ES2302497T3 - Procedimiento de secuenciacion de adn. - Google Patents

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Abstract

Un procedimiento para determinar la secuencia de un polinucleótido, que comprende las etapas de: i. hacer reaccionar un polinucleótido diana con una enzima que puede interaccionar con, y procesar, el polinucleótido, en condiciones suficientes para inducir actividad enzimática; y ii. detectar cambios conformacionales en la enzima a medida que la enzima procesa el polinucleótido; en el que la enzima comprende un primer marcador fluorescente unido, cuyas características se ven alteradas a medida que la enzima experimenta un cambio conformacional.

Description

Procedimiento de secuenciación de ADN.
Campo de la invención
Esta invención se refiere a determinaciones de secuencias de polinucleótidos.
Antecedentes de la invención
La capacidad de determinar la secuencia de un polinucleótido es de gran importancia científica. Por ejemplo, el Proyecto Genoma Humano es un ambicioso esfuerzo internacional para mapear y secuenciar los tres billones de bases del ADN codificado en el genoma humano. Cuando se complete, la base de datos de secuencias resultante será una herramienta de potencia sin precedentes para la investigación biomédica. El principal obstáculo para la finalización satisfactoria de este proyecto se refiere a la tecnología usada en el procedimiento de secuenciación.
El procedimiento principal de uso general para la secuenciación de ADN a gran escala es el procedimiento de terminación de cadena. Este procedimiento se desarrolló por primera vez por Sanger y Coulson (Sanger et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1977; 74: 5463-5467) y se basa en el uso de derivados didesoxilo de los cuatro nucleósidos trifosfatos que se incorporan en una cadena de polinucleótido naciente en una reacción de polimerasa. Tras la incorporación, los derivados didesoxilo terminan la reacción de polimerasa y entonces se separan los productos mediante electroforesis en gel y se analizan para revelar la posición en la que se incorporó el derivado didesoxilo particular en la cadena.
Aunque este procedimiento se usa ampliamente y produce resultados fiables, se reconoce que es lento, requiere mucho trabajo y es caro.
En el documento EP-A-0471732 se propone un procedimiento de secuenciación alternativo que usa medios espectroscópicos para detectar la incorporación de un nucleótido en una cadena de polinucleótido naciente complementaria a una diana. El procedimiento se basa en un complejo inmovilizado de molde y cebador, que se expone a un flujo que sólo contiene uno de los diferentes nucleótidos. Entonces se usan técnicas espectroscópicas para medir una señal que depende del tiempo que surge del crecimiento catalizado por la polimerasa de la copia del molde. Las técnicas espectroscópicas descritas son espectroscopía por resonancia de plasmón superficial (SPR), que mide cambios en un analito dentro de un campo de onda evanescente, y técnicas de medición de fluorescencia. Sin embargo, se reconocen limitaciones de este procedimiento; siendo la más grave para la técnica de SPR que, a medida que crece el tamaño de la cadena de copia, también crece el tamaño absoluto de la señal debido al movimiento de la cadena fuera del campo de onda evanescente, haciendo más difícil detectar los aumentos. Las técnicas de medición de fluorescencia tienen la desventaja de interferencia de fondo creciente a partir de los fluoróforos incorporados en la cadena de polinucleótido naciente en crecimiento. A medida que crece la cadena, aumenta el "ruido" de fondo y es necesario aumentar el tiempo requerido para detectar cada incorporación de nucleótido. Esto limita gravemente el uso del procedimiento para secuenciar polinucleótidos grandes.
En los documentos WO-A-9924797 y WO-A-9833939 se exponen enfoques de secuenciación de polinucleótidos de un único fragmento, empleando ambos detección fluorescente de moléculas de nucleótidos con un único marcador. Estos nucleótidos individuales se rompen del polinucleótido de molde, se mantienen en un flujo mediante una trampa óptica (Jett, et al., J. Biomol. Struc. Dyn, 1989; 7: 301-309), mediante la acción de una molécula de exonucleasa. Entonces estos nucleótidos rotos fluyen aguas abajo dentro de una célula de flujo de cuarzo, se someten a excitación por láser y después se detectan mediante un sistema de detección sensible. Sin embargo, se reconocen limitaciones de este procedimiento; siendo la más grave para la técnica de exonucleasa el hecho de que los nucleótidos marcados afectan gravemente a la capacidad de procesamiento de la enzima exonucleasa. Otras limitaciones de este procedimiento incluyen "adhesión" del/de los nucleótido(s) a la perla de biotina usada para inmovilizar el fragmento de polinucleótido, dando así como resultado que el flujo de nucleótidos se desfase; ineficacia y limitación de longitud del procedimiento de marcaje enzimático inicial; y el "cruce" de excitación entre las cuatro moléculas de colorante diferentes dando como resultado un gran aumento de la tasa de error.
Por tanto, existe una necesidad de un procedimiento mejorado, preferiblemente en el nivel del fragmento único, para determinar la secuencia de polinucleótidos, que aumente significativamente la velocidad y tamaño de fragmento del polinucleótido secuenciado y que se lleve a cabo preferiblemente mediante un procedimiento automatizado, reduciendo la complejidad y coste asociado con los procedimientos existentes.
Sumario de la invención
La presente invención se basa en la constatación de que la secuencia de un polinucleótido diana puede determinarse midiendo cambios conformacionales en una enzima que se une a, y procesa, el polinucleótido diana. El grado del cambio conformacional que tiene lugar es diferente dependiendo de qué nucleótido individual en la diana esté en contacto con la enzima.
Según un aspecto de la presente invención, se proporciona un procedimiento para determinar la secuencia de un polinucleótido tal como se define en la reivindicación 1.
En una realización preferida, la enzima es una enzima polimerasa que interacciona con la diana en el procedimiento de extender una cadena complementaria. Normalmente la enzima está inmovilizada sobre un soporte sólido para localizar la reacción dentro de una zona definida.
Según la invención, la enzima comprende un primer marcador detectable unido, cuyas características se ven alteradas a medida que la enzima experimenta un cambio conformacional. La enzima también puede comprender un segundo marcador detectable unido que puede interaccionar con el primer marcador, en el que el grado de interacción depende de un cambio conformacional en la enzima. Normalmente, el primer marcador es un aceptor de energía y el segundo marcador es un donador de energía, y la detección del cambio conformacional se lleva a cabo midiendo la transferencia de energía entre los dos marcadores.
Según una realización adicional de la invención, se usa transferencia de energía por resonancia de fluorescencia (FRET) para detectar un cambio conformacional en una enzima que interacciona con, y procesa, una polimerasa diana, determinando así la secuencia del polinucleótido. Puede llevarse a cabo la transferencia de energía por resonancia de fluorescencia entre marcadores donadores y aceptores de FRET, cada uno unido a la enzima. Como alternativa, uno de los marcadores puede estar unido a la enzima y el otro marcador puede estar unido al polinucleótido.
Según una realización adicional, existe el uso de una enzima marcada de manera detectable, que puede interaccionar con, y procesar, un polinucleótido diana, para determinar la secuencia del polinucleótido, en el que el marcador altera sus características detectables a medida que la enzima procesa el polinucleótido.
Según un aspecto adicional, se proporciona un soporte sólido según la reivindicación 12.
Según un aspecto adicional, se proporciona un sistema para determinar la secuencia de un polinucleótido según la reivindicación 14.
La presente invención ofrece varias ventajas con respecto a la tecnología de secuenciación convencional. Una vez que una enzima polimerasa comienza su ciclo de alargamiento del polinucleótido, tiende a polimerizar varios miles de nucleótidos antes de separarse de la cadena. Adicionalmente, ciertos sistemas de polimerasa específicos pueden anclarse o unirse ellos mismos al polinucleótido molde mediante una "sujeción deslizante" (por ejemplo, la polimerasa III) que rodea a la molécula molde o mediante un gancho molecular (por ejemplo complejo T7:tireodoxina) que rodea parcialmente al molde.
La invención también puede permitir secuenciar decenas de kilobases (kb) o más en una pasada, a una velocidad de cientos de pares de bases por segundo. Esto es un resultado de la secuenciación en un fragmento único de ADN. Una ventaja de secuenciar un fragmento único de ADN es que las velocidades de secuenciación se determinan por el sistema enzimático utilizado y no tras reacciones indirectas, añadidas, y por tanto son correspondientemente superiores. Tan importante como la elevada velocidad es la capacidad de secuenciar grandes fragmentos de ADN. Esto reducirá significativamente la cantidad de subclonación y el número de secuencias solapantes requerido para ensamblar segmentos de megabases de información de secuenciación. Una ventaja adicional del enfoque del fragmento único es la eliminación de problemas asociados con la eliminación de desechos peligrosos, tales como acrilamida, que asolan los esfuerzos actuales de secuenciación.
Descripción de los dibujos
La figura 1 es una ilustración esquemática de una configuración de microscopio confocal para su uso en la invención;
la figura 2 ilustra un perfil tomado tras la transferencia de energía por resonancia de fluorescencia, representando cada uno de los picos la detección de un nucleótido específico.
Descripción de la invención
El presente procedimiento para secuenciar un polinucleótido implica el análisis de cambios conformacionales entre una enzima y un polinucleótido diana.
El término "polinucleótido" tal como se usa en el presente documento debe interpretarse ampliamente, e incluye ADN y ARN, incluyendo ADN y ARN modificados, así como otras moléculas similares a ácido nucleico que hibridan, por ejemplo ácido nucleico peptídico (ANP).
La enzima puede ser una enzima polimerasa, y se provoca un cambio conformacional cuando la polimerasa incorpora un nucleótido en una cadena naciente complementaria al polinucleótido diana. Se ha encontrado que el cambio conformacional será diferente para cada uno de los diferentes nucleótidos, A, T, G o C y por tanto la medición del cambio identificará qué nucleótido se incorpora.
Como alternativa, la enzima puede ser cualquiera que esté implicada en una interacción con un polinucleótido, por ejemplo una enzima helicasa, primasa y holoenzima. A medida que la enzima procesa el polinucleótido, su conformación cambiará dependiendo de con qué nucleótido en la diana entra en contacto.
Una manera de detectar un cambio conformacional en la enzima es medir la transferencia de energía por resonancia entre un marcador donador de energía adecuado y un marcador aceptor de energía adecuado. En un ejemplo, el donador y el aceptor están cada uno unidos a la enzima y el cambio conformacional en la enzima provocado por su interacción con el polinucleótido diana altera la posición relativa de los marcadores. Las diferencias en la posición se reflejan en la transferencia de energía resultante y son características del nucleótido particular en contacto con la enzima. Como alternativa, un marcador puede estar situado en la enzima y el otro en un nucleótido de la diana o en un nucleótido incorporado a la cadena complementaria a la diana.
El uso de transferencia de energía por resonancia de fluorescencia (FRET) es una realización preferida de la invención. Esta técnica puede medir distancias en la escala de 2 nm a 8 nm y se basa en la transferencia de energía dependiente de la distancia entre un fluoróforo donador y un fluoróforo aceptor. La técnica no sólo tiene capacidades superiores de colocalización estática sino que también proporciona información sobre cambios dinámicos en la distancia u orientación entre los dos fluoróforos para la FRET intramolecular e intermolecular. Desde la primera medición de transferencia de energía entre un único donador y un único aceptor (FRET de un único par) (Ha, et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1996; 96: 893), se ha usado para estudiar la colocalización de ligando y receptor (Schutz, et al., Biophys. J., 1998; 74: 2223), para analizar con sondas fluctuaciones estructurales de proteínas en equilibrio e interacciones enzima-sustrato durante la catálisis (Ha, et al., 1999 citado anteriormente), y para identificar estados conformacionales y subpoblaciones de moléculas de difusión individuales en disoluciones. Todas estas variables se consideran aplicables dentro del contexto de la invención.
La presente invención también puede llevarse a cabo usando técnicas de medición que sólo requieren un único marcador. Cualquier sistema que pueda medir cambios en el entorno local de la enzima a nivel de la molécula única es una realización aceptada de la invención. Pueden explotarse diversas propiedades de sondas fluorescentes únicas unidas a una enzima que procesa polinucleótidos y/o su(s) sustrato(s) en el contexto de la invención para proporcionar datos sobre variables dentro de, o en estrecha proximidad con, el sistema enzimático/entorno molecular que son específicos para un acontecimiento de incorporación de nucleótido. Tales variables incluyen, pero no se limitan a, interacciones moleculares, actividad enzimática, cinética de reacción, dinámica conformacional, libertad de movimiento molecular y alteraciones en la actividad y en el entorno químico y electrostático.
Por ejemplo, pueden determinarse los dipolos de transición de absorción y emisión de fluoróforos únicos usando luz de excitación polarizada o analizando la polarización de emisión, o ambas. La variación temporal en la orientación del dipolo de un marcador fijado de manera rígida o unido en difusión rotacional puede informar sobre el movimiento angular de un sistema macromolecular o una de sus subunidades (Warshaw, et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1998; 95: 8034) y por tanto puede aplicarse en la presente invención.
Los marcadores que pueden usarse en la presente invención resultarán evidentes para los expertos en la técnica. Preferiblemente, el marcador es un marcador de fluorescencia, tales como los dados a conocer en Xue, et al., Nature, 1995; 373: 681. Como alternativa, pueden emplearse enzimas fluorescentes tales como proteína verde fluorescente (Lu, et al., Science, 1998; 282: 1877).
Sin embargo, la realización preferida de la invención implica el uso de pequeñas moléculas de fluorescencia que están fijadas de manera covalente y específica del sitio a la enzima que procesa polinucleótidos, por ejemplo tetrametilrodamina (TMR).
Si se usan marcadores fluorescentes en la invención, su detección puede realizarse mediante fotoblanqueado provocado por una exposición repetida a longitudes de onda de excitación. Una manera posible de evitar este problema es llevar a cabo muchas reacciones secuenciales, pero detectando señales de fluorescencia sólo en unas pocas cada vez. Usando este procedimiento iterativo, puede determinarse la secuencia correcta de señales y determinarse la secuencia del polinucleótido. Por ejemplo, inmovilizando una pluralidad de enzimas sobre un soporte sólido y poniéndolas en contacto con el polinucleótido diana, las reacciones de secuenciación deben comenzar aproximadamente en el mismo momento. La excitación y detección de fluorescencia pueden localizarse en una proporción de las reacciones totales, durante un tiempo hasta que el fotoblanqueado se hace evidente. En este momento, la excitación y detección pueden transferirse a una proporción diferente de las reacciones para continuar con la secuenciación. Ya que todas las reacciones están relativamente en fase, debe obtenerse la secuencia correcta con un reensamblaje mínimo de la
secuencia.
Los marcadores pueden fijarse a las enzimas mediante enlaces covalentes u otros. Pueden usarse varias estrategias para fijar los marcadores a la enzima. Las estrategias incluyen el uso de mutagénesis dirigida al sitio y mutagénesis de aminoácidos no naturales (Anthony-Cahil, et al., Trends Biochem. Sci., 1989; 14: 400) para introducir asas de cisteína y cetona para marcar proteínas con colorantes específicos y ortogonales (Cornish, et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1994; 91: 2910).
Otra realización prevista usada para marcar con etiqueta la enzima que procesa polinucleótidos es la fusión de proteína verde fluorescente (GFP) a la enzima que procesa (por ejemplo polimerasa) mediante técnicas de clonación molecular conocidas en la técnica (Pierce, D.W. et al., Nature, 1997; 388: 338). Se ha demostrado que esta técnica es aplicable a la medición de cambios conformacionales (Miyawaki, et al., Nature, 1997; 388: 882) y cambios de pH locales (Llopis, et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1998; 95: 6803).
Los soportes adecuados para su uso en la inmovilización de las enzimas resultarán evidentes al experto. Pueden usarse materiales de silicio, vidrio y cerámica. El soporte será normalmente una superficie plana. La inmovilización de enzimas puede llevarse a cabo por medio covalente u otro. Por ejemplo, pueden usarse moléculas conectoras covalentes para fijarse a una enzima preparada de manera adecuada. Los procedimientos de fijación los conoce el experto.
Puede haber una o más enzimas inmovilizadas al soporte sólido. En una realización preferida, hay una pluralidad de enzimas fijadas. Esto permite monitorizar muchas reacciones separadas, y puede ser útil para superar problemas de fotoblanqueado tal como se expuso anteriormente.
Puede usarse una variedad de técnicas para medir un cambio conformacional en la enzima. Puede medirse la transferencia de energía por resonancia mediante las técnicas de resonancia de plasmón superficial (SPR) o resonancia de plasmón superficial fluorescente.
Sin embargo, pueden considerarse otras técnicas que miden cambios en la radiación mediante interacción con un "marcador" o transductor de energía, por ejemplo espectroscopía mediante fluorescencia por reflexión interna total (TIRF), reflexión total atenuada (ATR), reflexión total frustrada (FTR), reflectometría de ángulo de Brewster, reflexión interna total dispersada (STIR), espectroscopía y microscopía de visualización de la vida media de fluorescencia (FLIMS), anisotropía de polarización de fluorescencia (FPA), espectroscopía de fluorescencia o elipsometría de ondas evanescentes.
Ahora se ilustrará adicionalmente la invención mediante el siguiente ejemplo, con referencia a los dibujos adjuntos.
Ejemplo
Este ejemplo usó una configuración de fluorescencia confocal, tal como se muestra en la figura 1.
Con referencia a la figura 1, la configuración consiste en una mesa (1) de barrido para realizar un barrido a alta resolución en las dimensiones X, Y y Z, un cubreobjetos (2) de clase que es parte de un sistema de células de flujo microfluidas con una entrada (8) para introducir el complejo (4) cebador-polinucleótido molde y nucleótidos sobre la molécula (3) de polimerasa inmovilizada (9) dentro de un tampón, y una salida (7) para el desecho. Se envía luz incidente a partir de una fuente (6) luminosa para la excitación del donador mediante un objetivo (5) de inmersión en aceite.
Conjugación de proteína
En este experimento, se usaron tetrametilrodamina (TMR, donador) y Cy5 (aceptor) como par de FRET. Esto se debió a sus longitudes de onda de emisión bien separadas (> 100 nm) y gran radio de Föster.
Se usó ADN polimerasa de T7 de New England Biolabs (suministrada a 10.000 U/ml). Se cambió el tampón de
50 \mul de T7 en un sistema Vivaspin 500 (Vivaspin) frente a 4 x 500 \mul de tampón acetato de sodio 200 mM a pH 4 con el fin de eliminar el DTT del tampón de almacenamiento en el que se suministra la ADN polimerasa de T7. Después, se añadieron 50 \mul de la ADN polimerasa de T7 sometida a cambio de tampón a 100 \mul de tampón acetato de sodio a pH 4 y 50 \mul de 2-2-dipiridil-disulfuro saturado en disolución acuosa. Después se dejó esta reacción durante 110 minutos y se observó la absorción a 343 nm. Finalmente, se cambió entonces la muestra de tampón en Tris 200 mM a pH 8 tal como anteriormente (4 veces 500 \mul).
Se verificó la fijación del colorante mediante electroforesis en gel de poliacrilamida desnaturalizante. Se conjugó éster succinimidílico de Cy5 (Molecular Probes) a TMR-ADN polimerasa de T7 en las mismas condiciones de marcaje y se purificó y caracterizó tal como se describió anteriormente.
Inmovilización de la polimerasa
Se derivatizaron cubreobjetos de vidrio con ácido N-[(3-trimetoxisilil)propil]etilendiaminatriacético. Después se pegó el cubreobjetos en una disposición de células de flujo que permitió hacer fluir el tampón de manera continua sobre la superficie de vidrio derivatizada. Después se añadió la polimerasa marcada al tampón y se dejó fluir sobre el cubreobjetos de manera que se inmovilizó la proteína sobre la superficie de vidrio.
Después se inmovilizaron las proteínas sobre la superficie de contacto vidrio-agua con baja densidad de manera que sólo había una molécula en el volumen de excitación por láser cada vez. Se enfocó luz láser (láser de ión Ar a 514 nm, 15 \muW, polarizado de manera circular) sobre un punto de 0,4 \mum en un objetivo de inmersión en aceite en una configuración de epi-iluminación de un microscopio confocal en fase de barrido. Se recogió la emisión de fluorescencia por el mismo objetivo y se dividió en dos mediante un divisor del haz dicroico (paso largo a 630 nm) y se detectó simultáneamente por dos unidades de recuento de fotodiodo de avalancha (APD).
Se colocó un filtro de paso de banda a 585 nm enfrente del detector de donador; se colocó un filtro de paso largo a 650 nm enfrente del detector de aceptor. Ya que los intervalos espectrales durante la detección de fluorescencia están lo suficientemente separados de la longitud de onda límite del divisor del haz dicroico, la dependencia de la polarización de la eficacia de detección de las señales tanto de donador como de aceptor es despreciable. Se ha mostrado que puede pasarse por alto el mezclado de la polarización debido al objetivo de alta abertura de campo próximo (NA) (Ha et al, citado anteriormente).
Con el fin de adquirir tiempos de emisión de donador y de aceptor, se empleó una condición de búsqueda sobre la señal de aceptor tal como se expone en (Ha, et al., Appl. Phys. Lett., 1997; 70: 782). Este procedimiento ayuda en la selección de proteínas marcadas de manera doble: sin excitación directa del aceptor, sólo las proteínas que experimentan FRET pueden mostrar señal de aceptor. Una vez seleccionada una proteína, localizada y colocada bajo el punto de láser, se adquirieron perfiles de tiempo de donador y de aceptor (tiempo de integración de 5 ms). El tiempo de adquisición duró hasta que se fotoblanquearon todos los marcadores fluorescentes en la proteína diana.
Inicio de la reacción
Los dos oligonucleótidos se sintetizaron usando química de fosforamidita convencional. Se usó el oligonucleótido definido como SEC ID NO. 1 como el polinucleótido diana, y se usó el oligonucleótido definido como SEC ID NO. 2 como el cebador. Se hicieron reaccionar los dos oligonucleótidos en condiciones de hibridación para formar el complejo diana-cebador.
CAAGGAGAGGACGCTGTCTGTCGAAGGTAAGGAACGGACGAGAGAAGGGAGAG SEC ID NO. 1
CTCTCCCTTCTCTCGTC SEC ID NO. 2
Entonces se inició la reacción inyectando el ADN con cebador en la célula de flujo con los cuatro nucleótidos (dGTP, dCTP, dATP y dTTP) presentes a una concentración de 0,4 mM. Se mantuvo la célula de flujo a 25ºC mediante un dispositivo Peltier modificado.
También se empleó un sistema de eliminación de oxígeno [glucosa oxidasa 50 \mug/ml, catalasa 10 \mug/ml, glucosa al 18% (p/p), \beta-mercaptoetanol al 1% (p/v)] para prolongar las vidas medias fluorescentes (Funatsu, et al., Nature, 1995; 374: 555-559).
Análisis de datos de FRET
Estudios iniciales han determinado los orígenes de picos de parpadeos, fotoblanqueado y estado de tripletes (Ha, et al., Chem. Phy., 1999; 247: 107-118), todos los cuales pueden interferir con los cambios subyacentes en la eficacia de FRET, debido a cambios en la distancia entre fluoróforos como resultado de cambios conformacionales. Tras sustraer la señal de fondo de los perfiles de tiempo de donador y de aceptor tal como se da a conocer en Ha, et al., 1999 (citado anteriormente), se aplicó un filtro mediano, con un promedio de cinco puntos, para eliminar picos de tripletes. A continuación, se ignoraron de los perfiles de tiempo los puntos de datos que mostraron cuentas oscuras simultáneas en ambos detectores debido a acontecimientos de parpadeo del donador.
La cantidad de recuperación de señal de donador tras el fotoblanqueado del aceptor está relacionada con los rendimientos cuánticos de las moléculas y sus eficacias globales de detección.
Entonces se obtuvo el perfil de tiempo de eficacia de transferencia de energía. El perfil de tiempo de la eficacia de FRET durante la polimerización de la cadena diana SEC ID NO. 1 se muestra en la figura 2. Al leer la figura 2, la secuencia corresponde a la complementaria de la SEC ID NO. 1 (leyendo de derecha a izquierda, menos la parte que se hibrida con la secuencia de cebador).
<110> Medical Biosystems Ltd.
\vskip0.400000\baselineskip
<120> Procedimiento de secuenciación de ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<130> REP06193WO
\vskip0.400000\baselineskip
<140> (aún no se conoce)
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<141> 06-10-2000
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<150> 9923644.0
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<151> 06-10-1999
\vskip0.400000\baselineskip
<160> 2
\vskip0.400000\baselineskip
<170> PatentIn Ver. 2.1
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<210> 1
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<211> 53
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<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la secuencia artificial: polinucleótido molde
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 1
100 
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<210> 2
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<211> 17
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<212> ADN
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<213> Secuencia artificial
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<220>
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<223> Descripción de la secuencia artificial: polinucleótido cebador
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 2
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\hskip-.1em\dddseqskip
ctctcccttc tctcgtc 
\hfill
17

Claims (14)

1. Un procedimiento para determinar la secuencia de un polinucleótido, que comprende las etapas de:
i.
hacer reaccionar un polinucleótido diana con una enzima que puede interaccionar con, y procesar, el polinucleótido, en condiciones suficientes para inducir actividad enzimática; y
ii.
detectar cambios conformacionales en la enzima a medida que la enzima procesa el polinucleótido;
en el que la enzima comprende un primer marcador fluorescente unido, cuyas características se ven alteradas a medida que la enzima experimenta un cambio conformacional.
2. Un procedimiento según la reivindicación 1, en el que la enzima es una enzima polimerasa.
3. Un procedimiento según la reivindicación 1, en el que la enzima es una enzima helicasa o una enzima primasa.
4. Un procedimiento según cualquier reivindicación anterior, en el que la enzima está inmovilizada sobre un soporte sólido.
5. Un procedimiento según la reivindicación 4, que comprende una pluralidad de enzimas inmovilizadas sobre el soporte sólido.
6. Un procedimiento según cualquier reivindicación anterior, en el que la enzima comprende un segundo marcador unido que puede interaccionar con el primer marcador fluorescente unido, en el que el grado de interacción depende de un cambio conformacional en la enzima.
7. Un procedimiento según la reivindicación 6, en el que el segundo marcador unido es un donador de energía, y en el que la etapa (ii) se lleva a cabo midiendo la transferencia de energía entre el primer marcador fluorescente unido y el segundo marcador unido.
8. Un procedimiento según cualquier reivindicación anterior, en el que la etapa (ii) se lleva a cabo usando microscopía confocal.
9. Un procedimiento según la reivindicación 8, en el que la etapa (ii) se lleva a cabo mediante formación de imágenes por fluorescencia.
10. Un procedimiento según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8, en el que la etapa (ii) se lleva a cabo midiendo un efecto de polarización consecuente sobre las características alteradas del primer marcador fluorescente unido.
11. Un procedimiento según la reivindicación 10, en el que la etapa (ii) se lleva a cabo mediante anisotropía de polarización de fluorescencia.
12. Un soporte sólido que comprende al menos una enzima polimerasa, helicasa o primasa inmovilizada, estando la enzima marcada con al menos un marcador donador de FRET y al menos un marcador aceptor de FRET.
13. Un soporte sólido según la reivindicación 12, en el que el marcador es un fluoróforo.
14. Un sistema para determinar una secuencia de un polinucleótido, que comprende un soporte sólido según la reivindicación 12 o la reivindicación 13, y un aparato para detectar los marcadores.
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Families Citing this family (62)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP2267165B1 (en) * 1997-07-28 2016-11-30 Gen-Probe Incorporated Nucleic acid sequence analysis
US7875440B2 (en) 1998-05-01 2011-01-25 Arizona Board Of Regents Method of determining the nucleotide sequence of oligonucleotides and DNA molecules
US6780591B2 (en) 1998-05-01 2004-08-24 Arizona Board Of Regents Method of determining the nucleotide sequence of oligonucleotides and DNA molecules
GB9907812D0 (en) * 1999-04-06 1999-06-02 Medical Biosystems Ltd Sequencing
EP1681357A3 (en) 1999-05-19 2006-07-26 Cornell Research Foundation, Inc. Method for sequencing nucleic acid molecules
US7056661B2 (en) 1999-05-19 2006-06-06 Cornell Research Foundation, Inc. Method for sequencing nucleic acid molecules
US6818395B1 (en) 1999-06-28 2004-11-16 California Institute Of Technology Methods and apparatus for analyzing polynucleotide sequences
US7501245B2 (en) 1999-06-28 2009-03-10 Helicos Biosciences Corp. Methods and apparatuses for analyzing polynucleotide sequences
US7211390B2 (en) 1999-09-16 2007-05-01 454 Life Sciences Corporation Method of sequencing a nucleic acid
US7244559B2 (en) 1999-09-16 2007-07-17 454 Life Sciences Corporation Method of sequencing a nucleic acid
GB9923644D0 (en) 1999-10-06 1999-12-08 Medical Biosystems Ltd DNA sequencing
WO2002004680A2 (en) 2000-07-07 2002-01-17 Visigen Biotechnologies, Inc. Real-time sequence determination
US7211414B2 (en) 2000-12-01 2007-05-01 Visigen Biotechnologies, Inc. Enzymatic nucleic acid synthesis: compositions and methods for altering monomer incorporation fidelity
EP1368497A4 (en) 2001-03-12 2007-08-15 California Inst Of Techn METHODS AND APPARATUS FOR ANALYZING ASYNCHRONOUS BASE EXTENSION POLYNUCLEOTIDE SEQUENCES
GB0112238D0 (en) * 2001-05-18 2001-07-11 Medical Biosystems Ltd Sequencing method
US6956114B2 (en) 2001-10-30 2005-10-18 '454 Corporation Sulfurylase-luciferase fusion proteins and thermostable sulfurylase
US6902921B2 (en) 2001-10-30 2005-06-07 454 Corporation Sulfurylase-luciferase fusion proteins and thermostable sulfurylase
SE0201655D0 (sv) * 2002-05-31 2002-05-31 Amersham Biosciences Ab A method of electrophoresis
US7575865B2 (en) 2003-01-29 2009-08-18 454 Life Sciences Corporation Methods of amplifying and sequencing nucleic acids
WO2005003375A2 (en) 2003-01-29 2005-01-13 454 Corporation Methods of amplifying and sequencing nucleic acids
KR20060058681A (ko) * 2003-07-15 2006-05-30 다니엘 헨리 덴샴 폴리뉴클레오티드 증폭반응의 측정법
GB0317343D0 (en) * 2003-07-24 2003-08-27 Medical Biosystems Ltd Polynucleotide sequencing
US7169560B2 (en) 2003-11-12 2007-01-30 Helicos Biosciences Corporation Short cycle methods for sequencing polynucleotides
WO2005080605A2 (en) 2004-02-19 2005-09-01 Helicos Biosciences Corporation Methods and kits for analyzing polynucleotide sequences
DE602005027700D1 (de) 2004-05-25 2011-06-09 Helicos Biosciences Corp Verfahren zur nukleinsäureimmobilisierung
US7476734B2 (en) 2005-12-06 2009-01-13 Helicos Biosciences Corporation Nucleotide analogs
US7315019B2 (en) 2004-09-17 2008-01-01 Pacific Biosciences Of California, Inc. Arrays of optical confinements and uses thereof
US7170050B2 (en) 2004-09-17 2007-01-30 Pacific Biosciences Of California, Inc. Apparatus and methods for optical analysis of molecules
US7220549B2 (en) 2004-12-30 2007-05-22 Helicos Biosciences Corporation Stabilizing a nucleic acid for nucleic acid sequencing
US7482120B2 (en) 2005-01-28 2009-01-27 Helicos Biosciences Corporation Methods and compositions for improving fidelity in a nucleic acid synthesis reaction
US7666593B2 (en) 2005-08-26 2010-02-23 Helicos Biosciences Corporation Single molecule sequencing of captured nucleic acids
US7397546B2 (en) 2006-03-08 2008-07-08 Helicos Biosciences Corporation Systems and methods for reducing detected intensity non-uniformity in a laser beam
EP3722409A1 (en) * 2006-03-31 2020-10-14 Illumina, Inc. Systems and devices for sequence by synthesis analysis
GB0721340D0 (en) * 2007-10-30 2007-12-12 Isis Innovation Polymerase-based single-molecule DNA sequencing
MX2010010600A (es) 2008-03-28 2011-03-30 Pacific Biosciences California Inc Composiciones y metodos para secuenciacion de acidos nucleicos.
US9182406B2 (en) 2008-08-04 2015-11-10 Biodesy, Inc. Nonlinear optical detection of molecules comprising an unnatural amino acid possessing a hyperpolarizability
US20110294116A1 (en) * 2008-12-11 2011-12-01 The Regents of the Unicersity of California Methods and systems for direct sequencing of single dna molecules
US8911972B2 (en) 2009-12-16 2014-12-16 Pacific Biosciences Of California, Inc. Sequencing methods using enzyme conformation
WO2011159942A1 (en) 2010-06-18 2011-12-22 Illumina, Inc. Conformational probes and methods for sequencing nucleic acids
US9428789B2 (en) 2011-03-21 2016-08-30 Biodesy, Inc. Classification of kinase inhibitors using nonlinear optical techniques
DE102013202721A1 (de) * 2013-02-20 2014-08-21 Siemens Aktiengesellschaft Sequenziervorrichtung zum Sequenzieren mindestens eines Nukleinsäureeinzelstrangs und Verfahren zum Sequenzieren mindestens eines Nukleinsäureeinzelstrangs
GB201306444D0 (en) * 2013-04-09 2013-05-22 Base4 Innovation Ltd Single nucleotide detection method
EP3460075B1 (en) 2014-07-15 2020-11-04 Illumina, Inc. Biochemically activated electronic device
EP3237906B8 (en) 2014-12-23 2020-10-28 Bluelight Therapeutics, Inc. Attachment of proteins to interfaces for use in nonlinear optical detection
US10077470B2 (en) 2015-07-21 2018-09-18 Omniome, Inc. Nucleic acid sequencing methods and systems
EP3449012B1 (en) 2016-04-29 2020-12-23 Omniome, Inc. Sequencing method employing ternary complex destabilization to identify cognate nucleotides
KR102230444B1 (ko) 2016-08-15 2021-03-23 옴니옴 인코포레이티드 핵산을 시퀀싱하기 위한 방법 및 시스템
US10428378B2 (en) 2016-08-15 2019-10-01 Omniome, Inc. Sequencing method for rapid identification and processing of cognate nucleotide pairs
US11248254B2 (en) 2016-12-30 2022-02-15 Omniome, Inc. Method and system employing distinguishable polymerases for detecting ternary complexes and identifying cognate nucleotides
US10975427B2 (en) 2017-01-20 2021-04-13 Omniome, Inc. Process for cognate nucleotide detection in a nucleic acid sequencing workflow
US9951385B1 (en) 2017-04-25 2018-04-24 Omniome, Inc. Methods and apparatus that increase sequencing-by-binding efficiency
US10161003B2 (en) 2017-04-25 2018-12-25 Omniome, Inc. Methods and apparatus that increase sequencing-by-binding efficiency
JP2020530257A (ja) * 2017-09-15 2020-10-22 イルミナ インコーポレイテッド 配列検出システム
WO2019079593A1 (en) 2017-10-19 2019-04-25 Omniome, Inc. BACKGROUND NOISE REDUCTION AND STABILIZATION OF SIMULTANEOUS COMPLEXES IN LINKED ASSAY WORKFLOWS
US11499962B2 (en) 2017-11-17 2022-11-15 Ultima Genomics, Inc. Methods and systems for analyte detection and analysis
US10267790B1 (en) 2017-11-17 2019-04-23 Ultima Genomics, Inc. Systems for biological sample processing and analysis
US10512911B1 (en) * 2018-12-07 2019-12-24 Ultima Genomics, Inc. Implementing barriers for controlled environments during sample processing and detection
US12239980B2 (en) 2018-12-07 2025-03-04 Ultima Genomics, Inc. Implementing barriers for controlled environments during sample processing and detection
US11118223B2 (en) 2019-03-14 2021-09-14 Ultima Genomics, Inc. Methods, devices, and systems for analyte detection and analysis
US10900078B2 (en) 2019-03-14 2021-01-26 Ultima Genomics, Inc. Methods, devices, and systems for analyte detection and analysis
US12060148B2 (en) 2022-08-16 2024-08-13 Honeywell International Inc. Ground resonance detection and warning system and method
CN116287109A (zh) * 2022-09-29 2023-06-23 清华大学 一种测量单分子rna力谱的方法及其应用

Family Cites Families (33)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
SE462454B (sv) 1988-11-10 1990-06-25 Pharmacia Ab Maetyta foer anvaendning i biosensorer
GB8910880D0 (en) * 1989-05-11 1989-06-28 Amersham Int Plc Sequencing method
CA2044616A1 (en) 1989-10-26 1991-04-27 Roger Y. Tsien Dna sequencing
US5583026A (en) * 1994-08-31 1996-12-10 Cornell Research Foundation, Inc. Process for reconstituting the polymerase III* and other subassemblies of E. coli DNA polymerase III holoenzyme from peptide subunits
GB9208733D0 (en) 1992-04-22 1992-06-10 Medical Res Council Dna sequencing method
US5360714A (en) * 1992-08-28 1994-11-01 Fox Chase Cancer Center Hepadnavirus polymerase gene product having RNA-dependent DNA priming and reverse transcriptase activities and methods of measuring the activities thereof
ATE220114T1 (de) 1993-03-19 2002-07-15 Sequenom Inc Dns-sequenzbestimmung durch massenspektrometrie auf dem weg des abbaus mit exonuklease
WO1995006138A1 (en) * 1993-08-25 1995-03-02 The Regents Of The University Of California Microscopic method for detecting micromotions
US5747247A (en) * 1994-07-25 1998-05-05 The Regents Of The University Of California Spectroscopic helicase assay
US5801042A (en) * 1994-08-18 1998-09-01 The Trustees Of Columbia University In The City Of New York Unique associated Kaposi's sarcoma virus sequences and uses thereof
US5753439A (en) * 1995-05-19 1998-05-19 Trustees Of Boston University Nucleic acid detection methods
CN1251609A (zh) * 1997-02-12 2000-04-26 尤金·Y·查恩 分析聚合物的方法和产品
JP2001514511A (ja) * 1997-03-05 2001-09-11 スクリプトゲン ファーマシューティカルズ インク 核酸への親和性を持つ化合物同定のための蛍光異方性を用いたスクリーニング
US6159687A (en) * 1997-03-18 2000-12-12 Novo Nordisk A/S Methods for generating recombined polynucleotides
EP2267165B1 (en) 1997-07-28 2016-11-30 Gen-Probe Incorporated Nucleic acid sequence analysis
US7875440B2 (en) * 1998-05-01 2011-01-25 Arizona Board Of Regents Method of determining the nucleotide sequence of oligonucleotides and DNA molecules
US6263286B1 (en) * 1998-08-13 2001-07-17 U.S. Genomics, Inc. Methods of analyzing polymers using a spatial network of fluorophores and fluorescence resonance energy transfer
WO2000009757A1 (en) 1998-08-13 2000-02-24 U.S. Genomics, Inc. Optically characterizing polymers
US6210896B1 (en) * 1998-08-13 2001-04-03 Us Genomics Molecular motors
AU3174600A (en) * 1999-03-10 2000-09-28 Asm Scientific, Inc. A method for direct nucleic acid sequencing
GB9907812D0 (en) * 1999-04-06 1999-06-02 Medical Biosystems Ltd Sequencing
US7056661B2 (en) * 1999-05-19 2006-06-06 Cornell Research Foundation, Inc. Method for sequencing nucleic acid molecules
US6335420B1 (en) 1999-11-22 2002-01-01 Ibc Advanced Technologies, Inc. Polyamide ligand-containing polymeric resins and methods of using the same for removing, separating and/or concentrating desired metal ions from solutions
GB9923644D0 (en) * 1999-10-06 1999-12-08 Medical Biosystems Ltd DNA sequencing
US6908736B1 (en) * 1999-10-06 2005-06-21 Medical Biosystems, Ltd. DNA sequencing method
GB0112238D0 (en) 2001-05-18 2001-07-11 Medical Biosystems Ltd Sequencing method
GB0317343D0 (en) * 2003-07-24 2003-08-27 Medical Biosystems Ltd Polynucleotide sequencing
GB0413082D0 (en) 2004-06-11 2004-07-14 Medical Biosystems Ltd Method
US8262900B2 (en) * 2006-12-14 2012-09-11 Life Technologies Corporation Methods and apparatus for measuring analytes using large scale FET arrays
US20100137143A1 (en) * 2008-10-22 2010-06-03 Ion Torrent Systems Incorporated Methods and apparatus for measuring analytes
US20100301398A1 (en) * 2009-05-29 2010-12-02 Ion Torrent Systems Incorporated Methods and apparatus for measuring analytes
US8574835B2 (en) * 2009-05-29 2013-11-05 Life Technologies Corporation Scaffolded nucleic acid polymer particles and methods of making and using
US8673627B2 (en) * 2009-05-29 2014-03-18 Life Technologies Corporation Apparatus and methods for performing electrochemical reactions

Also Published As

Publication number Publication date
JP2003511043A (ja) 2003-03-25
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BR0014468A (pt) 2002-08-20
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GB9923644D0 (en) 1999-12-08
AU769102B2 (en) 2004-01-15
DE60038244T2 (de) 2009-04-23
WO2001025480A2 (en) 2001-04-12
JP2012196201A (ja) 2012-10-18
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US20120214164A1 (en) 2012-08-23
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