JPH11507633A - ハプテン修飾された腫瘍細胞抽出物及び癌を治療又はスクリーニングするための方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 癌細胞もしくは癌細胞膜、またはそのペプチドから調製したハプテン修飾した腫瘍細胞抽出物を含む新規組成物を開示する。また治療効果量のシクロフォスファミドとハプテン修飾した癌細胞抽出物をアジュバント及びサイトカインと共にあるいは無しに投与することを含む、癌治療法についても開示する。さらに治療効果判定を目的とした癌のサイトカイン産生をスクリ−ニングする方法であって、患者組織サンプルから得たサイトカイン特異的核酸を増幅して検出可能な信号を得る、前記方法も開示する。

Description

【発明の詳細な説明】 ハプテン修飾された腫瘍細胞抽出物及び 癌を治療又はスクリーニングするための方法 関連出願参照 本出願は、現在放棄された１９９０年５月８日に出願された出願第０７／５２ ０，６４９号の継続出願である現在米国特許第５，２９０，５５１号の１９９２ 年１２月４日に出願された出願第０７／９８５，３３４号の一部継続出願である １９９４年２月２８日に出願された出願第０８／２０３，００４号の一部継続出 願である。 政府付与参照 本明細書中に記載された発明は、ＮＩＨ癌研究付与、付与番号ＣＡ３９２４８ からの付与または授与による研究中に得られた。米国政府は本発明におけるいく つかの権利を有することができる。本発明の一部は、１９９０年４月１８に米国 特許商標局に提出された開示書類に開示された。 背景技術 腫瘍細胞が正常細胞に存在しない特異抗原（ＴＳＡ）を有すると共に、これら の抗原に対する免疫応答により個体の腫瘍が拒絶され得ることが、１９６０年代 に理論上想定された。その後、ＴＳＡに対する免疫応答は、細胞に新しい免疫決 定因子を導入することにより増大し得ることが示唆された、Ｍｉｔｃｈｉｓｏｎ 、Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔ、Ｐｒｏｃ．、１９７０、２、９２。ハプテン、タンパ ク質、ウイルスコート抗原、移植抗原、または異種（ｘｅｎｏｇｅｎｏｕｓ）細 胞抗原であるこのような「ヘルパー決定因子」は腫瘍細胞群に導入することがで きるであろう。次に、これらの細胞は非修飾腫瘍細胞の増殖に耐性であることが 予想される個体に注入される。臨床的に、随伴ＴＳＡに対する反応が増大し、そ の他の場合は耐性となるような腫瘍細胞が破壊される結果として、ヘルパー決定 因 子に対して免疫反応が起こることが望まれた。上記のＭｉｔｃｈｉｓｏｎも、１ ）非修飾細胞は、それらの増殖速度が低下し、または免疫攻撃に対する感受性が 増大するという点で単に衰弱すること、２）ヘルパー決定因子は単に攻撃点を供 給し、修飾細胞がＴＳＡに対して向けられない免疫応答により殺傷できるように すること、３）ヘルパー決定因子が、抗体との結合または免疫化のために体の正 しい部分、特にリンパ節における細胞の局在促進などアジュバント作用を有する ことを含むヘルパー決定因子作用のいくつかの様式を示している。 Ｆｕｊｉｗａｒａら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．、１９８４ａ、１３２、１５７１ は、ハプテンであるトリニトロフェニル（ＴＮＰ）と接合した腫瘍細胞が、ハプ テン特異的サプレッサーＴ細胞の非存在下にマウスを最初にハプテンに感作する という条件で、マウス系における非修飾腫瘍細胞に対して全身性免疫を誘発する ことを示した。処置マウスからの脾細胞は、完全にかつ特異的に未処置受容動物 における腫瘍の増殖を予防した。Ｆｌｏｏｄら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．、１９８ ４、１３８、３５７３は、ＴＮＰ接合型紫外線光誘発「退行」（ｒｅｇｒｅｓｓ ｏｒ）腫瘍で免疫化したマウスが、その他の場合は非免疫性であるＴＮＰ接合「 前進」（ｐｒｏｇｒｅｓｓｏｒ）腫瘍を拒絶し得ることを示した。さらに、これ らのマウスは引き続き非接合型「前進」腫瘍によるチャレンジに対して耐性であ った。別の実験系において、Ｆｕｊｉｗａｒａら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．、１９ ８４ｂ、１３３、５１０は、シクロホフファミドの前処置後にトリニトロクロロ ベンゼン（ＴＮＣＢ）に感作したマウスが、腫瘍細胞の生体内ハプテン化により 大きな（１０ｍｍ）腫瘍が治癒され、これらの動物が非接合型腫瘍細胞によるチ ャレンジに対して特異的に耐性であることを明らかにした。 非修飾組織と交差反応するＴ細胞の存在が最近になって明らかにされている。 Ｗｅｌｔｚｉｅｎおよび共同研究者は、ＴＮＰ修飾同系リンパ球で免疫化したマ ウスから発生したクラスＩのＭＨＣ限定Ｔ細胞クローンが、ＭＨＣ結合ＴＮＰ− 修飾「自己」ペプチドに対して応答することを示している。Ｏｒｔｍａｎｎ，Ｂ ．ら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．、１９９２、１４８、１４４５。また、ＴＮＰ修飾 リンパ球でのマウスの免疫化により、二次的に増殖性を示すと共に試験管内で（ ｉｎ ｖｉｔｒｏ）ＴＮＰ−修飾細胞に対する細胞毒性反応を示す脾臓Ｔ細胞が 発 現することが確認されている。Ｓｈｅａｒｅｒ，Ｇ．Ｍ．Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕ ｎｏｌ．、１９７４、４、５２７。ＤＮＰ−またはＴＮＰ−修飾自己由来細胞で の免疫化により誘発されるリンパ球の、非修飾自己由来細胞に対する応答の可能 性は、１）薬物誘発自己免疫疾患、および２）癌免疫療法という２つの臨床的問 題に関連するとみられる点できわめて興味深い。前者に関しては、摂取薬物がハ プテンとして作用し、Ｔ細胞により認識される免疫複合体を形成する正常組織タ ンパク質と結合することが示されている。Ｔｓｕｔｓｕｉ，Ｈ．ら、Ｊ．Ｉｍｍ ｕｎｏｌ．、１９９２、１４９、７０６。その後、有害薬物の中止後または非存 在でも全身性エリテマトーデスなど自己免疫疾患が発現し持続することがある。 これは非修飾組織と交差反応するＴリンパ球の偶発的発生を意味するとみられる 。 その他の研究者により、細胞からの膜またはペプチド、および１例においては ウイルスからのペプチドが試験管内でＴ細胞リンパ球反応を誘発することが示さ れている。Ｈｅｉｋｅ，Ｍ．ら、Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒａｐｙ、１９９４ １５：１６５−１７４は、血漿膜調製物でマウスおよびヒト抗腫瘍細胞毒性Ｔリ ンパ球（ＣＴＬ）を刺激する方法を開示している。この引例は、ＣＴＬ反応の報 告における差違を確認し、これらの差違を例えば使用した腫瘍の免疫原性および 免疫化の様式と関連づけるものである。 その他の研究者は、細胞毒性Ｔ細胞によるヒト黒色腫細胞の認識が多くのペプ チドにより媒介されることを報告している。Ｓｌｉｎｇｌｕｆｆ，Ｃ．ら、Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ １９９３ １５０：２９５５−２９６３、Ｗｏｌｆｅｌ ，Ｔ．ら、Ｉｎｔ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ １９９４ ５７：４１３−４１８、およ びＣａｓｔｅｌｌｉ，Ｃ．ら、Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１９９５ １８１：３６３ −３６３、それぞれの開示はその全体について本明細書中で参考として援用する 。これらの引例はそれぞれ、所定の腫瘍に特徴的である多くのＴ細胞規定エピト ープが存在することを示している。これらの引例はいずれも、腫瘍細胞のハプテ ン修飾により得られる腫瘍細胞抽出物を開示していない。 これらの実験の共通の特徴は、サプレッサー細胞が誘発されない境下でのハプ テンによる感作である。シクロホスファミドで前処置したＴＮＣＢ−感作マウス からの脾細胞は、放射能耐性「増幅ヘルパー機能」を示した。すなわち、これら の細胞は抗−ＴＮＰ細胞毒性の試験管内（ｉｎ ｖｉｔｒｏ）発生を特異的に増 大させた。さらに、これらの増幅ヘルパー細胞がＴＮＰ接合型自己由来リンパ球 に試験管内曝露することにより活性化されていると、腫瘍抗原を含む無関係の抗 原に対する細胞毒性も増大することが可能であった（Ｆｕｊｉｗａｒａら、１９ ８４ｂ）。上記のＦｌｏｏｄら（１９８７）は、この増幅ヘルパー活性がＬｙｔ^- １⁺、Ｌｙｔ^-２^-、Ｌ３Ｔ４⁺、Ｉ^-Ｊ⁺の表現型を有するＴ細胞により媒介され たことを示すと共に、これらの細胞が新しいクラスの免疫調節Ｔ細胞であるコン トラサプレッサー細胞であることを示した。 黒色腫患者の免疫療法により、一次抗原カサシガイ（ｋｅｙｈｏｌｅ ｌｉｍ ｐｅｔ）ヘモシアニンによる感作３日前における高用量（１０００ｍｇ／Ｍ２） または低用量（３００ｍｇ／Ｍ²）でのシクロホスファミドの投与が、それらの 抗原に対する遅延型過敏症（ｄｅｌａｙｅｄ ｔｙｐｅ ｈｙｐｅｒｓｅｎｓｉ ｔｉｖｉｔｙ）の獲得を大幅に増大させることが示されている（Ｂｅｒｄら、Ｃ ａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．、１９８２、４２、４８６２、Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．、 １９８４ａ、４４、１２７５）。低用量のシクロホスファミド前処置により、転 移性黒色腫患者は自己由来黒色腫ワクチンの注射に応じて自己由来黒色腫細胞に 対する遅延型過敏症を発現する（Ｂｅｒｄら、Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．、１９８ ６、４６、２５７２）。低用量のシクロホスファミドとワクチンの併用により、 転移性腫瘍の臨床的に重要な退行を得ることができる（上記のＢｅｒｄら、（１ ９８６）、Ｃａｎｃｅｒ Ｉｎｖｅｓｔ．、１９８８ａ、６、３３５）。シクロ ホスファミドの投与により、ＣＤ４＋、ＣＤ４５ＲＡ＋サプレッサー誘発Ｔ細胞 をおそらく枯渇することで、末梢血リンパ球非特異的Ｔサプレッサー機能が低下 する（Ｂｅｒｄら、Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．、１９８４ｂ、４８、１６７１）。 この免疫療法方式の抗腫瘍効果は、ワクチン投与の開始と腫瘍細胞に対する遅延 型過敏症の発現との間のきわめて長い間隔により制限されるように思われる（Ｂ ｅｒｄら、Ｐｒｏｃ．Ａｍｅｒ．Ａｓｓｏｃ．Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．、１９８ ２ｃ、２９，４０８（＃１６２６））。したがって、依然として、このようなワ クチンの治療効果を増大し、さらに免疫原性にする必要がある。 ほとんどの腫瘍免疫学者は現在、Ｔリンパ球、白血球が腫瘍免疫の原因であり 、 腫瘍塊への浸潤が免疫系による腫瘍破壊の必要条件であることを認めている。結 果として、ＮＣＩにおけるＳｔｅｐｈｅｎ Ｒｏｓｅｎｂｅｒｇ博士により開拓 された「ＴＩＬ」療法として知られるようになった療法が大きく注目されている 。Ｒｏｓｅｎｂｅｒｇ博士およびその他の研究者は、天然に存在すると共に、Ｔ リンパ球の増殖因子であるインターロイキン２（ＩＬ２）と試験管内で培養する ことでそれらの数を大きく拡大するいくつかのＴリンパ球を癌転移部から抽出し た。Ｔｏｐａｌｉａｎら、Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｏｎｃｏｌ．、１９８６、６、８３９ 。しかし、この療法は、注射されるＴ細胞の腫瘍部位への「帰巣（ｈｏｍｅ）」 能に限界があるという点でそれほど効果が認められていない。 リンパ球を非特異的に細胞毒性キラー細胞となるようにする高濃度のＩＬ２の 誘発能は、多くの研究において治療的に利用活用されている（Ｌｏｔｚｅら、Ｊ ．Ｂｉｏｌ． Ｒｅｓｐｏｎｓｅ、１９８２、３、４７５、Ｗｅｓｔら、Ｎｅｗ Ｅｎｇｌ． Ｊ．Ｍｅｄ．、１９８７、３１６、８９８）。しかし、この方法 は高用量静脈内ＩＬ２の重篤な毒性により制限されている。抗原活性化Ｔ細胞の 増殖を誘発することにより、はるかに低い濃度のＩＬ２が免疫学的アジュバント として作用できるという所見にはほとんど注意が払われていない（Ｔａｍａｄｇ ｅら、Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．、１９８７、４７、５７２５、Ｍｅｕｅｒら、Ｌ ａｎｃｅｔ、１９８９、１、１５）。したがって、依然として、免疫学的アジュ バントとしてのＩＬ２の使用を理解すると共に利用活用することを試みる必要が ある。 ヒト黒色腫はＴリンパ球により認識される特有の表面抗原を発現すると考えら れている、Ｏｌｄ，Ｌ．Ｊ．、Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．、１９８１、４１、３６ １、Ｖａｎ ｄｅｒ Ｂｒｕｇｇｅｎ、Ｐ．ら、Ｓｃｉｅｎｃｅ、１９９１、２ ５４、１６４３、Ｍｕｋｈｅｒｊｉ，Ｂ．ら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．、１９８６ 、１３６、１８８８、およびＡｎｉｃｈｉｎｉ，Ａ．ら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ． 、１９８９、１４２、３６９２。しかし、これまでの免疫療法的方法は、生体内 で（ｉｎ ｖｉｖｏ）このような抗原に対する有効なＴ細胞媒介応答を誘発する ことが困難であることにより制限されている。 ヒト腫瘍関連抗原に耐性であると思われるものを説明するために提案されたい くつかのモデルがある。それらには以下のものが含まれる。 １）初期抗腫瘍反応を減少作用した腫瘍抗原特異的サプレッサー細胞。上記の Ｍｕｋｈｅｒｊｉら、Ｂｅｒｅｎｄｔ，Ｍ．Ｊ．およびＲ．Ｊ．Ｎｏｒｔｈ，Ｊ ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．、１９８０、１５１、６９。 ２）Ｔヘルパー細胞を引き出し、またはそれらのＴ細胞に共刺激信号を供給す るヒト腫瘍細胞の欠乏。Ｆｅａｒｏｎ，Ｅ．Ｒ．ら、Ｃｅｌｌ、１９９０、６０ 、３９７、Ｔｏｗｎｓｅｎｄ，Ｓ．Ｅ．およびＪ．Ｐ．Ａｌｌｉｓｏｎ、Ｓｃｉ ｅｎｃｅ、１９９３、２５９、３６８、および ３）Ｔ細胞によるそれらの認識を制限する、腫瘍細胞における主な組織適合性 産物の表面発現の減少。Ｒｕｉｔｅｒ，Ｄ．Ｊ．、Ｓｅｍｉｎａｒｓ ｉｎ Ｃ ａｎｃｅｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ、１９９１、２、３５。これらの仮説はいずれも臨 床系において未だ確証されていない。 腫瘍の能動免疫療法の目的は、増殖性全身性Ｔ細胞媒介腫瘍特異的免疫の発現 である。腫瘍特異的免疫は、一次腫瘍部位で作用するほか、遠位部位における小 転移病巣の清浄においても作用するとみられる。 Ｔ細胞免疫の発生は、細胞間の相互作用および多くのサイトカインの産生を必 要とする高度に調節された反応であることが明らかにされている。最近、ヒト系 およびマウス系における研究では、Ｔ細胞反応がＩ型およびＩＩ型の２つの範疇 に分離できることが明らかにされている（Ｍｏｓｓｍａｎら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏ ｌ．１９８９ １３６：２３４８）。Ｉ型反応は遅延型過敏症（ＤＴＨ）の発現 に要求され、マクロファージ活性化およびインターフェロン−γ（ＩＦＮγ）の 産生と関連し、ヒトらい（Ｙａｍａｍｕｒａ，Ｍ．ら、Ｓｃｉｅｎｃｅ １９９ １ ２５４：２７７−２７９）およびマウス リーシュマニア症（Ｓｃｏｔｔ， Ｐ．ら、Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｒｅｖｉｅｗ １９８９ １１２：１６ １−１８２）の消散と関係があることが明らかにされている。ＩＩ型反応は、Ｉ Ｌ４およびＩＬ１０の産生と関係し、主に抗体反応を支持すると共に、らい（上 記のＹａｍａｍｕｒａら）およびリーシュマニア症（上記のＹａｍａｍｕｒａら 、および上記のＳｃｏｔｔ，Ｐ．ら）の進行性形成と関係がある。ＤＴＨの発現 のほか、Ｉ型反応はＭＨＣの増加作用および腫瘍関連抗原ならびに局在ＩＦＮγ 産 生に伴う抗原提示の増強を介した、腫瘍特異的ＣＴＬの産生を増強することが予 想される。さらに最近になって、Ｉ型反応およびＩＩ型反応は交差調節であるこ とが明らかにされている。すなわち、ＩＮＦγはＩＩ型反応を抑制するが、ＩＬ ４およびＩＬ１０はＩ型反応を抑制する（Ｓｃｏｔｔ、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１ ９９１ １４７：３１４９−３１５５、およびＦｉｏｒｅｎｔｉｎｏら、Ｊ．Ｉ ｍｍｕｎｏｌ． １９９１ １４６：３４４４−３４５１）。リーシュマニア症 系において、病変部位におけるサイトカインの変調（ｍｏｄｕｌａｔｉｏｎ）は ＩＩ型反応のＩ型反応の変換を可能にし、結果として、進行性感染から疾患の根 絶への変化を可能とする（上記のＳｃｏｔｔ、１９９１）。 Ｐｉｓａら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ １９９２ ８ ９：７７０８−７７１２は、卵巣癌生検においてＩＬ１０ ｍＲＮＡを検出した が、卵巣癌細胞系においては検出せず、彼らはＩＬ１０の発生源が腫瘍浸潤リン パ球であると結論づけた。Ｇａｓｔｌら、Ｉｎｔ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ １９９１ ５５：９６−１０１は、１６／４８腫瘍細胞系が培養上清にＩＬ１０を放出し 、３／８黒色腫（メラノーマ）細胞系のみが陽性であることを突き止めた。最後 に、Ｃｈｅｎら、Ｉｎｔ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ、１９９４ ５６：７５５−７６０ は最近、転移性黒色腫から誘導された６／９細胞系がＩＬ１０ ｍＲＮＡを発現 することを報告した。しかし、本発明は、ＩＬ１０のｍＲＮＡの発明者に知られ ている転移性黒色腫生検における最初の報告である。 これらの所見がヒト腫瘍宿主関係に適用可能であるかどうか、すなわち、Ｔ細 胞浸潤腫瘍によるサイトカイン産生のパターンが免疫応答の有効性の適応である かどうかは不明である。自己由来ＤＮＰ修飾ワクチンで治療した転移性黒色腫患 者には腫瘍部位で炎症性反応が認められた、上記のＢｅｒｄら、１９９１．組織 学的に、これらの炎症型病変は、ときに腫瘍細胞破壊と関連するＴ細胞浸潤によ り特徴づけられる。本発明では、ＤＮＰワクチン治療患者からの腫瘍が、ワクチ ン投与前に切除された腫瘍においては検出不可能であるＩ型Ｔリンパ球を含むこ とが明らかにされる。 発明の概要 本発明は癌治療に関する。癌を治療する組成物および方法が、本発明の範囲に 含まれる。本発明の組成物は腫瘍細胞または腫瘍細胞抽出物から調製された組成 物を含む。本発明の方法は、腫瘍細胞または腫瘍細胞抽出物を含む治療的に有効 量の組成物を投与することを含む、癌治療に関する。 図面の簡単な説明 図１は、ＤＮＰ修飾自己由来ＰＢＬおよび黒色腫細胞へのＤＴＨ発現の動態を 示す図である。ＤＮＰワクチンで治療した転移性黒色腫患者を、ＤＮＰ修飾ＰＢ Ｌ（ＬＹ）または転移性塊から分離したＤＮＰ修飾黒色腫細胞（ＭＥＬ）で連続 的に皮膚試験した。それぞれのバーは、各時点での患者群の平均ＤＴＨ反応を示 す。１１９日に、ＰＢＬに対する反応のみを測定した。サンプル規模：０日、１ ４日、６３日、Ｎ＝８４、１１９日、Ｎ＝５７、１７５日、Ｎ＝４２、２３１日 、Ｎ＝３５。 図２は、ＤＮＰに対する抗体反応を示す図である。各時点で得られた血清を、 ＥＬＩＳＡを用いたＤＮＰに対する抗体（総免疫グロブリン）について試験した 。滴定は次のように規定した：（サンプルのピークＯＤ）Ｘ（陽性対照のピーク ＯＤの半分に等しいＯＤを示した希釈の逆数）。 図３は、ＤＮＰ修飾自己由来リンパ球に対するＰＢＬの増殖性反応を示す図で ある。ＰＢＬはそれぞれのＤＴＨ反応のピークでＤＮＰワクチンを投与した患者 ４例から得た。ＤＮＰ修飾自己由来ＰＢＬ（自己ＬＹ−ＤＮＰ）の増殖能につい て、非修飾自己由来ＰＢＬ（自己ＬＹ）を対照として細胞を試験した。６日目に¹²⁵ ＩＵＤＲで培養液をパルスした。 図４は、ＤＮＰ修飾リンパ球に対する増殖性反応の動態を示す図である。ＤＮ Ｐワクチンを投与しながら患者ＤＭ２から連続的にＰＢＬを採集した。それらを 凍結保存したのち、ＤＮＰ修飾自己由来ＰＢＬ（自己ＬＹ−ＤＮＰ）に対する増 殖性反応について同時に全サンプルを試験した。６日目に¹²⁵ＩＵＤＲで培養液 をパルスした。 図５は、ＤＮＰ修飾細胞に対する増殖性反応の特異性を示す図である。非修飾 （自己ＬＹ）、ＤＮＰ修飾（自己ＬＹ−ＤＮＰ）、またはＴＮＰ修飾（自己ＬＹ −ＴＮＰ）のいずれかの自己由来ＰＢＬ、および非修飾（ＭＥＬ−ＤＮＰ） ま たはＤＮＰ修飾（ＭＥＬ−ＤＮＰ）のいずれかの培養自己由来黒色腫細胞に対す る増殖性反応について、患者２例からのＰＢＬを試験した。６日目に¹²⁵ＩＵＤ Ｒで培養液をパルスした。 図６は、増殖（ｅｘｐａｎｄｅｄ）Ｔ細胞の特異性分析を示す図である。患者 ＤＭ２からのＰＢＬをIL2において増殖させ、自己由来ＤＮＰ修飾Ｂリンパ芽球 細胞で繰り返し刺激した。それらを非修飾（自己ＬＹ）、ＤＮＰ修飾（自己ＬＹ −ＤＮＰ）、またはＴＮＰ修飾（自己ＬＹ−ＴＮＰ）のいずれかの自己由来ＰＢ Ｌ、および非修飾（ＭＥＬ−ＤＮＰ） またはＤＮＰ修飾（ＭＥＬ−ＤＮＰ）の いずれかの培養自己由来黒色腫細胞、ならびに同種異系（ａｌｌｏｇｅｎｅｉｃ ）ＰＢＬ（同種異系ＬＹ）に対する増殖性反応について試験した。６日目に¹²⁵ ＩＵＤＲで培養液をパルスした。 図７は、ＤＮＰ修飾自己由来細胞に対するＣＤ８＋およびＣＤ４＋Ｔ細胞の反 応を示す図である。陽性パニング（ｐａｎｎｉｎｇ）により増殖Ｔ細胞をＣＤ８ 濃縮群またはＣＤ４濃縮群に分離した。次にそれらを非修飾（自己ＬＹ）、ＤＮ Ｐ修飾（自己ＬＹ−ＤＮＰ）、またはＴＮＰ修飾（自己ＬＹ−ＴＮＰ）のいずれ かの自己由来ＰＢＬ、および非修飾（ＭＥＬ−ＤＮＰ）またはＤＮＰ修飾（ＭＥ Ｌ−ＤＮＰ）のいずれかの培養自己由来黒色腫細胞に対する増殖性反応について 試験した。６日目に¹²⁵ＩＵＤＲで培養液をパルスした。 図８は、ＤＮＰ反応性Ｔ細胞によるサイトカイン産生を示す図である。ＤＮＰ 反応性Ｔ細胞系（「親」）、および限界希釈での平板培養により得られた３つの 継代培養（２Ｆ８、ＩＤ７、ＩＣ２）を自己由来ＤＮＰ修飾Ｂリンパ芽球細胞と 共に１８時間保温した。上清を採集し、γインターフェロン（ＩＦＮ）およびＩ Ｌ４について分析した。 図９は、抗ＭＨＣクラスＩモノクローナル抗体によるＴ細胞反応の遮断を示す 図である。自己由来ＤＮＰ修飾Ｂリンパ芽球細胞で拡張ＣＤ８＋Ｔ細胞を刺激し 、１８時間後にγインターフェロンについて培養液を分析した。次のうちのいず れか１つで刺激細胞をプレインキュベートした：抗体なし（なし）、非特異的マ ウスＩｇＧ（非特異的）、モノクローナル抗体Ｗ６／３２（クラスＩ）、または モ ノクローナル抗体Ｌ２４３（クラスＩＩ）。 図１０は、Ｔ細胞反応のＭＨＣ制限を示す図である。別の患者４例からのＤＮ Ｐ修飾自己由来ＰＢＬおよびＤＮＰ修飾同種異系ＰＢＬに応じた増殖能について 増殖ＣＤ８＋Ｔ細胞（ＨＬＡ−Ａ１、Ａ２、Ｂ６、ＢＷ６）を試験した。同種異 系刺激物質のうち３つを図に示したように１つまたはそれ以上のクラスＩ座で適 合させ、第４の刺激物質は完全に不適合させた（Ａ２４、Ａ２６、Ｂ４４、Ｂ６ ３）。６日目に¹²⁵ＩＵＤＲで培養液をパルスした。 図１１は、ＤＮＰ反応性Ｔ細胞の細胞毒性を示す図である。自己由来（自己） または同種異系クラスＩ不適合（同種）のいずれかの黒色腫細胞を、６時間⁵²Ｃ ｒアッセイにおける標的として用いた。エフェクター細胞は拡張ＣＤ８＋、ＤＮ Ｐ反応性Ｔ細胞であった。図１１Ａ−標的細胞を各濃度のＤＮＢＳまたはＴＮＢ Ｓでハプテン化した。エフェクター：標的細胞比は２０：１であった。図１１Ｂ −２．５ｍｇ／ｍｌのＤＮＢＳまたはＴＮＢＳでハプテン化した標的細胞を一連 のエフェクター：標的（Ｅ：Ｔ）比でエフェクター細胞と混合した。 図１２は、ＤＮＰワクチンおよび非ハプテン化対照ワクチンで治療した手術後 数カ月において腫瘍が認められない患者の割合を示す図である。 図１３は、それぞれ１０画分の５群にプールしたＨＰＬＣ画分を示す図である 。ジニトロフェニル修飾黒色腫細胞（ＤＮＰ−ＭＥＬ）またはジニトロフェニル 修飾Ｂ細胞（ＤＮＰ−ＬＹ）から誘導したペプチドはプール２において刺激性で あった。 図１４は、ＩＦＮγおよびＩＬ１０のｍＲＮＡを発現するＤＮＰワクチン免疫 化患者からの炎症性皮下黒色腫結節を示す図である。図１４−１はＲＴ−ＰＣＲ （レーン１＝サイズマーカー、２＝β−アクチン、３＝ＩＦＮγ、４＝ＩＬ４、 ５＝ＩＬ１０）により決定されるサイトカインのｍＲＮＡを示し、図１４−２は 皮下病変のＨ＆Ｅ染色切片を示す（４０ＯＸ）。 図１５は、ＩＦＮγではなくＩＬ１０のｍＲＮＡを発現する免疫化されていな い患者からのリンパ節転移を示す図である。図１５−１は、ＲＴ−ＰＣＲ（レー ン１＝サイズマーカー、２＝β−アクチン、３＝ＩＦＮγ、４＝ＩＬ４、５＝Ｉ Ｌ１０）により決定されるサイトカインのｍＲＮＡを示し、図１４−２はリンパ 節転移のＨ＆Ｅ染色切片を示す（４０ＯＸ）。 図１６は、ヒト黒色腫転移において発現したＩＬ１０ ｍＲＮＡのゲルを示す 図である。サイトカインのｍＲＮＡはＲＴ−ＰＣＲ（レーン１＝サイズマーカー 、Ｃ＝ＩＬ１０ ｃＤＮＡ対照、１−７＝患者サンプル）により決定された。 図１７は、黒色腫細胞により発現されたＩＬ１０ ｍＲＮＡのゲルを示す図で ある。図１７は、代表的腫瘍生検および誘導細胞系からのＲＴ−ＰＣＲにより発 現されるＩＬ１０ ｍＲＮＡを示す（レーン１＝サイズマーカー、２＝ＩＬ１０ ｃＤＮＡ、３＝腫瘍生検、４＝腫瘍系）。 図１８は、非炎症性黒色腫生検のパラフィン切片からのｉｎ ｓｉｔｕ ＲＴ −ＰＣＲである（Ａ＝１００Ｘ、Ｂ＝４００Ｘ）。 発明の詳細な説明 本発明は癌免疫療法に関する。本発明の範囲には癌治療の新規な腫瘍組成物お よび方法が含まれる。 本発明は、転移性癌および原発癌を含む癌の治療における使用に関する。本発 明により治療可能な癌には次の非限定例が含まれる：黒色腫、乳房、肺、結腸、 乳腺、腎臓、および前立腺。転移性癌を有する哺乳類、特にヒトは本発明の組成 物および方法で治療することができる。 本発明の組成物は、腫瘍細胞または腫瘍細胞抽出物から調製される。腫瘍細胞 はいかなる種類の癌の悪性または前悪性細胞であってもよい。本発明によれば、 前悪性とは、未だ癌細胞ではない癌細胞を示唆するすべての異常な細胞であり、 例えば、最終的に子宮頸癌となる子宮頸細胞における非形成変化、および黒色腫 となる異常な皮膚細胞である非形成母斑などであり、またこれらに限定されるも のではない。腫瘍細胞および抽出物は、治療すべき種類の癌から得られることが 好ましい。腫瘍癌および抽出物は、生検材料または組織培養から分離した自己由 来細胞および同種異系細胞、ならびにこれらの発生源からの幹細胞および抽出物 であってもよく、またこれらに限定されない。細胞および抽出物は自己由来であ ることが好ましい。本発明の腫瘍細胞抽出物は、ハプテン修飾癌細胞から分離し たペプチドまたはハプテン修飾癌細胞から分離した細胞膜であってもよい。 本発明の目的のため、ペプチドは２つまたはそれ以上のアミノ酸の化合物であ り、タンパク質を含む。ペプチドは、ハプテン化腫瘍細胞から分離され、Ｔ細胞 リンパ球を刺激してγインターフェロンを産生する、好ましくは約１，０００ｋ Ｄ乃至約１０，０００ｋＤの、より好ましくは約１，０００乃至約５，０００の 低分子量のペプチドである。Ｔ細胞は、エフェクターと制御の２種類の機能を媒 介し、タンパク質（リンフォカイン）を分泌すると共に、他の細胞を殺傷（細胞 毒性）するリンパ球である。エフェクター機能には、遅延型過敏性、同種移植片 拒絶反応、腫瘍免疫性、および移植片対宿主反応性などの反応性が含まれる。リ ンフォカイン産生および細胞毒性は、Ｔ細胞エフェクター機能により明らかにさ れる。Ｔ細胞の制御機能は、他のＴ細胞による細胞媒介性細胞毒性およびＢ細胞 による免疫グロブリン産生の増幅能により表される。調節機能はリンフォカイン の産生をも要求する。Ｔ細胞はマイトジェン、抗原、またはレクチンを含み、こ れらに限定されない刺激の誘発に応じて、γインターフェロン（ＩＦＮγ）を産 生する。ペプチドは約８個乃至２０個のアミノ酸であることが好ましく、さらに ペプチドはハプテン化されていることが好ましい。ペプチドは細胞表面、細胞内 部、または２つの位置のいずれの組み合わせからでも分離することができる。抽 出物は癌細胞（対正常細胞）のタイプに特別であってもよい。本発明のペプチド は、主な組織適合性複合体に結合するペプチド、細胞表面関連タンパク質、癌遺 伝子または変異した抗癌遺伝子を含むと共に、これらに限定されない。 本発明の癌細胞膜はハプテン化癌細胞から分離した膜からのすべての、または 一部の膜であってもよい。本発明に記載された癌細胞膜の定義により、癌細胞膜 を分離してハプテン化し、あるいは、癌細胞をハプテン化し、その後に膜を癌細 胞から分離することができる。 細胞抽出物はＴ細胞を刺激することができる。本発明の目的のための刺激とは 、細胞抽出物に反応したＴ細胞の増殖およびＴ細胞によるサイトカインの産生の ことを意味する。ハプテン修飾腫瘍細胞から分離した膜およびタンパク質ならび にそれぞれ独立したタンパク質は、Ｔ細胞の刺激能を有する。Ｔ細胞の増殖は、³ Ｈチミジン、¹²⁵ＩＵＤＲ（ヨードデオキシウリジン）など、またこれらに限定 されない修飾核酸、および生細胞を染色する３−（４，５−ジメチルチアゾル− ２− イル）−２，５−臭化ジフェニルテトラゾリウム（ＭＴＴ）など染料のＴ細胞に よる取込みにより確認することができる。また、サイトカインの産生は、ＩＦＮ γ、腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）、およびＩＬ−２などであり、またこれらには限定 されない。サイトカインの産生量は、１５ピコグラム／ｍｌより多いことが好ま しく、さらに好ましくは約２０乃至約３０ピコグラム／ｍｌであり、さらに好ま しくは約５０ピコグラム／ｍｌである。 好ましくは腫瘍細胞抽出物は、特定の種類の細胞に固有であり、または実質的 に特異的である細胞物質を含む。本発明の腫瘍細胞は生細胞であってもよい。本 発明の腫瘍細胞および抽出物は使用前に照射してもよい。腫瘍細胞または抽出物 は約２５００ｃＧｙで照射し、注射後の細胞が増殖することを防止する。 本発明の組成物は単独で、または本発明の他の組成物を含む（これらに限定さ れることのない）他の化合物と組み合わせて、本発明の方法において使用するこ とができる。こうして、癌細胞および癌細胞抽出物を単独で使用でき、または共 投与することができる。本発明の目的のために、共投与はいっしょに投与するこ とや連続的に投与することを含む。また、癌細胞膜はペプチドと共に共投与する ことができる。さらに、癌細胞および／または抽出物は、インターロイキン−２ 、インターロイキン−４、γインターフェロン、インターロイキン−１２、ＧＭ −ＣＳＦを含むと共に、これらに限定されない他の化合物といっしょに共投与す ることができる。本発明の腫瘍細胞および抽出物は、化学療法、放射線、抗体、 オリゴヌクレオチド配列、およびアンチセンスオリゴヌクレオチド配列を含むと 共に、これらに限定されない他の癌治療と共に使用することもできる。 本発明の組成物は、予定された投与経路および標準的な薬学的実務に関して選 択される薬学的に許容できる担体との混合物において投与することができる。投 与量は患者の体重、および臨床状態に関して設定することができる。担体と有効 成分との割合比は本来組成物の化学的性質、溶解度、および安定性、ならびに予 想される投与量により左右される。使用すべき本発明の腫瘍細胞および抽出物の 量は、癌性細胞に対する化合物の親和性、存在する癌性細胞の量および組成物の 溶解度などの因子により左右される。本発明の化合物は、例えば、皮内、静脈内 、腹腔内、筋内、および皮下の接種や注射を含む適切な経路で投与することがで き る。 本発明の組成物は単独で投与することができ、または通常、予定された投与経 路および標準的な製剤実務に関して選択される薬学的的担体との混合物で投与さ れる。 本発明の組成物は、腫瘍生細胞、ペプチドおよび癌細胞膜など腫瘍細胞抽出物 、並びに腫瘍細胞および１つ以上の腫瘍細胞抽出物の混合物を含む群から選択さ れる組成物の治療的に有効な量である。組成物は免疫学的アジュバントおよび／ または薬学的に許容できる担体と混合することができる。食塩水およびこれに限 定されない薬物送達に有効な周知の水性ビヒクルを、担体として本発明といっし ょに使用することができる。また、当業者に周知のアジュバントはいずれも本発 明の送達に有効と考えられる。アジュバントは、非限定的にＢａｃｉｌｌｕｓ Ｃａｌｍｅｔｔｅ−Ｇｕｅｒｉｎ（ＢＣＧ）を含み、インターロイキン−１２、 インターロイキン−２等の非限定的なサイトカイン、Ｌｉｖｉｎｇｓｔｏｎら、 Ｖａｃｃｉｎｅ １９９４ １２：１２７５により開示されたＯＳ−２１等の非 限定的な合成アジュバントを含み（Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ Ｂｉｏｔｅｃｈ、Ｗｏ ｒｅｓｔｅｒ、ＭＡ）、その開示は全体において本明細書中で参考として援用さ れる。細胞および細胞抽出物を照射し、そしてハプテン化する場合は、細胞をハ プテンに接合して、次に照射してもよい。あるいは、細胞を照射してからハプテ ンに接合してもよい。いずれの場合においても、抽出物は続いて精製し、さらに 照射および／またはハプテン化することもできる。抽出物を照射し、ハプテン化 するには、いずれかの方法を最初に実行した後、もう１つの方法を実行すること ができる。 または、腫瘍細胞または腫瘍細胞抽出物を抗原提示細胞に添加することができ る。癌細胞抽出物は、自己由来培養マクロファージおよび自己由来培養樹状細胞 を含む群から選択される、別の細胞型の抗原提示細胞といっしょに用いて癌を治 療することができる。マクロファージは、起始に関係なく、食作用を有する、す なわち他の細胞、死滅組織、変性細胞などを飲み下し破壊する、組織球および単 球など、非限定的な大型アメーバ様単核細胞である。マクロファージは、Ｔ細胞 を含む腫瘍抗原を含む、細胞に抗原を提示する抗原提示細胞である。樹状細胞も 抗原提示細胞であり、マクロファージと密接に関係していると思われるが、樹状 細胞はマクロファージよりもさらに有効な抗原提示細胞である。樹状細胞はＴ細 胞の有効な刺激物質であり、血液、皮膚（この場合、樹状細胞はランゲルハンス 細胞と呼ばれる）、リンパ系組織を含む、非限定的な種々の生体器官若しくは組 織から分離することができる。 例えばペプチドあるいは膜が結合した抗原提示細胞は、患者を免疫化するのに 利用できるだろう。患者から採血し、そこからマクロファ−ジあるいは樹状突起 細胞を得る。高濃度ペプチド（およそ１ｎｇ／ｍｌからおよそ１μｇ／ｍｌ、好 ましくはおよそ１０ｎｇ／ｍｌからおよそ１００ｎｇ／ｍｌである）、あるいは 膜（およそ１０⁵からおよそ１０⁷細胞当量で、細胞当量は出発細胞数と相関する ）を細胞と一晩もしくはおよそ８時間インキュベートさせる。膜とインキュベー トした場合には、膜はマクロファ−ジあるいは樹状突起細胞により食作用される 。膜を食作用したマクロファ−ジあるいは樹状突起細胞は、本明細書に全体とし て参考文献として援用されるＧｒａｂｂｅ，Ｓ．，ら．，Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ Ｔｏｄａｙ １９９５ １６；１１７−１２１に開示された方法により、患者 を免疫化するのに用いることができる。 本発明の好適な実施態様では、組成物は、非限定的にハンクス液、生理食塩水 、リン酸緩衝生理食塩水、水等のな薬学的に受容可能な担体もしくは希釈液中に 懸濁したおよそ１０×１０⁶からおよそ２５×１０⁶、より好ましくはおよそ５× １０⁶からおよそ２５×１０⁶の、生きているあるいは放射線照射された腫瘍細胞 、並びにこれに添加された非限定的な、Ｂａｃｉｌｌｕｓ Ｃａｌｍｅｔｔｅ− Ｇｕｅｒｉｎ（ＢＣＧ）等の免疫学的アジュバントからなるワクチンを含む。腫 瘍細胞および抽出物は、ハプテンと結合していてもよい。この混合液を、リンパ 節切除（ｄｉｓｓｅｃｔｉｏｎ）と同側の下肢を除く上腕あるいは下肢に投与毎 に３連続点内に皮内投与する。 患者はジニトロフルオロベンゼン（ＤＮＦＢ）を皮膚に適用することでジニト ロフェニル（ＤＮＰ）に対して免疫化できる。２週間後、ＤＮＰにハプテン化し た被照射細胞を含みうる該ワクチンを患者に投与する。このワクチンを４週毎、 に注射し合計８回投与する。腫瘍細胞に対する免疫反応を増強するために、シク ロフォスファミド（ＣＹ）を各ワクチン投与の３日前に投与してもよい。ハプテ ン化していないワクチンも同様にして投与できる。 本発明のワクチンはハプテン化してもしなくてもどちらでもよい。ハプテン化 された、あるいは化学的に結合した形状のワクチンは、例えばジニトロフェニル （ＤＮＰ）にハプテン化した腫瘍細胞を含む。その他のハプテンには、非限定的 に、トリニトロフェニル（ＴＮＰ）やＮ−ヨ−ドアセチル−Ｎ’−（５−スルホ ニック１−ナフチル）エチレンジアミン（ＡＥＤ）がある。腫瘍細胞抽出物のワ クチンも同様にハプテン化できる。ハプテン化した腫瘍細胞抽出物の場合、抽出 物、ペプチドならびに腫瘍細胞膜はハプテン化した腫瘍細胞から抽出する。本発 明はまた腫瘍細胞および／あるいは細胞抽出液のハプテン化していないワクチン も包含する。 本発明の方法において、腫瘍が疑われる患者を治療する方法は、薬学的に受容 可能な量のシクロフォスファミドと、肝癌細胞、腫瘍細胞抽出物、癌細胞と癌細 胞抽出物の混合体から成る群より選択された薬学的に受容可能な量の組成物を投 与することを含む。組成物が癌細胞抽出物の場合、抽出物は、ハプテン化した癌 細胞より分離したペプチドもしくは膜である。組成物は、免疫学的アジュバント および／または薬学的に受容可能な担体と混合してもよい。所望により、ハプテ ン化したワクチンの後に、薬学的に受容可能な量のハプテン化されていないワク チンを追加して投与することもできる。ハプテン化されていないワクチンもまた 本発明の方法により投与することができる。 本発明のワクチンは腫瘍細胞および／または腫瘍細胞抽出物を含むことができ る。本発明に利用できる腫瘍細胞は以下のように調製できる：腫瘍塊を前記の本 明細書に全文が参考文献として援用されるＢｅｒｄら（１９８６）の記載に従っ て処置する。細胞をコラゲナ−ゼおよびＤＮＡｓｅにより酵素的に解離し、さら に凍結速度調節型冷凍庫内で凍結し機械的に解離して、それから使用するまで液 体窒素内に保存した。患者に皮膚試験を行うもしくは処理をする日に細胞を融解 し、洗浄し、そしておよそ２５００Ｒの放射線照射を行う。細胞をもう一度洗浄 してからフェノ−ルレッドを抜いたハンクスのバランス塩溶液に懸濁させた。無 菌状態で腫瘍細胞をＤＮＦＢと３０分間反応させてから滅菌生理食塩水で洗浄す ることを含む、本明細書に全文が参考文献として援用されるＭｉｌｌｅｒとＣｌ ａｍａｎ、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１９７６，１１７，１５１９の方法を用いて 、調製細胞にＤＮＰを結合させた。 膜を分離し修飾するか、あるいは最初に膜を分離することなしに細胞にハプテ ンを結合させることにより、患者の癌細胞にハプテンを結合させることができる 。 癌細胞膜は、患者の癌細胞の非修飾調製物から細胞膜を分離することにより調 製できる。細胞を約１ｍＭのフェニルメチルスルホニルフルオライドを含む、お よそ５倍量のおよそ３０ｍＭの炭酸水素ナトリウム緩衝液に懸濁し、ガラスホモ ジナイザーで破壊した。およそ１０００ｇの遠心分離により残渣無傷（ｉｎｔａ ｃｔ）細胞と核を取り除く。膜を１００，０００ｇ、９０分間遠心分離して沈殿 させる。この膜をおよそ８％のショ糖液に再懸濁し、使用するまでおよそ−８０ ℃に凍結した。膜を懸濁するために（およそ５，０００，０００細胞当量／ｍｌ ）、約０．５ｍｌの１ｍｇ／ｍｌジニトロフルオロベンゼン（ＤＮＦＢ）を加え て約３０分間おいた。同様に、非限定的にトリニトロフェニルおよびＮ−ヨ−ド アセチル−Ｎ’−（５スルホニック１−ナフチル）エチレンジアミン等の他のハ プテンも利用できる。膜をおよそ０．１５Ｍ ＰＢＳに約３日間透析することに より過剰のＤＮＰを取り除く。膜は沈殿させる。 あるいは、癌細胞抽出物、ペプチドもしくは膜については、患者癌細胞をジニ トロフェニルの様なハプテンで修飾し、それから膜を調製しても得ることができ る。患者癌細胞は生検時に得て、使用するまで凍結する。およそ１００ｍｇのＤ ＮＦＢ（Ｓｉｇｍａ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏ．，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）を 約０．５ｍｌの７０％エタノ−ルに溶解した。約９９．５ｍｌのＰＢＳを加えた 。ＤＮＦＢ濃度はおよそ１５２ｍｇ／０．１ｍｌである。この溶液を一晩３７℃ の水槽内で攪拌した。この溶液の保存期間はおよそ４週間である。細胞を融解し 、沈殿物を５×細胞数／ｍｌになるようにハンクスバランス塩溶液に再懸濁させ た。細胞１ｍｌ当たりにおよそ０．１ｍｌのＤＮＦＢ溶液を加え、室温でおよそ ３０分間反応させた。非限定的に、トリニトロフェニルおよびＮ−ヨ−ドアセチ ル−Ｎ’−（５スルホニック１−ナフチル）エチレンジアミン等の他のハプテン も利用できる。それから細胞を２回ハンクスバランス塩溶液で洗浄した。細胞を 約１ｍＭのフェニルメチルスルホニルフルオライドを含むおよそ５倍量のおよそ ３０ｍＭの炭酸水素ナトリウム緩衝液に懸濁し、ガラスホモジナイザーで破壊し た。およそ１０００ｇの遠心分離により残渣無傷細胞と核を取り除く。膜を１０ ０，０００ｇ、９０分間遠心分離して沈殿させる。この膜をおよそ８％のショ糖 液に再懸濁し、使用するまでおよそ−８０℃に凍結した。 ＤＮＰ修飾した細胞からペプチドを抽出することができ、その内のいくつかは 細胞を修飾した結果ＤＮＰ修飾されたものである。当業者に公知の蛋白抽出技術 の後に、患者治療に有効な抗原を分離するためにアッセイを行ってもよい。細胞 抽出物を単離するための方法は、当業者に周知である。簡単に述べると、腫瘍細 胞を癌から単離し、試験管内で培養する。ジニトロフェニルを前記方法に従って 培養細胞に加える。本明細書に全文が参考文献として援用されるＲｏｔｚｓｃｈ ｋｅら．，Ｎａｔｕｒｅ、１９９０，３４８，２５２に開示される、確立した方 法により細胞よりペプチドを分離する。細胞を弱酸で処理する。それから、細胞 を遠心分離して上清を取る。ＨＰＬＣにより短かいペプチドを含む画分を得て、 濃縮し、凍結する。この画分を自己のＢリンパ芽球細胞に結合させることによっ てその免疫活性についてスクリ−ニングし、そしてメラノ−マ特異的リンパ球を 刺激する能力について試験した。 細胞を、これに限定されるものではないがトリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）の様な 弱酸で処理した。それから細胞を遠心分離して上清を保存した。ゲル濾過（Ｇ２ ５ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ，Ｐｈａｒｍａｃｉａ）により分子量５，０００以上の 成分を上清から取り除いた。上清の残査を０．１％トリフルオロ酢酸（ＴＦＡ） 中の逆相ＨＰＬＣカラム（Ｓｕｐｅｒｐａｃ Ｐｅｐ Ｓ、Ｐｈａｒｍａｃｉａ ＬＫＢ）上で、上昇するアセトニトリル濃度勾配を用いて分画した；流速は１ ｍｌ／分で、分画サイズは１ｍｌである。短いペプチドを含む分画は、Ｓａｍｂ ｒｏｏｋら．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒ ｙ Ｍａｎｕａｌ，２ｎｄ ｅｄ．，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ、 ＮＹ（１９８９）の方法に従ってＨＰＬＣによって回収し、濃縮、凍結した。こ の画分を自己のＢリンパ芽球細胞に結合させることによってその免疫活性につい てスクリ−ニングし、そしてメラノ−マ特異的リンパ球を刺激する能力について 試験した。 エプシュタインバ−ウイルス（ＥＢＶ、ＡＴＣＣ ＣＲＬ−１６１２，Ｂ９５ −８ ＥＢＶ形質転換白血球、コットントップマ−モセット、Ｓａｇｕｉｎｕｓ ｏｅｄｉｐｕｓ）を培養液中のＢリンパ芽球細胞に加える。Ｂリンパ芽球細胞は 患者自身のリンパ細胞からＢ細胞腫瘍に形質転換する。転移相からのメラノ−マ は、ＲＰＭＩ １６４０＋１０％ウシ胎児血清あるいは１０％ヒト血清で培養す る。接着していない細胞をＲＰＭＩ培地で洗い取った。細胞が集密的になったと き、これを０．１％ＥＤＴＡで剥がし、２本のフラスコに分ける。この作業を集 密的な細胞が単層的になるまで繰り返す。Ｔ細胞により産生されるγインタ−フ ェロンを試験するために、患者血液からリンパ球細胞を得た。前もってＤＮＰの 様なハプテンで修飾した患者自身の腫瘍細胞をリンパ球細胞と混合し、Ｔ細胞を 刺激する。７日ごとに、インタ−ロイキン−２を加える。Ｔ細胞は前記の様に分 割することにより増殖（ｅｘｐａｎｄ）させる。それからＴ細胞をハプテンで修 飾した細胞で刺激する。ハプテン修飾細胞に反応するＴ細胞濃密集団が得られる 。 多くの研究者によりヒト癌ワクチンが開発され、試験されている。これらワク チンは時に患者の癌に対して弱い免疫性を示すことはあるものの、腫瘍を退行さ せることは極めて稀である。本発明のＤＮＰ−ワクチンには、驚くべきことに転 移性腫瘍内に炎症性反応が出現した。腫瘍は次第に赤くなり、暖かくそして柔ら かくなった。最終的には腫瘍が消失したことが肉眼と顕微鏡で確認されるくらい 腫瘍が退行した例もあった。顕微鏡観察ではＴ細胞が腫瘍塊の中に浸潤している ことが観察される。従って、この方法では炎症反応、並びに、腫瘍内へ侵入する リンパ細胞の数と能力を増加させるものであることから、従来の技術に比べ重大 な進歩を遂げている。 本ワクチンの効果は様々な生物反応修飾体を加えることで改善できるだろう。 これらの薬剤は直接あるいは間接的に免疫反応を刺激する。本発明の生物反応修 飾体には、これに限定されるものではないがインタ−ロイキン１２やγインタ− フェロンが含まれる。本態様では、ＩＬ１２は各ワクチンを注射した後に投与さ れる。ＩＬ１２を炎症反応を示す患者に投与すると、腫瘍塊内のＴリンパ細胞を 増殖させ、より活性化させると信じられている。Ｔ細胞数と機能活性の増加によ り、癌が免疫学的に破壊される。ＩＬ１２の用量は前記の適用用量に従って調製 する。 転移性メラノ−マ患者は以下の成分を用いた免疫療法で処置した。１）ＤＮＰ に結合した自己腫瘍細胞からなるワクチン；および２）低用量シクロフォスファ ミドによる前処置。腫瘍が退行したかどうかを決定し、腫瘍炎症反応をモニタ− し、自己由来メラノ−マ細胞、ＤＮＦＢ（皮膚感作に用いた形式のＤＮＰ）、Ｄ ＮＰ−結合自己由来リンパ球、希釈剤（ハンクス液）、精製蛋白誘導体（ＰＰＤ ）および追想抗原（ｒｅｃａｌｌ ａｎｔｉｇｅｎ）（カンジダ、トリコフィト ン、ムンプス）に対する遅延型過敏性について調べる目的で患者を評価した。治 療が有益であると（臨床上あるいは免疫学上）考えられた患者についてはこの免 疫治療法を続けた。その後はシクロフォスファミドを除いてワクチンだけを投与 した。同様の実験で、ポリエチレングリコ−ルに結合したインタ−ロイキン２は 効果ないことが判明した。 別の態様では、ハプテンと結合した抽出物とＢａｃｉｌｌｕｓ Ｃａｌｍｅｔ ｔｅ−Ｇｕｅｒｉｎ、ＢＣＧ、の様な免疫学的アジュバントとを混合させた化学 抽出物を含むワクチンを使用する。 本発明では、ヒトメラノ−マ転移巣由来の生検を、ＲＴ−ＰＣＲを用いてサイ トカインｍＲＮＡの発現について調べた。ＩＦＮγについてのｍＲＮＡがＤＮＦ −ワクチン投与後の炎症転移巣には認められたが、治療前転移巣では多く異のリ ンパ節リンパ球が残っていたにもかかわらずｍＲＮＡは極めてわずかであった。 さらに、II型サイトカインであるＩＬ１０はほとんど全てのメラノ−マ転移巣に 認められ、メラノ−マ細胞自身より産生されたものと思われる。 自己由来のＤＮＰ修飾ワクチンを用いて治療した転移メラノ−マを有する患者 は、腫瘍部位に炎症反応を発した。組織化学的なこれらの炎症傷害部位の特徴は 、時に腫瘍細胞の崩壊を伴うＴ細胞の浸潤である。本発明では、ワクチン治療後 に炎症が見られた８例の皮下転移例の生検試料について、ＩＦＮγ、ＩＬ４、Ｔ ＮＦとＩＬ１０のｍＲＮＡ発現を調べた。ワクチン治療後には、炎症生検は、Ｉ ＦＮγのｍＲＮＡ（５／８）、ＩＬ４（４／８）あるいは両方（３／８）ならび にＴＮＦ（４／７）のｍＲＮＡを含んだ。対照的に、対照サンプル（治療前のリ ンパ節転移巣あるいは非炎症性皮下転移巣）ではわずかに１／１７でＩＦＮγが 、そして２／１６でＴＮＦ ｍＲＮＡが検出されたに過ぎなかった。抗炎症性機 能を有するのサイトカインであるＩＬ１０ ｍＲＮＡはメラノ−マ転移巣２４／ ２５に認められ、リンパ腫の有無とは無関係であった；生体内ＰＣＲによりメラ ノ −マ細胞が主な源であることが確認された。これらの所見より癌の免疫治療の効 果測定のための新しいパラメ−タが提供される。 本発明は新たに得られた転移メラノ−マ生検を、腫瘍部位の産生的免疫反応と 相関するサイトカインｍＲＮＡの存在について分析することを目的としている。 ＩＦＮγあるいはＩＬ４のｍＲＮＡの発現は、ＤＮＰ修飾型の自己由来ワクチン 投与による炎症反応がおきたメラノ−マ転移巣の特徴である。一方、ＩＬ１０ｍ ＲＮＡの発現は免疫反応とは無関係であり、メラノ−マの生検試料のほとんど全 てに見られる。メラノ−マの生検より得た細胞株について調べた結果ならびにｉ ｎ ｓｉｔｕＰＣＲ解析の結果より、ＩＬ１０はメラノ−マ細胞自身に由来する ものであり、付随するリンパ細胞に由来するものでないことが示された。 本発明の最も重要な発見はおそらく陰性なものである：即ち一般に未治療患者 由来のメラノ−マ転移巣だけでなく、たとえ大量のリンパ節リンパ球を含む転移 巣でもＩＦＮγおよびＩＬ４のｍＲＮＡは共に発見されないというものである。 このことから、生体内のサイトカイン産生の基準活性は、免疫療法により変化し たＴ細胞集団を有するメラノ−マ組織に比べ低いことを物語っている。さらに、 次の生物学的重要点を協調したい：メラノ−マリンパ節転移から得たＴ細胞は、 メラノ−マ抗原を認識して腫瘍細胞内に実際に浸潤したリンパ細胞ではなく、元 来リンパ節に存在していた集団の残りであると考えられることである。この様な 細胞は抗原による活性化を受けていないので、ＩＦＮγあるいはＩＬ４を産生す るよう刺激されていないのである。 逆に、ＤＮＰ−ワクチンの投与を受けた後に得た生検試料は、ＩＦＮγのｍＲ ＮＡを明確に発現している。しかし、ＤＮＰ−ワクチン誘導の炎症反応は、ＩＬ ４を含むサンプルもあることからＩ型には分類されない。ＰＣＲの持つｍＲＮＡ 解析の感度を考えると、上記現象は主にＩＦＮγを産生している浸潤Ｔ細胞のご く一部にある微量のＩＬ−４産生Ｔ細胞が原因であろう。一方、ＩＦＮγとＩＬ ４のｍＲＮＡの存在は、両サイトカインを産生するＴ細胞−いわゆるＴＨ０細胞 （Ｌｅｅら、Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１９９２ ２２：１４５５−１４５ ９）の存在を意味している。この問題を解決するにはｍＲＮＡ発現と形態学の相 関性を解析できる、生体内（ｉｎ ｓｉｔｕ）ＰＣＲの様な解析が必要である。 どの様な結果が得られようが、上記所見は測定された腫瘍内のサイトカイン産生 は免疫治療を受けている患者を測定する上で重要なパラメ−タの一つである。 本発明は、ＩＬ１０ ｍＲＮＡが、付随するリンパ細胞ではなくメラノ−マ細 胞自身に由来することを強く示唆している。２４／２５の生検試料中に強いＩＬ １０ｍＲＮＡバンドが認められ、その発現は付随するリンパ細胞数にもＤＮＰ− ワクチン−誘導炎症の有無とも無関係であった。さらに、ｉｎ ｓｉｔｕＰＣＲ はメラノ−マ細胞内にＩＬ１０ｍＲＮＡが存在することを明確に示している。生 検試料由来の細胞株はＩＬ１０ｍＲＮＡを発現しており、ＥＬＩＳＡによって測 定されるように、ＩＬ１０を産生した。 メラノ−マ組織でのＩＬ１０産生の持つ生理学的意味は不明である。ＩＬ１０ はＴ細胞増殖とＩＬ２産生を阻害すること（Ｊｉｎｑｕａｎ，Ｔ．，ら．，Ｊ． Ｉｍｍｕｎｏｌ．１９９３ １５１；４５４５−４５５１）と、おそらくマクロ ファ−ジの共刺激作用を低下させることにより、遅延型過敏症（Ｌｅｅ、前出） を起こすと考えられている抗炎症性サイトカインである。従って、ＩＬ１０は腫 瘍部位に浸潤したメラノ−マ反応性Ｔ細胞の活性化と増殖を抑制する。しかし、 最近ＩＬ１０がＣＤ８＋Ｔ細胞の走化性因子であることが示された（Ｊｉｎｑｕ ａｎ、前出）；この性質がＤＮＰ−ワクチン−誘導性のリンパ腫浸潤内にＣＤ８ ＋細胞が多い理由と考えられる。いずれにしても、腫瘍部位でのＩＬ１０産生が 変化することは腫瘍−宿主の関係上重要な事象である。 本発明の範囲はまた、自己由来の放射線照射を受けたハプテン結合細胞組成物 が癌の疑いのある患者に対して有効であるかを決めるために、腫瘍によるサイト カイン産生をスクリ−ニングする方法であって、以下の工程を含む方法を含む； 該患者に該ハプテン結合組成物を投与し；患者組織サンプルから核酸を含む試料 を得て；サイトカイン特異的核酸に特異的なプロ−ブをハイブリダイゼ−ション させることによって、該組織試料中のサイトカイン特異的核酸を増幅するか、あ るいはシグナルを増加させる、ここにおいて、当該増幅核酸又は増幅信号の存在 は癌を示唆し、当該組織試料からの当該増幅核酸又は増幅信号の存在は、該ハプ テン結合組成物が有効であることを示唆する。 組織サンプルは例えばメラノ−マ腫瘍あるいは例えば皮下炎症性の転移性メラ ノ−マの様な悪性もしくは前悪性の腫瘍である。さらに組織サンプルは固体組織 でも液状組織でもよく、非限定的に癌が疑われる患者の癌の全体あるいは一部、 唾液腺、喀痰、粘液、骨髄、血清、血液、尿、リンパ液、あるいは涙であるが、 もとよりこれに限定されない。 ＤＮＡ（ｃＤＮＡを含む）およびＲＮＡ（ｍＲＮＡを含む）等の核酸を、患者 組織試料より得る。好ましくはＲＮＡは組織サンプルより得る。総ＲＮＡは、本 明細書に全文が参考文献として援用されるＳａｍｂｒｏｏｋら．，Ｍｏｌｅｃｕ ｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ（Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎ ｇ Ｈａｒｂｏｒ，ＮＹ，１９３９）記載の様な当業者に公知のいずれかの方法 にて抽出される。 核酸の抽出は、該核酸の増幅後に続いて当業者公知のいずれかの技術により行 う。増幅段階ではサイトカイン特異的配列の一部に相補的であるプライマ−配列 を少なくとも１つ使用する。本発明の目的のためのサイトカイン特異的配列は、 ＩＦＮγ、ＴＮＦ、ＩＬ−２、ＩＬ−１２およびＩＬ−１３をコ−ドする配列の 全てあるいは一部を含むものである（もとよりこれに限定されない）。一般には 、プライマ−配列はおよそ２１ヌクレオチドからおよそ３３ヌクレオチドの長さ であり、好ましくはおよそ２１ヌクレオチド、３１ヌクレオチド、３２ヌクレオ チドならびにおよそ３３ヌクレオチドの長さである。 増幅法に有用なプライマ−配列には、配列番号１および２のβアクチン、配列 番号３および４のＩＦＮγ、配列番号５および６のＩＬ４，配列番号７および８ のＩＬ１０、そして配列番号９および１０のＴＮＦが含まれるが、もとよりこれ に限定されるものではない。 鋳型に依存した増幅工程では１組のプライマ−を用いるが、該組を構成する１ つのプライマ−はサイトカイン特異的蛋白質をコ−ドする核酸配列に相補的なオ リゴヌクレオチドを含んでもよい。該組を構成するもう１つのプライマ−は配列 番号１から１０から構成されるグル−プから選択することができる。 あるいは、プライマ−組を構成する２つのオリゴヌクレオチドのそれぞれは、 サイトカインをコ−ドする核酸配列に特異的でもよい。例えばプライマ−をサイ トカイン配列中の離れた領域に相補的になるよう設計することもできる。分離さ れた領域とは、第１プライマ−をサイトカイン配列の３’域に相補的に設定し、 第２プライマ−はサイトカイン配列の５’域に相補的に設定するということであ る。好ましくは、プライマ−は明確に分離した領域に相補的であり、プライマ− 同士は相補的でにないものである。配列番号１−１０のプライマ−は本発明に利 用できるプライマ−の一例である。 増幅法が、複製連鎖反応のように２つのプライマ−を必要とする場合、第１の プライマ−を配列番号１，３，５，７，ならびに９のグル−プから選択すること ができ、第２のプライマ−は配列番号２，４，６，８ならびに１０からなるグル −プより選択することができる。本発明の方法において、核酸を相互の方向に転 写し、サイトカインに特異的であるプライマ−対であれば、任意のものを使用で きる。 ＲＮＡを全抽出することが望ましい。本明細書中での”増幅”という用語は、 鋳型依存的な工程ならびにベクタ−を利用した増殖により、特異的な核酸分子が 初濃度に比べて増加するか、もしくは検出可能なシグナルを発する濃度まで増加 することを意味している。本明細書における鋳型依存的な工程とは鋳型に依存し たプライマ分子の伸長を含む工程を意味している。鋳型依存的な工程とは、新た に合成された核酸鎖の配列が公知の相補的塩基対形成のル−ルに従って行われる ＲＮＡあるいはＤＮＡ分子の核酸合成を意味している（例えば、本明細書に全文 が参考文献として援用されるＷａｔｓｏｎ，Ｊ．Ｄ．ら．，Ｉｎ： Ｍｏｌｅｃ ｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ ｏｆ ｔｈｅ Ｇｅｎｅ、４ｔｈ Ｅｄ．，Ｗ．Ａ ．Ｂｅｎｊａｍｉｎ、Ｉｎｃ．，Ｍｅｎｌｏ Ｐａｒｋ、Ｃａｌｉｆ．（１９８ ７）を参照）。典型的にはベクタ−を利用した方法は、核酸断片をＤＮＡあるい はＲＮＡベクタ−導入し、クロ−ンを増殖させてベクタ−を増やし、増えた核酸 断片を回収することを含む。この方法例は本明細書に全文が参考文献として援用 されるＣｏｈｅｎら（米国特許第４，２３７，２２４号）、ならびにＭａｎｉａ ｔｉｓ，Ｔ．ら．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ（Ａ Ｌａｂｏｒａｔ ｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ）、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒ ａｔｏｒｙ、１９８２に記載されている。 試料中に存在する所望の配列を増幅するために、多数の鋳型依存的な方法が利 用可能である。最もよく知られている増幅方法は複製連鎖反応（ＰＣＲ）であり 、本法はいずれも本明細書に全文が参考文献として援用される米国特許第４，６ ８３，１９５号、４，６８３，２０２号および４，８００，１５９号、そしてＩ ｎｎｉｓら．，ＰＣＲ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ．Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ、 Ｉｎｃ．，Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ ＣＡ，１９９０に詳細に記載されている。簡単 に説明すると、ＰＣＲでは標的とする配列の相対する相補鎖の領域に相補的な２ つのプライマ−配列を調製する。過剰量のデオキシヌクレオチド３リン酸をＤＮ Ａポリメラ−ゼ（例えばＴａｑポリメラ−ゼ）と一緒に反応液に加える。標的配 列が試料中に存在すると、プライマ−は標的配列に結合し、ポリメラ−ゼが標的 配列にそってプライマ−にヌクレオチドを付加して伸長させる。反応混合液の反 応温度を上下させることによって、伸長したプライマ−を標的から解離させて反 応産物を形成させ、さらに過剰のプライマ−が標的と反応産物に結合して上記反 応を繰り返す。好ましくは、増幅したｍＲＮＡ量を定量化するために逆転写ＰＣ Ｒ増幅法を行うことができる。複製連鎖反応の方法論は当業者に周知である。 その他の増幅方法としては本明細書に全文が参考文献として援用される欧州特 許第３２０，３０８号のリガーゼ鎖反応法（以下ＬＣＲと言う）がある。ＬＣＲ では、２組の相補的プロ−ブ対を調製し、標的配列存在下に各対を標的配列の相 対する相補鎖に結合させ互いを近接させる。リガーゼの存在により、２組のプロ −ブ対は結合して１つのユニットとなる。ＰＣＲの様な温度サイクルにより、結 合したプロ−ブのユニットは標的から解離し、今度は過剰に存在しているプロ− ブ対の標的配列となる。本明細書に全文が参考文献として援用される米国特許第 ４，８８３，７５０号には標的配列にプロ−ブ対を結合させるＬＣＲと同様の増 幅方法が記載されている。 本明細書に全文が参考文献として援用されるＰＣＴ出願第ＰＣＲ／ＵＳ８７／ ００８８０に記載されているＱベ−タレプリカ−ゼも本発明に利用可能な別の増 幅方法である。この方法では、標的域に相補的な領域を有するＲＮＡの複製配列 をＲＮＡポリメラ−ゼ存在下にサンプルに加える。ポリメラ−ゼは複製配列をコ ピ−し、これが検出できる。 制限酵素とリガーゼを用いてヌクレオチド５’−［α−チオ］３リン酸を制限 酵素部位の片方の鎖中に含む標的分子を増幅する等温増幅法（Ｗａｌｋｅｒ，Ｇ ．Ｔ．，ら．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ，Ｓｃｉ．（Ｕ．Ｓ．Ａ）１９９ ２，８９：３９２−３９６、本明細書に全文が参考文献として援用される）もま た本発明の核酸増幅法として利用できる。 鎖の置換と合成、すなわちニックトランスレ−ション等の多数繰り返しを含む 鎖置換増幅法（ＳＤＡ）も核酸の等温増幅を行うための別法である。同様の方法 、修復鎖反応法（ＲＣＲ）も、本発明に利用できる別の増幅方法にである。この 方法はまず増幅対象域全体をカバ−する複数のプロ−ブをアニーリングさせ、４ 塩基中の２塩基だけが存在する修復反応を行う。その後に残った２塩基は、検出 容易のためにビオチン化誘導体を加えることができる。ＳＤＡでも同様の方法を 利用する。 サイトカイン特異的配列はサイクリックプロ−ブ反応法（ＣＰＲ）でも検出で きる。ＣＰＲでは、サイトカイン非特異的ＤＮＡ配列を３’と５’配列に持ち、 中央部にサイトカイン特異的ＲＮＡ配列を持つプロ−ブを試料中のＤＮＡとハイ ブリダイズさせる。ハイブリダイゼ−ションの際に、反応産物をＲＮａｓｅＨで 処理して、プロ−ブ産物をこの消化により遊離してくるシグナルを生成する識別 可能な産物として同定する。元々の鋳型は別のサイクルプロ−ブと結合し、上記 反応を繰り返す。すなわち、ＣＰＲはプロ−ブをサイトカイン特異的核酸にハイ ブリダイゼ−ションさせることで生まれるシグナルを増幅する方法である。 本明細書に全文が参考文献として援用されるＧＢの出願第２２０２３２８号お よびＰＣＴ出願ＰＣＴ／ＵＳ８９／０１０２５号に記載されている別の増幅方法 も本発明に利用できるだろう。前者出願では、”修飾”プライマ−をＰＣＲの様 に用いて、鋳型および酵素に依存して合成を行う。プライマ−は捕捉部分により （例えばビオチン）および／または検出部分（例えば、酵素）により標識されて いてもよい。後者の出願では、過剰の標識プロ−ブを試料に加える。標的配列が あると、プロ−ブは結合し触媒作用により切断される。切断後、標的配列はその ままの形で放出され、過剰のプロ−ブと結合する。標識プロ−ブの切断が標的配 列の存在の信号となる。 その他の核酸配列法は、転写増殖システム（ＴＡＳ）（Ｋｏｗｈ Ｄ．，ら． ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．（Ｕ．Ｓ．Ａ．）１９８９、８６： １１７３，Ｇｉｎｇｅｒａｓ Ｔ．Ｒ．，らＰＣＴ出願ＷＯ８８／１０３１５， 本明細書に全文が参考文献として援用される）や核酸配列増幅法（ＮＡＳＢＡ） や３ＳＲ法を含む。ＮＡＳＢＡ法では、増幅のための核酸は、標準的なフェノ− ル／クロロホルム抽出法、臨床サンプルの熱変性、溶解緩衝液処理及びミニスピ ンカラムを用いたＤＮＡとＲＮＡの分離、あるいはグアニジン塩酸によるＲＮＡ の抽出、を用いて調製できる。これら増幅技術は前立腺特異的配列を有するプラ イマ−へのアニーリングを含む。重合反応に続いて、ＤＮＡ／ＲＮＡハイブリッ ドをＲＮａｓｅ Ｋで消化し、一方二重鎖ＤＮＡ分子は再度熱変性する。いずれ の場合も１本鎖になったＤＮＡに第二の前立腺特異的プライマ−を加えて重合反 応を行い完全長の２本鎖分子を得る。それから２本鎖ＤＮＡ分子にＴ７あるいは ＳＰ６の様なポリメラ−ゼを用いて転写反応を繰り返す。等温サイクル反応では 、ＲＮＡは２本鎖ＤＮＡに逆転写され、それからもう一度Ｔ７あるいはＳＰ６の 様なポリメラ−ゼにより転写される。得られた産物は不完全なものでも完全なも のでも、前立腺癌特異的配列を示す。 Ｄａｖｅｙ，Ｃ．，ら、本明細書に全文が参考文献として援用される欧州特許 出願３２９，８２２号は、本発明に利用できる１本鎖ＲＮＡ（”ｓｓＲＮＡ”） 、ｓｓＤＮＡ、および２本鎖ＤＮＡ（ｄｓＤＮＡ）を繰り返し合成することを含 む核酸増幅法を開示している。ｓｓＲＮＡは、鋳型として第１プライマ−オリゴ ヌクレオチドの第一鋳型となり、逆転写反応により鎖の伸長を行う（ＲＮＡ依存 型ＤＮＡポリメラ−ゼ）。それからリボヌクレア−ゼＨ（ＲＮａｓｅＨ、ＤＮＡ もしくはＤＮＡいずれかよりなる２重鎖におけるＲＮＡに特異的なＲＮａｓｅ） を用いてＲＮＡをこのＤＮＡ：ＲＮＡ２重鎖より除去する。得られたｓｓＤＮＡ は第２プライマーの第２の鋳型となり、鋳型と相同性を有する部分の５’側にＲ ＮＡポリメラ−ゼプロモ−タ−の配列（たとえばＴ７ ＲＮＡポリメラ−ゼ）を 含む。それからＤＮＡポリメラ−ゼ（例え大腸菌ＤＮＡポリメラ−ゼＩの大きな ”クレノー”断片）を用いてこのプライマ−を伸長し、プライマ−間に元々のＲ ＮＡ配列と同じ配列を有し、さらに一端にプロモ−タ−配列を有する２本鎖ＤＮ Ａ （”ｄｓＤＮＡ”）分子を得る。適当なＲＮＡポリメラ−ゼを利用するとこのプ ロモ−タ−配列から多数のＤＮＡのＲＮＡコピ−を作ることができる。次にこれ らのコピ−はサイクルに再び入ることができ、非常に迅速な増幅を行うことがで きる。酵素を適切に選択すると、新たな反応毎に酵素を添加することなく等温的 に増幅することができる。この反応が繰り返すサイクル反応であることから、出 発配列はＤＮＡでもＲＮＡのいずれでも選択できる。 Ｍｉｌｌｅｒ，Ｈ．Ｉ．，らは本明細書に全文が参考文献として援用されるＰ ＣＴ出願８９／Ｕ６７００号においてプロモ−タ−／プライマ−配列を１本鎖Ｄ ＮＡ（”ｓｓＤＮＡ”）とハイブリダイゼ−ションさせた後に、当該配列の多量 のＲＮＡコピ−転写を行う核酸配列増幅法を開示している。この方法はサイクル 型ではない；すなわち得られたＲＮＡ転写体から新たに鋳型は産生されない。そ の他の増幅法としては、本明細書に全文が参考文献として援用されるＦｏｒｈｍ ａｎ，Ｍ．Ａ．，らによる”レ−ス”法：ＰＣＲ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ：Ａ Ｇ ｕｉｄｅ ｔｏ Ｍｅｔｈｏｄｓ ａｎｄ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ １９９ ０，Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，Ｎ．Ｙ．）や”片側ＰＣＲ”（Ｏｈａｒａ ，Ｏ．，らＰｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．（Ｕ．Ｓ．Ａ．）１９８９ 、８６：５６７３−５６７７）が含まれる。 ”ジ−オリゴヌクレオチド”を生じる様な配列を有する核酸存在下に２種類（ あるいはそれ以上）のオリゴヌクレオチドを結合させ、それによってジ−オリゴ ヌクレオチドを増幅する方法（本明細書に全文が参考文献として援用されるＷｕ ，Ｄ．Ｙ．らＧｅｎｏｍｉｃｓ １９８９，４：５６０）も本発明の増幅工程に 使用することができる。 増幅後は、増幅産物の有無を検出することができる。増幅産物は当分野公知の 方法であり、前述のＳａｍｂｒｏｏｋ資料を参考にできるＭａｘａｍ Ｇｉｌｂ ｅｒｔ法にて配列決定できるが、もとよりこれに限定されるものではない。配列 決定された増幅産物は、ワクチン投与前に得た組織の配列と比較することができ る。ワクチン投与前の組織サンプルはサイトカイン配列、特にＩＦＮγ、ＴＮＦ ，ＩＬ２、ＩＬ１２ならびにＩＬ１３の配列は有していないはずである。核酸は 様々なサイズの直鎖状断片に断片化されていてもよい。例えば；ＤＮＡ断片は当 業 者公知の方法であるアガロ−スゲルマトリックスを用いた電気泳動法でその分子 量に従って分離することができるが、もとよりこの方法に限定されるものではな い。次いでこのゲルをサザンブロットハイブリダイゼ−ションにより分析する。 簡単に述べると、ゲル中のＤＮＡを、非限定的にニトロセルロ−ス膜やナイロン 膜の様なハイブリダイゼ−ション基質もしくはマトリックス上に写し取る。標識 したプロ−ブを、マトリックス上にある相補的ＤＮＡとハイブリダイズするよう に選択された条件下にマトリックスに作用させる。プロ−ブは安定な２本鎖を形 成することができる長さのものでもよい。該プロ−ブの長さはおよそ２００から およそ１０，０００ヌクレオチドであり、好ましくは２００ヌクレオチドである 。非限定的に、例えば同様の疎水性および親水性を有するミスマッチ配列は、本 発明でも既に開示したとおり当業者において公知である。検出もしくは視認でき るようにするための標識としては、もとよりこれに限定されるものではないが、 例えば蛍光染色、臭化エチジウム染色、アビジン／ビオチン、³²Ｐ標識の様な放 射線標識等がある。ＰＣＲ産物の様な産物はアガロ−スゲルを用いて電気泳動し 、臭化エチジウムの様な色素にて染色し可視化するのが好ましい。先述のＳａｍ ｂｒｏｏｋら．，を参照。それからマトリックスをオ−トラジオグラフィ−を用 いて解析し、プロ−ブとハイブリダイズした断片を特定する。 自己由来の、放射線照射されたハプテン結合細胞組成物の効果を調べるための キットは、１つまたはそれ以上の容器、プライマ−の一方がサイトカイン特異的 配列に相補的であり、該プライマ−が配列番号１、配列番号２，配列番号３，配 列番号４，配列番号５，配列番号６，配列番号７，配列番号８，配列番号９，な らびに配列番号１０より選択される１組のプライマ−対、並びに増幅ＤＮＡを可 視化するための手段を含んでおり、当該キットは該組成物の効果決定に利用でき るものである。 以下実施例１−８ならびに１１と予備実施例９−１０ならびに１２−１４によ り本発明を説明するが、これらは説明のみを目的とするものであって、本発明を これら特異的実施態様に限定するものではない。 実施例１ ６４名の患者に、シクロフォスファミド（ＣＹ）を低用量投与した後に、前記 方法に従い調製したメラノ−マワクチンを用いて転移性メラノ−マの治療を行い 、免疫効果と抗腫瘍活性について調べた。０日に患者にシクロフォスファミド３ ００ｍｇ／Ｍ²の静脈注射を行った。３日後、患者に１０×１０⁶から２５×１０⁶ の自己由来の凍結保存した放射線照射（２５００Ｒ）腫瘍細胞をＢＣＧと混合 して作成されたワクチンを皮内注射した；腫瘍細胞は転移巣塊を酵素的（コラゲ ナ−ゼおよびＤＮＡｓｅ）に解離させて得た。上記の治療過程を２８日ごとに８ 回繰り返した。 本治療による毒性としては、注射部位の局所性炎症反応と軽度の悪心ならびに シクロフォスファミド投与後の嘔吐のみであった。評価可能な転移巣を有してい た患者は４０名であった；５名に有効であった−４名が完治であり１名が部分治 癒であった。効果出現までの期間の中央値は１０ヶ月であった（７−８４ヶ月） 。患者内の１名は１１年目であるが緩和状態を続けている。退行は皮膚やリンパ 節転移巣だけでなく肺や肝臓の転移巣にも認められた。追加した６名の患者では 、抗腫瘍効果はこのワクチン治療特異的な結果と思われた、即ち転移傷害の退行 はが免疫治療を開始した後に出現した。３名の患者では、この”遅延型”退行が ２つあるいは３つの腫瘍で起きた。 自己由来の機械的に解離させたメラノ−マ細胞に対する遅延型過敏症（ＤＴＨ ）は治療前では患者の１６％だけに観察され、治療第４９日、１６１日、２１７ 日の出現率はそれぞれ４６％、５６％、７３％であった。この免疫治療に続く遅 延型過敏症発症率の増加は非独立ｔ試験では統計的に有意であった；０日対４９ 日、ｐ＜０．００１；０日対１６１日、＜０．００１；０日対２１７日、ｐ＜０ ．０２１。全体では２６／４３の患者（６１％）がいずれかの時点で自己由来メ ラノ−マ細胞に対する遅延型過敏反応（≧５ｍｍ）を示した。患者はまた腫瘍細 胞懸濁液を調製するのに用いた酵素に対しても強い遅延型過敏反応を示した：ワ クチン２回投与後にコラゲナ−ゼとＤＮａｓｅ混合液（各１μｇ／ｍｌ）を用い て遅延型過敏症について試験できた２４名の患者の内２１名（８８％）が＞５ｍ ｍの反応を示した。ワクチンの抗腫瘍効果は、機械的に解離した自己由来メラノ −マ細胞に対する遅延型過敏症と、強く相関していることが以下の観察から示 唆された：１）腫瘍の退行が認められた１０名中８名が遅延型過敏症を示した； ２）手術後アジュバント適用患者では、自己メラノ−マ細胞に対する遅延型過敏 症の強さと腫瘍再発の間に有意な相関性が認められた（ｒ＝０．６８０，ｐ＜０ ．００１）；３）それぞれの元のワクチン（”旧”腫瘍）の自己メラノ−マ細胞 に対する遅延型過敏症を発症した９名の患者が新たな転移巣（”新”腫瘍）を発 症させたが、この新腫瘍は遅延型過敏症を惹起しないか、または惹起しても軽微 であった。これらの患者はワクチン治療前とおおむね同じ状態であった。患者は ワクチン試験を開始する１から２ヶ月前に、元々の治療から除外した。従って、 患者はワクチン試験開始時点では未治療状態にあった。 ３例で我々は退行した腫瘍を組織学的に調べることができた；これらの腫瘍は 強いリンパ細胞の浸潤を受けていた。逆に、これらの患者から免疫治療前に採取 した腫瘍は、有意なリンパ球浸潤が認められない悪性細胞の均質な塊であった。 本試験よりシクロフォスファミドを使用すると癌患者中にメラノ−マ抗原に対 する免疫反応を起こすことができることが示された。 実施例２ 転移性メラノ−マ患者の上腕部にＤＮＰを１％ジニトロクロロベンゼン（ＤＮ ＣＢ）あるいはジニトロフルオロベンゼン（ＤＮＦＢ）と共に局所投与して感作 した。２週間後に患者に１０×１０⁶から２５×１０⁶の自己由来の放射線照射し たメラノ−マ細胞にＤＮＰを結合させたワクチンをＢＣＧと混合して投与した。 シクロフォスファミド３００ｍｇ／Ｍ²をＤＮＣＢ（またはＤＮＦＢ）もしくは ワクチン投与３日前に静脈注射した。評価可能な４名の患者の内の２回のワクチ ン治療後（８週）の３名の腫瘍塊の中に、に強い炎症反応が生じた。患者＃１は 脚部と下部腹部の＞５０の大きさ（１−３ｃｍ）の皮膚転移巣内に紅斑と浮腫を 発し、潰瘍に進展したのち壊死物質が漏れ、そのいくつかは退行を始めた。生検 は、ＣＤ４＋ＣＤ８＋Ｔリンパ細胞による浸潤を示した。患者＃２は下腹部皮膚 の紅斑と浮腫ならびに鼠径部を覆う大きな（８ｃｍ）リンパ節塊を発した。これ らの症状はまだ退行していないが、硬固状態から柔らかな状態に漸次移行してい る。患者＃３は３つの皮下転移巣上の皮膚に紅斑を有していた。これら３患者は 全てＤＮＣＢとＤＮＰが結合した自己リンパ細胞に対する遅延型過敏症を示した 。 これらの患者を、ワクチン治療前の状態と比較した。ワクチン試験前に治療を受 けていた患者は、ワクチン治療開始１から２ヶ月前に治療から除外した。従って 、患者はワクチン試験開始時には未治療状態にあった。 実施例３ １５名の患者について（実施例２の３名を含む）免疫治療の新しい方法：すな わちＤＮＰ結合腫瘍細胞ワクチンを用いて転移メラノ−マを治療した。患者の上 腕部にＤＮＰを５％ジニトロクロロベンゼンと共に局所投与して感作した。それ から４週毎に患者にシクロフォスファミド３００ｍｇ／Ｍ²を投与し、それから ３日後に１０×１０⁶から２５×１０⁶の自己由来の放射線照射したメラノ−マ細 胞にＤＮＰを結合させたものを投与した。この治療を６−８回繰り返した。患者 の大部分が（９２％）ＤＮＰ結合した自己由来リンパ細胞あるいは腫瘍細胞に対 する遅延型過敏反応（ＤＨＴ）を示した（平均ＤＴＨ＝１７ｍｍ）。ワクチンに より、１５名中１１名の患者に紅斑、浮腫、発熱ならびに腫瘍塊周辺の軟化から なる激しい炎症反応が皮下ならびに神経節転移巣に誘導され、１例では排膿が見 られた。生検はリンパ細胞の浸潤を示しており、これらの細胞が免疫病理および フロ−サイトメトリ−分析よりＣＤ３＋、ＣＤ４−、ＣＤ８＋、ＨＬＡ−ＤＲ＋ のＴ細胞であることが判明した。これらの組織にあるメラノ−マ細胞はＴ細胞の 接着分子であるＩＣＡＭ−１を強く発現していた。従って、ＤＮＰ−ワクチンは これまでの免疫治療では見られなかった強い抗メラノ−マ免疫性を有していると 思われる。患者をワクチン投与前の状態と比較した。ワクチン試験前に治療を受 けていた患者は、ワクチン治療開始１から２ヶ月前に治療から除外した。従って 、患者はワクチン試験開始時には未治療状態にあった。 実施例４ 本例では手術により転移巣を切除し臨床的には転移が認められない患者でのＤ ＮＰワクチンの有効性について検討した。４７名の患者をハプテンとＤＮＦＢ（ ジニトロフルオロベンゼン）に対して感作した。それから患者にＤＮＰを結合し た放射線照射済み自己由来のメラノ−マ細胞を皮内に注入した。２８日毎にワク チンを追加投与し、合計８回投与した。全ての患者に対して遅延型過敏反応、Ｄ ＴＨ、自己メラノ−マ細胞、ＤＮＰ−結合自己リンパ細胞、ならびに細菌抗原 に対する反応性を定期的に調べた。試験管内の試験は、転移性腫瘍および／ある いは末梢血液から分離した凍結保存したリンパ細胞を用い行った。 図１２は、手術後数ヶ月間ＤＮＰワクチンで治療した患者と、ハプテン化して いない対照ワクチンで治療した患者での無腫瘍の患者の数の比較である。本試験 で、手術により転移巣を切除し、臨床的に転移が認められない患者でのＤＮＰ− ワクチンの治療効果を試験した。全患者をハプテンとＤＮＦＢ（ジニトロフルオ ロベンゼン）に対して感作した。それから患者にＤＮＰを結合した放射線照射済 み自己のメラノ−マ細胞を皮内に注入した。２８日毎にワクチンを追加投与し、 合計８回投与した。全ての患者に対して遅延型過敏反応、ＤＴＨ、自己メラノ− マ細胞、ＤＮＰ−結合自己リンパ細胞、ならびに細菌抗原に対する反応性を定期 的に調べた。試験管内の試験は、転移性腫瘍および／あるいは末梢血液から分離 した凍結保存したリンパ細胞を用い行った。 ＣＹ（シクロフォスファミド）＝３００ｍｇ／Ｍ²静脈注射 丸薬、最初の２回 のワクチン投与前のみ投与 ワクチン＝５×１０⁶から２０×１０⁶自己由来、放射線照射メラノ−マ細胞にＢ ＣＧを混合したもの。 ＤＮＦＢ感作＝０．１ｍｌのアセトン−コ−ン油中の１．０ｍｇを側上腕に適用 した。 ＤＮＦＢチャレンジ＝０．１ｍｌのアセトン−コ−ン油中の２００μｇを前腕に 適用。 皮膚試験実施＝自己由来のメラノ−マ細胞、末梢血液リンパ細胞（ＰＢＬ）、Ｄ ＮＰを結合させた末梢血液リンパ細胞（ＰＢＬ−ＤＮＰ）、精製蛋白誘導体（Ｐ ＰＤ）（結核菌皮膚試験用）、細菌追想抗原 ０日：ＰＢＬ、ＰＢＬ−ＤＮＰだけ 皮膚試験結果判定＝硬化部位の平均直径 末梢血液採取＝１００ｃｃヘパリン血 一般検査＝全血球数（ＣＢＣ）、分化中の血球数（ｄｉｆｆ）、血小板数（ｐｌ ａｔｅｌｅｔｓ）、ＳＭＡ−１２（一般検査用パネル）、血中尿素窒素（ＢＵＮ ） ＤＮＰ感作−まず患者を以下の様にしてＤＮＰに感作した：第１７日目にシク ロフォスファミド３００ｍｇ／Ｍ²を素早く静脈内注射で投与した。３日後、第 １４日と１５日に患者をＤＮＦＢ（ジニトロフルオロベンゼン）に対して感作し た：アセトン−コ−ンオイルに溶解した１ｍｇのＤＮＦＢを直径２ｃｍの鉄製の 輪で領域制限して０．１ｍｌ用量局所投与した。２週後、患者に２００μｇのＤ ＮＦＢを局所適用し、さらにＤＮＰ−結合自己ＰＢＬを皮内投与してＤＮＰに対 する反応性を試験した。シクロフォスファミドを滅菌水で溶解調製し、適当量を 静脈注射により素早く投与した。 ワクチン調製−腫瘍塊を切り出した。細胞をコラゲナ−ゼとＤＮＡｓｅで酵素 的に解離させ、その後機械的にも分離させて速度コントロ−ル型冷凍庫で凍結し 、使用時まで液体窒素中に保管した。患者を治療する日に、細胞を融解し、洗浄 後、 ２５００Ｒで放射線照射した。それから細胞を再度洗浄し、フェノ−ルレッドが 入っていないハンクスバランス塩溶液に懸濁した。 メラノ−マ細胞へのＤＮＰの結合を行った。この作業は、腫瘍細胞をジニトロ フルオロベンゼン（ＤＮＦＢ）と無菌下で３０分間反応させ、その後滅菌生理食 塩水で洗浄して行った。 本ワクチンは０．２ｍｌのハンクス液に懸濁された５−２０×１０⁶生腫瘍細 胞である。ＢＣＧを加える時には、Ｔｉｃｅ ＢＣＧの１：１０希釈液を０．１ ｍｌ用いた。ワクチン投与は１回について上腕あるいは脚部に連続した箇所に１ 回づつ合計３回注射して行ったが、リンパ節切除する同側の四肢への注射は避け た。 試験方法−０日目に患者にシクロフォスファミド３００ｍｇ／Ｍ²を素早く静 脈内注射で投与した。３日後（＋３日目）に患者に自己メラノ−マワクチンを皮 内投与した。４週毎にワクチンを追加注射し合計８回投与した。シクロフォスフ ァミドは最初の２回の投与前だけに注射した。全てのワクチンはＤＮＰが結合し ており、Ｂａｃｉｌｌｕｓ Ｃａｌｍｅｔｔｅ−Ｇｕｅｒｉｎ（ＢＣＧ）と混合 されている。ＢＣＧはＴｉｃｅ株（パスツ−ル研究所株の亜株）をオルガノンテ クニカ社、Ｄｕｒｈａｍ，ＮＣより得た。凍結乾燥品を１ｍｌの滅菌水で再溶解 しリン酸緩衝生理食塩水、ｐＨ７．２で１：１０に希釈し、それからその内の０ ．１ｍｌを取り、ワクチンと混合して注射した。全てのワクチンは同部位に注射 した（上腕あるいは脚部）。 免疫評価−皮膚試験は０．１ｍｌの試験物質を前腕に皮内注射して行い、遅延 型過敏反応は４８時間目に硬化部分の平均直径を測定して行った。陽性反応は写 真を撮影した。以下の材料を使用した：１）１×１０⁶放射線照射した自己のメ ラノ−マ細胞；２）３×１０⁶の自己の末梢血液リンパ細胞でＤＮＰと未結合の ものと結合したものの両方；３）ハンクス液；４）ＰＰＤ−中強度；ならびに５ ）細菌追想抗原（ｍｉｃｒｏｂｉａｌ ｒｅｃａｌｌ ａｎｔｉｇｅｎ）−カン ジダ、トリコフィトン、ムンプスである。また、ＤＮＦＢへの接触感受性につい ては２００μｇを前腕の皮膚に適用し、４８時間目に硬化円部の面積を測定して 試験した。 患者全例から皮膚試験を実施した各時点でリンパ球と血清を分離し、凍結保存 するための採血を行った（採血スケジュ−ルについては表Ｉを参照）。定期的に 以下のテストを実施した：１）自己メラノ−マ細胞に対する増殖反応および細胞 傷害活性；ならびに２）ＤＮＰ−結合自己リンパ細胞に対する増殖反応である。試験期間 １）患者にはおよそ８ヶ月かけて８回のワクチン投与を行った。それから投与 は中止した。これらの患者については少なくとも最初の手術から５年間にわたり 再発について監視した。 ２）８回の投与が終了する前に、部分的な再発あるいは遠位部転移を起こした 患者は試験から除外し、臨床的に適当な治療を受けた（化学療法あるいは手術） 。 対照群は２２名の局所リンパ節へのメラノ−マ転移がある患者である。これら の患者は手術による切除を受けており、その時点で転移メラノ−マの臨床所見は 認められていない。それから、これらの患者にはハプテン化していない自己メラ ノ−マワクチンを投与された。まず、患者にはシクロフォスファミド３００ｍｇ ／Ｍ²が投与された。それから３日後に患者に１０×１０⁶から２５×１０⁶の放 射線照射を受けた自己メラノ−マ細胞にＢＣＧを混合したワクチンを皮内注射し た。シクロフォスファミド−ワクチン投与は２８日毎に繰り返した。合計で８回 投与した。患者は２ヶ月毎に臨床評価した。 対照患者の内、２年間にわたり癌がなかった者は２０％に過ぎなかった。一方 、本発明のＤＮＰ−ワクチンの投与を受けた患者は前述の様に有意に無癌の高い 生存率を示した。 ハプテン化したワクチンの投与を受けた患者全例では、もとの局所リンパ節に メラノ−マ転移巣を認めたが、遠位部への転移は認められなかった。この状態で 患者は罹患のリンパ節の手術による切除治療を受けた。手術により臨床的には症 状は解消したが、２年以内の転移メラノ−マ発症率は８０−８５％に達した。 対照群患者はハプテン化ワクチン群と比較するために同一の臨床条件に置いた 。即ち、対照群も局所リンパ節にメラノ−マ転移巣を有するが、遠位部への転移 は無く、罹患のリンパ節の手術による切除を受けている。非ハプテン化ワクチン で治療を開始した時、対照群患者は臨床的には病気でないが前述の様に８０％に 遠位部への転移が認められていた。 手術による治癒が見込めなかったメラノ−マ患者は、治癒率が０に近く、切除 可能なリンパ節転移巣を有する患者に比べてさらに生存期間が短いため対照群に は選択しなかった。 さらに、この様な患者では本発明のワクチンにより劇的に延びたパラメ−タであ る無病生存期間を測定することができない。 デ−タの統計解析は以下の様にした：無病生存期間と合計生存期間はＫａｐｌ ａｎ−Ｍｅｉｒプロットより計算した。ＤＮＰ−ワクチン患者と対照群患者の差 はＭａｎｔｅｌの対数ランク試験で解析した。これらは、上記デ−タの解析方法 として標準的な統計手法である。差はｐ＜．０１の時、有意とした。 追加の１７名の患者は引き続いて上記プロトコ−ルのアウトラインに従い投薬 をうけた（対照群の大きさは前記の理由より増加していない）。結果は同様に無 病生存率と合計生存期間の間に統計的な有意さが認められた。 実施例５ 自己のジニトロフェニル（ＤＮＰ）結合メラノ−マワクチン投与は、転移腫瘍 のＴ細胞浸潤を誘導し、局部転移巣が大きいためにリンパ節切除を行った患者の 生存期間を延ばした。このような作用はメラノ−マ特異的Ｔ細胞によるものと考 えられた。この様な細胞の増加はＤＮＰ−修飾メラノ−マ細胞に特異的なＴ細胞 （ＤＮＰ−ＭＥＬ）によるものである。臨床プロトコ−ル 患者は全て転移性メラノ−マであり、本明細書に全文が参考文献として援用さ れるＢｅｒｄ，Ｄ．，ら．，Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ。、１９９１，５１，２７３ Ｉに記載の様な自己、ＤＮＰ結合腫瘍ワクチンによる免疫治療を受けている。 患者よりインフォ−ムドコンセントを得ている。上記Ｂｅｒｄらの如く患者はま ず３００ｍｇ／Ｍ²のシクロフォスファミドによる前治療を受け、それから３日 後にアセトン−コ−ンオイルに溶かした１ＤＮＦＢ液０．１ｍｌを局所適用して ＤＮＦＢ感作を２日連続で受けた。２週間後に患者に再びシクロフォスファミド を投与し、３日後にＤＮＰ−結合メラノ−マワクチンを注射した。ＤＮＰワクチ ンは２８日ごとに繰り返し注射した。シクロフォスファミドは最初の２回の注射 前に投与した。ワクチンは１０×１０⁶から２５×１０⁶の凍結保存した、自己の 放 射線照射（２５００Ｒ）ＤＮＰ結合したメラノ−マ細胞にＤＮＰと、ＢＣＧ今混 合物を混合したものである。腫瘍調製物には全て、腫瘍浸潤したリンパ節組織の 残査であるリンパ細胞が含まれている。血清と末梢血リンパ細胞は以下の時点で 採取した：０日（感作前）、１４日目（ＤＮＦＢ感作後２週間目）、６３日目（ 第２回目ワクチン投与後）、１１９日（第４回ワクチン投与後）、１７５日（第 ６回ワクチン投与後）、２３１日（第８回ワクチン投与後）。細胞試薬 末梢血リンパ細胞はフィコ−ルを利用した密度勾配遠心分離法により分離した 。細胞を速度コントロ−ル型冷凍庫を用いて凍結溶媒（ＲＰＭＩ−１６４０（Ｍ ｄｅｉａｔｅｃｈ，Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ ＤＣ）＋１％ヒトアルブミン＋１０ ジメチルスルホキシド）中に凍結し、液体窒素中に保存した。末梢血リンパ細胞 のＨＬＡ型はＴｈｏｍａｓ Ｊｅｆｆｅｒｓｏｎ大学病院臨床検査部で決定した 。 メラノ−マ細胞は前述のＢｅｒｄらの方法（１９８６）により酵素的に転移塊 から得て凍結保存した。細胞株はこれらの懸濁液から確立し、１０％のウシ胎児 血清を含むＲＰＭＩ−１６４０中に維持した。本試験に参加した患者より得たメ ラノ−マ細胞株は米国タイプカルチャ−コレクションより得たモノクローナル抗 体パネルを利用したフロ−サイトメトリ−分析により決定したＭＨＣクラスＩの 違いにより分類した：（ＨＢ８２＝ＨＬＡ−Ａ２、ＨＢ１２２＝ＨＬＡ−Ａ３、 ＨＢ１６４＝ＨＬＡ−Ａ１１，２４）。ハプテン結合 末梢血リンパ細胞をＭｉｌｌｅｒ，Ｓ．Ｄ．とＨ．Ｎ．Ｃｌａｍａｎ、Ｊ．Ｉ ｍｍｕｎｏｌ．，１９７６，１１７，１５１９ならびにＧｅｃｚｙ，Ａ．Ｆ．お よびＡ．Ｂａｕｍｇａｒｔｅｎ，Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，１９７０，１９ １８ ９（本明細書に全文が参考文献として援用される）の方法に従い、それぞれ水溶 性ＤＮＦＢあるいはＤＮＢＳと３０分間インキュベートしてＤＮＰ修飾した。２ つの方法の収量は同等であった。特異性を検討するために、細胞をそれぞれＦｕ ｊｉｗａｒａ，Ｈ．，らＪ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１９８０，１２４，８６３およ びＢｏｅｒｒｉｇｔｅｒ，Ｇ．Ｒ．とＲ．Ｊ．Ｓｃｈｅｐｅｒ，Ｊ．Ｉｎｖｅｓ ｔ．Ｄｅｒｍａｔｏｌ．，１９８７，８８．３、（本明細書に全文が参考文献と して援用される）に従ってＴＮＢＳ、あるいはオキザロンとインキュベートして ＴＮＰで修飾した。ハプテンの結合はメラノ−マ細胞で繰り返した。 遅延型過敏反応（ＤＴＨ） 凍結保存した抹消血リンパ細胞を融解、洗浄後、ハンクスバランス塩溶液に再 懸濁した。細胞を３群：未修飾、ＤＮＰ結合、ＴＮＰ結合に分けた。洗浄後、１ ×１０⁶メラノ−マ細胞あるいは３×１０⁶末梢血リンパ細胞を０．１ｍｌのハン クス液に懸濁し、前腕皮内に注射した。ＤＴＨは４８時間目に硬化部の平均直径 を測定して決めた。メラノ−マ細胞を用いてＤＴＨ測定をもう一度行った。 全ての患者がＤＮＰ修飾した自己末梢血リンパ細胞に対しＤＴＨを起こした（ 図１）。ＤＴＨ反応はＤＮＦＢ局所適用後２週間目（第１４日）に明らかになり 、それから毎月ワクチン投与している間を通して変わらなかった。ＤＮＰ結合自 己メラノ−マ細胞懸濁液はＤＮＰ末梢血リンパ細胞より強くＤＴＨを惹起した（ 平均ＳＥ：末梢血リンパ細胞＝１３．１３ｍｍ±１．３ｍｍ、メラノ−マ細胞＝ ２１．９ｍｍ±３．６ｍｍ；ｐ＜０．０１）。ＴＮＰと結合した自己末梢血リン パ細胞は試験した５０名の患者には反応を引き起こさなかったことから、ＤＴＨ はＤＮＰ修飾した”自己”に特異的である。抗ＤＮＰ抗体 ＤＮＰ結合末梢血リンパ細胞でマイクロタイタ−ウエルをコ−ティングしてＥ ＬＩＳＡを作成した。この方法はＤＮＰ結合アルブミンを使ってプレ−トをコ− ティングするよりも好ましく、これによって感作前患者血清によるバックグラウ ンドの値を低くすることができる。ＤＮＰ結合末梢血リンパ細胞（０．１ｍｌ中 ５×１０⁵）を９６の平底プレ−トの各ウエルに加えた。細胞を乾燥させてさら に１００％メタノ−ルに５分間曝してプレ−トに固定した。それから、プレ−ト をリン酸緩衝生理食塩水＋０．０５％Ｔｗｅｅｎ−２０で５回洗浄した。試験血 清を段階希釈してウエルに加え、プレ−トを湿潤状態のチャンバ−内で３７℃、 １時間インキュベートした。インキュベート後、プレ−トを５回洗浄し、それか ら西洋ワサビパ−オキシダ−ゼ標識のヤギ抗ヒト免疫グロブリン（Ｃａｐｐｅｌ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｍａｌｖｅｒｎ，ＰＡ）を前もって最適化した希 釈率で希釈し加えた。ＩｇＧとＩｇＭ抗体を検出するためには、それぞれパ−オ キ シダ−ゼ標識ヤギ抗ヒトＩｇＧあるいはＩｇＭ抗体を用いた。３７℃１時間のイ ンキュベーション後、プレ−トを５回洗浄し、０．１ｍｌの基質（Ｏ−フェニレ ンジアミン、Ｓｉｇｍａ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏ．，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ ）を各ウエルに加え、さらに５０μｌの０．１２％過酸化水素を加えた。プレ− トをＥＬＩＳＡ測定器にて測光した。 測定はマウス抗ＤＮＰモノクロ−ナル抗体（クロ−ンＳＰＥ−７；Ｓｉｇｍａ ＩｍｍｕｎｏＣｈｅｍｉｃａｌｓ）とパ−オキシダ−ゼ標識抗マウス免疫グロ ブリン抗体を第二段階の試薬として用いて行った。続いて複数回ＤＮＰワクチン を注射を受けた患者より得た血清サンプルを陽性コントロ−ルとした。各血清サ ンプルの抗ＤＮＰ抗体力価は以下のようにして定義される： （サンプルの最高吸光度）×（陽性コントロ−ルの最高吸光度の１／２に等しい 吸光度の希釈率の逆数）Ｂｕｔｌｅｒ，Ｊ．Ｅ．，Ｍｅｈｔｏｄｓ Ｅｎｚｙｍ ｏｌ．，１９８１，７３，４８２。 抗ＤＮＰ抗体は試験した２７名の患者中２４名に見られた（図２）。ＤＴＨと は逆に、抗体はＤＮＦＢの局所適用では誘導されなかった（第１４日）。１９名 の患者で力価はＤＮＰ結合メラノ−マ細胞の皮内投与２回後に（第６３日）感作 前のレベルを越えた；さらに５名については４から６ワクチン投与後にのみ有意 な力価上昇が観察された。全ての患者でＩｇＧ抗体が認められた；抗ＤＮＰ Ｉ ｇＭが認められた患者は３名だけであった。抗ＤＮＰ抗体がＴＮＰ修飾細部とは 結合するが、関係ないハプテン、オキサザロンとは結合しないことから、抗ＤＮ Ｐ抗体がＴＮＰと交叉反応することが示された。Ｔ細胞株の樹立 末梢血リンパ細胞（１×１０⁶）を自己ＤＮＰ結合Ｂリンパ芽球細胞（１×１ ０⁵）とリンパ細胞培地の入った２４個の平底ウエルプレ−トで混合した。培養 ７日後にＩＬ２ １００Ｕ／ｍｌ（Ｃｅｔｕｓ Ｏｎｃｏｌｏｇｙ，Ｅｍｅｒｙ ｖｉｌｌｅ，ＣＡ提供）を加えた。増殖したＴ細胞培養体を培地＋ＩＬ２内で維 持し、必要に応じて分割し２２ｍｍ直径のウエル当たりおよそ２×１０⁶細胞液 濃度を維持した。１４日ごとに、培養体に自己ＤＮＰ結合Ｂリンパ芽球細胞を加 えて再刺激した。表現形はモノクロ−ナル抗体パネル（Ｂｅｃｔｏｎ−Ｄｉｃｋ ｉｎｓｏ ｎ，Ｓａｎ Ｊｏｓｅ，ＣＡ）を利用したフロ−サイトメトリ−で決定した。Ｃ Ｄ８＋ＣＤ４＋Ｔ細胞は、本明細書に全文が参考文献として援用されるＷｙｓｏ ｃｋｉ，Ｌ．Ｊ．およびＶ．Ｌ．Ｓａｔｏ、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓ ｃｉ．ＵＳＡ、１９７８，７５，２８４４記載の通常の方法に従い抗ＣＤ８抗体 あるいは抗ＣＤ４モノクロ−ナル抗体でコ−トしたＴ細胞を抗イムノグロブリン をコ−トした皿に接着させる間接パンニング法を利用して分離した；接着細胞を 分離してＤＮＰ修飾刺激剤とＩＬ２で増殖させた。 表現形質が均一なＴ細胞の亜集団を、２×１０⁶の放射線照射した自己由来の フィーダー細胞、２００Ｕ／ｍｌのＩＬ２、ならびにフィトヘマグルチニンを含 むリンパ細胞培地の入った丸底マイクロタイタ−ウエル内で限界希釈培養して得 た。増殖したリンパ細胞を含むウエルについて、ＤＮＰ修飾Ｂリンパ芽球細胞に 対して反応し増殖する能力を調べた。陽性ウエルをＩＬ２を用いて増殖させ、自 己ＤＮＰ結合Ｂリンパ芽球細胞で１４日ごとに再刺激した。リンパ細胞増殖反応− 末梢血リンパ細胞を応答細胞として試験した。細胞をリン パ細胞 培地内に懸濁し（ＲＰＭＩ−１６４０、１０％プ−ルヒトＡＢ血清、イ ンスリン−トランスフェリン−セレナイト培地添加剤（Ｓｉｇｍａ Ｃｈｅｍｉ ｃａｌ Ｃｏ．）２ｍＭ Ｌ−グルタミン、１％非必須アミノ酸、２５ｍＭ Ｈ ＥＰＥＳ緩衝液、ペニシリン＋ストレプトマイシン）で９６ウエルの丸底マイク ロタイタ−プレ−トに１×１０⁵細胞／ウエルの割合で加えた。刺激体細胞は； １）自己あるいは同種末梢血リンパ細胞、２）エプスタイン−バーウィルスで形 質転換して作られた、自己あるいは同種Ｂリンパ芽球細胞株、３）培養自己メラ ノ−マ細胞である；これらの細胞は放射線照射（５０００Ｒ）で不活性化されて いる。多くの実験では、応答細胞：刺激細胞の比率は１：１であった。プレ−ト をＣＯ₂インキュベ−タ−内に３７℃、５日間置いた；それからウエルに¹²⁵Ｉ標 識ＩＵＤＲ（ＩＣＮ Ｒａｄｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ，Ｃｏｓｔａ Ｍｅｓａ，Ｃ Ａ）で６時間パルス処理したのち自動採取装置で細胞を集め、ガンマカウンタ− で計測した。３つのウエルの測定値の平均を計算した。培養Ｔ細胞についても上 記の方法を用いてリンパ細胞増殖反応を調べた。 ＤＮＰ修飾自己細胞に対するＤＴＨ活性が最高値の時に凍結保存した４名の患 者の末梢血リンパ細胞を融解し、試験管内での増殖応答を調べた。４名全員の末 梢血リンパ細胞がＤＮＰ修飾細胞の刺激で増殖した（図３）。これらの患者中１ 名（ＤＭ２）の増殖反応の変化動態を図４に示す。ＤＮＦＢだけを適用した場合 （第１４日）には循環系に応答細胞は検出されなかった。反応性末梢血リンパ細 胞はＤＮＰ−ワクチン２回投与後（第６３日後）に検出されるようになり、その 後ワクチン投与した８ヶ月間持続して検出された。 ＤＮＰ修飾細胞に対する増殖応答は、未結合末梢血リンパ球もＴＮＦ修飾した 末梢血リンパ球も反応を惹起しないことから、特異的と考えられた（図５）。ワ クチン投与後の末梢血リンパ球もまた自己の腫瘍組織から得たＤＮＰ−修飾メラ ノ−マ細胞株による刺激を受けて活発に増殖した。同種リンパ細胞により刺激し た時には、末梢血リンパ球は期待通りＤＮＰ反応に比べ３から４倍大きな混合リ ンパ細胞反応を示した。 これらの患者の１例より得た循環Ｔリンパ細胞（ＤＭ２）を試験管内でＩＬ２ ならびに自己のＤＮＰ修飾Ｂリンパ芽球細胞で繰り返し増殖させた。増殖４週後 に、Ｔ細胞を７０％がＣＤ３＋、ＣＤ８＋、で３０％がＣＤ３＋、ＣＤ４＋であ った。これらの細胞は自己のＤＮＰ修飾Ｂリンパ芽球細胞またはＤＮＰ修飾培養 メラノーマ細胞で刺激を受けると増殖し、しかし未修飾の自己細胞の場合には増 殖しなかった（図６）。これらの細胞をポジティブパンニングによりＣＤ８−豊 富分画とＣＤ４−豊富分画に分離したが、サイトフロ−メトリ−の結果これら分 画の純度は９８％であった。図７に示すように、ＣＤ４−豊富分画とＣＤ８−豊 富分画Ｔ細胞は共にＤＮＰ−修飾自己Ｂリンパ芽球細胞に増殖応答した。しかし 、ＤＮＰ修飾自己メラノ−マ細胞に応答したのはＣＤ８＋Ｔ細胞だけであった。 この結果は、メラノ−マ細胞株によるＭＨＣクラスIIの構成的発現が低い（５％ 未満）ためと思われる。 増殖したＴ細胞について、自己のＤＮＰ修飾Ｂリンパ芽球細胞で刺激したとき にサイトカインを産生できるか試験した。図８に示すように、細胞はγインタ− フェロンを産生したがＩＬ４は産生しなかった。ＣＤ４＋およびＣＤ８＋Ｔ細胞 がサイトカイン応答に関係しているかを決めるために、Ｔ細胞を限界希釈により プレ−ティングして得た亜株について解析した。各培養体はＣＤ４とＣＤ８の発 現に関しては均質であった。これらの亜株のうち３亜株（２つのＣＤ４＋亜株、 １つのＣＤ８＋亜株）についてＤＮＰ修飾Ｂリンパ芽腫細胞に対するサイトカイ ン応答を調べた。３亜株全てがγインタ−フェロンを産生したが、ＩＬ４を産生 した株はなかった（図８）サイトカイン産生 −Ｔ細胞を丸底のマイクロタイタ−プレ−トに１×１０⁵細胞 ／ウエルの割合で加えた。 等量の刺激体（ＤＮＰ修飾自己Ｂリンパ芽球細胞） を加え、その上清を１８時間のインキュベート後に採取した。市販のＥＬＩＳＡ キットを用いてγインタ−フェロン（Ｅｎｄｏｇｅｎ，Ｂｏｓｔｏｎ，ＭＡ；感 度＝５ｐｇ／ｍｌ）とＩＬ４（Ｒ＆Ｄシステムズ、Ｍｉｎｎｅａｐｏｌｉｓ，Ｍ Ｎ：感度＝３ｐｇ／ｍｌ）を測定した。 応答のＭＨＣ依存性を調べるために、刺激体細胞をＭＨＣクラスＩ（Ｗ６／３ ２）あるいはＭＨＣクラスII（Ｌ２４３）に対するモノクロナ−ル細胞と１０μ ｇ／ｍｌの濃度で応答細胞を加える前１時間に前反応した。同濃度の非特異的マ ウス免疫グロブリンを陰性コントロ−ルとして試験した。 ＤＮＰ反応性ＣＤ８＋Ｔ細胞は全体集団をパンニングして得、これをＩＬ２含 有培地内で繰り返しＤＮＰ修飾自己Ｂリンパ芽球細胞で刺激し、長期間（３ヶ月 以上）培養維持することができた；これらの細胞の表現形は安定しており、ＣＤ ３＋、ＣＤ８＋であった。これら細胞の反応がＭＨＣクラスＩに拘束されている 証拠が２つ得られた：１）刺激体を抗クラスＩ共通抗体（ｆｒａｍｅｗｏｒｋ ａｎｔｉｂｏｄｙ）で前処理するとγインタ−フェロン産生が阻止されたが、抗 クラスII抗体では阻止されなかった（図９）、２）Ｔ細胞はＨＬＡ−Ａの一つあ るいは両方の座（ｌｏｃｉ）が一致した自己ＤＮＰ修飾刺激体には応答したが、 ＨＬＡ−Ａが不適合な刺激体には反応しなかった。図１０に示すように、Ｔ細胞 はＤＮＰ修飾同種末梢血リンパ球（ＨＬＡ−Ａ１、Ａ２，Ｂ８＋、Ｂｗ６）によ る刺激、およびＡ１あるいはＡ２もしくはその両方を発現しているＤＮＰ修飾自 己末梢血リンパ球の刺激により増殖した；しかしＡ１とＡ２が陰性であるＤＮＰ 修飾同種刺激体によっては増殖を誘導されなかった。細胞毒性 −メラノ−マ標的細胞を⁵¹Ｃｒ（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｃｏｒｐ、Ａｒｌ ｉｎｇｔｏｎ Ｈｅｉｇｈｔｓ，ＩＬ）で２時間標識し、２５００細胞を丸底の マイクロタイタ−ウエルに加えた。それからエフェクタ−細胞を各種のエフェク タ−細胞：標的細胞比になるよう加えた。６時間３７℃でインキュベートした後 、上清を取り出してガンマカウンタ−で測定した。細胞破壊は以下に定義した： （［ＣＰＭ ｔｅｓｔ−ＣＰＭｓｐｏｎｔａｎｅｏｕｓ］／［ＣＰＭｔｏｔａｌ −ＣＰＭｓｐｏｎｔａｎｅｏｕｓ］）×１００。 ＣＤ８＋Ｔ細胞株の細胞毒性は自己メラノ−マ細胞を標的細胞とした⁵¹Ｃｒ放 出アッセイ法で試験した。自然の⁵¹Ｃｒ放出を最小限にするために、ＤＮＰ修飾 をＤＮＦＢではなくＤＮＢＳを用いて行った。Ｔ細胞はＤＮＰ修飾自己メラノ− マ細胞を破壊したが、同種（クラスＩ不適合）のメラノ−マ細胞は破壊しなかっ た（図１１ａ、１１ｂ）。破壊に対する感受性とＤＮＰ修飾の度合いには、使用 したＤＮＢＳ濃度においては直接の相関性が認められた。ＴＮＰで修飾した自己 あるいは同種標的細胞は破壊されなかった。 実施例６ 集めた臨床デ−タからは、大きいが切除可能な局所リンパ節転移巣を持ったメ ラノ−マ患者では自己のＤＮＰ修飾メラノ−マワクチンが無病生存期間（ＤＦＳ ）と総生存期間（ＴＳ）を延長することが示唆された。４７名の患者が標準的な リンパ節切除による転移巣切除を受けた。腫瘍細胞を酵素的に組織から解離して 凍結保存した。ワクチンはＤＮＰを結合した１０×１０⁶から２０×１０⁶の放射 線照射した（２５００ｃＧｙ）メラノ−マ細胞とＢＣＧを混合して作成された。 このワクチンを２８日ごとに静脈注射し、計８回投与した。シクロフォスファミ ド３００ｍｇ／Ｍ²を最初の２回のワクチン投与時のみ３日前に投与した。投与 された患者のＤＦＳおよびＴＳを、実施例４の以前に未修飾ワクチンを投与した リンパ節切除メラノ−マ患者２２名の結果と比較した。ステ−ジ３（リンパ節内 に触診できる）の３６名の患者の内、２２名が平均追跡期間３３ヶ月無病であっ た。Ｋａｐｌａｎ−Ｍｅｉｒ分析より、患者の３年ＤＦＳとＴＳはそれぞれ５９ ％と７１％であった。対して、未結合のワクチンで治療したステージ３の患者の ＤＦＳおよびＴＳは、２２％と２７％であった（Ｐ＝０．０１，対数階級試験） 。ステ−ジ４（２つのリンパ節域に触診できる塊がある）のうち、５名が平均追 跡期間４１ヶ月ＮＥＤ（疾患証拠無し）であった。ステ−ジ３および４の患者で は、 最も高い再発率は当初６ヶ月のものであり、ちょうど抗メラノ−マ免疫が確立し ていない時期に相当する。このことは、感作スケジュ−ルを早めることで初期再 発率を少なくし全体の臨床結果を改善することから確かめられる。患者は、ワク チン治療前の状況と比較された。患者はワクチン試験開始前１から２ヶ月前に、 それ以前に受けていた治療から除外されている。従って、患者はワクチン試験開 始時は無治療の状態にあった。 実施例７ 材料と方法ヒトメラノ−マ組織と細胞株 −組織はワクチンプログラムに参加する前とワクチ ン投与後に転移性メラノ−マ患者より得た。ＤＮＰ−ワクチン投与の臨床プロト コ−ルはＢｅｒｄ，Ｄ．，らＣａｎｃｅｒ Ｒｅｓ． １９９１ ５１：２７３ １−２７３４に従い実施した。手術後、腫瘍サンプルを検査室に運び、腫瘍組織 を周囲の脂肪や結合組織から分離し、２−４ｍｍ³の大きさに切断してから液体 窒素に入れて急冷凍結した。同じサンプルのメラノ−マ細胞株は組織を酵素消化 し（ＤＮＡａｓｅとコラゲナ−ゼ）Ｂｅｒｄ，Ｄ．，らＣａｎｃｅｒ Ｒｅｓ． １９８６ ４６；２５７２−２５７７記載の方法で継代して得た。ＲＮＡの分離とＲＴ−ＰＣＲによる増幅 −凍結組織をグアニジンイソチオシアネ −ト内で破砕した後、ＣｓＣｌ勾配を利用したＬａｔｔｉｍｅ，Ｅ．Ｃ．，らの 方法Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１９９８ １４４；３４２２−３４２８を用いて全Ｒ ＮＡを分離した。組織ＲＮＡの消失を最小限にするために、大腸菌リボソ−ムＲ ＮＡ（ＳＩｇｍａ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏｒｐ．，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ） １５μｇをサンプルに加えた。分離したＲＮＡをジエチルピロカ−ボネイト処理 （ＤＥＰＣ−ｔｘ）（Ｓｉｇｍａ）した脱イオン蒸留水に再懸濁した。ｃＤＮＡ 合成は１０μｇのＲＮＡに、ランダムプライマ−（Ｇｉｂｃｏ ＢＲＬ、Ｇａｉ ｔｈｅｓｂｕｒｕｇ，ＭＤ）とＤＥＰＣ−ｔｘ水ＲＴ緩衝液を用いて行った。こ れを６５℃で１０分間反応させてから４℃に置いた。これに１０ｍＭのＤＴＴ（ Ｇｉｂｃｏ ＢＲＬ）、各０．５ｍＭのｄＡＴＰ，ｄＣＴＰ，ｄＴＴＰ，ｄＴＴ Ｐ（Ｇｉｂｃｏ ＢＲＬ）と５００ＵのＭＭＬＶ−ＲＴ（Ｇｉｂｃｏ ＢＲＬ） を加えて最終容量を５０μｌとした。サンプルを３７℃で１時間反応させて、 それから９５℃で５分間加熱した。 ＰＣＲ増幅は各ｃＤＮＡ５μｌＰＣＲ反応緩衝液、各０．２ｍＭのｄＡＴＰ， ｄＣＴＰ，ｄＧＴＰ，ｄＴＴＰと１．２５ＵのＡｍｐｌｉＴａｑ ＤＮＡポリメ ラ−ゼ（Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ）、各プライマ−対に最適であることが確認 されている濃度のＭｇＣｌ（最終濃度は１．５−６．０ｍＭ）と最終容量が５０ μｌになるよう０．５ｍＭの各プライマ−対が入ったＭｉｃｒｏＡｍｐ反応チュ −ブ（Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ、Ｎｏｒｗａｌｋ，ＣＴ）に加えた。本試験で 使用したプライマ−対はβアクチン、ＴＮＦ−α、ＩＬ−４、ＩＦＮγ，Ｓｏｕ ｔｈ Ｓａｎ Ｆｒａｎｃｉｓｃｏ，ＣＡ）ならびにＩＬ１０（Ｃｌｏｔｅｃｈ ，Ｐａｌｏ ＡＬｔｏ，ＣＡ）である。βアクチンはＲＴならびにＰＣＲ反応の 標準品としてと、サンプル間のｍＲＮＡ発現を相対比較するための標準品として 使用した。ＰＣＲサンプルはＧｅｎｅＡｍｐ Ｓｙｔｅｍ ９６００サ−マルサ イクラ− Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ）を使用して増幅した。各サンプルは９４ ℃、３７秒間加熱して変性させ、５５℃４５秒間アニ−ルさせ、７２℃６０秒間 の伸長反応からなるサイクルを３９回行い、その後７２℃で１０分間処理をした 。 ＰＣＲ産物と分子量マ−カ−（ＮＯｖａｇｅｎ，Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ）を２ ．０％アガロ−スゲル（ＦＭＣ ＢｉｏＰｒｏｄｕｃｔｓ，Ｒｏｃｋｌａｎｄ， ＭＥ）で分離した。ゲルは臭化エチジウムで染色し、紫外線照射して可視化して 写真撮影した。ＰＣＲ産物の電気泳動では、各プライマ−について期待された大 きさの断片からなるバンドが認められた。逆転写していないＲＮＡを用いたＣＲ 増幅をゲノミックＤＮＡの汚染を確認するための対照として実施した。 凍結保存され、酵素により解離されたメラノ−マ組織の細胞懸濁液はＲＮＡ分 析には不適である−これらの組織は通常、解離操作により活性化された結果と思 われる試験した全てのサイトカインｍＲＮＡの発現が認められる。組織学と生体内ＲＴ−ＰＣＲ −通常のヘマトキシリン−エオシン染色を代表的な サンプルについて病理学教室にて行った。生体内ＲＴ−ＰＣＲはプロテイネ−ス Ｋを用いて浸透化したパラフィン切片に逆転写酵素を作用させ、得られたＩＬ１ ０のＤＮＡをＢａｇａｓｒａ，Ｏ．，ら．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈ．１ ９９３ １５８：１３１−１４５の方法と上記プライマ−を用いて増幅した。炎症を起こしたワクチン投与後バイオプシ−内のサイトカインｍＲＮＡ −転移性 メラノ−マの特徴はリンパ細胞の浸潤が少ないことであるが（Ｅｌｄｅｒら．、 ”Ｔｈｅ ｓｕｒｇｉｃａｌ ｐａｔｈｏｌｏｇｙ ｏｆ ｃｕｔａｎｅｏｕｓ ｍａｌｉｇｎａｎｔ ｍｅｌａｎｏｍａ．”Ｉｎ：Ｗ．Ｈ．Ｃｌａｒｋ，Ｊｒ ．，ら。（編集）、Ｈｕｍａｎ Ｍａｌｉｇｎａｎｔ Ｍｅｌａｎｏｍａ，ｐｐ ．１００，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ：ＧｒｕｎｅとＳｔｒａｔｔｏｎ １９７９）、Ｄ ＮＰワクチンを投与すると転移塊内にＴ細胞の浸潤が誘導された（Ｂｅｒｄら． ，１９９１前出）。ワクチン投与後に炎症を示した８例の皮下転移巣（４名の患 者の）について調べ、ワクチン投与前の同皮下転移巣３例ならびにワクチン投与 後にも炎症を示さなかった４例と比較した。ワクチン投与後の炎症を示した箇所 のバイオプシ−にはＩＦＮγ（５／８）、ＩＬ４（４／８）あるいは両方（３／ ８）のｍＲＮＡが存在していた。一方、７例の対照例でにはＩＦＮγのｍＲＮＡ もＩＬ４のｍＲＮＡも共に認められなかった。１５例中１例を除き、すべての組 織がＩＬ１０のｍＲＮＡを発現していた。図１４は、Ｔ細胞浸潤が認められるワ クチン投与後のバイオプシ−の代表的なサイトカインｍＲＮＡの発現を対応する 組織学的変化とともに示したものである。リンパ節転移 −メラノ−マリンパ節転移を認めたバイオプシ−群について同様に 調べた。組織学的には、リンパ細胞の浸潤が多いことがこれらの傷害の特徴であ り（図１５）、これは腫瘍浸潤リンパ節リンパ球の残余であると考えられている （Ｃａｒｄｉ，ら．，Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ． １９８９ ４９：６５６２−６ ５６５）。試験した１０リンパ節中１例のみがＩＦＮγのｍＲＮＡを発現してい た；この試料ともう一つの試料にはＩＬ４のｍＲＮＡが存在していた。しかし、 ＩＬ１０のｍＲＮＡは全ての試料に認められた。図１５はリンパ節転移巣代表例 のサイトカインｍＲＮＡ発現を組織像とともに示している。メラノ−マ転移巣と細胞株のＩＬ１０産生 −上記のように、ＩＬ１０ｍＲＮＡの 発現が２４／２５のメラノ−マ転移巣に認められた（図１６）。この発現はＩＦ ＮγやＩＬ４のｍＲＮＡの発現とは無関係であり、Ｔ細胞の浸潤とは相関しない ことから、リンパ細胞ではなくメラノ−マ細胞自身がＩＬ１０を産生していると 考えられた。この仮説を証明するために２つの作業を行った。第一は上記記載の 転移腫瘍の２つから細胞株を樹立して調べた。図１７Ａに示すように、細胞株と それらの起源である組織の両方でＩＬ１０のｍＲＮＡが発現されていた。 両細胞株は７２時間の培養後の培養上清を調べた結果ＩＬ１０を産生していた（ ＩＬ１０濃度：７６０ｐｇ／ｍｌと１０ｐｇ／ｍｌ）。第二に、メラノ−マ転移 巣の組織切片上のＩＬ１０ｍＲＮＡ発現を生体内ＲＴ−ＰＣＲを用いて調べた。 図１７Ｂに示すように、ＩＬ１０ｍＲＮＡはメラノ−マ細胞に関連していたが、 非腫瘍部分には認められなかった。メラノ−マ転移巣内でのＴＮＦ ｍＲＮＡの発現 −ヒト結腸癌バイオプシ−内に はＴＮＦ ｍＲＮＡが発現していることが生体内ハイブリダイゼ−ションで示さ れており（Ｎａｙｌｏｒ，Ｍ．Ｓ．ら．，Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．１９９０ ５ ０：４４３６−４４４０），ＴＮＦ耐性と生体内の腫瘍成長との間には関連があ る（Ｌａｔｔｉｍｅ，Ｅ．Ｃ．ならびにＳｔｕｔｍａｎ，Ｏ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎ ｏｌ．１９８９ １４３；４３１７−４３２３）。ＴＮＦ ｍＲＮＡは６／２３ メラノ−マサンプル内に検出された。ＤＮＰワクチンによる炎症誘導との間に関 連が認められた：Ｔ細胞浸潤が見られたワクチン投与後バイオプシ−の７例中４ 例は陽性となったが、ワクチン前あるいはワクチン投与を受けたが浸潤が認めら れなかった例では２／１６に過ぎなかった。 実施例８ 本実施例ではジニトロフェニル修飾した腫瘍ペプチドによる癌の免疫治療を開 示する。 エプシュタインバーウイルス（ＥＢＶ）をＢリンパ芽球細胞の培養体に加える 。Ｂリンパ芽球細胞は形質転換して患者自身のリンパ球からＢ細胞腫を発症させ る。転移巣から得たメラノ−マをＲＰＭＩ１６４０＋１０％ウシ胎児血清あるい は１０％プ−ルヒト血清培地で培養する。非接着細胞をＲＰＭＩ培地で洗い流す 。細胞が高密化したら、細胞を０．１％のＥＤＴＡで剥がして２本のフラスコに 移した。この作業をおよそ１０からおよそ３０回繰り返した。Ｔ細胞によるγイ ンタ−フェロン産生を調べるために、患者血液からリンパ球を得た。およそ１， ０００，０００個のリンパ細胞をＤＮＰ修飾自己メラノ−マ細胞と混ぜてＴ細胞 を刺激した。７日ごとに１００Ｕ／ｍｌのインタ−ロイキン２を加えた。Ｔ細胞 を上 記方法でさらに増殖させた。それから、ＤＮＰ修飾自己メラノ−マ細胞を用いて Ｔ細胞を再度刺激した。こうして得たＴ細胞が豊富な集団はＤＮＰ修飾された自 己メラノ−マ細胞に対し反応性を有した。Ｔ細胞によるγインタ−フェロン産生 量から刺激の強さを測定した。一般に、γインタ−フェロンが１５ピコグラム／ ｍｌ以上産生されるとき刺激されたと判定した。これらのＴ細胞を用いてペプチ ドを調べた。 短いペプチドは４種類の細胞から抽出したが、全て１人の患者より得た；１） Ｂリンパ芽球細胞、２）ジニトロフェニル（ＤＮＰ）で修飾したＢリンパ芽球細 胞；３）培養メラノ−マ細胞、４）ＤＮＰで修飾した培養メラノ−マ細胞である 。細胞は０．１％のトリフルオロ酢酸に懸濁後、超音波処理して１００，０００ ×ｇで９０分間遠心分離した。上清中の分子量１０，０００以上の物質をＣｅｎ ｔｒｉｃｏｎ１０フィルタ−で濾過して取り除いた。残った物質を逆相ＨＰＬＣ カラムを用いて分離した。個々の分画を採取し、乾燥後、培地に再懸濁してから ペプチドを結合し提示させるため自己のＢリンパ芽球細胞に加えた。これらのペ プチドでパルス処理したＢ細胞について、自己ＤＮＰ修飾メラノ−マ細胞に特異 的に感作したＴリンパ細胞株に対する刺激能を調べた。 まず５０のＨＰＬＣ分画（各サンプル１０μｌ）を１０サンプルづつ一つにし て５群に分けた。図１３に示すように、ＤＮＰ修飾メラノ−マ細胞（ＤＮＰ−Ｍ ＥＬ）あるいはＤＮＰ修飾したＢ細胞（ＤＮＰ−Ｙ）から得たペプチドのみが刺 激性を有していて、プ−ル＃２のみが陽性であった。 プ−ル＃２の個々の分画それぞれについて、それぞれを用いたＴ細胞刺激試験 を実施して解析した；活性は分画＃１７と＃１８だけに認められ、そしてＤＮＰ −ＭＥＬペプチドはＤＮＰ−ＬＹに比べて２倍以上γインタ−フェロン産生を刺 激した。 これらの結果より、低分子分画ペプチド標本の一つのＨＰＬＣにＤＮＰ修飾さ れたメラノ−マ細胞に対して感作されたＴ細胞を刺激するペプチドが含まれてい ることが示唆された。 実施例９ 本実施例では抗ＤＮＰ抗体によるペプチド刺激阻害について調べた。 本実験は１つの事項を除いて実施例８におなじである。Ｂリンパ芽球細胞にペ プチドを添加した後に、様々な濃度（１−１００μｇ／ｍｌ）の抗ＤＮＰ抗体を 様々なサンプルに加える。抗ＤＮＰ抗体はＡＴＣＣ、ハイブリド−マ＃ＣＲＬ− １９６８あるいは同様の抗体より得ることができる。ＤＮＰ修飾ペプチドにより 刺激が起きるのであれば、抗体はこれを阻害するはずである。分画１７と１８が この抗体で阻害されることが期待される。 実施例１０ 実施例１０では、応答Ｔ細胞がＣＤ４＋またはＣＤ８＋であることを決めるこ とを目的とした。 本実施例は１つの事項を除き実施例８に同じである。ペプチドでパルスされた Ｂリンパ芽腫細胞に加える前に応答Ｔ細胞をサブセットに分画した。この作業は Ｔ細胞を抗ＣＤ４あるいはＣＤ８抗体をコ−トした磁性ビ−ズと混ぜて行った（ 市販品をＩｍｍｕｎｏｔｅｃｈ，Ｉｎｃ．，Ｗｅｓｔｂｒｏｏｋ，Ｍａｉｎｅよ り得た）。その後ビ−ズとビ−ズに結合した細胞を磁石で取り除いた。結合しな かった細胞を組織培養液で洗い（ＲＰＭＩ＋１０％プ−ルヒト血清）、計測して から刺激測定を行うためにマイクロタイタ−ウエルに加えた。 実施例１１ 実施例１１では癌免疫療法のためのジニトロフェニル修飾した腫瘍細胞膜を開 示する。 一人の患者より得た培養メラノ−マ細胞の膜を本明細書に全文が参考文献とし て援用されるＨｅｉｋｅら．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒａｐｙ １９９４ １ ５：１６５−１７４の方法に従って調製した。本明細書に全文が参考文献として 援用されるＭｉｌｌｅｒとＣｌａｍａｎ，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ １９７６ １１７：１５１９−１５２６の方法に従って、メラノ−マ細胞をジニトロフェ ニル（ＤＮＰ）に結合した。細胞を１ｍＭのフェニルメチルスルホニルフルオラ イドを添加した５倍量の３０ｍＭ重炭酸ナトリウム緩衝液に懸濁し、ガラスホモ ジナイザーにて破砕した。残った無傷の細胞と核は１０００ｇの遠心分離で取り 除いた。それから膜を１００，０００ｇ、９０分の遠心分離で沈殿させた。膜を ８％ショ糖液中に再懸濁し、使用時まで−８０℃に凍結した。ジニトロフェニル に結合させるためのメラノ−マ細胞を同様に調製した。 これらのＤＮＰ修飾されたメラノ−マ細胞膜を、ＤＮＰで修飾された無傷のメ ラノ−マ細胞に感作した自己Ｔリンパ細胞株に対する刺激能について調べた。こ の試験は、およそ１００，０００個のＴリンパ細胞／ウエルにウェルあたりおよ そ１０，０００個からおよそ１００，０００個相当のＤＮＰ修飾した膜を加えて インキュベートし、γインタ−フェロンの産生量（１５ピコグラム以上）を測定 して行った。この作業をＴリンパ細胞をＤＮＰ修飾メラノ−マ細胞とインキュベ ートして繰り返した。結果は、メラノ−マ細胞とそこから得た膜のＴ細胞刺激効 率は同じであることを示した。 本実験は数回繰り返し（同一患者サンプルを用いて）、同様の結果が得られた ことから、ＤＮＰ修飾メラノ−マ膜がＴ細胞反応誘導においてＤＮＰ修飾した無 傷のメラノ−マ細胞の代わりになりうることを示唆している。 実施例１２ 実施例１２では自己単核球あるいは樹状突起細胞が腫瘍膜に対するＴ細胞反応 を増強するかを調べた。 自己単核球は以下のようにして分離する。末梢血リンパ球を末梢血から、本明 細書に全文が参考文献として援用される、Ｂｏｙｕｍ，Ａ．，Ｓｃａｎｄ．Ｊ． Ｃｌｉｎ．Ｌａｂ．Ｉｎｖｅｓｔ．２１，１９６８ Ｓｕｐｐｌ ９７：７７− ８９，が開示した方法に従った密度勾配遠心法で分離する。分離した細胞を組織 培養液（ＲＰＭＩ−１６４０＋１０％プ−ルヒト血清）に懸濁してからプラスチ ック製マイクロタイタ−ウエル内に加え、およそ２時間培養して単核球を接着さ せた。それから接着しなかった細胞を培養液で洗い流した。様々な濃度のＧＭ− ＣＳＦ（顆粒球マクロファージコロニー刺激因子、市販品をＩｍｍｕｎｅｘ，Ｓ ｅａｔｔｌｅ，ＷＡより得た）を加えて単核球の増殖を刺激する。約２−３週後 、単核球、この時点ではマクロファ−ジと考えられるが、をプラスチック容器か ら０．１％ＥＤＴＡを用いて剥がし、新しいマイクロタイタ−ウエル内に希釈系 列的に加える（およそ１００からおよそ１０，０００／ウエル）。ＤＮＰ修飾し た自己腫瘍細胞から得た膜を希釈系列的に接着マクロファ−ジ単層に加える（量 は細胞当量で定量化する）。約６時間から約２４時間後にＤＮＰ特異的自己Ｔ細 胞 を加え、さらに２４時間培養する。その後に上清を集めて、これに限定されるわ けではないがγインタ−フェロン，ＩＬ２、腫瘍壊死因子の様なサイトカインの 産生を調べ、あるいは¹²⁵ＩＵＤＲ、³ＨチミジンあるいはＭＴＴの様な色素によ りＴ細胞の増殖あるいは刺激について試験する。たとえば¹²⁵ＩＵＤＲを添加し 、細胞をＴ細胞の増殖について試験するための全自動回収装置で回収する。対照 群は刺激していないＴ細胞と、マクロファ−ジ無しに膜により刺激したＴ細胞で ある。自己の樹状突起細胞の膜に対する応答を増強する能力についても同様にし て調べる。樹状突起細胞は末梢血単核球から分離して、本明細書に全文が参考文 献として援用されるＯ’Ｄｏｈｅｒｔｙ，Ｕ．，らＪ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１９９ ３ １７８：１０６７８−１０７８の方法に従って組織培養で増殖させた。 実施例１３ 実施例１３はＤＮＰ修飾したメラノ−マワクチンを投与された患者が自己ＤＮ Ｐ修飾メラノ−マ膜に対して遅延型過敏反応（ＤＴＨ）を示すか調べることを目 的にして実施した。 試験被検体はＤＮＰ修飾メラノ−マ細胞ワクチンの複数回投与を受けた患者で ある。膜は前記のようにして自己ＤＮＰ修飾メラノ−マ細胞から調製する。膜量 を希釈系列的に変化させた（およそ１００からおよそ１０，０００細胞当量）も のをＰＢＳで洗浄してから、ＰＢＳ中に再懸濁し、前腕部皮内に注射する。ＤＴ Ｈはおよそ４８時間後に皮膚の硬化部の直径を測定して決定する。対照は自己の 未修飾メラノ−マ細胞と自己血液リンパ球から得た膜でで構成される。 実施例１４ 実施例１４はマクロファ−ジあるいは樹状突起細胞が同種メラノ−マ膜を加工 し、マクロファ−ジと同系（ｓｙｎｇｅｎｅｉｃ）のＴ細胞に免疫的方法で提示 するか調べることを目的に実施した。 操作手順は実施例１２と同様であるが、刺激に使用した膜を同種ＤＮＰ修飾メ ラノ−マ細胞より調製した点が異なっている。患者Ａから得たマクロファ−ジあ るいは樹状突起細胞は試験管内で患者Ｂのメラノ−マ細胞より得た膜を加工でき ると仮定する。このことは結果として患者Ａから得たＴ細胞の刺激を引き起こす 。この実験は同種免疫を狙うことができる。ＤＮＰ修飾した膜を単一のメラノー マ 細胞あるいはプ−ルした同種の細胞株から調製し、これを患者マクロファ−ジも しくは樹状突起細胞に試験管内で加工させる。これらの細胞を用いて免疫した。 それぞれの引用した特許ならびに特許出願ならびに印刷物公表物あるいは本明 細書中の記載の開示は本明細書に全文が参考文献として援用される。 本明細書に示し、また記載したことに加えて、本発明に本記載をもとに様々な 改良をくわえることは当業者にとっては容易である。この様な改良も添付する請 求項の範囲内にあることも意図している。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ， ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，Ｌ Ｕ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ， ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＫＥ，ＬＳ，ＭＷ，ＳＤ，Ｓ Ｚ，ＵＧ)，ＵＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ ，ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ)，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＺ， ＤＥ，ＤＫ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＥ，ＨＵ，Ｉ Ｌ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＫ ，ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ， ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，Ｒ Ｕ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ ，ＴＴ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＳ，ＵＺ，ＶＮ (72)発明者 アイゼンローアー，ローレンス・シー アメリカ合衆国ペンシルバニア州19066, メリオン・ステーション，ロックランド・ アベニュー 110 (72)発明者 ラッティム，エドムンド アメリカ合衆国ニュージャージー州08540, プリンストン，セイア・ドライブ 600

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １．Ｔ細胞リンパ細胞を刺激し、癌治療に有用であるハプテン修飾された腫瘍 細胞抽出物の治療効果量を含む組成物。 ２．該腫瘍細胞抽出物が、ハプテン修飾された癌細胞膜、ハプテン修飾された 癌細胞より得た低分子量ペプチド、ハプテン修飾された癌細胞から得た低分子ペ プチドを結合している抗原提示細胞、ならびにハプテン修飾癌細胞膜を結合して いる抗原提示細胞からなるグル−プより選択される、請求項１の組成物。 ３．該腫瘍細胞抽出物が、ジニトロフェニル修飾癌細胞から得た低分子ペプチ ドである、請求項１の組成物。 ４．該腫瘍細胞抽出物がジニトロフェニル修飾癌細胞の膜である、請求項１の 組成物。 ５．該腫瘍細胞抽出物がハプテン修飾癌細胞から得た低分子量ペプチドあるい はハプテン修飾癌細胞膜を結合している抗原提示細胞である、請求項１の組成物 。 ６．該腫瘍細胞抽出物が自己由来の細胞ならびに同種異系細胞よりなるグル− プから選択される、請求項１の組成物。 ７．該腫瘍細胞抽出物がメラノ−マ、乳房、肺、結腸、乳房、腎臓ならびに前 立腺からなるグル−プから選択される、請求項１の組成物。 ８．該腫瘍がメラノ−マである、請求項１の組成物。 ９．該ハプテンがジニトロフェニル、トリニトロフェニル、ならびにＮ−ヨ− ドアセチル−Ｎ’−（５スルホニック１−ナフチル）エチレンジアミンよりなる グル−プから選択される、請求項２の組成物。 １０．該ハプテンがジニトロフェニルである、請求項９の組成物。 １１．さらに免疫アジュバントを含む、請求項１の組成物。 １２．該免疫アジュバントがＢａｃｉｌｌｕｓ Ｃａｌｍｅｔｔｅ−Ｇｕｅｒ ｉｎである、請求項１１の組成物。 １３．ジニトロフェニルにより修飾された癌細胞膜を治療効果量含む組成物で あって、Ｔ細胞リンパ細胞を刺激し、癌の治療に有用である、前記組成物。 １４．ジニトロフェニルにより修飾された癌細胞から得た低分子量ペプチドを 治療効果量含む組成物であって、Ｔ細胞リンパ細胞を刺激し、癌の治療に有用で ある、前記組成物。 １５．患者に治療効果量のシクロフォスファミドを投与し；治療効果量の、Ｔ 細胞リンパ細胞を刺激するハプテン修飾した細胞抽出物を投与することを含む、 癌を治療するための方法。 １６．該腫瘍がメラノ−マ、肺、結腸、乳房、腎臓および前立腺より選択され る、請求項１５の方法。 １７．メラノ−マ、肺癌、結腸癌、乳癌、腎臓癌、ならびに前立腺癌よりなる グル−プから選択された癌の治療に有用な、請求項１５の方法。 １８．該腫瘍細胞抽出物が、ハプテン修飾された癌細胞膜ならびにハプテン修 飾された癌細胞由来の低分子量ペプチドからなるグル−プより選択される、請求 項１５の方法。 １９．該ハプテンがジニトロフェニル、トリニトロフェニル、ならびにＮ−ヨ −ドアセチル−Ｎ’−（５−スルホニック１−ナフチル）エチレンジアミンより なるグル−プから選択される、請求項１８の方法。 ２０．該ハプテンがジニトロフェニルである、請求項１８の方法。 ２１．該腫瘍細胞抽出物が、ジニトロフェニル修飾癌細胞より得た低分子量ペ プチドである、請求項１５の方法。 ２２．該腫瘍細胞抽出物が、ジニトロフェニル修飾した癌細胞の膜である、請 求項１５の方法。 ２３．該腫瘍細胞抽出物が自己由来細胞および同種異系細胞より成るグル−プ から選択される、請求項１５の方法。 ２４．該シクロスフォスファミド治療効果量が、該組成物投与前にシクロフォ スファミドおよそ３００ｍｇ／Ｍ²用量を投与すれることを含む、請求項１５の 方法。 ２５．該組成物が、該免疫アジュバントと投与前に混合される、請求項１５の 方法。 ２６．該免疫アジュバントがＢａｃｉｌｌｕｓ Ｃａｌｍｅｔｔｅ−Ｇｕｅｒ ｉｎである、請求項２５の方法。 ２７．さらにシクロフォスファミド投与前に患者を治療効果量の１−フルオロ −２，４−ジニトロベンゼンで感作させることを含む、請求項１５の方法。 ２８．患者に治療効果量のシクロフォスファミドを投与し、Ｔ細胞リンパ細胞 を刺激する腫瘍細胞抽出物と免疫アジュバントと混合された該組成物を治療効果 量投与し；そしてインタ−ロイキン１２、インタロイキン−２、およびインタロ イキン−１３よりなるグル−プから選択される治療効果量のサイトカインを投与 することを含むヒトの癌を治療する方法。 ２９．該腫瘍細胞抽出物が、ハプテン修飾された癌細胞膜とハプテン修飾され た癌細胞より得た低分子量ペプチドからなるグル−プより選択される、請求項２ ８の方法。 ３０．該ハプテンがジニトロフェニル、トリニトロフェニル、ならびにＮ−ヨ −ドアセチル−Ｎ’−（５−スルホニック１−ナフチル）エチレンジアミンより なるグル−プから選択される、請求項２９の方法。 ３１．該ハプテンがジニトロフェニルである請求項２９の方法。 ３２．該腫瘍細胞抽出物が、ジニトロフェニル修飾癌細胞より得た低分子量ペ プチドである請求項２８の方法。 ３３．該腫瘍細胞抽出物が、ジニトロフェニル修飾した癌細胞の膜である請求 項２８の方法。 ３４．該腫瘍細胞抽出物が、自己由来細胞および同種異系細胞より成るグル− プから選択される請求項２８の方法。 ３５．該シクロフォスファミド治療効果量が、該組成物投与前にシクロフォス ファミドおよそ３００ｍｇ／Ｍ²用量を投与することを含む、請求項２８の方法 。 ３６．該組成物が該免疫アジュバントと投与前に混合される請求項２８の方法 。 ３７．該免疫アジュバントがＢａｃｉｌｌｕｓ Ｃａｌｍｅｔｔｅ−Ｇｕｅｒ ｉｎである請求項２８の方法。 ３８．該腫瘍がメラノ−マ、肺、結腸、乳房、腎臓および前立腺より選択され る請求項２８の方法。 ３９．メラノ−マ、肺癌、結腸癌、乳癌、腎臓癌、ならびに前立腺癌よりなる グル−プから選択された癌の治療に有用な請求項２８の方法。 ４０．さらにシクロフォスファミド投与前に患者を治療効果量の１−フルオロ −２，４−ジニトロベンゼンで感作させることを含む、請求項２８の方法。 ４１．患者に治療効果量のシクロフォスファミドを投与し、Ｔ細胞リンパ細胞 を刺激する肺瘍細胞抽出物と免疫アジュバントと混合された該組成物を治療効果 量投与し；腫瘍細胞抽出物を含むハプテン化していない放射線照射した組成物を 治療効果量投与することを含む、ヒトの癌を治療する方法。 ４２．癌の疑いのある患者の癌を緩和するための、自己の被放射線照射ハプテ ン結合細胞組成物の有効性を調べるために、腫瘍によるサイトカイン産生をスク リ−ニングする方法であって、 該ハプテン結合組成物を該患者に投与し； 患者組織サンプルより核酸を含むサンプルを得て； 該組織サンプル内のサイトカイン特異核酸配列に特異的なプロ−ブをハイブリ ダイゼ−ションさせることにより、サイトカイン特異的核酸を増幅し、あるいは シグナルを増幅し；そして 増幅した核酸あるいは増幅したシグナルを検出する、ここにおいて、該患者組 織サンプルの増幅された核酸あるいは増幅されたシグナルの存在は、サイトカイ ン産生を示し、該ハプテン結合組成物の効果を決定する ことを含む方法。 ４３．該ハプテンがジニトロフェニル、トリニトロフェニル、ならびにＮ−ヨ −ドアセチル−Ｎ’−（５−スルホニック１−ナフチル）エチレンジアミンより なるグル−プから選択される、請求項４２の方法。 ４４．該患者組織サンプルが皮下炎症部位である請求項４２の方法。 ４５．該増幅ステップが、サイトカイン特異的配列に相補的である少なくとも １種のオリゴヌクレオチドをサイトカイン特異的核酸へハイブリダイゼ−ション させることを含む、請求項４２の方法。 ４６．サイトカインに特異的な核酸が、γインタ−フェロン、腫瘍壊死因子、 インタ−ロイキン２，インタ−ロイキン１２ならびにインタ−ロイキン１３をコ ードする核酸を含む、請求項４２の方法。 ４７．該増幅ステップが、サイトカイン特異的核酸を、対中の１つのプライマ −がサイトカイン特異的配列に相補的であるプライマ−対と、ハイブリダイゼ− ションさせることを含む、請求項４２の方法。 ４８．該増幅ステップが、複製連鎖反応、リガーゼ鎖反応法、修復鎖反応法、 サイクリックプロ−ブ反応法、核酸配列増幅法、鎖置換増幅法、Ｑβレプリカ− ゼ法からなるグル−プより選択された方法を実施することを含む、請求項４２の 方法。 ４９．該増幅ステップが複製連鎖反応を実施することを含み、該複製連鎖反応 が第１プライマ−と第２プライマ−を含み、該第１プライマ−が配列番号１，３ ，５，７および９より選択され、該第２プライマ−が配列番号２，４，６，８お よび１０から選択される、請求項４２の方法。 ５０．該増幅ステップが複製連鎖反応を実施することを含み、該複製連鎖反応 が第１プライマ−と第２プライマ−を含み、該第１プライマ−が配列番号３であ り該第２プライマ−が配列番号４である請求項４２の方法。 ５１．該増幅ステップが、複製連鎖反応を実施することを含み、該複製連鎖反 応が１組のプライマ−対を含み、該プライマ−対の１つのプライマ−がサイトカ イン特異的配列に相補的である請求項４２の方法。 ５２．サイトカイン特異的配列に相補的である該プライマ−が、配列番号１か ら１０よりなるグル−プから選択される、請求項４２の方法。 ５３．サイトカイン特異的配列に相補的である該プライマ−が、配列番号１か ら１０よりなるグル−プから選択される、請求項４７の方法。 ５４．サイトカイン特異的配列に相補的である該プライマ−が、配列番号３の 請求項４７の方法。 ５５．該患者組織サンプルが腫瘍、唾液腺、喀痰、粘液、骨髄、血清、血液、 尿、リンパ液、および涙よりなるグル−プから選択される請求項４２の方法。 ５６．放射線照射されたハプテン結合した自己細胞組成物の効果をスクリ−ニ ングするための診断用キットであって、１つ以上の容器と、プライマ−の１つが 配列番号１，配列番号２，配列番号３，配列番号４，配列番号５，配列番号６， 配列番号７，配列番号８，配列番号９，配列番号１０のサイトカイン特異的配列 に相補的である１プライマ−対、および、増幅ＤＮＡを可視化する手段を含み、 、 該組成物の効果決定に有用である前記キット。 ５７．増幅したＤＮＡを可視化するための該方法が臭化エチジウム染色、³²Ｐ およびビオチンからなるグル−プより選択される請求項５６の診断用キット。 ５８．該患者組織サンプルがメラノ−マ組織である請求項４２の方法。 ５９．癌の疑いのある患者に於ける放射線照射されたハプテン結合した自己由 来細胞組成物の効果を決定するための腫瘍によるサイトカイン産生についてのス クリ−ニング法であって、： 患者腫瘍サンプルよりＲＮＡサンプルを得て； 逆転写反応にて該ＲＮＡをＤＮＡに転写し； サイトカイン配列の分離された領域に相補的であるプライマ−対を用いて複製 連鎖反応を行って該ＤＮＡを増幅し；そして 増幅したＤＮＡの有無を検出する、ここにおいて増幅したＤＮＡの存在はサイ トカイン産生を示し、該ハプテン結合した組成物の効果を決定する、 ことを含む、前記方法。 ６０．複製連鎖反応が、ｉｎ ｓｉｔｕ複製連鎖反応である請求項５９の方法 。