ES2301978T3 - Modificadores polimericos y composiciones farmaceuticas. - Google Patents

Modificadores polimericos y composiciones farmaceuticas. Download PDF

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Abstract

Copolímero o sal farmacológicamente aceptable del mismo, que contiene, como unidades constitucionales, (a)una o más unidades estructurales que pueden ser iguales o diferentes entre sí y que se representan mediante la fórmula (I) a continuación: (Ver fórmula) en la que: m es un número entero de desde 3 hasta 100, Alk representa un grupo alquileno que tiene desde 1 hasta 6 átomos de carbono, y R1 y R2 son iguales o diferentes y cada uno representa un átomo de hidrógeno o un grupo alquilo que tiene desde 1 hasta 6 átomos de carbono que puede estar opcionalmente sustituido con al menos un sustituyente seleccionado del grupo que consiste en grupos hidroxilo, átomos de halógeno y grupos arilo que tienen desde 6 hasta 14 átomos de carbono que pueden estar opcionalmente sustituidos con desde 1 hasta 5 sustituyentes seleccionados de los sustituyentes A definidos a continuación, y (b)una o más unidades estructurales que pueden ser iguales o diferentes entre sí y que se representan mediante la fórmula (II): (Ver fórmula) en la que: R3 representa un grupo hidroxilo, un grupo alcoxilo que tiene desde 1 hasta 6 átomos de carbono que puede estar opcionalmente sustituido con al menos un sustituyente seleccionado del grupo que consiste en grupos hidroxilo, átomos de halógeno y grupos arilo que tienen desde 6 hasta 14 átomos de carbono que pueden estar opcionalmente sustituidos con desde 1 hasta 5 sustituyentes seleccionados de los sustituyentes A definidos a continuación, un grupo ariloxilo que tiene desde 6 hasta 14 átomos de carbono que puede estar opcionalmente sustituido con desde 1 hasta 5 sustituyentes seleccionados de los sustituyentes A definidos a continuación, o un grupo representado por la fórmula -NR4R5, en la que R4 y R5 son iguales o diferentes entre sí y cada uno representa un átomo de hidrógeno o un grupo alquilo que tiene desde 1 hasta 6 átomos de carbono que puede estar opcionalmente sustituido con al menos un sustituyente seleccionado del grupo que consiste en grupos hidroxilo, átomos de halógeno y grupos arilo que tienen desde 6 hasta 14 átomos de carbono que pueden estar opcionalmente sustituidos con desde 1 hasta 5 sustituyentes seleccionados de los sustituyentes A definidos a continuación; los sustituyentes A se seleccionan de grupos alquilo que tienen desde 1 hasta 6 átomos de carbono, grupos alcoxilo que tienen desde 1 hasta 6 átomos de carbono, átomos de halógeno, grupos hidroxilo, grupos nitro y grupos carboxilo.

Description

Modificadores poliméricos y composiciones farmacéuticas.
Campo técnico
La presente invención se refiere a un copolímero novedoso, a una composición farmacéutica que comprende dicho copolímero, a un modificador de proteína que comprende dicho copolímero, a un complejo de dicho copolímero con una proteína, a un método de prevención o tratamiento de enfermedades usando dicho complejo, al uso de dicho complejo en la fabricación de un medicamento para prevenir o tratar enfermedades y a métodos para la síntesis de dichos copolímeros y dichos complejos.
Antecedentes de la invención
La modificación de proteínas con agentes adicionales tales como polímeros se ha empleado comúnmente para el fin de proporcionar propiedades farmacéuticas mejoradas, por ejemplo, estabilidad y retención mejoradas en la sangre y antigenicidad reducida [por ejemplo, véase F. M. Veronese y J. M. Harris, "Peptide and Protein Pegylation", Advanced Drug Delivery Reviews 54(4), 2002].
Cuando se modifican proteínas con un polímero, una técnica empleada en el pasado comprende unir la proteína y el modificador polimérico mediante un enlace covalente (por ejemplo, véase el documento WO-A-97/23614). En otros ejemplos de la modificación polimérica de una proteína, tal como en la modificación de un fármaco con un polímero, el fármaco se ha modificado mediante un enlace no covalente. Un ejemplo de este tipo se proporciona en la solicitud de patente japonesa (Kokai) Nº Hei 11-302199, que da a conocer que un copolímero de injerto, que comprende una cadena de injerto de un polímero no iónico y una cadena principal de un polímero cargado negativamente, forma un complejo de inclusión con una sustancia que puede cargarse positivamente en condiciones fisiológicas, por ejemplo, un liposoma o poli-L-lisina que porta carga negativa, para mejorar la retención en la sangre. Se sugiere otra alternativa en el documento WO-A-99/02131 que da a conocer que pueden mezclarse una proteína y un polímero soluble en agua en condiciones específicas en presencia de un disolvente orgánico para proporcionar micropartículas de liberación controlada.
Desafortunadamente pocos de estos modificadores de proteína poliméricos han sido particularmente satisfactorios por una variedad de razones. Un ejemplo reciente de un modificador de proteína polimérico que muestra propiedades mejoradas comprende un copolímero una base de compuesto de poli(ácido maleico) que contiene un compuesto de alquil éter de polioxialquileno como unidad constituyente [véase, por ejemplo, las patentes japonesas números 3035675 y 3271265]. Estos modificadores poliméricos muestran ciertamente una unión mejorada a las proteínas diana. Sin embargo, todavía existen problemas significativos con tales copolímeros. Se encuentra que el resto de anhídrido maleico de los mismos se une a las proteínas de manera no específica. Esto da como resultado los complejos obtenidos del copolímero y la proteína que muestra propiedades no uniformes dependiendo de las condiciones. Particularmente, se encuentra que estos modificadores poliméricos tienden a formar fácilmente estructuras reticuladas desorganizadas con las proteínas, formando así complejos voluminosos que provocan la modificación excesiva de la estructura de proteína y por tanto la reducción de la actividad de proteína deseada. Además, se ha encontrado que los complejos de estos modificadores de proteína poliméricos y una proteína muestran una retención no satisfactoria en la sangre tras la administración.
Existe, por tanto, una necesidad de un modificador polimérico que pueda proporcionar un complejo que tenga propiedades uniformes, especialmente una producción reducida de estructuras reticuladas desorganizadas con la proteína, un mejor mantenimiento de la actividad de proteína y una excelente retención de la proteína en la sangre tras la administración de dicho complejo.
Breve sumario de la invención
Por tanto, es un objeto de la presente invención proporcionar un modificador polimérico que pueda proporcionar un complejo que tiene propiedades uniformes, especialmente una producción reducida de estructuras reticuladas desorganizadas con la proteína, un mejor mantenimiento de actividad de proteína y una excelente retención de la proteína en la sangre tras la administración de dicho complejo.
Los presentes inventores han realizado un estudio extenso de diversos modificadores de proteína, y como resultado, han tenido éxito en obtener copolímeros novedosos que pueden formar complejos con proteínas que tienen propiedades uniformes y mejorar notablemente la retención en la sangre de las proteínas de dichos complejos, conduciendo así la conclusión de la presente invención.
Otros objetos y ventajas de la presente invención se harán evidentes a medida que avanza la descripción.
Por tanto, la presente invención proporciona un copolímero o una sal farmacológicamente aceptable del mismo, que contiene, como unidades constitucionales,
\newpage
(a) una o más unidades estructurales que pueden ser iguales o diferentes entre sí y que se representan mediante la fórmula (I) a continuación:
\vskip1.000000\baselineskip
1
en la que:
m es un número entero de desde 3 hasta 100,
Alk representa un grupo alquileno que tiene desde 1 hasta 6 átomos de carbono, y
R^{1} y R^{2} son iguales o diferentes y cada uno representa un átomo de hidrógeno o un grupo alquilo que tiene desde 1 hasta 6 átomos de carbono que puede estar opcionalmente sustituido con al menos un sustituyente seleccionado del grupo que consiste en grupos hidroxilo, átomos de halógeno y grupos arilo que tienen desde 6 hasta 14 átomos de carbono que pueden estar opcionalmente sustituidos con desde 1 hasta 5 sustituyentes seleccionados de los sustituyentes A definidos a continuación, y
(b) una o más unidades estructurales que pueden ser iguales o diferentes entre sí y que se representan mediante la fórmula (II):
\vskip1.000000\baselineskip
2
en la que:
R^{3} representa
un grupo hidroxilo,
un grupo alcoxilo que tiene desde 1 hasta 6 átomos de carbono que puede estar opcionalmente sustituido con al menos un sustituyente seleccionado del grupo que consiste en grupos hidroxilo, átomos de halógeno y grupos arilo que tienen desde 6 hasta 14 átomos de carbono que pueden estar opcionalmente sustituidos con desde 1 hasta 5 sustituyentes seleccionados de los sustituyentes A definidos a continuación,
un grupo ariloxilo que tiene desde 6 hasta 14 átomos de carbono que puede estar opcionalmente sustituido con desde 1 hasta 5 sustituyentes seleccionados de los sustituyentes A definidos a continuación, o
un grupo representado por la fórmula -NR^{4}R^{5}, en la que R^{4} y R^{5} son iguales o diferentes entre sí y cada uno representa un átomo de hidrógeno o un grupo alquilo que tiene desde 1 hasta 6 átomos de carbono que puede estar opcionalmente sustituido con al menos un sustituyente seleccionado del grupo que consiste en grupos hidroxilo, átomos de halógeno y grupos arilo que tienen desde 6 hasta 14 átomos de carbono que pueden estar opcionalmente sustituidos con desde 1 hasta 5 sustituyentes seleccionados de los sustituyentes A definidos a continuación;
los sustituyentes A se seleccionan de grupos alquilo que tienen desde 1 hasta 6 átomos de carbono, grupos alcoxilo que tienen desde 1 hasta 6 átomos de carbono, átomos de halógeno, grupos hidroxilo, grupos nitro y grupos carboxilo.
\vskip1.000000\baselineskip
La presente invención proporciona además un copolímero o una sal farmacológicamente aceptable del mismo que pueden obtenerse sometiendo uno o más restos de anhídrido carboxílico de fórmula (III) en un copolímero que contiene, como unidades constitucionales,
(a) una o más unidades estructurales que pueden ser iguales o diferentes entre sí y que se representan mediante la fórmula (I) a continuación:
3
en la que:
m es un número entero de desde 3 hasta 100,
Alk representa un grupo alquileno que tiene desde 1 hasta 6 átomos de carbono, y
R^{1} y R^{2} son iguales o diferentes y cada uno representa un átomo de hidrógeno o un grupo alquilo que tiene desde 1 hasta 6 átomos de carbono que puede estar opcionalmente sustituido con al menos un sustituyente seleccionado del grupo que consiste en grupos hidroxilo, átomos de halógeno y grupos arilo que tienen desde 6 hasta 14 átomos de carbono que pueden estar opcionalmente sustituidos con desde 1 hasta 5 sustituyentes seleccionados de los sustituyentes A definidos a continuación, y
(b) dicho(s) uno o más restos de anhídrido carboxílico de fórmula (III):
4
a una o más reacciones seleccionadas del grupo que consiste en (i) hidrólisis, (ii) amonólisis, (iii) aminólisis y (iv) alcohólisis;
los sustituyentes A se seleccionan de grupos alquilo que tienen desde 1 hasta 6 átomos de carbono, grupos alcoxilo que tienen desde 1 hasta 6 átomos de carbono, átomos de halógeno, grupos hidroxilo, grupos nitro y grupos carboxilo.
\vskip1.000000\baselineskip
La presente invención también proporciona una composición farmacéutica que comprende al menos un copolímero o una sal farmacológicamente aceptable del mismo de la presente invención tal como se describió anteriormente, particularmente una composición tal que también comprende al menos una proteína o un análogo o una variante de la misma.
La presente invención también proporciona un modificador que puede modificar una proteína o un análogo o una variante de la misma, comprendiendo dicho modificador un copolímero o una sal farmacológicamente aceptable del mismo de la presente invención tal como se describió anteriormente.
La presente invención también proporciona un complejo que comprende al menos una proteína o un análogo o una variante de la misma que está unido a al menos un copolímero o una sal farmacológicamente aceptable del mismo de la presente invención tal como se describió anteriormente.
La presente invención también proporciona una composición farmacéutica que comprende una cantidad eficaz de un agente farmacológicamente activo junto con un vehículo o diluyente del mismo, en la que dicho agente farmacológicamente activo es un complejo que comprende al menos una proteína o un análogo o una variante de la misma que está unido a al menos un copolímero o una sal farmacológicamente aceptable del mismo de la presente invención tal como se describió anteriormente.
La presente invención también proporciona un método para prolongar el tiempo que una proteína o un análogo o una variante de la misma se retiene en la circulación sanguínea tras la administración a un paciente complejando dicha proteína o un análogo o una variante de la misma con al menos un copolímero o una sal farmacológicamente aceptable del mismo de la presente invención tal como se describió anteriormente.
La presente invención también proporciona un método para el tratamiento o la profilaxis de una enfermedad en un paciente que es susceptible a una proteína o un análogo o una variante de la misma que comprende administrar a dicho paciente una cantidad eficaz de un complejo que comprende dicha proteína o un análogo o una variante de la misma que está unido a al menos un copolímero o una sal farmacológicamente aceptable del mismo de la presente invención tal como se describió anteriormente.
La presente invención también proporciona el uso de un complejo que comprende una proteína o un análogo o una variante de la misma que está unido a al menos un copolímero o una sal farmacológicamente aceptable del mismo de la presente invención tal como se describió anteriormente en la fabricación de un medicamento para la profilaxis o el tratamiento de una enfermedad susceptible a dicha proteína o un análogo o una variante de la misma.
La presente invención también proporciona un método para la preparación de un copolímero o una sal farmacológicamente aceptable del mismo que contienen, como unidades constitucionales,
(a) una o más unidades estructurales que pueden ser iguales o diferentes entre sí y que se representan mediante la fórmula (I) a continuación:
\vskip1.000000\baselineskip
5 
\vskip1.000000\baselineskip
en la que:
m, Alk, R^{1} y R^{2} son tal como se definieron anteriormente, y
(b) una o más unidades estructurales que pueden ser iguales o diferentes entre sí y que se representan mediante la fórmula (II):
\vskip1.000000\baselineskip
6 
\vskip1.000000\baselineskip
en la que:
R^{3} es tal como se definió anteriormente;
comprendiendo dicho método someter uno o más restos de anhídrido carboxílico de fórmula (III) en un copolímero que contiene, como unidades constitucionales,
(c) una o más unidades estructurales que pueden ser iguales o diferentes entre sí y que se representan mediante la fórmula (I) tal como se definió anteriormente, y
\newpage
(d) dicho uno o más restos de anhídrido carboxílico de fórmula (III):
7
a una o más reacciones seleccionadas del grupo que consiste en (i) hidrólisis, (ii) amonólisis, (iii) aminólisis y (iv) alcohólisis.
\vskip1.000000\baselineskip
La presente invención también proporciona un método para la preparación de un complejo que comprende al menos una proteína o un análogo o una variante de la misma que está unido a al menos un copolímero o una sal farmacológicamente aceptable del mismo tal como se definió anteriormente, comprendiendo dicho método hacer reaccionar dicho copolímero o una sal farmacológicamente aceptable del mismo con dicha proteína o un análogo o una variante de la misma en condiciones que favorecen la formación de dicho complejo.
Breve descripción de las figuras
La figura 1 muestra los resultados de la electroforesis en gel de SDS-poliacrilamida en los complejos de la presente invención de poli(PEG_{500}-MA)a-OCIF en condiciones no reductoras tal como se realiza en el ejemplo de prueba 6 a continuación:
(1)
Marcadores de peso molecular
(2)
Complejo de poli(PEG_{500}-MA)a-Na (compuesto Nº 9)-OCIF [OCIF:modificador polimérico=1:1 (razón en peso)]
(3)
Complejo de poli(PEG_{500}-MA)a-Na (compuesto Nº 9)-OCIF [OCIF:modificador polimérico=1:2 (razón en peso)]
(4)
Complejo de poli(PEG_{500}-MA)a-Na (compuesto Nº 9)-OCIF [OCIF:modificador polimérico=1:3 (razón en peso)]
(5)
Complejo de poli(PEG_{500}-MA)a-Na (compuesto Nº 9)-OCIF [OCIF:modificador polimérico=1:4 (razón en peso)]
(6)
Complejo de poli(PEG_{500}-MA)a-Na (compuesto Nº 9)-OCIF [OCIF:modificador polimérico=1:5 (razón en peso)]
(7)
OCIF no modificado.
\vskip1.000000\baselineskip
La figura 2 muestra resultados adicionales de la electroforesis en gel de SDS-poliacrilamida en complejos de la presente invención de poli(PEG_{500}-MA)a-OCIF en condiciones no reductoras tal como se realiza en el ejemplo de prueba 6 a continuación:
(1)
Marcador de peso molecular
(2)
Complejo de poli(PEG_{500}-MA)a-Na (compuesto Nº 9)-OCIF [OCIF:modificador polimérico=1:1 (razón en peso), concentración de OCIF durante la incubación: 3,5 mg/ml]
(3)
Complejo de poli(PEG_{500}-MA)a-Na (compuesto Nº 9)-OCIF [OCIF:modificador polimérico=1:1 (razón en peso), concentración de OCIF durante la incubación: 1,75 mg/ml]
(4)
Complejo de poli(PEG_{500}-MA)a-Na (compuesto Nº 9)-OCIF [OCIF:modificador polimérico=1:1 (razón en peso), concentración de OCIF durante la incubación: 0,875 mg/ml]
(5)
Complejo de poli(PEG_{500}-MA)a-Na (compuesto Nº 9)-OCIF [OCIF:modificador polimérico=1:2 (razón en peso), concentración de OCIF durante la incubación: 1,75 mg/ml]
(6)
Complejo de poli(PEG_{500}-MA)a-Na (compuesto Nº 9)-OCIF [OCIF:modificador polimérico=1:4 (razón en peso), concentración de OCIF durante la incubación: 0,875 mg/ml]
(7)
OCIF no modificado.
La figura 3 muestra los resultados de la de electroforesis en gel de SDS-poliacrilamida de complejos de la técnica anterior de poli (PEG_{500}-MA)-OCIF en condiciones no reductoras tal como se realiza en el ejemplo de prueba 6 a continuación:
(1)
Marcador de peso molecular
(2)
Complejo de poli(PEG_{500}-MA) (AM-0530K)-OCIF [OCIF:modificador polimérico=1:10 (razón en peso)]
(3)
Complejo de poli(PEG_{500}-MA) (AM-0530K)-OCIF [OCIF:modificador polimérico=1:2,5 (razón en peso)]
(4)
Complejo de poli(PEG_{500}-MA) (AM-0530K)-OCIF [OCIF:modificador polimérico=1:1 (razón en peso)]
(5)
OCIF no modificado.
Descripción detallada de la invención
(1) Tal como se indicó anteriormente, un aspecto de la presente invención proporciona un copolímero o una sal farmacológicamente aceptable del mismo, que contiene, como unidades constitucionales,
(a) una o más unidades estructurales que pueden ser iguales o diferentes entre sí y que se representan mediante la fórmula (I) a continuación:
8
en la que:
m, Alk, R^{1} y R^{2} son tal como se definieron anteriormente, y
(b) una o más unidades estructurales que pueden ser iguales o diferentes entre sí y que se representan mediante la fórmula (II):
9
en la que R^{3} es tal como se definió anteriormente. De estos copolímeros y sales farmacológicamente aceptables de los mismos, los preferidos incluyen:
(2) un copolímero o una sal farmacológicamente aceptable del mismo según (1), en los que las unidades estructurales representadas por la fórmula (I) y las unidades estructurales representadas por la fórmula (II) están dispuestas en una secuencia alternante de cabeza-cabeza, una secuencia alternante de cabeza-cola o una secuencia alternante mixta de cabeza-cabeza y cabeza-cola;
(3) un copolímero o una sal farmacológicamente aceptable del mismo según (1), en los que las unidades estructurales representadas por la fórmula (I) y las unidades estructurales representadas por la fórmula (II) están dispuestas en una secuencia al azar;
(4) un copolímero o una sal farmacológicamente aceptable del mismo según uno cualquiera de (1) a (3), en los que Alk es un grupo etileno o trimetileno;
(5) un copolímero o una sal farmacológicamente aceptable del mismo según (4), en los que Alk es un grupo etileno;
(6) un copolímero o una sal farmacológicamente aceptable del mismo según uno cualquiera de (1) a (5), en los que m es un número entero de desde 3 hasta 50;
(7) un copolímero o una sal farmacológicamente aceptable del mismo según (6), en los que m es un número entero de desde 3 hasta 40;
(8) un copolímero o una sal farmacológicamente aceptable del mismo según (7), en los que m es un número entero de desde 6 hasta 16 o de 28 a 38;
(9) un copolímero o una sal farmacológicamente aceptable del mismo según (8), en los que m es un número entero de desde 6 hasta 16;
(10) un copolímero o una sal farmacológicamente aceptable del mismo según uno cualquiera de (1) a (9), en los que R^{1} es un átomo de hidrógeno o un grupo metilo;
(11) un copolímero o una sal farmacológicamente aceptable del mismo según (10), en los que R^{1} es un átomo de hidrógeno;
(12) un copolímero o una sal farmacológicamente aceptable del mismo según uno cualquiera de (1) a (11), en los que R^{2} es un átomo de hidrógeno o un grupo metilo;
(13) un copolímero o una sal farmacológicamente aceptable del mismo según (12), en los que R^{2} es un grupo metilo;
(14) un copolímero o una sal farmacológicamente aceptable del mismo según uno cualquiera de (1) a (13), en los que R^{3} es un grupo hidroxilo, un grupo alcoxilo que tiene desde 1 hasta 6 átomos de carbono o un grupo representado por la fórmula -NR^{4}R^{5}, en la que R^{4} y R^{5} son iguales o diferentes y cada uno representa un átomo de hidrógeno o un grupo alquilo que tiene desde 1 hasta 6 átomos de carbono;
(15) un copolímero o una sal farmacológicamente aceptable del mismo según (14), en los que R^{3} es un grupo hidroxilo o un grupo alcoxilo que tiene desde 1 hasta 6 átomos de carbono;
(16) un copolímero o una sal farmacológicamente aceptable del mismo según (15), que comprende al menos una unidad estructural representada por la fórmula (II) en la que R^{3} es un grupo alcoxilo que tiene desde 1 hasta 6 átomos de carbono y opcionalmente al menos una unidad estructural representada por la fórmula (II) en la que R^{3} es un grupo hidroxilo, en los que la razón entre las unidades estructurales representadas por la fórmula (II) en la que R^{3} es un grupo hidroxilo y las unidades estructurales representadas por la fórmula (II) en la que R^{3} es un grupo alcoxilo que tiene desde 1 hasta 6 átomos de carbono está en el intervalo de desde 4:6 hasta 0:10;
(17) un copolímero o una sal farmacológicamente aceptable del mismo según (15) o (16), en los que R^{3} es un grupo alcoxilo que tiene desde 1 hasta 6 átomos de carbono;
(18) un copolímero o una sal farmacológicamente aceptable del mismo según uno cualquiera de (15) a (17), en los que dicho grupo alcoxilo que tiene desde 1 hasta 6 átomos de carbono es un grupo etoxilo;
(19) un copolímero o una sal farmacológicamente aceptable del mismo según (14), en los que R^{3} es un grupo hidroxilo o un grupo representado por la fórmula -NR^{4}R^{5}, en la que R^{4} y R^{5} son iguales o diferentes y cada uno representa un átomo de hidrógeno o un grupo alquilo que tiene desde 1 hasta 6 átomos de carbono;
(20) un copolímero o una sal farmacológicamente aceptable del mismo según (19), que comprenden al menos una unidad estructural representada por la fórmula (II) en la que R^{3} es un grupo representado por la fórmula -NR^{4}R^{5}, en la que R^{4} y R^{5} son iguales o diferentes y cada uno representa un átomo de hidrógeno o un grupo alquilo que tiene desde 1 hasta 6 átomos de carbono y opcionalmente al menos una unidad estructural representada por la fórmula (II) en la que R^{3} es un grupo hidroxilo, en los que la razón entre las unidades estructurales representadas por la fórmula (II) en la que R^{3} es un grupo hidroxilo y las unidades estructurales representadas por la fórmula (II) en la que R^{3} es un grupo representado por la fórmula -NR^{4}R^{5} está en el intervalo de desde 5:5 hasta 0:10;
(21) un copolímero o una sal farmacológicamente aceptable del mismo según (20), en los que la razón entre las unidades estructurales representadas por la fórmula (II) en la que R^{3} es un grupo hidroxilo y las unidades estructurales representadas por la fórmula (II) en la que R^{3} es un grupo representado por la fórmula -NR^{4}R^{5} está en el intervalo de desde 4:6 hasta 0:10;
(22) un copolímero o una sal farmacológicamente aceptable del mismo según uno cualquiera de (19) a (21), en los que R^{3} es un grupo representado por la fórmula -NR^{4}R^{5}, en la que R^{4} y R^{5} son iguales o diferentes y cada uno representa un átomo de hidrógeno o un grupo alquilo que tiene desde 1 hasta 6 átomos de carbono;
(23) un copolímero o una sal farmacológicamente aceptable del mismo según uno cualquiera de (19) a (22), en los que el grupo representado por la fórmula -NR^{4}R^{5} es un grupo amino, un grupo metilamino o un grupo dimetilamino;
(24) un copolímero o una sal farmacológicamente aceptable del mismo según (23), en los que el grupo representado por la fórmula -NR^{4}R^{5} es un grupo amino;
(25) un copolímero o una sal farmacológicamente aceptable del mismo según (23), en los que el grupo representado por la fórmula -NR^{4}R^{5} es un grupo dimetilamino;
(26) un copolímero o una sal farmacológicamente aceptable del mismo según (14), en los que R^{3} es un grupo hidroxilo;
(27) un copolímero o una sal farmacológicamente aceptable del mismo según (14), en los que R^{3} es un grupo 1-amino-2-propanol;
(28) un copolímero o una sal farmacológicamente aceptable del mismo según uno cualquiera de (1) a (27), en los que la razón entre la unidad estructural representada por la fórmula (I) y la unidad estructural representada por la fórmula (II) está en el intervalo de desde 10:1 hasta 1:10;
(29) un copolímero o una sal farmacológicamente aceptable del mismo según (28), en los que la razón entre la unidad estructural representada por la fórmula (I) y la unidad estructural representada por la fórmula (II) está en el intervalo de desde 3:1 hasta 1:8;
(30) un copolímero o una sal farmacológicamente aceptable del mismo según (28), en los que la razón entre la unidad estructural representada por la fórmula (I) y la unidad estructural representada por la fórmula (II) está en el intervalo de desde 2:1 hasta 1:2 o de 1:2 a 1:6;
(31) un copolímero o una sal farmacológicamente aceptable del mismo según (28), en los que la razón entre la unidad estructural representada por la fórmula (I) y la unidad estructural representada por la fórmula (II) es de 1:1 o está en el intervalo de desde 1:2 hasta 1:4;
(32) un copolímero o una sal farmacológicamente aceptable del mismo según uno cualquiera de (1) a (31), en los que el grado promedio de polimerización está en el intervalo de desde 5 hasta 200;
(33) un copolímero o una sal farmacológicamente aceptable del mismo según (32), en los que el grado promedio de polimerización está en el intervalo de desde 5 hasta 50;
(34) un copolímero o una sal farmacológicamente aceptable del mismo según (33), en los que el grado promedio de polimerización está en el intervalo de desde 5 hasta 20;
(35) un copolímero o una sal farmacológicamente aceptable del mismo según (32), en los que el grado promedio de polimerización está en el intervalo de desde 20 hasta 30;
(36) un copolímero o una sal farmacológicamente aceptable del mismo según (32), en los que el grado promedio de polimerización está en el intervalo de desde 30 hasta 40;
(37) un copolímero o una sal farmacológicamente aceptable del mismo según uno cualquiera de (1) a (31), en los que el radio de Stokes del mismo es de 9,3 nm o inferior;
(38) un copolímero o una sal farmacológicamente aceptable del mismo según (37), en los que el radio de Stokes del mismo es de 7,3 nm o inferior;
(39) un copolímero o una sal farmacológicamente aceptable del mismo según (38), en los que el radio de Stokes del mismo es de 6,2 nm o inferior;
(40) un copolímero o una sal farmacológicamente aceptable del mismo según (39), en los que el radio de Stokes del mismo es de 4,7 nm o inferior;
(41) un copolímero o una sal farmacológicamente aceptable del mismo según (40), en los que el radio de Stokes del mismo es de 3,1 nm o inferior;
(42) un copolímero o una sal farmacológicamente aceptable del mismo según (37), en los que el radio de Stokes del mismo está en el intervalo de desde 1,5 nm a 4,7 nm;
(43) un copolímero o una sal farmacológicamente aceptable del mismo según (37), en los que el radio de Stokes del mismo está en el intervalo de desde 3,1 nm a 6,2 nm; y
\newpage
(44) un copolímero o una sal farmacológicamente aceptable del mismo según (1) en los que:
m es un número entero de desde 3 hasta 100,
Alk representa un grupo alquileno que tiene desde 1 hasta 6 átomos de carbono,
R^{1} y R^{2} son iguales o diferentes y cada uno representa un átomo de hidrógeno o un grupo alquilo que tiene desde 1 hasta 6 átomos de carbono, y
R^{3} representa un grupo hidroxilo, un grupo alcoxilo que tiene desde 1 hasta 6 átomos de carbono que puede estar opcionalmente sustituido con un grupo hidroxilo, o un grupo representado por la fórmula -NR^{4}R^{5}, en la que R^{4} y R^{5} son iguales o diferentes entre sí y cada uno representa un átomo de hidrógeno o un grupo alquilo que tiene desde 1 hasta 6 átomos de carbono que puede estar opcionalmente sustituido con un grupo hidroxilo:
(45) un copolímero o una sal farmacológicamente aceptable del mismo según (1), en los que Alk representa un grupo etileno, R^{1} representa un átomo de hidrógeno, R^{2} representa un grupo metilo y m, R^{3}, la razón de las unidades estructurales de fórmulas (I) y (II) (la razón de composición) y, cuando sea pertinente, la razón entre las unidades de fórmula (II) en la que R^{3} representa un grupo hidroxilo y las unidades de fórmula (II) en la que R^{3} representa un grupo distinto de hidroxilo (la razón de hidrólisis) se seleccionan de lo siguiente:
(i)
m es desde 6 hasta 16, R^{3} es un grupo hidroxilo, la razón de composición es de 1:1 y el grado promedio de polimerización es desde 30 hasta 40;
(ii)
m es desde 28 hasta 38, R^{3} es un grupo hidroxilo, la razón de composición es de 1:1 y el grado promedio de polimerización es desde 10 hasta 15;
(iii)
m es desde 6 hasta 16, R^{3} es un grupo amino, la razón de composición es de 1:1 y el grado promedio de polimerización es desde 30 hasta 40;
(iv)
m es desde 6 hasta 16, R^{3} es un grupo dimetilamino, la razón de composición es de 1:1 y el grado promedio de polimerización es desde 30 hasta 40;
(v)
m es desde 6 hasta 16, R^{3} es un grupo 1-amino-2-propanol, la razón de composición es de 1:1 y el grado promedio de polimerización es desde 30 hasta 40;
(vi)
m es desde 6 hasta 16, R^{3} se selecciona de grupos etoxilo e hidroxilo, la razón de composición es de 1:1, el grado promedio de polimerización es desde 30 hasta 40 y la razón de hidrólisis es de 4:6;
(vii)
m es desde 28 hasta 16, R^{3} se selecciona de grupos amino e hidroxilo, la razón de composición es de 1:1, el grado promedio de polimerización es desde 10 hasta 15 y la razón de hidrólisis es de 4:6;
(viii)
m es desde 28 hasta 38, R^{3} es un grupo dimetilamino, la razón de composición es de 1:1 y el grado promedio de polimerización es desde 10 hasta 15;
(ix)
m es desde 6 hasta 16, R^{3} se selecciona de grupos amino e hidroxilo, la razón de composición es de 1:1, el grado promedio de polimerización es desde 30 hasta 40, la razón de hidrólisis es de 3,1:6,9 y el copolímero es una sal de sodio;
(x)
m es desde 6 hasta 16, R^{3} se selecciona de grupos amino e hidroxilo, la razón de composición es de 1:1, el grado promedio de polimerización es desde 30 hasta 40 y la razón de hidrólisis es de 1,4:8,6;
(xi)
m es desde 6 hasta 16, R^{3} se selecciona de grupos dimetilamino e hidroxilo, la razón de composición es de 1:1, el grado promedio de polimerización es desde 30 hasta 40, la razón de hidrólisis es de 2,9:7,1 y el copolímero es una sal de sodio;
(xii)
m es desde 6 hasta 16, R^{3} es un grupo amino, la razón de composición es de 1:2,4 y el grado promedio de polimerización es desde 20 hasta 30;
(xiii)
m es desde 6 hasta 16, R^{3} se selecciona de grupos amino e hidroxilo, la razón de composición es de 1:2,4, el grado promedio de polimerización es desde 20 hasta 30 y la razón de hidrólisis es de 0,4:9,6;
(xiv)
m es desde 6 hasta 16, R^{3} se selecciona de grupos amino e hidroxilo, la razón de composición es de 1:2,4, el grado promedio de polimerización es desde 20 hasta 30 y la razón de hidrólisis es de 2,9:7,1;
(xv)
m es desde 6 hasta 16, R^{3} se selecciona de grupos amino e hidroxilo, la razón de composición es de 1:2,4, el grado promedio de polimerización es desde 20 hasta 30 y la razón de hidrólisis es de 0,9:9,1;
(xvi)
m es desde 6 hasta 16, R^{3} se selecciona de grupos amino e hidroxilo, la razón de composición es de 1:2,4, el grado promedio de polimerización es desde 20 hasta 30 y la razón de hidrólisis es de 0,5:9,5;
(xvii)
m es desde 6 hasta 16, R^{3} se selecciona de grupos amino e hidroxilo, la razón de composición es de 1:2,4, el grado promedio de polimerización es desde 20 hasta 30 y la razón de hidrólisis es de 1,3:8,7;
(xviii)
m es desde 6 hasta 16, R^{3} se selecciona de grupos amino e hidroxilo, la razón de composición es de 1:2,4, el grado promedio de polimerización es desde 20 hasta 30 y la razón de hidrólisis es de 1,9:8,1;
(xix)
m es desde 6 hasta 16, R^{3} se selecciona de grupos amino e hidroxilo, la razón de composición es de 1:2,4, el grado promedio de polimerización es desde 20 hasta 30 y la razón de hidrólisis es de 1,0:9,0;
(xx)
m es desde 6 hasta 16, R^{3} se selecciona de grupos amino e hidroxilo, la razón de composición es de 1:2,4, el grado promedio de polimerización es desde 20 hasta 30 y la razón de hidrólisis es de 0,8:9,2;
(xxi)
m es desde 6 hasta 16, R^{3} se selecciona de grupos amino e hidroxilo, la razón de composición es de 1:2,4, el grado promedio de polimerización es desde 20 hasta 30 y la razón de hidrólisis es de 4,6:5,4;
(xxii)
m es desde 6 hasta 16, R^{3} se selecciona de grupos amino e hidroxilo, la razón de composición es de 1:2,4, el grado promedio de polimerización es desde 20 hasta 30 y la razón de hidrólisis es de 1,2:8,8;
(xxiii)
m es desde 6 hasta 16, R^{3} se selecciona de grupos amino e hidroxilo, la razón de composición es de 1:2,4, el grado promedio de polimerización es desde 20 hasta 30 y la razón de hidrólisis es de 2,0:8,0;
(xxiv)
m es desde 6 hasta 16, R^{3} se selecciona de grupos amino e hidroxilo, la razón de composición es de 1:2,4, el grado promedio de polimerización es desde 20 hasta 30 y la razón de hidrólisis es de 1,1:8,9;
(xxv)
m es desde 6 hasta 16, R^{3} se selecciona de grupos amino e hidroxilo, la razón de composición es de 1:2,4, el grado promedio de polimerización es desde 20 hasta 30 y la razón de hidrólisis es de 2,4:7:6;
(xxvi)
m es desde 6 hasta 16, R^{3} se selecciona de grupos amino e hidroxilo, la razón de composición es de 1:2,4, el grado promedio de polimerización es desde 20 hasta 30 y la razón de hidrólisis es de 0,9:9,1;
(xxvii)
m es desde 6 hasta 16, R^{3} se selecciona de grupos amino e hidroxilo, la razón de composición es de 1:2,4, el grado promedio de polimerización es desde 20 hasta 30 y la razón de hidrólisis es de 1,5:8,5;
(xxviii)
m es desde 6 hasta 16, R^{3} se selecciona de grupos amino e hidroxilo, la razón de composición es de 1:2,4, el grado promedio de polimerización es desde 20 hasta 30 y la razón de hidrólisis es de 0,7:9,3;
(xxix)
m es desde 6 hasta 16, R^{3} se selecciona de grupos amino e hidroxilo, la razón de composición es de 1:2,4, el grado promedio de polimerización es desde 20 hasta 30 y la razón de hidrólisis es de 4,5:5,5;
(xxx)
m es desde 6 hasta 16, R^{3} se selecciona de grupos amino e hidroxilo, la razón de composición es de 1:2,4, el grado promedio de polimerización es desde 20 hasta 30 y la razón de hidrólisis es de 1,4:8,6;
(xxxi)
m es desde 6 hasta 16, R^{3} se selecciona de grupos amino e hidroxilo, la razón de composición es de 1:2,4, el grado promedio de polimerización es desde 20 hasta 30 y la razón de hidrólisis es de 0,7:9,3;
(xxxii)
m es desde 6 hasta 16, R^{3} se selecciona de grupos amino e hidroxilo, la razón de composición es de 1:2,4, el grado promedio de polimerización es desde 20 hasta 30 y la razón de hidrólisis es de 0,8:9,2;
(xxxiii)
m es desde 6 hasta 16, R^{3} se selecciona de grupos amino e hidroxilo, la razón de composición es de 1:2,4, el grado promedio de polimerización es desde 20 hasta 30 y la razón de hidrólisis es de 1,4:8,6;
(xxxiv)
m es desde 6 hasta 16, R^{3} se selecciona de grupos amino e hidroxilo, la razón de composición es de 1:3,1, el grado promedio de polimerización es desde 20 hasta 30 y la razón de hidrólisis es de 0,7:9,3;
(xxxv)
m es desde 6 hasta 16, R^{3} se selecciona de grupos amino e hidroxilo, la razón de composición es de 1:2,4, el grado promedio de polimerización es desde 20 hasta 30 y la razón de hidrólisis es de 0,9:9,1;
(xxxvi)
m es desde 6 hasta 16, R^{3} se selecciona de grupos amino e hidroxilo, la razón de composición es de 1:2,4, el grado promedio de polimerización es desde 20 hasta 30 y la razón de hidrólisis es de 1,9:8,1;
(xxxvii)
m es desde 6 hasta 16, R^{3} se selecciona de grupos etoxilo e hidroxilo, la razón de composición es de aproximadamente 1:3, el grado promedio de polimerización es desde 20 hasta 30 y la razón de hidrólisis es de 3,1:6,9;
(xxxviii)
m es desde 6 hasta 16, R^{3} se selecciona de grupos amino e hidroxilo, la razón de composición es de 1:1, la razón de hidrólisis es de 1,4:8,6 y el radio de Stokes es de 9,3 nm o inferior;
(xxxix)
m es desde 6 hasta 16, R^{3} se selecciona de grupos amino e hidroxilo, la razón de composición es de 1:1, la razón de hidrólisis es de 1,4:8,6 y el radio de Stokes está en el intervalo de desde 3,1 hasta 6,2 nm;
(xl)
m es desde 6 hasta 16, R^{3} se selecciona de grupos amino e hidroxilo, la razón de composición es de 1:1, la razón de hidrólisis es de 1,4:8,6 y el radio de Stokes está en el intervalo de desde 1,5 hasta 4,7 nm;
(xli)
m es desde 6 hasta 16, R^{3} se selecciona de grupos amino e hidroxilo, la razón de composición es de 1:1, la razón de hidrólisis es de 1,4:8,6 y el radio de Stokes es de 3,1 nm o inferior;
(xlii)
m es desde 6 hasta 16, R^{3} se selecciona de grupos amino e hidroxilo, la razón de composición es de 1:1, la razón de hidrólisis es de 1,4:8,6 y el radio de Stokes es de 7,8 nm o inferior;
(xliii)
m es desde 6 hasta 16, R^{3} se selecciona de grupos amino e hidroxilo, la razón de composición es de 1:1, la razón de hidrólisis es de 1,4:8,6 y el radio de Stokes es de 6,2 nm o inferior; y
(xliv)
m es desde 6 hasta 16, R^{3} se selecciona de grupos amino e hidroxilo, la razón de composición es de 1:1, la razón de hidrólisis es de 1,4:8,6 y el radio de Stokes es de 4,7 nm o inferior.
\vskip1.000000\baselineskip
(46) Tal como se indicó anteriormente, otro aspecto de la presente invención proporciona un copolímero o una sal farmacológicamente aceptable del mismo que pueden obtenerse sometiendo uno o más restos de anhídrido carboxílico de fórmula (III) en un copolímero que contiene, como unidades constitucionales,
(a) una o más unidades estructurales que pueden ser iguales o diferentes entre sí y que se representan mediante la fórmula (I) a continuación:
10
en la que:
m, Alk, R^{1} y R^{2} son tal como se definieron anteriormente, y
(b) dicha unidad estructural que comprende un resto de anhídrido carboxílico de fórmula (III):
11
a una o más reacciones seleccionadas del grupo que consiste en (i) hidrólisis, (ii) amonólisis, (iii) aminólisis y (iv) alcohólisis.
\vskip1.000000\baselineskip
De estos copolímeros y sales farmacológicamente aceptables de los mismos, los preferidos son:
(47) un copolímero o una sal farmacológicamente aceptable del mismo según (46), en los que la unidad estructural representada por la fórmula (I) y la unidad estructural representada por la fórmula (III) en el copolímero están dispuestas en una secuencia alternante de cabeza-cabeza, una secuencia alternante de cabeza-cola o una secuencia alternante mixta de cabeza-cabeza y cabeza-cola;
(48) un copolímero o una sal farmacológicamente aceptable del mismo según (46), en los que la unidad estructural representada por la fórmula (I) y la unidad estructural representada por la fórmula (III) en el copolímero están dispuestas en secuencia al azar;
(49) un copolímero o una sal farmacológicamente aceptable del mismo según uno cualquiera de (46) a (48), en los que Alk es un grupo etileno o trimetileno;
(50) un copolímero o una sal farmacológicamente aceptable del mismo según (49), en los que Alk es un grupo etileno;
(51) un copolímero o una sal farmacológicamente aceptable del mismo según uno cualquiera de (46) a (50), en los que m es un número entero de desde 3 hasta 50;
(52) un copolímero o una sal farmacológicamente aceptable del mismo según (51), en los que m es un número entero de desde 3 hasta 40;
(53) un copolímero o una sal farmacológicamente aceptable del mismo según (52), en los que m es un número entero de desde 6 hasta 16 o de 28 a 38;
(54) un copolímero o una sal farmacológicamente aceptable del mismo según (53), en los que m es un número entero de desde 6 hasta 16;
(55) un copolímero o una sal farmacológicamente aceptable del mismo según uno cualquiera de (46) a (54), en los que R^{1} es un átomo de hidrógeno o un grupo metilo;
(56) un copolímero o una sal farmacológicamente aceptable del mismo según (55), en los que R^{1} es un átomo de hidrógeno;
(57) un copolímero o una sal farmacológicamente aceptable del mismo según uno cualquiera de (46) a (56), en los que R^{2} es un átomo de hidrógeno o un grupo metilo;
(58) un copolímero o una sal farmacológicamente aceptable del mismo según (57), en los que R^{2} es un grupo metilo;
(59) un copolímero o una sal farmacológicamente aceptable del mismo según uno cualquiera de (46) a (58), en los que la razón entre la unidad estructural representada por la fórmula (1) y la unidad estructural obtenida sometiendo una o más unidades estructurales de fórmula (III) a una o más reacciones seleccionadas del grupo que consiste en (i) hidrólisis, (ii) amonólisis, (iii) aminólisis y (iv) alcohólisis está en el intervalo de desde 10:1 hasta 1:10;
(60) un copolímero o una sal farmacológicamente aceptable del mismo según (59), en los que la razón entre la unidad estructural representada por la fórmula (I) y la unidad estructural obtenida sometiendo una o más unidades estructurales de fórmula (III) a una o más reacciones seleccionadas del grupo que consiste en (i) hidrólisis, (ii) amonólisis, (iii) aminólisis y (iv) alcohólisis está en el intervalo de desde 3:1 hasta 1:8;
(61) un copolímero o una sal farmacológicamente aceptable del mismo según (59), en los que la razón entre la unidad estructural representada por la fórmula (I) y la unidad estructural obtenida sometiendo una o más unidades estructurales de fórmula (III) a una o más reacciones seleccionadas del grupo que consiste en (i) hidrólisis, (ii) amonólisis, (iii) aminólisis y (iv) alcohólisis está en el intervalo de desde 2:1 hasta 1:2 o de 1:2 a 1:6;
(62) un copolímero o una sal farmacológicamente aceptable del mismo según (59), en los que la razón entre la unidad estructural representada por la fórmula (I) y la unidad estructural obtenida sometiendo una o más unidades estructurales de fórmula (III) a una o más reacciones seleccionadas del grupo que consiste en (i) hidrólisis, (ii) amonólisis, (iii) aminólisis y (iv) alcohólisis es de 1:1 o está en el intervalo de desde 1:2 hasta 1:4;
(63) un copolímero o una sal farmacológicamente aceptable del mismo según uno cualquiera de (46) a (62), en los que el grado promedio de polimerización está en el intervalo de desde 5 hasta 200;
(64) un copolímero o una sal farmacológicamente aceptable del mismo según (63), en los que el grado promedio de polimerización está en el intervalo de desde 5 hasta 50;
(65) un copolímero o una sal farmacológicamente aceptable del mismo según (64), en los que el grado promedio de polimerización está en el intervalo de desde 5 hasta 20;
(66) un copolímero o una sal farmacológicamente aceptable del mismo según (63), en los que el grado promedio de polimerización está en el intervalo de desde 20 hasta 30;
(67) un copolímero o una sal farmacológicamente aceptable del mismo según (63), en los que el grado promedio de polimerización está en el intervalo de desde 30 hasta 40;
(68) un copolímero o una sal farmacológicamente aceptable del mismo según (46) en los que:
m es un número entero de desde 3 hasta 100,
Alk representa un grupo alquileno que tiene desde 1 hasta 6 átomos de carbono, y
R^{1} y R^{2} son iguales o diferentes y cada uno representa un átomo de hidrógeno o un grupo alquilo que tiene desde 1 hasta 6 átomos de carbono;
(69) un copolímero o una sal farmacológicamente aceptable del mismo según uno cualquiera de (46) a (68), que pueden obtenerse sometiendo un resto de anhídrido carboxílico de fórmula (III) en el copolímero a amonólisis;
(70) un copolímero o una sal farmacológicamente aceptable del mismo según (69), que pueden obtenerse llevando a cabo la amonólisis con agua amoniacal;
(71) un copolímero o una sal farmacológicamente aceptable del mismo según uno cualquiera de (46) a (68), que pueden obtenerse sometiendo un resto de anhídrido carboxílico de fórmula (III) en el copolímero a aminólisis;
(72) un copolímero o una sal farmacológicamente aceptable del mismo según (71), que pueden obtenerse llevando a cabo la aminólisis usando una disolución acuosa de dimetilamina;
(73) un copolímero o una sal farmacológicamente aceptable del mismo según uno cualquiera de (46) a (68), que pueden obtenerse sometiendo un resto de anhídrido carboxílico de fórmula (III) en el copolímero a alcohólisis; y
(74) un copolímero o una sal farmacológicamente aceptable del mismo según (73), que pueden obtenerse llevando a cabo la alcohólisis usando etanol.
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La presente invención también hace uso los copolímeros y las sales farmacológicamente aceptables de los mismos de la presente invención para proporcionar una composición farmacéutica, un modificador que puede modificar una proteína, un complejo, un método para prolongar el tiempo que una proteína se retiene en la circulación sanguínea, un método para el tratamiento o la profilaxis de enfermedades y un uso del complejo de la invención para la fabricación de un medicamento para el tratamiento o la profilaxis de enfermedades. Los ejemplos preferidos de los aspectos de esta invención incluyen:
(75) una composición farmacéutica que comprende un vehículo o diluyente farmacéuticamente aceptable y al menos un copolímero o una sal farmacológicamente aceptable del mismo de la presente invención según uno cualquiera de (1) a (74);
(76) una composición farmacéutica según (75), en la que dicha composición comprende además al menos una proteína o un análogo o una variante de la misma;
(77) una composición farmacéutica según (76), en la que la proteína o un análogo o una variante de la misma es una proteína básica;
(78) una composición farmacéutica según (77), en la que la proteína básica es un factor de crecimiento de fibroblastos básico (bFGF), un factor de crecimiento epidérmico (EGF), un factor inhibidor de la osteoclastogénesis (OCIF), un factor de crecimiento derivado de plaquetas (PDGF), un factor neurotrófico derivado de cerebro (BDNF), un factor de crecimiento nervioso (NGF), una hormona del crecimiento humana (HGH), un factor de crecimiento de hepatocitos (HGF), o un factor de crecimiento endotelial vascular (VEGF), o un análogo o variante de los mismos;
(79) una composición farmacéutica según (77), en la que la proteína básica es un factor inhibidor de la osteoclastogénesis (OCIF) o un análogo o variante del mismo;
(80) una composición farmacéutica según (79), en la que dicho OCIF o un análogo o variante del mismo es OCIF de tipo natural o de tipo recombinante;
(81) una composición farmacéutica según (79), en la que dicho OCIF o un análogo o variante del mismo es un monómero o un dímero;
(82) una composición farmacéutica según (79), en la que dicho OCIF es un monómero de OCIF humano que tiene un peso molecular tal como se mide mediante SDS-PAGE en condiciones no reductoras de aproximadamente 60000 o un dímero de OCIF humano que tiene un peso molecular de aproximadamente 120000 tal como se mide mediante SDS-PAGE en condiciones no reductoras;
(83) una composición farmacéutica según (79), en la que dicho OCIF comprende los aminoácidos -21 a +380 de la SEQ. ID. NO.1 de la lista de secuencias;
(84) una composición farmacéutica según (79), en la que dicho OCIF comprende los aminoácidos +1 a +380 de la SEQ. ID. NO.1 de la lista de secuencias;
(85) un modificador que puede modificar una proteína o un análogo o una variante de la misma, comprendiendo dicho modificador el copolímero o una sal farmacológicamente aceptable del mismo según uno cualquiera de (1) a (74);
(86) un modificador que puede modificar una proteína o un análogo o una variante de la misma según (85), en el que la proteína es una proteína básica;
(87) un modificador que puede modificar una proteína o un análogo o una variante de la misma según (86), en el que la proteína básica es un factor de crecimiento de fibroblastos básico (bFGF), un factor de crecimiento epidérmico (EGF), un factor inhibidor de la osteoclastogénesis (OCIF), un factor de crecimiento derivado de plaquetas (PDGF), un factor neurotrófico derivado de cerebro (BDNF), un factor de crecimiento nervioso (NGF), una hormona del crecimiento humana (HGH), un factor de crecimiento de hepatocitos (HGF), o un factor de crecimiento endotelial vascular (VEGF), o un análogo o variante de los mismos;
(88) un modificador que puede modificar una proteína o un análogo o una variante de la misma según (86), en el que la proteína básica es un factor inhibidor de la osteoclastogénesis (OCIF) o un análogo o variante del mismo;
(89) un modificador que puede modificar una proteína o un análogo o una variante de la misma según (88), en el que dicho OCIF o un análogo o variante del mismo es OCIF de tipo natural o de tipo recombinante;
(90) un modificador que puede modificar una proteína o un análogo o una variante de la misma según (88), en el que dicho OCIF o un análogo o variante del mismo es un monómero o un dímero;
(91) un modificador que puede modificar una proteína o un análogo o una variante de la misma según (88), en el que dicho OCIF es un monómero de OCIF humano que tiene un peso molecular tal como se mide mediante SDS-PAGE en condiciones no reductoras de aproximadamente 60000 o un dímero de OCIF humano que tiene un peso molecular de aproximadamente 120000 tal como se mide mediante SDS-PAGE en condiciones no reductoras;
(92) un modificador que puede modificar una proteína o un análogo o una variante de la misma según (88), en el que dicho OCIF comprende los aminoácidos -21 a +380 de la SEQ. ID. NO.1 de la lista de secuencias;
(93) un modificador que puede modificar una proteína o un análogo o una variante de la misma según (88), en el que dicho OCIF comprende los aminoácidos +1 a +380 de la SEQ. ID. NO.1 de la lista de secuencias;
(94) un complejo que comprende al menos una proteína o un análogo o una variante de la misma que está unido a al menos un copolímero o una sal farmacológicamente aceptable del mismo según uno cualquiera de (1) a (74);
(95) un complejo según (94), en el que la proteína es una proteína básica;
(96) un complejo según (95), en el que la proteína básica es un factor de crecimiento de fibroblastos básico (bFGF), un factor de crecimiento epidérmico (EGF), un factor inhibidor de la osteoclastogénesis (OCIF), un factor de crecimiento derivado de plaquetas (FDGF), un factor neurotrófico derivado de cerebro (BDNF), un factor de crecimiento nervioso (NGF), una hormona del crecimiento humana (HGH), un factor de crecimiento de hepatocitos (HGF), o un factor de crecimiento endotelial vascular (VEGF), o un análogo o variante de los mismos;
(97) un complejo según (95), en el que la proteína básica es un factor inhibidor de la osteoclastogénesis (OCIF) o un análogo o variante de los mismos;
(98) un complejo según (97), en el que dicho OCIF o un análogo o variante del mismo es OCIF de tipo natural o de tipo recombinante;
(99) un complejo según (97), en el que dicho OCIF o un análogo o variante del mismo es un monómero o un dímero;
(100) un complejo según (97), en el que dicho OCIF es un monómero de OCIF humano que tiene un peso molecular tal como se mide mediante SDS-PAGE en condiciones no reductoras de aproximadamente 60000 o un dímero de OCIF humano que tiene un peso molecular de aproximadamente 120000 tal como se mide mediante SDS-PAGE en condiciones no reductoras;
(101) un complejo según (97), en el que dicho OCIF comprende los aminoácidos -21 a +380 de la SEQ. ID. NO.1 de la lista de secuencias;
(102) un complejo según (97), en el que dicho OCIF comprende los aminoácidos +1 a +380 de la SEQ. ID. NO.1 de la lista de secuencias;
(103) una composición farmacéutica que comprende una cantidad eficaz de un agente farmacológicamente activo junto con un vehículo o diluyente del mismo, en la que dicho agente farmacológicamente activo está en forma de un complejo según uno cualquiera de (94) a (102);
(104) un método para prolongar el tiempo que una proteína o un análogo o una variante de la misma se retiene en la circulación sanguínea tras la administración a un paciente complejando dicha proteína o un análogo o una variante de la misma con al menos un copolímero o una sal farmacológicamente aceptable del mismo según uno cualquiera de (1) a (74);
(105) un método según (104), en el que la proteína es una proteína básica;
(106) un método según (105), en el que la proteína básica es un factor de crecimiento de fibroblastos básico (bFGF), un factor de crecimiento epidérmico (EGF), un factor inhibidor de la osteoclastogénesis (OCIF), un factor de crecimiento derivado de plaquetas (PDGF), un factor neurotrófico derivado de cerebro (BDNF), un factor de crecimiento nervioso (NGF), una hormona del crecimiento humana (HGH), un factor de crecimiento de hepatocitos (HGF), o un factor de crecimiento endotelial vascular (VEGF), o un análogo o variante de los mismos;
(107) un método según (105), en el que la proteína básica es un factor inhibidor de la osteoclastogénesis (OCIF) o un análogo o variante del mismo;
(108) un método según (107), en el que dicho OCIF o un análogo o variante del mismo es OCIF de tipo natural o de tipo recombinante;
(109) un método según (107), en el que dicho OCIF o un análogo o variante del mismo es un monómero o un dímero;
(110) un método según (107), en el que dicho OCIF es un monómero de OCIF humano que tiene un peso molecular tal como se mide mediante SDS-PAGE en condiciones no reductoras de aproximadamente 60000 o un dímero de OCIF humano que tiene un peso molecular de aproximadamente 120000 tal como se mide mediante SDS-PAGE en condiciones no reductoras;
(111) un método según (107), en el que dicho OCIF comprende los aminoácidos -21 a +380 de la SEQ. ID. NO.1 de la lista de secuencias;
(112) un método según (107), en el que dicho OCIF comprende los aminoácidos +1 a +380 de la SEQ. ID. NO.1 de la lista de secuencias;
(113) un método para el tratamiento o la profilaxis de una enfermedad en un paciente que es susceptible a una proteína o un análogo o una variante de la misma que comprende administrar a dicho paciente una cantidad eficaz de un complejo que comprende dicha proteína o un análogo o una variante de la misma que está unido a al menos un copolímero o una sal farmacológicamente aceptable del mismo según uno cualquiera de (1) a (74);
(114) un método según (113), en el que la proteína es una proteína básica;
(115) un método según (114), en el que la proteína básica es un factor de crecimiento de fibroblastos básico (bFGF), un factor de crecimiento epidérmico (EGF), un factor inhibidor de la osteoclastogénesis (OCIF), un factor de crecimiento derivado de plaquetas (PDGF), un factor neurotrófico derivado de cerebro (BDNF), un factor de crecimiento nervioso (NGF), una hormona del crecimiento humana (HGH), un factor de crecimiento de hepatocitos (HGF), o un factor de crecimiento endotelial vascular (VEGF), o un análogo o variante de los mismos;
(116) un método según (114), en el que la proteína básica es un factor inhibidor de la osteoclastogénesis (OCIF) o un análogo o variante del mismo;
(117) una composición farmacéutica según (116), en la que dicho OCIF o un análogo o variante del mismo es OCIF de tipo natural o de tipo recombinante;
(118) un método según (116), en el que dicho OCIF o un análogo o variante del mismo es un monómero o un dímero;
(119) un método según (116), en el que dicho OCIF es un monómero de OCIF humano que tiene un peso molecular tal como se mide mediante SDS-PAGE en condiciones no reductoras de aproximadamente 60000 o un dímero de OCIF humano que tiene un peso molecular de aproximadamente 120000 tal como se mide mediante SDS-PAGE en condiciones no reductoras;
(120) un método según (116), en el que dicho OCIF comprende los aminoácidos -21 a +380 de la SEQ. ID. NO.1 de la lista de secuencias;
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(121) un método según (116), en el que dicho OCIF comprende los aminoácidos +1 a +380 de la SEQ. ID. NO.1 de la lista de secuencias;
(122) un método según uno cualquiera de (116) a (121), en el que dicha enfermedad es una enfermedad metabólica ósea;
(123) use de complejo que comprende una proteína o un análogo o una variante de la misma que está unido a al menos un copolímeroo una sal farmacológicamente aceptable del mismo según uno cualquiera de (1) a (74) en la fabricación de un medicamento para la profilaxis o el tratamiento de una enfermedad susceptible a dicha proteína o un análogo o una variante de la misma;
(124) uso según (122), en el que la proteína es una proteína básica;
(125) uso según (123), en el que la proteína básica es un factor de crecimiento de fibroblastos básico (bFGF), un factor de crecimiento epidérmico (EGF), un factor inhibidor de la osteoclastogénesis (OCIF), un factor de crecimiento derivado de plaquetas (PDGF), un factor neurotrófico derivado de cerebro (BDNF), un factor de crecimiento nervioso (NGF), una hormona del crecimiento humana (HGH), un factor de crecimiento de hepatocitos (HGF), o un factor de crecimiento endotelial vascular (VEGF), o un análogo o variante de los mismos;
(126) uso según (123), en el que la proteína básica es un factor inhibidor de la osteoclastogénesis (OCIF) o un análogo o variante del mismo;
(127) uso según (126), en el que dicho OCIF o un análogo o variante del mismo es OCIF de tipo natural o de tipo recombinante;
(128) uso según (126), en el que dicho OCIF o un análogo o variante del mismo es un monómero o un dímero;
(129) uso según (126), en el que dicho OCIF es un monómero de OCIF humano que tiene un peso molecular tal como se mide mediante SDS-PAGE en condiciones no reductoras de aproximadamente 60000 o un dímero de OCIF humano que tiene un peso molecular de aproximadamente 120000 tal como se mide mediante SDS-PAGE en condiciones no reductoras;
(130) uso según (126), en el que dicho OCIF comprende los aminoácidos -21 a +380 de la SEQ. ID. NO.1 de la lista de secuencias;
(131) uso según (126), en el que dicho OCIF comprende los aminoácidos +1 a +380 de la SEQ. ID. NO.1 de la lista de secuencias; y
(132) uso según uno cualquiera de (126) a (131), en el que dicha enfermedad es una enfermedad metabólica ósea.
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El "grupo alquileno que tiene desde 1 hasta 6 átomos de carbono" en la definición del sustituyente Alk en la fórmula (I) anterior es un grupo alquileno de cadena lineal o ramificada que tiene desde 1 hasta 6 átomos de carbono tal como un grupo metileno, metilmetileno, etileno, propileno, trimetileno, tetrametileno, 1-metiltrimetileno, 2-metiltrimetileno, 3-metiltrimetileno, pentametileno o hexametileno. Entre estos grupos alquileno, se prefieren los grupos alquileno de cadena lineal o ramificada que tienen de 1 a 4 átomos de carbono, se prefieren más los grupos etileno o trimetileno y un grupo etileno es el más preferido.
El grupo alquilo en el "grupo alquilo que tiene desde 1 hasta 6 átomos de carbono que puede estar opcionalmente sustituido con al menos un sustituyente seleccionado del grupo que consiste en grupos hidroxilo, átomos de halógeno y grupos arilo que tienen desde 6 hasta 14 átomos de carbono que pueden estar opcionalmente sustituidos con desde 1 hasta 5 sustituyentes seleccionados de los sustituyentes A definidos a continuación" en la definición de los sustituyentes R^{1}; R^{2}, R^{4}, R^{5} y sustituyentes A en las fórmulas (I) y (II) anteriores es un grupo alquilo de cadena lineal o ramificada que tiene desde 1 hasta 6 átomos de carbono tal como un grupo metilo, etilo, n-propilo, isopropilo, n-butilo, isobutilo, s-butilo, terc-butilo, n-pentilo, isopentilo, 2-metilbutilo, neopentilo, 1-etilpropilo, n-hexilo, isohexilo, 4-metilpentilo, 3-metilpentilo, 2-metilpentilo, 1-metilpentilo, 3,3-dimetilbutilo, 2,2-dimetilbutilo, 1,1-dimetilbutilo, 1,2-dimetilbutilo, 1,3-dimetilbutilo, 2,3-dimetilbutilo o 2-etilbutilo. Entre estos grupos alquilo, se prefieren los grupos alquilo de cadena lineal o ramificada que tienen de 1 a 4 átomos de carbono, se prefieren más los grupos metilo y etilo y un grupo metilo es el más preferido.
El grupo alcoxilo en el "grupo alcoxilo que tiene desde 1 hasta 6 átomos de carbono que puede estar opcionalmente sustituido con al menos un sustituyente seleccionado del grupo que consiste en grupos hidroxilo, átomos de halógeno y grupos arilo que tienen desde 6 hasta 14 átomos de carbono que pueden estar opcionalmente sustituidos con desde 1 hasta 5 sustituyentes seleccionados de los sustituyentes A definidos a continuación" en la definición del sustituyente R^{3} y los sustituyentes A en las fórmulas (I) y (II) anteriores es un sustituyente en el que el grupo alquilo que tiene desde 1 hasta 6 átomos de carbono mencionado anteriormente está unido a un átomo de oxígeno. Los ejemplos de un grupo alcoxilo de este tipo incluyen grupos alcoxilo de cadena lineal o ramificada que tienen de 1 a 6 átomos de carbono tales como grupos metoxilo, etoxilo, n-propoxilo, isopropoxilo, n-butoxilo, isobutoxilo, s-butoxilo, terc-butoxilo, n-pentiloxilo, isopentiloxilo, 2-metilbutoxilo, neopentiloxilo, n-hexiloxilo, 4-metilpentiloxilo, 3-metilpentiloxilo, 2-metil-pentiloxilo, 3,3-dimetilbutoxilo, 2,2-dimetilbutoxilo, 1,1-dimetilbutoxilo, 1,2-dimetilbutoxilo, 1,3-dimetilbutoxilo y 2,3-dimetilbutoxilo. Entre estos grupos alcoxilo, se prefieren más los grupos alcoxilo de cadena lineal o ramificada que tienen desde 1 hasta 4 átomos de carbono y un grupo etoxilo es el más preferido.
El "átomo de halógeno" que es uno de los "sustituyentes A" anteriores, es un sustituyente opcional en el "grupo alquilo que tiene desde 1 hasta 6 átomos de carbono que puede estar opcionalmente sustituido con al menos un sustituyente seleccionado del grupo que consiste en grupos hidroxilo, átomos de halógeno y grupos arilo que tienen desde 6 hasta 14 átomos de carbono que pueden estar opcionalmente sustituidos con desde 1 hasta 5 sustituyentes seleccionados de los sustituyentes A definidos a continuación" en la definición de los sustituyentes R^{1}, R^{2}, R^{4} y R^{5} en las fórmulas (I) y (II) anteriores y es un sustituyente opcional en el "grupo alcoxilo que tiene desde 1 hasta 6 átomos de carbono que puede estar opcionalmente sustituido con al menos un sustituyente seleccionado del grupo que consiste en grupos hidroxilo, átomos de halógeno y grupos arilo que tienen desde 6 hasta 14 átomos de carbono que pueden estar opcionalmente sustituidos con desde 1 hasta 5 sustituyentes seleccionados de los sustituyentes A definidos a continuación" en la definición del sustituyente R^{3} en la fórmula (II) anterior es un átomo de flúor, un átomo de cloro, un átomo de bromo o un átomo de yodo; y preferiblemente es un átomo de flúor o un átomo de cloro.
El "grupo arilo que tiene desde 6 hasta 14 átomos de carbono" que es un sustituyente opcional en el "grupo alquilo que tiene desde 1 hasta 6 átomos de carbono que puede estar opcionalmente sustituido con al menos un sustituyente seleccionado del grupo que consiste en grupos hidroxilo, átomos de halógeno y grupos arilo que tienen desde 6 hasta 14 átomos de carbono que pueden estar opcionalmente sustituidos con desde 1 hasta 5 sustituyentes seleccionados de los sustituyentes A definidos a continuación" en la definición de los sustituyentes R^{1}, R^{2}, R^{4} y R^{5} y un sustituyente opcional en el "grupo alcoxilo que tiene desde 1 hasta 6 átomos de carbono que puede estar opcionalmente sustituido con al menos un sustituyente seleccionado del grupo que consiste en grupos hidroxilo, átomos de halógeno y grupos arilo que tienen desde 6 hasta 14 átomos de carbono" en la definición del sustituyente R^{3} en la fórmula (II) anterior es un grupo de hidrocarburo aromático que tiene desde 6 hasta 14 átomos de carbono y puede ser, por ejemplo, un grupo fenilo, indenilo, naftilo, fenantrilo o antrilo. Preferiblemente es un grupo fenilo.
El "grupo ariloxilo que tiene desde 6 hasta 14 átomos de carbono que puede estar opcionalmente sustituido con desde 1 hasta 5 sustituyentes seleccionados de los sustituyentes A" en la definición del sustituyente R^{3} en la fórmula (II) anterior es un grupo arilo tal como se definió anteriormente que está unido a un átomo de oxígeno y puede ser, por ejemplo, un grupo fenoxilo, indeniloxilo, naftiloxilo, fenantriloxilo o antriloxilo. Preferiblemente es un grupo fenoxilo.
El "grupo alquilo que tiene desde 1 hasta 6 átomos de carbono que está opcionalmente sustituido con al menos un átomo de halógeno" en la definición de los sustituyentes R^{1}, R^{2}, R^{4} y R^{5} en las fórmulas (I) y (II) anteriores es un grupo alquilo que tiene desde 1 hasta 6 átomos de carbono tal como se describió anteriormente que está sustituido con al menos un átomo de halógeno tal como se describió anteriormente y puede ser, por ejemplo, un grupo trifluorometilo, un grupo triclorometilo, un grupo difluorometilo, un grupo diclorometilo, un grupo dibromometilo, un grupo fluorometilo, un grupo 2,2,2-trifluoroetilo, un grupo 2,2,2-tricloroetilo grupo, un grupo 2-bromoetilo, un grupo 2-cloroetilo, un grupo 2-fluoroetilo, un grupo 2-yodoetilo, un grupo 3-cloropropilo, un grupo 4-fluorobutilo, un grupo 6-yodohexilo, un grupo 2,2-dibromoetilo o un grupo pentafluoroetilo. Preferiblemente es un grupo trifluorometilo, un grupo triclorometilo, un grupo difluorometilo o un grupo pentafluoroetilo; y lo más preferiblemente e un grupo trifluorometilo.
Los ejemplos del "grupo alquilo que tiene desde 1 hasta 6 átomos de carbono que está opcionalmente sustituido con al menos un grupo hidroxilo" en la definición de los sustituyentes R^{1}, R^{4} y R^{5} en las fórmulas (I) y (II) anteriores incluyen un grupo hidroximetilo, un grupo 1-hidroxietilo, un grupo 1-hidroxipropilo y un grupo 2-hidroxipropilo.
El "grupo alcoxilo que tiene desde 1 hasta 6 átomos de carbono que está opcionalmente sustituido con al menos un átomo de halógeno" en las definiciones del sustituyente R^{3} en la fórmula (II) anterior es un grupo alcoxilo que tiene desde 1 hasta 6 átomos de carbono tal como se describió anteriormente que está sustituido con al menos un átomo de halógeno tal como se describió anteriormente y puede ser, por ejemplo, un grupo trifluorometoxilo, un grupo triclorometoxilo, un grupo difluorometoxilo, un grupo diclorometoxilo, un grupo dibromometoxilo, un grupo fluorometoxilo, un grupo 2,2,2-trifluoroetoxilo, un grupo 2,2,2-tricloroetoxilo, un grupo 2-bromoetoxilo, un grupo 2-cloroetoxilo, un grupo 2-fluoroetoxilo, un grupo 2-yodoetoxilo, un grupo 3-cloropropoxilo, un grupo 4-fluorobutoxilo, un grupo 6-yodohexiloxilo, un grupo 2,2-dibromoetoxilo o un grupo pentafluoroetoxilo; preferiblemente es un grupo alcoxilo C_{1}-C_{4} sustituido con átomos de flúor o cloro tal como un grupo trifluorometoxilo, un grupo triclorometoxilo, un grupo difluorometoxilo o un grupo pentafluoroetoxilo. Más preferiblemente es un grupo trifluorometoxilo.
Los ejemplos del "grupo alcoxilo que tiene desde 1 hasta 6 átomos de carbono que está opcionalmente sustituido con al menos un grupo hidroxilo" en la definición del sustituyente R^{3} en la fórmula (II) anterior incluyen un grupo hidroximetoxilo, un grupo 1-hidroxietoxilo, un grupo 1-hidroxipropoxilo y un grupo 2-hidroxipropoxilo.
El "grupo alquilo que tiene desde 1 hasta 6 átomos de carbono que está opcionalmente sustituido con al menos un grupo arilo que tiene desde 6 hasta 14 átomos de carbono que puede estar opcionalmente sustituido con desde 1 hasta 5 sustituyentes seleccionados de los sustituyentes A" en la definición de los sustituyentes R^{1}, R^{2}, R^{4} y R^{5} en las fórmulas (I) y (II) anteriores puede ser, por ejemplo, un grupo bencilo, un grupo 1-naftilmetilo, un grupo 2-naftilmetilo, un grupo indenilmetilo, un grupo 1-fenetilo, un grupo 2-fenetilo, un grupo 1-naftiletilo, un grupo 2-naftiletilo, un grupo 1-fenilpropilo, un grupo 2-fenilpropilo, un grupo 3-fenilpropilo, un grupo 1-naftilpropilo, un grupo 2-naftilpropilo, un grupo 3-naftilpropilo, un grupo 1-fenilbutilo, un grupo 2-fenilbutilo, un grupo 3-fenilbutilo, un grupo 4-fenilbutilo, un grupo 1-naftilbutilo, un grupo 2-naftilbutilo, un grupo 3-naftilbutilo, un grupo 4-naftilbutilo, un grupo 1-fenilpentilo, un grupo 2-fenilpentilo, un grupo 3-fenilpentilo, un grupo 4-fenilpentilo, un grupo 5-fenilpentilo, un grupo 1-fenilhexilo, un grupo 2-fenilhexilo, un grupo 3-fenilhexilo, un grupo 4-fenilhexilo, un grupo 5-fenilhexilo o un grupo 6-fenilhexilo; preferiblemente es un alquilo sustituido con un grupo arilo que tiene desde 6 hasta 10 átomos de carbono tal como un grupo bencilo, un grupo 1-naftilmetilo, un grupo 2-naftilmetilo, un grupo 1-fenetilo, un grupo 2-fenetilo, un grupo 1-naftiletilo, un grupo 2-naftiletilo, un grupo 1-fenilpropilo, un grupo 2-fenilpropilo, un grupo 3-fenilpropilo o un grupo 1-naftilpropilo; y más preferiblemente es un grupo bencilo.
El "grupo alcoxilo que tiene desde 1 hasta 6 átomos de carbono que está opcionalmente sustituido con al menos un grupo ariloque tiene desde 6 hasta 14 átomos de carbono que puede estar opcionalmente sustituido con desde 1 hasta 5 sustituyentes seleccionados de los sustituyentes A" en la definición del sustituyente R^{3} en la fórmula (II) anterior puede ser, por ejemplo, un grupo benzoxilo, un grupo 1-naftilmetoxilo, un grupo 2-naftilmetoxilo, un grupo indenilmetoxilo, un grupo 1-fenetoxilo, un grupo 2-fenetoxilo, un grupo 1-naftiletoxilo, un grupo 2-naftiletoxilo, un grupo 1-fenilpropoxilo, un grupo 2-fenilpropoxilo, un grupo 3-fenilpropoxilo, un grupo 1-naftilpropoxilo, un grupo 2-naftilpropoxilo, un grupo 3-naftilpropoxilo, un grupo 1-fenilbutoxilo, un grupo 2-fenilbutoxilo, un grupo 3-fenilbutoxilo, un grupo 4-fenilbutoxilo, un grupo 1-naftilbutoxilo, un grupo 2-naftilbutoxilo, un grupo 3-naftilbutoxilo, un grupo 4-naftilbutoxilo, un grupo 1-fenilpentoxilo, un grupo 2-fenilpentoxilo, un grupo 3-fenilpentoxilo, un grupo 4-fenilpentoxilo, un grupo 5-fenilpentoxilo, un grupo 1-fenilhexiloxilo, un grupo 2- fenilhexiloxilo, un grupo 3-fenilhexiloxilo, un grupo 4-fenilhexiloxilo, un grupo 5-fenilhexiloxilo o un grupo 6-fenilhexiloxilo; preferiblemente es un alquilo sustituido con un grupo arilo que tiene desde 6 hasta 10 átomos de carbono tal como un grupo benzoxilo, un grupo 1-naftilmetoxilo, un grupo 2-naftilmetoxilo, un grupo 1-fenetoxilo, un grupo 2-fenetoxilo, un grupo 1-naftiletoxilo, un grupo 2-naftiletoxilo, un grupo 1-fenilpropoxilo, un grupo 2-fenilpropoxilo, un grupo 3-fenilpropoxilo o un grupo 1-naftilpropoxilo; y más preferiblemente es un grupo benzoxilo.
Cuando R^{3} es un grupo "grupo ariloxilo que tiene desde 6 hasta 14 átomos de carbono que puede estar opcionalmente sustituido con desde 1 hasta 5 sustituyentes seleccionados de los sustituyentes A", es preferiblemente un grupo ariloxilo que tiene desde 6 hasta 10 átomos de carbono que está opcionalmente sustituido con desde 1 hasta 3 sustituyentes seleccionados del grupo A de sustituyentes; más preferiblemente, es un grupo fenoxilo que está opcionalmente sustituido con desde 1 hasta 3 sustituyentes seleccionados del grupo A de sustituyentes; todavía más preferiblemente, es un grupo fenoxilo opcionalmente sustituido con desde 1 hasta 3 átomos de halógeno, grupos alquilo que tienen desde 1 hasta 6 átomos de carbono, grupos hidroxilo o grupos nitro; y, lo más preferiblemente, es un grupo fenoxilo o un grupo p-nitrofenoxilo.
Cuando el copolímero de la presente invención tiene un grupo básico, el compuesto puede convertirse en una sal farmacológicamente aceptable del mismo haciendo reaccionar algunos o todos estos grupos básicos con un ácido. Además, los copolímeros de la presente invención tienen grupos carboxilo ácidos y el copolímero puede convertirse en una sal farmacológicamente aceptable del mismo haciendo reaccionar algunos o todos estos grupos carboxilo con una base.
Los ejemplos preferidos de las sales farmacológicamente aceptables formadas con un grupo básico presente en los copolímeros de la presente invención incluyen sales de ácidos inorgánicos tales como sales de ácidos hidrohalogenados (por ejemplo clorhidratos, bromhidratos y yodhidratos), nitratos, percloratos, sulfatos y fosfatos; sales de ácidos orgánicos tales como alcanosulfonatos inferiores en los que el resto de alquilo inferior de los mismos es tal como se definió anteriormente (por ejemplo metanosulfonatos, trifluorometanosulfonatos y etanosulfonatos), arilsulfonatos en los que el resto de arilo de los mismos es tal como se definió anteriormente (por ejemplo bencenosulfonato o p-toluenosulfonato), acetatos, malatos, fumaratos, succinatos, citratos, ascorbatos, tartratos, oxalatos y maleatos; y sales de aminoácidos tales como sales de glicina, sales de lisina, sales de arginina, sales ornitina, glutamatos y aspartatos. Se prefieren particularmente las sales de ácido hidrohalogenado.
Los ejemplos preferidos de las sales farmacológicamente aceptables formadas con un grupo carboxilo ácido presente en los copolímeros de la presente invención incluyen sales metálicas tales como sales de metales alcalinos (por ejemplo sales de sodio, sales de potasio y sales de litio), sales de metales alcalinotérreos (por ejemplo sales de calcio y sales de magnesio), sales metálicas tales como sales de aluminio, sales de hierro, sales de zinc, sales de cobre, sales de níquel y sales de cobalto; sales amina tales como sales de amina inorgánicas (por ejemplo sales de amonio) y sales de amina orgánicas (por ejemplo sales de t-octilamina, sales de dibencilamina, sales de morfolina, sales de glucosamina, sales de éster de fenilglicinalquilo, sales de etilendiamina, sales de N-metilglucamina, sales de guanidina, sales de dietilamina, sales de trietilamina, sales de diciclohexilamina, sales de N,N'-dibenciletilendiamina, sales de cloroprocaína, sales de procaína, sales de dietanolamina, sales de N-bencilfenetilamina, sales de piperazina, sales de tetrametilamonio y sales de tris(hidroximetil)aminometano; y sales de aminoácidos tales como sales de glicina, sales de lisina, sales de arginina, sales de ornitina, glutamatos y aspartatos. Se prefieren particularmente las sales de metales alcalinos y las sales de metales alcalinotérreos.
En la presente invención, la "unidad estructural" se define como una unidad constitucional mínima del copolímero de la invención y se describe en la definición del copolímero anterior como una unidad de fórmula (I) o una unidad de fórmula (II). La "unidad estructural" no es la estructura de un material de partida monomérico usado en una reacción de polimerización en la síntesis de un copolímero de la presente invención; sino que es la unidad que se deriva de dicho material de partida monomérico y está presente en dicho copolímero de la presente invención.
En la presente invención, la expresión "secuencia de cabeza-cabeza" significa que las unidades estructurales representadas por las fórmulas (I) y (II) están dispuestas tal como se muestra mediante la siguiente fórmula:
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12
En la presente invención, la expresión "secuencia de cabeza-cola" significa que las unidades estructurales representadas por las fórmulas (I) y (II) están dispuestas tal como se muestra mediante la siguiente fórmula:
\vskip1.000000\baselineskip
13
En la presente invención, los copolímeros y las sales farmacológicamente aceptables de los mismos pueden ser copolímeros alternantes o copolímeros al azar. Los copolímeros alternantes son aquéllos en los que la razón de las unidades estructurales de fórmula (I) con respecto a las unidades estructurales de fórmula (II) es de 1:1 y las unidades estructurales representadas por la fórmula (I) y las unidades estructurales representadas por la fórmula (II) están dispuestas en una secuencia alternante de cabeza-cabeza, una secuencia alternante de cabeza-cola o una secuencia alternante mixta de cabeza-cabeza y cabeza-cola. Los copolímeros al azar son aquéllos en los que las unidades estructurales representadas por la fórmula (I) y las unidades estructurales representadas por la fórmula (II) están dispuestas en una secuencia al azar.
En la presente invención, la "razón de composición" es la razón promedio del número de unidades estructurales representadas por la fórmula (I) con respecto al número de unidades estructurales representadas por la fórmula (II) en un copolímero de la presente invención. Cuando un copolímero es sustancialmente un copolímero alternante, la razón de composición será de 1:1. Sin embargo, cuando un copolímero es un copolímero al azar puede variarse dicha razón. En los copolímeros de la presente invención, no se limita particularmente dicha razón, y normalmente puede estar en el intervalo de desde 10:1 hasta 1:10; preferiblemente desde 3:1 hasta 1:8, más preferiblemente desde 2:1 hasta 1:2 o de 1:2 a 1:6, y lo más preferiblemente es o bien de 1:1 o bien desde 1:2 hasta 1:4. Debe observarse que los valores de la razón de composición varían algo de manera inevitable dependiendo de ligeros cambios en los materiales de partida y las condiciones de polimerización. Como resultado, las razones de composición dadas son valores aproximados; todavía se considera que variaciones de hasta \pm30% en los valores para las razones de composición dadas anteriormente están dentro del alcance de dichas razones.
La razón de composición de los copolímeros de la presente invención puede determinarse usando técnicas analíticas conocidas. Determinando el contenido en grupos carboxilo del copolímero (mmol/g) mediante valoración conductimétrica [requiriendo la determinación la preparación del correspondiente copolímero completamente hidrolizado (es decir R^{3} es OH), o bien hidrolizando el copolímero que se está analizando o bien sintetizando el correspondiente copolímero hidrolizado por separado] y a partir de un conocimiento de los pesos fórmula de cada una de las unidades estructurales de dicho copolímero, es posible determinar la razón de composición usando la siguiente fórmula:
Rii/Ri = (C x FWi)/(2000 - C x FWii)
en la que Ri es el número promedio de unidades estructurales (I), Rii es el número promedio de unidades estructurales (II), C es el contenido en grupos carboxilo del copolímero (mmol/g), FWi es el peso fórmula de la unidad estructural (I) y FWii es el peso fórmula de la unidad estructural (II).
Generalmente, el peso molecular de un polímero se determina como un peso molecular relativo respecto al de un compuesto patrón que contiene una estructura similar a la de dicho polímero y que tiene un valor de peso molecular absoluto conocido. Con frecuencia se usa un método de evaluación de este tipo en la determinación del peso molecular de copolímeros novedosos tales como los de la presente invención.
El peso molecular promedio del copolímero de la presente invención es el valor medido mediante cromatografía de filtración en gel usando un polímero que tiene un peso molecular absoluto conocido como un compuesto patrón. La naturaleza del gel, las condiciones de elución y el polímero de peso molecular absoluto conocido usado como la comparación pueden elegirse de manera apropiada por el experto usando técnicas conocidas y el conocimiento general, por ejemplo, véase "Comprehensive Polymer Science", pub. Pergamon Press (Oxford) 1989. El compuesto patrón usado para fines de comparación es preferiblemente un polímero que tiene una estructura y propiedades similares. Para los copolímeros de la presente invención, se considera que la parte de cadena lateral es una estructura característica. Por tanto, el compuesto patrón usado para la comparación es preferiblemente un polímero que contiene una estructura similar a la de la parte de cadena lateral del copolímero de la presente invención cuyo peso molecular promedio ha de medirse. Más preferiblemente el compuesto patrón usado es un poli(etilenoglicol).
En la presente invención, el "grado promedio de polimerización" es un valor promedio del grado de polimerización de las unidades estructurales en el copolímero de la presente invención, es decir es el número promedio de unidades estructurales en dicho copolímero. Se determina basándose en el peso molecular promedio del copolímero, los pesos fórmula de cada una de las unidades estructurales de dicho copolímero y la razón de composición de las unidades estructurales de dicho copolímero. El "grado promedio de polimerización" de un copolímero de la presente invención que tiene unidades estructurales I y II puede calcularse usando la siguiente fórmula:
Grado promedio de polimerización = Mc/(FWi x Ri + FWii x Rii)
en la que Mc es el peso molecular promedio del copolímero, Fwi y Fwii son los pesos fórmula para cada una las unidades estructurales I y II respectivamente y Ri y Rii representan las proporciones de las unidades estructurales I y II en el copolímero calculadas a partir de la razón de composición (razón de composición = Ri:Rii; Ri + Rii = 1).
En la fórmula anterior para determinar el grado promedio de polimerización de un copolímero de la presente invención, el valor de la razón de composición de las unidades estructurales, el peso molecular promedio del copolímero y los pesos fórmula de las unidades estructurales pueden determinarse todos tal como se discutió anteriormente. Con el fin de hacerlo, es necesario preparar el correspondiente copolímero completamente hidrolizado, amonolizado, aminolizado o alcoholizado (preferiblemente el correspondiente copolímero completamente hidrolizado). Alternativamente, si el copolímero de partida usado en la preparación del copolímero de la presente invención es de composición conocida, estos valores pueden determinarse sin necesidad de análisis. El grado promedio de polimerización en los copolímeros de la presente invención no se limita particularmente. Normalmente, está en un intervalo de desde 5 hasta 200; preferiblemente es desde 5 hasta 50; más preferiblemente desde 5 hasta 20 o de 20 a 30 o de 30 a 40.
En los copolímeros de la presente invención, las unidades estructurales de fórmula (II) pueden comprender al menos una unidad estructural de fórmula (II) en la que R^{3} es un grupo alcoxilo opcionalmente substituido que tiene desde 1 hasta 6 átomos de carbono, un grupo ariloxilo opcionalmente substituido o un grupo representado por la fórmula -NR^{4}R^{5} y opcionalmente al menos una unidad estructural representada por la fórmula (II) en la que R^{3} es un grupo hidroxilo. La razón entre las unidades estructurales representadas por la fórmula (II) en la que R^{3} es un grupo hidroxilo y las unidades estructurales representadas por la fórmula (II) en la que R^{3} es un grupo alcoxilo opcionalmente substituido, un grupo ariloxilo opcionalmente substituido o un grupo representado por la fórmula -NR^{4}R^{5} se denomina la razón de hidrólisis. Determinando el contenido en grupos carboxilo del copolímero (mmol/g) mediante valoración conductimétrica y a partir de un conocimiento de los pesos fórmula de cada una de las unidades estructurales de dicho copolímero y la razón de composición (véase en lo anterior), es posible determinar la razón de hidrólisis H : A usando la siguiente fórmula:
\frac{A}{H+A} = \frac{2000 \ x \ (Rii/Ri) - Cx \ [FWi + FWii \ x \ (Rii/Ri)]}{(Rii/Ri) \ x \ [C \ x \ FW(A)ii - FWii) + 1000]}
en la que H : A es la razón de hidrólisis, Ri:Rii es la razón de composición, C es el contenido en grupos carboxilo del copolímero (mmol/g), FWi es el peso fórmula de la unidad estructural (I), FWii es el peso fórmula de la unidad estructural (II) en la que R^{3} es OH y FW(A)ii es el peso fórmula de la unidad estructural (II) en la que R^{3} es un grupo alcoxilo opcionalmente substituido, un grupo ariloxilo opcionalmente substituido o un grupo representado por la fórmula -NR^{4}R^{5}.
Los intervalos preferidos para la razón de hidrólisis son de 5:5 a 0:10, de 4:6 a 0:10, de 3:7 a 0:10, de 2:8 a 0:10 y de 1:9 a 0:10. Debe observarse que los valores de la razón de hidrólisis varían algo de manera inevitable dependiendo de ligeros cambios en los materiales de partida y las condiciones de reacción. Como resultado, la razón de hidrólisis indicada en la presente solicitud son valores aproximados; todavía se considera que las variaciones de hasta \pm30% en los valores la razón de hidrólisis indicados en la presente solicitud están dentro del alcance de dichas razones.
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El tamaño molecular de los copolímeros de la invención puede medirse usando técnicas analíticas conocidas tales como cromatografía de exclusión molecular usando proteínas de tamaño molecular conocido como patrones (los ejemplos 15 y 16 a continuación proporcionan ejemplos del uso de una técnica de este tipo). Usando cromatografía de exclusión molecular, el tamaño molecular de un copolímero se da como su radio de Stokes. En la presente invención, el tamaño molecular de los copolímeros no se limita particularmente. Normalmente, el radio de Stokes de los copolímeros de la presente invención es de 9,3 nm o inferior, preferiblemente es de 7,3 nm o inferior, más preferiblemente es de 6,2 nm o inferior, de 4,7 nm o inferior o de 3,1 nm o inferior, o está en un intervalo de desde 3,1 hasta 6,2 nm o de 1,5 a 4,7 nm.
Los copolímeros y las sales farmacológicamente aceptables de los mismos de la presente invención pueden obtenerse mediante una reacción de copolimerización adecuada conocida por los expertos en la técnica [véase, por ejemplo, "Comprehensive Polymer Science" publicado por Pergamon Press (Oxford) en 1989] usando monómeros representados por las siguientes fórmulas (IV) y (V):
14
(en las que m, Alk, y R^{1}, R^{2} y R^{3} son tal como se definieron anteriormente). Con el fin de obtener un copolímero que tenga un grado promedio de polimerización o peso molecular deseado particular, el copolímero obtenido puede fraccionarse usando cromatografía de filtración en gel.
Los monómeros se conocen en la técnica o pueden obtenerse fácilmente según un método bien conocido por los expertos en la técnica [véase, por ejemplo, J.M. Harris, "Laboratory synthesis of polyethylene glycol derivatives", Rev. Macromol. Chem. Phys. C25, 326-373 (1985) y la patente japonesa número 2621308]. Los monómeros representados por la fórmula (V) pueden obtenerse fácilmente sometiendo anhídrido maleico a una o más reacciones seleccionadas del grupo que consiste en (a) hidrólisis, (b) amonólisis, (c) aminólisis y (d) alcohólisis.
Alternativamente, pueden obtenerse un copolímero o una sal farmacológicamente aceptable del mismo sometiendo uno o más restos de anhídrido carboxílico de fórmula (III) en un copolímero que contiene, como unidades constitucionales,
(a) una o más unidades estructurales que pueden ser iguales o diferentes entre sí y que se representan mediante la fórmula (I) a continuación:
15
en la que:
m, Alk, R^{1} y R^{2} son tal como se definieron anteriormente, y
(b) dicha unidad estructural que comprende un resto de anhídrido carboxílico de fórmula (III):
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16 
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a una o más reacciones seleccionadas del grupo que consiste en (i) hidrólisis, (ii) amonólisis, (iii) aminólisis y (iv) alcohólisis. Los copolímeros de partida que tienen unidades de fórmulas (I) y (III) o bien se conocen bien en la técnica (por ejemplo, copolímeros tales como AM-0530K y AM-1510K pueden adquirirse de NOF Corporation) o bien pueden prepararse fácilmente según un método bien conocido por los expertos en la técnica [véase, por ejemplo, Yoshimoto et al., "Polyethylene glycol derivative-modified cholesterol oxidase soluble and active in benzene", Biochem. Biophys. Res. Comm. 148, 876-882 (1987), patente japonesa número 2621308, publicación de solicitud de patente japonesa número 2003-105040 y publicación de solicitud de patente japonesa número 2003-105003].
Para obtener un copolímero que tenga un grado promedio de polimerización deseado o peso molecular deseado, pude fraccionarse el copolímero obtenido mediante cromatografía de filtración en gel.
En la presente invención, los copolímeros de la presente invención pueden obtenerse sometiendo uno o más restos de anhídrido carboxílico de fórmula (III) a una o más reacciones seleccionadas del grupo que consiste en (i) hidrólisis, (ii) amonólisis, (iii) aminólisis y (iv) alcohólisis.
En la presente invención, "hidrólisis" significa una reacción de apertura de anillo de un resto de anhídrido carboxílico de fórmula (III) con agua para dar una unidad estructural de fórmula (II) en la que R^{3} es un grupo hidroxilo. La naturaleza de la reacción de hidrólisis real no se limita particularmente siempre que sea un método empleado comúnmente por los expertos en la técnica.
Los ejemplos de un disolvente adecuado que va a usarse en la reacción de hidrólisis incluyen: agua; éteres tales como dietil éter, diisopropil éter, tetrahidrofurano, dioxano, dimetoxietano y dietilenglicol-dimetil éter; y amidas tales como formamida, N,N-dimetilformamida, N,N-dimetilacetamida, N-metil-2-pirrolidona, N-metilpirrolidinona y hexametilfosforotriamida. De estos disolventes, se prefieren agua o dioxano.
El reactivo que va a usarse es, de manera adecuada, agua. Si se usa agua como disolvente, no existe la necesidad de añadir agua adicional. Adicionalmente, puede añadirse una base para el fin de acelerar la reacción. Ejemplos de una base de este tipo incluyen: bases inorgánicas tales como carbonatos de metales alcalinos (por ejemplo, carbonato de sodio, carbonato de potasio y carbonato de litio), hidrogenocarbonatos de metales alcalinos (por ejemplo, hidrogenocarbonato de sodio, hidrogenocarbonato de potasio e hidrogenocarbonato de litio), hidruros de metales alcalinos (por ejemplo, hidruro de litio, hidruro de sodio e hidruro de potasio), hidróxidos de metales alcalinos (por ejemplo, hidróxido de sodio, hidróxido de potasio, hidróxido de bario e hidróxido de litio), fluoruros de metales alcalinos (por ejemplo, fluoruro de sodio y fluoruro de potasio); y bases orgánicas tales como alcóxidos de metales alcalinos (por ejemplo, metóxido de sodio, etóxido de sodio, metóxido de potasio, etóxido de potasio, t-butóxido de potasio y metóxido de litio), N-metilmorfolina, trietilamina, tripropilamina, tributilamina, diisopropiletilamina, diciclohexilamina, N-metilpiperidina, piridina, 4-pirrolidinopiridina, picolina, 4-(N,N-dimetilamino)piridina, 2,6-di(t-butil)-4-metilpiridina, quinolina, N,N-dimetilanilina, N,N-dietilanilina, 1,5-diazabiciclo[4.3.0]non-5-eno (DBN), 1,4-diazabiciclo[2.2.2]octano (DABCO) y 1,8-diazabiciclo[5.4.0]undec-7-eno (DBU). De estas bases, se prefieren las bases orgánicas y piridina es la más preferida. A este respecto, ha de observarse que cuando la reacción de hidrólisis avanza satisfactoriamente en ausencia de una base, no existe la necesidad de añadir una base.
La temperatura de reacción varía dependiendo del compuesto de partida y del reactivo, pero normalmente está en el intervalo de desde 0 hasta 100ºC y preferiblemente en el intervalo de desde 20 hasta 60ºC.
El tiempo de reacción varía dependiendo de la temperatura de reacción, el compuesto de partida, el reactivo y la clase de disolvente usado, pero está normalmente en el intervalo de desde 10 minutos hasta 3 días y preferiblemente en el intervalo de desde 6 horas hasta 24 horas.
Tras la finalización de la reacción, puede aislarse el compuesto deseado de la reacción de hidrólisis a partir de la mezcla de reacción mediante un método convencional conocido por el experto en la técnica. Por ejemplo, puede condensarse la mezcla de reacción resultante usando una membrana de ultrafiltración y luego liofilizarse para obtener el compuesto diana de la reacción. Alternativamente, el compuesto deseado puede usarse como una disolución sin aislamiento del mismo cuando va a usarse para la modificación de proteínas.
El compuesto deseado así obtenido, si es necesario, puede purificarse adicionalmente mediante una técnica convencional tal como, por ejemplo, cromatografía de filtración en gel. Para obtener un compuesto que tiene un grado promedio de polimerización deseado particular o un peso molecular deseado, puede fraccionarse adicionalmente el compuesto purificado usando cromatografía de filtración en gel.
En la presente invención, "amonólisis" significa una reacción de apertura de anillo de un resto de anhídrido carboxílico de fórmula (III) con amoniaco para dar un resto de fórmula (II) en la que R^{3} es un grupo amino. La naturaleza de la reacción de amonólisis real no se limita particularmente siempre que sea un método empleado comúnmente por los expertos en la técnica.
Los ejemplos de un disolvente adecuado que va a usarse incluyen: agua; éteres tales como dietil éter, diisopropil éter, tetrahidrofurano, dioxano, dimetoxietano y dietilenglicol-dimetil éter; y amidas tales como formamida, N, N-dimetilformamida, N,N-dimetilacetamida, N-metil-2-pirrolidona, N-metilpirrolidinona y hexametilfosforotriamida. De estos disolventes, se prefieren agua o dioxano. Ha de observarse que el reactivo que va a usarse puede usarse también como disolvente.
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Los ejemplos de reactivos adecuados que van a usarse incluyen gas amoniaco y agua amoniacal, y se prefiere amoniaco.
La temperatura de reacción varía dependiendo del material de partida y del reactivo, pero está normalmente en el intervalo de desde 0 hasta 100ºC y preferiblemente en el intervalo de desde 10 hasta 40ºC.
El tiempo de reacción varía dependiendo de la temperatura de reacción, el compuesto de partida, el reactivo y la clase de disolvente usado, pero está normalmente en el intervalo de desde 10 minutos hasta 3 días y preferiblemente en el intervalo de desde 6 horas hasta 24 horas.
Tras la finalización de la reacción, puede aislarse el compuesto deseado de la reacción de amonólisis a partir de la mezcla de reacción mediante un método convencional conocido por el experto en la técnica. La mezcla de reacción resultante puede tratarse, por ejemplo, tal como sigue para aislar el compuesto diana: (1) diálisis a través de una membrana semipermeable mediante el uso de un ácido tal como una disolución acuosa de ácido acético para eliminar el amoniaco en exceso (la diálisis se lleva a cabo en condiciones tales que la disolución de mezcla de reacción no se vuelve ácida, añadiendo agua según sea necesario), seguido de condensación usando una membrana de ultrafiltración y luego liofilización del condensado así obtenido; o (2) adición de una disolución acuosa de hidróxido de sodio y un disolvente orgánico inmiscible tal como dietil éter, agitar la mezcla resultante (la agitación puede llevarse a cabo dos o más veces, según sea necesario) y luego se liofiliza la fase acuosa separada que contiene el compuesto diana para obtener el compuesto diana. Alternativamente, puede usarse el compuesto deseado como una disolución sin aislamiento del mismo cuando va a usarse para la modificación de proteínas.
El compuesto deseado así obtenido, si es necesario, puede purificarse adicionalmente mediante una técnica convencional tal como, por ejemplo, cromatografía de filtración en gel. Para obtener un compuesto que tiene un grado promedio de polimerización deseado particular o un peso molecular deseado, puede fraccionarse adicionalmente el compuesto purificado usando cromatografía de filtración en gel.
Debe observarse que el compuesto diana de la reacción de amonólisis puede contener unidades estructurales de fórmula (II) en la que R^{3} es un grupo hidroxilo como resultado de la hidrólisis de algunas unidades de fórmula (III) en el material de partida mediante el agua presente en el disolvente o el reactivo. También debe observarse que puede añadirse una base al compuesto diana para un almacenamiento mejorado.
En la presente invención, "aminólisis" significa una reacción de apertura de anillo de un resto de anhídrido carboxílico de fórmula (III) con una amina para dar un resto de fórmula (II) en la que R^{3} es un grupo de fórmula -NR^{4}R^{5}, en la que R^{4} y R^{5} son tal como se definieron anteriormente. La naturaleza de la reacción de aminólisis real no se limita particularmente siempre que sea un método empleado comúnmente por los expertos en la técnica.
Los ejemplos de un disolvente adecuado que va a usarse incluyen: agua; éteres tales como dietil éter, diisopropil éter, tetrahidrofurano, dioxano, dimetoxietano y dietilenglicol-dimetil éter; y amidas tales como formamida, N, N-dimetilformamida, N,N-dimetilacetamida, N-metil-2-pirrolidona, N-metilpirrolidinona y hexametilfosforotriamida. De estos disolventes, se prefieren agua o dioxano. Ha de observarse que el reactivo que va a usarse puede usarse también como disolvente.
El reactivo que va a usarse depende obviamente de la naturaleza del grupo diana de fórmula -NR^{4}R^{5}. Las aminas usadas normalmente incluyen metilamina, dimetilamina, etilamina, dietilamina, 2-hidroxietilamina, di-2-hidroxietilamina, n-propilamina, di-n-propilamina, isopropilamina, diisopropilamina, 1-amino-2-propanol y 2-hidroxiisopropilamina, y disoluciones acuosas de las mismas. De estos reactivos, los reactivos preferidos incluyen una disolución acuosa de dimetilamina y 1-amino-2-propanol; una disolución acuosa de dimetilamina es la más preferida.
La temperatura de reacción varía dependiendo del compuesto de partida y del reactivo pero está normalmente en el intervalo de desde 0 hasta 100ºC y preferiblemente en el intervalo de desde 10 hasta 40ºC.
El tiempo de reacción varía dependiendo de la temperatura de reacción, el compuesto de partida, el reactivo y la clase de disolvente usado, pero está normalmente en el intervalo de desde 10 minutos hasta 3 días y preferiblemente en el intervalo de desde 6 horas hasta 36 horas.
Tras la finalización de la reacción, puede aislarse el compuesto deseado de la reacción de aminólisis a partir de la mezcla de reacción mediante un método convencional conocido por el experto en la técnica. La mezcla de reacción resultante puede tratarse, por ejemplo, tal como sigue para aislar el compuesto diana: (1) diálisis a través de una membrana semipermeable mediante el uso de un ácido tal como una disolución acuosa de ácido acético para eliminar el amoniaco en exceso (la diálisis se lleva a cabo en condiciones tales que la disolución de mezcla de reacción no se vuelve ácida, añadiendo agua según sea necesario), seguido de condensación usando una membrana de ultrafiltración y luego liofilización del condensado así obtenido; o (2) adición de una disolución acuosa de hidróxido de sodio y un disolvente orgánico inmiscible tal como dietil éter, agitar la mezcla resultante (la agitación puede llevarse a cabo dos o más veces, según sea necesario) y luego se liofiliza la fase acuosa separada que contiene el compuesto diana para obtener el compuesto diana. Alternativamente, puede usarse el compuesto deseado como una disolución sin aislamiento del mismo cuando va a usarse para la modificación de proteínas.
El compuesto deseado así obtenido, si es necesario, puede purificarse adicionalmente mediante una técnica convencional tal como, por ejemplo, una columna de filtración en gel. Para obtener un compuesto que tiene un grado promedio de polimerización deseado particular o un peso molecular deseado, puede fraccionarse adicionalmente el compuesto purificado usando cromatografía de filtración en gel.
Debe observarse que el compuesto diana de la reacción de aminólisis puede contener unidades estructurales de fórmula (II) en la que R^{3} es un grupo hidroxilo como resultado de la hidrólisis de algunas unidades de fórmula (III) en el material de partida mediante el agua presente en el disolvente o el reactivo. También debe observarse que puede añadirse una base al compuesto diana para un almacenamiento mejorado.
En la presente invención, "alcohólisis" significa una reacción de apertura de anillo de un resto de anhídrido carboxílico de fórmula (III) con un alcohol o un alcohol arílico para dar un resto de fórmula (II) en la que R^{3} es un grupo alcoxilo o ariloxilo tal como se definió anteriormente. La naturaleza de la reacción de alcohólisis real no se limita particularmente siempre que sea un método empleado comúnmente por los expertos en la técnica.
Los ejemplos del disolvente que va a usarse en la reacción de alcohólisis incluyen agua; y amidas tales como formamida, N,N-dimetilformamida, N,N-dimetilacetamida, N-metil-2-pirrolidona, N-metilpirrolidinona y hexametilfosforotriamida. De estos disolventes, se prefiere agua. Ha de observarse que el reactivo que va a usarse puede usarse también como disolvente.
El reactivo que va a usarse depende obviamente de la naturaleza del grupo alcoxilo o ariloxilo diana. Los ejemplos típicos del alcohol usado para obtener el grupo alcoxilo deseado incluyen metanol, etanol, etilenglicol, n-propanol, propilenglicol, 2-hidroxi-n-propanol e iso-propanol, y disoluciones acuosas de los mismos, mientras que ejemplos típicos del alcohol usado para obtener el grupo ariloxilo deseado incluyen fenol y p-nitrofenol. De estos reactivos, se prefiere etanol.
La temperatura de reacción varía dependiendo del compuesto de partida y del reactivo pero está normalmente en el intervalo de desde 0 hasta 100ºC y preferiblemente en el intervalo de desde 10 hasta 40ºC.
El tiempo de reacción varía dependiendo de la temperatura de reacción, el compuesto de partida, el reactivo y la clase de disolvente usado pero está normalmente en el intervalo de desde 10 minutos hasta 3 días y preferiblemente en el intervalo de desde 6 horas hasta 36 horas.
Tras la finalización de la reacción, el compuesto deseado de la reacción de alcohólisis puede aislarse a partir de la mezcla de reacción mediante un método convencional conocido por el experto en la técnica. Por ejemplo, puede condensarse la mezcla de reacción usando una membrana de ultrafiltración, añadirse agua y luego condensarse adicionalmente la mezcla dos o más veces adicionales usando una membrana de ultrafiltración para eliminar el alcohol en exceso, y luego se liofiliza el condensado obtenido para obtener el compuesto diana. Alternativamente, puede usarse el com-
puesto deseado como una disolución sin aislamiento del mismo cuando va a usarse para la modificación de proteínas.
El compuesto deseado así obtenido, si es necesario, puede purificarse adicionalmente mediante una técnica convencional tal como, por ejemplo, una columna de filtración en gel. Para obtener un compuesto que tiene un grado promedio de polimerización deseado particular o un peso molecular deseado, puede fraccionarse adicionalmente el compuesto purificado usando cromatografía de filtración en gel.
Debe observarse que el compuesto diana de la reacción de alcohólisis puede contener unidades estructurales de fórmula (II) en la que R^{3} es un grupo hidroxilo como resultado de la hidrólisis de algunas unidades de fórmula (III) en el material de partida mediante el agua presente en el disolvente o el reactivo. También debe observarse que puede añadirse una base al compuesto diana para un almacenamiento mejorado.
Cuando el copolímero deseado de la presente invención es una sal farmacológicamente aceptable, el método para preparar dicha sal no se limita particularmente siempre que sea un método empleado comúnmente en el campo. Por ejemplo, puede obtenerse una sal farmacológicamente aceptable disolviendo el copolímero de la invención en un disolvente orgánico, añadiendo una base a la disolución así obtenida y recogiendo luego la sal resultante que precipita.
Puede emplearse una variedad de tácticas para controlar el peso molecular promedio, la magnitud de la disposición alternante y la razón de composición de los copolímeros de la presente invención.
Se conoce bien que los monómeros de anhídrido maleico tienden a polimerizar de manera alternante con comonómeros incluyendo alil-metil diéter de polioxietileno [por ejemplo, véase Comprehensive Polymer Scence Vol. 4, Chain polimerization Parte II, Ed. por G. C. Eastmond et al., páginas 377-422, Pergamon Press (1989); T. Yoshimoto et al., Biochemical Biophysical Research Communication Vol. 148, 876-882 (1987)]. El peso molecular promedio y la disposición de los polímero puede controlarse por los expertos en la técnica (por ejemplo, véase T. Ohtsu y M. Kinoshita, Koubunshi Gousei no Jikkenhou páginas 125-154, Kagaku- Dojin 1972). Además, aunque el anhídrido maleico tiende a polimerizar de manera alternante con comonómeros, los expertos en la técnica conocen bien la posibilidad de que más del 50% en moles de la razón de composición esté compuesto de unidades de anhídrido maleico en el copolímero (patente japonesa número 2621308, número 2701295, número 2803265, número 3271265, número 3035675 y número 3106265, y publicación de solicitud de patente japonesa número 2003-105003 y número 2003-105040).
Generalmente, para obtener polímeros con un peso molecular más alto y un grado de disposición alternante mayor, debe llevarse a cabo la polimerización en condiciones suaves, tales como temperatura más baja y concentración de iniciador más baja. La concentración monomérica más alta y la concentración de disolvente más baja que reducen la concentración relativa de iniciador, también dan como resultado un peso molecular más alto y un grado de disposición alternante más alto.
Alternativamente, para obtener polímeros con un peso molecular más bajo y un grado de disposición alternante más bajo, son favorables temperatura más alta, concentración de iniciador más alta, concentración monomérica más baja y concentración de disolvente más alta. Además, en tales condiciones de polimerización relativamente rigurosas y/o siendo más del 50% en moles de los monómeros totales en la mezcla monomérica anhídrido maleico, la razón de composición de unidades de anhídrido maleico en el copolímero resultante puede ser más del 50% en moles.
Se describen algunos ejemplos de condiciones de polimerización para alil-metil diéter de polioxietileno y anhídrido maleico en T. Yoshimoto et al., Biochemical Biophysical Research Communication Vol. 148, 876-882 (1987). Según este artículo, se mezclaron alil-metil diéter de polioxietileno, anhídrido maleico, tolueno y peróxido de benzoílo (iniciador) y se realizó la polimerización sometiendo a reflujo a 80ºC durante 7 horas. El polímero resultante tuvo un peso molecular de 13 kD, y presentaba 8 cadenas de PEG y 8 unidades de anhídrido maleico. Se sugirió una disposición alternante del copolímero a partir del hecho de que tiene una razón de composición de 1:1 y de que los monómeros de anhídrido maleico tienden a copolimerizar de manera alternante con los comonómeros. Si se necesitan un copolímero que tenga un peso molecular más bajo y una magnitud más baja de disposición alternante, entonces deben aplicarse una concentración de iniciador más alta, concentración monomérica más baja y/o concentración de disolvente más alta. Por ejemplo, cuando se usa tolueno como el disolvente en la polimerización y la polimerización se realiza a 1 atmósfera, la polimerización puede realizarse hasta su punto de ebullición de 110ºC. Además, se prefiere una temperatura más alta con un disolvente diferente cuya temperatura de ebullición es más alta que la del tolueno. En tales casos, se necesita seleccionar de manera adecuada la clase de iniciador porque cada iniciador tiene una constante de velocidad de descomposición específica diferente y algunos iniciadores se descompondrían a estas temperaturas más altas. En la técnica se conocen ya numerosos iniciadores con velocidades de descomposición diferentes [por ejemplo, véase Polymer Handbook, tercera edición, páginas II/1-II/65, Ed. por J. Brandrup y E. Immergut, John Wiley & Sons (1989)].
También se dan a conocer disolventes, iniciadores y condiciones de reacción alternativos para variar la razón de composición, el peso molecular y el grado de disposición alternante en las reacciones de copolimerización de alil-metil diéter de polioxietileno y anhídrido maleico en otros documentos de la técnica anterior tales como la publicación de solicitud de patente japonesa número 2003-105003. El xileno, por ejemplo tiene un punto de ebullición más alto a 1 atmósfera (140ºC) que el tolueno. También se conoce que las reacciones de copolimerización pueden realizarse sin ningún disolvente en algunos casos, lo que elimina la limitación del punto de ebullición del disolvente sobre la temperatura de polimerización. También se dan a conocer iniciadores alternativos tales como peróxido de benzoílo, peróxido de di-tercbutilo y peroxiisobutirato de terc-butilo e iniciadores azo tales como azobisisobutironitrilo. También es posible disminuir el peso molecular promedio del copolímero mediante el uso de reactivos de transferencia de cadena.
Si se requiere una razón de composición de unidades de anhídrido maleico con respecto a las unidades monoméricas totales en el copolímero superior al 50%, debe aplicarse un porcentaje aumentado de monómeros de anhídrido maleico en la mezcla monomérica con o sin tales condiciones de polimerización relativamente rigurosas.
Cuando se está preparando un componente farmacéuticamente activo usando un copolímero de la presente invención o una sal farmacológicamente aceptable del mismo y una proteína o un análogo o una variante de la misma, la razón del copolímero con respecto a la proteína o un análogo o una variante de la misma no se limita específicamente siempre que el complejo resultante tenga la actividad farmacéutica requerida. Normalmente, la razón en peso del copolímero de la presente invención o una sal farmacológicamente aceptable del mismo con respecto a la proteína o un análogo o una variante de la misma es desde 0,01 hasta 100:1; preferiblemente es desde 0,1 hasta 50:1; aún más preferiblemente es desde 1 hasta 10:1; y lo más preferiblemente es desde 1 hasta 1,5:1.
En el uso práctico, normalmente se prepara un componente farmacéuticamente activo que comprende el copolímero de la presente invención o una sal farmacológicamente aceptable del mismo y una proteína o un análogo o una variante de la misma en forma de una disolución de proteína que contiene el copolímero o una liofilizada que contiene el copolímero de la presente invención o una sal farmacológicamente aceptable del mismo y la proteína o un análogo o una variante de la misma. En el último caso, se disuelve la forma liofilizada del principio activo justo antes de usarse. Alternativamente, puede prepararse el componente farmacéuticamente activo en forma de un kit. En este caso, se almacenan el copolímero de la presente invención o una sal farmacológicamente aceptable del mismo y una proteína o un análogo o una variante de la misma en recipientes diferentes y luego se mezclan para preparar el componente farmacéuticamente activo deseado justo antes del uso. De estas formas diferentes, la forma liofilizada es la más preferida.
Cuando se usa el copolímero de la presente invención o una sal farmacológicamente aceptable del mismo como un modificador de proteína, la razón del copolímero o sal farmacológicamente aceptable del mismo con respecto a la proteína o un análogo o una variante de la misma no se limita particularmente a ningún valor específico siempre que se consiga la modificación de proteína. Normalmente, la razón en peso del copolímero de la presente invención o una sal farmacológicamente aceptable del mismo con respecto a la proteína o un análogo o una variante de la misma es de 0,01 a 100:1; preferiblemente s desde 0,1 hasta 50:1; aún más preferiblemente es desde 1 hasta 10:1; y lo más preferiblemente es desde 1 hasta 1,5:1.
Cuando se usa el copolímero de la presente invención como un modificador de proteína, el método para modificar la proteína no se limita particularmente siempre que sea un método empleado comúnmente para modificar una proteína. Por ejemplo, puede modificarse una proteína o un análogo o una variante de la misma tal como sigue.
El disolvente que va a usarse en el proceso de modificación es una disolución acuosa que contiene un electrolito que se usa comúnmente para disolver una proteína, y el pH de la misma no se limita a ningún valor específico siempre que caiga dentro de un intervalo en el que el modificador de proteína pueda estar cargado negativamente como resultado de la disociación de al menos algunos de los grupos carboxilo en el modificador de proteína de la presente invención y la proteína o un análogo o una variante de la misma puedan estar cargados positivamente. Por ejemplo, puede fijarse el pH a un valor en el intervalo de desde 3 hasta el punto isoeléctrico de la proteína o un análogo o una variante de la misma, y preferiblemente se fija a un valor en el intervalo de desde 4 hasta 8. A este respecto, debe observarse que el punto isoeléctrico de la proteína o un análogo o una variante de la misma puede determinarse mediante electroforesis.
El modificador de proteína se disuelve en el disolvente descrito anteriormente y luego se añade la disolución así obtenida a una disolución acuosa de dicha proteína o un análogo o una variante de la misma. Puede agitarse la disolución obtenida para facilitar la reacción si es necesario. Puede ajustarse el pH de la mezcla resultante si se desea mediante la adición de un ácido y/o una base. La razón del modificador de proteína de la presente invención que va a usarse con respecto a dicha proteína o un análogo o una variante de la misma no se limita a ningún valor específico siempre que dé la modificación deseada a la proteína. Normalmente, la razón está en el intervalo de desde 0,01 hasta 100 en peso; preferiblemente en el intervalo de desde 0,1 hasta 50; más preferiblemente en el intervalo de desde 1 hasta 10; y lo más preferiblemente es desde 1 hasta 1,5:1.
La temperatura de reacción para el proceso de modificación varía dependiendo del compuesto y del reactivo usados pero está normalmente en el intervalo de desde 0 hasta 100ºC, preferiblemente en el intervalo de desde 4 hasta 40ºC y lo más preferiblemente en el intervalo de desde 30 hasta 40ºC.
El tiempo de reacción varía dependiendo de la temperatura de reacción, el compuesto usado, el reactivo y la clase de disolvente usado, pero está normalmente en el intervalo de desde 5 minutos a 14 días, preferiblemente en el intervalo de desde 1 hora hasta 12 días, y más preferiblemente en el intervalo de desde 5 días hasta 10 días.
Algunas veces, durante el proceso de modificación de proteína las condiciones usadas son tales que algunas de las unidades estructurales de fórmula (II) en el copolímero se convierten en unidades de fórmula (II) que tienen una identidad diferente. Por ejemplo, cuando R^{3} en las unidades estructurales de fórmula (II) es un grupo distinto de un grupo hidroxilo, las condiciones usadas para el proceso de modificación son tales que algunos de dichos grupos R^{3} se hidrolizan para dar unidades estructurales de fórmula (II) en la que R^{3} es un grupo hidroxilo.
Tal como se indicó anteriormente, los complejos de la presente invención comprenden al menos una proteína o un análogo o una variante de la misma que está unido a al menos un copolímero de la presente invención o una sal farmacológicamente aceptable del mismo. En dicho complejo, la proteína o un análogo o una variante de la misma y copolímero o una sal farmacológicamente aceptable del mismo están unidos entre sí mediante un enlace químico tal como un enlace covalente (por ejemplo, formación de base de Schiff, formación de enlace amida y formación de enlace éster), un enlace iónico o un enlace coordinado, o mediante un enlace no químico tal como una interacción hidrófoba, un enlace de hidrógeno, una interacción electrostática o una unión por afinidad.
Preferiblemente, los complejos de la presente invención no se detectan en forma disociada en ninguna magnitud significativa cuando se someten a cromatografía de exclusión molecular o SDS-PAGE en condiciones no reductoras. Más preferiblemente, los complejos de la presente invención no se detectan en forma disociada en ninguna magnitud significativa cuando se someten a cromatografía de exclusión molecular y SDS-PAGE en condiciones no reductoras. Aún más preferiblemente, adicionalmente la tasa de fracaso al detectar la proteína del complejo mediante ELISA de los complejos de la presente invención como resultado de la modificación de la estructura de proteína mediante los copolímeros y las sales farmacológicamente aceptables de los mismos es muy baja (preferiblemente, la tasa de fracaso es del 20% o inferior, más preferiblemente del 15% o inferior y lo más preferiblemente del 10% o inferior).
En la presente invención, se define un análogo de proteína como una proteína codificada por ADNc clonado a partir de una biblioteca de ADNc derivada de células animales, fluidos o tejidos corporales mediante hibridación usando el ADNc de la proteína en condiciones rigurosas (de 60 a 70ºC, 6xSSC).
En la presente invención, se define una variante de proteína como una proteína que se obtiene sustituyendo, delecionando, añadiendo o insertando uno o más aminoácidos en la proteína original y tiene todavía al menos una parte de la actividad de la proteína original a un nivel detectable.
Preferiblemente, la proteína o un análogo o una variante de la misma es una proteína básica. Más preferiblemente, la proteína básica es un factor de crecimiento de fibroblastos básico (bFGF), un factor de crecimiento epidérmico (EGF), un factor inhibidor de la osteoclastogénesis (OCIF), un factor de crecimiento derivado de plaquetas (PDGF), un factor neurotrófico derivado de cerebro (BDNF), un factor de crecimiento nervioso (NGF), una hormona del crecimiento humana (HGH), un factor de crecimiento de hepatocitos (HGF), o un factor de crecimiento endotelial vascular (VEGF), o un análogo o variante de los mismos. Lo más preferiblemente, la proteína básica es un factor inhibidor de la osteoclastogénesis (OCIF) o un análogo o variante del mismo.
El OCIF, un análogo del mismo o una variante del mismo usado en la presente invención puede se de tipo natural o puede ser de tipo recombinante y su origen no se limita particularmente. OCIF de tipo natural significa OCIF que se obtiene como una proteína producida de manera natural mediante extracción, purificación y/o aislamiento a partir de un órgano, un fluido corporal, un cultivo celular o un medio de cultivo derivado de un ser humano o un animal no humano. El OCIF de tipo recombinante, un análogo del mismo o una variante del mismo es una proteína recombinante obtenida mediante extracción, purificación y/o aislamiento de dicha proteína a partir de un huésped usado de manera convencional en tales técnicas tales como una célula huésped procariota (por ejemplo Escherichia coli) o una célula eucariota tal como una línea celular humana o no humana que se ha transformado con un vector que comprende un polinucleótido que codifica para un OCIF, un análogo del mismo o una variante del mismo [por ejemplo, véanse los métodos recombinantes dados a conocer en los documentos EP-A-0816380 (WO-A-96/26217) y WO-A-97/23614].
El origen del OCIF, análogos de los mismos y variantes de los mismos usados en la presente invención no se limita particularmente y pueden derivarse de un ser humano o un animal no humano. Preferiblemente, pueden derivarse de un mamífero tal como un ser humano, una rata, un ratón, un conejo, un perro, un gato, una vaca, un cerdo, una oveja o una cabra; o un ave tal como un ave de corral, un ganso, una gallina o un pavo. Más preferiblemente, se derivan de mamíferos y lo más preferiblemente se derivan de un ser humano.
El OCIF o análogo del mismo usado en la presente invención puede ser un OCIF de tipo monomérico (por ejemplo, en seres humanos, un monómero que tiene un peso molecular tal como se mide mediante SDS-PAGE en condiciones no reductoras de aproximadamente 60000) o un tipo dimérico (por ejemplo en seres humanos un dímero que tiene un peso molecular de aproximadamente 120000 tal como se mide mediante SDS-PAGE en condiciones no reductoras) [véase el documento EP-A-0816380 (WO-A-96/26217)]. Preferiblemente es un monómero de OCIF humano que tiene un peso molecular de aproximadamente 60.000 tal como se mide mediante SDS-PAGE en condiciones no reductoras o un dímero de OCIF humano que tiene un peso molecular de aproximadamente 120.000 tal como se mide mediante SDS-PAGE en condiciones no reductoras, y más preferiblemente es un dímero de OCIF humano que tiene un peso molecular de aproximadamente 120.000 tal como se mide mediante SDS-PAGE en condiciones no reductoras.
Se conoce que el OCIF se traduce en células como un polipéptido que contiene un péptido señal en el extremo amino terminal del mismo y que se madura entonces mediante un procesamiento que implica la eliminación de dicho péptido señal [por ejemplo, véanse los métodos recombinantes dados a conocer en los documentos EP-A-0816380 (WO-A-96/26217) y WO-A-97/23614]. El OCIF, análogo del mismo o variante del mismo usado en la presente invención incluye tanto el polipéptido que contiene un péptido señal como la forma madura del mismo. Los ejemplos preferidos incluyen el OCIF humano teniendo el péptido señal los aminoácidos -21 a +380 de la SEQ.ID. NO.1 de la lista de secuencias y el OCIF humano maduro sin el péptido señal que tiene los aminoácidos +1 a +380 de la SEQ. ID. NO.1 de la lista de secuencias. De éstos, se prefiere particularmente el OCIF humano maduro.
También se conoce que puede añadirse metionina a una forma madura tal de OCIF, un análogo del mismo o una variante del mismo, cuando se expresa como una proteína recombinante en una célula huésped, especialmente en una célula huésped procariota tal como Escherichia coli. Esto se consigue añadiendo un triplete de nucleótidos que tiene la secuencia ATG (AUG) al extremo 5' de un polinucleótido que codifica para una forma madura de OCIF, un análogo del mismo o una variante del mismo, e insertando el polinucleótido resultante en un vector de expresión adecuado. La proteína madura deseada que tiene metionina en el extremo amino terminal de la misma puede expresarse por una célula huésped adecuada que se ha transformado mediante dicho vector de expresión recombinante. Adicionalmente, pueden añadirse uno o más de un aminoácido a dicha proteína en una posición próxima a la metionina amino terminal mediante la adición de tripletes de nucleótidos adicionales próximos al triplete ATG añadido en el extremo 5' del polinucleótido que codifica para una forma madura de OCIF, un análogo del mismo o una variante del mismo. La forma madura diana de OCIF, un análogo del mismo o una variante del mismo que tiene metionina en el extremo amino terminal puede purificarse y aislarse a partir de un cultivo de la célula huésped transformada según un método convencional. Además, pueden insertarse uno o más aminoácidos en la forma madura de OCIF que tiene metionina en el extremo amino terminal, un análogo del mismo, o una variante del mismo en una posición adyacente a la metionina y más cerca del extremo carboxilo terminal que la metionina.
En la presente invención, un análogo de OCIF significa una proteína codificada por un polinucleótido que existe naturalmente en las células, el fluido corporal y/o los órganos de un ser humano o animal no humano tal como los mostrados a modo del ejemplo anteriormente. Los ejemplos específicos preferidos de tales análogos incluyen OCIF2, OCIF3, OCIF4 y OCIF5 [véase el documento EP-A-0816380 (WO96/26217)]. Tales análogos de OCIF o fragmentos activos de los mismos pueden obtenerse mediante un método tal como el siguiente: se extrae ARN de una célula, un órgano o un tejido o fluido corporal de un ser humano o un animal no humano; se sintetiza una primera hebra de ADNc que es complementaria a dicho ARN usando una transcriptasa inversa y luego se sintetiza una segunda hebra de dicho ADNc usando la primera como molde usando una ADN polimerasa; se inserta el ADNc bicatenario así obtenido en un vector de expresión adecuado, usado de manera convencional; luego se transforma una célula huésped adecuada, usada de manera convencional mediante el vector así obtenido; luego se selecciona el huésped que produce el péptido deseado para usar una técnica de hibridación tal como hibridación en placa o hibridación con fago usando ADNc de OCIF o un fragmento del mismo como sonda en condiciones rigurosas [véase el documento EP-A-0816380 (WO-A-96/26217)]; y luego, finalmente, se expresa el análogo de OCIF deseado mediante una técnica convencional por la célula huésped así obtenida.
En la presente invención, una variante de OCIF significa una proteína que tiene una secuencia de aminoácidos en la que uno o más de un residuos de aminoácido se han sustituido en, delecionado de, añadido a o insertado en la secuencia de aminoácidos de un OCIF o un análogo del mismo, y todavía tiene al menos alguna actividad de OCIF. Tales variantes de OCIF pueden obtenerse mediante, por ejemplo, el siguiente método: sustituir, delecionar, añadir y/o insertar un nucleótido o más de un nucleótidos en una secuencia de nucleótidos que codifica para OCIF o un análogo del mismo usando un método de reacción en cadena de la polimerasa (denominado en lo sucesivo en el presente documento PCR), un método de recombinación genética o un método de digestión por nucleasas usando una exonucleasa o endonucleasa tal como una enzima de restricción; transformar una célula huésped eucariota tal como una célula animal o una célula huésped procariota como Escherichia coli con un vector de expresión en el que el se ha insertado el nucleótido obtenido que codifica para la variante de OCIF deseada; y luego extraer, purificar y/o aislar el péptido deseado a partir de la fracción que contiene proteína producida por un cultivo celular de dicho huésped transformado según un método bien conocido por el experto en la técnica.
También se conoce que las formas truncadas de OCIF en el que se ha delecionado una parte considerable de la secuencia de aminoácidos del extremo carboxilo terminal de un polipéptido de OCIF conservan al menos algo de actividad de OCIF [por ejemplo, véanse los documentos EP-A-0816380 (WO-A-96/26217) y WO-A-97/23614]. Tales tipos truncados de OCIF que retienen al menos algo de la actividad del polipéptido de OCIF completo se incluyen también en las variantes de OCIF de la presente invención.
Además se conoce el OCIF o una forma truncada del mismo que se fusiona con el dominio de una inmunoglobulina tal como el dominio Fc (por ejemplo un polipéptido de fusión en el que el dominio Fc de IgG humana está unido al extremo carboxilo terminal del OCIF) y que retiene al menos algo de la actividad del polipéptido de OCIF completo (véase el documento WO-A-97/23614), y tales proteínas de fusión se incluyen también en las variantes de OCIF de la presente invención.
Cualquier OCIF producido de manera natural o un análogo del mismo o OCIF recombinantes o análogo o variante del mismo puede contener una cadena de azúcar que está unida al OCIF o análogo o variante del mismo de manera post-traduccional. Pueden obtenerse OCIF producido de manera natural o un análogo del mismo que contiene una cadena de azúcar a partir de cultivos celulares, tejidos, órganos, fluidos corporales o líneas celulares derivadas de seres humanos o animales no humanos usando técnicas convencionales. Puede obtenerse OCIF recombinante o un análogo o variante del mismo que contiene una cadena de azúcar a partir de un cultivo de una célula huésped eucariota transformada usando un vector que comprende una secuencia de nucleótidos que codifica cualquier OCIF o un análogo o variante del mismo tal como los descritos y mostrados a modo del ejemplo anteriormente. Los ejemplos de células huésped adecuadas que pueden usarse que pueden realizar la modificación post-traduccional de OCIF o un análogo o variante del mismo de modo que se una a una cadena de azúcar incluyen células de ovario de hámster chino y células COS [Yasuda, H. et al, Endocrinology, 139, 1329-1337 (1998)]. El OCIF o un análogo o variante del mismo que contiene una cadena de azúcar de este tipo son adecuados para su uso en la formación de los complejos de la presente invención. La cadena de azúcar en el OCIF o un análogo o variante del mismo que contienen una cadena de azúcar pueden modifi-
carse artificialmente (en particular, enzimáticamente) con polímeros, polisacáridos o polisacáridos modificados.
La composición farmacéutica de la presente invención que contiene un copolímero de la presente invención o una sal farmacológicamente aceptable del mismo y una proteína o un análogo de la misma puede ser una disolución preparada según un método descrito anteriormente o una obtenido liofilizando la disolución. Alternativamente, puede formularse una composición farmacéutica de este tipo según un método alternativo o puede estar en forma de un kit. En el último caso, el copolímero de la presente invención o una sal farmacológicamente aceptable del mismo y una proteína o un análogo o una variante de la misma se almacena en recipientes diferentes y luego se mezclan para preparar la composición farmacéuticamente deseada justo antes de su uso.
Las composiciones farmacéuticas de la presente invención pueden comprender además opcionalmente una base. La base no se limita a ninguna base específica siempre que sea una base usada comúnmente en composiciones farmacéuticas. Los ejemplos de una base de este tipo incluyen: bases inorgánicas tales como carbonatos de metales alcalinos (por ejemplo carbonato de sodio, carbonato de potasio y carbonato de litio), hidrogenocarbonatos de metales alcalinos (por ejemplo hidrogenocarbonato de sodio, hidrogenocarbonato de potasio e hidrogenocarbonato de litio), hidruros de metales alcalinos (por ejemplo hidruro de litio, hidruro de sodio e hidruro de potasio), hidróxidos de metales alcalinos (por ejemplo hidróxido de sodio, hidróxido de potasio, hidróxido de bario e hidróxido de litio), fluoruros de metales alcalinos (por ejemplo fluoruro de sodio y fluoruro de potasio); y bases orgánicas tales como alcóxidos de metales alcalinos (por ejemplo metóxido de sodio, etóxido de sodio, metóxido de potasio, etóxido de potasio, t-butóxido de potasio y metóxido de litio), mercaptanos de metales alcalinos (por ejemplo metilmercaptano de sodio y etilmercaptano de sodio), N-metilmorfolina, trietilamina, tripropilamina, tributilamina, diisopropiletilamina, diciclohexilamina, N-metilpiperidina, piridina, 4-pirrolidinopiridina, picolina, 4-(N,N-dimetilamino)piridina, 2,6-di(t-butil)-4-metilpiridina, quinolina, N,N-dimetilanilina, N,N-dietilanilina, 1,5-diazabiciclo[4.3.0]non-5-eno (DBN), 1,4-diazabiciclo[2.2.2]octano (DABCO) y 1,8-diazabiciclo[5.4.0]undec-7-eno (DBU). De estas bases, se prefieren los hidróxidos de metales alcalinos y se prefiere particularmente hidróxido de sodio. A este respecto, ha de observarse que una parte o todo de las bases puede formar sales con el copolímero de la presente invención.
Los ejemplos de la composición farmacéutica según la presente invención comprenden un complejo de al menos una sustancia seleccionada de un copolímero de la presente invención o una sal farmacológicamente aceptable del mismo y una proteína o un análogo o una variante de la misma seleccionados de bFGF (usado para el tratamiento o la prevención de arteriopatía isquémica y úlceras de la piel resistentes a tratamiento), EGF (usado para el tratamiento o la prevención de enfermedades ulcerosas tales como colitis ulcerosa y trastorno del epitelio corneal prolongado), PDGF (usado para el tratamiento de heridas), BDNF y NGF (usados para el tratamiento o la prevención de enfermedades del sistema nervioso central tal como enfermedad de Parkinson y enfermedad de Alzheimer), HGH (usado para el tratamiento o la prevención de deficiencia en hormona del crecimiento, síndrome de hiposecreción de hormona del crecimiento, síndrome de Turner y distrofia de cartílago), HGF (usado para el tratamiento o la prevención de diabetes mellitus, arteriosclerosis tal como infarto cerebral y fibrosis por hepatitis) y VEGF (arteriopatía isquémica y arteriopatía oclusiva periférica).
Un ejemplo particularmente preferido de la composición farmacéutica según la presente invención comprende un complejo de al menos una sustancia seleccionada de OCIF, un análogo y una variante del mismo y al menos una sustancia seleccionada de un copolímero de la presente invención o una sal farmacológicamente aceptable del mismo. Una composición farmacéutica de este tipo es particularmente adecuada para la prevención o el tratamiento de osteopatías metabólicas. En la presente invención, tales osteopatías metabólicas incluyen cualquier enfermedad que se caracterice por una reducción de masa ósea sustancial en el paciente que padece la misma y en la que es necesario suprimir la resorción ósea o la tasa de resorción ósea con el fin de prevenir o tratar dichas enfermedades.
Las osteopatías metabólicas que puede tratarse o prevenirse usando la composición farmacéutica de la presente invención incluyen: osteoporosis primaria (osteoporosis senil, osteoporosis postmenopáusica y osteoporosis juvenil idiopática); osteoporosis endocrina (hipertiroidismo, hiperparatiroidismo, síndrome de Cushing y acromegalia); osteoporosis que acompaña a hipogonadismo (hipopituitarismo, síndrome de Klinefelter y síndrome de Turner); osteoporosis hereditaria y congénita (osteogenesis imperfecta, homocistinuria, síndrome de Menkes y síndrome de Riley-Day); osteopenia debida a fijación o alivio de la carga de gravedad e inmovilización de las extremidades; enfermedad de Paget; osteomielitis; foco infeccioso debido a la pérdida de hueso; hipercalcemia que resulta de carcinoma sólido (carcinoma de mama, cáncer de pulmón, cáncer de riñón y cáncer de próstata); neoplasias hematológicas (mieloma múltiple, linfoma y leucemia); hipercalcemia idiopática; hipercalcemia que acompaña a hipertiroidismo o insuficiencia renal; osteopenia que resulta de medicación con esteroides; osteopenia que resulta de la administración de otros medicamentos (por ejemplo, agentes inmunosupresores tales como metotrexato y ciclosporina A, heparina y antiepilépticos); osteopenia que acompaña a insuficiencia renal; osteopenia que acompaña a una operación quirúrgica o enfermedades del aparato digestivo (por ejemplo, obstrucción del intestino delgado, obstrucción del intestino grueso, hepatitis crónica, gastrectomía, cirrosis hepática biliar primaria y cirrosis hepática); osteopenia debida a diversos tipos de reumatismo tal como artritis reumatoide; osteoclasia y destrucción de las articulaciones debido a diversos tipos de reumatismo tal como artritis reumatoide; artritis reumatoide de tipo mutilante; osteoartritis; pérdida de hueso periodontal; metástasis cancerígena en hueso (metástasis con osteolisis); osteonecrosis o muerte de osteocitos que acompaña a una lesión traumática, enfermedad de Gaucher, anemia drepanocítica, lupus eritematoso sistémico o lesión no traumática; osteodistrofia tal como osteodistrofia renal; osteopenia que acompaña a hipofosfatasia o diabetes; osteopenia que acompaña a un trastorno nutricional o trastorno de alimentación; y otras osteopenias. Además, en la presente invención, la caquexia debida al carcinoma sólido mencionado anteriormente, la metástasis cancerígena en hueso (metástasis con osteolisis) o neoplasias hematológicas se incluyen también en osteopatías metabólicas (véase la solicitud de patente japonesa (Kokai) número 2000-178200).
La composición farmacéutica según la presente invención tal como se describió anteriormente puede administrarse de manera segura por vía oral y por vía no oral a un ser humano o animales distintos de un ser humano. La forma farmacéutica de la composición farmacéutica puede seleccionarse de manera apropiada dependiendo de la clase de enfermedad, el nivel de la enfermedad y el estado, edad, sexo y peso del paciente. Por ejemplo, la composición farmacéutica puede administrarse por vía oral en forma de comprimidos, cápsulas, polvos, gránulos o jarabes; inyectarse en forma de una inyección por vía intravenosa sola o en combinación con un coadyuvante común tal como glucosa o aminoácidos, o inyectarse por vía intramuscular, por vía subcutánea, por vía intracutánea o por vía intraperitoneal sola; administrarse por vía transdérmica en forma de cataplasma; administrarse por vía transnasal en forma de gotas nasales; administrarse por vía transmucosa o a la cavidad oral en forma de una preparación transmucosa; o administrarse por vía intrarrectal en forma de un supositorio. Estas preparaciones pueden formularse de una manera convencional usando agentes auxiliares bien conocidos que se usan generalmente en el campo de la medicina tales como excipientes, agentes de unión, disgregantes, lubricantes, agentes aromatizantes, solubilizantes, agentes de suspensión, colorantes, reguladores de pH, antisépticos, agentes de gelificación, tensioactivos y agentes de recubrimiento.
Cuando la composición farmacéutica se prepara en forma de un comprimido, pueden usarse diversos vehículos conocidos en la técnica. Los ejemplos de tales vehículos incluyen: excipientes tales como lactosa, sacarosa, cloruro de sodio, glucosa, urea, almidón, carbonato de calcio, caolín, celulosa cristalina y ácido silícico; agentes de unión tales como agua, etanol, propanol, jarabe simple, disolución de glucosa, disolución de almidón, disolución de gelatina, carboximetilcelulosa, goma laca, metilcelulosa, fosfato de potasio y polivinilpirrolidona; disgregantes tales como almidón seco, alginato de sodio, polvo de agar, polvo de laminaran, hidrogenocarbonato de sodio, carbonato de calcio, ésteres de ácido graso polioxietileno-sorbitano, laurilsulfato de sodio, monoglicérido de ácido esteárico, almidón y lactosa; inhibidores de la desintegración tales como sacarosa, estearina, manteca de cacao y aceite hidrogenado; aceleradores de la absorción tales como bases de amonio cuaternario y laurilsulfato de sodio; agentes hidratantes tales como glicerina y almidón; absorbentes tales como almidón, lactosa, caolín, bentonita y ácido silícico coloidal; y lubricantes tales como talco purificado, estearatos, polvo de ácido bórico y polietilenglicol. Además, puede cubrirse un comprimido de este tipo con un recubrimiento convencional, si es necesario. Los ejemplos de un comprimido recubierto de este tipo incluyen un comprimido recubierto de azúcar, un comprimido recubierto de gelatina, un comprimido con recubrimiento entérico, un comprimido con recubrimiento de película, un comprimido de dos capas y un comprimido de múltiples capas.
Cuando la composición farmacéutica se prepara en forma de una píldora, pueden usarse diversos vehículos conocidos en la técnica. Los ejemplos de tales vehículos incluyen: excipientes tales como glucosa, lactosa, manteca de cacao, almidón, aceite vegetal hidrogenado, caolín y talco; agentes de unión tales como polvo de goma arábiga, polvo de goma tragacanto, gelatina y etanol; y disgregantes tales como agar de laminaran.
Cuando la composición farmacéutica se prepara en forma de un supositorio, pueden usarse diversos vehículos conocidos en la técnica. Los ejemplos de tales vehículos incluyen polietilenglicol, manteca de cacao, alcoholes superiores, ésteres de alcoholes superiores, gelatina y glicéridos semisintéticos.
Cuando se prepara la composición farmacéutica en forma de una inyección, se prefiere que la composición en forma de una disolución o una suspensión se esterilice y se haga isotónica con sangre. Si se prepara una composición de este tipo en forma de una disolución, una emulsión, una suspensión o una disolución acuosa sustancialmente homogénea, pueden usarse diversos diluyentes conocidos en la técnica. Los ejemplos de tales diluyentes incluyen agua, etanol, propilenglicol, alcohol isoestearílico etoxilado, alcohol isoestearílico polioxilado y ésteres de ácido graso polioxietileno sorbitano. En este caso, la composición farmacéutica puede contener además sal común, glucosa o glicerina en una cantidad suficiente para mantener la isotonicidad con la sangre. Además, la composición farmacéutica puede contener también solubilizantes convencionales, agentes de tamponamiento, agentes suavizantes, reguladores de pH, estabilizadores o agentes solubilizantes. Una inyección de este tipo puede liofilizarse.
Adicionalmente, la composición farmacéutica de la presente invención puede contener también colorantes, conservantes, perfumes, agentes aromatizantes, edulcorantes u otro medicamento si se requiere.
La cantidad del complejo de OCIF o un análogo o variante del mismo y copolímero o una sal farmacológicamente aceptable del mismo contenida en la composición farmacéutica de la presente invención no se limita a ningún valor específico, pero normalmente está en el intervalo de desde el 0,1 hasta el 70% en peso, y preferiblemente en el intervalo de desde el 1 hasta el 30% en peso.
En la presente invención, la dosis del complejo de OCIF o un análogo o variante del mismo y copolímero o una sal farmacológicamente aceptable del mismo contenida en la composición farmacéutica de la presente invención depende de diversos factores incluyendo el estado y la edad del paciente, la vía de administración y la forma del fármaco. En general, la cantidad administrada a un ser humano adulto por administración está en el intervalo entre el límite superior de 1 a 50 mg/kg y un límite inferior de 0,001 a 0,1 mg/kg, en la que se prefiere el intervalo de desde 0,01 hasta 1 mg/kg, y se prefiere más el intervalo de desde 0,1 hasta 1 mg/kg.
La composición farmacéutica según la presente invención debe administrarse una vez en varios meses, una vez al mes, una vez en varios días, una vez al día o varias veces al día dependiendo de la clase de componente contenido en la composición farmacéutica, la vía de administración y la forma del fármaco. Si la composición comprende un complejo de OCIF o un análogo o variante del mismo y un copolímero o una sal farmacológicamente aceptable del mismo para su uso como un agente para el tratamiento o la prevención de osteopatías metabólicas según la presente invención debe administrarse una vez en varios meses, una vez al mes, una vez en varios días, una vez aldía o varias veces al día dependiendo de la clase de principio activo contenido en el agente para el tratamiento o la prevención de osteopatías metabólicas, la vía de administración y la forma del fármaco.
El copolímero de la presente invención y las sales farmacológicamente aceptables de los mismos son útiles como modificador polimérico que puede proporcionar un complejo que tiene propiedades uniformes, especialmente producción reducida de estructuras reticuladas desorganizadas con la proteína, mejor mantenimiento de actividad de proteína y excelente retención de la proteína en la sangre tras la administración de dicho complejo. Esto lo hace particularmente útil como un modificador para modificar las propiedades farmacéuticas de las proteínas que tienen una actividad farmacéutica útil.
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Ejemplos
Los siguientes ejemplos, ejemplos de referencia y ejemplos de prueba pretenden ilustrar adicionalmente la presente invención y no pretenden limitar el alcance de la invención en ningún modo. En los siguientes ejemplos, m y R^{3} son tal como se definieron anteriormente para las fórmulas (I) y (II), "razón de comp." es la razón de composición [es decir la razón de las unidades estructurales (I) y (II)], "gr. prom. pol." es el grado promedio de polimerización del copolímero preparado y "razón de hid." es la razón de hidrólisis del copolímero preparado [es decir, la razón promedio de las unidades estructurales en las que R^{3} es -OH con respecto a las unidades estructurales en las que R^{3} es distinto de -OH].
Ejemplo 1 Preparación de hidrolizado de poli(PEG_{500}-MA) [poli (PEG_{500}-MA)h)] en el que m=6-16, R^{3}=OH, razón de comp.=aproximadamente 1:1, gr. prom. pol.=30-40 y razón de hid.=aproximadamente 10:0 (compuesto Nº 1)
Se usó como material de partida un copolímero de alil-metil diéter de polioxietileno (m=6-16, Alk=etileno, R^{1}=hidrógeno y R^{2}=metilo) y anhídrido maleico, en el que la cadena lateral de polioxietileno tiene un peso molecular promedio de aproximadamente 500 y el grado promedio de polimerización de la cadena principal está en el intervalo de desde 30 hasta 40, [AM-0530K, fabricado por NOF Corporation (a continuación en el presente documento denominado "poli(PEG_{500}-MA)"]. Se añadieron 50 ml de agua destilada a 3 g de poli(PEG_{500}-MA) para disolver dicho material de partida, y se agitó la disolución así obtenida a 40ºC durante 15 horas. Se condensó la disolución resultante usando una membrana de ultrafiltración hecha de polietersulfona (que tiene un límite de peso molecular de 10.000, fabricado por Millipore Corporation, número de modelo PBGC07610), y se liofilizó el condensado resultante para obtener 1,3 g del compuesto del título poli(PEG_{500}-MA)h (compuesto Nº 1) como un compuesto aceitoso.
Se purificó poli(PEG_{500}-MA)h (compuesto Nº 1) usando filtración en gel tal como sigue. Se disolvieron 100 mg de poli(PEG_{500}-MA)h (compuesto Nº 1) en 4 ml de disolución de hidróxido de sodio 0,001 N. Se dividió la disolución en cuatro lotes y se aplicó cada lote de 1 ml a una columna de filtración en gel (PD-10, fabricada por Amersham-Pharmacia). Se desechó el primer 1 ml de eluyente. Entonces se aplicaron 1,5 ml de disolución de hidróxido de sodio 0,001 N a cada columna y se eluyeron 1,5 ml adicionales de la columna y se desecharon. Entonces se aplicaron 2,5 ml de disolución de hidróxido de sodio 0,001 N a cada columna y se eluyeron 2,5 ml adicionales de la columna y ésta es la fracción que contenía el poli(PEG_{500}-MA)h purificado (compuesto Nº 1). Se combinaron las fracciones purificadas de las cuatro columnas para dar 10 ml de una disolución purificada del compuesto del título. Se determinó que el rendimiento tras la etapa de purificación (determinado espectrofotométricamente midiendo la absorbancia del poli(PEG_{500}-MA)h a 210 nm antes y después de la purificación) era del 80% (80 mg de polímero) y se determinó que la concentración en la disolución purificada era de 8 mg/ml.
Se determinó el contenido en grupos carboxilo del compuesto del título mediante valoración conductimétrica tal como sigue. Se enrasaron 7,5 ml de la disolución del compuesto del título purificado obtenido anteriormente (que contenía 60 mg del compuesto del título) hasta un volumen de 50 ml con agua destilada y se ajustó la disolución así obtenida a pH 12 con disolución acuosa de hidróxido de sodio 1 M. Se añadió ácido clorhídrico 0,1 M a la disolución en incrementos de 0,1 ml, midiéndose el pH y la conductividad de la disolución tras cada adición de ácido clorhídrico. Entonces se calculó el contenido en grupos carboxilo del copolímero a partir de la cantidad de ácido clorhídrico 0,1 M añadida en la región de tamponamiento de la conductividad (es decir la región de la gráfica de conductividad frente a la cantidad de ácido clorhídrico añadida en la que los grupos carboxilo del copolímero del compuesto del título actúan como un tampón, correspondiendo dicha región a un intervalo de pH de aproximadamente 10,5 a 3); la cantidad molar de ácido clorhídrico usada en la región de tamponamiento de la conductividad es igual a la cantidad molar de grupos carboxilo en el copolímero del compuesto del título. Como resultado, se determinó que el contenido en grupos carboxilo por 1 g de compuesto del título era de 3,22 mmoles. A partir de esto, se calculó que la razón de composición era de 1:1,07. Esta cifra se aplicó para los siguientes ejemplos, en los que se usó el mismo material de partida.
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Ejemplo 2 Preparación de hidrolizado de poli(PEG_{1500}-MA) [poli (PEG_{1500}-MA)h)] en el que m=28-38, R^{3}=OH, razón de comp.=aproximadamente 1:1, gr. prom. pol.=10-15 y razón de hid.=aproximadamente 10:0 (compuesto Nº 2)
Se usó como material de partida un copolímero de alil-metil diéter de polioxietileno (m=28-38, Alk=etileno, R^{1}=hidrógeno y R^{2}=metilo) y anhídrido maleico, en el que el polioxietileno tiene un peso molecular promedio de aproximadamente 1500 y el grado promedio de polimerización de la cadena principal está en el intervalo de 10-15, (AM-1510K, fabricado por NOF Corporation) [a continuación en el presente documento denominado "poli(PEG_{1500}-MA)"]. Se añadieron 25 ml de agua destilada a 1,5 g de poli(PEG_{1500}-MA) para disolver dicho material de partida, y se agitó la disolución así obtenida a temperatura ambiente durante 20 horas. Al final de este tiempo, se condensó la disolución de la misma manera que se describió en el ejemplo 1 anterior usando una membrana de ultrafiltración hecha de polietersulfona (que tiene un límite de peso molecular de 10.000, fabricada por Millipore Corporation, número de modelo PBGC07610), y se liofilizó el condensado resultante para obtener 0,8 g del compuesto del título poli(PEG_{1500}-MA)h (compuesto Nº 2) como un compuesto aceitoso.
Se midió el contenido en grupos carboxilo del compuesto del título poli(PEG_{1500}-MA)h (compuesto Nº 2) de la misma manera que se describió en el ejemplo 1 anterior y, como resultado, se determinó que el contenido en grupos carboxilo por 1 g del compuesto del título era de 1,63 mmoles. A partir de esto, se calculó que la razón de composición era de 1:1,4. Esta cifra se aplicó para los siguientes ejemplos en los que se usó el mismo material de partida.
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Ejemplo 3 Preparación del producto de amonólisis de poli(PEG_{500}-MA) [poli (PEG_{500}-MA)a)] en el que m=6-16, R^{3}=NH_{2}, razón de comp.=aproximadamente 1:1, gr. prom. pol.=30-40 y razón de hid.=aproximadamente 0:10 (compuesto Nº 3)
Se añadieron 9,5 g de agua amoniacal (concentración de amoniaco: 28% en peso) a 1 g de poli(PEG_{500}-MA) (AM-0530K, fabricado por NOF Corporation) para disolver dicho material de partida, y se agitó la disolución así obtenida a temperatura ambiente durante 16 horas. Al final de este tiempo, se sometió a diálisis la disolución así obtenida a través de una membrana de celulosa regenerada (que tiene un límite de peso molecular de 12.000 a 14.000, fabricada por Sanko Junyaku Co., Ltd., número de modelo UC36-32-100) frente a 1 litro de una disolución acuosa de ácido acético al 0,1% en peso durante un día, y entonces se sometió adicionalmente a diálisis frente a 1 litro de agua durante 1 día. Tras renovar 1 litro de agua, se sometió adicionalmente a diálisis durante un día más. Llevando a cabo tal diálisis, se eliminó el amoniaco en exceso del producto. Se condensó la disolución así obtenida usando una membrana de ultrafiltración hecha de polietersulfona (que tiene un límite de peso molecular de 10.000, y fabricada por Millipore Corporation, número de modelo PBGC07610), y se liofilizó el condensado resultante para obtener 0,99 g del compuesto del título poli(PEG_{500}-MA)a (compuesto Nº 3) como un compuesto aceitoso.
Se determinó el contenido en grupos carboxilo en 1 g de poli(PEG_{500}-MA)a (compuesto Nº 3) mediante valoración conductimétrica de la misma manera que se describió en el ejemplo 1 anterior y, como resultado, se determinó que el contenido en grupos carboxilo por 1 g del compuesto del título era de 1,55 mmoles.
En las condiciones de reacción usadas, es posible que pudiera someterse el residuo de anhídrido maleico no sólo a una reacción de apertura de anillo debida a la amonólisis sino también hidrólisis mediante el agua presente en el sistema de reacción. Se calculó la razón de los residuos de anhídrido maleico sometidos a amonólisis con respecto a los residuos de anhídrido maleico sometidos a hidrólisis tal como sigue.
En el ejemplo 1, se determinó el contenido en grupos carboxilo en 1 g de poli(PEG_{500}-MA)h (compuesto Nº 1). Esto da la cifra para el contenido en grupos carboxilo cuando todos los residuos de ácido maleico están completamente hidrolizados (3,22 mmoles por 1 g de polímero). A partir de este resultado, se determinaron mediante cálculo el peso de poli(PEG_{500}-MA)h (compuesto Nº 1) por mol de grupo carboxilo (1/3,22x10^{-3} g) y el peso de poli(PEG_{500}-MA)h (compuesto Nº 1) por mol de residuo de ácido maleico de anillo abierto [2 x el peso de poli(PEG_{500}-MA)h (compuesto Nº 1) por mol de residuo de ácido maleico de anillo abierto, puesto que hay 2 grupos carboxilo por residuo de ácido maleico completamente hidrolizado], dando los resultados de 311 g y 621 g, respectivamente. A partir de estos valores, se determinaron el peso de poli(PEG_{500}-MA) (es decir, el peso del copolímero antes de la hidrólisis) por gramo de grupo funcional, y el peso de poli(PEG_{500}-MA)a (compuesto Nº 3) obtenido añadiendo amoniaco a poli (PEG_{500}-MA) por gramo de grupo funcional. Específicamente, se obtuvo el peso de poli(PEG_{500}-MA) (es decir, el peso del copolímero antes de la hidrólisis) por mol de residuo de anhídrido maleico restando el peso molecular de una molécula de agua (18 g) del peso del copolímero completamente hidrolizado, dando una cifra de 603 g. Se obtuvo el peso de poli(PEG_{500}-MA)a (compuesto Nº 3) por mol de grupo carboxilo añadiendo el peso molecular de una molécula de amoniaco (17 g) al peso de poli(PEG_{500}-MA), dando una cifra de 620 g. A partir de este valor, se determinó mediante cálculo (1 g/620) el contenido teórico en grupos carboxilo por 1 g de poli(PEG_{500}-MA)a (compuesto Nº 3) en el que todos los residuos de anhídrido maleico se han sometido a amonólisis (es decir, nada de hidrólisis), y se encontró que era de 1,61 mmoles. A partir del contenido en grupos carboxilo por 1 g de poli(PEG_{500}-MA)h (compuesto Nº 1), en el que todos los residuos de anhídrido maleico se sometieron a hidrólisis, el contenido teórico en grupos carboxilo por 1 g de poli(PEG_{500}-MA)a (compuesto Nº 3) en el que todos los residuos de anhídrido maleico se han sometido a amonólisis, y el contenido real en grupos carboxilo por 1 g de poli(PEG_{500}-MA)a (compuesto Nº 3) medido anteriormente (es decir 1,55 mmoles), se calculó la razón de residuos de anhídrido maleico sometidos a amonólisis en el compuesto del título con respecto al número total de residuos de anhídrido maleico en el material de partida, y se determinó que era de 1,0. Por tanto, se confirmó que sustancialmente todos los residuos de anhídrido maleico se habían sometido a amonólisis y que no había tenido lugar casi nada de hidrólisis.
Ejemplo 4 Preparación del producto de reacción de dimetilamina y poli(PEG_{500}-MA) [poli (PEG_{500}-MA)dma)] en el que m=6-16, R^{3}=NMe_{2}, razón de comp.=aproximadamente 1:1, gr. prom. pol.=30-40 y razón de hid.=aproximadamente 0:10 (compuesto Nº 4)
Se añadieron 71 g de una disolución acuosa de dimetilamina (concentración de dimetilamina: 50% en peso) a 10 g de poli(PEG_{500}-MA) (AM-0530K, fabricado por NOF Corporation) para disolverlo, y se agitó la disolución así obtenida a temperatura ambiente durante 20 horas. Al final de este tiempo, se sometió la disolución así obtenida a diálisis a través de una membrana de celulosa regenerada (que tiene un límite de peso molecular de 12.000 a 14.000, y fabricada por Sanko Junyaku Co., Ltd., número de modelo UC36-32-100) frente a 10 litros de una disolución acuosa de ácido acético al 0,1% en peso durante un día, y entonces se sometió adicionalmente a diálisis frente a 10 litros de agua durante 1 día. Tras renovar 10 litros de agua, se sometió adicionalmente a diálisis durante un día más. Llevando a cabo tal diálisis, se eliminó la dimetilamina en exceso del producto. Se condensó la disolución así obtenida usando una membrana de ultrafiltración hecha de polietersulfona (que tiene un límite de peso molecular de 10.000, y fabricada por Millipore Corporation, número de modelo PBGC07610), y se liofilizó el condensado resultante para obtener 6,3 g del compuesto del título poli(PEG_{500}-MA)dma (compuesto Nº 4) como un compuesto aceitoso.
Se determinó el contenido en grupos carboxilo en 1 g de poli(PEG_{500}-MA)dma (compuesto Nº 4) de la misma manera que se describió en el ejemplo 1 anterior, y se determinó que era de 1,53 mmoles. Usando un cálculo similar al del ejemplo 3 para el producto de la amonólisis, se determinó mediante cálculo el contenido teórico en grupos carboxilo en 1 g de poli(PEG_{500}-MA)dma (compuesto Nº 4) en el que todos los residuos de anhídrido maleico se han sometido a aminólisis, y se determinó que era de 1,54 mmoles. A partir de estos resultados, se calculó la razón de residuos de anhídrido maleico sometidos a aminólisis en el compuesto del título con respecto al número total de residuos de anhídrido maleico en el material de partida, y se determinó que era de 1,0. Por tanto, se confirmó que sustancialmente todos los residuos de anhídrido maleico se habían sometido a aminólisis mediante dimetilamina y que no había tenido lugar casi nada de hidrólisis.
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Ejemplo 5 Preparación del producto de reacción de 1-amino-2-propanol y poli(PEG_{500}-MA) [poli (PEG_{500}-MA)ipa)] en el que m=6-16, R^{3}=NH(CH_{2}CH(OH)CH_{3}), razón de comp.=aproximadamente 1:1, gr. prom. pol.=30-40 y razón de hid.=aproximadamente 0:10 (compuesto Nº 5)
Se añadieron 14 g de 1-amino-2-propanol a 1,5 g de poli(PEG_{500}-MA) (AM-0530K, fabricado por NOF Corporation) para disolverlo, y se agitó la disolución así obtenida a temperatura ambiente durante 16 horas. Al final de este tiempo, se añadieron 300 ml de agua destilada a la disolución, y se añadió adicionalmente ácido acético glacial para neutralizar la disolución. Se condensó la disolución así obtenida usando una membrana de ultrafiltración hecha de polietersulfona (que tiene un límite de peso molecular de 10.000, y fabricada por Millipore Corporation, número de modelo PBGC07610) para obtener 50 ml de condensado. Se añadieron 300 ml de agua destilada al condensado, y se condensó de nuevo la disolución resultante de la misma manera. Se repitió cinco veces este ciclo de diluir el condensado con agua destilada seguido de re-condensación para eliminar el 1-amino-2-propanol en exceso. Se liofilizó el condensado resultante para obtener 1,3 g del compuesto del título poli(PEG_{500}-MA)ipa (compuesto Nº 5) como un compuesto aceitoso.
Se determinó el contenido en grupos carboxilo en 1 g de poli(PEG_{500}-MA)ipa (compuesto Nº 5) de la misma manera que se describió en el ejemplo 1 anterior, y se determinó que era de 1,55 mmoles. Usando un cálculo similar al del ejemplo 3 para el producto de la amonólisis, se determinó mediante cálculo el contenido teórico en grupos carboxilo en 1 g de poli(PEG_{500}-MA)ipa (compuesto Nº 5) en el que todos los residuos de anhídrido maleico se han sometido a aminólisis, y se determinó que era de 1,47 mmoles. A partir de estos resultados, se calculó la razón de residuos de anhídrido maleico sometidos a aminólisis en el compuesto del título con respecto al número total de residuos de anhídrido maleico en el material de partida, y se determinó que era de 1,0. Por tanto, se confirmó que sustancialmente todos los residuos de anhídrido maleico en el material de partida se habían sometido a aminólisis mediante 1-amino-2-propanol y que no había tenido lugar casi nada de hidrólisis.
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Ejemplo 6 Producto de reacción de alcohólisis entre etanol y poli(PEG_{500}-MA) [poli (PEG_{500}-MA)ea)] en el que m=6-16, R^{3}=OCH_{2}CH_{3}, razón de comp.=aproximadamente 1:1, gr. prom. pol.=30-40 y razón de hid.=aproximadamente 4:6 (compuesto Nº 6)
Se añadieron 25 g de etanol absoluto a 1,5 g de poli(PEG_{500}-MA) (AM-0530K, fabricado por NOF Corporation) para disolverlo, y se agitó la disolución así obtenida a temperatura ambiente durante 16 horas. Al final de este tiempo, se añadieron 300 ml de agua, y se condensó la disolución resultante usando una membrana de ultrafiltración hecha de polietersulfona (que tiene un límite de peso molecular de 10.000 y fabricada por Millipore Corporation, número de modelo PBGC07610) para obtener 50 ml de condensado. Se añadieron 300 ml de agua destilada al condensado, y se condensó de nuevo la disolución resultante de la misma manera. Se repitió cinco veces este ciclo de diluir el condensado con agua destilada seguido de re-condensación para eliminar en exceso etanol. Se liofilizó el condensado resultante para obtener 0,8 g del compuesto del título poli(PEG_{500}-MA)ea (compuesto Nº 6) como un compuesto aceitoso.
Se determinó el contenido en grupos carboxilo en 1 g de poli(PEG_{500}-MA)ea (compuesto Nº 6) de la misma manera que se describió en el ejemplo 1 anterior, y se determinó que era de 2,16 mmoles. Usando un cálculo similar al del ejemplo 3 para el producto de la amonólisis, se determinó mediante cálculo el contenido teórico en grupos carboxilo en 1 g de poli(PEG_{500}-MA)ea (compuesto Nº 6) en el que todos los residuos de anhídrido maleico se han sometido a alcohólisis, y se determinó que era de 1,47 mmoles. A partir del resultado, se calculó la razón de residuos de anhídrido maleico en el compuesto del título sometidos a alcohólisis con respecto al número total de residuos de anhídrido maleico en el material de partida, y se determinó que era de 0,6. Por tanto, puede observarse que el 60% de los residuos de anhídrido maleico en el material de partida se sometieron a alcohólisis, y el 40% restante de los residuos de anhídrido maleico se sometieron a hidrólisis.
Ejemplo 7 Preparación del producto de amonólisis de poli(PEG_{1500}-MA) [poli (PEG_{1500}-MA)a)] en el que m=28-38, R^{3}=NH_{2}, razón de comp.= aproximadamente 1:1. gr. prom. pol.=10-15 y razón de hid.= aproximadamente 4:6 (compuesto Nº 7)
Se añadieron 14,5 g de agua amoniacal (concentración de amoniaco: 28% en peso) a 1,5 g de poli(PEG_{1500}-MA) (AM- 1510K, fabricado por NOF Corporation) para disolverlo, y se agitó la disolución así obtenida a temperatura ambiente durante 20 horas. Al final de este tiempo, se añadieron 300 ml de agua destilada a la disolución, y se añadió adicionalmente ácido acético glacial para neutralizar dicha disolución. Se condensó la disolución resultante usando una membrana de ultrafiltración hecha de polietersulfona (que tiene un límite de peso molecular de 10.000 y fabricada por Millipore Corporation, número de modelo PBGC07610) para obtener 50 ml de condensado. Se añadieron 300 ml de agua destilada al condensado, y se condensó de nuevo la disolución resultante de la misma manera. Se repitió cinco veces este ciclo de diluir el condensado con agua destilada seguido de re-condensación para eliminar el amoniaco en exceso. Se liofilizó el condensado resultante para obtener 0,7 g del compuesto del título poli(PEG_{1500}-MA)a (compuesto Nº 7) como un compuesto aceitoso.
Se determinó el contenido en grupos carboxilo en 1 g de poli(PEG_{1500}-MA)a de la misma manera que en el ejemplo 1, y se encontró que era de 1,12 mmoles. Al igual que con la amonólisis de poli(PEG_{500}-MA)a del ejemplo 3, existe una posibilidad de que los residuos de anhídrido maleico en el material partida de poli(PEG_{1500}-MA) pudieran someterse tanto a amonólisis como a hidrólisis. Por tanto, se calculó la razón de residuos de anhídrido maleico sometidos a amonólisis con respecto a la razón de residuos de anhídrido maleico sometidos a hidrólisis tal como sigue.
En el ejemplo 2, se determinó el contenido en grupos carboxilo en 1 g de poli(PEG_{1500}-MA)h (compuesto Nº 2). Esto da la cifra para el contenido en grupos carboxilo cuando todos los residuos de ácido maleico están completamente hidrolizados (1,63 mmoles por 1 g de polímero). A partir de este resultado, se calcularon el peso de poli(PEG_{1500}-MA)h (compuesto Nº 2) por mol de grupo carboxilo (1/1,63x10^{-3} g) y el peso de poli(PEG_{1500}-MA)h (compuesto Nº 2) por mol de residuo de ácido maleico de anillo abierto [2 x el peso de poli(PEG_{1500}-MA)h (compuesto Nº 2) por mol de residuo de ácido maleico de anillo abierto, puesto que hay 2 grupos carboxilo por residuo de ácido maleico completamente hidrolizado], dando los resultados de 613 g y 1,227 g, respectivamente. A partir del peso así obtenido de poli(PEG_{1500}-MA)h, y usando un enfoque similar al del ejemplo 3 anterior, se calculó el contenido teórico en grupos carboxilo por 1 g de poli(PEG_{1500}-MA)a (compuesto Nº 7) en el que todos los residuos de anhídrido maleico se han sometido a amonólisis, y se determinó que era de 0,82 mmoles. A partir de estos valores y el contenido real en grupos carboxilo de poli(PEG_{1500}-MA)a (compuesto Nº 7) medido anteriormente (1,12 mmoles), se determinó mediante cálculo la razón de residuos de anhídrido maleico en el compuesto del título sometidos a amonólisis con respecto al número total de residuos de anhídrido maleico en el material de partida, y se encontró que era de 0,6. Por tanto, se confirmó que el 60% de los residuos de anhídrido maleico en el material de partida poli(PEG_{1500}-MA) se sometieron a amonólisis, y el 40% restante de los residuos de anhídrido maleico se sometieron a hidrólisis.
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Ejemplo 8 Preparación del producto de reacción de dimetilamina y poli(PEG_{1500}-MA) [poli (PEG_{1500}-MA)dma)] en el que m=28-38, R^{3}=NMe_{2}, razón de comp.= aproximadamente 1:1, gr. prom. pol.=10-15 y razón de hid.= aproximadamente 0:10 (compuesto Nº 8)
Se añadieron 11 g de una disolución acuosa de dimetilamina (que tiene una concentración del 50% en peso) a 1 g de poli (PEG_{1500}-MA) (AM-1510K, fabricado por NOF Corporation) para disolverlo, y se agitó la disolución así obtenida a temperatura ambiente durante 20 horas. Al final de este tiempo, se añadieron 300 ml de agua destilada a la disolución, y se añadió adicionalmente ácido acético glacial para neutralizar la disolución. Se condensó la disolución resultante usando una membrana de ultrafiltración hecha de polietersulfona (que tiene un límite de peso molecular de 10.000 y fabricada por Millipore Corporation, número de modelo PBGC07610) para obtener 50 ml de condensado. Se añadieron 300 ml de agua destilada al condensado, y se condensó de nuevo la disolución resultante de la misma manera. Se repitió cinco veces este ciclo de diluir el condensado con agua destilada seguido de re-condensación para eliminar la dimetilamina en exceso. Se liofilizó el condensado resultante para obtener el compuesto del título poli(PEG_{1500}-MA)dma (compuesto Nº 8) como un compuesto aceitoso.
Se determinó el contenido en grupos carboxilo en 1 g de poli(PEG_{1500}-MA)dma (compuesto Nº 8) de la misma manera que en el ejemplo 1, y se calculó que era de 0,82 mmoles. Usando un enfoque similar al usado en el ejemplo 3, se determinó mediante cálculo que el contenido teórico en grupos carboxilo en 1 g de poli(PEG_{1500}-MA)dma en el que todos los residuos de anhídrido maleico se han sometido a aminólisis era de 0,80 mmol. A partir de estos resultados, se determinó mediante cálculo la razón de residuos de anhídrido maleico en el compuesto del título sometidos a aminólisis con respecto al número total de residuos de anhídrido maleico en el material de partida, y se encontró que era de 1,0. Por tanto, se confirmó que sustancialmente todos los residuos de anhídrido maleico se habían sometido a aminólisis mediante dimetilamina.
Ejemplo 9 Preparación de complejos de modificadores poliméricos de los ejemplos 1 a 8 con OCIF
Se disolvió cada uno de los modificadores poliméricos preparados en el ejemplos 1 a 8 en solución salina tamponada con fosfato (PBS) pH 6,0 (disolución que se obtiene mezclando una disolución que contiene hidrogenofosfato de disodio 10 mM y cloruro de sodio 150 mM y una disolución que contiene dihidrogenofosfato de sodio 10 mM y cloruro de sodio 150 mM a una razón adecuada para dar un tampón que tiene un pH de 6,0) para preparar disoluciones que tienen una concentración de modificador de desde 1 hasta 20 mg/ml. Para cada disolución de cada modificador a su vez, se mezclaron 0,625 ml de la disolución preparada de modificador polimérico y 0,625 ml de una disolución que contenía OCIF maduro humano purificado (OCIF preparado tal como se describe en los documentos WO 96/26217 y EP 816380) [concentración de proteína: 2 mg/ml, medio: PBS (pH 6,0)], y se dejó reposar la mezcla así obtenida a de 4ºC a 37ºC durante al menos una hora, para dar una serie de disoluciones [medio: PBS (pH 6,0)] que contenían OCIF modificado con los modificadores poliméricos de los ejemplos 1 a 8 en las que la razón de modificador con respecto a OCIF en cada disolución se determina mediante la concentración de la disolución de modificador añadida y las condiciones de reacción. Las razones en peso de modificador/OCIF para algunos de los complejos preparados (y las condiciones en las que se prepararon) se muestran en la tabla 6 en el ejemplo de prueba 2 a continuación. Se midió el tamaño molecular de cada uno de los complejos resultantes tal como se explica en el ejemplo de prueba 11 a continuación. La tasa de detección de OCIF mediante ELISA en los complejos se midió tal como se describe en el ejemplo de prueba 3 a continuación.
Adicionalmente, para cada uno de los modificadores poliméricos, se preparó una disolución de OCIF modificado con el modificador polimérico de la misma manera excepto en que se usó PBS con un pH de 7,4 como medio.
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Ejemplo 10 Preparación de sal de sodio del producto de amonólisis de poli(PEG_{500}-MA) [poli (PEG_{500}-MA)a)-Na] en el que m=6-16, R^{3}=NH_{2}, razón de comp.= aproximadamente 1:1, gr. prom. pol.=30-40 y razón de hid.= aproximadamente 3,1:6,9 (compuesto Nº 9)
Se usó como material de partida un copolímero de alil-metil diéter de polioxietileno (m = 6-16, Alk = etileno, R^{1} = hidrógeno y R^{2} = metilo) y anhídrido maleico, en el que la cadena lateral de polioxietileno tiene un peso molecular promedio de aproximadamente 500 y el grado promedio de polimerización de la cadena principal está en el intervalo de desde 30 hasta 40 (AM-0530K, fabricado por NOF Corporation, que tiene un número de lote de M34529) [a continuación en el presente documento denominado "poli(PEG_{500}-MA)"]. Se añadieron 61 ml de una disolución amoniaco 0,5 M/1,4-dioxano a 10,1 g de dicho material de partida de poli(PEG_{500}-MA), y se agitó la disolución resultante a 25ºC durante 20 horas. Al final de este tiempo, se añadieron 200 ml de dietil éter y 100 ml de una disolución acuosa de hidróxido de sodio 0,2 M a la disolución, y se agitó enérgicamente la mezcla durante aproximadamente 3 minutos. Tras permitir la separación de fases de las fases orgánica y acuosa, se recogió la fase inferior. Se añadieron 200 ml de dietil éter y 60 ml de 1,4-dioxano a la fase recogida, y la disolución así obtenida se agitó de nuevo enérgicamente. Tras la separación de fases, se recogió la fase inferior resultante y luego se liofilizó para obtener 10,1 g del compuesto del título sal de sodio de poli(PEG_{500}-MA)a (compuesto Nº 9) como un sólido amarillo.
Se determinó el contenido en grupos carboxilo y la razón de hidrólisis para el polímero del título tal como se describe en el ejemplo de prueba 1 a continuación.
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Ejemplo 11 Preparación del producto de amonólisis de poli(PEG_{500}-MA) [poli (PEG_{500}-MA)a)] en el que m=6-16, R^{3}=NH_{2}, razón de comp.= aproximadamente 1:1, gr. prom. pol.=30-40 y razón de hid.= aproximadamente 1,4:8,6 (compuesto Nº10)
Se añadieron 9,5 g de agua amoniacal al 28% p/p a 1 g de poli(PEG_{500}-MA) (AM-0530K, fabricado por NOF Corporation, que tiene un número de lote de M34529) para disolverlo, y se agitó la disolución así obtenida a 25ºC durante 4 horas. Al final de este tiempo, se añadieron 250 ml de agua amoniacal al 0,28%, y se condensó la disolución resultante usando una membrana de ultrafiltración hecha de polietersulfona (que tiene un límite de peso molecular de 10.000 y fabricado por Millipore Corporation, número de modelo PBGC07610), y se liofilizó el condensado así obtenido para obtener 0,8 g del compuesto del título poli(PEG_{500}-MA)a (compuesto Nº 10) como un compuesto aceitoso.
Se determinó el contenido en grupos carboxilo y la razón de hidrólisis para el polímero del título tal como se describe en el ejemplo de prueba 1 a continuación.
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Ejemplo 12 Preparación del producto de reacción de dimetilamina y poli(PEG_{500}-MA) [sal de Na de poli(PEG_{500}-MA)dma)] en el que m=6-16,R^{3}=NMe_{2}, razón de comp.= aproximadamente 1:1, gr. prom. pol.=30-40 y razón de hid.= aproximadamente 2,9:7,1 (compuesto Nº 11)
Se añadieron 35 g de a disolución acuosa de dimetilamina al 50% p/p a 5 g de poli(PEG_{500}-MA) (AM-0530K, número de lote: M34529 obtenido de NOF Corporation) para disolverlo, y se agitó la disolución resultante a 25ºC durante 3 horas, luego se agitó adicionalmente a 4ºC durante 16 horas. Al final de este tiempo, se añadieron 100 ml de una disolución acuosa de hidróxido de sodio 0,1 M, y se liofilizó la disolución así obtenida para obtener 5,4 g del compuesto del título sal de Na de poli(PEG_{500}-MA)dma (compuesto Nº 11) como un sólido amarillo.
Se determinó el contenido en grupos carboxilo y la razón de hidrólisis para el polímero del título tal como se describe en el ejemplo de prueba 1 a continuación.
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Ejemplo 13 Preparación de hidrolizado de poli(PEG_{500}-MA) [poli (PEG_{500}-MA)h)] en el que m=6-16, R^{3}=OH, razón de comp.= aproximadamente 1:1, gr. prom. pol.=30-40 y razón de hid.= aproximadamente 10:0 (compuesto Nº12)
Se añadieron 17 ml de agua destilada a 1 g de poli(PEG_{500}-MA) (AM-0530K, fabricado por NOF Corporation, que tiene un número de lote de M34529) para disolverlo, y se agitó la disolución resultante a 40ºC durante 4 horas. Al final de este tiempo, se añadieron a esto 250 ml de agua amoniacal al 0,28% p/p, y se condensó la disolución así obtenida usando una membrana de ultrafiltración hecha de polietersulfona (que tiene un límite de peso molecular de 10.000, y fabricada por Millipore Corporation, número de modelo PBGC07610). Se liofilizó el condensado así obtenido para obtener 0,7 g del compuesto del título poli(PEG_{500}-MA)h (compuesto Nº 12) como un compuesto aceitoso.
Se determinó el contenido en grupos carboxilo y la razón de hidrólisis para el polímero del título tal como se describe en el ejemplo de prueba 1 a continuación.
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Ejemplo 14 Preparación de complejos de modificadores poliméricos de los ejemplos 10 a 13 con OCIF
Se disolvió cada uno de los modificadores poliméricos preparados en los ejemplos 10 a 13 en solución salina tamponada con fosfato (PBS) pH 7,0 (que es una disolución obtenida mezclando una disolución que contiene hidrogenofosfato de disodio 10 mM y cloruro de sodio 150 mM y una disolución que contiene dihidrogenofosfato de sodio 10 mM y cloruro de sodio 150 mM a una razón adecuada para dar un tampón que tiene un pH de 7,0) para preparar disoluciones que tienen un intervalo de concentraciones de modificador en el intervalo de desde 1,25 a 105 mg/ml. Para cada modificador polimérico a su vez, se mezclaron las disoluciones de modificador polimérico así obtenidas y una disolución que contenía OCIF maduro humano purificado (OCIF preparado tal como se describe en los documentos WO 96/26217 y EP 816380) [concentración de proteína: de 0,25 a 14 mg/ml, medio: PBS (pH 6,0)] a una razón de 1:1 en volumen para dar disoluciones que tienen diferentes razones en peso entre el modificador y OCIF. Se ajustaron las disoluciones así obtenidas hasta pH 5,0, 5,5, 6,0, 6,5, 7,0 ó 7,4 usando disolución de ácido clorhídrico 1 M o hidróxido de sodio acuoso 1 M. Se dejó reposar cada una de las disoluciones así obtenidas a 25ºC durante entre 12 horas y una semana para obtener una disolución de un complejo del modificador polimérico de la presente invención y OCIF. Se almacenaron las disoluciones preparadas a 4ºC. Se midió el tamaño molecular de los complejos resultantes tal como se explica en los ejemplo de prueba 6 y 11 a continuación. Se midió la tasa de detección de OCIF mediante ELISA en los complejos tal como se describe en el ejemplo de prueba 8 a continuación.
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Ejemplo 15 Preparación de sal de sodio del producto de amonólisis de poli(PEG_{500}-MA) [sal de Na de poli(PEG_{500}-MA)a] que tiene un tamaño molecular controlado en el que m=6-16, R^{3}=NH_{2}, razón de comp.= aproximadamente 1:1. gr. prom. pol. tal como se muestra a continuación y razón de hidrólisis= aproximadamente 1,4:8,6 (compuestos Nº 13-19)
Se disolvieron 100 mg de la sal de sodio de poli(PEG_{500}-MA)a (compuesto Nº 9) obtenida en el ejemplo 10 en 1 ml de una solución salina tamponada con fosfato (PBS que tiene un pH de 7,4 obtenida mezclando una disolución acuosa que contiene 10 mM de hidrogenofosfato de disodio y 150 mM de cloruro de sodio con una disolución acuosa que contiene 10 mM de dihidrogenofosfato de sodio y 150 mM de cloruro de sodio a una razón adecuada). Se fraccionó la disolución así obtenida mediante cromatografía de filtración en gel. Se usaron dos condiciones diferentes de filtración en gel, tal como sigue:
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(1) Método de fraccionamiento usando Superose 6 (a continuación en el presente documento denominado el método SRF)
Columna: Superose 6 HR 10/30 Amersham Bioscience
Temperatura de columna: 8ºC
Fase móvil: PBS (pH 7,4)
Longitud de onda para la detección: 280 nm
Velocidad de flujo: 0,3 ml/min.
Cantidad inyectada en la columna: 100 \mul
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(2) Método de fraccionamiento usando Superdex 200 (a continuación en el presente documento denominado el método SDF)
Columna: Superdex 200 HR 16/60 Amersham Biosciences
Temperatura de columna: temperatura ambiente
Fase móvil: PBS (pH 7,4)
Longitud de onda para la detección: 280 nm
Velocidad de flujo: 2 ml/min.
Cantidad inyectada en la columna: 5 ml
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Los modificadores poliméricos que se eluyeron mediante estos dos métodos de fraccionamiento en un tiempo de elución de x a y minutos se definieron como poli(PEG_{500}-MA)a-Na(SRF_{x-y}) y poli(PEG_{500}-MA)a-Na(SDF_{x-y}) respectivamente.
Se determinó la concentración del modificador polimérico en cada fracción (disolución acuosa) mediante cromatografía de líquidos de alta resolución. Las condiciones usadas en la cromatografía de líquidos de alta resolución son tal como sigue:
Columna: Shodex OHpak SB-806M HQ (disponible de SHOWA DENKO K.K.)
Precolumna: Shodex OHpak SB-G (disponible de SHOWA DENKO K.K.)
Temperatura de columna: 40ºC
Fase móvil: disolución acuosa de hidrogenofosfato de disodio 50 mM ajustada hasta pH 7,0 con ácido clorhídrico 1 M.
Longitud de onda para la detección: 210 nm
Velocidad de flujo: 0,5 ml/min.
Cantidad inyectada en la columna: 50 \mul
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Se sometieron poli(PEG_{500}-MA)a-Na(SRF_{x-y}) y poli(PEG_{500}-MA)a-Na(SDF_{x-y}) respectivamente obtenidos mediante fraccionamiento según el método SRF y el método SDF a cromatografía de filtración en gel adicional (método SRF) usando las mismas condiciones de elución que las descritas anteriormente para el primer fraccionamiento según el método SRF para evaluar el tamaño molecular de cada una de las muestras tras el fraccionamiento. Se usaron proteínas que tenían cada una un tamaño molecular conocido (disponibles de Amersham Bioscience) como muestras patrón. A este respecto, se muestran el peso molecular y tamaño molecular de cada una de las proteínas en el catálogo relevante del que se adquirieron.
El tamaño molecular calculado de los modificadores poliméricos obtenidos mediante fraccionamiento se muestra en la tabla 1 a continuación.
TABLA 1
17
18 
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Usando este enfoque se prepararon diversos polímeros de poli(PEG_{500}-MA)a-Na que tenían diferentes tamaños moleculares (compuestos Nº 13-19). Se calculó el grado promedio de polimerización de los compuestos Nº 13, 14, 15, 16, 17, 18 y 19 tal como en ejemplos anteriores y se encontró que era de <30, <<30, \men{3}30, <30, <<30, \men{3}30 y \men{3}30 respectivamente.
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Ejemplo 16 Preparación del producto de amonólisis de poli(PEG_{1500}-MA) [poli (PEG_{1500}-MA)a] que tiene un tamaño molecular controlado en el que m=28-38, R^{3}=NH_{2}, razón de comp.= aproximadamente 1:1, gr. prom. pol. es tal como se da a continuación (compuestos Nº 20-22)
A partir de [poli(PEG_{1500}-MA)a] (compuesto Nº 7) preparado en el ejemplo 7 anterior como material de partida y usando el mismo enfoque que se usó en el ejemplo 15 anterior, se preparó poli(PEG_{1500}-MA)a(SRF_{x-y}) de la misma manera que en el ejemplo 15. Las condiciones de elución para las eluciones de SRF fueron las mismas que en el ejemplo 15. Los rendimientos de los modificadores poliméricos obtenidos mediante fraccionamiento se muestran en la tabla 2 a continuación.
TABLA 2
19
Usando este enfoque, se prepararon diversos polímeros de poli(PEG_{1500}-MA)a que tenían diferentes tamaños moleculares (compuestos Nº 20-22). Se calculó el grado promedio de polimerización de los compuestos Nº 20, 21 y 22 tal como en ejemplos anteriores y se encontró que era de <10, <<10 y \men{3}10 respectivamente.
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Ejemplo 17 Preparación de complejos de modificadores poliméricos de los ejemplos 15 y 16 con OCIF
Se prepararon complejos de polímero-OCIF de la presente invención como disoluciones acuosas usando esencialmente el mismo enfoque preparativo que en el ejemplo 14 anterior usando disoluciones acuosas de los compuestos Nº 13 a 22 preparados en los ejemplos 15 y 16 anteriores (medio: PBS que tiene un pH de 7,4) y una disolución acuosa de OCIF maduro humano purificado (OCIF preparado tal como se describe en los documentos WO 96/26217 y EP 816380) (medio: PBS que tiene un pH de 6,0) como materiales de partida. Más específicamente, para cada uno de los modificadores se mezcló una disolución 0,5 mg/ml de los mismos en PBS (pH 7,4) (preparada tal como se describe en el ejemplo 9 anterior) con una disolución de OCIF 0,5 mg/ml en PBS (pH 6,0) a una razón en volumen de 1:1. Se dejaron reposar las mezclas de reacción resultantes a 25ºC durante 7 días. Se midió el tamaño molecular de los complejos resultantes tal como se explica en el ejemplo de prueba 11 a continuación.
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Ejemplo 18 Preparación del producto de amonólisis de poli(PEG_{500}-MA) [sal de Na de poli(PEG_{500}-MA)a] que tiene un tamaño molecular controlado: (a) m=6-16, R^{3}=NH_{2}, razón de comp.= aproximadamente 1:2 y gr. prom. pol.=20-30 (Comp. Nº 27) y (b) m=6-16, R^{3}=NH_{2}, razón de comp.= aproximadamente 1:1 y gr. prom. pol.= aproximadamente 15 (Comp. Nº 28)
Se prepararon dos polímeros de la presente invención poli(PEG_{500}-MA)a (compuesto Nº 27) y poli(PEG_{500}-MA)a (compuesto Nº 28) tal como sigue. El material de partida para el primero es poli(PEG_{500}-MA) (AM-0510K fabricado usando un procedimiento similar al dado a conocer en la patente japonesa número 2621308 y publicaciones de solicitud de patente japonesa números 2003-105040 y 2003-104003), un copolímero de alil-metil diéter de polioxietileno (m = 6-16, Alk = etileno, R^{1} = hidrógeno y R^{2} = metilo) y anhídrido maleico, en el que la cadena lateral de polioxietileno tiene un peso molecular promedio de aproximadamente 500 y el grado promedio de polimerización de la cadena principal está en el intervalo de desde 20 hasta 30, siendo la razón de unidades de alil-metil diéter de polioxietileno con respecto a unidades de anhídrido maleico de 1:2 y siendo el peso molecular promedio aproximadamente de 6.000 [el peso molecular promedio en número es aproximadamente de 6.000 y el índice de distribución de peso molecular (M_{w}/M_{n}) es aproximadamente de 1,25]. El material de partida para el último es poli(PEG_{500}-MA) (AM-0515K fabricado usando un procedimiento similar al dado a conocer en la patente japonesa número 2621308 y publicaciones de solicitud de patente japonesa números 2003-105040 y 2003-104003), un copolímero de alil-metil diéter de polioxietileno (m = 6-16, Alk = etileno, R^{1} = hidrógeno y R^{2} = metilo) y anhídrido maleico, en el que la cadena lateral de polioxietileno tiene un peso molecular promedio de aproximadamente 500, el grado promedio de polimerización de la cadena principal es aproximadamente de 15 y el peso molecular promedio es aproximadamente de 10.000. Se sometieron ambos materiales de partida a amonólisis usando condiciones esencialmente idénticas a las usadas en el ejemplo 10 para dar los compuestos del título sal de Na de poli(PEG_{500}-MA)a (compuesto Nº 27) y sal de Na de poli (PEG_{500}-MA)a (compuesto Nº 28). Se determinó el contenido en grupos carboxilo para el polímero del título tal como se describe en el ejemplo de prueba 1 a continuación y se encontró que era de 2,73 mmol/g para el compuesto Nº 27 y 2,05 mmol/g para el compuesto Nº 28.
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Ejemplo 19 Preparación de complejos de los modificadores poliméricos del ejemplo 18 con OCIF
Se prepararon los complejos de polímero-OCIF de la presente invención como disoluciones acuosas usando esencialmente el mismo enfoque preparativo que en el ejemplo 14 anterior usando disoluciones acuosas de los compuestos Nº 27 y 28 preparados en el ejemplo 18 anterior como materiales de partida. Más específicamente, para cada uno de los modificadores se mezcló una disolución 5 mg/ml de los mismos en PBS (pH 7,4) con una disolución de OCIF maduro humano 5 mg/ml en PBS (pH 6,0) a una razón en volumen de 1:1. Se ajustó el pH de la mezcla resultante a 5,5 con ácido clorhídrico 1 M y luego se dejó reposar la mezcla de reacción a 25ºC durante 7 días. Se midió el tamaño molecular de los complejos resultantes tal como se explica en el ejemplo de prueba 11 a continuación.
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Ejemplo 20 Evaluación de la composición de poli(PEG_{500}-MA) y preparación y evaluación de poli(PEG_{500}-MA)a (compuestos Nº 29-53) en diversas condiciones 20(1) Determinación de la razón de composición de poli(PEG_{500}-MA)
Se sometieron a prueba varios copolímeros de alil-metil diéter de polioxietileno y anhídrido maleico, poli(PEG_{500}-MA), de diferente composición para determinar la razón de alil-metil diéter de PEG y unidades de anhídrido maleico (la razón de composición) en ellos (lotes diferentes de AM-0510K fabricado usando un procedimiento similar al dado a conocer en la patente japonesa número 2621308 y las publicaciones de solicitud de patente japonesa números 2003-105040 y 2003-104003), un copolímero al azar de alil-metil diéter de polioxietileno (m = 6-16, Alk = etileno, R^{1} = hidrógeno y R^{2} = metilo) y anhídrido maleico, en el que la cadena lateral de polioxietileno tiene un peso molecular promedio de aproximadamente 500 y el grado promedio de polimerización de la cadena principal está en el intervalo de desde 20 hasta 30. El peso molecular promedio en número (M_{n}) y el índice de distribución de peso molecular (M_{w}/M_{n}, en el que M_{w} es el peso molecular promedio en peso) de cada lote de los copolímeros sometidos a prueba se muestra a continuación. Se determinó el peso molecular (PM) de cada lote de poli(PEG_{500}-MA) mediante cromatografía de filtración en gel usando poli(etilenglicol) con un PM predeterminado como patrón. Por consiguiente, el PM de poli(PEG_{500}-MA) mostrado a continuación no es el PM absoluto, sino el PM relativo medido usando PEG como patrón.
M3O538 M_{n} = 6431;M_{w} /M_{n} = 1,27
M3N549 M_{n} = 6360; M_{w} /M_{n} = 1,23
M3N550 M_{n} = 5891; M_{w} /M_{n} = 1,28
M3N569 M_{n} = 5897; M_{w} /M_{n} = 1,25
Con el fin de determinar la razón de composición de cada uno de los copolímeros, fue necesario convertirlos en las sales de sodio correspondientes de los copolímeros hidrolizados, es decir sal de sodio de poli(PEG_{500}-MA)h. Las condiciones de hidrólisis usadas son tal como sigue.
Se añadieron 25 ml de 1,4-dioxano, 100 ml de éter y 42 ml de disolución acuosa de NaOH 0,1 N a 1 g de poli(PEG_{500}-MA) (lote M3O538). Entonces se agitó enérgicamente la mezcla resultante y, tras dejar que sedimentara, se recogió la fase acuosa así obtenida. Se agitó la fase acuosa así obtenida a 40ºC durante 2 h tras filtrar a través de papel de filtro (704 x 40 m/m obtenido de Nihon Pikagaku-kiki Corporation). Al final de este tiempo, se liofilizó la disolución resultante. Se obtuvo la sal de sodio del producto hidrolizado del material de partida, concretamente sal de sodio de poli(PEG_{500}-MA)h (lote M3O538), como un sólido amarillo (rendimiento del 100%).
Se añadieron 12 ml de 1,4-dioxano y 9 ml de disolución acuosa de NaOH 1 N a 1 g de poli(PEG_{500}-MA) (lote M3N549). Luego se agitó a mezcla resultante a temperatura ambiente durante 24 h. Al final de este tiempo, se añadió 1 ml de disolución acuosa de NaOH 1 N y se liofilizó la mezcla resultante. Se obtuvo la sal de sodio del producto hidrolizado del material de partida, concretamente sal de sodio de poli(PEG_{500}-MA)h (M3N549) como un sólido amarillo (rendimiento del 100%).
Se añadieron 5 ml de 1,4-dioxano y 9 ml de disolución acuosa de NaOH 1 N a 2 g de poli(PEG_{500}-MA) (lote M3N550). Luego se agitó la mezcla resultante a 40ºC durante 23 h. Al final de este tiempo, se liofilizó la mezcla de reacción. Se obtuvo la sal de sodio del producto hidrolizado del material de partida, concretamente sal de sodio de poli(PEG_{500}-MA)h (lote M3N550) como un sólido amarillo (rendimiento del 100%).
Se añadieron 5 ml de 1,4-dioxano y 9 ml de disolución acuosa de NaOH 1 N a 2 g de poli(PEG_{500}-MA) (lote M3N569). Luego se agitó la mezcla resultante a 40ºC durante 23 h. Al final de este tiempo, se liofilizó la mezcla de reacción. Se obtuvo la sal de sodio del producto hidrolizado del material de partida, concretamente poli(PEG_{500}-MA)h como un sólido amarillo (rendimiento del 100%).
Se midió el contenido en grupos carboxilo de cada una de las sales de sodio de poli(PEG_{500}-MA)h así preparada mediante valoración conductimétrica tal como se describió anteriormente. Los resultados se muestran en la tabla 3 a continuación.
La sal de sodio de poli(PEG_{500}-MA)h comprende las dos unidades monoméricas siguientes:
21
Si el número de unidades monoméricas de sal de sodio de ácido maleico por 1 unidad de alil-metil diéter de PEG se define como "a", y la unidad mínima de repetición teórica comprende una unidad de alil-metil diéter de PEG y "a" unidades de maleato de sodio, entonces el peso fórmula (PF) de la unidad mínima de repetición se da mediante la ecuación 1:
100
El número de grupos carboxilo en la unidad mínima de repetición de sal de sodio de poli(PEG_{500}-MA)h es 2a. Por consiguiente, el contenido en grupos carboxilo (C, mmol/g) en la unidad mínima de repetición de sal de sodio de poli(PEG_{500}-MA)h se da mediante la ecuación 2:
(Ec. 2)C = 2a / (541 + 160a) * 1000
La razón del número de unidades de sal de sodio de ácido maleico con respecto al número de unidades de alil-metil diéter de PEG en las sales de sodio de poli(PEG_{500}-MA)h reales es igual que la razón en las unidades mínimas de repetición. Por consiguiente, el valor de C es también igual en la unidad mínima de repetición y en las sales de sodio de poli(PEG_{500}-MA)h reales, de las que se determinó el contenido en grupos carboxilo mediante valoración conductimétrica (véase anteriormente). Por tanto, midiendo el contenido en grupos carboxilo y usando la ecuación 2, puede obtenerse el valor de la razón de composición "a", concretamente el número de unidades de sal de sodio de ácido maleico por 1 unidad de alil-metil diéter de PEG [que es la composición monomérica de poli(PEG_{500}-MA)]. Los resultados se muestran en la tabla 3 a continuación.
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TABLA 3
22
La razón de composición de las sales de sodio de poli(PEG_{500}-MA)h estaba en el intervalo de desde 1:2 hasta 1:3,3. Obviamente, la razón de composición es igual en poli(PEG_{500}-MA) y la sal de sodio de poli(PEG_{500}-MA)h, de modo que se confirmó que las razones de composición monomérica de los diferentes copolímeros de partida poli(PEG_{500}-MA) estaban en el intervalo de desde 1:2 hasta 1:3:3.
20(2) Amonólisis de poli(PEG_{500}-MA) en diferentes condiciones para dar poli(PEG_{500}-MA)a (compuestos Nº 29-53) y determinación de la razón de hidrólisis en dichos compuestos
Usando la razón de composición (a) y el contenido en grupos carboxilo de las sales de sodio de poli(PEG_{500}-MA)h, puede calcularse la razón de hidrólisis (es decir la razón de unidades de anhídrido de ácido maleico en el polímero de partida sometidas a amonólisis con respecto a las sometidas a hidrólisis) tal como sigue. La fórmula de la sal de sodio de la unidad de ácido maleico amidado (ácido maleámico, sal de sodio) se muestra a continuación:
23
De la misma manera que en el caso de las sales de sodio de poli(PEG_{500}-MA)h anterior, puede suponerse que la unidad mínima de sal de sodio de poli(PEG_{500}-MA)a comprende una unidad de alil-metil diéter de PEG, ax unidades de sal de sodio de ácido maleámico y a(1 - x) unidades de sal de sodio de ácido maleico. El peso fórmula de la unidad mínima de sal de sodio de poli(PEG_{500}-MA)a se da mediante la siguiente ecuación 3:
101
Puesto que el contenido en grupos carboxilo en la unidad mínima de sal de sodio de poli(PEG_{500}-MA)a es ax + 2a(1-x) = 2a - ax, el contenido en grupos carboxilo (C, mmol/g) en la unidad mínima de sal de sodio de poli(PEG_{500}-MA)a puede derivarse de la ecuación 4:
(Ec. 4)C = 1000 X (2a - ax) / (541 + 160a - 23ax)
La razón de hidrólisis (1-x) : x puede determinarse por tanto mediante la ecuación 4 usando el contenido en grupos carboxilo (C, mmol/g) que puede obtenerse mediante valoración conductimétrica de sal de sodio de poli(PEG_{500}-MA)a y el valor de "a" que se obtuvo anteriormente.
A continuación se muestran varios ejemplos de la preparación de poli(PEG_{500}-MA)a, y la razón de hidrólisis calculada en el producto poli(PEG_{500}-MA)a.
(a) Se añadió disolución de amoniaco 0,5 M/1,4-dioxano (cantidades tal como se dan en la tabla 4 a continuación) a 100 mg de poli(PEG_{500}-MA), y se agitó la disolución obtenida a las temperaturas y tiempos dados en la tabla 4 a continuación. Al final del tiempo de reacción, aproximadamente se añadieron 0,4 ml (oscilando desde 0,3 hasta 0,5 ml) de disolución acuosa de NaOH 1 N a la mezcla de reacción. Se liofilizó la disolución resultante para obtener la sal de sodio de poli(PEG_{500}-MA)a como un material sólido.
La "tasa de reacción del componente de amina" de cada una de las sales de sodio de poli(PEG_{500}-MA)a [es decir el porcentaje de unidades de anhídrido de ácido maleico en el polímero de partida sometidas a amonólisis (100*x)] preparadas en estas diversas condiciones de reacción se muestra en la tabla 4 a continuación.
TABLA 4
24
Nº 8-19, 25 y 27-37 son los polímeros del título poli(PEG_{500}-MA)a (compuestos Nº 29-52). Cada uno de estos polímeros es al azar y m = 6-16, R^{3} = NH_{2}, razón de composición = 1:2,4 y grado promedio de polimerización = 20-30.
Tal como se muestra en la tabla 4, todos los productos de reacción poli(PEG_{500}-MA)a (compuestos Nº 29-52) tuvieron "tasas de reacción del componente de amina" muy altas, lo que indica que se obtuvo una conversión muy próxima al 100% en el grupo amino usando las diversas condiciones de reacción descritas anteriormente.
A continuación se describen varios ejemplos adicionales de métodos de preparación alternativos de poli(PEG_{500}-MA)a:
(b) Se disolvieron 0,44 g de poli(PEG_{500}-MA) en 9 ml de dimetilformamida. Entonces se burbujeó gas amoniaco en la disolución a -50ºC. La cantidad de amoniaco final en la mezcla de reacción fue de 0,67 g. Se selló la mezcla de reacción así obtenida en una ampolla de vidrio bajo una atmósfera de nitrógeno y luego se agitó a temperatura ambiente durante 24 h. Al final de este tiempo, se evaporó el gas amoniaco a presión reducida tras abrirse la ampolla de vidrio. Entonces se añadió la mezcla de reacción gota a gota a 90 ml de dietil éter. Se recogió el precipitado así obtenido y se secó a presión reducida. Se obtuvieron 0,28 g de sal de amonio de poli(PEG_{500}-MA)a (compuesto Nº 53) (denominado Nº 41 en la tabla 4 anterior) como un polvo amarillo. El polímero es al azar y m = 6-16, R^{3} = NH_{2}, razón de composición = 1:3,10 y grado promedio de polimerización = 20-30.
(c) Se obtuvo sal de amonio de poli(PEG_{500}-MA)a del mismo modo que en (b) usando tolueno en lugar de dimetilformamida.
(4) Se obtuvo sal de amonio de poli(PEG_{500}-MA)a del mismo modo que en (b) usando 1,4-dioxano en lugar de dimetilformamida.
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Ejemplo 21 Preparación del producto de la reacción de alcohólisis entre etanol y poli(PEG_{500}-MA) [poli (PEG_{500}-MA)ea-Na] en el que, m = 6-16, R^{3} = OCH_{2}CH_{3}, razón de comp.= aproximadamente 1:3, gr. prom. pol. = 20-30, razón de hid.= aproximadamente 3,1:6,9 (compuesto Nº 54)
Se usó como material de partida poli(PEG_{500}-MA) (AM-0510K, lote M3N550 fabricado usando un procedimiento similar al dado a conocer en la patente japonesa número 2621308 y las publicaciones de solicitud de patente japonesa números 2003-105040 y 2003-104003), un copolímero de alil-metil diéter de polioxietileno (m=6-16, Alk=etileno, R^{1}=hidrógeno y R^{2}=metilo) y anhídrido maleico en el que la cadena lateral de polioxietileno tiene un peso molecular promedio de aproximadamente 500, el grado promedio de polimerización de la cadena principal está en el intervalo de desde 20 hasta 30, la razón de unidades de alil-metil diéter de polioxietileno con respecto a las unidades de anhídrido maleico es aproximadamente de 1:3, el peso molecular promedio en número (M_{n}) es de 5891 y el índice de distribución de peso molecular (M_{n}/M_{w}) es de 1,28 (véase el ejemplo 20 anterior). Se añadió 1 ml de etanol a 100 mg de dicho compuesto de partida y se dejó reposar la mezcla de reacción resultante durante 16 horas a 40ºC. Al final de este tiempo, se añadieron 52 \mul de una disolución 2,5 M de hidróxido de sodio en etanol. Se concentró la mezcla así obtenida a 35ºC mediante evaporación, y luego se secó a vacío para obtener sal de sodio de poli(PEG_{500}-MA)ea (compuesto Nº 54) como un material aceitoso. Se calculó la razón de hidrólisis usando el método descrito en los ejemplos 3 y 6 anteriores. Concretamente, determinando el contenido en grupos carboxilo de la sal de sodio de poli(PEG_{500}-MA)ea (compuesto Nº 54) y la sal de sodio de poli(PEG_{500}-MA)h correspondiente, se calculó la razón de residuos de anhídrido maleico en el compuesto del título sometidos a alcohólisis con respecto al número total de residuos de anhídrido maleico en el material de partida, y se determinó que era de 0,69. Por tanto, puede observarse que el 69% de los residuos de anhídrido maleico en el material de partida se sometieron a alcohólisis, y el 31% restante de los residuos de anhídrido maleico se sometieron a hidrólisis.
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Ejemplo 22 Preparación de complejos del modificador polimérico del ejemplo 21 con OCIF
Se prepararon complejos de polímero-OCIF de la presente invención como disoluciones acuosas usando esencialmente el mismo enfoque preparativo que en el ejemplo 14 anterior usando una disolución acuosa del compuesto Nº 54 preparada en el ejemplo 21 anterior [concentración de compuesto Nº 54, 17,2 mg/ml; medio, PBS pH 7,4 (que es una disolución obtenida mezclando una disolución acuosa que contiene 10 mM de hidrógenofosfato de disodio y 150 mM de cloruro de sodio con una disolución acuosa que contiene 10 mM de dihidrógenofosfato de sodio y 150 mM de cloruro de sodio a una razón adecuada para dar un tampón que tiene un pH de 7,4)] y una disolución acuosa de OCIF maduro humano purificado (OCIF preparado tal como se describe en los documentos WO 96/26217 y EP 816380) (concentración de OCIF, 4 mg/ml; medio, tampón que contiene ion fosfato 10 mM y NaCl 150 mM, pH 6,0). Más específicamente, se añadieron 0,472 ml de una disolución 17,2 mg/ml del compuesto Nº 54 a 1,328 ml de dicha disolución de OCIF 4 mg/ml para dar una disolución que contenía 4,5 mg/ml de compuesto Nº 54 y 3 mg/ml de OCIF. Se dejó reposar la mezcla de reacción resultante durante 3 días a 4, 10 ó 25ºC para obtener disoluciones acuosas de los complejos deseados de la presente invención. Se midieron los tamaños de complejo en el ejemplo de prueba 13 a continuación.
Ejemplo 23 Preparación del producto de la reacción de alcohólisis entre etanol y poli(PEG_{500}-MA) [poli (PEG_{500}-MA)ea] en el que, m = 6-16, R^{3} = OCH_{2}CH_{3}, razón de comp.= aproximadamente 1:3, gr. prom. pol.=20-30 (compuesto Nº 55)
Se usó como material de partida poli(PEG_{500}-MA) (AM-0510K, lote M3N550 fabricado usando un procedimiento similar al dado a conocer en la patente japonesa número 2621308 y las publicaciones de solicitud de patente japonesa números 2003-105040 y 2003-104003), un copolímero al azar de alil-metil diéter de polioxietileno (m = 6-16, Alk = etileno, R^{1}=hidrógeno y R^{2}=metilo) y anhídrido maleico en el que la cadena lateral de polioxietileno tiene un peso molecular promedio de aproximadamente 500, el grado promedio de polimerización de la cadena principal está en el intervalo de desde 20 hasta 30, la razón de unidades de alil-metil diéter de polioxietileno con respecto a las unidades de anhídrido maleico es aproximadamente de 1:3, el peso molecular promedio en número (M_{n}) es de 5891 y el índice de distribución de peso molecular (M_{n}/M_{w}) es de 1,28 (véase el ejemplo 20 anterior). Se añadieron 0,5 ml de etanol absoluto a 50 mg de dicho compuesto de partida y se dejó reposar la mezcla de reacción resultante a 37ºC durante 24 horas. Se obtuvo el compuesto del título poli(PEG_{500}-MA)ea (compuesto Nº 55) como una disolución etanólica [poli (PEG_{500}-MA)ea conc.: 100 mg/ml].
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Ejemplo 24 Preparación de complejos del modificador polimérico del ejemplo 23 con OCIF
Se prepararon complejos de polímero-OCIF de la presente invención como disoluciones acuosas usando esencialmente el mismo enfoque preparativo que en el ejemplo 14 anterior usando la disolución etanólica del compuesto Nº 55 preparada en el ejemplo 23 anterior y una disolución acuosa de OCIF maduro humano purificado (OCIF preparado tal como se describe en los documentos WO 96/26217 y EP 816380) (concentración de OCIF, 5 mg/ml; medio, tampón que contiene ión fosfato 10 mM y NaCl 150 mM, pH 6,0). Más específicamente, se añadieron 37,5 \mul de la disolución etanólica del compuesto Nº 55 a 0,5 ml de dicha disolución de OCIF 5 mg/ml y se dejó reposar la mezcla de reacción resultante durante 3 días a 25ºC para dar disoluciones de los complejos deseados de la presente invención. Se midieron los tamaños de complejo en el ejemplo de prueba 13 a continuación.
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Ejemplo comparativo 1
Preparación de copolímero de monometoxipolietilenglicol - metil-vinil éter - ácido maleico (PEG-PMVMA)
Se preparó el copolímero de injerto, copolímero de monometoxipolietilenglicol - metil-vinil éter - ácido maleico (PEG-PMVMA) según el método dado a conocer en el ejemplo 2 de la solicitud de patente japonesa (Kokai) número Hei 11-302199.
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Ejemplo comparativo 2
Preparación de un complejo que comprende copolímero de monometoxipolietilenglicol - metil-vinil éter -ácido maleico (PEG-PMVMA) y proteína de OCIF
Se preparó OCIF humano purificado (OCIF preparado tal como se describe en los documentos WO96/26217 y EP 816380) modificado con PEG-PMVA preparado tal como se describe en el ejemplo comparativo 1 anterior como una disolución [medio: PBS (pH 6,0)] esencialmente de la misma manera que en el ejemplo 9. Más específicamente, se mezclaron 1 ml de disolución de OCIF [concentración de OCIF 2 mg/ml; medio PBS (pH 6,0)] y 1 ml de disolución de PEG-PMVA [concentración de PEG-PMVA 2 ó 20 mg/ml; medio PBS (pH 6,0)] y se dejó reposar la mezcla durante 24 horas a 25ºC para dar el complejo del título.
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Ejemplo comparativo 3
Preparación de un complejo que comprende un modificador polimérico y proteína de OCIF usando poli(PEG_{500}-MA) como modificador polimérico
Se añadieron 2,2 \mul de una disolución de dimetilsulfóxido que contenía poli(PEG_{500}-MA) [AM-0530K, fabricado por NOF Corporation (denominado a continuación en el presente documento "poli(PEG_{500}-MA)"] (concentración de polímero: de 35 a 350 mg/ml) a 28,4 \mul de una disolución acuosa de OCIF humano purificado (OCIF preparado tal como se describe en los documentos WO 96/26217 y EP 816380) (concentración de proteína: 3,5 mg/ml, medio: disolución acuosa de NaH_{2}PO_{4} 0,5 M, cuyo pH se ajustó a 7,6 con disolución acuosa de NaOH 5 M), y se agitó la disolución así obtenida (concentración de OCIF: 3,2 mg/ml, concentración de poli(PEG_{500}-MA): 2,5 mg/ml o 6,3 mg/ml) a 25ºC durante 40 horas. Al final de este tiempo, se diluyó la disolución con PBS (pH 7,0) para obtener una disolución de OCIF modificado con el modificador polimérico que tiene una concentración de OCIF de 0,25 mg/ml. Se almacenó la disolución así preparada a 4ºC.
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Ejemplo de prueba 1
Medición del contenido en grupos carboxilo de los polímeros de los ejemplos 10 a 13 mediante valoración conductimétrica
Se determinó el contenido en grupos carboxilo de cada uno de los polímeros [poli(PEG_{500}-MA)a (compuestos Nº 9 y 10), poli (PEG_{500}-MA)dma (compuesto Nº 11) y poli(PEG_{500}-MA)h (compuesto Nº 12)] preparados en los ejemplos 10 a 13 mediante un método valoración conductimétrica tal como sigue.
En primer lugar, se purificó cada uno de los polímeros usando filtración en gel tal como sigue. Para cada polímero, se disolvieron 100 mg del polímero en 4 ml de disolución de hidróxido de sodio 0,001 N. Se dividió la disolución en cuatro lotes y se aplicó cada lote de 1 ml a una columna de filtración en gel (PD-10, fabricada por Amersham-Pharmacia). Se desechó el primer 1 ml de eluyente. Entonces se aplicaron 1,5 ml de disolución de hidróxido de sodio 0,001 N a cada columna y se eluyeron 1,5 ml adicionales de la columna y se desecharon. Entonces se aplicaron 2,5 ml de disolución de hidróxido de sodio 0,001 N a cada columna y se eluyeron 2,5 ml adicionales de la columna y ésta es la fracción que contenía el compuesto purificado. Se combinaron las fracciones purificadas de las cuatro columnas para dar una disolución purificada de los compuestos del título. Se determinó que el rendimiento tras la etapa de purificación (determinado espectrofotométricamente midiendo la absorbancia de poli(PEG_{500}-MA)h a 210 nm antes y después de la purificación) era del 80% y se determinó que la concentración en la disolución purificada era de 8 mg/ml.
Para cada una de las disoluciones de polímero purificado, se enrasó una alícuota (de 2,5 a 7,5 ml) hasta 50 ml con agua destilada o disolución acuosa de hidróxido de sodio 0,001 M, y luego se añadió una disolución acuosa de hidróxido de sodio 1 M a la disolución resultante para ajustar el pH a 12. Entonces se añadió ácido clorhídrico 0,1 M a la disolución o bien en incrementos de 0,1 ml o de manera continua a una velocidad de 0,1 ml/min. En el primer caso, se midieron el pH y la conductividad tras cada adición, y en el segundo se midieron cada 15 segundos. Entonces se calculó el contenido en grupos carboxilo del polímero a partir de la cantidad de ácido clorhídrico 0,1 M añadida en la región de tamponamiento de la conductividad (correspondiente a un intervalo de pH de aproximadamente 10 a 5,5). Los resultados se muestran en la tabla 5 a continuación.
TABLA 5
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Para los polímeros de los ejemplos 10 a 12, se determinó la razón de residuos de anhídrido maleico en el material de partida sometidos a amonólisis o aminólisis con respecto a los residuos de anhídrido maleico sometidos a hidrólisis para cada uno, mediante cálculo tal como sigue. Tal como se muestra en la tabla 5 anterior, el contenido en grupos carboxilo por 1 g de poli(PEG_{500}-MA)h (compuesto Nº 12) es de 3,21 mmoles. A partir de estos valores, se determinaron el peso de poli(PEG_{500}-MA) (es decir, el peso del copolímero antes de la hidrólisis) por gramo de grupo funcional, y el peso de poli(PEG_{500}-MA)a (compuestos Nº 9 y 10) obtenido añadiendo amoniaco a poli(PEG_{500}-MA) por gramo de grupo funcional. Específicamente, se obtuvo el peso de poli(PEG_{500}-MA) (es decir, el peso del copolímero antes de la hidrólisis) por mol de residuo de anhídrido maleico restando el peso molecular de una molécula de agua (18 g) del peso del copolímero completamente hidrolizado, dando una cifra de 605 g. Se obtuvo el peso de poli(PEG_{500}-MA)a (compuestos Nº 9 y 10) por mol de grupo carboxilo añadiendo el peso molecular de una molécula de amoniaco (17 g) al peso de poli(PEG_{500}-MA), dando una cifra de 622 g. A partir de este valor, el contenido teórico en grupos carboxilo por 1 g de poli(PEG_{500}-MA)a (compuestos Nº 9 y 10) en el que todos los residuos de anhídrido maleico se han sometido a amonólisis (es decir, nada de hidrólisis) se determinó mediante cálculo (1 g/622), y se encontró que era de 1,61 mmoles. De la misma manera, se determinó el peso de poli(PEG_{500}-MA)dma (compuesto Nº 11) obtenido añadiendo dimetilamina a poli(PEG_{500}-MA) por mol de grupo carboxilo añadiendo el peso molecular de una molécula de dimetilamina al peso de poli(PEG_{500}-MA), dando una cifra de 650 g. A partir de este valor, se determinó el contenido teórico en grupos carboxilo por 1 g de poli(PEG_{500}-MA)dma en el que todos los residuos de anhídrido maleico se han sometido a aminólisis mediante dimetilamina mediante cálculo, y se encontró que era de 1,54 mmoles.
Para cada uno de los polímeros de los ejemplos 10 a 12, se determinó la razón de hidrólisis (el porcentaje del material de partida sometido a hidrólisis en comparación con amonólisis o aminólisis) y la tasa de reacción (%) de amonólisis o aminólisis a partir del contenido en grupos carboxilo por 1 g de poli(PEG_{500}-MA)h (compuesto Nº 11) en el que todos los residuos de anhídrido maleico se han sometido a hidrólisis, el contenido teórico en grupos carboxilo por 1 g de poli(PEG_{500}-MA)a (compuestos Nº 9 y 10) en el que todos los residuos de anhídrido maleico se han sometido a amonólisis, el contenido teórico en grupos carboxilo por 1 g de poli(PEG_{500}-MA)dma (compuesto Nº 11) en el que todos los residuos de anhídrido maleico se han sometido a aminólisis mediante dimetilamina, y el contenido medido real en grupos carboxilo por 1 g de cada uno para cada uno de los polímeros de los ejemplos 10 a 12 medido mediante la valoración conductimétrica anterior. Los resultados son tal como se muestran en la tabla 5 anterior.
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Ejemplo de prueba 2
Evaluación de retención de complejos de OCIF-modificador en la sangre usando ratas
Se diluyó de manera apropiada cada una de las muestras preparadas tal como se describe en el ejemplo 9, ejemplo comparativo 2 y OCIF humano purificado no modificado (OCIF preparado tal como se describe en los documentos WO 96/26217 y EP 816380) con PBS (pH 6,0) de modo que la concentración de OCIF fue de 0,25 mg/ml. Se administró cada una de las muestras diluidas así obtenidas a la cola de una rata hembra Wistar de cinco semanas de edad (que tenía un peso corporal de aproximadamente 100 g y que se había privado de alimento durante un día) por una vena de modo que la dosis de OCIF fue de 0,5 mg/kg (2 ml/kg en volumen). Seis horas tras la administración, se extrajeron 200 \mul de sangre del corazón de la rata, y luego se midió la concentración de OCIF en suero sanguíneo mediante un método de ELISA, siendo las condiciones usadas tal como se describe en el ejemplo de prueba 3 a continuación.
La concentración de OCIF en suero sanguíneo tras la administración de cada muestra, se muestra en la tabla 6 a continuación.
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TABLA 6 Concentración de OCIF en suero sanguíneo tras la administración intravenosa de cada muestra de OCIF
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Se apreciará fácilmente a partir de la tabla 6 anterior que cada uno de los complejos de modificador polimérico y proteína de la presente invención mejoraron significativamente la retención de la proteína en la sangre cuando se comparó con la retención de la proteína cuando se administraba sola. También puede observarse mediante la comparación del complejo de PEG-PMVMA y proteína de la técnica anterior (dado a conocer en la patente japonesa abierta a consulta por el público número Hei 11-302199 y preparado en el ejemplo comparativo 2 anterior) y los complejos de la presente invención que tienen la misma razón en peso entre el modificador y la proteína (1 ó 10), que los complejos de modificador y proteína de la presente invención dieron una retención considerablemente mejorada de la proteína en la sangre en comparación con el complejo de PEG-PMVMA y proteína de la técnica anterior.
Ejemplo de prueba 3
Evaluación de la tasa de detección de OCIF mediante ELISA
Uno de los problemas encontrados con los modificadores de proteína de la técnica anterior es que la unión de los modificadores a la proteína produce la modificación de la estructura de la proteína y/o protección de la proteína debido a la formación de complejos voluminosos. Con el fin de someter a prueba los complejos de OCIF-modificador de la presente invención, se determinó la tasa de detección de cada uno de los complejos preparados tal como se describe en el ejemplo 9 y el ejemplo comparativo 2 partiendo de la base de OCIF humano purificado no modificado (OCIF preparado tal como se describe en los documentos WO 96/26217 y EP 816380) mediante ELISA. Se llevó a cabo el ELISA tal como sigue.
Se disolvió anticuerpo monoclonal OI-29 anti-OCIF humano (preparado según el método dado a conocer en el documento EP0974671) en una disolución de carbonato ácido de sodio 0,1 M (pH 9,6) para obtener una disolución que tenía una concentración de OI-19 de 10 \mug/ml. Se colocaron 100 \mul de la disolución de OI-19 así preparada en cada pocillo de una inmunoplaca de 96 pocillos (fabricada por Nunc), y se dejaron reposar las placas a 4ºC durante la noche. Al final de este tiempo, se añadió a cada pocillo Block Ace al 50% (adquirido de Snow Brand Milk Products Co., Ltd.) para bloquear, y entonces se lavaron las placas tres veces con PBS (tampón de lavado) que contenía Tween 20 al 0,1%. Se disolvió OCIF humano purificado (OCIF preparado tal como se describe en los documentos WO 96/26217 y EP 816380) en tampón de reacción primario (es decir, disolución tampón de Tris 0,2 M - ácido clorhídrico (pH 7,4) que contenía Block Ace al 40%, Tween 20 al 0,1% y 10 \mug/ml de IgG de ratón) para preparar disoluciones patrón con diversas concentraciones de OCIF. Se añadieron a cada pocillo 100 \mul de cada de una de estas disoluciones así preparadas con diversas concentraciones de OCIF, se agitaron las placas a temperatura ambiente durante 2 horas y entonces se lavó cada pocillo seis veces con el tampón de lavado. Entonces se diluyó POD-OI-4 (es decir, un anticuerpo marcado con peroxidasa y que reconoce OCIF, preparado tal como se describe en el documento EP 0974671) 10.000 veces con tampón de reacción secundario (es decir, disolución tampón de Tris 0,1 M - ácido clorhídrico (pH 7,4) que contenía Block Ace al 25%, Tween 20 al 0,1% y 10 \mug/ml de IgG de ratón), se añadieron a cada pocillo 100 \mul de la disolución resultante, se agitaron las placas a temperatura ambiente durante 2 horas y entonces se lavó cada pocillo seis veces. Una vez realizado esto, se añadieron a cada pocillo 100 \mul de una disolución de sustrato (reactivo soluble de TMB, disponible de Scytek), y se agitaron las placas a temperatura ambiente durante de 10 a 15 minutos. Después, se añadieron a cada pocillo 100 \mul de un reactivo de parada de la reacción (tampón de parada TMB, disponible de Scytek) y se agitaron suavemente las placas. Al final de este tiempo, se midió la absorbancia a una longitud de onda de 450 nm para cada pocillo mediante un lector de microplacas (MEML 001, fabricado por Molecular Device corporation). A partir de estos resultados se produjo una curva de calibración de la concentración de OCIF frente a la absorbancia. Una vez producida esta curva de calibración, se repitió el procedimiento para cada uno de los complejos de OCIF y modificador sometidos a prueba, añadiéndose a cada pocillo 100 \mul de cada una de las disoluciones que contenían un complejo de prueba, llevándose a cabo la reacción con POD-OI-4 de la misma manera que anteriormente y midiéndose entonces la absorbancia a una longitud de onda de 450 nm para cada pocillo mediante un lector de microplacas. La comparación de las absorbancias obtenidas con la curva de calibración permitió medir la concentración de OCIF detectable mediante ELISA en cada uno de los complejos.
Para cada una de las muestras, se calculó la tasa de fracaso al detectar OCIF mediante ELISA y los resultados se muestran en la tabla 7 a continuación. La tasa de fracaso al detectar OCIF mediante ELISA se define mediante la siguiente ecuación:
Tasa = [1-(concentración de OCIF medida mediante ELISA) / (concentración de OCIF medida mediante el método de Lowry)] x 100
En la ecuación anterior, se determina el método de Lowry para medir la concentración de OCIF en los complejos tal como se describe en la solicitud de patente japonesa número 2002-190407. Esto da una medida de la concentración de OCIF total en los complejos. La tasa de fracaso al detectar OCIF mediante ELISA en el complejo es una medida del cambio de conformación de OCIF producido mediante la complejación con el modificador. Una tasa de fracaso baja es evidencia de que OCIF en el complejo puede unirse fácilmente tanto mediante anticuerpos anti-OCIF OI-19 como OI-4, mostrando así poca o ninguna modificación de la estructura de OCIF en el complejo.
TABLA 7 Tasa de fracaso al detectar la muestra de OCIF mediante ELISA
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A partir de los resultados mostrados en la tabla 7 anterior puede observarse que, para los complejos de modificador polimérico y proteína de la presente invención, la tasa de fracaso al detectar OCIF mediante ELISA como resultado de la modificación de la estructura de la proteína disminuyó significativamente en comparación con la alta tasa que se obtuvo en el caso del complejo de PEG-PMVMA y proteína de la técnica anterior preparado en el ejemplo de prueba 2 anterior.
A partir del resultados de los ejemplos de prueba 2 y 3, se confirmó así que la disminución en la sensibilidad de la detección de la proteína producida por la modificación excesiva de la proteína por los complejos de modificador polimérico y proteína de la presente invención es muy baja y, además, la retención en la sangre de la proteína en dichos complejos es significativamente mejor que la lograda con los complejos de la técnica anterior.
Ejemplo de prueba 4
Medición de la concentración de OCIF en la sangre
Cada una de las muestras preparadas tal como se describe en el ejemplo 9 y OCIF humano purificado (OCIF preparado tal como se describe en los documentos WO 96/26217 y EP 816380) se diluye apropiadamente con PBS (que tiene un pH de 6,0 a 7,4) de modo que la concentración de OCIF es de 0,1 a 1 mg/ml. Cada una de las muestras diluidas así preparadas se administra entonces a un mono cinomolgo hembra de seis o siete años de edad (que tiene un peso corporal de 2 a 4 kg y que no ha privado de alimento durante un día) por la vena safena o por vía subcutánea dorsalmente para administrar una dosis de OCIF de 0,1 a 1 mg/kg (1 ml/kg en volumen). A un periodo de tiempo predeterminado en el intervalo de desde cinco minutos hasta un mes tras la administración, se extraen 500 \mul de sangre del vaso sanguíneo femoral del mismo y se mide la concentración de OCIF en el suero sanguíneo mediante el método de ELISA descrito en el ejemplo de prueba 3 anterior.
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Ejemplo de prueba 5
Medición de la densidad ósea
Cada una de las muestras preparadas tal como se describe en el ejemplo 9 y OCIF humano purificado (OCIF preparado tal como se describe en los documentos WO 96/26217 y EP 816380) se diluye apropiadamente con PBS (que tiene un pH de 6,0 a 7,4) de modo que la concentración de OCIF está en el intervalo de desde 0,7 hasta 3,5 mg/ml. Entonces se prepara un adyuvante usando células inactivadas de Mycobacterium butyricum y parafina líquida, y se inyecta en la piel de la base de la cola de una rata Lewis hembra de 5 a 10 semanas de edad para dar lugar a artritis en dicha rata. Dos semanas tras la inyección del adyuvante, se administra a la rata cada una de las muestras preparadas por la vena de la cola o por vía subcutánea dorsalmente de modo que la dosis de OCIF es de 1,4 a 7 mg/kg (2 ml/kg en volumen). Tres semanas tras la inyección del adyuvante, se diseccionó la rata para extraer el fémur derecho e izquierdo y se midió la densidad ósea de los mismos.
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Ejemplo de prueba 6
Evaluación del tamaño molecular mediante electroforesis en gel de SDS-poliacrilamida en condiciones no reductoras
Se evaluó el tamaño molecular de cada uno de los complejos de modificador polimérico y OCIF preparado tal como se describe en el ejemplo 14 y en el ejemplo comparativo 3 y OCIF humano purificado (OCIF preparado tal como se describe en los documentos WO96/26217 y EP 816380) mediante SDS-PAGE en condiciones no reductoras tal como sigue.
Se añadieron 5 \mul de NuPAGE (marca comercial), tampón de muestra LDS (4X) (obtenido de Invitrogen Life Technology) y 5 \mul de agua purificada a 10 \mul de cada una de las muestras sometidas a prueba [que se diluyeron si era necesario con solución salina tamponada con fosfato (PBS (pH 7,0), que es una disolución tampón obtenida mezclando una disolución que contiene hidrógenofosfato de disodio 10 mM y cloruro de sodio 150 mM y una disolución que contiene hidrógenofosfato de sodio 10 mM y cloruro de sodio 150 mM a una razón de volumen apropiada para dar un tampón pH de 7,0) de modo que la concentración de la proteína fue de 250 mg/ml] y se calentó cada una de las disoluciones resultantes a 95ºC durante 7 minutos. Al final de este tiempo, se añadió la cantidad total de la mezcla de reacción a un gel de electroforesis de SDS-poliacrilamida (gel de Tris a del 3 al 8% - acetato que tiene un espesor de 1 mm y fabricado por NOVEX), y se aplicó al gel un voltaje de 150 V usando un dispositivo de suministro de energía (PhoreStar Pro, fabricado por Anatech). Tras la finalización de la electroforesis, se tiñó la proteína en el gel con azul de Coomassie según un método bien conocido por los expertos en la técnica.
Tal como se observa en las figuras 1 y 2, se detectó establemente OCIF modificado con el modificador polimérico de la presente invención como una sustancia que tenía un peso molecular superior al de OCIF no modificado (120 kD) a todas las razones de mezclado (se detectó una banda primaria de 130 a 150 kD y una banda secundaria de 180 a 200 kD partiendo de la base de los marcadores de peso molecular), y además no se detectó ningún complejo que tuviera un peso molecular que superase los 210 kD. También se obtuvieron resultados similares (no mostrados) para otros modificadores poliméricos de la presente invención que eran los productos de la aminólisis y la alcohólisis. Por otro lado, tal como puede observarse en la figura 3, en el caso de OCIF modificado con el modificador polimérico convencional poli(PEG_{500}-MA) preparado en ejemplo comparativo 3, la cantidad de complejo voluminoso obtenida se aumenta notablemente a medida que se aumenta la razón del modificador.
Este resultado muestra que usando el modificador polimérico de la presente invención, es posible suprimir notablemente la formación de complejos voluminosos que no son farmacéuticamente preferibles y preparar un complejo de modificador polimérico y proteína que tiene propiedades estables, independientemente de la razón de mezclado, cuando se compara con el modificador polimérico bastante similar estructuralmente poli(PEG_{500}-MA) de la técnica anterior.
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Ejemplo de prueba 7
Evaluación de la actividad de formación de enlaces covalentes de poli(PEG_{500}-MA)a
Se determinó la reactividad de cada uno de los modificadores poliméricos poli(PEG_{500}-MA)a (compuesto Nº 9) y poli(PEG_{500}-MA)h (compuesto Nº 12) con tetrametilrodamina-cadaverina, que es una sustancia fluorescente que tiene un grupo amino y un peso molecular de 514,62 (disponible de Molecular Probes, Inc.) (denominada a continuación en el presente documento "Rho-NH_{2}"), y se evaluó la actividad de formación de enlaces covalentes de los modificadores comparando la reactividad de los dos modificadores poliméricos tal como sigue.
Se añadieron 3,8 \mul de disoluciones de cada uno de poli(PEG_{500}-MA)h (compuesto Nº 12) (preparado tal como se describe en el ejemplo 13 anterior) y poli(PEG_{500}-MA)a (compuesto Nº 9) [concentración de polímero: 21 mg/ml, medio: PBS (el pH se ajustó a 9,5 con NaOH 1 M)] (preparado tal como se describe en el ejemplo 10 anterior) a 18,9 \mul de PBS (pH 6,0) que contenía 1,08 mg/ml de Rho-NH_{2}. Se dejaron reposar las disoluciones así obtenidas a 25ºC durante 3 días. Al final de este tiempo, se fraccionaron las mezclas de reacción mediante cromatografía de filtración en gel (columna: PD-10 fabricada por Amersham Biotech, fase móvil: agua purificada) tal como sigue. Se aplicaron 0,5 ml de la mezcla de reacción a la columna de filtración en gel y se extrajeron de la columna y se descartaron 0,5 ml. Se añadieron a la columna 2 ml de agua destilada y se eluyeron y descartaron 2 ml adicionales. Se añadieron a la columna 2 ml adicionales de agua destilada y se eluyeron 2 ml adicionales y esta fracción contenía la fracción de polímero. Se cuantificó la Rho-NH_{2} contenida en las fracciones de polímero mediante espectrometría de fluorescencia (longitud de onda de excitación: 544 nm, longitud de onda fluorescente: 571 nm, medio: agua purificada ajustada a pH 3), para calcular la razón de la cantidad de Rho-NH_{2} contenida en cada complejo de polímero y Rho-NH_{2} con respecto a la cantidad total de Rho-NH_{2} en la mezcla de reacción, es decir la razón de unión de Rho-NH_{2} al polímero.
Los resultados fueron tal como se muestra en la tabla 8 a continuación.
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TABLA 8 Reactividad del modificador polimérico
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A partir de la tabla 8 anterior puede observarse fácilmente que para la mezcla de reacción del modificador polimérico poli(FEG_{500}-MA)a (compuesto Nº 9) con Rho-NH_{2}, hay un nivel bastante alto de Rho-NH_{2} detectada en la fracción de polímero. Esto está en contraposición con la mezcla de reacción del modificador polimérico poli(PEG_{500}-MA)h (compuesto Nº 12) con Rho-NH_{2}, en la que sólo hay un nivel bajo de Rho-NH_{2} detectado en la fracción de polímero. Cuando sólo se aplicó Rho-NH_{2} a la columna, no se eluyó Rho-NH_{2} en la "fracción de polímero". Estos resultados indican que el modificador polimérico poli(PEG_{500}-MA)a (compuesto Nº 9) de la presente invención se une fuertemente al grupo amino de Rho-NH_{2}. Por otra parte, la razón de unión del modificador polimérico poli(PEG_{500}-MA)h (compuesto Nº 12) de la presente invención es baja, lo que sugiere que este modificador polimérico no se une fuertemente al grupo amino de Rho-NH_{2}.
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Ejemplo de prueba 8
Evaluación de la tasa de detección de OCIF mediante ELISA
Se determinó la tasa de detección de cada uno de los complejos de OCIF y modificador polimérico preparado tal como se describe en el ejemplo 14 y el ejemplo comparativo 3 anterior partiendo de la base de OCIF humano purificado no modificado (OCIF preparado tal como se describe en los documentos WO 96/26217 y EP 816380) mediante ELISA. Se llevó a cabo el ELISA tal como sigue.
Se disolvió el anticuerpo monoclonal OI-29 anti-OCIF humano (preparado según el método dado a conocer en el documento EP0974671) en una disolución de carbonato ácido de sodio 0,1 M (pH 9,6) para obtener una disolución que tenía una concentración de OI-19 de 10 \mug/ml. Se colocaron 100 \mul de la disolución de OI-19 así preparada en cada pocillo de una inmunoplaca de 96 pocillos (fabricada por Nunc), y se dejaron reposar las placas a 4ºC durante la noche. Al final de este tiempo, se añadió a cada pocillo Block Ace al 50% (adquirido de Snow Brand Milk Products Co., Ltd.) para bloquear, y entonces se lavaron las placas tres veces con PBS (tampón de lavado) que contenía Tween 20 al 0,1%. Se disolvió OCIF humano purificado (OCIF preparado tal como se describe en los documentos WO 96/26217 y EP 816380) en tampón de reacción primario (es decir, disolución tampón de Tris 0,2 M - ácido clorhídrico (pH 7,4) que contenía Block Ace al 40%, Tween 20 al 0,1% y 10 \mug/ml de IgG de ratón) para preparar disoluciones patrón con diversas concentraciones de OCIF. Se añadieron a cada pocillo 100 \mul de cada de una de las disoluciones así preparadas con diversas concentraciones de OCIF, se agitaron las placas a temperatura ambiente durante 2 horas y entonces se lavó cada pocillo seis veces con el tampón de lavado. Entonces se diluyó POD-OI-4 (es decir, un anticuerpo marcado con peroxidasa y que reconoce OCIF, preparado tal como se describe en el documento EP0974671) 10.000 veces con tampón de reacción secundario (es decir, disolución tampón de Tris 0,1 M - ácido clorhídrico (pH 7,4) que contenía Block Ace al 25%, Tween 20 al 0,1% y 10 \mug/ml de IgG de ratón), se añadieron a cada pocillo 100 \mul de la disolución resultante, se agitaron las placas a temperatura ambiente durante 2 horas y entonces se lavó cada pocillo seis veces. Una vez realizado esto, se añadieron a cada pocillo 100 \mul de una disolución de sustrato (reactivo soluble TMB, disponible de Scytek), y se agitaron las placas a temperatura ambiente durante de 10 a 15 minutos. Después, se añadieron a cada pocillo 100 \mul de un reactivo de parada de la reacción (tampón de parada TMB, disponible de Scytek) y se agitaron suavemente las placas. Al final de este tiempo, se midió la absorbancia a una longitud de onda de 450 nm para cada pocillo mediante un lector de microplacas (MEML 001, fabricado por Molecular Device corporation). Se calculó la concentración de OCIF de cada muestra patrón de OCIF basándose en la curva de calibración producida usando disoluciones de OCIF que tenían una concentración conocida.
Para cada una de las muestras del complejo sometido a prueba, se midieron las absorbancias, las concentraciones de OCIF calculadas a partir de la curva patrón y se calculó la tasa de fracaso al detectar OCIF mediante ELISA tal como se explica en el ejemplo de prueba 3 anterior. Los resultados obtenidos son tal como se muestra en la tabla 9 a continuación.
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TABLA 9 Tasa de fracaso al detectar la muestra de OCIF mediante ELISA 
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A partir de la tabla 9 anterior puede observarse fácilmente que para cada uno de los complejos de modificador polimérico y proteína de la presente invención preparados en el ejemplo 14, la tasa de fracaso al detectar OCIF mediante ELISA producida mediante la modificación de la proteína disminuyó significativamente en comparación con el complejo de polímero y proteína de la técnica anterior preparado en ejemplo comparativo 3, para el que la tasa de fracaso al detectar OCIF mediante ELISA era muy alta.
A partir de estos resultados, está claro que los complejos de modificador polimérico y proteína de la presente invención sólo dan lugar a una disminución muy pequeña en la sensibilidad de la detección mediante ELISA que puede producirse por una modificación en exceso de la proteína y/o por la formación de un complejo voluminoso.
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Ejemplo de prueba 9
Evaluación de la retención en la sangre usando ratas
Se diluyó apropiadamente cada una de las muestras preparadas en el ejemplo 14 y OCIF humano purificado no modificado (OCIF preparado tal como se describe en los documentos WO 96/26217 y EP 816380) con PBS (pH 7,0) de modo que la concentración de OCIF fue de 0,25 ó 0,025 mg/ml. Se administró cada una de las muestras diluidas así obtenidas a una rata Wistar hembra de cinco semanas de edad (que tenía un peso corporal de aproximadamente 100 g que no había privado de alimento durante un día) por una vena femoral de modo que la dosis de OCIF fue de 0,5 ó 0,05 mg/kg (2 ml/kg por volumen). Seis horas tras la administración, se extrajeron 200 \mul de sangre de la vena yugular de la rata, y entonces se midió la concentración de OCIF en el suero sanguíneo mediante el método de ELISA descrito anteriormente.
La concentración de OCIF en suero sanguíneo medida tras la administración de cada muestra se muestra en la tabla 10 a continuación.
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TABLA 10 Concentración de OCIF en suero sanguíneo tras la administración intravenosa de cada muestra de OCIF
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Tal como resulta evidente a partir de la tabla 10 anterior, el complejo de modificador polimérico y proteína de la presente invención mejoraron significativamente la retención de dicha proteína en la sangre cuando se comparó con cuando se administró la proteína sola.
A partir de los resultados anteriores, está claro que el complejo de modificador polimérico y proteína de la presente invención puede producirse establemente en condiciones que oscilan ampliamente y que dicho complejo mejora significativamente la retención en la sangre de la proteína del complejo tras la administración. Por tanto, es probable que el complejo sea extremadamente útil en los campos farmacéutico y bioquímico.
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Ejemplo de prueba 10
Evaluación de la retención en la sangre usando ratas
Se evaluó cada una de las muestras preparadas en el ejemplo 17 y en el ejemplo 19 de la misma manera que en el ejemplo de prueba 9. La concentración de OCIF en suero sanguíneo medida tras la administración de cada muestra se muestra en la tabla 11 a continuación.
TABLA 11 Concentración de OCIF en suero sanguíneo tras la administración intravenosa de cada muestra de OCIF
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A partir de la tabla 11 anterior puede observarse fácilmente que todos los modificadores poliméricos sometidos a prueba de la presente invención que tenían diversos tamaños moleculares aumentaron significativamente la retención en la sangre de la proteína en comparación con cuando se administró la proteína sola.
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Ejemplo de prueba 11
Evaluación del tamaño molecular mediante cromatografía de exclusión molecular
Se evaluó el tamaño molecular de cada uno de los complejos de modificador polimérico y OCIF preparados en el ejemplo 9, ejemplo 14, ejemplo 17 y ejemplo 19 mediante cromatografía de exclusión molecular. Las condiciones de prueba son tal como se muestra en la tabla 12 a continuación.
TABLA 12 Condiciones para la cromatografía de exclusión molecular
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El tiempo de retención de las siguientes proteínas patrón en las condiciones mencionadas anteriormente son tal como se muestra en la tabla 13 a continuación.
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TABLA 13 El tiempo de retención de cada proteína patrón
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A partir de los resultados de la cromatografía de exclusión molecular, se determinó que el radio de Stokes de OCIF no complejado era de 5,63 nm, y de cada complejo modificador polimérico - OCIF de la invención se determinó tal como sigue:
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Complejos preparados en el ejemplo 9
complejos de poli(PEG_{500}-MA)h (compuesto Nº 1)-OCIF (Radios de Stokes que oscilan desde 6,13 nm hasta
7,32 nm)
complejos de poli(PEG_{500}-MA)a (compuesto Nº 3)-OCIF (desde 6,12 nm hasta 6,54 nm),
complejos de poli(PEG_{500}-MA)dma (compuesto Nº 4)-OCIF (6,39 nm),
complejo de poli(PEG_{500}-MA)ipa (compuesto Nº 5)-OCIF (6,26 nm),
complejo de poli(PEG_{500}-MA)ea (compuesto Nº 6)-OCIF (6,44 nm),
complejo de poli(PEG_{1500}-MA)h (compuesto Nº 2)-OCIF (desde 6,44 nm hasta 6,71 nm),
complejo de poli(PEG_{1500}-MA)a (compuesto Nº 7)-OCIF (desde 6,40 nm hasta 6,47 nm),
complejo de poli(PEG_{1500}-MA)dma (compuesto Nº 8)-OCIF (6,55 nm).
A partir de estos resultados es evidente que cada uno de los complejos de la invención tenía un radio de Stokes que era mayor en aproximadamente 1 nm que el de OCIF no complejado en la solución salina tamponada con fosfato usada como fase móvil. Además, para cada una de las muestras, no se detectó un pico derivado de OCIF no modificado, lo que demuestra la estabilidad de los complejos.
Los radios de Stokes de los otros complejos se determinaron en condiciones similares a las descritas anteriormente. Los resultados fueron tal como sigue:
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Complejos preparados en el ejemplo 14
Complejos preparados en las condiciones de conc. de OCIF, 5 mg/ml; conc. de modificador polimérico, que oscila desde 1,25 mg/ml hasta 5 mg/ml; pH 7,4; 25ºC; 36 h; medio, solución salina tamponada con fosfato (conc. de fosfato, 10 mM; conc. de NaCl, 150 mM), se encontró que los radios de Stokes oscilaban desde 6,2 nm hasta 6,5 nm. Además, para cada una de las muestras, no se detectó un pico derivado de OCIF no modificado, lo que demuestra la estabilidad de los complejos.
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Complejos preparados en el ejemplo 17
Complejos preparados con condiciones de incubación de conc. de OCIF, 0,5 mg/ml; conc. de modificador polimérico, 0,5 mg/ml; pH 6,0; 25ºC; 168 h; medio, solución salina tamponada con fosfato (conc. de fosfato, 10 mM; conc. de NaCl, 150 mM), se encontró que tenían radios de Stokes que oscilaban desde 6,1 nm hasta 6,7 nm. Además, para cada una de las muestras, no se detectó un pico derivado de OCIF no modificado, lo que demuestra la estabilidad de los complejos.
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Complejos preparados en el ejemplo 19
Complejos con condiciones de incubación de conc. de OCIF, 5 mg/ml; conc. de modificador polimérico, 5 mg/ml; pH 5,5; 25ºC; 168 h; medio, solución salina tamponada con fosfato (conc. de fosfato, 10 mM; conc. de NaCl, 150 mM), se encontró que tenían radios de Stokes que oscilaban desde 6,3 nm hasta 6,8 nm. Además, para cada una de las muestras, no se detectó un pico derivado de OCIF no modificado, lo que demuestra la estabilidad de los complejos.
El aumento en los radios de Stokes de los complejos de modificador polimérico - OCIF de la presente invención cuando se comparó con OCIF no complejado puede atribuirse a la modificación de OCIF con los modificadores poliméricos de la presente invención.
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Ejemplo de prueba 12
Evaluación de retención en la sangre usando ratas y evaluación de la tasa de detección de OCIF mediante ELISA
Se sometieron a prueba la retención en la sangre y la tasa de detección de OCIF mediante ELISA para el complejo preparado en el ejemplo 22 (complejo de compuesto Nº 54 y OCIF) (temperatura de incubación: 25ºC) de la misma manera que se describió en los ejemplos de prueba 2 y 3 anteriores. Se estableció la dosis equivalente de OCIF a 0,1 mg/kg. Se encontró que la concentración sérica de OCIF era de 189 ng/ml 6 horas tras la inyección por vía i.v. del complejo. Por tanto, se confirmó que los complejos preparados con sal de sodio de poli(PEG_{500}-MA)ea (compuesto Nº 54) en el ejemplo 22 anterior mostraron un nivel excelente de retención en la sangre. Además, se encontró que la disminución en la sensibilidad de la detección de OCIF mediante ELISA debido a la modificación excesiva de la proteína por el modificador en el complejo era muy baja.
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Ejemplo de prueba 13
Evaluación del tamaño del complejo
Se evaluó el tamaño molecular de los complejos preparados en los ejemplos 22 (complejo de compuesto Nº 54 y OCIF) y 24 (complejo de compuesto Nº 55 y OCIF) mediante cromatografía de filtración en gel tal como se describe en el ejemplo de prueba 11 anterior. Se encontró que el tamaño molecular de estos complejos mostraba un alto nivel de uniformidad. Para los complejos del compuesto Nº 54 y OCIF complejados a 4ºC, 10ºC y 25ºC, se encontró que los radios de Stokes eran de 6,0 nm, 6,0 nm y 6,0 nm. Para los complejos del compuesto Nº 55 y OCIF, los radios de Stokes eran de 6,4 nm. Cada uno de los complejos preparados en el ejemplo 22 y 24 tenían por tanto un radio de Stokes mayor que el OCIF humano purificado no modificado (radio de Stokes: 5,63 nm).
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Ejemplo de preparación
Se liofiliza una disolución que contiene el complejo obtenido en condiciones estériles de la misma manera que se describió en el ejemplo 14 anterior para obtener una preparación liofilizada.

Claims (121)

1. Copolímero o sal farmacológicamente aceptable del mismo, que contiene, como unidades constitucionales,
(a) una o más unidades estructurales que pueden ser iguales o diferentes entre sí y que se representan mediante la fórmula (I) a continuación:
40
en la que:
m es un número entero de desde 3 hasta 100,
Alk representa un grupo alquileno que tiene desde 1 hasta 6 átomos de carbono, y
R^{1} y R^{2} son iguales o diferentes y cada uno representa un átomo de hidrógeno o un grupo alquilo que tiene desde 1 hasta 6 átomos de carbono que puede estar opcionalmente sustituido con al menos un sustituyente seleccionado del grupo que consiste en grupos hidroxilo, átomos de halógeno y grupos arilo que tienen desde 6 hasta 14 átomos de carbono que pueden estar opcionalmente sustituidos con desde 1 hasta 5 sustituyentes seleccionados de los sustituyentes A definidos a continuación, y
(b) una o más unidades estructurales que pueden ser iguales o diferentes entre sí y que se representan mediante la fórmula (II):
41
en la que:
R^{3} representa
un grupo hidroxilo,
un grupo alcoxilo que tiene desde 1 hasta 6 átomos de carbono que puede estar opcionalmente sustituido con al menos un sustituyente seleccionado del grupo que consiste en grupos hidroxilo, átomos de halógeno y grupos arilo que tienen desde 6 hasta 14 átomos de carbono que pueden estar opcionalmente sustituidos con desde 1 hasta 5 sustituyentes seleccionados de los sustituyentes A definidos a continuación,
un grupo ariloxilo que tiene desde 6 hasta 14 átomos de carbono que puede estar opcionalmente sustituido con desde 1 hasta 5 sustituyentes seleccionados de los sustituyentes A definidos a continuación, o
un grupo representado por la fórmula -NR^{4}R^{5}, en la que R^{4} y R^{5} son iguales o diferentes entre sí y cada uno representa un átomo de hidrógeno o un grupo alquilo que tiene desde 1 hasta 6 átomos de carbono que puede estar opcionalmente sustituido con al menos un sustituyente seleccionado del grupo que consiste en grupos hidroxilo, átomos de halógeno y grupos arilo que tienen desde 6 hasta 14 átomos de carbono que pueden estar opcionalmente sustituidos con desde 1 hasta 5 sustituyentes seleccionados de los sustituyentes A definidos a continuación;
los sustituyentes A se seleccionan de grupos alquilo que tienen desde 1 hasta 6 átomos de carbono, grupos alcoxilo que tienen desde 1 hasta 6 átomos de carbono, átomos de halógeno, grupos hidroxilo, grupos nitro y grupos carboxilo.
2. Copolímero o sal farmacológicamente aceptable del mismo según la reivindicación 1, en los que las unidades estructurales representadas por la fórmula (I) y las unidades estructurales representadas por la fórmula (II) están dispuestas en una secuencia alternante de cabeza-cabeza, una secuencia alternante de cabeza-cola o una secuencia alternante mixta de cabeza-cabeza y cabeza-cola.
3. Copolímero o sal farmacológicamente aceptable del mismo según la reivindicación 1, en los que las unidades estructurales representadas por la fórmula (I) y las unidades estructurales representadas por la fórmula (II) están dispuestas en una secuencia al azar.
4. Copolímero o sal farmacológicamente aceptable del mismo según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, en los que Alk es un grupo etileno o trimetileno.
5. Copolímero o sal farmacológicamente aceptable del mismo según la reivindicación 4, en los que Alk es un grupo etileno.
6. Copolímero o sal farmacológicamente aceptable del mismo según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, en los que m es un número entero de desde 3 hasta 50.
7. Copolímero o sal farmacológicamente aceptable del mismo según la reivindicación 6, en los que m es un número entero de desde 3 hasta 40.
8. Copolímero o sal farmacológicamente aceptable del mismo según la reivindicación 7, en los que m es un número entero de desde 6 hasta 16 o de 28 a 38.
9. Copolímero o sal farmacológicamente aceptable del mismo según la reivindicación 8, en los que m es un número entero de desde 6 hasta 16.
10. Copolímero o sal farmacológicamente aceptable del mismo según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9, en los que R^{1} es un átomo de hidrógeno o un grupo metilo.
11. Copolímero o sal farmacológicamente aceptable del mismo según la reivindicación 10, en los que R^{1} es un átomo de hidrógeno.
12. Copolímero o sal farmacológicamente aceptable del mismo según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 11, en los que R^{2} es un átomo de hidrógeno o un grupo metilo.
13. Copolímero o sal farmacológicamente aceptable del mismo según la reivindicación 12, en los que R^{2} es un grupo metilo.
14. Copolímero o sal farmacológicamente aceptable del mismo según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 13, en los que R^{3} es un grupo hidroxilo, un grupo alcoxilo que tiene desde 1 hasta 6 átomos de carbono o un grupo representado por la fórmula -NR^{4}R^{5}, en la que R^{4} y R^{5} son iguales o diferentes y cada uno representa un átomo de hidrógeno o un grupo alquilo que tiene desde 1 hasta 6 átomos de carbono.
15. Copolímero o sal farmacológicamente aceptable del mismo según la reivindicación 14, en los que R^{3} es un grupo hidroxilo o un grupo alcoxilo que tiene desde 1 hasta 6 átomos de carbono.
16. Copolímero o sal farmacológicamente aceptable del mismo según la reivindicación 15, que comprenden al menos una unidad estructural representada por la fórmula (II) en la que R^{3} es un grupo alcoxilo que tiene desde 1 hasta 6 átomos de carbono y opcionalmente al menos una unidad estructural representada por la fórmula (II) en la que R^{3} es un grupo hidroxilo, en los que la razón entre las unidades estructurales representadas por la fórmula (II) en la que R^{3} es un grupo hidroxilo y las unidades estructurales representadas por la fórmula (II) en la que R^{3} es un grupo alcoxilo que tiene desde 1 hasta 6 átomos de carbono está en el intervalo de desde 4:6 hasta 0:10.
17. Copolímero o sal farmacológicamente aceptable del mismo según la reivindicación 15 o reivindicación 16, en los que R^{3} es un grupo alcoxilo que tiene desde 1 hasta 6 átomos de carbono.
18. Copolímero o sal farmacológicamente aceptable del mismo según una cualquiera de las reivindicaciones 15 a 17, en los que dicho grupo alcoxilo que tiene desde 1 hasta 6 átomos de carbono es un grupo etoxilo.
19. Copolímero o sal farmacológicamente aceptable del mismo según la reivindicación 14, en los que R^{3} es un grupo hidroxilo o un grupo representado por la fórmula -NR^{4}R^{5}, en la que R^{4} y R^{5} son iguales o diferentes y cada uno representa un átomo de hidrógeno o un grupo alquilo que tiene desde 1 hasta 6 átomos de carbono.
20. Copolímero o sal farmacológicamente aceptable del mismo según la reivindicación 19, que comprenden al menos una unidad estructural representada por la fórmula (II) en la que R^{3} es un grupo representado por la fórmula -NR^{4}R^{5}, en la que R^{4} y R^{5} son iguales o diferentes y cada uno representa un átomo de hidrógeno o un grupo alquilo que tiene desde 1 hasta 6 átomos de carbono y opcionalmente al menos una unidad estructural representada por la fórmula (II) en la que R^{3} es un grupo hidroxilo, en los que la razón entre las unidades estructurales representadas por la fórmula (II) en la que R^{3} es un grupo hidroxilo y las unidades estructurales representadas por la fórmula (II) en la que R^{3} es un grupo representado por la fórmula -NR^{4}R^{5} está en el intervalo de desde 5:5 hasta 0:10.
21. Copolímero o sal farmacológicamente aceptable del mismo según la reivindicación 20, en los que la razón entre las unidades estructurales representadas por la fórmula (II) en la que R^{3} es un grupo hidroxilo y las unidades estructurales representadas por la fórmula (II) en la que R^{3} es un grupo representado por la fórmula -NR^{4}R^{5} está en el intervalo de desde 4:6 hasta 0:10.
22. Copolímero o sal farmacológicamente aceptable del mismo según una cualquiera de las reivindicaciones 19 a 21, en los que R^{3} es un grupo representado por la fórmula -NR^{4}R^{5}, en la que R^{4} y R^{5} son iguales o diferentes y cada uno representa un átomo de hidrógeno o un grupo alquilo que tiene desde 1 hasta 6 átomos de carbono.
23. Copolímero o sal farmacológicamente aceptable del mismo según una cualquiera de las reivindicaciones 19 a 22, en los que el grupo representado por la fórmula -NR^{4}R^{5} es un grupo amino, un grupo metilamino o un grupo dimetilamino.
24. Copolímero o sal farmacológicamente aceptable del mismo según la reivindicación 23, en los que el grupo representado por la fórmula -NR^{4}R^{5} es un grupo amino.
25. Copolímero o sal farmacológicamente aceptable del mismo según la reivindicación 23, en los que el grupo representado por la fórmula -NR^{4}R^{5} es un grupo dimetilamino.
26. Copolímero o sal farmacológicamente aceptable del mismo según la reivindicación 14, en los que R^{3} es un grupo hidroxilo.
27. Copolímero o sal farmacológicamente aceptable del mismo según la reivindicación 14, en los que R^{3} es un grupo 1-amino-2-propanol.
28. Copolímero o sal farmacológicamente aceptable del mismo según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 27, en los que la razón entre la unidad estructural representada por la fórmula (I) y la unidad estructural representada por la fórmula (II) está en el intervalo de desde 10:1 hasta 1:10.
29. Copolímero o sal farmacológicamente aceptable del mismo según la reivindicación 28, en los que la razón entre la unidad estructural representada por la fórmula (I) y la unidad estructural representada por la fórmula (II) está en el intervalo de desde 3:1 hasta 1:8.
30. Copolímero o sal farmacológicamente aceptable del mismo según la reivindicación 28, en los que la razón entre la unidad estructural representada por la fórmula (I) y la unidad estructural representada por la fórmula (II) está en el intervalo de desde 2:1 hasta 1:2 o de 1:2 a 1:6.
31. Copolímero o sal farmacológicamente aceptable del mismo según la reivindicación 28, en los que la razón entre la unidad estructural representada por la fórmula (I) y la unidad estructural representada por la fórmula (II) es de 1:1 o está en el intervalo de desde 1:2 hasta 1:4.
32. Copolímero o sal farmacológicamente aceptable del mismo según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 31, en los que el grado promedio de polimerización está en el intervalo de desde 5 hasta 200.
33. Copolímero o sal farmacológicamente aceptable del mismo según la reivindicación 32, en los que el grado promedio de polimerización está en el intervalo de desde 5 hasta 50.
34. Copolímero o sal farmacológicamente aceptable del mismo según la reivindicación 33, en los que el grado promedio de polimerización está en el intervalo de desde 5 hasta 20.
35. Copolímero o sal farmacológicamente aceptable del mismo según la reivindicación 32, en los que el grado promedio de polimerización está en el intervalo de desde 20 hasta 30.
36. Copolímero o sal farmacológicamente aceptable del mismo según la reivindicación 32, en los que el grado promedio de polimerización está en el intervalo de desde 30 hasta 40.
37. Copolímero o sal farmacológicamente aceptable del mismo según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 31, en los que el radio de Stokes del mismo es de 9,3 nm o inferior.
38. Copolímero o sal farmacológicamente aceptable del mismo según la reivindicación 37, en los que el radio de Stokes del mismo es de 7,3 nm o inferior.
39. Copolímero o sal farmacológicamente aceptable del mismo según la reivindicación 38, en los que el radio de Stokes del mismo es de 6,2 nm o inferior.
40. Copolímero o sal farmacológicamente aceptable del mismo según la reivindicación 39, en los que el radio de Stokes del mismo es de 4,7 nm o inferior.
41. Copolímero o sal farmacológicamente aceptable del mismo según la reivindicación 40, en los que el radio de Stokes del mismo es de 3,1 nm o inferior.
42. Copolímero o sal farmacológicamente aceptable del mismo según la reivindicación 37, en los que el radio de Stokes del mismo está en el intervalo de desde 1,5 nm hasta 4,7 nm.
43. Copolímero o sal farmacológicamente aceptable del mismo según la reivindicación 37, en los que el radio de Stokes del mismo está en el intervalo de desde 3,1 nm hasta 6,2 nm.
44. Copolímero o sal farmacológicamente aceptable del mismo según la reivindicación 1, en los que:
m es un número entero de desde 3 hasta 100,
Alk representa un grupo alquileno que tiene desde 1 hasta 6 átomos de carbono,
R^{1} y R^{2} son iguales o diferentes y cada uno representa un átomo de hidrógeno o un grupo alquilo que tiene desde 1 hasta 6 átomos de carbono, y
R^{3} representa un grupo hidroxilo, un grupo alcoxilo que tiene desde 1 hasta 6 átomos de carbono que puede estar opcionalmente sustituido con un grupo hidroxilo, o un grupo representado por la fórmula -NR^{4}R^{5}, en la que R^{4} y R^{5} son iguales o diferentes entre sí y cada uno representa un átomo de hidrógeno o un grupo alquilo que tiene desde 1 hasta 6 átomos de carbono que puede estar opcionalmente sustituido con un grupo hidroxilo.
45. Copolímero o sal farmacológicamente aceptable del mismo según la reivindicación 1, en los que Alk representa un grupo etileno, R^{1} representa un átomo de hidrógeno, R^{2} representa un grupo metilo y m, R^{3}, la razón de las unidades estructurales de fórmulas (I) y (II) (la razón de composición) y, cuando sea pertinente, la razón entre las unidades de fórmula (II) en la que R^{3} representa un grupo hidroxilo y las unidades de fórmula (II) en la que R^{3} representa un grupo distinto de hidroxilo (la razón de hidrólisis) se seleccionan de lo siguiente:
(i)
m es desde 6 hasta 16, R^{3} es un grupo hidroxilo, la razón de composición es de 1:1 y el grado promedio de polimerización es desde 30 hasta 40;
(ii)
m es desde 28 hasta 38, R^{3} es un grupo hidroxilo, la razón de composición es de 1:1 y el grado promedio de polimerización es desde 10 hasta 15;
(iii)
m es desde 6 hasta 16, R^{3} es un grupo amino, la razón de composición es de 1:1 y el grado promedio de polimerización es desde 30 hasta 40;
(iv)
m es desde 6 hasta 16, R^{3} es un grupo dimetilamino, la razón de composición es de 1:1 y el grado promedio de polimerización es desde 30 hasta 40;
(v)
m es desde 6 hasta 16, R^{3} es un grupo 1-amino-2-propanol, la razón de composición es de 1:1 y el grado promedio de polimerización es desde 30 hasta 40;
(vi)
m es desde 6 hasta 16, R^{3} se selecciona de grupos etoxilo e hidroxilo, la razón de composición es de 1:1, el grado promedio de polimerización es desde 30 hasta 40 y la razón de hidrólisis es de 4:6;
(vii)
m es desde 28 hasta 16, R^{3} se selecciona de grupos amino e hidroxilo, la razón de composición es de 1:1, el grado promedio de polimerización es desde 10 hasta 15 y la razón de hidrólisis es de 4:6;
(viii)
m es desde 28 hasta 38, R^{3} es un grupo dimetilamino, la razón de composición es de 1:1 y el grado promedio de polimerización es desde 10 hasta 15;
(ix)
m es desde 6 hasta 16, R^{3} se selecciona de grupos amino e hidroxilo, la razón de composición es de 1:1, el grado promedio de polimerización es desde 30 hasta 40, la razón de hidrólisis es de 3,1:6,9 y el copolímero es una sal de sodio;
(x)
m es desde 6 hasta 16, R^{3} se selecciona de grupos amino e hidroxilo, la razón de composición es de 1:1, el grado promedio de polimerización es desde 30 hasta 40 y la razón de hidrólisis es de 1,4:8,6;
(xi)
m es desde 6 hasta 16, R^{3} se selecciona de grupos dimetilamino e hidroxilo, la razón de composición es de 1:1, el grado promedio de polimerización es desde 30 hasta 40, la razón de hidrólisis es de 2,9:7,1 y el copolímero es una sal de sodio;
(xii)
m es desde 6 hasta 16, R^{3} es un grupo amino, la razón de composición es de 1:2,4 y el grado promedio de polimerización es desde 20 hasta 30;
(xiii)
m es desde 6 hasta 16, R^{3} se selecciona de grupos amino e hidroxilo, la razón de composición es de 1:2,4, el grado promedio de polimerización es desde 20 hasta 30 y la razón de hidrólisis es de 0,4:9,6;
(xiv)
m es desde 6 hasta 16, R^{3} se selecciona de grupos amino e hidroxilo, la razón de composición es de 1:2,4, el grado promedio de polimerización es desde 20 hasta 30 y la razón de hidrólisis es de 2,9:7,1;
(xv)
m es desde 6 hasta 16, R^{3} se selecciona de grupos amino e hidroxilo, la razón de composición es de 1:2,4, el grado promedio de polimerización es desde 20 hasta 30 y la razón de hidrólisis es de 0,9:9,1;
(xvi)
m es desde 6 hasta 16, R^{3} se selecciona de grupos amino e hidroxilo, la razón de composición es de 1:2,4, el grado promedio de polimerización es desde 20 hasta 30 y la razón de hidrólisis es de 0,5:9,5;
(xvii)
m es desde 6 hasta 16, R^{3} se selecciona de grupos amino e hidroxilo, la razón de composición es de 1:2,4, el grado promedio de polimerización es desde 20 hasta 30 y la razón de hidrólisis es de 1,3:8,7;
(xviii)
m es desde 6 hasta 16, R^{3} se selecciona de grupos amino e hidroxilo, la razón de composición es de 1:2,4, el grado promedio de polimerización es desde 20 hasta 30 y la razón de hidrólisis es de 1,9:8,1;
(xix)
m es desde 6 hasta 16, R^{3} se selecciona de grupos amino e hidroxilo, la razón de composición es de 1:2,4, el grado promedio de polimerización es desde 20 hasta 30 y la razón de hidrólisis es de 1,0:9,0;
(xx)
m es desde 6 hasta 16, R^{3} se selecciona de grupos amino e hidroxilo, la razón de composición es de 1:2,4, el grado promedio de polimerización es desde 20 hasta 30 y la razón de hidrólisis es de 0,8:9,2;
(xxi)
m es desde 6 hasta 16, R^{3} se selecciona de grupos amino e hidroxilo, la razón de composición es de 1:2,4, el grado promedio de polimerización es desde 20 hasta 30 y la razón de hidrólisis es de 4,6:5,4;
(xxii)
m es desde 6 hasta 16, R^{3} se selecciona de grupos amino e hidroxilo, la razón de composición es de 1:2,4, el grado promedio de polimerización es desde 20 hasta 30 y la razón de hidrólisis es de 1,2:8,8;
(xxiii)
m es desde 6 hasta 16, R^{3} se selecciona de grupos amino e hidroxilo, la razón de composición es de 1:2,4, el grado promedio de polimerización es desde 20 hasta 30 y la razón de hidrólisis es de 2,0:8,0;
(xxiv)
m es desde 6 hasta 16, R^{3} se selecciona de grupos amino e hidroxilo, la razón de composición es de 1:2,4, el grado promedio de polimerización es desde 20 hasta 30 y la razón de hidrólisis es de 1,1:8,9;
(xxv)
m es desde 6 hasta 16, R^{3} se selecciona de grupos amino e hidroxilo, la razón de composición es de 1:2,4, el grado promedio de polimerización es desde 20 hasta 30 y la razón de hidrólisis es de 2,4:7:6;
(xxvi)
m es desde 6 hasta 16, R^{3} se selecciona de grupos amino e hidroxilo, la razón de composición es de 1:2,4, el grado promedio de polimerización es desde 20 hasta 30 y la razón de hidrólisis es de 0,9:9,1;
(xxvii)
m es desde 6 hasta 16, R^{3} se selecciona de grupos amino e hidroxilo, la razón de composición es de 1:2,4, el grado promedio de polimerización es desde 20 hasta 30 y la razón de hidrólisis es de 1,5:8,5;
(xxviii)
m es desde 6 hasta 16, R^{3} se selecciona de grupos amino e hidroxilo, la razón de composición es de 1:2,4, el grado promedio de polimerización es desde 20 hasta 30 y la razón de hidrólisis es de 0,7:9,3;
(xxix)
m es desde 6 hasta 16, R^{3} se selecciona de grupos amino e hidroxilo, la razón de composición es de 1:2,4, el grado promedio de polimerización es desde 20 hasta 30 y la razón de hidrólisis es de 4,5:5,5;
(xxx)
m es desde 6 hasta 16, R^{3} se selecciona de grupos amino e hidroxilo, la razón de composición es de 1:2,4, el grado promedio de polimerización es desde 20 hasta 30 y la razón de hidrólisis es de 1,4:8,6;
(xxxi)
m es desde 6 hasta 16, R^{3} se selecciona de grupos amino e hidroxilo, la razón de composición es de 1:2,4, el grado promedio de polimerización es desde 20 hasta 30 y la razón de hidrólisis es de 0,7:9,3;
(xxxii)
m es desde 6 hasta 16, R^{3} se selecciona de grupos amino e hidroxilo, la razón de composición es de 1:2,4, el grado promedio de polimerización es desde 20 hasta 30 y la razón de hidrólisis es de 0,8:9,2;
(xxxiii)
m es desde 6 hasta 16, R^{3} se selecciona de grupos amino e hidroxilo, la razón de composición es de 1:2,4, el grado promedio de polimerización es desde 20 hasta 30 y la razón de hidrólisis es de 1,4:8,6;
(xxxiv)
m es desde 6 hasta 16, R^{3} se selecciona de grupos amino e hidroxilo, la razón de composición es de 1:3,1, el grado promedio de polimerización es desde 20 hasta 30 y la razón de hidrólisis es de 0,7:9,3;
(xxxv)
m es desde 6 hasta 16, R^{3} se selecciona de grupos amino e hidroxilo, la razón de composición es de 1:2,4, el grado promedio de polimerización es desde 20 hasta 30 y la razón de hidrólisis es de 0,9:9,1;
(xxxvi)
m es desde 6 hasta 16, R^{3} se selecciona de grupos amino e hidroxilo, la razón de composición es de 1:2,4, el grado promedio de polimerización es desde 20 hasta 30 y la razón de hidrólisis es de 1,9:8,1;
(xxxvii)
m es desde 6 hasta 16, R^{3} se selecciona de grupos etoxilo e hidroxilo, la razón de composición es de aproximadamente 1:3, el grado promedio de polimerización es desde 20 hasta 30 y la razón de hidrólisis es de 3,1:6,9;
(xxxviii)
m es desde 6 hasta 16, R^{3} se selecciona de grupos amino e hidroxilo, la razón de composición es de 1:1, la razón de hidrólisis es de 1,4:8,6 y el radio de Stokes es de 9,3 nm o inferior;
(xxxix)
m es desde 6 hasta 16, R^{3} se selecciona de grupos amino e hidroxilo, la razón de composición es de 1:1, la razón de hidrólisis es de 1,4:8,6 y el radio de Stokes está en el intervalo de desde 3,1 hasta 6,2 nm;
(xl)
m es desde 6 hasta 16, R^{3} se selecciona de grupos amino e hidroxilo, la razón de composición es de 1:1, la razón de hidrólisis es de 1,4:8,6 y el radio de Stokes está en el intervalo de desde 1,5 hasta 4,7 nm;
(xli)
m es desde 6 hasta 16, R^{3} se selecciona de grupos amino e hidroxilo, la razón de composición es de 1:1, la razón de hidrólisis es de 1,4:8,6 y el radio de Stokes es de 3,1 nm o inferior;
(xlii)
m es desde 6 hasta 16, R^{3} se selecciona de grupos amino e hidroxilo, la razón de composición es de 1:1, la razón de hidrólisis es de 1,4:8,6 y el radio de Stokes es de 7,8 nm o inferior;
(xliii)
m es desde 6 hasta 16, R^{3} se selecciona de grupos amino e hidroxilo, la razón de composición es de 1:1, la razón de hidrólisis es de 1,4:8,6 y el radio de Stokes es de 6,2 nm o inferior; y
(xliv)
m es desde 6 hasta 16, R^{3} se selecciona de grupos amino e hidroxilo, la razón de composición es de 1:1, la razón de hidrólisis es de 1,4:8,6 y el radio de Stokes es de 4,7 nm o inferior.
\vskip1.000000\baselineskip
46. Copolímero o sal farmacológicamente aceptable del mismo que pueden obtenerse sometiendo uno o más restos de anhídrido carboxílico de fórmula (III) en un copolímero que contiene, como unidades constitucionales,
(a) una o más unidades estructurales que pueden ser iguales o diferentes entre sí y que se representan mediante la fórmula (I) a continuación:
\vskip1.000000\baselineskip
42 
\vskip1.000000\baselineskip
en la que:
m es un número entero de desde 3 hasta 100,
Alk representa un grupo alquileno que tiene desde 1 hasta 6 átomos de carbono, y
R^{1} y R^{2} son iguales o diferentes y cada uno representa un átomo de hidrógeno o un grupo alquilo que tiene desde 1 hasta 6 átomos de carbono que puede estar opcionalmente sustituido con al menos un sustituyente seleccionado del grupo que consiste en grupos hidroxilo, átomos de halógeno y grupos arilo que tienen desde 6 hasta 14 átomos de carbono que pueden estar opcionalmente sustituidos con desde 1 hasta 5 sustituyentes seleccionados de los sustituyentes A definidos a continuación, y
\newpage
(b) dicha unidad estructural que comprende un resto de anhídrido carboxílico de fórmula (III):
\vskip1.000000\baselineskip
43 
\vskip1.000000\baselineskip
a una o más reacciones seleccionadas del grupo que consiste en (i) hidrólisis, (ii) amonólisis, (iii) aminólisis y (iv) alcohólisis;
los sustituyentes A se seleccionan de grupos alquilo que tienen desde 1 hasta 6 átomos de carbono, grupos alcoxilo que tienen desde 1 hasta 6 átomos de carbono, átomos de halógeno, grupos hidroxilo, grupos nitro y grupos carboxilo.
47. Copolímero o sal farmacológicamente aceptable del mismo según la reivindicación 46, en los que la unidad estructural representada por la fórmula (I) y la unidad estructural representada por la fórmula (III) en el copolímero están dispuestas en una secuencia alternante de cabeza-cabeza, una secuencia alternante de cabeza-cola o una secuencia alternante mixta de cabeza-cabeza y cabeza-cola.
48. Copolímero o sal farmacológicamente aceptable del mismo según la reivindicación 46, en los que la unidad estructural representada por la fórmula (I) y la unidad estructural representada por la fórmula (III) en el copolímero están dispuestas en secuencia al azar.
49. Copolímero o sal farmacológicamente aceptable del mismo según una cualquiera de las reivindicaciones 46 a 48, en los que Alk es un grupo etileno o trimetileno.
50. Copolímero o sal farmacológicamente aceptable del mismo según la reivindicación 49, en los que Alk es un grupo etileno.
51. Copolímero o sal farmacológicamente aceptable del mismo según una cualquiera de las reivindicaciones 46 a 50, en los que m es un número entero de desde 3 hasta 50.
52. Copolímero o sal farmacológicamente aceptable del mismo según la reivindicación 51, en los que m es un número entero de desde 3 hasta 40.
53. Copolímero o sal farmacológicamente aceptable del mismo según la reivindicación 52, en los que m es un número entero de desde 6 hasta 16 o de 28 a 38.
54. Copolímero o sal farmacológicamente aceptable del mismo según la reivindicación 53, en los que m es un número entero de desde 6 hasta 16.
55. Copolímero o sal farmacológicamente aceptable del mismo según una cualquiera de las reivindicaciones 46 a 54, en los que R^{1} es un átomo de hidrógeno o un grupo metilo.
56. Copolímero o sal farmacológicamente aceptable del mismo según la reivindicación 55, en los que R^{1} es un átomo de hidrógeno.
57. Copolímero o sal farmacológicamente aceptable del mismo según una cualquiera de las reivindicaciones 46 a 56, en los que R^{2} es un átomo de hidrógeno o un grupo metilo.
58. Copolímero o sal farmacológicamente aceptable del mismo según la reivindicación 57, en los que R^{2} es un grupo metilo.
59. Copolímero o sal farmacológicamente aceptable del mismo según una cualquiera de las reivindicaciones 46 a 58, en los que la razón entre la unidad estructural representada por la fórmula (I) y la unidad estructural obtenida sometiendo una o más unidades estructurales de fórmula (III) a una o más reacciones seleccionadas del grupo que consiste en (i) hidrólisis, (ii) amonólisis, (iii) aminólisis y (iv) alcohólisis está en el intervalo de desde 10:1 hasta 1:10.
60. Copolímero o sal farmacológicamente aceptable del mismo según la reivindicación 59, en los que la razón entre la unidad estructural representada por la fórmula (I) y la unidad estructural obtenida sometiendo una o más unidades estructurales de fórmula (III) a una o más reacciones seleccionadas del grupo que consiste en (i) hidrólisis, (ii) amonólisis, (iii) aminólisis y (iv) alcohólisis está en el intervalo de desde 3:1 hasta 1:8.
61. Copolímero o sal farmacológicamente aceptable del mismo según la reivindicación 59, en los que la razón entre la unidad estructural representada por la fórmula (I) y la unidad estructural obtenida sometiendo una o más unidades estructurales de fórmula (III) a una o más reacciones seleccionadas del grupo que consiste en (i) hidrólisis, (ii) amonólisis, (iii) aminólisis y (iv) alcohólisis está en el intervalo de desde 2:1 hasta 1:2 o de 1:2 a 1:6.
62. Copolímero o sal farmacológicamente aceptable del mismo según la reivindicación 59, en los que la razón entre la unidad estructural representada por la fórmula (I) y la unidad estructural obtenida sometiendo una o más unidades estructurales de fórmula (III) a una o más reacciones seleccionadas del grupo que consiste en (i) hidrólisis, (ii) amonólisis, (iii) aminólisis y (iv) alcohólisis es de 1:1 o está en el intervalo de desde 1:2 hasta 1:4.
63. Copolímero o sal farmacológicamente aceptable del mismo según una cualquiera de las reivindicaciones 46 a 62, en los que el grado promedio de polimerización está en el intervalo de desde 5 hasta 200.
64. Copolímero o sal farmacológicamente aceptable del mismo según la reivindicación 63, en los que el grado promedio de polimerización está en el intervalo de desde 5 hasta 50.
65. Copolímero o sal farmacológicamente aceptable del mismo según la reivindicación 64, en los que el grado promedio de polimerización está en el intervalo de desde 5 hasta 20.
66. Copolímero o sal farmacológicamente aceptable del mismo según la reivindicación 63, en los que el grado promedio de polimerización está en el intervalo de desde 20 hasta 30.
67. Copolímero o sal farmacológicamente aceptable del mismo según la reivindicación 63, en los que el grado promedio de polimerización está en el intervalo de desde 30 hasta 40.
68. Copolímero o sal farmacológicamente aceptable del mismo según la reivindicación 46 en los que:
m es un número entero de desde 3 hasta 100,
Alk representa un grupo alquileno que tiene desde 1 hasta 6 átomos de carbono, y
R^{1} y R^{2} son iguales o diferentes y cada uno representa un átomo de hidrógeno o un grupo alquilo que tiene desde 1 hasta 6 átomos de carbono.
69. Copolímero o sal farmacológicamente aceptable del mismo según una cualquiera de las reivindicaciones 46 a 68, que puede obtenerse sometiendo un resto de anhídrido carboxílico de fórmula (III) en el copolímero a amonólisis.
70. Copolímero o sal farmacológicamente aceptable del mismo según la reivindicación 69, que puede obtenerse llevando a cabo la amonólisis con agua amoniacal.
71. Copolímero o sal farmacológicamente aceptable del mismo según una cualquiera de las reivindicaciones 46 a 68, que puede obtenerse sometiendo un resto de anhídrido carboxílico de fórmula (III) en el copolímero a aminólisis.
72. Copolímero o sal farmacológicamente aceptable del mismo según la reivindicación 71, que puede obtenerse llevando a cabo la aminólisis usando una disolución acuosa de dimetilamina.
73. Copolímero o sal farmacológicamente aceptable del mismo según una cualquiera de las reivindicaciones 46 a 68, que puede obtenerse sometiendo un resto de anhídrido carboxílico de fórmula (III) en el copolímero a alcohólisis.
74. Copolímero o sal farmacológicamente aceptable del mismo según la reivindicación 73, que puede obtenerse llevando a cabo la alcohólisis usando etanol.
75. Composición farmacéutica que comprende al menos un copolímero o una sal farmacológicamente aceptable del mismo según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 74, al menos una proteína o un análogo o una variante de la misma, y un vehículo o diluyente farmacéuticamente aceptable.
76. Composición farmacéutica según la reivindicación 75, en la que la proteína o un análogo o una variante de la misma es una proteína básica.
77. Composición farmacéutica según la reivindicación 76, en la que la proteína básica es un factor de crecimiento de fibroblastos básico (bFGF), un factor de crecimiento epidérmico (EGF), un factor inhibidor de la osteoclastogénesis (OCIF), un factor de crecimiento derivado de plaquetas (PDGF), un factor neurotrófico derivado de cerebro (BDNF), un factor de crecimiento nervioso (NGF), una hormona del crecimiento humana (HGH), un factor de crecimiento de hepatocitos (HGF), o un factor de crecimiento endotelial vascular (VEGF), o un análogo o variante de los mismos.
78. Composición farmacéutica según la reivindicación 76, en la que la proteína básica es un factor inhibidor de la osteoclastogénesis (OCIF) o un análogo o variante del mismo.
79. Composición farmacéutica según la reivindicación 78, en la que dicho OCIF o un análogo o variante del mismo es OCIF de tipo natural o de tipo recombinante.
80. Composición farmacéutica según la reivindicación 78, en la que dicho OCIF o un análogo o variante del mismo es un monómero o un dímero.
81. Composición farmacéutica según la reivindicación 78, en la que dicho OCIF es un monómero de OCIF humano que tiene un peso molecular tal como se mide mediante SDS-PAGE en condiciones no reductoras de aproximadamente 60000 o un dímero de OCIF humano que tiene un peso molecular de aproximadamente 120000 tal como se mide mediante SDS-PAGE en condiciones no reductoras.
82. Composición farmacéutica según la reivindicación 78, en la que dicho OCIF comprende los aminoácidos -21 a +380 de la SEQ. ID. NO.1 de la lista de secuencias.
83. Composición farmacéutica según la reivindicación 78, en la que dicho OCIF comprende los aminoácidos +1 a +380 de la SEQ. ID. NO.1 de la lista de secuencias.
84. Modificador que puede modificar una proteína o un análogo o una variante de la misma, comprendiendo dicho modificador el copolímero o una sal farmacológicamente aceptable del mismo según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 74.
85. Modificador que puede modificar una proteína o un análogo o una variante de la misma según la reivindicación 84, en el que la proteína es una proteína básica.
86. Modificador que puede modificar una proteína o un análogo o una variante de la misma según la reivindicación 85, en el que la proteína básica es un factor de crecimiento de fibroblastos básico (bFGF), un factor de crecimiento epidérmico (EGF), un factor inhibidor de la osteoclastogénesis (OCIF), un factor de crecimiento derivado de plaquetas (PDGF), un factor neurotrófico derivado de cerebro (BDNF), un factor de crecimiento nervioso (NGF), una hormona del crecimiento humana (HGH), un factor de crecimiento de hepatocitos (HGF), o un factor de crecimiento endotelial vascular (VEGF), o un análogo o variante de los mismos.
87. Modificador que puede modificar una proteína o un análogo o una variante de la misma según la reivindicación 85, en el que la proteína básica es un factor inhibidor de la osteoclastogénesis (OCIF) o un análogo o variante del mismo.
88. Modificador que puede modificar una proteína o un análogo o una variante de la misma según la reivindicación 87, en el que dicho OCIF o un análogo o variante del mismo es OCIF de tipo natural o de tipo recombinante.
89. Modificador que puede modificar una proteína o un análogo o una variante de la misma según la reivindicación 87, en el que dicho OCIF o un análogo o variante del mismo es un monómero o un dímero.
90. Modificador que puede modificar una proteína o un análogo o una variante de la misma según la reivindicación 87, en el que dicho OCIF es un monómero de OCIF humano que tiene un peso molecular tal como se mide mediante SDS-PAGE en condiciones no reductoras de aproximadamente 60000 o un dímero de OCIF humano que tiene un peso molecular de aproximadamente 120000 tal como se mide mediante SDS-PAGE en condiciones no reductoras.
91. Modificador que puede modificar una proteína o un análogo o una variante de la misma según la reivindicación 87, en el que dicho OCIF comprende los aminoácidos -21 a +380 de la SEQ. ID. NO.1 de la lista de secuencias.
92. Modificador que puede modificar una proteína o un análogo o una variante de la misma según la reivindicación 87, en el que dicho OCIF comprende los aminoácidos +1 a +380 de la SEQ. ID. NO.1 de la lista de secuencias.
93. Complejo que comprende al menos una proteína o un análogo o una variante de la misma que está unido a al menos un copolímero o una sal farmacológicamente aceptable del mismo según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 74.
94. Complejo según la reivindicación 93, en el que la proteína es una proteína básica.
95. Complejo según la reivindicación 94, en el que la proteína básica es un factor de crecimiento de fibroblastos básico (bFGF), un factor de crecimiento epidérmico (EGF), un factor inhibidor de la osteoclastogénesis (OCIF), un factor de crecimiento derivado de plaquetas (PDGF), un factor neurotrófico derivado de cerebro (BDNF), un factor de crecimiento nervioso (NGF), una hormona del crecimiento humana (HGH), un factor de crecimiento de hepatocitos (HGF), o un factor de crecimiento endotelial vascular (VEGF), o un análogo o variante de los mismos.
96. Complejo según la reivindicación 94, en el que la proteína básica es un factor inhibidor de la osteoclastogénesis (OCIF) o un análogo o variante del mismo.
\newpage
97. Complejo según la reivindicación 96, en el que dicho OCIF o un análogo o variante del mismo es OCIF de tipo natural o de tipo recombinante.
98. Complejo según la reivindicación 96, en el que dicho OCIF o un análogo o variante del mismo es un monómero o un dímero.
99. Complejo según la reivindicación 96, en el que dicho OCIF es un monómero de OCIF humano que tiene un peso molecular tal como se mide mediante SDS-PAGE en condiciones no reductoras de aproximadamente 60000 o un dímero de OCIF humano que tiene un peso molecular de aproximadamente 120000 tal como se mide mediante SDS-PAGE en condiciones no reductoras.
100. Complejo según la reivindicación 96, en el que dicho OCIF comprende los aminoácidos -21 a +380 de la SEQ. ID. NO.1 de la lista de secuencias.
101. Complejo según la reivindicación 96, en el que dicho OCIF comprende los aminoácidos +1 a +380 de la SEQ. ID. NO.1 de la lista de secuencias.
102. Composición farmacéutica que comprende una cantidad eficaz de un agente farmacológicamente activo junto con un vehículo o diluyente del mismo, en la que dicho agente farmacológicamente activo está en forma de complejo según una cualquiera de las reivindicaciones 93 a 101.
103. Método para prolongar el tiempo que una proteína o un análogo o una variante de la misma se retiene en la circulación sanguínea tras la administración a un paciente complejando dicha proteína o un análogo o una variante de la misma con al menos un copolímero o una sal farmacológicamente aceptable del mismo según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 74.
104. Método según la reivindicación 103, en el que la proteína es una proteína básica.
105. Método según la reivindicación 104, en el que la proteína básica es un factor de crecimiento de fibroblastos básico (bFGF), un factor de crecimiento epidérmico (EGF), un factor inhibidor de la osteoclastogénesis (OCIF), un factor de crecimiento derivado de plaquetas (PDGF), un factor neurotrófico derivado de cerebro (BDNF), un factor de crecimiento nervioso (NGF), una hormona del crecimiento humana (HGH), un factor de crecimiento de hepatocitos (HGF), o un factor de crecimiento endotelial vascular (VEGF), o un análogo o variante de los mismos.
106. Método según la reivindicación 104, en el que la proteína básica es un factor inhibidor de la osteoclastogénesis (OCIF) o un análogo o variante del mismo.
107. Método según la reivindicación 106, en el que dicho OCIF o un análogo o variante del mismo es OCIF de tipo natural o de tipo recombinante.
108. Método según la reivindicación 106, en el que dicho OCIF o un análogo o variante del mismo es un monómero o un dímero.
109. Método según la reivindicación 106, en el que dicho OCIF es un monómero de OCIF humano que tiene un peso molecular tal como se mide mediante SDS-PAGE en condiciones no reductoras de aproximadamente 60000 o un dímero de OCIF humano que tiene un peso molecular de aproximadamente 120000 tal como se mide mediante SDS-PAGE en condiciones no reductoras.
110. Método según la reivindicación 106, en el que dicho OCIF comprende los aminoácidos -21 a +380 de la SEQ. ID. NO.1 de la lista de secuencias.
111. Método según la reivindicación 106, en el que dicho OCIF comprende los aminoácidos +1 a +380 de la SEQ. ID. NO.1 de la lista de secuencias.
112. Uso del complejo que comprende una proteína o un análogo o una variante de la misma que está unido a al menos un copolímero o una sal farmacológicamente aceptable del mismo según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 74 en la fabricación de un medicamento para la profilaxis o el tratamiento de una enfermedad susceptible a dicha proteína o un análogo o una variante de la misma.
113. Uso según la reivindicación 112, en el que la proteína es una proteína básica.
114. Uso según la reivindicación 113, en el que la proteína básica es un factor de crecimiento de fibroblastos básico (bFGF), un factor de crecimiento epidérmico (EGF), un factor inhibidor de la osteoclastogénesis (OCIF), un factor de crecimiento derivado de plaquetas (PDGF), un factor neurotrófico derivado de cerebro (BDNF), un factor de crecimiento nervioso (NGF), una hormona del crecimiento humana (HGH), un factor de crecimiento de hepatocitos (HGF), o un factor de crecimiento endotelial vascular (VEGF), o un análogo o variante de los mismos.
\newpage
115. Uso según la reivindicación 113, en el que la proteína básica es un factor inhibidor de la osteoclastogénesis (OCIF) o un análogo o variante del mismo.
116. Uso según la reivindicación 115, en el que dicho OCIF o un análogo o variante del mismo es OCIF de tipo natural o de tipo recombinante.
117. Uso según la reivindicación 115, en el que dicho OCIF o un análogo o variante del mismo es un monómero o un dímero.
118. Uso según la reivindicación 115, en el que dicho OCIF es un monómero de OCIF humano que tiene un peso molecular tal como se mide mediante SDS-PAGE en condiciones no reductoras de aproximadamente 60000 o un dímero de OCIF humano que tiene un peso molecular de aproximadamente 120000 tal como se mide mediante SDS-PAGE en condiciones no reductoras.
119. Uso según la reivindicación 115, en el que dicho OCIF comprende los aminoácidos -21 a +380 de la SEQ. ID. NO.1 de la lista de secuencias.
120. Uso según la reivindicación 115, en el que dicho OCIF comprende los aminoácidos +1 a +380 de la SEQ. ID. NO.1 de la lista de secuencias.
121. Uso según una cualquiera de las reivindicaciones 115 a 120, en el que dicha enfermedad es una enfermedad metabólica ósea.
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