el contra-colorante (o
"tinte 2") mostrará los coeficientes de absorción,
\varepsilon_{2r}, \varepsilon_{2g}, y \varepsilon_{2b},
en los canales del rojo, verde y azul, respectivamente. En
consecuencia, de acuerdo con la propiedad aditiva de la ley de
Lambert-Beer, el análisis de la muestra en el
entorno RGB conduce a tres ecuaciones de la densidad óptica:
en donde OD_{r}, OD_{g} y
OD_{b} representan las densidades ópticas de la muestra medidas en
los canales del rojo, verde y azul, respectivamente. Incluso
además, en el caso de una complejidad incrementada de la
preparación de la muestra, tal como por ejemplo el tratamiento de la
muestra con tres colorantes distintos (3), (4), y (5), ello conduce
a:
En tal situación, los tres colorantes pueden
comprender, por ejemplo, un colorante marcador y dos
contracolorantes, o bien dos colorantes marcadores y un
contracolorante, o incluso tres colorantes marcadores
independientes. Se comprenderá por el técnico especializado en el
arte, no obstante, que esta propiedad demostrada de la ley de
Lambert-Beer puede ampliarse para incluir una
pluralidad incluso mayor de combinaciones de los colorantes, de
acuerdo con el espíritu y alcance de la invención presente. Se
observará también que una realización particularmente ventajosa de
la presente invención utiliza un dispositivo de tratamiento de
imágenes de color de captura rápida, tal como por ejemplo una
cámara 3CCD RGB, para la generación de imágenes
multi-espectrales de los marcadores a través de
tres canales distintos (rojo, verde y azul). En consecuencia, los
análisis a modo de ejemplo se presentan en términos de tres
ecuaciones, aunque el técnico especializado en el arte apreciará que
el concepto demostrado podrá ser aplicado a todos los distintos
canales que estén disponibles en un dispositivo de tratamiento de
imágenes en particular.
Al aplicar la ley de
Lambert-Beer a un sistema 100 de microscopía
digital, de acuerdo con las realizaciones de la presente invención,
será difícil y complejo e inexacto, o en ocasiones no posible, el
medir el grosor 1 de la muestra 500. En tales casos, la
concentración C de la especie molecular podrá ampliarse y examinarse
como el producto de I y C(l. C), y tratar en consecuencia
los resultados. Por ejemplo, cuando la concentración de un
colorante se está comparando con la concentración de otro colorante
en una muestra en particular, el término del grosor de la muestra
será común a ambas concentraciones, y por tanto llegará a ser menos
importante que el grosor de la muestra como un valor absoluto y
preciso. En consecuencia, se comprenderá por el técnico
especializado en el arte que una determinación precisa del grosor de
la muestra no se requiere típicamente. La aplicación de la ley de
Lambert-Beer en un sistema 100 de microscopia
digital de la presente invención reconoce también que la ley de
Lambert-Beer puede ser expresada también como:
para una imagen digital 450 de la
muestra 500 que comprende una pluralidad de píxeles configurados,
por ejemplo, de acuerdo con un sistema de coordenadas cartesianas,
en donde (x, y) significa un píxel en particular en la imagen 450,
OD_{(x, y)} es la densidad óptica de la muestra 500 en dicho
píxel, I_{(x, y)} es la intensidad de la luz transmitida o
transmitancia de la muestra 500 en dicho píxel, e
I_{o(x,y)} es la intensidad de la luz de la fuente
luminosa 200, según se mide sin ningún objeto de absorción de la luz
intermedio, tal como la muestra. En
consecuencia:
en donde IOD es la densidad óptica
integrada de la imagen digital 450 de la muestra 500, y N es el
número de píxeles en la imagen de la superficie 450 de la muestra.
Se observará además por el técnico especializado en el arte que la
relación logarítmica descrita en las ecuaciones (9) y (10) pueden se
expresadas dentro del alcance de la presente invención. Por
ejemplo, las relaciones pueden ser expresadas en base 2, en base
10, o con logaritmos naturales, en donde las distintas bases están
relacionadas por las respectivas constantes de proporcionalidad
(por ejemplo, In(x) ó log_{e}(x) = 2,3026
log_{10}(x)). Así pues, la constante de proporcionalidad
puede considerarse en la forma apropiada al deducir las
comparaciones relativas en las intensidades de la luz. Además de
ello, en la microscopia cuantitativa de acuerdo con la ley de
Lambert-Beer, se conserva la relación de
proporcionalidad entre la densidad óptica OD de la muestra y las
concentraciones del
colorante.
En consecuencia, para una muestra preparada 500
examinada por el sistema 100, la relación apropiada se expresa
como:
En donde, por ejemplo, se utiliza una cámara 300
de 8 bits RGB en el sistema 100, en donde la luz transmitida a
través de la muestra en cada canal puede expresarse como 2^{8}
(=256) valores entre 0 y 255. Por ejemplo, la intensidad inicial
I_{o} de la fuente luminosa 200, que se corresponde con la
transmitancia del 100%, se expresará preferiblemente en cada uno de
los canales del rojo 550, verde 600, y azul 650, como un valor
cercano a 255, que representa el valor posible más brillante en cada
canal. La cámara 300 y/o la fuente luminosa 200 pueden ajustarse en
la forma adecuada, tal que en la ausencia de la muestra, una luz
"blanca" pura tenga un valor de intensidad de 255 en cada uno
de los canales del rojo 550, verde 600 y azul 650, correspondientes
a la transmitancia del 100%. A la inversa, en la ausencia de la luz,
correspondiente en general a la transmitancia cercana al 0%, una
"imagen negra" tendrá un valor de intensidad cercano a 0, en
cada uno de los canales del rojo 550, verde 600, y azul 650. En
cualquier píxel, la intensidad inicial I_{o} de la fuente luminosa
200, correspondiente a la transmitancia del 100%, se expresará por
tanto como la diferencia entre el valor de intensidad medido en
presencia de la fuente luminosa 200 menos el valor de intensidad
medido en ausencia de la fuente luminosa 200, para cada uno de los
canales del rojo 550, verde 600 y azul 650. Debido a que la
intensidad de la fuente luminosa 200 puede variar espacialmente a
través de la imagen 450, o sobre el campo de visión medido, y
debido a que el objetivo de amplificación 250 o bien otros
componentes ópticos pueden absorber luz en forma heterogénea, la
transmitancia del 100% puede ser representada por varias
intensidades diferenciales a través del campo de visión medido. No
obstante, puesto que la densidad óptica OD de la muestra se expresa
como el logaritmo de la relación de la transmitancia luminosa en
ausencia de la muestra (intensidad inicial I_{o}) con respecto a
la transmitancia luminosa en la presencia de la muestra (I), la
densidad óptica OD es en gran parte insensible espacialmente a las
pequeñas variaciones en las intensidades diferenciales a través del
campo de visión medido.
Puesto que la fuente luminosa 200 permanece
substancialmente constante a través del tiempo, o bien puede ser
re-evaluada fácilmente, la media de la intensidad
luminosa para cualquier píxel, en la presencia de la muestra, puede
ser trasladada a la transmitancia I en dicho píxel y en cada uno de
los canales del rojo 550, verde 600 y azul 650. Una vez que se
haya determinado la intensidad inicial I_{o} y la transmitancia I,
podrá calcularse la densidad óptica OD. Como tal, en cualquier
lugar en el campo de visión 450 en donde esté presente un única
tintura (tal como el único objeto de absorción de la luz entre la
fuente luminosa 200 y la cámara 300), el coeficiente de absorción
s de dicho colorante podrá ser determinado en cada uno de los
canales del rojo 550, verde 600 y azul 650. Más en particular,
1-C para un píxel dado será igual en cada uno de los
canales del rojo 50, verde 600 y azul 650. Así pues, si se conocen
1 y C, el coeficiente de absorción \varepsilon podrá ser
calculado de acuerdo con la ecuación (11) o bien en cada uno de los
canales del rojo 550, verde 600, y azul 650, como:
No obstante, I.C no se conoce típicamente para
un píxel en particular en una imagen de una muestra en particular.
En consecuencia, los coeficientes de absorción \varepsilon se
calculan para cada canal de acuerdo con la relación de la densidad
óptica OD en cada canal, medida en un píxel dado, con respecto a la
máxima densidad óptica OD fuera de todos los canales medidos en el
mismo píxel. Más en particular, se observará por cualquier técnico
especializado en el arte que la determinación del coeficiente de
absorción \varepsilon en cada uno de los canales del rojo 500,
verde 600, y azul 650, en la ausencia de un conocimiento a
priori de I y/o C, es un asunto de manipulación de las
ecuaciones lineales, con el fin de conseguir una solución relativa,
en donde I-C se fija arbitrariamente con el valor de
1, en donde:
En consecuencia, si la concentración absoluta
del colorante en particular permanece desconocida, podrá calcularse
un coeficiente de absorción \varepsilon en cada uno de los
canales del rojo 550, verde 600 y azul 650 para cualquier píxel
dado, con un factor de error igual a I-C.
Alternativamente, debido a que I es único en una
posición dada del píxel, y que puede ajustarse arbitrariamente al
valor de 1, las ecuaciones (6-8) pueden
reescribirse tal como sigue, en donde C_{1}, C_{2} y C_{3}
están relacionados por un factor de 1:
Se observará que la determinación de una matriz
de coeficientes de absorción \varepsilon para distintos
colorantes puede realizarse en forma independiente de la evaluación
de la muestra, y almacenarse para una aplicación posterior en las
muestras tratadas con al menos uno de los colorantes respectivos.
Además de ello, las distintas matrices \varepsilon de los
coeficientes de absorción para los colorantes en particular, así
como también los datos de la intensidad I_{o} de la luz original
para la fuente luminosa 200 pueden almacenarse, por ejemplo, en un
dispositivo 350 de ordenador, un servidor situado en una red de
intranet o en Internet, o bien otro dispositivo de almacenamiento
de datos tal como se apreciará por el técnico especializado en el
arte. Como tal, cuando los coeficientes de absorción \varepsilon
hayan sido evaluados por los distintos colorantes, y se hayan
determinado las densidades ópticas OD a partir de los datos de la
imagen, podrán resolverse las ecuaciones apropiadas como un
conjunto de ecuaciones lineales, para extraer las respectivas
concentraciones de los colorante C_{1}, C_{2} y C_{3}.
A modo de una explicación adicional, el conjunto
representativo de las ecuaciones algebraicas lineales puede
expresarse por ejemplo como:
en donde para los N desconocidos,
x_{j}, j = 1, 2, ..., N están relacionados por las M ecuaciones.
Los coeficientes a_{ij}, en donde i = 1, 2, ...,M, y j=1, 2,..,N
son conocidos en general. En tal caso, puede no haber la matriz x
de solución o más de una solución. Además de ello, si N = M entonces
existirán tantas ecuaciones como desconocidos, y se determinará una
matriz x de solución única. Además de ello, si M > N, entonces
existirán más ecuaciones que desconocidos, y en general, ninguna
matriz x de solución en particular existirá para el conjunto de
ecuaciones. En consecuencia, el conjunto de ecuaciones se dice que
están sobre-determinadas, y en tal caso, la
solución más apropiada se considerará como la solución que
proporcione el mejor ajuste para las ecuaciones, en donde la mejor
solución de ajuste corresponderá típicamente a la solución que tenga
la suma mínima de errores de
reconstrucción.
La ecuación (21) puede ser expresada
alternativamente como:
en donde "." denota la
multiplicación de matrices, A es la matriz de los coeficientes, y b
es la parte derecha expresada como un vector columna. En general,
por convención, el primer índice de un elemento a_{ij} denota la
fila de elementos; mientras que el segundo índice es la columna de
elementos. Además de ello, a_{j} o [i] denota una fila completa
a[i][j], j = 1, ...,N. En consecuencia, la solución de la
ecuación de la matriz A.x = b para un vector x desconocido, en
donde A es la matriz de coeficientes, y b es la parte derecha,
requiere usualmente la determinación de A^{-1} de la matriz
inversa de la matriz Z. Así
pues:
Puesto que A^{-1} es la matriz inversa de la
matriz A, entonces A . A^{-1} = A^{-1} . A = ID, en donde ID es
una matriz de identidad. Para facilitar la determinación de una
solución, pueden establecerse unos parámetros, de forma tal que el
número de ecuaciones sea mayor o igual que el número de
desconocidos, o bien M\geqN. Tal como se ha expuesto antes,
cuando M > N en general no existe un matriz x de solución en
particular para la ecuación (21), y el conjunto de ecuaciones
estará sobre-determinado. En tales situaciones, no
obstante, el mejor "compromiso" o la mejor solución de ajuste
son con frecuencia la solución que pueda satisfacer en forma más
cercana a todas las ecuaciones. Dicha cercanía puede estar definida,
por ejemplo, en la forma de cuadrados mínimos, en donde la suma de
los cuadrados de las diferencias entre ambos lados de la ecuación
(21) sea mínima. Como resultado de ello, el conjunto
sobredeterminado de las ecuaciones lineales puede típicamente
reducirse a un problema lineal solucionable, con frecuencia
denominado como un problema de cuadrados mínimos lineales, que
puede resolverse con las matemáticas de descomposición de valores
singulares (SVD), tal como se apreciará por el técnico
especializado en el arte. El sistema SVD está dirigido a la
modelación paramétrica de datos, y usualmente es el método
seleccionado para resolver los problemas de cuadrados mínimos
lineales, y que se encuentra descrito con más detalles, por
ejemplo, en el documento PROGRAMAS NUMÉRICOS EN C: EL ARTE DEL
CALCULO CIENTÍFICO POR ORDENADOR (ISBN
0-521-43108-S)
Copyright© 1988-1992, de Cambridge University Press.
Programas Copyright© 1988-1992 por Numerical Recipes
Software.
En algunas situaciones, las soluciones de
precalculo por ordenador para todos los valores de píxeles posibles
a parir de la configuración del sistema descrito, puede facilitar
realmente el procesamiento en tiempo real del análisis de la
imagen. Más en particular, si se utiliza un dispositivo de
adquisición de imágenes en color de 8 bits, tal como por ejemplo
una cámara RGB 3CCD de 8 bits, la intensidad I luminosa medida de
una muestra tendrá 256 valores posibles, abarcando entre los
limites de 0 y 255 en cada uno de los canales del rojo 550, verde
600, y azul 650. En tal caso, todos los posibles valores de gris
(256^{3} valores posibles de gris para un sistema de 8 bits) con
respecto a la intensidad I_{o} luminosa original podrán ser
calculados y almacenados, por ejemplo, como una tabla de consulta
(LUT) dentro del dispositivo de ordenador 350. Así pues, para una
muestra 500 coloreada con un tintado en particular, la intensidad I
luminosa transmitida (o la densidad óptica OD) puede ser medida en
un píxel de cada uno de los canales del rojo 550, verde 600 y azul
650, y comparándolos después con los valores de grises almacenados
previamente, y la matriz de \varepsilon coeficientes de absorción
para el colorante en particular, para poder determinar por tanto la
concentración C del colorante, o bien una estimación del mismo
como el producto I.C en dicho píxel. En consecuencia, un sistema
de 8 bits proporcionará 256 (canal rojo) x 256 (canal verde) x 256
(canal azul) = 256^{3} posibles soluciones de valores de grises,
asciendo por tanto a una OUT de 16 MB para cada colorante. Un
sistema que tenga una resolución de valores de grises que exceded
de 8 bits por canal, conducirá a una LUT de objetivo tal como, por
ejemplo, una LUT > 1 GB para una resolución del sistema de 10
bits por canal, en donde el dispositivo de ordenador 350 puede
configurarse apropiadamente para proporcionar las capacidades
necesarias de calculo y/o almacenamiento.
La operación del sistema 100 tal como se ha
descrito anteriormente puede se ilustrada adicionalmente, suponiendo
que la fuente de luz es una luz "blanca", que tiene I_{o} =
255 en cada uno de los canales del rojo 550, verde 600, y azul 650,
y que se estén utilizando tres colorantes, teniendo las siguientes
características I de la intensidad luminosa transmitida en cada uno
de los canales del rojo 550, verde 600 y azul 650:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
La matriz de densidad óptica OD correspondiente
(en donde cada elemento se calcula como ln(I_{o}/I) llega a
ser:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
No obstante, puesto que OD = \varepsilon.I.C,
los valores de OD para cada colorante pueden ser normalizados con
respecto al canal que tengan el OD más alto, para proporcionar una
matriz de coeficientes \varepsilon de absorción para los
colorantes respectivos, puesto que los valores I.C serán constantes
a través de los canales. En consecuencia:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
Subsiguientemente, suponiendo que se haya
coloreado una muestra 500 con los mismos tres colorantes, Colorante
1, Colorante 2 y Colorante 3, y que se ha utilizado una fuente
luminosa 200 con características similares para iluminar la muestra
500, la imagen 450 de la muestra 500 será capturada por la cámara
300. En un píxel en particular en la imagen 450, el dispositivo de
ordenador 350 determinará entonces que la intensidad luminosa
transmitida en cada uno de los canales del rojo 550, verde 600 y
azul 650 será:
\vskip1.000000\baselineskip
En donde:
\vskip1.000000\baselineskip
Por tanto:
para un píxel en particular. En
consecuencia, con el fin de determinar las concentraciones de los
tres colorantes en dicho píxel, la matriz OD se multiplica por el
inverso de la matriz de coeficientes \varepsilon de absorción
relativa previamente predeterminados ((OD).\varepsilon^{-1} =
1.C). En
consecuencia:
De acuerdo con la metodología descrita aquí, los
niveles de gris determinados, en este ejemplo, o los valores de la
transmitancia RGB de cualquier combinación de los tres colorantes
sujetos pueden utilizarse como una imagen artificial, puesto que no
existen valores desconocidos. De acuerdo con dicho píxel en
particular, y las concentraciones de colorante determinadas, las
imágenes de los colorantes simples corresponderían a las siguientes
intensidades de blanco y negro 3 (BW) o a las intensidades de
píxeles RGB:
En consecuencia:
Se realizan además los aspectos adicionales
ventajosos de la presente invención, como el resultado de las
técnicas de separación de los colorantes, utilizando el tratamiento
de imágenes de vídeo de color, tal como se han descritos
previamente aquí. Por ejemplo, una imagen artificial del campo de
visión puede generarse en un espacio de color RGB o en niveles de
grises como una imagen en tiempo real o en directo, o como una
imagen fija, utilizando combinaciones de los colorantes que
comprendan un marcador y/o un contra-colorante
utilizado para preparar la muestra. Más en particular, una imagen
artificial de la campo de visión puede generarse, la cual muestre
la muestra según lo afectado por todos los colorantes, estando
afectada la muestra por uno o más colorantes marcadores, o la
muestra afectada por el contra-colorante.
Consecuentemente, puesto que los colorantes utilizados para
preparar la muestra están caracterizados por el sistema, las
capacidades del sistema pueden ampliarse de forma tal que, por
ejemplo, la muestra o el campo de visión pueda ser escaneada
automáticamente para detectar una zona específica de interés, según
lo identificado por las características de un colorante en
particular o para afectar o facilitar una tarea a ejecutar en dicha
zona específica de interés.
De acuerdo con una realización de la presente
invención, el sistema puede configurarse para que sea capaz de
detectar uno o más colorantes en particular, los cuales hayan sido
caracterizados previamente por el sistema. En algunos casos, dicho
colorante puede comprender, por ejemplo, la tinta de una pluma en
particular o un marcador de tinta similar que haya ido
caracterizado por el sistema, como teniendo unas caracterizas únicas
del color, en donde estas características únicas de color estén
retenidas por el sistema, como un conjunto correspondiente de los
coeficientes de extinción. Se deduce que el sistema puede estar
configurado para reconocer y responder a las partes del campo de
visión en donde el colorante esté identificado, y en donde en
algunos casos el marcador o marcadores en particular puedan
comprender una parte tangible de dicho sistema tal como se describe
aquí. Por ejemplo, dicha pluma puede utilizarse por ejemplo cuando
un operador tal como un patólogo o un especialista en citología que
identifique unas zonas especiales de interés en un portaobjetos de
cristal o plástico que contenga la muestra. Una zona de interés
especial puede comprender, por ejemplo, una zona de diagnóstico
potencial o un área de referencia. El operador, utilizando la pluma,
puede entonces rodear el área con una línea de tinta procedente de
dicha pluma. Después de procesar varios portaobjetos, el operador
puede introducir los portaobjetos, por ejemplo, en un sistema de
escaneado automático, para la evaluación cuantitativa. Habiendo
sido configurado para detectar la tinta de la pluma, el sistema
puede entonces identificar inclusivamente el área de interés,
correspondiente al área dentro de la línea de la tinta, rodeada con
un círculo por el operador con la pluma. El sistema puede después
procesar debidamente dicha área del portaobjetos, por ejemplo, en
donde un color de la tinta de la pluma puede indicar que una
evaluación de diagnostico en particular tiene que ser ejecutada,
mientras que otro color de la tinta puede indicar que el área
contiene un material de calibración o de referencia, y que pediría
al sistema el ejecutar un procedimiento de calibración
correspondiente. Se observará que, además de los portaobjetos, la
técnica descrita puede se adaptada fácilmente para examinar otras
formas de montaje para el material del microscopio, tal como por
ejemplo, las microplacas o micromatríces. Así pues, se observará
por el técnico especializado en el arte que las capacidades de tales
realizaciones del sistema, configuradas para reconocer los
colorantes o tintas en particular, pueden ampliarse a muchos otros
procesos de escaneado automático distintos, en donde pueda
utilizarse la marcación interactiva de las áreas de interés con
plumas específicas, teniendo las plumas distintas tintas de colores
previamente evaluadas por el sistema, pudiendo utilizarse para
designar automáticamente y promover una evaluación subsiguiente o
bien otro procesamiento de dicha área de interés, mediante un
componente apropiado del sistema o de otro dispositivo
específico.
Adicionalmente, las imágenes artificiales del
campo de visión pueden también facilitar la presentación de los
datos en una configuración que permita la identificación y selección
de los objetos significativos o áreas de interés, tales como por
ejemplo las imágenes fijas en un informe preparado para el
diagnostico o bien otros fines de informes.
Otros aspectos ventajosos de la presente
invención pueden realizarse también a partir del sistema descrito y
del método expuesto aquí. Por ejemplo, las diferencias en las
características entre los colorantes marcadores y el
contra-colorante, según lo realizado en varias
imágenes de colorantes específicos de la muestra, pueden
utilizarse para evaluar la adecuación del foco del campo de visión.
Más en particular, por ejemplo, la muestra puede ser tratada con
dos colorantes independientes, en donde un colorante comprende un
tinte del núcleo y el otro colorante comprende un colorante de la
membrana. En tal caso, la imagen dirigida al colorante de la
membrana puede ser evaluada en cuanto la adecuación del foco,
mediante el examen del foco de la misma imagen dirigida al
colorante de los núcleo, en donde la imagen del colorante de los
núcleos muestre una estructura más definida sobre la cual poder
evaluar el foco.
Adicionalmente incluso, la imagen artificial de
la campo de visión puede utilizarse para facilitar la identificación
y la extracción de las características seleccionadas de la muestra
tratada. Por ejemplo, los procesos de señalización marcados, el
análisis contextual, y/o las geoestadísticas pueden utilizarse para
identificar y extraer las características de la imagen, basándose
por ejemplo en el análisis de distribución espacial de un colorante
en particular. Tal capacidad de extracción de funciones permitiría
también el permitir, por ejemplo, los campos de visualización o
bien los objetos de interés a clasificar, etiquetados, o bien
identificados de otra forma o agrupados, por ejemplo, según un
contenido global de un colorante marcador dado, o bien una relación
seleccionada de un marcador en particular. En caso por ejemplo de
tener que establecer unos criterios del umbral, tal como una
capacidad, sería la detección de eventos raros, de empeoramiento, o
de otros eventos serios. Procediendo adicionalmente, pueden
establecerse clasificadores basados específicamente en el
procesamiento de imágenes, resultantes de la
contra-coloración y/o de imágenes especificas de la
coloración del marcador, y utilizados para evaluar la presencia de
ciertos tipos, o para ejecutar diagnosis basándose en el campo de
visión. Por ejemplo, el HER2 puede ser evaluado de esta forma,
mediante la comparación con una escala de diagnósticos continuos
establecidos de acuerdo con el sistema y los métodos aquí
descritos. Tales clasificadores pueden abarcar también otras
funciones informativas, tales como por ejemplo los detalles basados
en la morfología o la textura de las células.
Además de ello, se realiza otro aspecto
ventajoso de la presente invención, en donde el sistema es capaz de
procesar los datos de la imagen a una velocidad más rápida que la
velocidad con la que hayan sido adquiridas las imágenes. La
velocidad mejorada a la cual se procesan los datos de la imagen
puede permitir, por ejemplo, que las funciones indicadas por un
colorante marcador en particular sean procesadas y clasificadas. En
consecuencia, las distintas condiciones pueden identificarse
basándose en los criterios predeterminados. Como tales, pueden
establecerse alarmas visuales y/o audibles y/o mapeadas en
conjunción con el procesamiento de los datos de la imagen. Así
pues, en algunos casos, la atención del operador puede estar
dirigida a un campo de visión específico o bien un objeto de
interés cuando una característica de un marcador obtenga un nivel
predeterminado, por ejemplo, en la intensidad o presencia en un
campo en particular.
La figura 2 es una representación esquemática de
una realización práctica de una configuración ampliada del sistema,
de acuerdo con una realización de la presente invención. En dicha
implantación, el sistema 100 está centrado alrededor de un
microscopio 150. El microscopio 150 puede incluir uno o más
componentes robóticas, incluyendo, por ejemplo, una etapa
motorizada, un mecanismo de foco automático, un cambiador de
objetivos motorizado, y un ajuste de intensidad luminosa
automática. El sistema 100 puede incluir varios dispositivos de
entrada, tales como por ejemplo la cámaras 300a y 300b que tienen
enfoque rápido automático, y que están configuradas para adquirir
imágenes de baja resolución y alta resolución, unos escáneres 310
lineales planos, utilizados para adquirir imágenes de baja
resolución, una estación de uniones 320, y un dispositivo 330 de
grabación de voz, los cuales están enlazados a un dispositivo de
ordenador 350, a través de varios enlaces de transmisión de datos
400. La estación de trabajo 100 puede ser parte de una Red de Área
Local (LAN) 700, aunque puede estar configurada para soportar
varios protocolos distintos de comunicaciones, tales como los
canales de comunicaciones disponibles, tales como por ejemplo una
línea telefónica estándar, una conexión ISDN, o bien una línea T1,
que puedan conectar rápidamente la estación de trabajo 100 con los
demás componentes o dispositivos a través de largas distancias por
medio de una Red de Área Amplia (WAN) 750, tal como se observará por
el técnico especializado en el arte.
Si la estación de patología 100 está configurada
para operar en un entorno integrado, la conexión a la red WAN 700,
o la red LAN 750, puede permitir el acceso a las bases de datos 800
existentes, y a los Sistemas de Información de Hospitales (HIS)
850. Con dicha configuración, los nuevos ejemplos y/o los casos
pueden ser comparados fácilmente con las imágenes y la información
adjunta de los casos de referencia acumulados previamente. Además
de ello, las imágenes adquiridas de las muestras y/o de los
portaobjetos examinados en la estación de trabajo 100 pueden ser
completadas con el historial del paciente según sea necesario.
En la realización de la configuración ampliada
que se muestra en la figura 2, la estación de trabajo de patología
100 está configurada particularmente para una evaluación exhaustiva
de la muestra. Por ejemplo, con la información y las imágenes
digitales de la muestra biológica inicial, las imágenes de los
portaobjetos preparados a partir de la muestra pueden ser
preparadas y procesadas según lo aquí descrito. El paciente y la
información del caso, las imágenes y la información cuantitativa
resultante sobre los componentes de la célula de la muestra y la
arquitectura de la muestra (en el caso de por ejemplo las muestras
de tejidos) pueden recogerse, integrarse si fuera necesario, y
almacenarse en una base de datos única. Si por ejemplo, se precisa
una opinión inicial o segunda opinión de expertos o si el
portaobjetos se utiliza para entrenamiento o comprobación del
rendimiento, las capacidades de comunicación de la configuración
ampliada junto con las funciones de automatización del microscopio
150 pueden permitir que la estación de trabajo 100 se utilice como
un sistema de tele-patología. Por ejemplo, las
imágenes de alta resolución dirigidas a las funciones u objetos de
interés que caractericen a una situación cuestionable en un
portaobjetos en particular pueden enviarse electrónicamente a un
experto y/o al candidato auditado. En algunos casos, puede
proporcionarse una imagen general del portaobjeto, en donde el
microscopio automatizado 150 se utiliza para escanear el
portaobjetos automáticamente, por ejemplo, en un campo mediante las
bases del campo. Las imágenes digitales correspondientes pueden ser
entonces almacenadas en la memoria de un ordenador 350. Cuando se
utilice un campo mediante las bases del campo, los bordes de los
campos adyacentes pueden adaptarse con precisión utilizando
algoritmos de correlación, con el fin de proporcionar una imagen de
visión general grande del portaobjetos entero. Dicha imagen de
visión general puede ayudar al patólogo de referencia en la
realización de una valoración de la información. En algunos casos,
el patólogo de referencia puede controlar remotamente la estación
de trabajo 100 desde un lugar remoto, para adquirir las imágenes
necesarias y/o suplementarias, las cuales puedan ser necesarias para
proporcionar una valoración correcta y completa del
portaobjetos.
Subsiguientemente, la información acumulada por
la estación de trabajo 100 para un caso estudiado tal como, por
ejemplo, la imágenes reales o bien generadas matemáticamente, los
resultados de las medidas y las representaciones gráficas, datos
del paciente, datos de la preparación, y mapas de cribado, pueden
integrarse selectivamente en un informe, el cual pueda imprimirse o
tener acceso al mismo electrónicamente. Dicho informe proporcionaría
una imagen completa del caso en evaluación, y facilitaría también
una seguridad de la calidad y de los temas de estandarización.
Se comprenderá que la metodología y los
procedimientos detallados aquí en conjunción con el sistema 100
especifican un método de cuantificación de una magnitud de una
especie molecular de una imagen o una muestra capturada por una
cámara RGB en un sistema de videomicroscopía. El técnico
especializado en el arte apreciará también que dicho método puede
ser automatizado, de forma que proporcione un producto de un
programa de software para ordenador, ejecutable en un dispositivo
de ordenador, teniendo partes ejecutables capaces de cuantificar la
magnitud de una especie molecular a partir de una imagen digital de
una muestra capturada por un dispositivo de adquisición de imágenes
en color, tal como una cámara RGB, en un sistema de
videomicroscopía. En consecuencia, las realizaciones del sistema
100 describen la implementación del método y/o el producto del
programa de software de ordenador, el cual pueda configurarse en el
hardware configurado debidamente, o bien una combinación de hardware
y software de acuerdo con el espíritu y alcance de la presente
edición.
Así pues, las realizaciones de la presente
invención comprenden una técnica de análisis colorimétrico para las
muestras preparadas, que proporciona una defección efectiva y la
cuantificación de las especies de interés que solucione los
factores limitantes de las técnica del arte previo, como por
ejemplo, el solapado espectral, la mezcla de colores debido al
solapado espacial de los marcadores de la membrana y el núcleo, la
resolución espectral limitada del dispositivo de adquisición,
particularidades de la calibración, la subjetividad de la detección
y el proceso de cuantificación, y las incompatibilidades entre los
operadores humanos del equipo de análisis. Las realizaciones de la
presente invención proporcionan además una técnica de procesamiento
de las imágenes, la cual no se basa sobre la detección subjetiva del
contraste dentro de la muestra preparada, o un análisis complejo y
voluminoso de la muestra para unas longitudes de onda específicas de
la luz, utilizando una combinación de fuentes luminosas y filtros.
En consecuencia, las realizaciones de la presente invención
proporcionan una técnica de análisis colorimétrico más simple y más
efectiva, que soluciona las limitaciones de detección y
cuantificación en la técnicas de análisis del arte previo,
reduciendo la subjetividad y la incompatibilidad en el análisis de
las muestras, y siendo capaz de proporcionar la información
necesaria del análisis sobre la muestra, una vez capturada la
imagen de la muestra, sin basarse más en el examen de la muestra
para completar el análisis.
Más particularmente y tal como se ha demostrado,
los análisis (detección y cuantificación de una especie molecular
de interés) de la muestra preparada se llevan a cabo por medio de la
medida de las intensidades luminosas que se manifiestan en una
imagen digital de la muestra capturada por un dispositivo de
adquisición de imágenes de color. Puesto que el análisis depende
relativamente de la imagen, más bien que dependiente de la muestra,
las imágenes redundantes pueden ser capturadas para su análisis,
mientras que pueden procesarse muchas muestras, con el fin de poder
capturar las imágenes necesarias dentro de un periodo de tiempo
relativamente corto. Una vez que los datos de la imagen se hayan
capturado y almacenado, el análisis en curso puede tener lugar a
una hora posterior o según sea necesario, sin precisar de la
presencia física de la muestra en curso. Dicho análisis puede
aplicarse además para examinar la muestra completa o incluso el
portaobjetos completo. Así pues, las realizaciones de la presente
invención proporcionan un sistema de videomicroscopía cuantitativa
fácil que permite el uso de dicho sistema como una rutina o
herramienta de "producción", capaz de llevar a cabo un trabajo
completo de análisis relativamente grande. Como tal, las ventajas
significativas se llevan a cabo por las realizaciones de la
presente invención, en comparación con los sistemas de microscopia
cuantitativa del arte previo, los cuales estaban limitados en el
análisis completo de las muestras, haciendo que tales sistemas sean
más útiles como herramientas de investigación.
Muchas modificaciones y otras realizaciones de
la invención vendrán a la mente de los técnicos especializados en
el arte, a los cuales pertenece esta invención, teniendo la ventaja
de los beneficios de las exposiciones presentadas en las anteriores
descripciones y los dibujos asociados. En consecuencia, se
comprenderá que la invención no está limitada a las realizaciones
específicas expuestas, y que las modificaciones y otras
realizaciones tienen por objeto el que se incluyan dentro del
alcance de las reivindicaciones adjuntas. Aunque aquí se utilizan
términos específicos, se utilizan solo en sentido genérico y
descriptivo, y no para los fines de ninguna limitación.
Claims (18)
1. Un método de determinación de una magnitud
de al menos una especie molecular que comprende una muestra (500),
en donde cada especie molecular está indicada por un colorante, en
un sistema de videomicroscopía (100), comprendiendo el mencionado
método:
capturar una imagen (450) de la muestra como
datos de la imagen con un dispositivo de adquisición de imágenes de
banda ancha;
determinar una densidad óptica de la muestra a
partir de los datos de la imagen, en cada uno de los canales del
rojo, verde y azul (550, 600, 650) en un píxel en la imagen, de
forma tal que se FOME una matriz de densidades ópticas
correspondientes para el píxel; y
multiplicar la matriz de densidades ópticas por
el inverso de la matriz de coeficientes de absorción relativa, con
el fin de formar una matriz resultante para el píxel, en donde la
matriz de coeficientes de absorción relativa comprende un
coeficiente de absorción relativa para cada colorante,
independientemente de la muestra, en cada uno de los canales del
rojo, verde y azul, comprendiendo la matriz resultante la magnitud
de cada especie molecular, según lo indicado por el colorante
respectivo para el píxel.
2. Un método de acuerdo con la reivindicación 1,
que además comprende la determinación del coeficiente de absorción
relativa para cada colorante, independientemente de la muestra,
mediante:
la determinación de una intensidad inicial de
una luz emitida por una fuente luminosa en cada uno de los canales
del rojo, verde y azul;
iluminar cada colorante con la fuente luminosa,
independientemente de la muestra; determinando la intensidad
transmitida de la luz transmitida a través de cada colorante en cada
uno de los canales del rojo, verde y azul;
determinar el logaritmo natural de una relación
de la intensidad inicial de la luz con respecto a la intensidad
transmitida de la luz en cada uno de los canales del rojo, verde y
azul, con el fin de determinar la densidad óptica de cada colorante;
y
normalizar la densidad óptica en cada uno de los
canales del rojo, verde y azul para cada colorante, con respecto al
canal que tenga la densidad óptica más alta, para poder formar la
matriz de coeficientes de absorción relativa.
3. Un metido de acuerdo con la reivindicación
2, en donde se determina una densidad óptica de la muestra que
comprende además:
iluminar la muestra con la fuente luminosa y
determinar la intensidad transmitida de la luz transmitida a través
de la muestra en cada uno de los canales del rojo, verde y azul;
y
determinar un logaritmo natural de la relación
de la intensidad inicial de la luz con respecto a la intensidad
transmitida de la luz a través de la muestra en cada uno de los
canales del rojo, verde y azul, de manera que se forme la matriz de
la densidad óptica.
4. Un método de acuerdo con la reivindicación 1,
en el que la captura de una imagen de la muestra comprende además la
captura de una imagen de la muestra como datos de la imagen en cada
uno de los canales del rojo, verde y azul, de l menos un medio de
una cámara RGB y un escáner configurado en el sistema RGB.
5. Un método según la reivindicación 1, que
comprende además la iluminación de la muestra bajo condiciones de
iluminación de Koehlex, y de corrección de la aberración cromática
en el sistema de videomicroscopía.
6. Un método según la reivindicación 1, que
comprende además la indicación al menos de una especie molecular con
un primer colorante, que comprende un colorante marcador y otra
especie molecular con un segundo colorante que comprende un
contra-colorante.
7. Un método según la reivindicación 5, en el
que el sistema de videomicroscopía comprende una fuente luminosa
para emitir luz para iluminar la muestra, en donde la luz emitida es
detectable por un objetivo de amplificación acoplado operativamente
a un componente de captura de imágenes del dispositivo de
adquisición de imágenes de color de banda ancha, por lo que el
sistema de videomicroscopía está configurado para generar la imagen,
y en donde se corrige la aberración cromática en el sistema de
videomicroscopía, que comprende:
determinar unas coordenadas céntricas del
objetivo de amplificación con respecto a las coordenadas céntricas
de la componente de captura de la imagen;
\newpage
determinar, para una pluralidad de longitudes de
onda de luz seleccionadas de la luz emitida por la fuente luminosa,
un factor de amplificación para cada una de la pluralidad de
longitudes de onda con respecto al factor de amplificación para una
longitud de onda promedio, seleccionada a partir de la pluralidad de
las longitudes de onda; y
ajustar la imagen, sin ajustar el objetivo de
amplificación o el componente de captura de la imagen, de forma tal
que las coordenadas céntricas del objetivo de amplificación se
correspondan con las coordenadas céntricas del componente de captura
de la imagen, y en donde el factor de amplificación para cada
longitud de onda corresponda al factor de amplificación para la
longitud de onda promedio.
8. Un método de acuerdo con la reivindicación 7,
que comprende además:
disponer un portaobjetos que tenga una red
calibrada de aperturas entre la fuente luminosa y el objetivo de
amplificación;
formar una imagen de la red para cada una de la
pluralidad de longitudes de onda, y con respecto a un sistema de
coordenadas cartesianas que tengan un eje x y un eje y;
determinar una coordenada central con respecto
al sistema de coordenadas para cada apertura de la red a partir de
la imagen para cada una de la pluralidad de longitudes de onda;
designar la imagen para una longitud de onda
promedio como imagen de referencia;
determinar para cada imagen con respecto a la
imagen de referencia, y para cada apertura de la red, una diferencia
entre la coordenada central de la apertura en la imagen respectiva
de la coordenada céntrica de la apertura correspondiente en la
imagen de referencia con respecto al sistema de coordenadas,
expresando la diferencia como una componente diferencial a lo lago
del eje x y una componente diferencia a lo largo del eje y.
determinar una ecuación lineal minimizando un
error de reconstrucción para cada diferencial a lo largo del eje x,
como una función de x y un diferencial a lo largo del eje y como una
función de y;
determinar la coordenada central del objetivo de
amplificación mediante la resolución de la ecuación lineal para cada
diferencial a lo largo del eje x, como una función de x, y el
diferencial a lo largo del eje x como una función de y, con el
diferencial a lo largo del eje x y el diferencial a lo largo del
eje y, ajustándose a un valor de cero para la ecuación lineal
respectiva; y
determinar una ecuación lineal para minimizar un
error de reconstrucción de una raíz cuadrada de una suma de los
cuadrados del diferencial a lo largo del eje x, y el diferencial a
lo largo del eje y, como una función de la distancia al centro del
objetivo de amplificación.
9. Un método según la reivindicación 8, que
comprende además la determinación de la pendiente de la ecuación
lineal como una función de la distancia al centro del objetivo de
amplificación, para proporcionar el factor de amplificación de la
imagen para cada una de la pluralidad de longitudes de onda con
respecto al factor de amplificación de la imagen de referencia.
10. Unos programas de software de ordenador que
tienen al menos una parte ejecutable capaz de ejecutar un método
según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9.
11. Un sistema de videomicroscopía (100) para
determinar una magnitud de al menos una especie molecular, que
comprende una muestra (500), en donde cada especie molecular está
indicada por un colorante, a partir de una imagen de la muestra,
comprendiendo el mencionado sistema:
un dispositivo (300) de adquisición de imágenes
de color de banda ancha, configurado para que sea capaz de capturar
una imagen (450) de la muestra como datos de la imagen; y
un dispositivo (350) de ordenador, acoplado
operativamente con el dispositivo de adquisición de imágenes, y que
comprende:
- una primera parte de procesamiento configurada para determinar una densidad óptica de la muestra a partir de los datos de la imagen en cada uno de los canales del rojo, verde y azul (550, 600, 650) en un píxel en la imagen, para poder formar una matriz de la densidad óptica correspondiente para el píxel; y
- una segunda parte de procesamiento configurada para multiplicar la matriz de la densidad óptica por un inverso de la matriz de coeficientes de absorción relativa, para formar una matriz resultante para el píxel de la imagen, en donde la matriz de coeficiente de absorción relativa comprende un coeficiente de absorción relativa para cada colorante, independientemente de la muestra en cada uno de los canales del rojo, verde y azul, comprendiendo la matriz resultante la magnitud de cada especie molecular, según lo indicado por el colorante respectivo, para el píxel.
\newpage
12. Un sistema según la reivindicación 11, en
donde el dispositivo de adquisición de imágenes comprende al menos
un escáner y una cámara de color acoplada operativamente con un
microscopio.
13. Un sistema de acuerdo con la
reivindicación 12, en el que el microscopio está configurado para
formar una imagen amplificada de la muestra, y en el que la cámara
de color comprende además una cámara RGB que tiene un canal del
rojo, un canal del verde, y un canal de azul, en donde la cámara RGB
está acoplada operativamente con el microscopio, para que sea capaz
de formar una imagen digital de la imagen amplificada.
14. Un sistema de acuerdo con la reivindicación
11, que comprende además una fuente luminosa dirigida hacia el
dispositivo de adquisición de imágenes, y configurada para emitir un
luz que tenga una intensidad inicial en cada uno de los canales del
rojo, verde y azul.
15. Un sistema de acuerdo con la reivindicación
14, en el que la fuente luminosa está configurada para iluminar la
muestra y la primera parte de procesamiento para determinar la
densidad óptica, estando configurada además para:
determinar una intensidad transmitida de la luz
transmitida a través de la muestra en cada uno de los canales del
rojo, verde y azul; y
determinar un logaritmo natural de una relación
de la intensidad inicial de la luz con respecto a la intensidad
transmitida de la luz, con el fin de determinar una densidad óptica
para la muestra en cada uno de los canales del rojo, verde y azul y
con respecto a la matriz óptica.
16. Un sistema de acuerdo con la reivindicación
14, en el que el dispositivo de captura comprende además una
tercera parte de procesamiento, configurada para:
dirigir la fuente luminosa para iluminar cada
colorante, independientemente de la muestra; para la determinación
de una intensidad transmitida de la luz transmitida;
a través de cada colorante en cada uno de los
canales del rojo, verde y azul; determinar un logaritmo natural de
una relación de la intensidad luminosa de la luz con respecto a la
intensidad de la luz en cada uno de los canales del rojo, verde y
azul, con el fin de determinar una densidad óptica de cada
colorante; y
normalizar la densidad óptica en cada uno de los
canales del rojo, verde y azul para cada colorante, con respecto al
canal que tenga la densidad óptica más alta, para cada colorante,
para determinar el coeficiente de absorción relativa en cada uno de
los canales del rojo, verde y azul, y para formar la matriz de
coeficientes de absorción relativa.
17. Un sistema de acuerdo con la reivindicación
11, en donde el dispositivo de ordenador comprende además:
unos medios de almacenamiento configurados para
almacenar el coeficiente de absorción relativa en cada uno de los
canales del rojo, verde y azul para una pluralidad de colorantes,
indicando los colorantes las especies moleculares en la muestra que
se seleccione a partir de la pluralidad de colorantes;
una cuarta parte de procesamiento configurada
para recuperar los coeficientes de absorción relativa respectivos
para cada colorante, a partir de los medios de almacenamiento, y
para formar la correspondiente matriz de coeficientes de absorción
relativa, de acuerdo con los colorantes, indicando las especies
moleculares en la muestra que se seleccionen a partir de la
pluralidad de colorantes; y una quinta parte de procesamiento
configurada para invertir la matriz de coeficientes de absorción
relativa.
18. Un sistema de acuerdo con la reivindicación
14, en donde la fuente luminosa está configurada además para
proporcionar unas condiciones de iluminación Koehler, y en donde al
menos uno de los dispositivos de adquisición de imágenes y el de
ordenador está configurado para corregir la aberración
cromática.
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Families Citing this family (44)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US20060073509A1 (en) * | 1999-11-18 | 2006-04-06 | Michael Kilpatrick | Method for detecting and quantitating multiple subcellular components |
| CA2469843A1 (en) * | 2001-06-04 | 2002-12-12 | Ikonisys Inc. | Method for detecting infectious agents using computer controlled automated image analysis |
| US20030097424A1 (en) * | 2001-09-26 | 2003-05-22 | Jean-Christophe Pautrat | Method to construct a technology roadmap |
| US7133547B2 (en) * | 2002-01-24 | 2006-11-07 | Tripath Imaging, Inc. | Method for quantitative video-microscopy and associated system and computer software program product |
| US20030210262A1 (en) | 2002-05-10 | 2003-11-13 | Tripath Imaging, Inc. | Video microscopy system and multi-view virtual slide viewer capable of simultaneously acquiring and displaying various digital views of an area of interest located on a microscopic slide |
| US7200252B2 (en) | 2002-10-28 | 2007-04-03 | Ventana Medical Systems, Inc. | Color space transformations for use in identifying objects of interest in biological specimens |
| US8712118B2 (en) * | 2003-04-10 | 2014-04-29 | Carl Zeiss Microimaging Gmbh | Automated measurement of concentration and/or amount in a biological sample |
| US8442280B2 (en) * | 2004-01-21 | 2013-05-14 | Edda Technology, Inc. | Method and system for intelligent qualitative and quantitative analysis of digital radiography softcopy reading |
| DE102004008675B4 (de) * | 2004-02-20 | 2009-05-07 | Imedos Gmbh | Bildgebendes Verfahren zur Erfassung medizinisch relevanter Unterschiede von Strukturen und Eigenschaften eines Untersuchungsobjektes und dazu geeignete Vorrichtung |
| US7450754B2 (en) * | 2004-03-23 | 2008-11-11 | Microsoft Corporation | Radiometric calibration from a single image |
| CA2567749C (en) | 2004-05-26 | 2013-07-23 | Anima Cell Metrology | Methods for evaluating ribonucleotide sequences |
| ATE520050T1 (de) * | 2004-06-21 | 2011-08-15 | Koninkl Philips Electronics Nv | Aberrationskorrektur für die spektroskopische analyse |
| WO2006017811A2 (en) * | 2004-08-06 | 2006-02-16 | Compucyte Corporation | Multiple-color monochromatic light absorption and quantification of light absorption in a stained sample |
| US20060041385A1 (en) * | 2004-08-18 | 2006-02-23 | Bauer Kenneth D | Method of quantitating proteins and genes in cells using a combination of immunohistochemistry and in situ hybridization |
| US20060133657A1 (en) * | 2004-08-18 | 2006-06-22 | Tripath Imaging, Inc. | Microscopy system having automatic and interactive modes for forming a magnified mosaic image and associated method |
| AU2005289728B2 (en) * | 2004-09-22 | 2011-11-24 | Tripath Imaging, Inc. | Methods and compositions for evaluating breast cancer prognosis |
| US8084260B2 (en) * | 2004-11-24 | 2011-12-27 | Applied Biosystems, Llc | Spectral calibration method and system for multiple instruments |
| US20060178833A1 (en) * | 2005-02-04 | 2006-08-10 | Bauer Kenneth D | System for and method of providing diagnostic information through microscopic imaging |
| EP1975874A3 (en) * | 2005-05-13 | 2008-10-08 | Tripath Imaging, Inc. | Methods of chromogen separation-based image analysis |
| JP4976387B2 (ja) * | 2005-06-13 | 2012-07-18 | トライパス イメージング インコーポレイテッド | 顕微鏡画像取得装置を用いた、スライド上のサンプル中の対象物の位置を再検索するためのシステムおよび方法 |
| US7417213B2 (en) * | 2005-06-22 | 2008-08-26 | Tripath Imaging, Inc. | Apparatus and method for rapid microscopic image focusing having a movable objective |
| US20120157350A1 (en) * | 2005-09-13 | 2012-06-21 | Affymetrix, Inc. | Brownian Microbarcodes for Bioassays |
| US20070091109A1 (en) * | 2005-09-13 | 2007-04-26 | Roscoe Atkinson | Image quality |
| JP4915071B2 (ja) * | 2005-09-22 | 2012-04-11 | 株式会社ニコン | 顕微鏡、およびバーチャルスライド作成システム |
| CA2685875C (en) * | 2007-05-01 | 2015-10-06 | Hill's Pet Nutrition, Inc. | Methods and compositions for diagnosing osteoarthritis in a feline |
| EP2188383B1 (en) | 2007-10-09 | 2017-01-18 | Anima Cell Metrology, Inc. | Systems and methods for measuring translation activity in viable cells |
| DE102007054602A1 (de) * | 2007-11-15 | 2009-05-28 | Deutsches Zentrum für Luft- und Raumfahrt e.V. | Verfahren und Messaufbau zum Erfassen der Verteilung mindestens einer Zustandsgröße in einem Messfeld mit verschiedenen Sonden |
| DE202008017969U1 (de) * | 2008-12-03 | 2011-01-13 | Krones Ag | Befüllvorrichtung |
| EP2480890B1 (en) | 2009-09-24 | 2018-02-28 | Anima Biotech Inc. | Methods for measuring translation of target proteins in cells |
| WO2012142111A1 (en) * | 2011-04-12 | 2012-10-18 | Tripath Imaging, Inc. | Method for preparing quantitative video-microscopy and associated system |
| US9122904B2 (en) | 2011-04-12 | 2015-09-01 | Tripath Imaging, Inc. | Method for optimization of quantitative video-microscopy and associated system |
| BE1019985A3 (nl) * | 2011-05-23 | 2013-03-05 | Willy Boermans | Chemie doen met behulp van kleurensensoren. |
| US10648970B2 (en) * | 2011-11-08 | 2020-05-12 | Agilent Technologies, Inc. | Method for evaluation of target in histological sample |
| US8928781B2 (en) | 2011-11-30 | 2015-01-06 | Microsoft Corporation | Response function determination by rank minimization |
| JP2013170861A (ja) * | 2012-02-20 | 2013-09-02 | Dainippon Screen Mfg Co Ltd | 撮像装置、試料保持プレートおよび撮像方法 |
| EP3100025B1 (en) | 2014-01-30 | 2021-03-03 | BD Kiestra B.V. | System and method for imaging biological samples disposed in culture media |
| JP2016052116A (ja) * | 2014-08-28 | 2016-04-11 | パナソニックＩｐマネジメント株式会社 | 画像処理装置、画像処理方法およびコンピュータプログラム |
| CN104655572B (zh) * | 2015-01-09 | 2017-07-21 | 上海绿帝环保科技有限公司 | 溶液显色反应定量分析检测装置 |
| JP6101746B2 (ja) * | 2015-06-25 | 2017-03-22 | 株式会社Ｓｃｒｅｅｎホールディングス | 試料保持プレート、撮像装置および撮像方法 |
| JP6317003B2 (ja) * | 2017-02-27 | 2018-04-25 | 株式会社Ｓｃｒｅｅｎホールディングス | 撮像装置および撮像方法 |
| US9738937B1 (en) * | 2017-03-31 | 2017-08-22 | Cellmax, Ltd. | Identifying candidate cells using image analysis |
| JP2022537055A (ja) * | 2019-06-20 | 2022-08-23 | エッセンリックス コーポレーション | 改善された光透過試料ホルダーおよび多波長での分析方法 |
| US12022584B2 (en) | 2020-04-30 | 2024-06-25 | Siemens Healthcare Diagnostics Inc. | Apparatus, method for calibrating an apparatus and device therefor |
| CN117437235B (zh) * | 2023-12-21 | 2024-03-12 | 四川新康意众申新材料有限公司 | 基于图像处理的塑料薄膜质量检测方法 |
Family Cites Families (30)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US615105A (en) * | 1898-11-29 | Lifting jack | ||
| US4191940A (en) * | 1978-01-09 | 1980-03-04 | Environmental Research Institute Of Michigan | Method and apparatus for analyzing microscopic specimens and the like |
| JPS5742286A (en) * | 1980-08-27 | 1982-03-09 | Hitachi Denshi Ltd | Compensation method for positional shift amount of video signal |
| DK282085D0 (da) * | 1985-06-21 | 1985-06-21 | Radiometer As | Fremgangsmaade og apparat til bestemmelse af blodkomponenter |
| US5008185A (en) * | 1985-11-04 | 1991-04-16 | Cell Analysis Systems, Inc. | Methods and apparatus for the quantitation of nuclear proteins |
| US4998284A (en) * | 1987-11-17 | 1991-03-05 | Cell Analysis Systems, Inc. | Dual color camera microscope and methodology for cell staining and analysis |
| US5134662A (en) * | 1985-11-04 | 1992-07-28 | Cell Analysis Systems, Inc. | Dual color camera microscope and methodology for cell staining and analysis |
| US5109429A (en) * | 1985-11-04 | 1992-04-28 | Cell Analysis Systems,Inc. | Apparatus and method for analyses of biological specimens |
| US4741043B1 (en) * | 1985-11-04 | 1994-08-09 | Cell Analysis Systems Inc | Method of and apparatus for image analyses of biological specimens |
| US5121436A (en) * | 1987-08-14 | 1992-06-09 | International Remote Imaging Systems, Inc. | Method and apparatus for generating a plurality of parameters of an object in a field of view |
| US5202931A (en) * | 1987-10-06 | 1993-04-13 | Cell Analysis Systems, Inc. | Methods and apparatus for the quantitation of nuclear protein |
| US5016173A (en) * | 1989-04-13 | 1991-05-14 | Vanguard Imaging Ltd. | Apparatus and method for monitoring visually accessible surfaces of the body |
| US5784162A (en) * | 1993-08-18 | 1998-07-21 | Applied Spectral Imaging Ltd. | Spectral bio-imaging methods for biological research, medical diagnostics and therapy |
| JPH0678314A (ja) * | 1992-08-27 | 1994-03-18 | Hitachi Denshi Ltd | 顕微鏡用テレビジョンカメラシステム |
| US5734498A (en) * | 1994-05-09 | 1998-03-31 | The Regents Of The University Of California | Illuminator elements for conventional light microscopes |
| US5625705A (en) * | 1994-06-03 | 1997-04-29 | Neuromedical Systems, Inc. | Intensity texture based classification system and method |
| JP3556283B2 (ja) * | 1994-09-30 | 2004-08-18 | オリンパス株式会社 | 顕微鏡用照明光学系 |
| US5732150A (en) * | 1995-09-19 | 1998-03-24 | Ihc Health Services, Inc. | Method and system for multiple wavelength microscopy image analysis |
| US6151405A (en) | 1996-11-27 | 2000-11-21 | Chromavision Medical Systems, Inc. | System and method for cellular specimen grading |
| US5835617A (en) * | 1996-01-18 | 1998-11-10 | Hamamatsu Photonics K.K. | Optical computer tomographic apparatus and image reconstruction method using optical computer tomography |
| JP3039388B2 (ja) * | 1996-03-22 | 2000-05-08 | 株式会社ニコン | 極低倍用第１対物レンズを備えた顕微鏡 |
| US5717518A (en) * | 1996-07-22 | 1998-02-10 | Kla Instruments Corporation | Broad spectrum ultraviolet catadioptric imaging system |
| US6031930A (en) * | 1996-08-23 | 2000-02-29 | Bacus Research Laboratories, Inc. | Method and apparatus for testing a progression of neoplasia including cancer chemoprevention testing |
| JP2002506521A (ja) * | 1997-06-05 | 2002-02-26 | カイロス サイエンティフィック インコーポレーテッド | マイクロスコピーにおける蛍光共鳴エネルギー伝達の較正 |
| JP2000010012A (ja) * | 1998-06-19 | 2000-01-14 | Olympus Optical Co Ltd | 顕微鏡照明光学系 |
| JP4285807B2 (ja) * | 1998-09-22 | 2009-06-24 | オリンパス株式会社 | 落射蛍光顕微鏡 |
| JP2000310735A (ja) * | 1999-04-28 | 2000-11-07 | Olympus Optical Co Ltd | 共焦点顕微鏡 |
| US6453060B1 (en) | 1999-06-29 | 2002-09-17 | Tri Path Imaging, Inc. | Method and apparatus for deriving separate images from multiple chromogens in a branched image analysis system |
| GB9930156D0 (en) | 1999-12-22 | 2000-02-09 | Secr Defence | Optical system interface |
| CA2448980A1 (en) * | 2001-05-29 | 2002-12-05 | Tissueinformatics, Inc. | Robust stain detection and quantification for histological specimens based on a physical model for stain absorption |
-
2001
- 2001-09-19 US US09/957,446 patent/US7065236B2/en not_active Expired - Lifetime
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