ES2302337T3 - Extracto de celulas tumorales modificadas con hapteno y procedimientos para tratar cancer. - Google Patents

Abstract

SE REVELA UNA NOVEDOSA COMPOSICION QUE CONSTA DE UN HAPTENO MODIFICADO DE EXTRACTO DE CELULAS TUMORALES PREPARADO A PARTIR DE CELULAS CANCEROSAS, O DE MEMBRANAS DE CELULAS CANCEROSAS O DE PEPTIDOS OBTENIDOS DE ELLAS. TAMBIEN SE REVELAN UNOS METODOS DE TRATAMIENTO DEL CANCER QUE CONSISTEN EN LA ADMINISTRACION DE CANTIDADES TERAPEUTICAMENTE EFICACES DE CICLOFOSFAMIDA Y HAPTENO MODIFICADO DE EXTRACTO DE CELULAS TUMORALES, CON O SIN ADYUVANTES Y CITOCINAS. TAMBIEN SE REVELA UN METODO DE DETECCION DE LA PRODUCCION DE CITOCINA EN TUMORES A FIN DE DETERMINAR LA EFICACIA DEL TRATAMIENTO, EN DONDE SE AMPLIFICAN ACIDOS NUCLEICOS ESPECIFICOS DE LAS CITOCINAS A PARTIR DE UNA MUESTRA DE TEJIDO DEL ENFERMO, CON EL FIN DE CONSEGUIR UNA SEÑAL DETECTABLE.

Description

Extracto de células tumorales modificadas con hapteno y procedimientos para tratar cáncer.

Antecedentes de la invención

Se propuso en los años 60 que las células tumorales portan antígenos específicos (TSA) que no están presentes en las células normales y que la respuesta inmune a estos antígenos puede hacer posible que un individuo rechace un tumor. Posteriormente se sugirió que la respuesta inmune a TSA podría ser aumentada introduciendo nuevos determinantes inmunológicos en las células. Mitchison, Transplant. Proc., 1970, 2, 92. Este "determinante helper", que puede ser un hapteno, una proteína, un antígeno de capa viral, un antígeno de transplante o un antígeno de célula xenógena, podría ser introducido en una población de células tumorales. Las células serían seguidamente inyectadas en un individuo que se espera que tolerara el crecimiento de células tumorales sin modificar. Clínicamente la esperanza era que se produjera una reacción inmunológica contra los determinantes helper, como consecuencia de lo cual sería aumentada la reacción del TSA acompañante, y las células tumorales, que de lo contrario serían toleradas, son destruidas. Mitchison, supra, sugiere también varios modos de acción de los determinantes helper que incluyen 1) que las células sin modificar son meramente atenuadas, en el sentido de que su velocidad de crecimiento es ralentizada o su susceptibilidad al ataque inmunológico es aumentada; 2) que los determinantes helper proporcionan meramente puntos de ataque y, por tanto, hacen posible que las células modificadas sean destruidas por una respuesta inmune no dirigida contra TSA; 3) que los determinantes helper tienen un adyuvante ah, con una acción tal como la unión a un anticuerpo o el favorecimiento de la localización de las células en la parte derecha del cuerpo para la inmunización, en particular, en nódulos linfáticos.

Fujiwara et al., en la publicación J. Immunol., 1984a, 132, 1571 mostraron que las células tumorales conjugadas con el hapteno, trinitrofenilo (TNP), podrían inducir una inmunidad sistémica contra células tumorales sin modificar en un sistema de múridos, con la condición de que los ratones fueran sensibilizados primero al hapteno en ausencia de células T supresoras específicas para hapteno. Las células de bazo de los ratones tratados redimieron de formas completa y específica el crecimiento de tumores en animales receptores in tratar. Flood et al., J. Immunol., 1987, 138, 3573 mostraron que los ratones inmunizados con un tumor "regresor" inducido por luz ultravioleta, conjugado a TNP, eran capaces de rechazar el tumor "progresor" conjugado a TNP que de lo contrario era no inmunógeno. Además de ello, estos ratones fueron posteriormente resistentes a una estimulación con un tumor "progresor" no conjugado. En otro sistema experimental, Fujiwara et al., J. Immunol., 1984b, 133, 510 demostraron que los ratones sensibilizados al trinitroclorobenceno (TNCB) después de un tratamiento previo con ciclofosfamida podían ser curados de tumores grandes (10 mm) mediante haptenización in situ de células tumorales; posteriormente estos animales fueron específicamente resistentes a una estimulación con células tumorales no conjugadas.

La existencia de células T que experimentan una reacción cruzada con tejidos no modificados ha sido recientemente demostrada. Weltzien y colaboradores han mostrado que clones de células T restringidos con MHC de clase I generados a partir de ratones inmunizados con linfocitos singenésicos modificados con TNP responden a "auto" péptidos modificados con TNP asociados a MHC. Ortmann, B., et al., J. Immunol., 1992, 148, 1445. Además, se ha establecido que la inmunización de ratones con linfocitos modificados con TNP da lugar al desarrollo de células T esplénicas que exhiben respuestas proliferativas y citotóxicas secundarias a células modificadas con TNP in vitro Shearer, G. M. Eur. J. Immunol., 1974, 4, 527. La capacidad potencial de linfocitos surgidos mediante inmunización con células autólogas modificadas con DNP o TNP para responder a células autólogas sin modificar es de considerable interés porque puede ser relevante para dos problemas clínicos: 1) enfermedad autoinmune inducida por fármacos y 2) inmunoterapia del cáncer. Con respecto a lo primero, se ha sugerido que los fármacos ingeridos actúan como haptenos, que se combinan con la proteína de tejidos normales formando complejos inmunógenos que son reconocidos por las células T. Tsutsui, H., et al., J. Immunol., 1992, 149, 706. Posteriormente, la enfermedad autoinmune, por ejemplo, lupus sistémico eritematoso, se puede desarrollar y continuar incluso después de la retirada o ausencia del fármaco agresor. Esto implicaría la generación eventual de linfocitos T que experimentan una reacción cruzada con tejidos sin modificar.

Otros han mostrado que las membranas o péptidos de las células, y en un caso un péptido de un virus, puede provocar una respuesta de linfocitos de células T in vitro. Heike, M., et al., J Immunotherapy, 1994 15:165-174, describen un procedimiento para estimular linfocitos T citotóxicos (CTL) antitumorales de ratón y humanos con preparaciones de membranas de plasma. Esta referencia identifica diferencias entre los informes de respuestas de CTL y asocia estas diferencias con las diferencias de inmunogenicidad de los tumores usados y el modo de inmunización, por ejemplo.

Otros informan que el reconocimiento de las células de melanoma humanos por células T citotóxicas es mediado por cierto número de péptidos Slingluff, C., et al., J Immunology 1993150:2955-2963; Wofel, T., et al., Int. J. Cancer 1994 57:413-418; y Castelli, C., et al., J. Exp. Med. 1995181:363-368. Cada una de estas referencia indica que hay un cierto número epitopos definidos por células T que son únicos para un tumor dado. Ninguna de estas referencias describe un extracto de células tumorales que se obtenga mediante modificación con hapteno de una célula tumoral.

El denominador común de estos experimentos es la sensibilización con hapteno en un medio en el que no son inducidas células supresoras. Las células de bazo a partir de ratones sensibilizados con TNCB previamente tratados ciclofosfamida exhibieron una "función helper amplificada" radio-resistente, es decir, aumentaron específicamente la generación in vitro de la citotoxicidad anti-TNP. Además de ello, una vez que estas helpers amplificadas habían sido activadas mediante una exposición in vitro a linfocitos autólogos conjugados a TLP, fueron capaces de aumentar la citotoxicidad a antígenos no relacionados también, incluidos antígenos tumorales (Fujiwara et al., 1984b). Flood et al., (1987), supra, mostraron que esta actividad de helper amplificada estaba mediada por células T con el fenotipo Lyt1^{+}, Lyt2^{+}, L3T4^{+}, I^{-}J^{+} y sugiere que estas células eran células contrasupresoras, una nueva clase de célula T inmuno-reguladora.

La inmunoterapia de pacientes con melanoma ha mostrado que la administración de ciclofosfamida a una dosis elevada (1000 mg/M^{2}) o una dosis baja (300 mg/M^{2}) tres días antes de la sensibilización con la hemocianina de lapa de antígeno primario aumenta la adquisición de la hipersensibilidad de tipo retrasado a ese antígeno (Berd et al., Cáncer Res., 1982, 42, 4862; Cancer Res., 1984a, 44, 1275). El pretratamiento con ciclofosfamida a una dosis baja permite que los pacientes con melanoma metastático desarrollen una hipersensibilidad de tipo retrasado a células de melanoma autólogas en respuesta a una inyección con una vacuna de melanoma autóloga (Berd et al., Cáncer Res., 1986, 46, 2572). La combinación de ciclofosfamida de dosis baja y vacuna puede producir una regresión clínicamente importante del tumor metastático (Berd et al. (1986), supra; Cancer Invest., 1988a, 6, 335). La administración de ciclofosfamida da lugar a una reducción de la función supresora T no específica de linfocitos de sangre periférica (Berd et al., Cancer Res., 1984b, 44, 5439; Cancer Res., 1987, 47, 3317), posiblemente agotado células T inductoras supresoras CD4+, CD45RA+ (Berd et al., Cancer Res., 1988b, 48, 1671). Los efectos anti-tumorales de este régimen de inmunoterapia parece que están limitados por el intervalo excesivamente largo entre el inicio de la administración de la vacuna y el desarrollo de hipersensibilidad de tipo retrasado a células tumorales (Berd et al., Proc. Amer. Assoc. Cancer Res., 1988c, 29, 408(nº 1626)). Por lo tanto, continúa habiendo una necesidad de aumentar la eficacia terapéutica de esta vacuna para hacerla más inmunógena.

La mayoría de los inmunologistas tumorales coinciden actualmente en que los linfocitos T, glóbulos blancos responsables de la inmunidad tumoral, cuya infiltración en la masa tumoral es un requisito previó para la destrucción del tumor por el sistema inmune. Consecuentemente, se ha enfocado una considerable atención sobre lo que ha resultado conocido como terapia "TIL", que fue puesta en marcha Dr. Stephen Rosenberg en NCI. Dr. Stephen Rosenberg y otros han extirpado de metástasis de cáncer humano los pocos linfocitos T que están presentes de forma natural y expandieron grandemente sus número cultivándolos in vitro con interleucina 2 (IL2), un factor de crecimiento para linfocitos T. Topalian et al., J. Clin. Oncol., 1988, 6, 839. Sin embargo, está terapia no ha sido muy eficaz porque las células T inyectadas están limitadas en su capacidad para "albergarse" en el sitio del tumor.

La capacidad de las concentraciones elevadas de IL2 para inducir linfocitos que se conviertan en células asesinas no específicamente citotóxicas ha sido terapéuticamente explotada en un cierto número de estudios (Lotze et al., J. Biol. Response, 1982, 3, 475; West et al., New Engl. J. Med., 1987, 316, 898). Sin embargo esta aproximación ha estado limitada por la toxicidad grave de una dosis elevada de IL2 intravenosa. Se ha prestado menos atención a la observación de que las concentraciones mucho más bajas de IL2 pueden actuar como un adyuvante inmunológico induciendo la expansión de células T activadas por antígenos (Talmadge et al., Cáncer Res., 1987, 47, 5725; Meuer et al., Lancet, 1989, 1, 15). Por lo tanto, continúa habiendo una necesidad de comprender e intentar explotar el uso de IL2 como un adyuvante inmunológico.

Los melanomas humanos se cree que expresan antígenos de superficies únicas reconocibles por linfocitos T. Old, L. J., Cáncer Res., 1981, 41, 361; Van der Bruggen, P., et al., Science, 1991, 254, 1643; Mukherji, B., et al., J. Immunol., 1986, 136, 1888; y Anichini, A., et al., J. Immunol., 1989, 142, 3692. Sin embargo, las aproximaciones inmunoterapéuticas hasta la fecha han estado limitadas por la dificultad de inducir una respuesta eficaz medida por células T a estos antígenos in vivo.

Hay varios modelos propuestos para explicar lo que parece ser una tolerancia a antígenos asociados a tumores humanos. Estos incluyen:

1) Células supresoras específicas para antígenos tumorales que infra-regulaban respuestas anti-tumorales incipientes. Mukherji, et al., supra; Berendt, M. J. and R. J. North., J. Exp. Med., 1980, 151, 69.

2) Fallo de las células tumorales humanas para provocar células helper T o para proporcionar señales estimuladoras para esas células T. Fearon, E. R., et al., Cell, 1990, 60, 397; Townsend, S. E. y J. P. Allison, Science, 1993, 259, 368; y

3) Expresión superficial reducida de productos principales de histocompatibilidad sobre células tumorales que limita su reconocimiento por células T. Ruiter, D. J., Seminars in Cáncer Biology, 1991, 2, 35. Ninguna de estas hipótesis ha sido corroborada hasta ahora en un sistema clínico.

El objetivo de una inmunoterapia activa para tumores es el desarrollo de una inmunidad específica para tumor mediada por células T sistémicamente productivas. La inmunidad específica para tumores actuaría tanto en el sitio principal del tumor como en la desaparición de pequeños focos metastáticos en sitios distantes. La generación de inmunidad de células T se ha mostrado que es una respuesta altamente regulada que requiere la interacción célula-célula y la producción de un cierto número de citoquinas. De estas ultimas, unos estudios en un cierto número de sistemas humanos y de múridos han mostrado que las respuestas de células T pueden ser separadas en dos categorías denominas tipo I y II (Mossman, et al., J. Immunol. 1986 136:2348). Las respuestas de tipo I son necesarias para el desarrollo de hipersensibilidad de tipo retrasado (DTH), están asociadas con la activación de macrófagos y la producción de interceron-gamma ((IFN\gamma), y se ha mostrado que están asociadas con la resolución de la lepra humana (Yamamura, M., et al., Science 1991 254:277279) y la leishmaniasis de múridos (Scott, P., et al., Immunological Review 1989 112:161-182). Las respuestas de tipo II están asociadas con la producción IL4 e IL10, principalmente respuestas de anticuerpos de soporte, y están asociadas con las formas progresivas de lepra (Yamamura, M., et al., supra) y leishmaniasis (Yamamu-a et al., supra; and Scott, P., et al., supra.) además del desarrollo de DTH, las respuestas de tipo I se espera que aumenten la generación de CTL específicas para tumores a través de la sobre-regulación de MHC y antígenos asociados a tumores, así como la presentación de antígenos aumentados secundarios a la producción de IFN\gamma localizada. Más recientemente, las respuestas de tipo I y II se ha mostrado que son de regulación cruzada: el IFN\gamma inhibe las respuestas de tipo II, mientras que IL4 y IL10 inhiben el tipo I (Scott, J. Immunol. 1991 147:3149-3155; y Fiorentino et al., J. Immunol. 1991146:3444-3451). En el sistema de leishmania, la modulación de citoquinas en el sitio de la lesión permite la conversión de una respuesta de tipo II en una tipo I y, consecuentemente, un cambio de la infección progresiva hasta la erradicación de la enfermedad (Scott, 1991,
supra).

Pisa et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 1992 89:7708-7712 detectaron mRNA de IL10 en biopsias de IL10 en biopsias de carcinomas de ovarios, pero no en líneas celulares de carcinoma de ovarios; llegaron a la conclusión de que la fuente de IL10 eran linfocitos infiltrados en los tumores. Gastl et al, Int. J. Cáncer 1991 55:96-101 encontraron que 16/48 líneas celulares tumorales liberaban IL10 en la materia sobrenadante del cultivo. Solamente 3/8 líneas celulares de melanomas eran positivas. Finalmente, Chen et al., Int. J. Cáncer, 1994 56:755-760 informaron recientemente que 6/9 líneas celulares derivadas de melanomas metastáticos expresaban mRNA de IL10. Sin embargo, la presente invención es la primera información conocida por los inventores de mRNA para IL10 en biopsias de melanoma metastático.

No es conocido si estas observaciones son aplicables a la relación tumor humano-hospedante, es decir, si el modelo de producción de citoquinas por células T infiltradas en tumores es un indicador de la eficacia de la respuesta inmune. Los pacientes con melanoma metastático tratados con una vacuna autóloga modificada con DNP desarrollaron respuestas inflamatorias en los sitios de los tumores, Berd et al., 1991, supra. El uso de células tumorales autólogas modificadas con hapteno en el tratamiento de melanomas es conocido (documento US-A-5290551, Berd et al., Proceedings of the Annual Meeting of the Am. Assoc for Cancer Res., Vol. 35, 1994, páginas 667-668, y Ann. New York Acad. Sci., Vol. 690, 1993 páginas 147-152). Histológicamente, estas lesiones inflamadas se caracterizan por la infiltración de células T que está a veces asociada con la destrucción de células tumorales. La presente invención encuentra que los tumores de pacientes tratados con vacunas de DNP contienen linfocitos T de tipo I, que no son detectables en tumores extirpados antes de la administración de la vacuna.

Sumario de la invención

La presente invención se refiere a composiciones para el tratamiento de cáncer y se describen en la presente memoria descriptiva procedimientos para tratar el cáncer. Las composiciones de la presente invención comprenden una cantidad terapéuticamente eficaz de un extracto de células tumorales modificadas con hapteno, en las que dicha composición estimula los linfocitos de células T y es útil para el tratamiento del cáncer, y en el que dicho extracto de células tumorales es una membrana de célula cancerígena modificada con hapteno o una célula que presenta antígenos con una membrana de célula cancerígena modificada con hapteno unida a la misma.

Breve descripción de las figuras

Las figuras que no se refieren específicamente a la invención reivindicada son incluidas solamente para ilustración.

La Figura 1 expone la cinética del desarrollo de DTH a PBL autóloga modificada con DNP y células de melanoma. Los pacientes con melanoma metastático tratados con una vacuna de DNP fueron sometidos a ensayos en serie de la piel con PBL modificada con DNP (LY) o células de melanoma modificadas con DNP disociadas de una masa metastática (MEL). Cada barra indica la respuesta medida de DTH para el grupo de pacientes en cada valor del tiempo; barras de errores = error típico. Para el día 119, solo se midieron las respuestas a PBL. Tamaños de las muestras: días 0, 14, 63 N = 84; día 119, N = 57; día 175, N = 42; día 231, N = 35.

La Figura 2 exhibe la respuesta de anticuerpos a DNP. El suero obtenido para diversos valores del tiempo fue ensayado en cuanto anticuerpo (inmunoglobulina total) para DNP usando un ensayo ELISA. El título fue definido como pico OD de muestra) x (recíproco de la dilución que proporcionó una OD igual a la mitad del pico OD del testigo positivo).

La Figura 3 es un gráfico de la respuesta proliferativa de PBL a linfocitos autólogos modificados con DNP. Las PBL fueron obtenidas a partir de cuatro pacientes que recibieron vacuna de DNP en el pico de sus respuestas a DTH. Las células fueron ensayadas en cuanto a la capacidad de proliferar a PBL autóloga modificada con DNP (LY-DNP autol) con PBL autólogas sin modificar (LY autol) como testigo. Los cultivos fueron impulsados con ^{125}IUDR en el día 6.

La Figura 4 muestra la cinética de la respuesta proliferativa para linfocitos modificados con DNP. Las PBL fueron recogidas en serie de paciente DM2 mientras recibía una vacuna de DNP. Fueron crioconservados y seguidamente todas las muestras fueron ensayadas simultáneamente en cuanto a la respuesta proliferativa a PBL (autóloga modificada con DNP (autol LY-DNP). Los cultivos fueron impulsados con ^{125}IUDR en el día 6.

La Figura 5 muestra la especifidad de la respuesta proliferativa para células modificadas con DNP. Las PBL de dos pacientes fueron ensayadas en cuanto a la respuesta proliferativa a PBL autóloga, sin modificar (autol LY), modificada con DNP (autol LY-DNP) o modificada con TNP (autol Ly-TNP) y las células de melanoma autólogas cultivadas, sin modificar (MEL) o modificadas con DNP (MELDNP). Los cultivos fueron impulsados con ^{125}IUDR en el día 6.

La Figura 6 es un análisis de especicidad de células T expandidas. Las PBL del paciente DM2 fueron expandidas IL2 y repetidamente estimuladas con células linfloblastoides 8 modificadas con DNP. Fueron ensayadas en cuanto a la respuesta proliferativa a PBL autóloga, sin modificar (autol LY), modificadas con DNP (autol LY-DNP) o modificadas con TNP (autol LY-TNP); las células de melanoma autólogas cultivadas, sin modificar (MEL) o modificadas con DNP (MELDNP) y PBL alogénicas (alo LY). Cultivos fueron impulsados con ^{125}IUDR en el día 6.

La Figura 7 muestra las respuestas de células CD8+ y CD4+ a células autólogas modificadas con DNP. Las células T expandidas fueron separadas en poblaciones enriquecidas en CD8 o enriquecidas en CD4 mediante fijación positiva. Seguidamente fueron ensayadas en cuento a una respuesta proliferativa a PBL sin modificar (autol LY), modificadas con DNP (autol LY-DNP) y a las células de melanoma autólogas cultivadas, sin modificar (MEL) o modificadas con DNP (MELDNP). Los cultivos fueron impulsados con ^{125}IUDR en el día 6.

La Figura 8 muestra la producción de citoquinas por células T reactivas con DNP. La línea de células T reactivas con DNP ("parental") y tres subcultivos (2F8, 1D7, 1C2), obtenidas disponiendo en placas a una dilución limitantes, fueron incubadas con células linfoblastoides 8 modificadas con DNP autólogas durante 18 horas; las materia sobrenadantes se recogieron y se ensayaron en cuanto a gamma-interferón (IFN) y IL4.

La Figura 9 muestra el bloqueo de la respuesta de células T por anticuerpo monoclonal de clase I anti-MHC. Las células T CD8+ expandidas fueron estimuladas con células linfoblastoides B modificadas con DNP y los cultivos fueron ensayados en cuanto a gamma-interferón después de 18 horas. Las células estimuladoras fueron pre-incubadas con uno de los siguientes: sin anticuerpo (ninguno), IgG (de ratón no específico), anticuerpo monoclonal W6/32 (clase I), o anticuerpo monoclonal L243 (clase II).

La Figura 10 exhibe la restricción de MHC de la respuesta de células T. Las células T CD8+ expandidas (HLA-AI, A2, B8, Bw6) fueron ensayadas en cuanto a la capacidad de proliferar en respuesta a PBL autólogas modificadas con DNP y PBL alogénicas modificadas con DNP a partir de otros cuatro pacientes. Tres de los estimuladores alogénicos se hicieron coincidir en uno o más lugares de clase I como se muestra, y el cuarto era completamente desadaptado (A24, A26, B44, B63). Los cultivos fueron impulsados con ^{125}IUDR en el día 6.

La Figura 11 muestra gráficos de la citotoxicidad de células T reactivas con DNP. Se usaron células de melanoma, autólogas, (autol) o alogénicas de clase I desadaptada (alo) como dianas en un ensayo con ^{51}Cr de 6 horas. Las células efectoras fueron células T reactivas con DNP CD8+ expandidas. Figura 11A - las células dianas fueron haptenizadas con diversas concentraciones de DNBS o TNBS. La relación de células efectoras:dianas era 20:1. Figura 11B - células dianas haptenizadas con 2,5 mg/ml de DNBS o TNBS fueron mezcladas con células efectoras a una serie de relaciones de efectoras:dianas (E:T).

La Figura 12 muestra un gráfico del porcentaje de pacientes exentos de tumores en los meses que siguieron a una cirugía, tratados con una vacuna de DNP y una vacuna testigo no haptenizada.

La Figura 13 muestra las fracciones de HPLC que fueron reunidas en cinco grupos de diez fracciones cada uno. Los péptidos derivados de células de melanoma modificadas con dinitrofenilo (DNP-MEL) o células B modificadas con dinitrofenilo (DNP-LY) fueron estimuladoras en la agrupación 2.

La Figura 14 muestra un nódulo de melanoma subcutáneo inflamado de un paciente inmunizado con vacuna de DNP que expresa mRNA para IFN\gamma y IL10. La Figura 14-1 muestra mRNA de citoquinas determinado mediante RT-PCR (columna 1 = marcador de tamaño; 2 = \beta-actina; 3 = IFN\gamma, 4 = IL4; 5 =IL10); La Figura 14-2 es una sección teñida H&E de la lesión subcutánea (400X).

La Figura 15 exhibe una metástasis de nódulo linfático de un paciente sin inmunizar que expresa mRNA para IL10 pero no IFN\gamma. La Figura 15-1 muestra mRNA de citoquinas determinado mediante RT-PCR (columna 1 = marcador de tamaño; 2 = \beta-actin; 3 = IFN\gamma; 4 = IL4; 5 =IL10); La Figura 15-2 es una sección teñida H&E de la metástasis de nódulo linfático (400X).

La Figura 16 es un gel de mRNA de IL10 expresado en metástasis de melanoma humano. mRNA para las citoquinas se determinó mediante RT-PCR (columna 1 = marcador de tamaños; C = testigo de cDNA de IL10; 1-7 = muestra de pacientes).

La Figura 17 es un gel mRNA de IL10 expresado por las células de melanoma. La Figura 17 muestra la expresión de mRNA de IL10 mediante RT-PCR a partir de una biopsia tumoral representativa y la línea celular derivada (columna 1 = marcador de tamaños; 2 = cDNA de IL10; 3 = biopsia tumoral; 4 = línea tumoral).

La Figura 18 es una RT-PCR in situ de una sección en parafina de una biopsia de melanoma no inflamado (A=100x, B=400x).

Descripción detallada de la invención

La presente invención se refiere a la inmunoterapia del cáncer. La invención proporciona composiciones como se definen en las reivindicaciones.

La presente invención se refiere al tratamiento del cáncer incluidos cánceres metastáticos y primarios. Los cánceres tratables con las composiciones de la presente invención incluyen los siguientes ejemplos no limitativos: melanoma, mamas, pulmón, colón, mamas, riñón y próstata. Los mamíferos, particularmente seres humanos, que tienen un cáncer metastático, pueden ser tratados con las composiciones de la presente invención.

Las composiciones de la presente invención se preparan a partir de un extracto de células tumorales. Una célula tumoral puede ser una célula maligna o pre-maligna de cualquier tipo de cáncer. De acuerdo con la presente invención, pre-maligna se refiere a cualquier célula anormal sugestiva de una célula cancerígena, que no es todavía una célula cancerígena como, y sin limitación, los cambios displásticos en células cervicales que finalmente conducen a un cáncer cervical y los nervios displásticos que son células anormales de la piel que conducen a un melanoma. Los extractos de células tumorales son originarios preferentemente del tipo de cáncer que va a ser tratado. Los extractos de células tumorales pueden ser, pero sin limitación, extractos de células autólogas y alogénicas disociadas de muestras de biopsias o cultivos de tejidos, así como células troncales.

Preferentemente, los extractos celulares son autólogos. Los extractos de células tumorales de la presente invención pueden contener una membrana celular aislada de una célula cancerígena modificada con hapteno.

Para los fines de la presente descripción, los péptidos son compuestos de dos o más aminoácidos e incluyen las proteínas. Los péptidos serán preferentemente debajo peso molecular de aproximadamente 1.000 kD a aproximadamente 10.000 kD, más preferentemente de aproximadamente 1.000 a aproximadamente 5.000, que son aislados de una célula tumoral haptenizada y que estimulan los linfocitos de células T para producir gamma-interferón. Las células T son linfocitos que median dos tipos de funciones inmunológicas, efectora y reguladora, secretan proteínas (linfoquinas) y destruyen otras células (citotoxicidad). Las funciones efectoras incluyen la reactividad como una hipersensibilidad retrasada, rechazo de aloinjertos, inmunidad tumoral y reactividad de injerto frente a hospedante. La producción de linfoquinas y la citotoxicidad es demostrada por las funciones efectoras de las células T. Las funciones reguladoras de las células T están presentadas por su capacidad para amplificar la citotoxicidad mediada por células mediante otras células T y la producción de inmunoglobulina por células de B. Las funciones reguladoras requieren también la producción de linfoquinas. Las células T producen gamma-interferón (IFN-\gamma) en respuesta a un estímulo inductor que incluye, sin limitación, mitogenes, antígenos o lectinas. El péptido puede tener preferentemente de aproximadamente 8 a aproximadamente 20 aminoácidos, además el péptido está preferentemente haptenizado. Los péptidos pueden ser aislados de la superficie celular, el interior celular o cualquier combinación de los dos lugares. El extracto puede ser particular para el tipo de célula cancerígena (frente a célula normal). El péptido de la presente descripción incluye, sin limitación, un péptido que se une al complejo principal de histocompatibilidad, una proteína asociada a la superficie celular, una proteína codificada por oncogenes cancerígenos o anti-oncogenes mutados.

La membrana de células cancerígenas de la presente invención puede ser en su totalidad o en parte una membrana de una membrana aislada a partir de una célula cancerígena haptenizada. De acuerdo con la definición de membrana de célula cancerígena, como se expone para la presente invención, una membrana de célula cancerígena puede ser aislada y seguidamente haptenizada o, alternativamente, una célula cancerígena puede ser haptizada y la membrana posteriormente aislada posteriormente a partir de la misma.

Los extractos celulares son capaces de estimular células T. La estimulación para los fines de la presente invención se refiere a la proliferación de células T así como a la producción de citoquinas por células T, en respuesta al extracto celular. Las membranas y proteínas aisladas a partir de células y proteínas modificadas con hapteno tienen cada una independientemente la capacidad de estimular células T. La proliferación de células T puede ser observada por absorción por células T de ácidos nucleicos modificados como, sin limitación, ^{3}H-timidina, ^{135}IUDR (yododeoxiuridina) y colorantes como bromuro de 3-(4,5-dimetiltiiazol-2-il) -2,5-difeniltetrazolio (MTT) que tiñe células vivas. Además, la producción de citoquinas como, sin limitación, IFN\gamma, factor de necrosis tumoral (TNF) e IL-2. La producción de citoquinas es preferentemente en una cantidad mayor que 15 picogramos/ml, más preferentemente de aproximadamente 20 a aproximadamente 30 picogramos/ml incluso más preferentemente de aproximadamente 50 picrogramos/ml.

Preferentemente el extracto de células tumorales comprende materiales células que son únicos o sustancialmente específicos para un tipo particular de cáncer. Las células tumorales de la presente descripción pueden ser células vivas. Las células y extractos tumorales de la presente descripción pueden ser irradiadas antes de ser usadas. Las células o extractos tumorales son irradiadas a aproximadamente 2.500 cGy para evitar que las células crezcan después de la inyección.

Las composiciones de la invención pueden ser empleadas en el procedimiento descrito en la presente memoria descriptiva de forma aislada o en combinación con otros compuestos que incluyen, sin limitación, otras composiciones de la invención. Consecuentemente, los extractos de células cancerígenas pueden ser usados solos o conjuntamente administrados. Para los fines de la presente descripción, la administración conjunta incluye la administración de forma conjunta y consecutiva. Además, la membrana de células cancerígenas puede ser conjuntamente administrada con el péptido. Adicionalmente, los extractos de células cancerígenas pueden ser conjuntamente administrados con otros compuestos que incluyen, sin limitación, citoquinas como interleucina-2, interleucina-4, gamma-interferón, interleucina-12 o GM-CSF. Los extractos de células tumorales de la invención pueden ser usados también conjuntamente con otros tratamientos del cáncer que incluyen, sin limitación, quimioterapia, radiación, anticuerpos, secuencias de oligonucleótidos y secuencias de oligonucleótidos antisentido.

Las composiciones de la invención pueden ser administradas mezcladas con un vehículo farmacéuticamente aceptables, seleccionado con respecto a la vía de administración prevista y la práctica farmacéutica estándar. Las dosificaciones pueden ser ajustadas considerando el peso y estado clínico del paciente. La relación proporcional de ingrediente activo a vehículo naturalmente depende de la naturaleza química, solubilidad y estabilidad de las compasiones, así como de la dosificación contemplada. Las cantidades de extractos de células tumorales de la invención que van a ser usadas dependen de factores como la afinidad de los compuestos por células cancerosas, la cantidad de células cancerosas presentes y solubilidad de la composición. Los compuestos de la presente invención pueden ser administrados por medio de cualquier vía adecuada, incluida la inoculación y la inyección, por ejemplo, intradermal, intravenosa, intraperitoneal, intramuscular y subcutánea.

Las composiciones de la presente invención pueden ser administradas solas o generalmente serán administradas mezcladas con un vehículo farmacéutico seleccionado con respecto a la vía de administración prevista y la práctica farmacéutica estándar.

La composición de la presente invención es una cantidad terapéuticamente eficaz de una composición como se define en las reivindicaciones. La composición puede ser mezclada con un adyuvante inmunológico y/o un vehículo farmacéuticamente aceptable. Puede ser usado cualquier vehículo acuoso conocido útil para el suministro de fármacos como, sin limitación, solución salina, de acuerdo con la presente invención, como un vehículo. Además, cualquier adyuvante conocido por los expertos en la técnica puede ser útil en el suministro de la presente invención. Los adyuvantes incluyen, sin limitación, bacillus calmette-Guerin (BCG); citoquinas como, sin limitación, interleucina-12, interleucina-2 y adyuvantes sintéticos como, sin limitación QA-21 (Cambridge Biotech, Wocester, MA) descrito por Livingston et al., Vaccine 1994 12:1275. En el caso en el que los extractos celulares estén irradiados y haptenizados, las células pueden ser conjugadas a un hapteno y seguidamente irradiadas. Alternativamente, las células pueden ser irradiadas y seguidamente conjugadas a un hapteno en cualquier caso, los extractos son posteriormente purificados y seguidamente pueden ser también irradiados y/o haptenizados. Para irradiar y haptenizar los extractos, puede ser realizado en primer lugar cualquier procedimiento, seguido del otro procedimiento.

Alternativamente, los extractos de células T tumorales pueden ser añadidos a células que presenten antígenos. El extracto de células cancerígenas puede ser usado para tratar cáncer junto con otro tipo de célula, una célula que presente antígenos, seleccionada entre el grupo que consiste en macrófagos cultivados autólogos y células dendríticas cultivadas autólogas. Los macrófagos son cualquier célula mononuclear ameboide grande independientemente de su origen como, sin limitación histiocitos y monocitos, que fagocitan, es decir, engullen y destruyen otras células, tejidos muertos, células degeneradas y similares. Los macrófagos con células que presentan antígenos, incluidos antígenos tumorales, a células, incluidas células T. Las células dendríticas son también células que presentan antígenos y parecen que están estrechamente relacionadas con los macrófagos, sin embargo, las células dendríticas son células que presentan antígenos más eficaces que los macrófagos. Son potentes estimuladores de células T y pueden ser aisladas a partir de una diversidad de órganos y tejidos incluidos, sin limitación, la sangre, la piel (en la que las células dendríticas con denominadas células Langerhans) y tejidos linfoides.

Las células que presentan antígenos con péptidos o membranas unidos a ellas, por ejemplo, pueden ser usadas para inmunizar pacientes. Se obtiene la sangre del paciente y los macrófagos o células dendríticas son extraídos de las mismas. Las concentraciones elevadas del péptido (aproximadamente 1 ng/ml a aproximadamente 1 \mum/ml, preferentemente aproximadamente 10 ng/ml a aproximadamente 100 ng/ml), o membrana (aproximadamente 10^{5} a aproximadamente 10^{7} equivalentes de células, los equivalentes de células están relacionados con el número de células de partida) son incubadas con las células durante una noche o durante aproximadamente 8 horas. En el caso de una incubación con membranas, las membranas son fagocitadas por los macrófagos o células dendríticas. Los macrófagos o células dendríticas que han fagocitado las membranas son usados para inmunizar el paciente, Grabbe, S., et al., Immunology Today 1995 16:117-121.

Se ha previsto una composición que comprende una vacuna que consiste en aproximadamente 10 x 10^{6} a aproximadamente 25 x 10^{6} más preferentemente de 5 x 10^{6} a aproximadamente 25 x 10^{6} de células tumorales irradiadas vivas puestas en suspensión en un vehículo o diluyente farmacéuticamente aceptable como, sin limitación solución Hanks, solución salina, solución salina tamponada con fosfato y agua, a la que se añade un adyuvante inmunológico como, sin limitación, Bacillus Calmette-Guerin (BCG). Los extractos de células tumorales pueden ser conjugados a un hapteno. La mezcla es inyectada por vía intradermal en tres sitios contiguos por administración en la parte superior de los brazos o las piernas, excluidas las extremidades ipsilaterales a una disección de nódulos
linfáticos.

Los pacientes pueden ser inmunizados al producto químico dinitrofenilo (DNP) mediante la aplicación de dinitrofluorobenceno (DNFB) a la piel. Dos semanas más tarde, a los pacientes se les inyecta una vacuna, que puede incluir células irradiadas haptenizadas a DNP. La vacuna se vuelve a inyectar cada 4 semanas durante un total de ocho tratamientos. El fármaco ciclofosfamida (CY) puede ser administrado 3 días antes de cada administración de la vacuna para aumentar la respuesta inmune a las células tumorales. Puede ser análogamente administrada una forma no haptenizada de la vacuna.

La vacuna de la presente invención comprende un extracto de células tumorales modificado con hapteno. La forma haptenizada o químicamente conectada de la vacuna puede incluir una membrana de célula tumoral haptenizada a dinitrofenilo (DNP) por ejemplo. Otros haptenos incluyen, sin limitación trinitrofenilo (TNP) y N-yodoacetil-N'-(5-sulfónico-1-naftil)etileno-diamina (AED). En el caso de extractos células cancerígenas haptenizadas, el extracto es aislado de células cancerígenas haptenizadas. La presente descripción contempla también una vacuna no haptenizada de células tumorales y/o extractos de células.

En los procedimientos descritos en la presente memoria descriptiva, un procedimiento para tratar un paciente que se sospecha que tiene cáncer comprende administrar una cantidad farmacéuticamente aceptable de ciclofosfamida, una cantidad farmacéuticamente aceptable de una composición seleccionada entre el grupo que consiste en células de tumores vivos, extractos de células tumorales y una mezcla de células tumorales y extractos de células tumorales. Cuando la composición es un extracto de células cancerígenas, el extracto puede ser un péptido o una membrana aislada de una célula cancerígena haptenizada. La composición puede ser mezclada con un adyuvante inmunológico y/o un vehículo farmacéuticamente aceptable. La vacuna haptenizada puede estar seguida opcionalmente de la administración de una cantidad farmacéuticamente aceptable de una vacuna no haptenizada. Una vacuna no haptenizada puede ser administrada también de acuerdo con los procedimientos descritos en la presente memoria
descriptiva.

La vacuna descrita en la presente memoria descriptiva pueden comprender células tumorales y/o extractos de células tumorales. Las células tumorales para ser usadas en la presente invención pueden ser preparadas como sigue. Las masas tumorales son tratadas como se describe por Berd et al. (1986), supra. Las células son extraídas mediante disociación enzimática con colagenasa y DNAsa mediante disociación mecánica, son congeladas en un frigorífico a velocidad controlada y almacenadas en nitrógeno líquido hasta que sea necesario. En el día en que un paciente es ensayado o tratado en la piel, las células son descongeladas, lavadas e irradiadas a aproximadamente 2500 R. Son nuevamente lavadas y puestas en suspensión en solución de sales equilibrada de Hanks sin rojo de fenol. La conjugación de las células preparadas con DNP se realizan mediante el procedimiento de Miller y Claman, J. Immunol., 1976, 117, 1519 que incluye una incubación de 30 minutos de células tumorales con DNFB bajo condiciones esterilizadas, seguida de lavado con solución salina esterilizada.

Las células cancerígenas de un paciente pueden ser conjugadas a un hapteno aislando las membranas y modificando las membranas o conjugando las células a un hapteno sin aislar primero las membranas.

Una membrana de células cancerígenas puede ser preparada aislando membranas de una preparación no modificada de células cancerígenas de un paciente. Las células se ponen en suspensión en aproximadamente cinco volúmenes de tampón de bicarbonato de sodio aproximadamente 30 mM con fluoruro de fenil-metil-sulfonilo aproximadamente 1 mM y disgregadas con un homogeneizador de vidrio. Las células y los núcleos intactos residuales son separados mediante centrifugación a aproximadamente 1000 g. Las membranas son sedimentadas por centrifugación a 100.000 g durante 90 minutos. Las membranas se vuelven a poner en suspensión en sacarosa en aproximadamente al 8% y se congelan a aproximadamente -80ºC hasta que sea necesario. A una suspensión de membranas (aproximadamente 5.000.000 equivalentes de células/ml) se añaden aproximadamente 0,5 ml de 1 mg/ml de dimitrofluorobenceno (DNFB) durante aproximadamente 30 minutos. Análogamente pueden ser usados otros haptenos como, sin limitación, trinitrofenilo y N-yodoacetil-N'-(5-sulfónico-1-naftil)etileno-diamina. El DNP en exceso se separa dializando las membranas frente a PBS aproximadamente 0,15 M durante aproximadamente tres días. Las membranas son sedimentadas.

Alternativamente, el extracto de células cancerígenas el péptido o la membrana pueden ser preparados modificando células cancerígenas de un paciente con un hapteno como dinitrofenilo y preparando seguidamente membranas a partir del mismo. Las células cancerígenas de un paciente se obtienen durante una biopsia y se congelan hasta que sea necesario. Se disolvieron aproximadamente 100 mg de DNFB (Sigma Chemical Co., St. Louis, MO) en aproximadamente 0,5 ml de etanol al 70%. Se añadieron aproximadamente 99,5 ml de PBS. La concentración de DNFB debe ser de aproximadamente 152 mg/0,1 ml. La solución se agitó durante una noche en un baño de agua a 37ºC. La vida en almacenamiento de la solución era de aproximadamente 4 semanas. Las células se descongelaron y el sedimento se volvió a poner en suspensión en 5X células/ml en solución de sales equilibrada de Hanks. Se añadió aproximadamente 0,1 ml de solución de DNFB a cada ml de células y se incubó durante aproximadamente 30 minutos a temperatura ambiente. Análogamente, pueden ser usados otros haptenos como, sin limitación, trinitrofenilo y N-yoodoacetil-N'-(5-sulfónico-a-naftil)-etileno-diamina. Seguidamente las células se lavaron dos veces en solución de sales equilibrada de Hanks. Las células se pusieron en suspensión en aproximadamente 5 volúmenes de tampón de bicarbonato de sodio aproximadamente 30 mM con fluoruro de metil-fenil-sulfonilo aproximadamente 1 mM y se disgregaron con un homogeneizador de vidrio. Las células y núcleos intactos residuales se separaron por centrifugación aproximadamente 100 g. Las membranas se sedimentaron por centrifugación a 100.000 g durante 90 minutos. Las membranas se volvieron a poner en suspensión en sacarosa aproximadamente al 8% y se congelaron a aproximadamente -80ºC hasta que fue necesario.

A partir de las células modificadas con DNP puede ser extraído péptido, parte del cual fue modificado con DNP como consecuencia de la modificación de las células. Las técnicas de extracción de proteínas conocidas por los expertos en la técnica pueden estar seguidas de ensayados de antígenos para aislar antígeno(s) eficaces para el tratamiento del paciente. Los procedimientos para aislar extractos celulares son fácilmente conocidos por los expertos en la técnica. Brevemente, las células cancerosas son aisladas a partir de un tumor y cultivadas in vitro. Se añade dinitrofenilo a las células cultivadas de acuerdo con el procedimiento anteriormente expuesto. Los péptidos son aislados a partir de las células según una técnica establecida Rotzschke et al., Nature, 1990, 348, 252. Las células son tratadas con un ácido débil. Seguidamente son centrifugadas y las materias sobrenadantes son guardadas. Las fracciones que contienen péptidos pequeños son obtenidas mediante HPLC concentradas y congeladas. Las fracciones son seleccionadas en cuanto a la actividad inmunológica permitiendo que se unan a células linfoblastoides B autólogas que son seguidamente ensayadas en cuanto a la capacidad para estimular linfocitos T específicos para
melanomas.

Las células son tratadas con un ácido débil como, sin limitación ácido trifluoroacético (TFA). Las células son seguidamente centrifugadas y la materia sobrenadante es guardada. Los compuestos que tienen un peso molecular mayor que 5.000 fueron separados de la materia sobrenadante sobre filtración sobre gel (G25 Sepharose, Pharmacia). El resto de la materia sobrenadante se separa en una columna de HPLC de fase invertida (Superpac Pep S, Pharmacia LKB) en ácido trifluoroacético (TFA) al 0,1% usando un gradiente de concentración creciente de acetonitrilo. Caudal = 1 ml/minuto, tamaño de la fracción = 1 ml. La fracciones que contienen péptidos pequeños se obtienen mediante HPLC según el procedimiento de Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboatoy Manual, 2nd ed., Cold Spring Harbor Laboatoy Press, Cold Spring Harbor, NY (1989), se concentran y se congelan. Las fracciones se seleccionan en cuanto la actividad inmunológica permitiendo que se usan a células linfoblastoides B autólogas que son seguidamente ensayadas en cuanto ala capacidad para estimular linfocitos T específicos para melanomas.

Se añade virus Epstein barr (EBV, ATCC CRL-1612, leucocitos transformados B95-8 EBV, tamarínn pinche, Sanguinus oedipus) a células linfoblastoides B en cultivo. Las células linfoblastoides B se transforman en un tumor de células B a partir de linfocitos del propio paciente. El melanoma de una metástasis es cultivado en RPMI 1640 + 10% de suero de ternera fetal o 10% de suero humano agrupado. Las células no adheridas se lavan con medio RPMI. Cuando las células son confluentes, son desprendidas con EDTA al 0,1% y divididas en dos matraces. Este procedimiento continúa cuando las células confluentes son continuamente divididas. Para ensayar la producción de gamma-interferón por células T, se obtienen linfocitos de la sangre de un paciente. Las células tumorales del propio paciente, que han sido modificadas con un hapteno, como DNP, se mezclan con los linfocitos para estimular las células T. Cada siete días se añade interleucina-2. Las células se expanden mediante división como se expuso anteriormente. Seguidamente, las células T son nuevamente estimuladas mediante las células modificadas con hapteno. Una población enriquecida de células T resulta que son sensibles a las células modificadas con hapteno.

Han sido desarrolladas vacunas de cáncer humano y han sido ensayadas por un cierto número de especialistas. Aunque a veces pueden inducir una inmunidad débil en el cáncer del paciente, raramente provocan regresión tumoral. El desarrollo de respuestas inflamatorias en tumores metastáticos fue encontrado sorprendentemente con la vacuna de DNP de la presente invención. El tumor se hace rojizo se calienta y se pone tierno. Finalmente, en algunos casos, el tumor retrocede hasta el punto de que le tumor desaparece a simple vista y microscópicamente. Microscópicamente, se observa la infiltración de linfocitos T en la masa tumoral. Por lo tanto, esta aproximación que aumenta la respuesta inflamatoria y el número de capacidad de linfocitos que entran en el tumor es un avance significativo en la
técnica.

La eficacia de la vacuna puede ser mejorada añadiendo diversos modificadores de respuestas biológicas. Estos agentes funcionan estimulando directa e indirectamente la respuesta inmune. Los modificadores de respuestas biológicas para ser usados conjuntamente con la presente invención incluyen, sin limitación, interleucina-12 y gamma-interferón. En está realización, la IL12 será proporcionada a continuación de cada inyección de vacuna. La administración de IL12 a pacientes con respuesta inflamatorias se cree que provoca que los linfocitos T en la masa tumoral proliferen y se hagan más activos. Los números y la capacidad funcional de las células T aumentadas conducen a la destrucción inmunológica de los tumores. Las dosificaciones de IL12 serán preparadas de acuerdo con las indicaciones de dosificación anteriormente expuestas.

Los pacientes con melanoma metastático fueron tratados usando un régimen de inmunoterapia con los siguientes componentes: 1) vacuna que consiste en células tumorales autólogas conjugadas a DNP; y 2) pretratamiento con ciclofofamida a baja dosis. Los pacientes fueron evaluados para determinar si se había producido una regresión tumoral, para verificar las respuestas inflamatorias tumorales y medir la hipersensibilidad de tipo retrasado para células autólogas de melanoma de DNFB (la forma de DNP usada para sensibilización de la piel), linfocitos autólogas conjugados a DNP, diluyente (solución de Hanks), derivado de proteínas purificadas (PPD) y antígenos de recuerdo (candida, trichophyton y parotitis epidémica). Los pacientes que se consideró que estaban obteniendo una ventaja (clínica o inmunológica) de la terapia continuaron en el régimen de inmunoterapia. Pueden ser proporcionadas vacunas posteriores sin ciclofosfamida. En un experimento similar, la interleucina 2 conectada a polietilenglicol se encontró que no era eficaz.

En otro procedimiento, se usa una vacuna que comprende extractos químicos de células cancerígenas conjugadas a hapteno y mezcladas con un adyuvante inmunológico, como Bacillus Calmette-Guerin, BCG.

Las biopsias de metástasis de melanomas humanos fueron examinadas en cuanto a la expresión de mRNA de citoquinas usando RT-PCR. Se encuentra mRNA para IFN\gamma en una vacuna posterior a DNP, metástasis inflamadas, pero solo raramente en metástasis de pretratamiento, incluso las que contienen grandes números de linfocitos de nódulos linfaticos residuales. Además de ellos, la citoquina de tipo II IL10 se encuentra en casi todas las metástasis de melanoma y parece que es producida por las propias células de melanoma.

Los pacientes con melanoma metastático tratados con una vacuna autóloga modificada con DNP desarrollan respuestas inflamatorias en sitios del tumor. Histológicamente, estas lesiones inflamadas se caracterizan por la infiltración de células T que a veces está asociada con la destrucción de células tumorales. En la presente descripción, muestras de biopsias de 8 metástasis subcutáneas que habían desarrollado inflamación después del tratamiento con la vacuna fueron ensayadas en cuanto a la expresión mRNA para INFN\gamma y IL4, TMS e IL10. Después de la vacuna las biopsias inflamadas contenían mRNA para IFN\gamma (5/8), IL4 (4/8) o ambas (3/8), y para TNF (4/7). Por el contrario, se detectó mRNA de IFN\gamma en solamente 1/17 y mRNA de TNF en 2/16 muestras testigos (pretratamiento de metástasis de nódulos linfáticos o metástasis subcutáneas no inflamadas), mRNA para IL10, una citoquina con propiedades antiinflamatorias, fue detectada en 24/25 metástasis de melanoma y era independiente del contenido de linfoides; una PCR in situ confirmo que las células de melanoma eran la fuente principal. Estos descubrimientos proporcionan un nuevo parámetro mediante el cual medir los efectos de la inmunoterapia del
cáncer.

La presente descripción incluye analizar biopsias de melanomas metastáticos recientemente obtenidas en cuanto a la presencia de mRNA de citoquina, que se correlaciona con una respuesta inmune productiva en el sitio del tumor. La expresión de mRNA de IFN\gamma o IL4 es característica de metástasis de melanomas que han desarrollado una respuesta inflamatoria a continuación de la administración de una vacuna autóloga modificada con DNP. Por otra parte, la expresión de mRNA de Il10 es independiente de una respuesta inflamatoria y es observada en casi todas las muestras de biopsias de melanomas. El examen de las líneas celulares de biopsias de melanomas, así como el análisis PCR in situ, demostraron que la fuente de IL10 son las propias células de melanoma y no los linfocitos
asociados.

Quizás el descubrimiento más importante de este trabajo es el negativo: el mRNA para IFN\gamma e IL4 generalmente no se encuentra en metástasis de melanomas de pacientes sin tratar, ni en masas metastáticas que contienen grandes número de linfocitos de nódulos linfáticos. Esto proporciona una nueva actividad de base de la producción de citoquinas in situ contra la que compiten los tejidos de melanomas cuya población de células T ha sido alterada por inmunoterapia. Además de ello, subyace un importante aspecto biológico: las células T extraídas de metástasis nodales de melanomas representan probablemente los residuos de la población de nódulos linfáticos originales en lugar de los linfocitos que se han infiltrado realmente en el tumor como consecuencia de cu reconocimiento de antígenos de melanomas. Como no son activadas por antígenos, no han recibido ningún estímulo para producir IFN\gamma o
IL4.

Por el contrario, las muestras de biopsias obtenidas a continuación de la administración de vacuna de DNP normalmente expresaron mRNA para IFN\gamma. Sin embargo, las respuestas inflamatorias inducidas por vacuna de DNP no pueden ser caracterizadas como de tipo I, ya que algunas de estas muestras contenían también IL4. Dada la sensibilidad del análisis de mRNA basado en PCR, este modelo podría ser producido por un pequeño foco de células T productoras de IL4 en el medio de un infiltrado de células T que es predominantemente productor de IFN\gamma. Por otra parte, la presencia de mRNA para IFN\gamma e IL4 podría significar la presencia de células T que producen tanto citoquinas como las denominas células TH_{O} (Lee et al, Eur. J. Immunol. 1992 22:1455-1459). La resolución de esta cuestión requerirá un análisis que permita la correlación de la expresión de mRNA con la morfología, como PCR in situ. Cualesquiera que sean los resultados, estos descubrimientos sugieren que la medición de la producción de citoquinas intra-tumorales puede ser un parámetro importante para medir en pacientes que experimenten
inmunoterapia.

La presente descripción sugiere fuertemente que la fuente de mRNA de IL10 son las propias células de melanoma, y no los linfocitos asociados. Se detectaron bandas fuertes de mRNA de IL10 en 24/25 biopsias y su expresión era independiente del número de linfocitos asociados o de la presencia de inflamación inducida por vacuna de DNP. Además de ello, la PCR in situ mostró claramente mRNA de IL10 en células de melanoma. Las líneas celulares derivadas del material de la biopsia expresaron mRNA de IL10 y produjeron IL10 en una medición mediante
ELISA.

El carácter significativo fisiológico de la producción de IL10 en tejidos de melanomas no está claro. La IL10 se conoce que es una citoquina antiinflamatoria con capacidad para inhibir la proliferación de células T y la producción de IL2 (Jinquan, T., et al., J. Immunol. 1993 151:4545-4551) y la hipersensibilidad de tipo retrasado (Lee, supra), probablemente reduciendo la función co-estimuladora de macrófagos. Por tanto, la IL10 podría suprimir la activación y la proliferación de células T reactivas con melanomas que se han infiltrado en el sitio del tumor. Sin embargo, la IL10 se ha demostrado recientemente que es quimioatractora para células T CD8+ (Jinquan, supra); está propiedad podría ser responsable del predominio de células CD8+ en infiltrados linfoides inducidos por vacuna de DNP. En cualquier caso la modulación de la producción de IL10 en el sitio del tumor puede tener consecuencias importantes para la relación tumor-hospedante.

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Se describe también en la presente memoria descriptiva un procedimiento para seleccionar la producción de citoquinas por un tumor para determinar la eficacia de una composición de células conjugadas a hapteno irradiadas y autólogas en un paciente que se sospecha que tiene cáncer, comprendiendo dicho procedimiento la administración de dicha composición conjugada a un hapteno a dicho paciente; obtener una muestra que comprende ácidos nucleicos de una muestra de tejidos del paciente; amplificar ácidos nucleicos específicos para una citoquina o amplificar una señal generada por hibridación de una sonda específica para un ácido nucleico específico para citoquinas en dicha muestra de tejido; y detectar la presencia de los ácidos nucleicos amplificados o la señal amplificada, de forma que la presencia de ácidos nucleicos amplificados o una señal amplificada indica cáncer y de forma que la presencia de ácidos nucleicos anticipados o una señal amplificada a partir de dicha muestra de tejidos del paciente indica la eficacia de dicha composición conjugada a hapteno.

La muestra de tejidos puede ser un tumor maligno o pre-maligno, un tumor de melanoma, por ejemplo, o un melanoma metastático inflamatorio subcutáneo, por ejemplo. Además, una muestra de tejido puede ser muestra de tejido sólido o líquido, sin limitación, la totalidad o parte de un tumor, saliva, esputo, mucosidad, médula ósea, suero, sangre, orina, nódulos linfáticos o una lágrima de un paciente que se sospecha que tiene cáncer.

Los ácidos nucleicos como DNA (incluido cDNA) y RNA (incluido mRNA) se obtienen de la muestra de tejido del paciente. Preferentemente, el RNA se obtiene a partir de una muestra de tejido. El RNA total es extraído mediante cualquier procedimiento conocido en la técnica como se describe por Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboatoy Manual (Cold Spring Harbor Laboatoy, Cold Spring Harbor, NY, 1989).

La extracción de ácidos nucleicos está seguida de la amplificación de los mismos mediante cualquier técnica conocida en el estado de la técnica. La etapa de amplificación incluye el uso de al menos una secuencia cebadora que es complementaria a una parte de una secuencia específica de citoquinas. Las secuencias específicas de citoquinas se define para los fines de la presente invención que incluyen (y no están limitadas a ello) la totalidad o parte de secuencias que codifican IFN\gamma, TNF, IL-2, IL-12 e IL-13. Generalmente, la secuencia cebadora tiene aproximadamente de 21 nucleótidos a aproximadamente 33 nucleótidos, preferentemente de aproximadamente 21 nucleótidos, aproximadamente 31 nucleótidos, 32 nucleótidos y aproximadamente 33 nucleótidos de longitud.

Las secuencias cebadoras útiles en los procedimientos de amplificación incluyen, sin limitación actina \beta, SEQ ID NO. 1 y 2; INF\gamma, SEQ ID NO. 3 y 4; IL4, SEQ ID NO. 5 y 6; IL10, SEQ ID NO. 7 y 8 y TNF, SEQ ID NO. 9 y
10.

Cuando un procedimiento de amplificación dependiente de plantillas usa un par de cebadores, un cebador del par puede comprender oligonucleótidos que son complementarios a secuencias de ácidos nucleicos que codifican proteínas específicas para citoquinas. Un cebador del par puede ser seleccionado entre el grupo que consiste en las SEQ ID NO. 1 a 10.

Alternativamente, cada uno de los dos oligonucleótidos en el par de cebadores puede ser específico para una secuencia de ácidos nucleicos que codifica una citoquina. Los cebadores pueden estar diseñados para ser complementarios a regiones separadas de una secuencia de citoquinas, por ejemplo. Mediante "regiones separadas" se quiere indicar que un primer cebador es complementario a una región en 3' de una secuencia de citoquinas y un segundo cebador es complementario a una región en 5' de una secuencia de citoquinas. Preferentemente, los cebadores son complementarios regiones distintas y separadas y no son complementarios uno respecto al otro. Los cebadores de las SEQ ID NO. 1-10 son meramente ilustrativos de los cebadores que pueden ser útiles en el procedimiento.

Cuando un procedimiento de amplificación incluye el uso de dos cebadores como en la reacción de cadena de polimerasa, el primer cebador puede ser seleccionado entre el grupo que consiste en SEQ ID NO. 1, 3, 5, 7, y 9 y el segundo cebador puede ser seleccionado entre le grupo que consiste en SEQ ID NO. 2, 4, 6, 8, y 10. Cualquiera de los pares de cebadores que transcriben ácidos nucleicos uno hacia otro y que sean específicos para citoquinas pueden ser usados de acuerdo con los procedimientos descritos en la presente memoria descriptiva.

Preferentemente se lleva a cabo la extracción total de RNA. Como se usa en la presente memoria descriptiva, el término "amplificación" se refiere a procedimientos dependientes de plantillas y a la propagación medida por vectores que da lugar a un aumento en la concentración de una molécula específica de ácido nucleico con relación a su concentración inicial, o a un aumento en la concentración de una señal detectable. Como se usa en la presente memoria descriptiva, la expresión "procedimiento dependiente de plantillas" está previsto que se refiera a un procedimiento que incluye la extensión dependiente de plantillas de una molécula de cebador. La expresión "procedimiento dependiente de plantillas" se refiere a la síntesis de ácidos nucleicos de un RNA o una molécula de DNA en la que la secuencia de la cadena recientemente sintetizada de ácido nucleico está dictada por las reglas bien conocidas de emparejamiento de bases complementarias (véase, por ejemplo, Watson, J. D. et al., In: Molecular Biology of the Gene, 4th Ed., W. A. Benjamin, Inc., Menlo Park, Calif. (1987)). Normalmente, las metodologías medidas por vectores incluyen la introducción del fragmento de ácido nucleico en un vector de DNA o RNA, la amplificación clonal del vector y la recuperación del fragmento de ácido nucleico amplificado. Ejemplos de estas metodologías son proporcionadas por Cohen et al. (U.S. Pat. No. 4.237.224), Maniatis, T. et al., Molecular Cloning (A Laboatoy Manual), Cold Spring Harbor Laboatoy, 1982.

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Está disponible un cierto número de procedimientos de plantillas para amplificar las secuencias diana de interés presentes en una muestra. Uno de los procedimiento de amplificación mejor conocidos es la reacción de cadena de polimerasa (PCR) que es descrito en detalle en las patentes de EE.UU. 4.683.195, 4.683.202 y 4.800.159, y por Innis et al., PCR Protocols, Academic Press, Inc., San Diego CA, 1990. Brevemente, en una PCR, se preparan dos secuencias de cebadores que son complementarias a regiones en cadenas complementarias opuestas de la secuencia diana. Se añade un exceso de trifosfatos de desoxinucleósidos a una mezcla de reacción junto con una DNA polimerasa (por ejemplo, Taq polimerasa). Si está presente la secuencia diana en una muestra, los cebadores se unirán a la diana y la polimerasa provocará que los cebadores se extiendan a lo largo de la secuencia diana añadiendo nucleótidos. Aumentado y disminuyendo la temperatura de la mezcla de reacción, los cebadores extendidos se disociarán de la diana para formar productos de reacción, los cebadores en exceso se unirán a la diana y a los productos de la reacción y el procedimiento se repite. Preferentemente, se puede realizar un procedimiento de amplificación PCR de transcriptasa inversa con el fin de cuantificar la cantidad de mRNA amplificado. Las metodologías de reacción de amplificación de polimerasa son bien conocidas en la técnica.

Otro procedimiento para la amplificación es la reacción de cadena de ligasa (referida como LCR), descrita en el documento EP nº 320.308. En la LCR, se preparan dos pares de sondas complementarias y, en presencia de la secuencia diana, cada par se unirá a cadenas complementarias opuestas de la diana de forma que se superponen. En presencia de una ligasa, los dos pares de sondas se conectarán para formar una única unidad. Mediante una ciclación de la temperatura, como en la PCR, las unidades ligadas unidas se disocian de la diana y seguidamente sirven como "secuencias dianas" para la ligadura de los pares de sondas en exceso. La patente de EE.UU. 4.883.750, incorporada como referencia a la presente memoria descriptiva en su totalidad, describe un procedimiento alternativo de amplificación similar a la LCR para unir pares de sondas a una secuencia diana.

La Qbeta replicasa, descrita en la solicitud PCT nº PCT/US87/00880, (WO-8706270) puede ser usada también como todavía otro procedimiento de amplificación. En este procedimiento, una secuencia replicativa de RNA que tiene una región complementaria a la de una diana es añadida a una muestra en presencia de una RNA polimerasa. La polimerasa copiará la secuencia replicativa que puede ser seguidamente detectada.

Un procedimiento de amplificación isotérmica, en la que son usadas endodonucleasas y ligasa de restricción para conseguir la amplificación de moléculas dianas que contiene nucleótido 5'-[alfa-tio]trifosfatos en una cadena de un sitio de restricción (Walker, G. T., et al., Proc. Natl. Acad, Sci. (U.S.A.) 1992, 89:392-396), puede ser también útil en la amplificación de ácidos nucleicos.

La amplificación por desplazamiento de cadenas (SDA) es otro procedimiento para llevar a cabo la amplificación isotérmica de ácidos nucleicos que incluye múltiples etapas de desplazamiento y síntesis de cadenas, es decir, traducción de mella. Un procedimiento similar, denominado reacción de cadenas de reparación (RCR) es otro procedimiento de amplificación que puede ser útil en la presente invención e incluye la reasociación de varias sondas por toda una región dirigida a diana para amplificación, seguida de una reacción de reparación de la que están presentes solamente dos de las cuatro bases. Las otras dos bases pueden ser añadidas como derivados biotinilados para una fácil detección. Una aproximación similar es usa en SDA.

Las secuencias específicas de citoquinas pueden ser detectadas también usando una reacción de sondas cíclicas (CPR) en una CPR, una sonda que tiene secuencias en 3' y 5' de DNA no específico de citoquina y una secuencia media de RNA específico de citoquina es hiridada a DNA que está presente en una muestra. Tras la hibridación, la reacción es tratada con RNAsaH y los productos de la sonda identificados como productos distintivos que generan una señal, que son liberados después de una digestión. La plantilla original es reasociada a otra sonda de ciclación y la reacción se repite. Por tanto, al CPR incluye amplificar una señal generada por hibridación de una sonda a un ácido nucleico específico de citoquina.

Todavía, pueden ser usados otros procedimientos de amplificación descritos en la solicitud británica nº 2.202.328 y en la solicitud PCT nº PCT/US89/01025 (WO-A-890284). En la solicitud anterior se usan cebadores "modificados" en una síntesis dependiente de plantillas y enzimas de tipo PCR. Los cebadores pueden ser modificados marcando con un resto de captura (por ejemplo, biotina) y/o un resto detector (por ejemplo, una enzima). En la solicitud posterior, se añade un exceso de sondas marcadas a una muestra. En presencia de la secuencia diana, la sonda se une y escinde catalíticamente. Después de la escisión la secuencia diana es liberada intacta para unirse en exceso. La escisión de la sonda marcada indica la presencia de la secuencia diana.

Otros procedimientos de amplificación de ácidos nucleicos incluyen los sistemas de amplificación basados en trascripción (TAS) (Kwoh D., et al., Proc. Natl. Acad. Sci. (U.S.A.) 1989, 86:1173, Gingeras T.R., et al.), solicitud PCT WO 88/10315, que incluye la amplificación basada en secuencias de ácidos nucleicos (NASBA) y 3SR. En NASBA, se pueden preparar los ácidos nucleicos para la amplificación mediante extracción estándar en fenol/cloroformo, desnaturalización con calor de una muestra clínica, tratamiento con tampón de lisis y columnas miniespín para el aislamiento de DNA y RNA o extracción con cloruro de guanidinio de RNA. Estas técnicas de amplificación incluyen la reasociación de un cebador que tiene secuencias específicas de la próstata. A continuación de la polimerización, los híbridos de DNA/RNA son digeridos RNAsaH mientras que las moléculas de DNA de cadena doble son nuevamente desnaturalizadas con calor. En cualquier caso, el DNA de cadena única se hace completamente de cadena doble mediante la adición de un segundo cebador específico de próstata seguido de polimerización. Las moléculas de DNA de cadena doble seguidamente se transcriben de forma múltiple por medio de una polimerasa T7 o SP6. En una reacción cíclica isotérmica, los RNAs son transcritos de forma inversa en DNA de cadena doble y nuevamente transcritos con una polimerasa como T7 o SP6. Los productos resultantes, truncados o completos, indican secuencias específicas de cáncer de próstata.

Davey, C., et al., publicación de solicitud de patente europea nº 229.822, describen un procedimiento de amplificación de ácidos nucleicos que incluye sintetizar cíclicamente RNA de cadena única ("ssRNA"), ssDNA y DNA de cadena doble (dsDNA), que puede ser usado. El ssRNA es un primera plantilla para un primer oligonucleótido cebador que es alargado por medio de transcriptasa inversa (DNA polimerasa dependiente de RNA). El RNA se separa seguidamente del dúplex de DNA:RNA mediante la acción de ribonucleasa H (RNAsa H, una RNAsa específica para RNA en un dúplex con DNA o RNA). El ssDNA resultante es una segunda plantilla para un segundo cebador que incluye también las secuencias de un promotor de RNA polimerasa (ilustrado por T7 RNA polimerasa) en 5'respecto a su homología o su plantilla. Esté cebador es seguidamente extendido por medio de DNA polimerasa (ilustrada por el fragmento "Klenow" largo de DNA polimerasa I de E. coli), dando lugar a una molécula de DNA de cadena doble ("dsDNA"), que tiene una secuencia idéntica a la del RNA original entre los cebadores y que tiene opcionalmente en un extremo una secuencia promotora. Esta secuencia promotora se puede usar mediante la RNA polimerasa acuerda para preparar muchas copias de RNA del DNA. Estas copias seguidamente pueden volver a entrar en el ciclo que conduce a una amplificación muy rápida. Con la elección apropiada de enzimas, esta amplificación se puede hacer isotérmicamente sin la adición de enzimas en cada ciclo. Debido a la naturaleza clínica de esté procedimiento, la secuencia de partida puede ser escogida para esté en la forma de DNA o
RNA.

Miller, H. I., et al., en la solicitud PCT WO 89/06700, describen un esquema de amplificación de secuencias de ácidos nucleicos basado en la hibridación de una secuencia promotora/cebadora a un DNA de cadena única ("ssDNA") diana, seguida de transcripción de muchas copias de RNA de la secuencia. Este esquema no es cíclico, es decir, no se producen plantillas nuevas a partir de los transcriptos de RNA resultantes. Otros procedimientos de amplificación incluyen "race" descrito por Frohman, M. A., en: PCR Protocols: A Guide to Methods y Applicaticns 1990, Academic Press, N.Y.) y "one-sided PCR" (Ohara, O., et al., Proc. Natl. Acad. Sci. (U.S.A.) 1989, 86:5673-
5677).

Los procedimientos basados en la ligadura de dos o más oligonucleótidos en presencia de un ácido nucleico que tiene la secuencia del "di-oligonucleótido" resultante, amplificando el di-oligonucleótido (Wu, D. Y. et al., Genomics 1989, 4:560), pueden ser usados también en la etapa de amplificación.

A continuación de la amplificación, puede ser detectada la presencia o ausencia del producto de amplificación. El producto amplificado puede ser secuenciado mediante cualquier procedimiento conocido en la técnica, incluido, pero sin limitación, el procedimiento de Maxam y Gilbert, véase Sambrook, supra. El producto amplificado secuenciado se puede comparar seguidamente con los resultados obtenidos con unos tejidos extirpados antes del tratamiento con la vacuna. Las muestras de tejidos obtenidas antes del tratamiento con la vacuna deben estar exentas de secuencias de citoquinas, particularmente IFN\gamma, TNF, IL2, IL12 e IL13. Los ácidos nucleicos pueden ser fragmentados en tamaños variables de fragmentos discretos. Por ejemplo, los fragmentos de DNA pueden ser separados según el peso molecular mediante procedimientos como, sin limitación, electroforesis a través de una matriz de gel de agarosa. Los geles se analizan seguidamente mediante hibridación Southern. Brevemente, el DNA en el gel es transferido a un sustrato o matriz de hibridación como, sin limitación, una lámina de nitrocelulosa y una membrana de nilón. Se aplica una sonda marcada a la matriz bajo condiciones de hibridación seleccionadas de forma que se hibride con el DNA complementario localizado en la matriz. La sonda puede ser de una longitud capaz de formar un dúplex estable. La sonda puede tener un intervalo de tamaños de aproximadamente 200 a aproximadamente 10.000 nucleótidos de longitud, preferentemente de aproximadamente 200 nucleótidos longitud. Las desadaptaciones como, sin limitación, las secuencias hidrofobicidad e hidrofilicidad similares, serán conocidas por los expertos en la técnica una vez que hayan considerado la presente descripción. Son conocidos diversos marcadores para la visualización o detección como, sin limitación, el teñido fluorescentes, teñido con bromuro de etidio, por ejemplo, avidina/biotina, marcador reactivo como marcador de ^{32}P y similares. Preferentemente el producto, como el producto de PCR, se puede experimentar en un gel de agarosa y ser visualizado usando un tinte como bromuro de etidio. Véase Sambrook et al., supra. Seguidamente la matriz puede ser analizada mediante auto-radiografía para localizar fragmentos particulares que se hibridan a la
sonda.

Está previsto un estuche de diagnóstico para seleccionar la eficacia de una composición celular conjugada a hapteno irradiada y autóloga que comprende, en uno o más recipientes, un par de cebadores, de forma que los cebadores en dicho par son complementarios a una secuencia específica de citoquinas y de forma que dicho cebador se selecciona entre el grupo que consiste en SEQ ID NO. 1, SEQ ID NO. 2, SEQ ID NO. 3, SEQ ID NO. 4, SEQ ID NO. 5, SEQ ID NO. 6, SEQ ID NO. 7, SEQ ID NO. 8, SEQ ID NO. 9 y SEQ ID NO. 10 y medios para visualizar DNA amplificado; dicho estuche de ensayo es útil para determinar la eficacia de dicha composición.

La invención se ilustra adicionalmente por medio de los siguientes ejemplos reales 1-8 y 11 y los ejemplos predictivos 9-10 y 12-14 que están destinados a ser solamente ilustrativos y no está previsto limitar la presente invención a estas realizaciones específicas. Los aspectos de los ejemplos que no se relacionan específicamente con la invención reivindicada son incluidos solamente por motivos de ilustración.

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Ejemplo 1

Sesenta y cuatro pacientes fueron tratados con melanoma metastático usando una vacuna de melanoma, preparada de acuerdo con los procedimientos anteriormente expuestos, precedidos de ciclofosfamida (CY) de dosis baja y fueron verificados en cuanto a efectos inmunológicos y actividad antitumoral. En el día 0, se les proporcionó a los pacientes ciclofosfamida 300 mg/M^{2} i.v. Tres días más tarde se les inyectó por vía intradermal una vacuna que consistía en 10 x 10^{6} a 25 x 10^{6} células tumorales irradiadas (2.500 R) crioconservadas y autólogas mezcladas con BCG; las células tumorales fueron obtenidas mediante disociación de masas metastáticas por vía enzimática (colagenasa y DNAsa). Está secuencia de tratamiento se repitió cada 28 días, para 8 tratamientos.

La toxicidad de la terapia estaba limitada a una respuesta inflamatoria local en el sitio de la inyección y una náusea y vómitos suaves a continuación de la administración ciclofosfamida. Había 40 pacientes evaluables con metástasis medibles, 5 tenían respuestas, 4 completas y 1 parcial. La duración media de respuestas fue de 10 meses (7-84 + meses). Un paciente continúa estando en remisión a los 11 años. La regresión se produjo no solamente en metástasis de piel y nodales, sino también en metástasis de pulmón e hígado. En 6 pacientes adicionales se observó una respuesta anti-tumoral que parecía peculiar para esta terapia de vacuna, es decir, la regresión de lesiones metastáticas que aparecía después de que había comenzado la inmunoterapia. En 3 pacientes esta regresión "retrasada" se produjo en dos o más tumores.

La hipersensibilidad de tipo retrasado (DTH) para células de melanoma mecánicamente disociadas y autólogas era detectable en solamente un 16% de pacientes antes del tratamiento, en comparación con 46%, 56% y 73% de pacientes en los días 49, 161 y 217, respectivamente. Los aumentos de hipersensibilidad de tipo retrasado a continuación de una inmunoterapia fueron estadísticamente significativos en un ensayo t no independiente, el día 0 frente al día 49, p < 0,001; día 0 frente a día 161, p < 0,001; día 0 frente a día 217, p = 0,02. Globalmente, 26/43 pacientes (61%) exhibían una respuesta de hipersensibilidad positiva de tipo retrasado (\geq5 mm) a células de melanoma autólogas en algún valor del tiempo. Los pacientes desarrollaron también una fuerte hipersensibilidad de tipo retrasado a las enzimas usadas para preparar las suspensiones de células tumorales: de 24 pacientes ensayados en cuanto a hipersensibilidad de tipo retrasado con una mezcla de colagenasa y DNAsa (cada una a 1 \mug/ml) después de dos tratamientos con vacunas, 21 (88%) tenían respuestas > 5 mm. Las respuestas antitumorales a la vacuna estaban fuertemente asociadas con la hipersensibilidad de tipo retrasado a células de melanoma autólogas mecánicamente disociadas, según se indicaba mediante tres observaciones: 1) 8/10 pacientes que exhibían regresión tumoral tenían hipersensibilidad positiva de tipo retrasado; 2) en pacientes con adyuvante post-quirúrgico, había una elevada correlación significativa entre la intensidad de la hipersensibilidad de tipo retrasado para células de melanoma autólogas y el tiempo para la recurrencia del tumor (r = 0,680, p < 0,0011); 3) nueve pacientes que desarrollan hipersensibilidad de tipo retrasado a las células de melanoma autólogas en su vacuna original (tumor antiguo) desarrollaron nuevas metástasis (tumor "nuevo") que no provocaron hipersensibilidad de tipo retrasado o provocaron una respuesta mucho más pequeña. Los pacientes fueron comparados con su estado antes del tratamiento con la vacuna. Los pacientes tratados antes del estudio con vacuna fueron retirados del tratamiento uno a dos meses antes del comienzo del estudio con la vacuna. Consecuentemente, los pacientes estaban sin tratar al comienzo del estudio con la
vacuna.

En tres casos fue posible extirpar tumores en regresión para un examen histológico; estos tumores estaban caracterizados por una infiltración intensa de linfocitos. Por el contrario, los tumores extirpados de estos pacientes antes de la inmunoterapia consistían en masas homogéneas de células malignas sin infiltración linfocítica significativa.

Este estudio muestra que el uso de ciclofosfamida permite el desarrollo de una respuesta inmune a antígenos asociados con melanomas en pacientes que portan cáncer.

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Ejemplo 2

Los pacientes con melanoma metastático fueron sensibilizados a DNP mediante la aplicación tópica en la parte superior del brazo con 1% de dinitroclorobenceno (DNCB) o dinitrofluorobenceno (DNFB). Dos semanas más tarde se les inyectó una vacuna que consistía en 10 x 10^{6} a 25 x 10^{6} de células de melanoma irradiadas y autólogas conjugadas a DNP y mezcladas con BCG. Se proporcionó ciclofosfamida 300 mg/M^{2} i.v. 3 días antes del DNCB (o DNFB) o la vacuna. De 4 pacientes evaluables, 3 habían desarrollado una llamativa respuesta inflamatoria en masa tumorales después de 2 tratamientos con vacunas (8 semanas) El paciente nº 1 desarrolló ericema e hinchamiento en los > 50 metástasis dérmicas grandes (1-3 cm) en la pierna y el abdomen inferior, seguido de ulceración y drenaje de material necrótico y algunos habían comenzado a remitir. Una biopsia mostró infiltración linfocitos CD4+ CD8+. El paciente nº 2 desarrolló ericema e hinchamiento en la piel en el abdomen inferior y la ingle superpuestos a grandes masas nodales (8 cm). Éstas todavía no habían remitido, pero habían cambiado de consistencia desde dureza pétrea a fluctuante. El paciente nº 3 exhibió ericema moderado en la piel superpuesto a 3 metástasis subcutáneas. La totalidad de los tres pacientes habían desarrollado hipersensibilidad de tipo retrasado en linfocitos autólogos conjugados tanto a DNCB como a DNP. Los pacientes se compararon con su estado antes del tratamiento con la vacuna. Los pacientes tratados antes del estudio con la vacuna fueron retirados del tratamiento uno a dos meses antes del comienzo del estudio con la vacuna. Consecuentemente, los pacientes estaban sin tratar al comienzo del estudio con la
vacuna.

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Ejemplo 3

Quince pacientes (incluidos 3 pacientes del ejemplo 2) fueron tratados con melanoma metastático usando una nueva forma de inmunoterapia, es decir, vacuna de célula tumoral conjugada a DNP. Los pacientes fueron sensibilizados a DNP mediante la aplicación tópica a la parte superior del brazo de 5% dinitroclorobenceno. Seguidamente cada 4 semanas recibieron ciclofosfamida 300 mg/M^{2} seguida 3 días más tarde de inyección de 10 x 10^{6} a 25 x 10^{6} células de melanoma irradiadas y autólogas conjugadas a DNP. Los pacientes recibieron 6-8 tratamientos. La mayoría de los pacientes (92%) desarrollaron hipersensibilidad de tipo retrasado (DTH) a linfocitos autólogos conjugados a DNP o células tumorales (DTH media = 17 mm). La vacuna indujo una llamativa respuesta inflamatoria en metástasis subcutáneas y nodales en 11/15 pacientes que consistían en ericema, hinchamiento, calentura y enternecimiento alrededor de las masas tumorales y en un caso drenaje purulento. Las biopsias mostraron infiltración con linfocitos que, mediante análisis inmunopatológicos y citométricos de flujo, eran principalmente células T CD3+, CD4-, CD8+, HLA-DR+. Las células de melanoma en estos tejidos expresaban fuertemente ICAM-1, que sirven como una molécula de adhesión para células T. Por tanto, La vacuna de DNP parece inducir un grado de inmunidad anti-melanoma no observado con la inmunoterapia previamente ensayada. Los pacientes fueron comparados con su estado antes del tratamiento con la vacuna. Los pacientes tratados antes del estudio con la vacuna fueron retirados del tratamiento uno a dos meses antes del comienzo del estudio con la vacuna. Consecuentemente, los pacientes estaban sin tratar al comienzo del estudio con la vacuna.

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Ejemplo 4

Este ejemplo examinó los efectos terapéuticos de la vacuna de DNP en pacientes con metástasis quirúrgicamente extirpadas y ninguna evidencia clínica de enfermedad metastática. Cuarenta y siete pacientes fueron sensibilizados al hapteno, DNFB (dinitrofluorobenceno). Seguidamente fueron tratados mediante inyección intradermal de células de melanoma irradiadas y autólogas conjugadas a DNP. Se administraron inyecciones de vacunas adicionales cada 28 días para un total de ocho tratamientos. Todos los pacientes fueron periódicamente ensayados en cuanto a hipersensibilidad de tipo retrasado, DTH, respuestas a células de melanoma autólogas, linfocitos autólogos conjugados a DNP y antígenos microbianos. Se realizaron estudios in vitro con linfocitos crioconservados extraídos de tumores metastáticos y/o separados de sangre periférica.

El gráfico de la Figura 12 compara el porcentaje de pacientes exentos de tumores en los meses que siguieron a una cirugía tratada con vacuna de DNP y vacuna testigo no haptenizada. El estudio examinó los efectos terapéuticos de la vacuna de DNFB en pacientes con metástasis quirúrgicamente extirpadas y sin evidencia clínica de enfermedad metastática. Todos los pacientes fueron sensibilizados al hapteno, DNFB (dinitrofluorobenceno). Seguidamente fueron tratados mediante inyección intradermal de células de melanoma irradiadas y autólogas conjugadas a DNP. Se administraron inyecciones de vacunas adicionales durante 28 días durante un total de ocho tratamientos. Todos los pacientes fueron periódicamente ensayados en cuanto a hipersensibilidad de tipo retrasado, DTH, respuestas a células de melanoma autólogas, linfocitos autólogos conjugados a DNP y antígenos microbianos. Se realizaron estudios in vitro con linfocitos crioconservados extraídos de tumores metastáticos y/o separados de sangre
periférica.

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(Tabla pasa a página siguiente)

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Terapia de vacuna de DNP de melanoma

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Sensibilización a DNP - Los pacientes fueron inicialmente sensibilizados a DNP como sigue: En el día 17, ciclofosfamida, 300 mg/m^{2} fue administrada en forma de una infusión rápida i.v. Tres días más tarde, en los días 14 y 15, los pacientes fueron sensibilizados con DNFB (dinitrofluorobenceno): 1 mg de DNFB disuelto en acetona-aceite de maíz y aplicado por vía tópica en un volumen de 0,1 ml en los confines de un anillo de acero de 2 cm de diámetro. Dos semanas más tarde, los pacientes fueron ensayados en cuanto a la reactividad a DNP mediante la aplicación tópica de 200 \mug de DNFB e inyección intradermal PBL autóloga conjugada a DNP. La ciclofosfamida fue reconstituida en agua esterilizada y la dosificación apropiada se administró mediante infusión rápida i.v.

Preparación de vacunas - Las masas tumorales fueron tratadas. Se extrajeron células mediante disociación enzimática con colagenasa y DNAsa y mediante disociación mecánica, se congelaron en un congelador a velocidad controlada y se almacenaron en nitrógeno líquido hasta que fue necesario. En el día en que un paciente iba a ser tratado, las células se descongelaron, se lavaron y se irradiaron a 2500 R. Seguidamente se lavaron nuevamente y se pusieron en suspensión en soluciones de sales equilibrada de Hanks sin rojo de fenol.

Se realizó la conjugación de célula de melanomas con DNP. Esto incluyó una incubación de 30 minutos de células tumorales con dinitrofluorobenceno (DNFB) bajo condiciones esterilizadas, seguida de lavado con solución salina esterilizada.

La vacuna consiste en 5-20 x 10^{6} células tumorales vivas puestas en suspensión en 0,2 ml de solución de Hanks. Cuando se añade BCG, consiste en 0,1 ml de 1 dilución 1:10 de Tice BCG. Cada tratamiento con vacuna consintió en tres inyecciones en sitios contiguos en la parte superior de los brazos o las piernas, excluidas las extremidades ipsilaterales a una disección de nódulos linfáticos.

Procedimientos de estudio - En el día 0 los pacientes recibieron 300 mg/M^{2} de ciclofosfamida en forma de una infusión rápida i.v. Tres días más tarde, en el día +3, se les inyectó por vía intradermal una vacuna de melanoma autóloga. Las inyecciones de vacunas adicionales se administraron cada cuatro semanas durante un total de ocho tratamientos. Se les proporcionó ciclofosfamida solamente antes de las dos primeras inyecciones. Todas las vacunas estaban conjugadas a DNP y mezcladas con Bacillus Calmette-Guerin (BCG). BCG es la cepa Tice (subcepa de la cepa del Instituto Pasteur) obtenida de la entidad Organon Teknika Coporation, Durham, NC. El material liofilizado se reconstituyó con 1 ml de agua esterilizada y se diluyó 1:10 en solución salina tamponada con fosfato, pH 7,2; seguidamente se extrajo 0,1 ml, se mezcló con la vacuna y se inyectó. Todas las vacunas se inyectaron en el mismo sitio (parte superior del brazo o la pierna).

Evaluación inmunológica - El ensayo de la piel se realizó mediante la inyección intradermal de 0,1 ml de material del ensayo en el antebrazo y la hipersensibilidad de tipo retrasado se valoró a las 48 horas midiendo el diámetro medio de induración. Las reacciones positivas fueron fotografiadas. Se ensayaron los siguientes materiales: 1) 1 x 10^{6} de células de melanoma autólogas irradiadas; 2) 3 x 10^{6} linfocitos autólogos de sangre periférica, ambos sin conjugar y conjugados a DNP; 3) solución de Hanks; 4) resistencia intermedia a PPD; y 5) antígenos de recuerdo microbianos - Candida, trichophyton y parotitis epidémica. También, la sensibilidad de contacto a DNFB se ensayó aplicando 200 \mug de la piel del antebrazo y examinando la zona para un círculo de induración de 48 horas.

Se recogió sangre de todos los pacientes para la separación y crioconservación de linfocitos y suero cada vez que se realizó un ensayo de la piel (véase la Tabla 1 para un esquema de las tomas de sangre). Periódicamente, estas fueron ensayadas en cuanto a: 1) respuesta proliferativa y citotóxicas a células autólogas de melanomas; y 2) respuesta proliferativa a linfocitos autólogos conjugados a DNP.

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Duración del estudio

1) Los pacientes fueron tratados con ocho series de vacunas que requirieron aproximadamente ocho meses. Seguidamente el tratamiento se interrumpió. Estos pacientes serán verificados hasta que hayan transcurrido al menos 5 años desde su cirugía inicial.

2) Los pacientes que desarrollaron una recurrencia regional o metástasis distantes antes de completar los ocho tratamientos fueron excluidos del estudio y tratados como está clínicamente indicado (quimioterapia o cirugía).

El grupo testigo consistía en 22 pacientes con melanoma metastático para nódulos linfáticos regionales. Experimentaron una extirpación quirúrgica de su enfermedad, momento en el cual no tenían una evidencia clínica de melanoma metastático. Seguidamente, recibieron un tratamiento con vacuna de melanoma autóloga no haptenizada. En primer lugar se les proporcionó ciclofosfamida, 300 mg/M^{2}. Tres días más tarde se les inyectó por vía intradermal la vacuna, que consistía en 10 x 10^{6} a 25 x 10^{6} de células de melanoma autólogas irradiadas mezcladas con BCG. El tratamiento de vacuna de ciclofosfamida se repitió cada 28 días. Se proporcionó un total de ocho tratamientos. Los pacientes fueron clínicamente evaluados cada dos meses.

Solamente un 20% de los pacientes testigos estaban exentos de cáncer a los dos años. Por el contrario, los pacientes tratados con vacuna de DNP de la invención tenían una supervivencia exenta de cáncer significativamente mayor, como se expuso anteriormente.

Los pacientes que recibieron vacuna haptenizada teñían todos melanoma metastático para los nódulos linfáticos regionales, pero ninguna evidencia de metástasis distantes. Los pacientes en este estado fueron rutinariamente tratados mediante extirpación quirúrgica de los nódulos enfermos. La extirpación quirúrgica los hace clínicamente exentos de enfermedad, pero tienen un 80-85% de posibilidades de desarrollar melanoma metastático en dos años.

Los pacientes en el grupo testigo estaban en el mismo estado clínico con el fin de ser comparables con el grupo de vacunas haptenizadas. Por tanto, el grupo testigo consistía también en pacientes con melanoma metastático para los nódulos linfáticos, pero sin evidencia de metástasis distantes, que habían experimentado una extirpación quirúrgica de los nódulos enfermos. Cuando se inició el tratamiento con la vacuna no haptenizada, los pacientes testigos estaban clínicamente exentos de enfermedad pero, como se indicó previamente, un 80% desarrollo metástasis
distantes.

Los pacientes con melanoma quirúrgicamente incurable no fueron seleccionados como testigos porque estos pacientes tienen una velocidad de curación que se aproxima a 0 y una supervivencia incluso más corta que los pacientes con metástasis extirpable de nódulos linfáticos. Además de ello, no es posible en estos pacientes medir la supervivencia exenta de enfermedad, un parámetro que fue enormemente prolongado por la vacuna de la presente
invención.

Se realizó un análisis estadístico de los datos como sigue: se construyeron gráficos de Kaplan-Meir de la supervivencia exenta de enfermedad y la supervivencia total. La diferencia entre paciente de vacuna de DNP y los pacientes testigos se analizó mediante el ensayo de Mantel-Cox. Estos son procedimientos estadísticos estándar para analizar estos datos. La diferencia fue altamente significativa con p < 0,01.

Diecisiete pacientes adicionales fueron posteriormente tratados según el protocolo anteriormente indicado (el tamaño del grupo testigo no fue aumentado por la razones anteriormente expuestas). Los resultados mantuvieron diferencias estadísticamente significativas en la supervivencia exenta de enfermedad y la supervivencia total.

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Ejemplo 5

La administración de una vacuna de melanoma conjugada con dinitrofenilo (DNP) y autóloga induce la infiltración de células T de tumores metastáticos y prolonga la supervivencia de pacientes que han experimentado una linfadenectomía para metástasis regionales masivas. Estos efectos parece que son debidos a células T específicas de melanomas. Su generación está relacionada con las células T con especifidad por células de melanoma modificadas con DNP (DNP-MEL).

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Protocolo clínico

Todos los pacientes tenían melanoma metastático y estaban experimentando una inmunoterapia con vacuna autóloga de tumor conjugado a DNP, como se describió previamente por Berd, D., et al., Cáncer Res., 1991, 51, 273. Se obtuvo un consentimiento informado de los pacientes. Los pacientes fueron previamente tratados a ciclofosfamida a 300 mg/M^{2}, véase Berd et al. (1986) supra y tres días más tarde fueron sensibilizados a DNFB mediante la aplicación tópica de 0,1 ml de una solución de DNFB en acetona-aceite de maíz en dos días consecutivos. Dos semanas más tarde a los pacientes se les proporcionó nuevamente ciclofosfamida, seguida tres días más tarde de inyección de vacuna de melanoma conjugada a DNP. La vacuna de DNP se repitió cada 28 días. Se les proporcionó ciclofosfamida antes de los dos primeros ciclos. La vacuna consistía en 10 x 10^{6} - 25 x 10^{6} células de melanoma conjugadas a DNP irradiadas (2500 R) autólogas y crioconservadas conjugadas a DNP y mezcladas con BCG. Todas las preparaciones tumorales contenían linfocitos que eran los residuos de tejido de nódulos linfáticos infiltrados con tumor. El suero y la PBL fueron recogidos para los siguientes valores del tiempo: día 0 (antes de la sensibilización), día 14 (2 semanas después de la sensibilización con DNFB), día 63 (después de 2 vacunas), día 119 (después de 4 vacunas), día 175 (después de 6 vacunas) y día 231 (después de 8 vacunas).

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Reactivos celulares

Se separó PBL mediante centrifugación de gradiente de densidad en metrizoato Ficoll. Se pusieron en suspensión en un medio de congelación (RPMI-1640 (Mediatech, Washington DC) + 1% albúmina humana + 10 de dimetil-sulfóxido) se congelaron en un congelador a velocidad controlada y se almacenaron en nitrógeno líquido. Se realizó una tipificación en HLA de PBL por el laboratorio clínico del hospital universitario Thomas Jefferson.

Las células de melanoma fueron enzimáticamente extraídas de masas metastáticos según el procedimiento de Berd, D., et al., (1986) supra, y fueron crioconservadas. Se derivaron líneas celulares de estas suspensiones y se mantuvieron en RPMI-1640 con 10% de suero de ternera fetal. Las líneas celulares de melanoma de los pacientes usados en este estudio se distinguieron mediante diferencias de clase I de MHC determinadas por análisis citométricos de flujo con un conjunto de anticuerpos monoclonales obtenidos de la colección de cultivos de tipo americano (HB82 = HLA-A2, HB122 = HLA-A3, HB164 = HLA-A11,24).

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Conjugación a hapteno

La PBL fue modificada con DNP mediante una incubación de 30 minutos con DNFB o DNBS acuosos, según los procedimientos de Miller, S. D. y H. N. Claman, J. Immunol., 1976, 117, 1519 y Geczy, A. F. y A. Baumgarten, Immunology, 1970, 19, 189 respectivamente; los dos procedimientos produjeron resultados equivalentes. Para testigos de la especifidad, las células fueron modificadas con TNP mediante incubación con TNBS, o con oxazolona según los procedimientos de Fujiwara, H., et al., J. Immunol., 1980, 124, 863 y Boerrigter, G. H. y R. J. Scheper, J. Invest. Dermatol., 1987, 88, 3 respectivamente. La conjugación con hapteno se repitió con células de melanoma.

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Hipersensibilidad de tipo retrasado (DTH)

Las PBL crioconservadas se descongelaron, se lavaron y se volvieron a poner en suspensión en solución de sales equilibrada de Hanks. Las células se dividieron en tres grupos, sin modificar, conjugadas a DNP, y conjugadas a TNP. Después de lavar, se pusieron en suspensión 1 x 10^{6} células de melanoma o 3 x 10^{6} PBL en 0,1 ml de solución de Hanks y se inyectaron por vía intradermal en el antebrazo. Se determinó la DTH a las 48 horas midiendo el diámetro medio de induración. El ensayo de DTH se repitió con células de melanoma.

Todos los pacientes desarrollaron DTH para PBL autóloga modificada con DNP (Figura 1). Las respuestas de DTH eran evidentes dos semanas después de la aplicación tópica de DNFB (día 14) y seguidamente permanecieron estables durante todo el período de administración mensual de vacunas. Las suspensiones de células de melanoma autólogas conjugadas DNP provocaron un DTH más fuerte que DNP-PBL (SE: PBL media = 13,3 mm \pm 1,3 mm, células de melanoma = 21,9 mm \pm 3.6 mm; p < 0,01). La DTH era específica para "auto" modificada con DNP ya que la PBL autóloga conjugada a TNP no provocó respuesta en 50 pacientes ensayados.

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Anticuerpo anti-DNP

Se desarrolló un ensayo ELISA revistiendo pocillos de microtitulación con PBL conjugado a DNP. Este procedimiento se encontró que está preferible para revestir placas con albúmina conjugada a DNP porque daba lugar a lecturas de fondo inferiores con suero de pacientes previamente inmunizados. Se añadió PBL conjugado a DNP (5 x 10^{5} en 0,1 ml) a cada pocillo de una placa de 96 pocillos de fondo liso. Las células se fijaron a placa mediante secado seguido de una exposición de 5 minutos a metanol al 100%. Seguidamente las placas se lavaron 5 veces con solución salina tamponada con fosfato + 0,05% de Tween-20. Se añadieron diluciones en serie de sueros del ensayo a los pocillos y la placa se incubó en una cámara humidificada a 37ºC durante 1 hora. Después de la incubación, la placa se lavó cinco veces y seguidamente se añadió inmunoglobulina anti-humana de cabra conjugada a peroxidasa de rábano silvestre (Cappel Laboatories, Malvern, PA) a una dilución óptima predeterminada. Para detectar anticuerpos de IgG o IgM, se usaron respectivamente IgG o IgM anti-humana de cabra conjugada a peroxidasa. Después de 1 hora de incubación a 37ºC se lavó cinco veces y se añadió 0,1 ml de sustrato (O-fenilendiamina, Sigma Chemical Co., St. Louis, MO) a cada pocillo seguido de 50 \mul de peróxido de hidrógeno al 0,12%. La placa se leyó en un lector de placas ELISA.

El ensayo se validó usando un anticuerpo monoclonal anti-DNP de múrido (clon SPE-7; Sigma ImmunoChemicals) y un anticuerpo de inmunoglobulina anti-ratón conjugado a peroxidasa como el reactivo de la segunda etapa. Posteriormente, el testigo positivo consistió en una muestra de suero de un paciente que había recibido múltiples inyecciones de vacuna de DNP. El título de anticuerpo anti-DNP de cada muestra de suero se definió como sigue:

(OD pico de muestra) X (recíproca de la discusión que tiene una OD igual a la mitad de la OD pico del testigo positivo)

Butler, J. E., Methods Enzymol., 1981, 73, 482.

El anticuerpo anti-DNP se desarrolló en 24 de 27 pacientes ensayados (Figura 2). Contrariamente al DTH el anticuerpo no fue inducido mediante aplicación tópica de DNFB (día 14). En 19 pacientes, los títulos aumentaron por encima de los niveles previos a la inmunización después de dos inyecciones intradermales de células de melanoma conjugadas a DNP (día 63); en 5 pacientes adicionales, se encontraron títulos significativos solamente después de 4 a 6 vacunas. En todos los pacientes se detectó anticuerpo IgG; se encontró IgM anti-DNP solamente en tres pacientes. El anticuerpo anti-DNP tuvo una reacción cruzada con TNP, mostrada por la unión a células modificadas con TNP, pero no al hapteno no relacionado, oxazolona.

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Desarrollo de líneas de células T

Se mezcló PBL (1 x 10^{6}) con células linfoblastoides B autólogas conjugadas a DNP (1 x 10^{5}) en placas de 24 pocillos de fondo liso en un medio de cultivo de linfocitos. Después de 7 días de cultivo, se añadieron 100 U/ml de IL2 (una donación de Cetus Oncology, Emeryville, CA). Los cultivos de células T en expansión se mantuvieron en medio +IL2 y se dividieron en la medida necesaria para mantener una concertación de aproximadamente 2 x 10^{6} células en un pocillo de 22 mm de diámetro. Cada 14 días se volvieron a estimular los cultivos añadiendo células linfoblastoides B autólogas conjugadas DNP. Los fenotipos se determinaron mediante citometría de flujo con un conjunto de anticuerpos monoclonales (Becton-Dickinson, San Jose, CA). La separación de células T CD8+ y CD4+ se realizó mediante fijación indirecta en la que células T revestidas con anticuerpos monoclonales anti-CD8 o anti-CD4 fueron adheridas a platos revestidos con anti-inmunoglobulina usando técnicas estándar según los procedimientos de Wysocki, L. J. y V. L. Sato, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1978, 75, 2844; las células adherente se aislaron y se expandieron con estimuladores modificados con DNP y con IL2.

Las subpoblaciones fenotípicamente homogéneas de células T se obtuvieron cultivando a una dilución limitante en pocillos de microtitulación de fondo redondo en un medio de cultivo de linfocitos que contenía 2 x 10^{5} células alimentadoras alógenicas irradiadas, 200 U/ml de IL2 y fitohemaglutinina. Los pocillos con colonias de linfocitos en crecimiento se seleccionaron en cuanto a la capacidad de proliferar en respuesta a células linfoblastoides B modificadas con DNP. Los pocillos positivos se expandieron en IL2 y se volvieron a estimular con células linfoblastoides B autólogas conjugadas a DNP cada 14 días.

Respuestas linfoproliferativas- Se ensayaron PBL como células respondedoras. Se pusieron en suspensión en medio de cultivo de linfocitos (RPMI-1640, suero AB* humano reagrupado al 10%, complemento de medios de insulina-transferrina-selenita (Sigma Chemical Co.), L-glutamina 2 mM, 1% de aminoácidos no esenciales, tampón HEPES 25 mM, penicilina + estreptomicina) y se añadieron a placas de microtitulación de fondo redondo de 96 pocillos a 1 x 10^{5} células/pocillo. Las células estimuladoras incluían: 1) PBL autólogo o alógeno, 2) líneas linfoblastoides B autólogas o alógenas preparadas mediante transfección con virus Epstein-Barr, 3) células de melanoma autólogas cultivadas; fueron inactivadas mediante irradiación (5000 R). En la mayoría de los experimentos, la reacción de respuesta:estimuladora fue 1:1. Las placas se incubaron en un incubador de CO_{2} a 37ºC durante 5 días; seguidamente los pocillos fueron sometidos a impulsos con IUDR marcado con ^{125}I (ICN-Radiochemical, Costa Mesa, CA) durante 6 horas, se recolectaron con una dispositivo recolector automático y se contaron en un contador gamma. Se calculó la media de pocillos por triplicado. Las células T cultivadas se ensayaron también en cuanto a una respuesta linfoproliferativa de acuerdo con los procedimientos anteriores.

Los PBL obtenidos y crioconservados a partir de 4 pacientes en el momento de máxima reactividad de DTH para células autólogas modificadas con DNP fueron seguidamente descongelados y ensayados en cuanto a respuestas proliferativas in vitro. Los PBL de la totalidad de los cuatro pacientes proliferaron tras una estimulación con células modificadas con DNP (Figura 3). La cinética del desarrollo de la respuesta proliferativa en uno de estos pacientes (DM2) se muestran en la Figura 4. La aplicación de DNFB solo (día 14) no dio lugar números detectables de células respondedoras en circulación. Los PBL reactivos se detectaron después de dos inyecciones de vacuna de DNP (día 63) y se continuaron detectando durante el período de 8 meses de tratamiento con vacuna.

La respuesta proliferativa para células modificadas con DNP fue específica, ya que ni los PBL sin conjugar ni los PBL modificados con TNP provocaron respuestas (Figura 5). Los PBL posteriores a la vacuna proliferaron también bruscamente cuando fueron estimulados con una línea celular de melanoma modificada con DNP derivada de tejido tumoral autólogo. Cuando fueron estimulados con linfocitos alógenos, los PBL exhibieron la reacción de linfocitos mixtos esperada que era 3 a 5 veces mayor que las respuestas de DNP.

Los linfocitos T en circulación de uno de estos pacientes (DM2) se expandieron in vitro mediante cultivo IL2 y se repitió la nueva estimulación con células linfoblastoides B modificadas con DNP. Después de cuatro semanas de expansión, las células T eran 70% CD3+, CD8+ y 30% CD3+, CD4+. Proliferaron cuando fueron estimuladas con células linfoblastoides B autólogas modificadas con DNP o células de melanoma cultivadas modificadas con DNP, pero no mediante células autólogas sin conjugar (Figura 6). Estas células fueron separadas mediante fijación positiva en poblaciones enriquecidas con CD8 y enriquecidas con CD4 que eran un 98% puras según se determinó mediante análisis de citometría de flujo. Como se muestra en la Figura 7, las células T enriquecidas con CD4 y enriquecidas con CD8 exhibían una respuesta proliferativa a células linfoblastoides B autólogas modificadas con DNP. Sin embargo, solamente las células T CD8+ T respondieron a células de melanoma autólogas modificadas con DNP. Este resultado puede ser debido a la baja expresión constitutiva (< 5%) de la clase II de MHC por la línea celular de
melanoma.

Las células T expandidas fueron ensayadas en cuanto a la capacidad para producir citoquinas al ser estimuladas con células linfoblastoides B autólogas modificadas con DNP. Como se muestra en la Figura 8, produjeron gamma-interferón pero no IL4. Para determinar si las células T CD4+ y CD8+ estaban involucradas en la respuesta de citoquinas, se analizaron las sublíneas que fueron obtenidas disponiendo en placas células T a una dilución limitante. Cada uno de estos cultivos eran homogéneo con respecto a la expresión de CD4 y CDE. Tres de estas sublíneas (dos CD4+, una CD8+) fueron ensayadas en cuanto a a la respuesta de citoquinas para células linfoblastoides B modificadas con DNP. La totalidad de las tres produjo gamma-interferón, mientras que ninguna produjo IL4
(Figura 8).

Producción de citoquinas - se añadieron células T a placas de microtitulación de fondo redondo a 1 x 10^{5} células/pocillo. Se añadió un número igual de estimuladores (células linfoblastoides B autólogas modificadas con DNP), y las materias sobrenadantes se recogieron después de 18 horas de incubación. Se usaron estuches de ensayo ELISA disponibles en el comercio para medir gamma-interferón (Endogen, Boston, MA; Sensibilidad = 5 pg/ml) e IL4 (R & Systems, Mineapolis, MN; Sensibilidad = 3 pg/ml).

Para determinar la dependencia de MHC de la respuesta, fueron pre-incubadas células estimuladoras con anticuerpos monoclonales para la clase I de MHC (W6/32) o la clase II MHC (L243) a una concentración de 10 \mug/ml durante una hora antes de añadir células respondedoras. Se ensayó inmunoglobulina de ratón no específica a la misma concentración como testigo negativo.

Las células T CD8+ reactivas con DNP obtenidas mediante fijación de la población en masa pudrieron ser mantenidas en un cultivo a largo plazo (> 3 meses) en medio que contenía IL2 mediante estimulación repetida con células linfoblastoides B autólogas modificadas con DNP; retuvieron el fenotipo estables, CD3+, CD8+. Dos líneas de evidencia confirmaron que su respuesta estaba restringida a clase I de MHC: 1) la producción de gamma-interferón fue bloqueada mediante la pre-incubación de células estimuladoras con anticuerpo de marco anti-clase I pero no por anticuerpo anti-clase II (Figura 9), 2) las células T pudieron responder a estimuladores alógenicos modificados con DNP que estaban adaptados en uno o dos lugares HLA-A, pero no a estimuladores que no estaban adaptados en HLA-A. Como se muestra en la Figura 10, las células T proliferaron tras una estimulación con PBL autólogo modificado con DNP (HLA-A1, A2, B8+, Bw6) y con alógenico modificado con DNP que expresaba a A1 o A2 o ambos; no se provocó ninguna respuesta por estimuladores alógenicos modificados con DNP que eran negativos para Al y A2.

Citotoxicidad - Se marcaron células de melanoma durante dos horas con ^{51}Cr (Amersham Cop, Arlington Heights, IL), y se añadieron 2500 células a pocillos de microtitulación de fondo redondo. Seguidamente se añadieron células efectoras para conseguir una serie de relaciones E:T. Después de 6 horas de incubación a 37ºC las materias sobrenadantes de separaron y se contaron en un contador gamma. La lisis se definió como:

(\{CPM_{ensayo} - CPM_{espontánea}\}/\{CPM_{total} - CPM_{espontánea}\})\ x\ 100

La citotoxicidad de la línea celular T CD8+ se ensayó en un ensayo de liberación de ^{51}Cr con células de melanoma autólogas como dianas. Para minimizar la liberación espontánea de ^{51}Cr, la modificación de DNP m se realizó con DNBS en lugar de DNFB. Las células T lisaron células de melanoma autólogas modificadas con DNP pero no células de melanoma alógenas (clase I, desadaptada) (Figuras 11a, 11b). Había una relación directa entre la susceptibilidad a la lisis y el grado de modificación de DNP, según se determinó por medio de la concentración de DNBS usado. Ni las dianas autólogas ni las alogénicas modificadas con TNP fueron lisadas.

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Ejemplo 6

Se recogieron datos clínicos para sugerir que una vacuna de melanoma autóloga conjugada a DNP prologa la supervivencia exenta de enfermedad (DFS) y supervivencia total (TS) en pacientes de melanoma con metástasis de nódulos linfáticos regionales masivos pero extirpables. Cuarenta y siete pacientes experimentaron una linfadenectomía estándar con extirpación de masas metastáticos. Las células tumorales fueron enzimáticamente de estos tejidos y crioconservadas. Las vacunas consistían en 10 x 10^{6} a 20 x 10^{6} células de melanoma irradiadas (2500 cGy), conjugadas a DNP y mezcladas con BCG. Fueron inyectadas i.d. cada 28 días durante un total de 8 tratamientos. Se suministró ciclofosfamida, 300 mg/M^{2} i.v. 3 días antes de las dos primeras vacunas solamente. La DFS y TS de estos pacientes se compararon con las de 22 pacientes de melanoma con metástasis nodales extirpadas previamente tratadas con una vacuna no conjugada, véase el Ejemplo 4. De 36 pacientes con melanoma de fase 3 (masa palpable en una región de nódulos linfáticos), 22 estaban exentos de enfermedad con un seguimiento mediano de 33 meses. Una análisis de Kaplan-Meir proyecta una DFS y TS a los 3 años de 59% y 71%, respectivamente. Por el contrario, la DFS y TS de pacientes de fase 3 tratados con vacuna sin conjugar era de 22% y 27% respectivamente (p = 0,01, ensayo de Mantel-Cox). De 11 pacientes de fase 4 (masa palpable en dos regiones de nódulos linfáticos), 5 eran NED (sin evidencia de enfermedad) con un seguimiento mediano de 41 meses. Para pacientes tanto de fase 3 como de fase 4, la tasa más elevada de recaída estaba en los 6 primeros meses, un momento en que la inmunidad anti-melanoma puede que todavía no se haya establecido. Este experimento estará seguido de un esquema acelerado de inmunizaciones para reducir la tasa de recaídas tempranas y mejorar el resultado clínico global. Los pacientes se compararon con su estado antes del tratamiento con la vacuna. Los pacientes tratados antes del estudio con la vacuna fueron retirados del tratamiento uno a dos meses antes de comenzar el estudio con la vacuna. Consecuentemente, los pacientes estaban sin tratar al comienzo del estudio con la vacuna.

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Ejemplo 7

Materiales y procedimientos

Tejido y líneas celulares de melanoma humano - El tejido se obtuvo de pacientes con melanoma metastático antes de entrar en el programa de vacunación y para valores del tiempo posteriores a la vacunación. El protocolo clínico para la administración de vacuna de DNP se realizó de acuerdo con Berd, D., et al., Cancer Res. 199151:2731-2734. A continuación de una cirugía, la muestra de tumor fue transportada al laboratorio, el tejido tumoral se aisló de las fascias y tejido conectivo circundante, y trozos de tumor que median 2-4 mm^{3} fueron congelados súbitamente en nitrógeno líquido. Se hicieron derivar líneas celulares de melanoma de las mismas muestras a partir de digestos de enzimas (DNAsa y colagenasa) del tumor y se propagaron como se describe por Berd, D., et 1986 46:2572-2577.

Aislamiento de RNA y amplificación a través de RT-PCR - Se extrajo RNA total de tejidos congelados triturando en isotiocianato de guanidio, seguido de asilamiento usando un gradiente de CsCl como se describe por Lattime, E.C., et al., J. Immunol. 1988 144:3422-3428. Para minimizar la pérdida de RNA se añadieron 15 \mug de RNA ribosomal de E. coli (Sigma Chemical Cop., St. Louis, MO) a cada muestra. El RNA aislado se volvió a poner en suspensión en agua destilada desionizada tratada con pirocarbonato de dietilo (DEPC-tx) (Sigma). La síntesis de cDNA se realizó usando 10 \mug de RNA total, cebador Romdo (Gibco BRL, Gaithersburg, MD) y tampón RT en agua de DEPC-tx. Este se incubó a 65ºC durante 10 minutos y seguidamente se coloco a 4ºC. A esto se añadió DTT 10 mM (Gibco BRL), dATP, dCTP, dTTP, dTTP cada uno 0,5 mM (Gibco BRL) y 500 U de MMLV-RT (Gibco BRL) para conseguir un volumen de reacción final de 50 \mul. Las muestras se incubaron a 37ºC durante 1 hora y seguidamente se calentaron a 95ºC durante 5 minutos.

Para una amplificación mediante PCR, se añadieron seguidamente 5 \mul de cada cDNA a tubos de reacción MicroAmp (Perkin Elmer, Nowalk, CT) que contenían tampón de reacción PCR, dATP, dCTP, dGTP, dTTP 0,2 mM cada uno, 1,25 U de AmpliTaq DNA polimerasa (Perkin Elmer), las concentraciones de MgCl_{2} que se determinó que eran óptimas para cada par de cebadores (concentraciones finales de 1,5-6,0 mM), y 0,5 mM para cada uno de los pares de cebadores apropiados en un volumen final de 50 \mul. Los pares de cebadores usados en este estudio incluían \beta-actina, TNF-\alpha, IL-4, IFN\gamma, (South San Francisco, CA) e IL10 (Clontech, Palo Alto, CA). La \beta-actina servía como un patrón para una comparación relativa a la expresión de mRNA entre muestras, así como un testigo para reacción RT y PCR. Las muestras de PCR fueron amplificadas usando un termociclador GeneAmp System 9600, Perkin Elmer. Cada muestra fue desnaturalizada a 94ºC durante 37 s, reasociada a 55ºC durante 45 s y extendida a 72ºC durante 60 s durante 39 ciclos, seguido de una extensión de 10 minutos a 72ºC.

Los productos de PCR y los marcadores de tamaños (Novagen, Madison, WI) se separaron en un gel de agarosa al 2,0% (FMC BioProducts, Rockly, ME). El gel se tiñó con bromuro de etidio, se visualizó y se fotografío bajo iluminación UV. Una electroforesis de los productos de PCR puso de manifiesto una banda correspondiente al tamaño de fragmentos previsto para cada conjunto de cebadores. El RNA trascrito no inverso se sometió a amplificación mediante PCR como un testigo para la contaminación de DNA genómico.

Las suspensiones de células disociadas de enzimas crioconservadas de tejidos de melanoma se encontró que no eran adecuadas para un análisis de RNA. Estas muestras habitualmente expresaban mRNA para todas las citoquinas ensayadas, probablemente como consecuencia de una activación mediante el procedimiento de disociación.

Histología y RT-PCR in situ - El DNA de IL10 resultante se amplificó usando los mismos cebadores anteriormente indicados y usando una metodología según Bagasra, O., et al., J. Immunol. Meth. 1993 158:131-145.

mRNA de citoquinas en biopsias inflamadas exteriores a la vacunación - Aunque el melanoma metastático se caracteriza por una escasez de la infiltración linfocitica (Elder et al., "The surgical pathology of cutaneous malignant melanoma". In: W.H. Clark, Jr., et al. (Eds.), Human Malignant Melanoma, pág. 100, New York: Grune y Stratton 1979), la administración de una vacuna de DNP induce la infiltración de células T en masas (Berd et al., 1991 supra.). Se estudiaron ocho (8) metástasis subcutáneas (de 4 pacientes) que habían desarrollado inflamación a continuación del tratamiento con la vacuna y se compararon con 3 metástasis subcutáneas extirpadas antes de la vacuna y 4 metástasis posteriores a la vacuna que no consiguieron desarrollar una respuesta inflamatoria. Posteriormente a la vacuna, las biopsias inflamadas contenían mRNA para IFN\gamma (5/8), IL4 (4/8) o ambas (3/8). Por el contrario, ni el mRNA de IFN\gamma ni el mRNA de IL4 fue detectado en las 7 muestras testigos. La totalidad menos uno de estos 15 tejidos expresaban mRNA para IL10. La Figura 14 muestra la expresión mRNA de citoquina para una biopsia representativa posterior a la vacuna infiltrada con células T con la correspondiente histología.

Metástasis de nódulos linfáticos - Se estudió también un grupo de biopsias de metástasis de nódulos linfáticos de melanoma. Histológicamente, estas lesiones se caracterizan por una abundancia de linfocitos (Figura 15B) que se cree que son los residuos de los linfocitos de nódulos linfáticos infiltrados en tumores (Cardi, et al., Cancer Res. 1989 49:6562-6565). De las 10 biopsias de nódulos linfáticos estudiadas, solamente una expresada mRNA para IFN\gamma; esta muestra, y una muestra adicional, contenían mRNA para IL4. Sin embargo, la totalidad de las 10 muestras contenían mRNA para IL10. La Figura 15 muestra la expresión de mRNA de citoquinas para una metástasis representativa de nódulos linfáticos junto con la correspondiente histología.

Producción de L10 por metástasis y líneas celulares de melanoma - Como se indicó anteriormente, la expresión de mRNA de IL10 se observó en 24/25 metástasis de melanoma (Figura 16). Como era independiente de la expresión IFN\gamma o IL4 y no se correlacionaba con la infiltración de células T, las células de melanoma, en lugar de los linfocitos, pueden ser la fuente de IL10. Se usaron dos aproximaciones para ensayar está hipótesis. En primer lugar se examinaron líneas celulares derivadas de dos tumores metastáticos anteriormente descritos. Como se ilustra en la Figura 17A, tanto las líneas celulares como el tejido del que derivaban expresaban mRNA de IL10.

Las dos líneas celulares producían IL10, según se determinó mediante un ensayo de materias sobrenadantes de cultivo después de 72 horas de incubación (concentraciones de IL10: 760 pg/ml y 10 pg/ml, respectivamente). En segundo lugar, se estudió la expresión de mRNA de IL10 en una sección de tejido de una metástasis de melanoma usando RT-PCR in situ. Como se observa en la Figura 17B, el mRNA de IL10 está asociado en células de melanoma y no en elementos no tumorales.

El mRNA de TNF se expresa en metástasis de melanoma - El mRNA para TNF en biopsias de carcinoma de colón humano usando una hibridación in situ (Naylor, M.S., et al., Cancer Res. 1990 50:4436-4440), y la resistencia a TNF están asociadas con el crecimiento tumoral in vivo (Lattime, E.C. y Stutman, O., J. Immunol. 1989 143:4317-4323). El mRNA de TNF se detectó en 6/23 muestras de melanoma. Había una asociación con la inflamación inducida por vacuna de DNP: 4/7 biopsias posteriores a la vacuna infiltradas con células T eran positivas frente a 2/6 muestras previas a la vacuna o posteriores a la vacuna no infiltradas.

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Ejemplo 8

Este ejemplo describe péptidos de tumores modificados con dinitrofenilo para la inmunoterapia del cáncer.

Se añadió virus Eprein barr (EBV) a células linfoblastoides B en cultivo. Las células linfoblastoides B se transformaron en tumor de células B a partir de los linfocitos del propio paciente. El melanoma de una metástasis se cultivó en RPMI 1640 + 10% de suero de ternera fetal o 10% de suero humano apartado. Las células no adheridas se lavaron con medio RPMI. Cuando las células eran confluentes, se desprendieron con 0,1% de EDTA y se almacenaron en dos matraces. Este procedimiento continuó durante aproximadamente 10 a aproximadamente 30 almacenamientos. Para examinar la producción de gamma-interferón por células T, se obtuvieron linfocitos de la sangre de un paciente. Se mezclaron aproximadamente 1.000.000 linfocitos con células de melanoma autólogas modificadas con DNP para estimular células T. Cada siete días, se añadieron 100 U/ml de interleucina-2. Las células T se expandieron por almacenamiento como se describió anteriormente. Las células T seguidamente se volvieron a estimular por medio de células de melanoma autólogas modificadas con DNP. Resultó una población enriquecida de células T que era respondedora a las células de melanoma autólogas modificadas con DNP. La estimulación se determinó mediante la producción de gamma-interferón por las células T. Generalmente se considero la producción de gamma-interferón a más de 15 picogramos/ml. Estas células T se usaron seguidamente para ensayar el péptido.

Se extrajeron péptidos pequeños de 4 tipos de células, todas generadas de un único paciente: 1) linfoblastoide B, 2) células linfoblastoides B modificadas con dinitrofenilo (DNP), 3) células de melanoma cultivadas, 4) células de melanoma cultivadas modificadas con DNP. Las células se pusieron en suspensión en 0,1% de ácido trifluoroacético, se disgregaron, se sometieron a ultrasonidos y se centrifugaron a 100.000 xg durante 90 minutos. El material en la materia sobrenadante de peso molecular > 10.000 se separó por medio de un filtro Centricon 10. El material restante se separó en una columna de HPLC de fase invertida. Las fracciones individuales se recogieron, se secaron, se volvieron a poner en suspensión en el medio de cultivo y se añadieron a células linfoblastoides B autólogas, que se unieron y presentaron los péptidos. Estas células B impulsadas por péptidos fueron ensayadas en cuanto a la capacidad de estimular una línea celular de linfocitos T que estaba específicamente sensibilizada para células de melanoma autólogas modificadas con DNP.

Inicialmente las 50 fracciones de HPLC (10 \mul de cada muestra) se reagruparon en 5 grupos de 10 fracciones cada una. Como se muestra en la Figura 13, solamente los péptidos derivados de células de melanoma modificadas con DNP (DNP-MEL) o células B modificadas con DNP (DNP-LY) eran estimuladoras, y solamente la agrupación nº 2 era positiva.

Cada una de las fracciones individuales de la agrupación nº 2 fue analizada realizando el ensayo de estimulación de células de T con cada fracción en la agrupación 2; se encontró actividad solamente en las fracciones nº 17 y nº 18, y el péptido de DNP-MEL estimuló dos veces más producción de gamma-interferón que DNP-LY.

Estos resultados indican que una única fracción de HPLC de la preparación de péptidos de bajo peso molecular contiene el péptido o péptidos responsables de la estimulación de células T sensibilizadas para células de melanoma modificadas con DNP.

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Ejemplo 9

Este ejemplo determinará la inhibición de la estimulación de péptidos por un anticuerpo anti-DNP.

El experimento será igual al descrito para el Ejemplo 8 con una excepción después de añadir péptido a las células linfoblastoides B, y justo antes de añadir las células T respondedoras, se añadieron concentraciones variables (1-100 \mug/ml) de anticuerpo anti-DNP a muestras diferentes. El anticuerpo anti-DNP puede ser obtenido de la entidad ATCC, hibridoma nº CRL-1968, o un anticuerpo similar. Si la estimulación está provocada por péptidos modificados con DNP, el anticuerpo los inhibirá. Se espera que las fracciones 17 y 18 sean inhibidas por el anticuerpo.

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Ejemplo 10

El Ejemplo 10 se espera que determine si las células T respondedoras con CD4 + CD8+.

El experimento será igual al descrito para el Ejemplo 8 con una excepción. Las células T respondedoras se fraccionarán en subconjuntos antes de ser añadidas a las células linfoblastoides B impulsadas por péptidos. Esto se realiza mezclando las células T con gránulos magnéticos revestidos con anticuerpos anti-CD4 o anti-CD8 (obtenidos en el comercio de la empresa Immunotech, Inc., Westbrook, Maine). Seguidamente los gránulos y las células que se han unido a ellos son separados con un imán. Las células que no son de unión se lavan en medio de cultivo de tejido (RPMI + 10% de suero humano agrupado), se cuentan y se añaden a pocillos de microtitulación para la medición de la estimulación.

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Ejemplo 11

El Ejemplo 11 describe membranas tumorales modificadas con dinitrofenilo para una inmunoterapia del cáncer.

Las membranas de células de melanoma cultivadas de un paciente se prepararon según el procedimiento de Heike et al., J. Immunotherapy 1994 15:165-174. Las células de melanoma se conjugaron a dinitrofenilo (DNP) según los procedimientos de Miller y Claman, J. Immunology 1976 117:1519-1526. Las células se pusieron en suspensión en 5 volúmenes de tampón de bicarbonato de sodio 30 mM con fluoruro de fenil-metil-sulfonilo 1 mM y se disgregaron con un homogeneizador de vidrio. Las células y los núcleos intactos residuales se separaron por centrifugación a 1000 g. Seguidamente las membranas se sedimentaron por centrifugación a 100.000 g durante 90 minutos. Las membranas se volvieron a poner en suspensión en sacarosa al 8% y se congelaron a -80ºC hasta que fue necesario. Se prepararon análogamente células de melanoma para una conjugación a dinitrofenilo.

Estas membranas de células de melanoma modificadas con DNP fueron ensayadas en cuanto a su capacidad para estimular linfocitos T autólogos que habían sido sensibilizados a células de melanoma intactas modificadas con DNP. Esto se hizo incubando aproximadamente 100.000 linfocitos T/pocillo con aproximadamente 10.000 a aproximadamente 100.000 membranas de células equivalentes modificadas con DNP/pocillo y midiendo la producción de gamma-interferón (mayor que 15 picogramos). Este procedimiento se repitió incubando los linfocitos T con células de melanoma modificadas con DNP. Los resultados pusieron de manifiesto que las células de melanoma intactas y los linfocitos T de las membranas a partir de los mismos eran igualmente eficaces para estimular células T.

Este experimento, que se repitió varias veces (usando la misma muestra de pacientes) con resultados similares, indica que las células de melanoma intactas modificadas con DNP pueden ser sustituidas con membranas de melanoma modificadas con DNP para inducir una respuesta de células T.

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Ejemplo 12

El Ejemplo 12 determinara si la adición de monocitos autólogos o células dendríticas aumenta la respuesta de células T para membranas tumorales.

Se aislaran monocitos autólogos como sigue. Los linfocitos de sangre periférica se separaran de la sangre periférica mediante una centrifugación gradiente según los procedimientos de Boyum, A., Scy. J. Clin. Lab. Invest. 21, 1968 Suppl 97:77-89. Se pusieron en suspensión en medio de cultivo de tejido (RPMI-1640 + 10% de suero humano agrupado) y se añadieron a pocillos de microtitulación de plástico durante aproximadamente 2 horas con el fin de que se adhieran los mocitos. Seguidamente las células no adherentes se retiraran mediante lavado con medio de cultivo. Se añadirán diversas concentraciones de GM-CSF de (factor de estimulación de colonias de granulocitos-macrófagos, obtenido en el comercio de la empresa Immunex, Seattle, WA) para estimular el crecimiento de los monocitos. Después de aproximadamente 2-3 semanas los monocitos, considerados ahora macrófagos, se separan del plástico con EDTA al 0,1% y se añadirán en números graduados (a aproximadamente 100 a aproximadamente 100.000/pocillos) a pocillos de microtitulación de nueva aportación. Los números graduados de membranas preparados a partir de células tumorales autólogas modificadas con DNP (cuantificadas como equivalentes de células) se añadirán a la monocapa de macrófagos adherentes. Después de aproximadamente 6 a aproximadamente 24 horas se añadirán células T autólogas específicas para DNP y se incubarán durante 24 horas adicionales. Seguidamente las materias sobrenadantes se recogerán y se ensayarán en cuanto a la producción de citoquinas como, sin limitación, gamma-interferón, IL2, factor de necrosis tumoral; o en cuanto a la proliferación o estimulación de células T como mediante ^{125}IUDR, ^{3}H inhibida, o con colorantes como MTT. Por ejemplo, se añadirá ^{125}IUDR y las células se recogerán en un dispositivo recolector automático para ensayar en cuanto a la proliferación de células T. Los testigos consistirán en células T sin estimular y células T estimuladas con membranas en ausencia de macrófagos. La capacidad de las células dendríticas autólogas para aumentar la respuesta a las membranas se ensayará de la misma manera. Las células dendríticas se aislaran a partir de células mononucleares de sangre periferia y se harán crecer en cultivo de tejido según el procedimiento de O Doherty, U., et al., J. Exp. Med. 1993 178:10678-1078.

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Ejemplo 13

El Ejemplo 13 se espera que determine si los pacientes que recibieron vacuna de melanoma modificada con DNP manifiestan hipersensibilidad de tipo retrasado (DTH) a membranas de melanoma autólogas modificadas con DNP.

Los sujetos del estudio serán pacientes que hayan recibido dosis repetidas de vacuna de células de melanoma modificadas con DNP. Las membranas se prepararán a partir de células de melanoma autólogas modificadas con DNP como se describió anteriormente. Número graduados de membranas (aproximadamente 100 a aproximadamente 10.000 equivalentes de células) se lavarán en PBS, se volverán a poner en suspensión PBS y se inyectarán por vía intradermal en el antebrazo. La DTH se medirá aproximadamente 48 horas más tarde como el diámetro de induración cutánea. Los testigos consistirán en membranas de células autólogas de melanoma sin conjugar y membranas preparadas a partir de linfocitos sanguíneos autólogos.

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Ejemplo 14

El Ejemplo 14 se espera que determine si los macrófagos o células dendríticas tratan las membranas de melanoma alógenas y las presentan de una manera inmunógena a células T singénicas para esos macrófagos.

El procedimiento será similar al descrito para el Ejemplo 12, con la excepción de que las membranas estimulantes serán preparadas a partir de células de melanoma alógenas conjugadas a DNP. La hipótesis es que los macrófagos o células dendríticas de un paciente A pueden tratar in vitro membranas obtenidas de células de melanoma del paciente B. Esto da lugar ala estimulación de células T del paciente A. Este experimento puede conducir a una estrategia para una inmunización alógena. Las membranas modificadas con DNP preparadas a partir de una única línea celular alógena de melanoma, o una agrupación de líneas celulares alógenas, serían tratadas por los macrófagos o células dendríticas de un paciente in vitro. Esas células serían usadas para la inmunización.

Diversas modificaciones de la invención, además de las mostradas y descritas en la presente memoria descriptiva, serán envidas para los expertos en la técnica a partir de la descripción que antecede. Estas modificaciones pueden caer también dentro del alcance de las reivindicaciones anejas.

(1) INFORMACIÓN GENERAL:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

SOLICITANTE: Berd, David;

{}\hskip3,9cm Eisenhlohr, Lawrence; y

{}\hskip3,9cm Lattime, Edmund

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TÍTULO DE LA INVENCIÓN: COMPOSICIÓN QUE COMPRENDE UN EXTRACTO DE CÉLULAS TUMORALES Y PROCEDIMIENTO PARA USAR LA COMPOSICIÓN

\vskip0.800000\baselineskip

(IV)

DIRECCIÓN DE CORRESPONDENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

DESTINATARIO: Woodcock Washburn Kurz Mackiewicz & Norris

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

CALLE: One Liberty Place - 46th Floor

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

CIUDAD: Philadelphia

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

ESTADO: PA

\vskip0.500000\baselineskip

(E)

PAÍS: USA

\vskip0.500000\baselineskip

(F)

ZIP: 19103

\vskip0.800000\baselineskip

(v)

FORMA LEGIBLE EN ORDENADOR:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

TIPO DE MEDIO: DISKETTE, 8,3 CENTÍMETROS, 1,44 Mb DE ALMACENAMIENTO

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

ORDENADOR: IBM PS/2

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

SISTEMA OPERATIVO: PC-DOS

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

SOFTWARE: WORDPERFECT 5.1

\vskip0.800000\baselineskip

(vi)

DATOS DE LA SOLICITUD ACTUAL:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

NÚMERO DE SOLICITUD: Desconocido

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

FECHA DE PRESENTACIÓN: 7 de junio de 1.995

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

CLASIFICACIÓN: Desconocida

\vskip0.800000\baselineskip

(vii)

DATOS DE SOLICITUD ANTERIOR:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

NÚMERO DE SOLICITUD: 08/203,044

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

FECHA DE PRESENTACIÓN: 28 de febrero de 1994

\vskip0.800000\baselineskip

(viii)

INFORMACIÓN DE REPRESENTANTE/AGENTE:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

NOMBRE: Lori Y. Beardell

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

NÚMERO DE REGISTRO: 34,293

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

NÚMERO DE REFERENCIA/REGISTRO: TJU-1582

\vskip0.800000\baselineskip

(ix)

INFORMACIÓN DE TELECOMUNICACIONES:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

TELÉFONO: (215)568-3100

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TELEFAX: (215)568-3439

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO. 1:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 21 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

TIPO DE CADENA: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: ácidos nucleicos

\vskip0.800000\baselineskip

(iii)

HIPOTÉTICA: No

\vskip0.800000\baselineskip

(iv)

ANTISENTIDO: No

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO. 1:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

ATGGATGATG ATATCGCCGC G

\hfill

21

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO. 2:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 33 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

TIPO DE CADENA: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: ácidos nucleicos

\vskip0.800000\baselineskip

(iii)

HIPOTÉTICA: No

\vskip0.800000\baselineskip

(iv)

ANTISENTIDO: Sí

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO. 2:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

CTAGAAGCAT TTGCGGTGGA CGATGGAGGG GCC

\hfill

33

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO. 3:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 21 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

TIPO DE CADENA: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: ácidos nucleicos

\vskip0.800000\baselineskip

(iii)

HIPOTÉTICA: No

\vskip0.800000\baselineskip

(iv)

ANTISENTIDO: No

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO. 3:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

ATGAAATATA CAAGTTATAT C

\hfill

21

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO. 4:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 33 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

TIPO DE CADENA: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: ácidos nucleicos

\vskip0.800000\baselineskip

(iii)

HIPOTÉTICA: No

\vskip0.800000\baselineskip

(iv)

ANTISENTIDO: Sí

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO. 4:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

TTACTGGGAT GCTCTTCGAC CTCGAAACAG CAT

\hfill

33

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO. 5:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 21 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácidos nucleicos

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

TIPO DE CADENA: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: ácidos nucleicos

\vskip0.800000\baselineskip

(iii)

HIPOTÉTICA: No

\vskip0.800000\baselineskip

(iv)

ANTISENTIDO: No

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO. 5:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

ATGGGTCTCA CCTCCCAACT G

\hfill

21

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO. 6:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 33 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácidos nucleicos

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

TIPO DE CADENA: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: ácidos nucleicos

\vskip0.800000\baselineskip

(iii)

HIPOTÉTICA: No

\vskip0.800000\baselineskip

(iv)

ANTISENTIDO: Sí

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO. 6:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

TCAGCTCGAA CACTTTGAAT ATTTCTCTCT CAT

\hfill

33

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO. 7:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 32 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

TIPO DE CADENA: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: ácidos nucleicos

\vskip0.800000\baselineskip

(iii)

HIPOTÉTICA: No

\vskip0.800000\baselineskip

(iv)

ANTISENTIDO: No

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO. 7:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

AAGCTGAGAA CCAAGACCCA GACATCAAGG CG

\hfill

32

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO. 8:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 31 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácidos nucleicos

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

TIPO DE CADENA: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: ácidos nucleicos

\vskip0.800000\baselineskip

(iii)

HIPOTÉTICA: No

\vskip0.800000\baselineskip

(iv)

ANTISENTIDO: Sí

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO. 8:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

AGCTATCCCA GAGCCCCAGA TCCGATTTTG G

\hfill

31

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO. 9:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 21 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácidos nucleicos

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

TIPO DE CADENA: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: ácidos nucleicos

\vskip0.800000\baselineskip

(iii)

HIPOTÉTICA: No

\vskip0.800000\baselineskip

(iv)

ANTISENTIDO: No

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO. 9:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

ATGAGCACTG AAAGCATGAT C

\hfill

21

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO. 10:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 23 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácidos nucleicos

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

TIPO DE CADENA: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: ácidos nucleicos

\vskip0.800000\baselineskip

(iii)

HIPOTÉTICA: No

\vskip0.800000\baselineskip

(iv)

ANTISENTIDO: No

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO. 10:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

TCACAGGGCA ATGATCCCAA AGT

\hfill

23

Claims (19)

1. Una composición que comprende una cantidad terapéuticamente eficaz de un extracto de células tumorales modificadas con hapteno, en la que dicha composición estimula linfocitos de células T y es útil para el tratamiento del cáncer y en la que dicho extracto de células tumorales es una membrana de células cancerígenas modificadas con hapteno o una célula que presenta antígenos con una membrana de células cancerígenas modificadas con hapteno unida a la misma.

2. La composición de la reivindicación 1, en la que dicho extracto de células tumorales es una membrana de una célula cancerígena modificada con dinitrofenilo.

3. Una composición según la reivindicación 1, en la que dicho extracto de células tumorales es o deriva de una célula que presenta antígenos con una membrana de células cancerígenas modificadas con hapteno unida a la misma.

4. La composición de la reivindicación 1, en la que dicha célula tumoral o extracto de células tumorales es o deriva de una célula autóloga o una célula alogénica.

5. La composición de la reivindicación 1, en la que dicho tumor se selecciona entre el grupo que consiste en mamas, pulmón, colon, riñón y próstata.

6. La composición de la reivindicación 1, en la que dicho tumor es un melanoma.

7. La composición de una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en la que dicho hapteno se selecciona entre el grupo que consiste en dinitrofenilo, trinitrofenilo y N-yodoacetil-N'-(5-sulfónico-1-naftilo)-etileno-diamina.

8. La composición de la reivindicación 7, en la que dicho hapteno es dinitrofenilo.

9. La composición de una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, que comprende adicionalmente un adyuvante inmunológico.

10. La composición de la reivindicación 9, en la que dicho adyuvante inmunológico se selecciona entre el grupo que consiste en citoquinas de Bacillus Calmette-Guerin y QS-21.

11. Una composición según una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, que comprende un vehículo.

12. Una composición según la reivindicación 11, en la que dicho vehículo se selecciona entre el grupo que consiste en solución salina y medio de cultivo.

13. Una composición según una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, que comprende adicionalmente una cantidad terapéuticamente eficaz de ciclofosfamida.

14. Una composición según la reivindicación 13, en la que la ciclofosfamida está presente a una concentración de 300 mg/m^{2} de células cancerígenas.

15. Una composición según una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, que comprende adicionalmente una cantidad terapéuticamente eficaz de una citoquina seleccionada entre el grupo que consiste en interleucina-12, interleucina-2 e interleucina-13.

16. Una composición según una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, que comprende adicionalmente una cantidad terapéuticamente eficaz de una composición irradiada no haptenizada que comprende un extracto de células tumorales.

17. Una composición según una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, para ser usada en terapia.

18. Una composición según una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, para ser usada en el tratamiento del cáncer.

19. La composición de cualquiera de las reivindicaciones 17 ó 18, en la que dicho cáncer se selecciona entre le grupo que consiste en melanoma, cáncer pulmón, cáncer de colón, cáncer de mamas, cáncer de riñón y cáncer de próstata.