ES2302811T3 - Procedimiento para proteger transplantes de islotes alogenicos usando moleculas mutantes soblules ctla4. - Google Patents
Procedimiento para proteger transplantes de islotes alogenicos usando moleculas mutantes soblules ctla4. Download PDFInfo
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Abstract
Uso de una molécula mutante de CTLA4 soluble en la fabricación de un medicamento para inhibir el rechazo de trasplante de células de islotes, en el que la molécula mutante de CTLA4 soluble comprende dominio extracelular mutado de CTLA4, teniendo el dominio extracelular mutado de CTLA4 a) una secuencia de aminoácidos que comienza con metionina en la posición +1 y termina con ácido aspártico en la posición +124 como se muestra en la Figura 3. o que comienza con alanina en la posición -1 y termina con ácido aspártico en la posición +124 como se muestra en la Figura 3; b) una secuencia de aminoácidos que comienza con metionina en la posición +1 y termina con ácido aspártico en la posición +124 como se muestra en la Figura 19, o que comienza con alanina en la posición -1 y termina con ácido aspártico en la posición +124 como se muestra en la Figura 19; c) una secuencia de aminoácidos que comienza con metionina en la posición +1 y termina con ácido aspártico en la posición +124 como se muestra en la Figura 20, o que comienza con alanina en la posición -1 y termina con ácido aspártico en la posición +124 como se muestra en la Figura 20; d) una secuencia de aminoácidos que comienza con metionina en la posición +1 y termina con ácido aspártico en la posición +124 como se muestra en la Figura 21, o que comienza con alanina en la posición -1 y termina con ácido aspártico en la posición +124 como se muestra en la Figura 21; o
Description
Procedimiento para proteger transplantes de
islotes alogénicos usando moléculas mutantes solubles CTLA4.
La presente invención se refiere en general al
campo de inhibición de transplante de las células de los islotes.
En particular, la invención se refiere a los procedimientos para
tratar diabetes, incluyendo diabetes de tipo 1 y tipo 2, mediante
la administración a un sujeto de una cantidad eficaz de moléculas
mutantes CTLA4.
El transplante de órganos ha surgido como un
procedimiento preferido de tratamiento de muchas formas de
enfermedades que amenazan la vida que implican daño de órganos. Se
han logrado resultados mejorados en el transplante clínico
principalmente hasta del desarrollo de cada vez más fármacos
potentes inmunosupresores no específicos que inhiben las respuestas
del rechazo (Lancet, 345: 1321 - 1325 (1995)). Mientras los
resultados a corto plazo han mejorado, los éxitos a largo plazo
son inadecuados. Actualmente, los agentes inmunosupresores de larga
vida se requieren para combatir el rechazo crónico del órgano
trasplantado, y el uso de estos agentes incrementa de manera
notable los riesgos de enfermedad cardiovascular, infecciones y
malignidades.
El desarrollo de las estrategias para promover
la aceptación de tejidos alogénicos sin la necesidad de
inmunosupresión crónica puede reducir el riesgo de estas
complicaciones de riesgo para la vida, y en gran medida extienden
la aplicación de trasplante de órganos, tejido y celular para
enfermedades tales como hemoglobinopatías, inmunodeficiencias
genéticas, y enfermedades autoinmunes.
La diabetes mellitus dependiente de insulina
(IDDM) es uno de los trastornos metabólicos que se produce más
frecuentemente en el mundo. En los Estados Unidos IDDM afecta
aproximadamente a una de 300 a 400 personas, y los estudios
epidemiológicos sugieren que la incidencia de IDDM está
continuamente incrementándose. La IDDM está provocada por una
respuesta inmune que da como resultado la destrucción mediada por
los linfocitos T de las células de los islotes que producen
insulina del páncreas.
Una vez que los síntomas clínicos de la IDDM se
han hecho evidentes, la terapia más comúnmente empleada para
controlar los síntomas clínicos de IDDM es el reemplazo exógeno de
insulina. Aunque la terapia de reemplazo de insulina permite que la
mayoría de los pacientes de IDDM lleven algo de vida normal, no
reestablece completamente la homeostasis metabólica, y como
resultado, son comunes graves complicaciones incluyendo disfunciones
del ojo, riñón, corazón, y otros órganos en pacientes diabéticos
que se someten a terapia de reemplazo de insulina.
Un tratamiento a largo plazo para los pacientes
de IDDM es el trasplante de los islotes. Sin embargo, las células
de los islotes trasplantadas que producen insulina se destruyen a
menudo rápidamente mediante la misma respuesta inmune que
previamente destruía las propias células de los islotes de los
pacientes. De los 260 aloinjertos trasplantados desde 1990,
solamente el 12,4% daban como resultado independencia de insulina
durante períodos de más de una semana, y solamente un 8,25% han
sido independientes de insulina durante períodos de más de un año
(Linsley et al. Diabetes (1997) 46: 1120 - 3). En la mayoría
de estos procedimientos, el régimen de base de la inmunosupresión
consistía de la inducción de anticuerpos con una inmunoglobulina
anti linfocito combinada con ciclosporina, azatiprina, y
glucocorticoides.
Para cualquier tipo de procedimiento de
trasplante, un equilibrio entre la eficacia y toxicidad es un factor
clave para su aceptación clínica. Con respecto al trasplante de
islotes, un asunto adicional es que muchos de los agentes
inmunosupresoers actuales con glucocorticoides particulares o un
inhibidor de la calcineurina, tal como Tarcolimus, lesión de las
células beta o inducen resistencia a insulina (Zeng et al.
Surgery (1993) 113: 98 - 102).
Un protocolo de inmunosupresores sin esteroides
("Protocolo Edmonton") que incluye sirolimus, Tarcolimus de
dosis baja, y un anticuerpo monoclonal (mAb) contra el receptor de
IL-2 se ha usado en un ensayo de trasplante de
islotes solo para pacientes con diabetes de tipo 1 (Shapiro, A.M.J.
et al, (2000), N. Eng. J. Med, 343: 230 - 238).
El éxito reciente que usa "Protocolo
Edmonton" tiene un entusiasmo renovado para el uso de de
trasplante de islotes para tratar diabetes. Sin embargo, los
asuntos con relación a la toxicidad del Tarcolimus puede limitar
la aplicación de esta terapia en seres humanos. Los agentes
biológicos que bloquean las señales coestimuladoras de las células
T claves en particular la ruta de CD28, son alternativas potenciales
para proteger los islotes alogénicos. Los ejemplos de los agentes
que bloquean la ruta de CD28 incluyen pero no se limitan a CTLA4
soluble incluyendo moléculas mutantes de CTLA4.
La presente invención se refiere al uso de una
molécula mutante de CTLA4 en la fabricación de un medicamento para
inhibir el rechazo de trasplante de células de islotes, en el que la
molécula mutante de CTLA4 soluble comprende un dominio extracelular
mutado de CTLA4, teniendo el dominio extracelular mutado de
CTLA4
a) una secuencia de aminoácidos que comienza con
metionina en la posición +124 como se muestra en la Figura 3, o que
comienza con alanina en la posición -1 y termina con ácido aspártico
en la posición +124 como se muestra en la Figura 3;
b) una secuencia de aminoácidos que comienza con
metionina en la posición +1 y termina con ácido aspártico en la
posición +124 como se muestra en la Figura 19, o que comienza con
alanina en la posición -1 y termina con ácido aspártico en la
posición +124 como se muestra en la Figura 19;
c) una secuencia de aminoácidos que comienza con
metionina en la posición +1 y termina con ácido aspártico en la
posición +124 como se muestra en la Figura 20, o que comienza con
alanina en la posición -1 y termina con ácido aspártico en la
posición +124 como se muestra en la Figura 20;
d) una secuencia de aminoácidos que comienza con
metionina en la posición +1 y termina con ácido aspártico en la
posición +124 como se muestra en la Figura 21, o que comienza con
alanina en la posición -1 y termina con ácido aspártico en la
posición +124 como se muestra en la Figura 21; o
e) una secuencia de aminoácidos que comienza con
metionina en la posición +1 y termina con ácido aspártico en la
posición +124 como se muestra en la Figura 22, o que comienza con
alanina en la posición -1 y termina con ácido aspártico en la
posición +124 como se muestra en la Figura 22.
\vskip1.000000\baselineskip
La presente invención también se refiere a una
molécula mutante de CTLA4 soluble para uso en la inhibición de del
rechazo de trasplante de de células de islotes, en el que la
molécula mutante de CTLA4 soluble es como se ha definido
anteriormente.
De acuerdo con una realización particular de la
invención, el trasplante de las células de los islotes es para
tratar diabetes, en particular, la diabetes de tipo 1 o diabetes de
tipo 2. El trasplante de células de islotes puede comprender
células de islotes encapsuladas.
La inhibición de rechazo de trasplante de
células de islotes puede comprender la administración de la molécula
mutante de CTLA4 soluble antes, durante o después del trasplante de
células de islotes.
De acuerdo con una realización particular de la
invención, el dominio extracelular de CTLA4 está condensado a un
resto no CTLA4, el resto no CTLA4 que comprende un resto de
inmunoglobulina, por ejemplo, una región constante de
inmunoglobulina o parte de la misma tal como una que comprende una
o más mutaciones para reducir la función del efector. La región
constante de inmunoglobulina también puede comprender las regiones
bisagra CH2 y CH3 de una molécula de inmunoglobulina. Además, la
región constante de inmunoglobulina o parte de la misma puede ser
una región constante de inmunoglobulina humana o de mono.
De acuerdo con una realización particular de la
invención, la molécula mutante de CTLA4 soluble es:
\vskip1.000000\baselineskip
a) L104EA29YIg como se muestra en la Figura 3
que comienza con Ala en la posición -1 o Met en la posición +1 y
que termina con Lys en la posición +357 (SEQ ID NO:6, que comienza
con Ala en la posición 26 y que termina con Lys en la posición 383,
o que comienza con Met en la posición 27 y que termina con Lys en la
posición 383);
b) L104EIg como se muestra en la Figura 19 que
comienza con Ala en la posición -1 o Met en la posición +1 y que
termina con Lys en la posición +357 (SEQ ID NO:8, que comienza con
Ala en la posición 26 y que termina con Lys en la posición 383, o
que comienza con Met en la posición 27 y que termina con Lys en la
posición 383);
c) L104EA29LIg como se muestra en la Figura 20
que comienza con Ala en la posición -1 o Met en la posición +1 y
que termina con Lys en la posición +357 (SEQ ID NO:10, que comienza
con Ala en la posición 26 y que termina con Lys en la posición 383,
o que comienza con Met en la posición 27 y que termina con Lys en la
posición 383);
d) L104EA29TIg como se muestra en la Figura 21
que comienza con Ala en la posición -1 o Met en la posición +1 y
que termina con Lys en la posición +357 (SEQ ID NO:12, que comienza
con Ala en la posición 26 y que termina con Lys en la posición 383,
o que comienza con Met en la posición 27 y que termina con Lys en la
posición 383; o
e) L104EA29WIg como se muestra en la Figura 22
que comienza con Ala en la posición -1 o Met en la posición +1 y
que termina con Lys en la posición +357 (SEQ ID NO:14, que comienza
con Ala en la posición 26 y que termina con Lys en la posición 383,
o que comienza con Met en la posición 27 y que termina con Lys en la
posición 383).
\vskip1.000000\baselineskip
De acuerdo con una realización particular de la
invención, la molécula mutante de CTLA4 soluble y al menos un
compuesto adicional son para ello. El compuesto adicional se puede
seleccionar entre el grupo constituido por compuestos
inmunosupresores, compuestos inmunomoduladores y compuestos
antiinflamatorios. En particular, el compuesto se puede seleccionar
entre el grupo constituido por anakinra, adrenocorticosteroides,
azatioprina, basiliximab, inhibidores de calcineurina, cloroquina,
corticosteroides, ciclosporina, prednisona, ciclofosfamida,
citoxan, 15-deoxispergualina y sus análogos,
D-penicilamina, etanercept, acetato de glatiramer,
FTY720 y sus análogos, glucocorticoides, sales de oro, globulina de
timocitos anti-humana de caballo (ATGAM),
anti-TAC (HAT) humanizado, hidroxicloroquina,
infliximab, interferón beta-1a, interferón
beta-1b, leflunomida y sus análogos, globulina
inmune de linfocitos, agentes buscadores de linfocitos, metoxsalen,
metotrexato, clorhidrato de mitoxantrona, ácido micofenólico,
micofenolato mofetil, mizoribina, NSAIDs, globulina de timocitos
anti-humano de conejo, globulina inmune Rho (D),
sirolismus (rapamicina) y sus derivados (por ejemplo
40-0-(2-hidroxi)etilrapamicina),
sulfasalazopirina, sulfasalzinae, tacrolismus
(FK-506), talidomida, bloqueadores de TNF\alpha y
agentes biológicos que que dirigen una citoquina inflamatoria,
inhibidores TOR, compuestos que interfieren con CD40 y CD154, gp39
soluble, CD29 soluble, CD40 soluble, CD80 soluble (por ejemplo ATCC
68627), CD86 soluble, CD28 soluble, CD56 soluble,
Thy-1 soluble, CD3 soluble, TCR soluble,
VLA-4 soluble, VCAM-1 soluble,
LECAM-1 soluble, ELAM-1 soluble,
CD44 soluble, anticuerpos reactivos con gp39 (por ejemplo ATCC
HB-10916, ATCC HB-12055 y ATCC
HB-12056), anticuerpos reactivos con CD40 (por
ejemplo ATCC HB-9110), anticuerpos reactivos con B7
(por ejemplo ATCC HB-253, ATCC
CRL-2223, ATCC CRL-2226, ATCC
HB-301, ATCC HB-11341), anticuerpos
reactivos con CD28 (por ejemplo ATCC HB-11944 o mAb
9.3), anticuerpos reactivos con LFA-1 (por ejemplo
ATCC HB-9579 y ATCC TIB-213),
anticuerpos reactivos con LFA-2, anticuerpos
reactivos con IL-2, anticuerpos reactivos con
IL-12, anticuerpos reactivos con
IFN-gamma, anticuerpos reactivos con CD2,
anticuerpos reactivos con CD48, anticuerpos reactivos con cualquier
ICAM (por ejemplo, con ICAM-1 (ATCC
CRL-2252), ICAM-2 y
ICAM-3), anticuerpos reactivos con CTLA4 (por
ejemplo ATCC HB-304), anticuerpos reactivos con
Thy-1, anticuerpos reactivos con CD56, anticuerpos
reactivos con CD3, anticuerpos reactivos con CD29, anticuerpos
reactivos con TCR, anticuerpos reactivos con VLA-4,
anticuerpos reactivos con VCAM-1, anticuerpos
reactivos con LECAM-1, anticuerpos reactivos con
ELAM-1, anticuerpos reactivos con CD44, anticuerpos
monoclonales a receptores de leucocitos, por ejemplo MHC, CD2, CD3,
CD4, CDIIa/CD18, CD7, CD25, CD27, B7, CD40, CD45, CD58, CD137,
ICOS, CD150 (SLAM), OX40, 4-1BB o sus ligandos,
CTLA4/CD28-Ig; antagonistas de
LFA-1, antagonistas de selectina y antagonistas de
VLA-4 y mAbs de IL-2R
anti-humanos. La molécula mutante de CTLA4 soluble
y el compuesto adicional se puede administrar conjuntamente,
administrar de manera simultánea o en secuencia.
De acuerdo con una realización particular de la
invención, la inhibición del rechazo de trasplante de células de
islotes comprende un régimen inmunosupresor adicional. El régimen
inmunosupresor adicional puede ser sin glucocorticoide o comprender
un corticosteroide. De acuerdo con una realización de la invención,
el régimen inmunosupresor adicional es sin inhibidor de
calcineurina.
En particular, el régimen inmunosupresor
adicional puede comprender uno o más de los compuestos anteriores a
usar en combinación con la molécula mutante de CTLA4 soluble. Puede
comprender un inhibidor de TOR, por ejemplo, rapamicina
(sirolismus) o su derivado, y/o un agente biológico que dirige
IL-2, por ejemplo, un anticuerpo reactivo con
IL-2 o un mAb de IL-2R
anti-humano tal como basiliximab; ácido micofenólico
o micofenolato mofetil; o un compuesto que interfiere con la unión
de CD40 a CD154, por ejemplo un anticuerpo anti-CD40
o un anticuerpo anti-CD154.
De acuerdo con una realización particular de la
invención, la inhibición del rechazo de trasplante de células de
islotes comprende la administración de células de médula ósea
agotadas de células T. La administración de células de médula ósea
agotadas de células T puede ser a aproximadamente el mismo tiempo
que la colocación del trasplante de células de islotes o antes de
la colocación del trasplante de células de islotes. La
administración de las células de médula ósea agotadas de células T
puede comprender una primera dosis y una segunda dosis.
Las moléculas mutante de CTLA4 solubles de la
invención se unen a moléculas CD80 y/o CD86 sobre células positivas
CD80 y/o CD86, inhibiendo por lo tanto las moléculas endógenas CD80
y/o CD86 a partir de la unión a CTLA4 y/o CD28 sobre las células T,
y de este modo, bloquear las señales coestimuladoras de las células
T clave T, en particular la ruta de CD28.
La Figura 1 muestra la secuencia de nucleótidos
(SEQ ID NO.: 1) y de aminoácidos (SEQ ID NO.: 2) completa para el
receptor de CTLA4 humano condensado al péptido de señal M de
oncostatina. El péptido de señal M de oncostatina está indicado en
la posición -25 a -1.
La Figura 2 muestra una secuencia de nucleótidos
(SEQ m NO.: 3) y de aminoácidos (SEQ ID NO.: 4) de una CTLA4Ig que
tiene un péptido de señal; una secuencia de aminoácidos de tipo
salvaje del dominio extracelular de CTLA4 que comienza en metionina
en la posición +1 a ácido aspártico en la posición +124, o que
comienza en alanina en la posición -1 a ácido aspártico en la
posición +124; y una región de Ig.
La Figura 3 muestra una secuencia de nucleótidos
(SEQ ID NO.: 5) y de aminoácidos (SEQ ID NO.: 6) de una molécula
mutante de CTLA4 (L104EA29YIg) que comprende un péptido de señal; un
dominio extracelular mutado de CTLA4 que comienza en metionina en
la posición +1 y que termina en ácido aspártico en la posición +124,
o que comienza en alanina en la posición -1 y que termina en
ácido aspártico en la posición +124; y una región de Ig como se
describe en el Ejemplo 1, más abajo.
La Figura 4 es un gráfico de líneas que ilustra
el nivel de glucosa en plasma en ayunas en un sujeto normal, como
se describe en el Ejemplo 3, más abajo.
La Figura 5 es un gráfico de líneas que ilustra
el nivel de glucosa en plasma en sujetos pancreatectomizados con
células de islotes pancreáticas trasplantadas como se describe en
el Ejemplo 3. Los animales se trasplantaron con células de islotes
el día 0, y o bien se trataron con un régimen inmunosupresor que
contiene L104EA29YIg, y un régimen inmunosupresor de base
(tratado), o solamente un régimen inmunosupresor de base (control).
El régimen inmunosupresor de base contenía rapamicina y IL2R
anti-humano.
La Figura 6 es un gráfico de líneas que ilustra
el requerimiento de insulina en sujetos con células de islotes
trasplantadas como se describe en el Ejemplo 3. Los animales se
trasplantaron con células de islotes el día 0, y se trataron con un
régimen inmunosupresor que contenía L104EA29YIg y un régimen
inmunosupresor de base (tratado), o solamente un régimen
inmunosupresor de base (control).
La Figura 7 es un gráfico de líneas que ilustra
el nivel de glucosa en sangre en un ensayo de tolerancia a glucosa
intravenosa antes y después del trasplante de islotes, como se
describe en el Ejemplo 3.
La Figura 8 muestra un diagrama esquemático de
un vector, piLN-L104EA29Y, que tiene la
inserción
L104EA29YIg.
L104EA29YIg.
Las Figuras 9A y 9B ilustran los datos de los
ensayos FACS que muestran la unión de L104EA29YIg, L104EIg, y
CTLA4Ig a células CHO transfectadas CD80- o CD86 como se describe
en el Ejemplo 2, más abajo.
Las Figuras 10A y 10B muestra la inhibición de
la proliferación de células CHO CD80-positiva y
CD86-positiva como se describe en el Ejemplo 2, más
abajo.
Las Figuras 11A y 11B muestra que L104EA29YIg es
más eficaz que CTLA4Ig en la inhibición de la proliferación de
células T primarias y secundarias como se describe en el Ejemplo 2,
más abajo.
Las Figuras 12A-C ilustran que
L104EA29YIg es más eficaz que CTLA4Ig en la inhibición
IL-2 (Fig. 12A), IL-4 (Fig. 12B), y
producción de citoquinas de \gamma-interferon
(Fig. 12C) de células T humanas aloestimuladas como se describe en
el Ejemplo 2, más abajo.
La Figura 13 demuestra que L104EA29YIg es más
eficaz que CTLA4Ig en la inhibición de la proliferación de células
T de mono estimuladas con fitohemaglutinina- (FA) como se describe
en el Ejemplo 2, más abajo.
Las Figuras 14A-C son gel de SDS
gel (Fig. 14A) para CTLA4Ig (banda 1), L104EIg (banda 2), y
L104EA29YIg (banda 3A); y cromatografías de exclusión de tamaño de
CTLA4Ig (Fig. 14B) y L104EA29YIg (Fig. 14C).
Las Figuras 15A y 15B ilustran a un diagrama de
bandas del pliegue de tipo V de Ig extracelular de CTLA4 generado
a partir de la estructura de solución determinada por espectroscopía
de RMN. La Fig. 15B muestra una vista expandida de la región
S25-R33 y la región MYPPPY que indica la
localización y orientación de la cadena lateral de las mutaciones
que potencian la avidez, L104 y A29.
La Figura 16 muestra glucosa de sangre en ayunas
para receptores tratados con LEA29YIg (A) y control (B) de islotes
alogénicos (animales representativos) antes y después del
trasplante. Todos los animales se sometieron a pancreastectomía
quirúrgica al menos 2 semanas antes de del trasplante
(requerimiento de insulina antes del trasplante medio de 8,76 \pm
0,18 unidades/día) (C) Después de la infusión intraportal de islotes
alogénicos, los receptores rápidamente se hicieron euglicémicos que
no requería un trasplante exógeno posterior de insulina. (D) La
inducción de diabetes y función de los islotes después del
trasplante se confirmó mediante el ensayo de tolerancia de glucosa
intravenosa antes del trasplante 1 mes y 3 meses después del
trasplante, como se describe en el Ejemplo 3, más abajo.
La Figura 17 muestra (A) la inmunohistología de
islote trasplantado funcional confirmado mediante tinción positiva
para insulin. (B) Islote de un animal que recibe régimen de
control rodeado por infiltrado mononuclear, que indica rechazo,
como se describe en el Ejemplo 3, más abajo.
La Figura 18 muestra la supresión de respuestas
de células T- y B- anti-donante por el régimen
L104EA29Y. (A) la respuesta de
IFN-\gamma-ELISpot
anti-donante corresponde al programa de rechazo en
los controles. (\sim 1 semana después del trasplante). (B) el
régimen L104EA29Y suprime de manera eficaz la generación de
respuesta de células T anti-donante. (C) los
animales que reciben mAb anti-IL-2R
de rapamicina rápidamente producen anticuerpo
anti-donante detectable, como se mide por
procedimientos citométricos de flujo en el momento del rechazo. (D)
los receptores de islotes que reciben el régimen que contiene
L104EA29Y no genera una respuesta de anticuerpo
anti-donante mientras se trata, como se describe en
el Ejemplo 3, más abajo.
La Figura 19 muestra las secuencias de
nucleótidos y de aminoácidos de L104EIg (SEQ ID NOs.: 7 - 8), como
se describe en el Ejemplo 2, más abajo.
La Figura 20 muestra las secuencias de
nucleótidos y de aminoácidos de L104EA29LIg (SEQ ID NOs.: 9 -
10).
La Figura 21 muestra las secuencias de
nucleótidos y de aminoácidos de L104EA29TIg (SEQ ID NOs.:
11-12).
La Figura 22 muestra las secuencias de
nucleótidos y de aminoácidos de L104EA29WIg (SEQ ID NOs.:
13-14).
La Figura 23 muestra la secuencia de nucleótidos
de una CTLA4Ig (SEQ ID NO.: 15) que tiene un péptido de señal; una
secuencia de aminoácidos de tipo salvajes del dominio extracelular
de CTLA4 que comienza en metionina en la posición +1 a ácido
aspártico en la posición +124, o que comienza en alanina en la
posición -1 a ácido aspártico en la posición +124; y una región
Ig.
La Figura 24 muestra la secuencia de aminoácidos
de CTLA4Ig (SEQ ID NO.: 16) que tiene un péptido de señal; una
secuencia de aminoácidos de tipo salvaje del dominio extracelular
de CTLA4 que comienza en metionina en la posición +1 a ácido
aspártico en la posición +124, o que comienza en alanina en la
posición -1 a ácido aspártico en la posición +124; y una región
Ig.
Todos los términos científicos y técnicos usados
en esta solicitud tienen significado usado de manera común en la
técnica salvo que se especifique de otra manera. Como se usa en esta
solicitud, las siguientes palabras o frases tienen los significados
especificados.
Como se usa en el presente documento "CTLA4 de
tipo salvaje" tiene la secuencia de aminoácidos de origen
natural, CTLA4 de longitud completa (Patentes de Estados Unidos
Números. 5.434.131, 5.844.095, 5.851.795), o cualquiera de sus
partes que se une a la molécula B7 (CD80 y/o CD86), o interfiere con
una molécula de B7 (por ejemplo, CD80 y/o CD86) de manera que
bloquee su unión a su ligando, o bloquea su unión al dominio
extracelular de CTLA4 o sus partes. En particular realizaciones,
CTLA4 de tipo salvaje comienza con metionina en la posición +1 y
termina en ácido aspártico en la posición +124, o CTLA4 de tipo
salvaje comienza con alanina en la posición - 1 y termina en
ácido aspártico en la posición +124. En otras realizaciones, CTLA4
de tipo salvaje consta de los 187 aminoácidos del receptor de CTLA4
como se describe en la Fig. 3 de las patentes de Estados Unidos
números 5.434.131. 5.844.095. 5.851.795. y se muestra en el
presente documento como la Figura 1. CTLA4 de tipo salvaje es una
proteína de superficie celular, que tiene un dominio extracelular
N-terminal, un dominio transmembrana, y un dominio
citoplásmico C-terminal. El dominio extracelular se
une a antígenos diana, tales como CD80 y CD86. En una célula, las
proteínas de CTLA4 de tipo salvaje, de origen natural se traducen
como un polipéptido inmaduro, que incluye un péptido de señal en el
extremo N-terminal. El polipéptido inmaduro que
experimenta el procesamiento después de la traducción, que incluye
la escisión y retirada del péptido de señal para generar un
producto de escisión de CTLA4 que tiene un extremo
N-terminal generado recientemente a partir del
extremo N-terminal en la forma inmadura. Los
expertos en la técnica apreciarán que se puede producir un
procesamiento adicional después de traducción, que elimina uno o más
de los aminoácidos del extremo N-terminal generado
recientemente del producto de escisión de CTLA4. La forma madura de
la molécula de CTLA4 incluye el dominio extracelular de CTLA4, o
cualquier parte del mismo, que se une a CD80 y/o CD86.
Como se usa en el presente documento "el
domino extracelular CTLA4" es la parte del receptor de CTLA4 que
se extiende fuera de la membrana celular, e incluye cualquier parte
de CTLA4 que se extiende fuera de la membrana celular que reconoce
y se une a ligandos de CTLA4, tal como una molécula de B7 (por
ejemplo, moléculas CD80 y/o CD86). Por ejemplo, un dominio
extracelular de CTLA4 comprende metionina en la posición +1 a ácido
aspártico en la posición +124 (Figura 2). Como alternativa, un
dominio extracelular de CTLA4 comprende alanina en la posición +1
a ácido aspártico en la posición +125 (Figura 1). El dominio
extracelular incluye fragmentos o derivados de CTLA4 que se unen a
una molécula de B7 (por ejemplo, CD80 y/o CD86).
Como se usa en el presente documento una
"secuencia de proteínas no CTLA4" o "molécula no CTLA4"
se define como cualquier molécula que no se une a CD80 y/o CD86 y
no interfiere con la unión de CTLA4 a su diana. Un ejemplo incluye,
pero no se limita a, una región constante de inmunoglobulina (Ig) o
su parte. Preferiblemente, la región de Ig constante es una región
constante de Ig, por ejemplo, humano C (gamma)1, incluyendo
las regiones bisagra, CH2 y CH3. La región constante de Ig se puede
mutar para reducir sus funciones efectoras (Patentes de Estados
Unidos Números: 5.637.481; y 6.090.914).
Como se usa en el presente documento,
"soluble" se refiere a cualquier molécula, o sus fragmentos o
derivados, no unida o anexada a la célula, es decir, circulante.
Por ejemplo, CTLA4, L104EA29YIg, B7 o CD28 se puede hacer soluble
mediante la anexión de un resto de inmunoglobulina (Ig) al dominio
extracelular de CTLA4, B7 o CD28, respectivamente. Otras moléculas
pueden ser producto génico E7 de papilomavirus (E7), antígeno
asociado a melanoma p97 (p97) o proteína env de VIH (env gp120).
Como alternativa, una molécula tal como CTLA4 se puede hacer
soluble eliminando su dominio transmembrana. Típicamente, las
moléculas solubles en los procedimientos de la invención no
incluyen una secuencia de señal (o guía).
"CTLA4Ig" es una proteína de fusión soluble
que comprende un dominio extracelular de CTLA4, o una parte del
mismo que se une a CD80 y/o CD86, que se une a la cola de Ig. Una
realización particular comprende el dominio extracelular de CTLA4
de tipo salvaje que comienza en metionina en la posición +1 y que
termina en ácido aspártico en la posición +124; o que comienza en
alanina en la posición -1 a ácido aspártico en la posición +124;
un resto de aminoácido de conexión glutamina en la posición +125; y
una parte de inmunoglobulina que comprende ácido glutámico en la
posición +126 por medio de lisina en la posición +357 (Figura 2).
ADN que codifica CTLA4Ig se depositó el 31 de mayo de 1991 con la
Colección Americana de Cultivos Tipo (ATCC), 10801 University Blvd.,
Manassas, VA 20110-2209 bajo las disposiciones del
Tratado de Budapest, y se ha acordado en número de acceso de ATCC
ATCC 68629; Linsley, P., et al., 1994 Immunity 1:793 - 80).
CTLA4Ig-24, se depositó una línea celular de Ovario
de Hámster Chino (CHO) que expresa CTLA4Ig se depositó el 31 de
mayo de 1991 con el número de identificación de ATCC
CRL-10762). Las moléculas de CTLA4Ig solubles usadas
en los procedimientos y/o kits de la invención puede o no puede
incluir una secuencia de péptido señal (guía). Típicamente, en los
procedimientos y/o kits de la invención, las moléculas no incluyen
una secuencia de péptido señal.
Como se usa en el presente documento,
"moléculas de CTLA4 solubles" significa moléculas de CTLA4 no
unidas a la superficie de las células (es decir, circulantes) (tipo
salvaje o mutante) o cualquier parte funcional de una molécula de
CTLA4 que se une a B7 que incluye, pero no se limita a: proteínas de
fusión de CTLA4Ig (por ejemplo, ATCC 68629), en las que el dominio
extracelular de CTLA4 está condensada a un resto de inmunoglobulina
(Ig) que hace la molécula de fusión soluble, o sus fragmentos y
derivados; proteínas con el dominio extracelular de CTLA4
condensada o unida a una parte de una proteína biológicamente activa
o químicamente activa tal como el producto génico de papilomavirus
E7 (CTLA4-E7), antígeno asociado a melanona p97
(CTLA4-p97) o proteína env de VIH
(CTLA4-env gp 120), o sus fragmentos o derivados;
proteínas de fusión híbridas (quiméricas) tal como CD28/CTLA4Ig, o
sus fragmentos y derivados; las moléculas de CTLA4 con el dominio
transmembrana eliminado para hacer la proteína soluble (Oaks, M.
K., et al., 2000 Cellular Immunology 201:144 - 153), o sus
fragmentos y derivados. "Moléculas de CTLA4 solubles" también
incluyen sus fragmentos, partes o, derivados, y moléculas mutantes
de CTLA4 solubles que tienen actividad de unión de CTLA4. Las
moléculas de CTLA4 solubles usadas en los procedimientos de la
invención pueden o no pueden incluir una secuencia de péptido de
señal (guía). Típicamente, en los procedimientos de la invención,
las moléculas no incluyen una secuencia de péptido de señal.
Como se usa en el presente documento, a
"proteína de fusión" se define como una o más secuencias de
aminoácidos unidas conjuntamente usando los procedimientos bien
conocidos en la técnica y descritos en las patentes de Estados
Unidos Números 5.434.131 o 5.637.481. Por lo tanto las secuencias de
aminoácidos unidas forman una proteína de fusión.
Como se usa en el presente documento a
"molécula mutante de CTLA4" es una molécula que puede ser CTLA4
de longitud completa o sus partes (derivados o fragmentos) que
tienen una mutación o mutaciones múltiples en CTLA4
(preferiblemente en el dominio extracelular de CTLA4) de manera que
es similar pero no idéntica a la molécula de CTLA4 de tipo salvaje.
Las moléculas mutantes de CTLA4 se unen a una molécula de B7 (por
ejemplo, o bien CD80 o CD86, o ambas). Las moléculas mutantes de
CTLA4 pueden incluir una molécula biológica o químicamente activa
no CTLA4 en ella o unida a ella. Las moléculas mutantes pueden ser
solubles (es decir, circulantes) o unidas a la superficie. Las
moléculas mutantes de CTLA4 pueden incluir el dominio extracelular
entero de CTLA4 o sus partes, por ejemplo, fragmentos o derivados.
Las moléculas mutantes de CTLA4 se pueden preparar de manera
sintética o recombinante.
Como se usa en el presente documento, el término
"mutación" es un cambio en la secuencia de nucleótidos o
aminoácidos de un polipéptido de tipo salvaje. La presente invención
proporciona una mutación o un cambio en el dominio extracelular de
CTLA4 de tipo salvaje. Los cambios en la secuencia de CTLA4 de tipo
salvaje incluyen cambios conservadores y no conservadores. El
cambio puede ser un cambio de aminoácidos que incluye
sustituciones, supresiones, adiciones, o truncamientos. Una molécula
mutante puede tener una o más mutaciones. Las mutaciones en una
secuencia de nucleótidos puede o no puede dar como resultado una
mutación en la secuencia de aminoácidos como se entiende bien en la
técnica. A este respecto ciertos codones de nucleótidos codifican
el mismo aminoácido. Los ejemplos incluyen los codones de
nucleótidos CGT, CGG, CGC, y CGA que codifican el aminoácido,
arginina (R); o codones GAT, y GAC que codifican el aminoácido,
ácido aspártico (D). De este modo, una proteína puede estar
codificada por una o más moléculas de ácido nucleico que difieren en
su secuencia de nucleótidos específica, pero todavía codifican
moléculas de proteínas que tienen secuencias idénticas. La
secuencia que codifican los aminoácidos es como sigue:
"L104EA29YIg" es una proteína de fusión que
es una molécula mutante de CTLA4 soluble que comprende un dominio
extracelular de CTLA4 de tipo salvaje que tiene cambios de
aminoácidos A29Y (un resto de aminoácido tirosina que se sustituye
por una alanina en la posición 29) y L104E (un resto de
aminoácido ácido glutámico que se sustituye por una leucina en la
posición +104), o su parte que se une a una molécula B7, unida a una
cola de Ig (se incluye en la Figura 3; el ADN que codifica
L104EA29YIg se depositó con la Colección Americana de Cultivos Tipo
el 20 de junio 2000 y asignado el número de ATCC
PTA-2104). Las moléculas solubles de L104EA29YIg
usadas en los procedimientos y/o kits de la invención pueden o no
pueden incluir una secuencia de péptido de señal (guía).
Típi-
camente, en los procedimientos y/o kits de la invención, las moléculas no incluyen una secuencia de péptido de señal.
camente, en los procedimientos y/o kits de la invención, las moléculas no incluyen una secuencia de péptido de señal.
La molécula mutante puede tener una o más
mutaciones. Como se usa en el presente documento, a "una secuencia
de proteína no CTLA4" o "molécula no CTLA4" significa
cualquier molécula de proteína que no se une a B7 y no interfiere
con la unión de CTLA4 a su diana. Un ejemplo incluye, pero no se
limita a, una región constante de inmunoglobulina (Ig) o su parte.
Preferiblemente, la regios constante de Ig es una región constante
de Ig de ser humano o de mono, por ejemplo,
C(gamma)1 humana, que incluye las regiones bisagra CH2
y CH3. la región constante de Ig se puede mutar para reducir sus
funciones efectoras (Patentes de Estados Unidos números 5.637.481.
5.844.095 y 5.434.131).
Como se usa en el presente documento, un
"fragmento" o "parte" es cualquier parte o segmento de una
molécula por ejemplo CTLA4 o CD28, preferiblemente el dominio
extracelular de CTLA4 o CD28 o su parte o segmento, que reconoce y
se une a su diana, por ejemplo, una molécula de B7.
Como se usa en el presente documento, "B7"
se refiere a la familia de B7 de moléculas que incluyen, pero no se
limitan a B7-1 (CD80) (Freeman et al, 1989, J
Immunol. 143: 2714 - 2722, incorporada en el presente documento por
referencia en su totalidad), B7-2 (CD86) (Freeman
et al, 1993, Science 262: 909 - 911 incorporada en el
presente documento por referencia en su totalidad; Azuma et
al, 1993, Nature 366:76 - 79 incorporada en el presente
documento por referencia en su totalidad) que puede reconocer y
unirse a CTLA4 y/o CD28.
Como se usa en el presente documento,
"CD28" se refiere a la molécula que reconoce y se une a B7
como se describe en los documentos de Estados Unidos Números de
serie 5.580.756 y 5.521.288 (incorporadas en el presente documento
por referencia en su totalidad).
Como se usa en el presente documento, "células
positivas de B7" son cualesquiera con uno o más tipos de
moléculas de B7 expresadas sobre la superficie celular.
Como se usa en el presente documento, un
"derivado" es una molécula que comparte similitud de secuencia
y actividad de su molécula precursora. Por ejemplo, un derivado de
CTLA4 incluye una molécula de CTLA4 soluble que tiene una secuencia
de aminoácidos al menos 70% similar al dominio extracelular de CTLA4
de tipo salvaje, y que reconoce y se une a B7 por ejemplo CTLA4Ig o
molécula mutante de CTLA4 soluble L104EA29YIg.
Como se usa en el presente documento,
"bloquear" o "inhibir" un receptor, señal o molécula que
interfiere con la activación del receptor, señal o molécula, como
se detecta por un ensayo reconocido en la técnica. Por ejemplo, el
bloqueo de una respuesta inmune mediada por célula se puede detector
mediante la determinación de de la reducción de los síntomas
asociados a enfermedades reumáticas. El bloqueo o inhibición puede
ser parcial o total.
Como se usa en el presente documento, "bloqueo
de la interacción de B7" significa que interfiere con la unión
de B7 a sus ligandos, tales como CD28 y/o CTLA4, Obstruyendo por lo
tanto las interacciones de células T y células B7 positivas. Los
ejemplos de agentes que bloquean las interacciones de B7 incluyendo,
pero sin limitación a, moléculas tal como un anticuerpo (o su parte
o derivado) que reconoce y se une a cualesquiera de las moléculas
CTLA4, CD28 o B7 (por ejemplo B7-1,
B7-2); una forma soluble (o su parte o derivado) de
las moléculas tal como CTLA4 soluble; un fragmento peptídico u otra
molécula pequeña diseñada para interferir con la señal de la célula
mediante la interacción mediada por CTLA4/CD28B7. En una
realización preferida, el agente bloqueador es una molécula de
CTLA4 soluble, tal como CTLA4Ig (ATCC 68629) o L104EA29YIg (ATCC
PTA-2104), una molécula de CD28 soluble tal como
CD28Ig (ATCC 68628), una molécula de B7 soluble tal como B7Ig (ATCC
68627), un anticuerpo monoclonal anti-B7 (por
ejemplo ATCC HB-253, ATCC CRL-2223,
ATCC CRL-2226, ATCC HB-301, ATCC
HB-11341 y anticuerpos monoclonales como describen
Anderson et al en la Patente de Estados Unidos Nº 6.113.898
o Yokochi et al., 1982. J. Immun., 128 (2): 823 - 827), un
anticuerpo monoclonal anti-CTLA4 (por ejemplo ATCC
HB-304, y anticuerpos monoclonales como se describe
en las referencias 82-83) y/o un anticuerpo
monoclonal anti-CD28 (por ejemplo ATCC HB 11944 y
mAb 9.3 como ha descrito Hansen (Hansen et al., 1980.
Immunogenetics 10: 247 - 260) o Martin (Martin et al., 1984.
J. Clin. Immun., 4(1): 18 - 22)).
Como se usa en el presente documento,
"enfermedad del sistema inmune" significa cualquier enfermedad
mediada por las interacciones de células T con células B7
positivas Que incluye, pero no se limita a, enfermedades
autoinmunes, trastornos relacionados con injertos y enfermedades
inmunoproliferativas. Los ejemplos de enfermedades del sistema
inmune incluyen enfermedad del huésped contra injerto (GVHD) (por
ejemplo, tales como las que se producen a partir de trasplante de
médula ósea, o en la inducción de tolerancia), trastornos inmunes
asociados a rechazo de trasplante de injertos, rechazo crónico, y
trasplantes de tejidos o de células homólogo o heterólogo,
incluyendo órganos sólidos, piel, islotes, músculos, hepatocitos,
neuronas. Los ejemplos de enfermedades inmunoproliferativas
incluyen, pero no se limitan a, psoriasis, linfoma de células T,
leucemia linfoblástica aguda de células T, linfoma de células T
angiocéntrico testicular, angiitis linfática benigna, lupus (por
ejemplo lupus eritematoso, lupus nefritis), tiroiditis de
Hashimoto, mixedema primario, enfermedad de Graves, anemia
perniciosa, gastritis atrófica autoinmune, enfermedad de Addison,
diabetes (por ejemplo diabetes mellitus insulina dependiente,
diabetes mellitus de tipo I, diabetes mellitus de tipo II), síndrome
de Good Pasture, miastemoa grave, pénfigo, enfermedad de Crohn,
oftalmia simpática, uveitis autoinmune, esclerosis múltiple, anemia
hemolítica autoinmune, trombocitopenia idiopática, cirrosis biliar
primaria, hepatitis de acción crónica, colitis ulcerosa, síndrome
de Sjogren, enfermedades reumáticas (por ejemplo artritis
reumatoide), polimiositis, escleroderma, y enfermedad de tejido
conectivo mixta.
Como se usa en el presente documento,
"sujeto" incluye pero no se limita a seres humanos, primates
no humanos (por ejemplo, ratón, mono), oveja, conejo, cerdo, perro,
gato, ratón, o rata.
Como se usa en el presente documento,
"trasplante de tejidos" se define como un tejido de todo, o
parte de, un órgano que se trasplanta a un sujeto receptor. En
ciertas realizaciones, el tejido es procedenet de uno o más órganos
sólidos. Los ejemplos de tejidos u órganos incluyen, pero no se
limitan a, piel, corazón, páncreas, riñón, hígado, médula ósea,
células de los islotes pancreáticos, células del tronco
pluripotentes, suspensiones celulares, y células modificaads
genéticamente. El tejido se puede eliminar de un sujeto donante, o
se puede desarrollar in vitro. El traslante puede ser un
autotrasplante, isotrasplante, alotrasplante o heterotrasplante o
su combinación.
Como se usa en el presente documento, "rechazo
de trasplante" se define como la pérdida casi completa o completa
de tejido de injerto viable del sujeto receptor.
Como se usa en el presente documento,
"encapsulación" se define como un procedimiento que aísla de
manera inmunológica células y/o grupos de células, que producen y
secretan sustancias terapéuticas, por ejemplo insulina, y al uso
médico de estas formulaciones. El procedimiento de encapsulación
implica la colocación de las células y/o grupos de células dentro
de una barrera de membrana semipermeable antes de trasplante con
el fin de evitar el rechazo por el sistema inmune. El corte del peso
molecular de la membrana de encapsulación se puede controlar
mediante el procedimiento de encapsulación de manera que excluya la
difusión hacia el interior de inmunoglobulina y factores líticos
del sistema de complemento, pero permite el paso de moléculas más
pequeñas tales como glucosa e insulina. La encapsulación permite
que las células de los islotes respondan fisiológicamente a cambios
en la glucosa en sangre pero evita el contacto con los componentes
del sistema inmune. Los procedimientos de encapsulación de células
de los islotes pancreáticos se describen en la Patente de Estados
Unidos Nº 6.080.412.
Como se usa en el presente documento,
"ligando" se refiere a una molécula que reconoce y se une de
manera específica a otra molécula, por ejemplo, un ligando para
CTLA4 es una molécula de CD80 y/o CD86.
Como se usa en el presente documento, "un
ligando soluble que reconoce y se une a antígeno de CD80 y/o CD86
"incluye los ligandos tales como CTLA4Ig, CD28Ig u otras formas
solubles de CTLA4 y CD28; CTLA4 y CD28 recombinantes; moléculas de
CTLA4 mutantes tales como L104EA29YIg; y cualquier molécula de
anticuerpo, su fragmento o proteína de unión recombinante que
reconoce y se une a antígeno CD80 y/o CD86. Estos agentes también se
consideran "agentes inmunosupresores".
Como se usa en el presente documento, "ruta
coestimuladora" se define como una ruta bioquímica que se
produce a partir de la interacción de las señales coestimuladoras
sobre las células T y las células que presentan antígeno (APCs).
Las señales coestimuladoras ayudan a determinar la magnitud de la
respuesta inmunológica a un antígeno. Una señal coestimuladora se
proporciona mediante la interacción con los receptores de las
células T CD28 y CTLA4 con las moléculas CD80 y/o CD86 sobre
APCs.
Como se usa en el presente documento, "CD80
y/o CD86" incluye B7-1 (también llamado CD80).
B7-2 (también llamado CD86), B7-3
(también llamado CD74), y the B7 family, por ejemplo, a combinación
of B7-1, B7-2, y / o
B7-3.
Como se usa en el presente documento, "bloqueo
coestimulador" se define como un protocolo de administración a
un sujeto, uno o más agentes que interfieren o bloquean una ruta
coestimuladora, como se ha descrito anteriormente. Los ejemplos de
agentes que interfieren con el bloqueo coestimulador incluyen, pero
no se limitan a, CTLA4 soluble, CTLA4 mutante, CD28 soluble,
anticuerpos monoclonales anti-B7 (mAbs), CD40
soluble, y mAbs anti-gp39. En una realización,
L104EA29YIg es un agente preferido que interfiere con el bloqueo
coestimulador.
Como se usa en el presente documento, "médula
ósea agotada de células T" se define como una médula ósea
retirada del hueso que se ha expuesto a un protocolo de células
anti-T. Un protocolo de células
anti-T se define como un procedimiento para retirar
las células T de la médula ósea. Los procedimientos de la retirada
de las células T de manera selectiva son bien conocidos en la
técnica. Un ejemplo de un protocolo de células T es la exposición
de la médula ósea a anticuerpos específicos de células T, tales como
anticuerpos monoclonales anti-CD3,
anti-CD4, anti-CD5,
anti-CD8, y anti-CD90, en la que los
anticuerpos son citotóxicos para las células T. Como alternativa,
los anticuerpos se pueden acoplar a partículas magnéticas que
permiten la retirada de las células T de la médula ósea usando
campos magnéticos. Otro ejemplo de un protocolo de células
anti-T es exponer a las células T de médula ósea a
suero anti-linfocito o globulina
anti-timocito.
Como se usa en el presente documento, "dosis
de tolerancia de médula ósea agotada de células T" se define
como una dosis inicial de médula ósea agotada de células T que se
administra a un sujeto con el propósito de inactivar las células
potenciales T reactivas al donante.
Como se usa en el presente documento, "dosis
de injerto de médula ósea agotada de células T" se define como
una dosis posterior de médula ósea agotada de células T que se
administra a un sujeto con el propósito de establecer una quimera
hematopoyética mixta. La dosis de injerto de médula ósea agotada de
células T se administrará de manera adecuada después de la dosis de
tolerancia de médula ósea agotada de células T.
Como se usa en el presente documento, "quimera
hematopoyética mixta" se define como la presencia de células
del progenitor y maduras de sangre del donante y receptor (por
ejemplo, células de derivación de sangre) en la ausencia (o
presencia no detectable) de una respuesta inmune.
Como se usa en el presente documento
"emparejamiento de donante-receptor" se definen
basándose en la tipificación molecular usando un panel de alelos
de de histocompatibilidad principal definidos anteriormente (8
clases I y 12 clases II) (Lobashevsky A, et al., Tissue
Antigens 54: 254 - 263, (1999); Knapp LA, et al., Tissue
Antigens 50:657 - 661, (1997); Watkins D.I., Crit Rev Immunol 15:1 -
29, (1995)). La disparidad maximizada de emparejamientos en ambos
loci de las clases I y II.
Como se usa en el presente documento,
"administrar" o "administración" a un sujeto incluye pero
no se limita a administración intravenosa (i.v.), administración
intraperitoneal (i.p.), administración intramuscular (i.m.),
administración subcutánea, administración oral, administración
mediante inyección, como un supositorio, o el implante de un
dispositivo de liberación lenta tal como una bomba miniosmótica al
sujeto.
Como se usa en el presente documento,
"vehículo farmacéuticamente aceptable" incluye cualquier
material que, cuando se combina con el agente reactivo, mantiene la
actividad biológica del agente reactivo, por ejemplo, especificidad
de unión y es no reactivo con el sistema inmune del sujeto. Los
ejemplos incluyen, pero no se limitan a, cualquiera de los
vehículos farmacéuticos convencionales tales como una solución
salina tamponada con fosfato, agua, emulsiones tal como emulsión de
aceite / agua, y diversos tipos de agentes humectantes. Otros
vehículos también pueden incluir soluciones estériles, comprimidos,
que incluyen comprimidos revestidos y cápsulas. Típicamente, tales
vehículos contienen excipientes tales como almidón, leche, azúcar,
ciertos tipos de arcilla, gelatina, ácido esteárico o sales, de los
mismos, estearato de magnesio, talco, grasas vegetales o aceites,
gomas, glicoles, u otros excipientes conocidos. Tales vehículos
también pueden incluir aditivos de aroma y color u otros
ingredientes. Las composiciones que comprenden tales vehículos se
formulan mediante procedimientos convencionales bien conocidos.
Como se usa en el presente documento, "agentes
inmunosupresores" se definen como una composición que tiene uno
o más tipos de moléculas que evitan la aparición de una respuesta
inmune, o debilita un sistema inmune del sujeto. Preferiblemente,
los agentes reducen o evitan la proliferación de de las células T.
Algunos agentes pueden inhibir la proliferación de las células T
mediante la inhibición de la interacción de las células T con
otras células que presentan antígeno (APCs). Un ejemplo de APCs es
células B. Los ejemplos de agentes que interfieren con las
interacciones de células T con, y por lo tanto inhiben la
proliferación de las células T, incluyen, pero no se limitan a,
ligandos para los antígenos CD80 y/o CD86, ligandos para el antígeno
CTLA4, y ligandos para el antígeno CD28. Los ejemplos de ligandos
para los antígenos CD80 y/o CD86 incluyen, pero no se limitan a,
CTLA4 soluble, mutante de CTLA4 soluble, CD28 soluble, o anticuerpos
monoclonales que reconocen y se unen a antígenos CD80 y/o CD86, o
sus fragmentos. Un agente preferido es L104EA29YIg. Los ligandos
para los antígenos CTLA4 o CD28 incluyen anticuerpos monoclonales
que reconocen y se unen a CTLA4 y/o CD28, o sus fragmentos. Otros
ligandos para CTLA4 o CD28 incluyen moléculas de CD80 y/o CD86
solubles, tal como CD80 y/o CD86Ig. Los expertos en la técnica
entenderán fácilmente que se pueden usar otros agentes o ligandos
para inhibir la interacción de CD28 con CD80 y/o CD86.
Los agentes inmunosupersores incluyen, pero no
se limitan a, metotrexato, ciclofosfamida, ciclosporina,
ciclosporina A, cloroquina, hidroxicloroquina, sulfasalazina
(sulfasalazopirina), sales de oro, D-penicilamina,
leflunomida, azatioprina, anakinra, infliximab (REMICADE ^{R}),
etanercept, bloqueadores de TNF\alpha, un agente biológico que
dirige una citoquina inflamatoria, un fármaco antiinflamatorios no
esteroide (NSAIDs). Los NSAIDs incluyen, pero no se limitan a ácido
acetil salicílico, colina magnesio salicilato, diflunisal,
salicilato de magnesio, salsalato, salicilato de sodio, diclofenac,
etodolac, fenoprofeno, flurbiprofeno, indometacina, ketoprofeno,
ketorolac, meclofenamato, naproxeno, nabumetona, fenilbutazona,
piroxicam, sulindac, tolmetin, acetaminofeno, ibuprofeno,
inhibidores de Cox-2 y tramadol.
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Las moléculas CTLA4, con las secuencias mutantes
o de tipo salvaje, se pueden hacer solubles suprimiendo el segmento
trans-membrana de CTLA4 (Oaks, M. K., et al,
2000 Cellular Immunology 201:144 - 153).
Como alternativa, las moléculas de CTLA4
solubles, con secuencias mutantes o de tipo salvaje, pueden ser
proteínas de fusión, en las que las moléculas de CTLA4 están
condensadas a restos no CTLA4 tales como moléculas de
inmunoglobulina-(Ig) que hacen que las moléculas de CTLA4 sean
solubles. Por ejemplo, una proteína de fusión CTLA4 puede incluir
el dominio extracelular de CTLA4 condensado a un dominio constante
de inmunoglobulina, que da como resultado la molécula de CTLA4Ig
(Figura 2) (Linsley, P. S., et al., 1994 Immunity 1: 793 -
80).
Para los protocolos clínicos, se prefiere que el
resto de inmunoglobulina no induce una respuesta inmune perjudicial
en un sujeto. El resto preferido es la región constante de
inmunoglobulina, que incluye las regiones constantes de
inmunoglobulina de ser humano y de mono. Un ejemplo de la región de
inmunoglobulina adecuada es Cyl humana, que incluye las regiones
bisagra CH2 y CH3 que pueden mediar las funciones efectoras tales
como la unión a receptores de Fc, que median la citotoxicidad
dependiente del complemento (CDC), o median en la citotoxicidad
mediada por las células dependiente de anticuerpos (ADCC). El resto
de inmunoglobulina puede tener una o más mutaciones en ella (por
ejemplo, en el dominio CH2, para reducir las funciones efectoras
tales como CDC o ADCC) donde la mutación modula la capacidad de la
inmunoglobulina a su ligando, mediante el aumento o disminución de
de la capacidad de unión de la inmunoglobulina a los receptores de
Fc. Por ejemplo, las mutaciones en el resto de inmunoglobulina
puede incluir cambios en cualquiera o todos sus restos de cisteína
dentro del dominio bisagra, por ejemplo, las cisteínas en las
posiciones +130, +136, y +139 están sustituidas con serina (Figura
24). El resto de inmunoglobulina también puede incluir la prolina en
la posición +148 sustituida con una serina, como se muestra en la
Figura 24. Además, las mutaciones en el resto de inmunoglobulina
puede incluir que tenga la leucina en la posición +144 sustituida
con fenilalanina, leucina en la posición +145 sustituida con ácido
glutámico, o glicina en la posición +147 sustituida con
alanina.
Los restos adicionales no-CTLA4
para uso en las moléculas de CTLA4 solubles o moléculas mutantes de
CTLA4 solubles incluyen, pero no se limitan a, molécula de p97,
molécula de env gp 120, molécula E7, y molécula ova (Dash, B. et
al. 1994 J. Gen. Virol. 75 (Pt 6):1389 - 97; Ikeda, T., et
al. 1994 Gene
138(1-2):193-6; Falk, K.,
et al. 1993 Cell. Immunol. 150(2): 447 - 52; Fujisaka,
K. et al. 1994 Virology 204 (2): 789-93).
También son posibles otras moléculas (Gerard, C. et al. 1994
Neuroscience 62(3):721; Byrn, R et al. 1989
63(10):4370; Smith, D. et al. 1987 Science 238:1704;
Lasky, L. 1996 Science 233:209).
La presente invención proporciona moléculas de
CTLA4 solubles que incluyen una secuencia de péptido de señal unida
al extremo N-terminal del dominio extracelular de la
parte de CTLA4 de la molécula. El péptido de señal puede ser
cualquier secuencia que permitirá la secreción de la molécula
mutante, que incluye el péptido de señal de la oncostatina M
(Malik, et al., 1989 Molec. Cell. Biol. 9: 2847 - 2853), o
CD5 (Jones, N. H. et al., 1986 Nature 323: 346 - 349), o el
péptido de señal de cualquier de cualquier proteína extracelular. La
molécula de CTLA4 soluble de la invención puede incluir el péptido
de señal de oncostatina M unido al extremo
N-terminal del dominio extracelular de CTLA4, y la
molécula de inmunoglobulina humana (por ejemplo, bisagra, CH2 y
CH3) unida al extremo C-terminal del dominio
extracelular (tipo salvaje o mutado) de CTLA4. Esta molécula
incluye el péptido de señal de oncostatina M que abarca una
secuencia de aminoácidos que tiene metionina en la posición -26
hasta de alanina en la posición -1, la parte de CTLA4 que abarca
una secuencia de aminoácidos que tiene metionina en la posición +1
hasta ácido aspártico en la posición +124, una unión del resto de
aminoácido glutamina en la posición +125, y la parte de
inmunoglobulina que abarca una secuencia de aminoácidos que tiene
ácido glutámico en la posición +126 hasta lisina en la posición
+357.
En una realización, las moléculas mutantes de
CTLA4 solubles de la invención, que comprenden las secuencias de
CTLA4 mutadas descritas más abajo más abajo, son moléculas de
fusión que comprenden restos de IgC(gamma)1 humana
(es decir, IgCyl) condensados a los fragmentos de CTLA4. Las
moléculas mutantes de CTLA4 solubles pueden comprender una o más
mutaciones (por ejemplo, sustituciones, supresiones o inserciones de
aminoácidos,) en el dominio extracelular de CTLA4.
Por ejemplo, las moléculas mutantes de CTLA4
solubles pueden incluir una mutación o mutaciones dentro o en
estrecha proximidad a la región abarcada por la serina en la
posición +25 hasta arginina en la posición +33 (por ejemplo,
S25-R33, que usa los símbolos de aminoácidos de una
letra convencionales). Las moléculas de CTLA4 mutantes pueden
incluir una sustitución de aminoácidos en cualquiera de las
posiciones: S25, P26, G27, K28, A29, T30, E31, o R33.
En otra realización, las moléculas mutantes de
CTLA4 solubles pueden incluir una mutación o mutaciones dentro o en
estrecha proximidad a la región abarcada por ácido glutámico en la
posición +95 a glicina en la posición +107 (por ejemplo,
E95-G107) Las moléculas de CTLA4 mutantes pueden
incluir una sustitución de aminoácidos en una o más de las
siguientes posiciones: K93, L96, M97, Y98, P99, P100, P101, Y102,
Y103, L104, G105, I106, y
G107.
G107.
Adicionalmente, la invención proporciona
moléculas mutantes de CTLA4 solubles que tienen una mutación o
mutaciones dentro o en estrecha proximidad a la región abarcada por
asparagina +108 a isoleucina en la posición +115 (por ejemplo,
N108-I115). La molécula mutante de CTLA4 puede
incluir una sustitución de aminoácidos en cualquiera o más de las
posiciones: L104, G105, I106, G107, Q111, Y113, o I115.
En una realización, las moléculas mutantes de
CTLA4 solubles comprenden IgC\gamma1 condensada a un fragmento de
CTLA4 que comprende una mutación en un solo sitio en el dominio
extracelular. El dominio extracelular de CTLA4 comprende metionina
en la posición +1 hasta ácido aspártico en la posición +124 (por
ejemplo, Figura 1). La parte extracelular de la CTLA4 puede
comprender alanina en la posición -1 hasta ácido aspártico en la
posición +124 (por ejemplo, Figura 1).
Los ejemplos de mutaciones de un solo sitio
incluyen los siguientes en los que leucina en la posición +104 se
cambia a por cualquier otro aminoácido:
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\vskip1.000000\baselineskip
Además, la invención proporciona moléculas
mutantes que tienen el dominio extracelular de CTLA4 con dos
mutaciones, condensado a un resto Ig C\gamma1. Los ejemplos
incluyen los siguientes en los que leucina en la posición +104 está
cambiada por otro aminoácido (por ejemplo ácido glutámico) y la
glicina en la posición +105, la serina en la posición +25, la
treonina en la posición +30 o la alanina en la posición +29 se
cambia por cualquier otro aminoácido:
Además todavía, la invención proporciona
moléculas mutantes que tienen el dominio extracelular de CTLA4 que
comprenden tres mutaciones, condensadas a un resto Ig C\gamma1.
Los ejemplos incluyen los siguientes en los que la leucina en la
posición +104 está cambiada por otro aminoácido (por ejemplo ácido
glutámico), la alanina en la posición +29 está cambiada por otro
aminoácido (por ejemplo tirosina) y la serina en la posición +25
está cambiada por otro aminoácido:
\vskip1.000000\baselineskip
Las moléculas mutantes de CTLA4 solubles pueden
tener un resto de aminoácido de unión que se localiza entre la
parte de CTLA4 y la parte Ig de la molécula. El aminoácido de unión
puede ser cualquier aminoácido, incluyendo glutamina. El aminoácido
de unión se puede introducir mediante procedimientos de síntesis
moleculares o químicos conocidos en la técnica.
La invención proporciona moléculas mutantes de
CTLA4 solubles que comprenden una mutación de un solo sitio en el
dominio extracelular de CTLA4 tal como L104EIg (como se incluye en
la Figura 19) o L104SIg, en los que L104EIg y L104SIg están mutados
en sus secuencias de CTLA4 de manera que la leucina en la posición
+104 está sustituida con ácido glutámico o serina, respectivamente.
Las moléculas de mutación de un solo sitio además incluyen partes
de CTLA4 que abarcan metionina en la posición +1 hasta ácido
aspártico en la posición +124, un resto de aminoácido de unión de
glutamina en la posición +125, y una parte de inmunoglobulina que
abarca ácido glutámico en la posición +126 hasta lisina en la
posición +357. La parte de inmunoglobulina de la molécula mutante
también puede estar mutada de manera que las cisteínas en las
posiciones +130, +136, y +139 están sustituidas con serina, y la
prolina en la posición +148 está sustituida con serina. Como
alternativa, molécula mutante de CTLA4 soluble de un solo sitio
puede tener una parte de CTLA4 que abarca alanina en la posición
-1 hasta ácido aspártico en la posición +124.
La invención proporciona moléculas mutantes de
CTLA4 solubles que comprenden mutación de un doble sitio en el
dominio extracelular de CTLA4, tales como L104EA29YIg, L104EA29LIg,
L104EA29TIg o L104EA29WIg, en los que leucina en la posición +104
está sustituida con a ácido glutámico y alanina en la posición +29
está cambiaba a tirosina, leucina, treonina y triptófano,
respectivamente. Las secuencias para L104EA29YIg, L104EA29LIg,
L104EA29TIg y L104EA29WIg, que comienza en metionina en la posición
+1 y que termina con lisina en la posición +357, más una secuencia
de péptido de señal (guía) se incluyen en las secuencias como se
muestra en las Figuras 3 y 20-22 respectivamente.
Las moléculas mutantes de doble sitio además comprenden partes de
CTLA4 que abarcan metionina en la posición +1 hasta ácido aspártico
en la posición +124, un resto de aminoácido de unión glutamina en
la posición +125, y una parte de inmunoglobulina que abarca ácido
glutámico en la posición +126 hasta lisina en la posición +357. La
parte de inmunoglobulina de la molécula mutante también puede estar
mutada, de manera que las cisteínas en las posiciones +130, +136, y
+139 están sustituidas con serina, y la prolina en la posición +148
está sustituida con serina. Como alternativa, estas moléculas
mutantes pueden tener una parte de CTLA4 que abarca alanina en la
posición -1 hasta ácido aspártico en la posición +124.
La invención proporciona moléculas mutantes de
CTLA4 solubles que comprenden una mutación de doble sitio en el
dominio extracelular de CTLA4, tales como L104EG10SFIg, L104EG105WIg
y L104EG105LIg, en los que leucina en la posición +104 está
sustituida con a ácido glutámico y glicina en la posición +105 está
sustituida con fenilalanina, triptófano y leucina, respectivamente.
Las moléculas mutantes de doble sitio además comprenden partes de
CTLA4 que abarcan metionina en la posición +1 hasta ácido aspártico
en la posición +124, un resto de aminoácido de unión glutamina en
la posición +125, y una parte de inmunoglobulina que abarca ácido
glutámico en la posición +126 hasta lisina en la posición +357. La
parte de inmunoglobulina también puede estar mutada, de manera que
las cisteínas en las posiciones +130, +136, y +139 están sustituidas
con serina, y la prolina en la posición +148 está sustituida con
serina. Como alternativa, estas moléculas mutantes pueden tener una
parte de CTLA4 que abarca alanina en la posición -1 hasta ácido
aspártico en la posición +124.
La invención proporciona L104ES25RIg que es una
molécula mutante de doble sitio que incluye una parte de CTLA4 que
abarca metionina en la posición +1 hasta ácido aspártico en la
posición +124, un resto de aminoácido de unión glutamina en la
posición +125, y la parte de inmunoglobulina que abarca ácido
glutámico en la posición +126 hasta lisina en la posición +357. La
parte que tiene el dominio extracelular de CTLA4 está mutada de
manera que la serina en la posición +25 está sustituida con
arginina, y leucina en la posición +104 está sustituida con ácido
glutámico. Como alternativa, L104ES25RIg puede tener una parte de
CTLA4 que abarca alanina en la posición -1 hasta ácido aspártico
en la posición +124.
La invención proporciona moléculas mutantes de
CTLA4 solubles que comprenden una mutación de doble sitio en el
dominio extracelular de CTLA4, tales como L104ET30GIg y L104ET30NIg,
en los que leucina en la posición +104 está sustituida con a ácido
glutámico y treonina en la posición +30 está sustituida con glicina
y asparagina, respectivamente. Las moléculas mutantes de doble
sitio además comprenden partes de CTLA4 que abarcan metionina en la
posición +1 hasta ácido aspártico en la posición +124, un resto de
aminoácido de unión glutamina en la posición +125, y una parte de
inmunoglobulina que abarca ácido glutámico en la posición +126 hasta
lisina en la posición +357. La parte de inmunoglobulina de la
molécula mutante también puede estar mutada, de manera que las
cisteínas en las posiciones +130, +136, y +139 están sustituidas con
serina, y la prolina en la posición +148 está sustituida con
serina. Como alternativa, estás moléculas mutantes pueden tener una
parte de CTLA4 que abarca alanina en la posición -1 hasta ácido
aspártico en la posición +124.
La invención proporciona moléculas mutantes de
CTLA4 solubles que comprenden una mutación de triple sitio en el
dominio extracelular de CTLA4, tales como L104EA29YS25KIg,
L104EA29YS25NIg, L104EA29YS25RIg, en los que leucina en la posición
+104 está sustituida con a ácido glutámico, alanina en la posición
+29 está cambiada a tirosina y serina en la posición +25 está
cambiada a lisina, asparagina y arginina, respectivamente. Las
moléculas mutantes de triple sitio además comprenden partes de CTLA4
que abarcan metionina en la posición +1 hasta ácido aspártico en la
posición +124, un resto de aminoácido de unión glutamina en la
posición +125, y una parte de inmunoglobulina que abarca ácido
glutámico en la posición +126 hasta lisina en la posición +357. La
parte de inmunoglobulina de la molécula mutante también puede estar
mutada, de manera que las cisteínas en las posiciones +130, +136, y
+139 están sustituidas con serina, y la prolina en la posición +148
está sustituida con serina. Como alternativa, estas moléculas
mutantes pueden tener una parte de CTLA4 que abarcan alanina en la
posición -1 hasta ácido aspártico en la posición +124.
Realizaciones adicionales de moléculas mutantes
de CTLA4 solubles incluyen moléculas mutantes homólogas de
CTLA4/CD28 que se unen a una B7 (Peach, R. J., et al., 1994 J
Exp Med 180: 2049 - 2058). Los ejemplos de estas moléculas mutantes
quiméricas de CTLA4/CD28 incluyen HS1, HS2, HS3, HS4, HS5, HS6,
HS4A, HS4B, HS7, HS8, HS9, HS10, HS11, HS 12, HS13 y HS14 (Patente
de Estados Unidos Nº 5.773.253).
Las realizaciones preferidas de la invención son
moléculas solubles de CTLA4 tal como CTLA4Ig (como se muestra en la
Figura 2, que comienza en metionina en la posición +1 y que termina
en lisina en la posición +357) y L104EA29YIg mutante soluble de
CTLA4 (como se muestra en la Figura 3, que comienza en metionina en
la posición +1 y que termina en lisina en la posición +357).
La invención además proporciona moléculas de
ácido nucleico que comprenden secuencias de nucleótidos que
codifican las secuencias de aminoácidos que corresponden a las
moléculas solubles de CTLA4 de la invención. En una realización, la
molécula de ácido nucleico es un ADN (por ejemplo, ADNc) o su
híbrido. El ADN que codifica CTLA4Ig (Figura 2) se depositó el 31
de mayo de 1991 con la Colección Americana de Cultivos Tipo (ATCC),
10801 University Blvd., Manassas, VA 20110-2209 y
se ha acordó con el número de acceso de ATCC ATCC 68629. El ADN que
codifica L104EA29YIg (seceuncia incluida en la Figura 3) se
depositó el 19 de junio de 2000 con la ATCC y se ha acordado el
número de acceso de ATCC PTA-2104. Como alternativa,
las moléculas de ácido nucleico son ARN o uno de sus híbridos.
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La presente invención proporciona moléculas
mutantes de CTLA4 solubles que comprenden al menos el dominio
extracelular de CTLA4 o sus partes que se unen a CD80 y/o CD86. La
parte extracelular de CTLA4 comprende metionina en la posición +1
hasta ácido aspártico en la posición +124 (por ejemplo, Figura 1).
La parte extracelular de CTLA4 puede comprender alanina en la
posición -1 hasta ácido aspártico en la posición +124 (por ejemplo,
Figura 1). La parte extracelular de CTLA4 puede comprender ácido
glutámico en la posición +95 hasta cisteína en la posición +120. La
parte extracelular de la CTLA4 puede comprender metionina en la
posición +1 hasta cisteína en la posición +21 y ácido glutámico en
la posición +95 hasta ácido aspártico en la posición +122. La parte
extracelular de la CTLA4 puede comprender metionina en la posición
+1 hasta tirosina en la posición +23 y valina en la posición +32
hasta ácido aspártico en la posición +122. La parte extracelular de
la CTLA4 puede comprender alanina en la posición +24 hasta ácido
glutámico en la posición +31 y ácido glutámico en la posición +95
hasta ácido aspártico en la posición +122. La parte extracelular de
la CTLA4 puede comprender alanina en la posición +24 hasta ácido
glutámico en la posición +31 y ácido glutámico en la posición +95
hasta isoleucina en la posición +112. La parte extracelular de la
CTLA4 puede comprender alanina en la posición +24 hasta ácido
glutámico en la posición +31 y tirosina en la posición +113 hasta
ácido aspártico en la posición +122. La parte extracelular de la
CTLA4 puede comprender alanina en la posición +50 hasta ácido
glutámico en la posición +57 y ácido glutámico en la posición +95
hasta ácido aspártico en la posición +122. La parte extracelular de
la CTLA4 puede comprender alanina en la posición +24 hasta ácido
glutámico en la posición +31; alanina en la posición +50 hasta
ácido glutámico en la posición +57; y ácido glutámico en la posición
+95 hasta ácido aspártico en la posición +122. La parte
extracelular de la CTLA4 puede comprender alanina en la posición
+50 hasta ácido glutámico en la posición +57 y ácido glutámico en la
posición +95 hasta isoleucina en la posición +112. La parte
extracelular de la CTLA4 puede comprender alanina en la posición
+24 hasta ácido glutámico en la posición +31; alanina en la
posición +50 hasta ácido glutámico en la posición +57; y ácido
glutámico en la posición +95 hasta ácido aspártico en la posición
+122. La parte extracelular de CTLA4 puede comprender alanina en la
posición +24 hasta valina en la posición +94. La parte extracelular
de CTLA4 puede comprender alanina en la posición -1 hasta cisteína
en la posición +21. La parte extracelular de CTLA4 puede comprender
metionina en la posición +1 hasta cisteína en la posición +21. La
parte extracelular de CTLA4 puede comprender ácido glutámico en la
posición +95 hasta ácido aspártico en la posición +122. La parte
extracelular de CTLA4 puede comprender alanina en la posición -1
hasta valina en la posición +94. La parte extracelular de CTLA4
puede comprender metionina en la posición +1 hasta valina en la
posición +94. La parte extracelular de CTLA4 puede comprender
alanina en la posición +24 hasta ácido glutámico en la posición
+31. La parte extracelular de CTLA4 puede comprender alanina en la
posición -1 hasta tirosina en la posición +23. La parte extracelular
de CTLA4 puede comprender metionina en la posición +1 hasta
tirosina en la posición +23. La parte extracelular de CTLA4 puede
comprender valina en la posición +32 hasta ácido aspártico en la
posición +122. La parte extracelular de CTLA4 puede comprender
tirosina en la posición +113 hasta ácido aspártico en la posición
+122. La parte extracelular de CTLA4 puede comprender ácido
glutámico en la posición +95 hasta isoleucina en la posición +112.
La parte extracelular de CTLA4 puede comprender alanina en la
posición +50 hasta ácido glutámico en la posición +57.
\vskip1.000000\baselineskip
La expresión de las moléculas mutantes de CTLA4
puede estar en las células procarióticas. Los procariotas lo más
frecuentemente están representados por diversas cepas de bacterias.
Las bacterias pueden ser gran positivas o gran negativas. También
se pueden usar otras cepas microbianas.
Las secuencias de nucleótidos de moléculas
mutantes de CTLA4 se pueden insertar en un vector diseñado para
expresar secuencias foráneas en las células procarióticas tal como
E. coli. Estos vectores pueden incluir secuencias de control
procarióticas usadas de manera común que se definen en el presente
documento para que incluyan promotores para el inicio de la
trascripción, opcionalmente con un operador, junto con secuencias
de sitio de unión de ribomas, incluyen tales promotores usados de
manera común como los sistemas promotores de
beta-lactamasa (penicilinasa) y lactosa (lac)
(Chang, et al., (1977) Nature 198:1056), el sistema promotor
de triptófano (trp) (Goeddel, et al., (1980) Nucleic Acids
Res. 8: 4057) y el promotor P_{L} derivado de lambda y el sitio
unión de ribosoma del gen N (Shimatake, et al., (1981) Nature
292: 128).
Tales vectores de inclusión también incluirán
orígenes de replicación y marcadores seleccionables, tal como un
gen de beta-lactamasa o de neomicina
fosfotransferasa que confiere resistencia a antibióticos, de manera
que los vectores se pueden replicar en bacterias y células que
llevan los plásmidos se pueden seleccionar cuando se desarrollan en
la presencia de antibióticos, tales como ampicilina o
kanamicina.
\newpage
El plásmido de expersión se puede introducir en
células procarióticas mediante una diversidad de procedimientos
convencionales, que incluyen pero no se limitan a cloque de
CaCl_{2} (Cohen, (1972) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 69: 2110, y
Sambrook et al. (eds.), "Molecular Cloning: A Laboratory
Manual", 2ª Edición, Cold Spring Harbor Press, (1989)) y
electroporación.
De acuerdo con la práctica de la invención, las
células eucarióticas son también son también células huésped
adecuadas. Los ejemplos de células eucarióticas incluyen cualquier
célula animal, ya sea primaria o levadura inmortalizada (por
ejemplo, Saccharomyces cerevisiae, Schizosaccharomyces pombe
y Pichia pastoris), y células vegetales. Las células de
mieloma, COS y CHO son ejemplos de células animales que se pueden
usar como huéspedes. Las células de CHO particulares incluyen, pero
no se limitan a, DG44 (Chasin, et al., 1986 Som. Cell. Molec.
Genet. 12: 555 - 556; Kolkekar 1997 Biochemistry 36: 10901 -
10909), CHO-K1 (ATCC No. CCL-61),
CHO-K1 Tet-Una línea celular
(Clontech), CHO designada ECACC 85050302 (CAMR, Salisbury,
Wiltshire, UK), CHO clon 13 (GEIMG, Genova, IT), CHO clon B (GEIMG,
Genova, IT), CHO-K1/SF designada ECACC 93061607
(CAMR, Salisbury, Wiltshire, UK), y RR-CHOK1
designada ECACC 92052129 (CAMR, Salisbury, Wiltshire, UK). Las
células ejemplares vegetales incluyen células de tabaco (plantas
enteras, cultivo de células, o callo), maíz, soja, y arroz. Semillas
de maíz, soja, y arroz son también aceptables.
Las secuencias de nucleótidos que codifican las
moléculas mutantes de CTLA4 también se pueden insertar en un vector
diseñado para expresar secuencias foráneas en un huésped
eucariótico. Los elementos reguladores del vector pueden variar de
acuerdo con el huésped eucariótico particular. La molécula de ácido
nucleico que codifica L104EA29YIg está contenida en pD16
L104EA29YIg y se depositó el 19 de junio de 2000 con la Colección
Americana de Cultivos Tipo (ATCC), 10801 University Blvd., Manasas,
VA 20110-2209 (ATCC No. PTA-2104).
El vector pD16 L104EA29YIg es un derivado del vector pcDNA3
(INVITROGEN).
Las secuencias de control eucarióticas usadas de
manera común para uso en los vectores de expresión incluyen
promotores y secuencias de control compatibles con las células de
mamífero tales como, por ejemplo, promotor de CMV (vector CDM8) y
virus de sarcoma aviar (ASV) (vector \piLN). Otros promotores
usados de manera común incluyen los promotores tempranos tardíos
del Virus 40 de Simios (SV40) (Fiers, et al., (1973) Nature
273: 113), o u otros promotores virales tales como los derivados de
polioma, Adenovirus 2, y virus de papiloma bovino. También se puede
usar un promotor inducible, tal como hMII (Karin, et al.,
(1982) Nature 299: 797 - 802).
Los vectores para expresar moléculas mutantes de
CTLA4 en eucariotos también pueden llevar secuencias llamadas
regiones potenciadoras. Éstas son importantes en la optimización de
la expresión génica y se encuentran o bien cadena arriba o cadena
debajo de la región promotora.
Los ejemplos de expresión para las células
huésped eucarióticas incluyen, pero no se limitan a, vectores para
células huésped de mamíferos (por ejemplo, BPV-1,
pHyg, pRSV, pSV2, pTK2 (Maniatis); pIRES (Clontech); pRc/CMV2,
pRc/RSV, pSFV1 (Life Technologies); vectores pVPakc, vectores pCMV,
vectores pSG5 (Stratagene)), vectores retrovirales (por ejemplo,
vectores pFB (Stratagene)), pCDNA-3 (Invitrogen) o
sus formas modificadas, vectores adenovirales; vectores de virus
asociados a Adeno, vectores baculovirus, vectores de levaduras (por
ejemplo, vectores pESC (Stratagene)).
Las secuencias de nucleótidos que codifican
moléculas mutantes de CTLA4 se pueden integrar en el genoma de la
célula huésped eucariótica y replicarse a medida que se replica el
genoma huésped. Como alternativa, el vector que lleva moléculas
mutantes de CTLA4 pueden contener los orígenes de replicación que
permite la replicación extracromosómica.
Para la expresión de las secuencias en
Saccharomyces cerevisiae, el origen de de replicación del
plásmido, se puede usar el círculo de 2\mu. (Broach, (1983) Meth.
Enz. 101: 307). Como alternativa, se pueden usar las secuencias del
genoma de levadura capaz de promover la replicación autónoma
(véase, por ejemplo, Stinchcomb et al., (1979) Nature 282:
39); Tschemper et al., (1980) Gene 10: 157; y Clarke et
al., (1983) Meth. Enz. 101: 300).
Las secuencias de transcripción de la
transcripción para los vectores de levaduras incluyen promotores
para la síntesis de enzimas glicolíticas (Hess et al.,
(1968) J. Adv. Enzyme Reg. 7: 149; Holland et al., (1978)
Biochemistry 17: 4900). Los promotores adicionales conocidos en la
técnica incluyen el promotor de CMV proporcionado en el vector CDM8
(Toyama y Okayama, (1990) FEBS 268: 217 - 221); el promotor para la
3-fosfoglicerato quinasa (Hitzeman et al.,
(1980) J. Biol. Chem. 255: 2073), y aquellos para otras enzimas
glicolíticas.
Otros promotores son inducibles debido a que se
pueden regular mediante estímulos ambientales o el medio de
crecimiento de las células. Estos promotores inducibles incluyen los
de los genes para las proteínas de choque térmico, alcohol
deshidrogenasa 2, isocitocromo C, fosfatasa ácida, enzimas asociadas
a nitrógeno, y enzimas responsables para la utilización de maltosa
y galactosa.
También se pueden colocar secuencias reguladoras
en el extremo 3' de las secuencias de codificación. Estas
secuencias pueden actuar para estabilizar el ARN mensajero. Tales
terminadores se encuentran en la región no traducida de 3' después
de las secuencias de notificación en varios genes derivados de
levaduras y de mamíferos.
Los vectores ejemplares para las plantas y
células de plantas incluyen, pero no se limitan a, plásmidos de
Agrobacterium T_{i}, virus del mosaico de coliflor (CaMV), y virus
del mosaico amarillo del tomate (TGMV).
Los aspectos generales de transformaciones del
sistema de huésped de células de mamíferos se han descrito por Axel
(Patente de Estados Unidos Nº 4.399.216 emitida el 16 de agosto de
1983). Las céluals de mamíferos se pueden transformar mediante
procedimientos que incluyen pero no se limitan a, transfección en
la presencia de fosfato de calcio, microinyección, electroporación,
o mediante transducción con vectores virales. Los procedimientos
para introducir secuencias de ADN foráneo en genomas de plantas y
levaduras incluyen (1) procedimientos mecánicos, tales como
microinyección de ADN en células individuales o protoplastos,
células agitadas en un aparato Vóretx con perlas de vidrio en
presencia de ADN, o disparo de esferas de tungsteno u oro revestidas
de ADN en células o protoplastos; (2) introducción de ADN
preparando membranas celulares permeables a macromoléculas
mediante tratamiento de polietilen glicol o someter a altos pulsos
eléctricos de tensión (electroporación); o (3) el uso de liposomas
(que contienen ADNc) que se funden a los membranas celulares.
La expresión de las moléculas mutantes de CTLA4
se pueden detector mediante tinción de geles
SDS-PAGE de tinción de Coomassie y
inmunotransferencia que usa anticuerpos que se unen a CTLA4. La
recuperación de proteínas se puede realizar usando medios de
purificación de proteínas convencionales, por ejemplo, cromatografía
de afinidad o cromatografía de intercambio iónico, para producir
producto sustancialmente puro (R. Scopes en: "Protein
Purification, Principles y Practice", tercera Edición,
Springer-Verlag (1994)).
La invención además proporciona moléculas de
proteínas mutantes de CTLA4 solubles producidas por los
procedimientos en el presente documento.
En una realización, la mutagénesis dirigida al
sitio y el procedimiento de selección novedosos se usaron para
identificar varias mutaciones en el dominio extracelular de CTLA4
que mejoran la actividad de unión para CD86. En esta realización,
se llevaron a cabo mutaciones en los residuos en las regiones del el
dominio extracelular de CTLA4 desde serina 25 hasta arginina 33, la
hebra de C' (alanina 49 y treonina 51), la hebra F (lisina 93,
ácido glutámico 95 y leucina 96), y en la región desde metionina 97
hasta tirosina 102, tirosina 103 hasta glicina 107 y en la hebra G
en las posiciones glutamina 111, tirosina 113 e isoleucina 115.
Estos sitios se eligieron basándose en los estudios de proteínas de
fusión de CD28/CTLA4 quiméricas (Peach et al., J. Exp. Med.,
1994, 180: 2049 - 2058), y en un modelo de predicción de qué cadenas
de laterales de restos de aminoácidos se expondrían de manera
solvente, y una carencia de identidad u homología de restos de
aminoácidos en ciertas posiciones entre CD28 y CTLA4. También,
cualquier resto que está espacialmente en proximidad cercana (5 a
20 Unidades Angstrom) a los restos identificados se considera parte
de la presente invención.
Para sintetizar y seleccionar moléculas mutantes
de CTLA4 solubles con afinidades alteradas para CD80 y / o CD86, se
adoptó una estrategia de dos etapas. Los experimentos ocasionaron
primero generación una genoteca de mutaciones en un codón
específico de una parte extracelular de CTLA4 y después
seleccionando estos de BIAcore para identificar mutantes con
reactividad alterada a CD80 o CD86. El sistema de ensayo de Biacore
(Farmacia, Piscataway, N.J.) usa un sistema detector de resonancia
de plasmón superficial que esencialmente implica la unión covalente
de o bien CD80Ig o CD86Ig a un procesador sensor revestido de
dextrano que se localiza en un detector. La molécula de ensayo se
puede después inyectar en la cámara que contiene el procesador
sensor y la cantidad de proteína complementaria que se une se puede
determinar basándose en el cambio en la masa molecular que está
físicamente asociada físicamente al lado revestido de dextrano del
procesador sensor, el cambio de masa< molecular se puede medir
mediante el sistema detector.
La invención incluye composiciones farmacéuticas
para uso en el tratamiento de enfermedades del sistema inmune que
comprende cantidades farmacéuticamente eficaces de moléculas
mutantes de CTLA4 solubles. En ciertas realizaciones, las
enfermedades del sistema inmune están mediadas por interacciones de
las células CD28- y/o CTLA4-positivas con células
CD80 y/o CD86 positivas. Las moléculas de CTLA4 solubles son
preferiblemente moléculas de CTLA4 solubles con secuencia de tipo
salvaje y/o moléculas de CTLA4 solubles que tienen una o más
mutaciones en el dominio extracelular de CTLA4. La composición
farmacéutica puede incluir moléculas de proteínas de CTLA4 o CTLA4
mutantes y / moléculas de ácidos nucleicos, y/o vectores que
codifican las moléculas. En una realización preferida, la molécula
mutante de CTLA4 soluble tiene la secuencia de aminoácidos del
dominio extracelular de CTLA4 como se muestra en cualquiera de las
Figuras 3 (L104EA29Y). Incluso más preferiblemente, la molécula
mutante de CTLA4 soluble es L104EA29YIg como se describe en el
presente documento y se muestra en la Figura 3. Las composiciones
pueden de manera adicional incluir otros agentes terapéuticos, que
incluyen, pero no se limitan a, agentes inmunosupresores, NSAIDs,
corticosteroides, glucococoticoides, fármacos, toxinas, enzimas,
anticuerpos, o conjugados.
Una realización de la composición farmacéutica
comprende una cantidad eficaz de una molécula de CTLA4 soluble sola
o en combinación con una cantidad eficaz de al menos otro agente
terapéutico, incluyendo un agente inmunosupresor, o NSAID.
Las cantidades eficaces de CTLA4 soluble en la
composición farmacéutica puede variar entre aproximadamente 0,1 y
100 mg/kg por peso del sujeto. En otra realización, la cantidad
eficaz puede ser una cantidad entre aproximadamente 0,5 y 5 mg/kg
por peso de un sujeto, aproximadamente entre 5 y 10 mg/kg por peso
de un sujeto, aproximadamente entre 10 y 15 mg/kg por peso de un
sujeto, aproximadamente entre 15 y 20 mg/kg por peso de un sujeto,
aproximadamente entre 20 y 25 mg/kg por peso de un sujeto,
aproximadamente entre 25 y 30 mg/kg por peso de un sujeto,
aproximadamente entre 30 y 35 mg/kg por peso de un sujeto,
aproximadamente entre 35 y 40 mg/kg por peso de un sujeto,
aproximadamente entre 40 y 45 mg/kg de un sujeto, aproximadamente
entre 45 y 50 mg/kg por peso de un sujeto, aproximadamente entre 50
y 55 mg/kg por peso de un sujeto, aproximadamente entre 55 y 60
mg/kg por peso de un sujeto, aproximadamente entre 60 y 65 mg/kg por
peso de un sujeto, aproximadamente entre 65 y 70 mg/kg por peso de
un sujeto, aproximadamente entre 70 y 75 mg/kg por peso de un
sujeto, aproximadamente entre 75 y 80 mg/kg por peso de un sujeto,
aproximadamente entre 80 y 85 mg/kg por peso de un sujeto,
aproximadamente entre 85 y 90 mg/kg por peso de un sujeto,
aproximadamente entre 90 y 95 mg/kg por peso de un sujeto, o
aproximadamente entre 95 y 100 mg/kg por peso de un sujeto. En una
realización, la cantidad eficaz es 2 mg/kg por peso de un sujeto.
En otra realización, la cantidad eficaz es 10 mg/kg por peso de un
sujeto. En una realización, la cantidad eficaz de una molécula de
CTLA4 soluble es 2 mg/kg por peso de un sujeto. En una realización,
la cantidad eficaz de una molécula de CTLA4 soluble es 10 mg/kg por
peso de un sujeto.
La cantidad de un agente inmunosupresor
administrado a un sujeto varía dependiendo de varios factores
incluyendo la eficacia del fármaco sobre un sujeto específico y la
toxicidad (es decir, la tolerancia) de un fármaco a un sujeto.
El metotrexato se administra de manera común en
una cantidad entre aproximadamente 0,1 y 40 mg por semana con una
dosificación común que varía entre aproximadamente 5 y 30 mg por
semana. El metotrexato se puede administrar a un sujeto en diversos
incrementos: aproximadamente entre 0,1 y 5 mg/semana,
aproximadamente entre 5 y 10 mg/semana, aproximadamente entre 10 y
15 mg/semana, aproximadamente entre 15 y 20 mg/semana,
aproximadamente entre 20 y 25 mg/semana, aproximadamente entre 25 y
30 mg/semana, aproximadamente entre 30 y 35 mg/semana, o
aproximadamente entre 35 y 40 mg/semana. En una realización, una
cantidad eficaz de un agente inmunosupresor, incluyendo
metotrexato, es una cantidad entre aproximadamente 10 y 30
mg/semana.
Las cantidades eficaces de metotrexato varían
entre aproximadamente 0,1 y 40 mg/semana. En una realización, la
cantidad eficaz varía entre aproximadamente 0,1 y 5 mg/semana,
aproximadamente entre 5 y 10 mg/semana, aproximadamente entre 10 y
15 mg/semana, aproximadamente entre 15 y 20 mg/semana,
aproximadamente entre 20 y 25 mg/semana, aproximadamente entre 25 y
30 mg/semana, aproximadamente entre 30 y 35 mg/semana, o
aproximadamente entre 35 y 40 mg/ semana. En una realización, el
metotrexato se administra en una cantidad que varía entre
aproximadamente 10 y 30 mg/semana.
La ciclofosfamida, un agente alcalino, se puede
administrar en dosificaciones que varían entre aproximadamente 1 y
10 mg/kg de peso corporal al día.
Ciclosporina (por ejemplo NEORAL^{R}) también
conocida como Ciclosporina A, se administra de manera común en
dosificaciones que varían entre aproximadamente 1 y 10 mg/kg de peso
corporal al día. Las dosificaciones que varían entre
aproximadamente 2,5 y 4 mg por peso corporal al día son comúnmente
usadas.
La Cloroquina o hidroxicloroquina (por ejemplo
PLAQUENIL^{R}); se administra de manera común en dosificaciones
que varían entre aproximadamente 100 y 1000 mg al día. Las
dosificaciones preferidas varían entre aproximadamente 200 - 600 mg
administrados al día.
Sulfasalazina (por ejemplo, AZULFIDINE
EN-tabs^{R}) se administra de manera común en
dosificaciones que varían entre aproximadamente 50 y 5000 mg al
día, con una dosificación común de aproximadamente entre 2000 y
3000 mg al día para adultos. Las dosificaciones para niños están de
manera común entre aproximadamente 5 y 100 mg/kg de peso corporal,
hasta 2 gramos al día.
Las sales de oro se formulan para
administración: inyección u oral. Las sales de oro inyectables se
prescriben de manera común en dosificaciones entre aproximadamente
5 y 100 mg dosis cada dos a cuatro semanas. Las sales de oro
administradas por vía oral se prescriben de manera común en
dosificaciones que varían entre aproximadamente 1 y 10 mg al
día.
D-penicilamina o penicilamina
(CUPRIMINE^{R}) se administra de manera común en dosificaciones
entre aproximadamente 50 y 2000 mg al día, con dosificaciones
preferidas entre aproximadamente 125 mg al día hasta 1500 mg al
día.
La Azatioprina se administra de manera común en
dosificaciones entre aproximadamente 10 y 250 mg al día. Las
dosificaciones preferidas varían entre aproximadamente 25 y 200 mg
al día.
La anakinra (por ejemplo KINERET^{R}) es un
antagonista del receptor de interleukina-1. Un
intervalo de dosificación para anakinra está entre aproximadamente
10 y 250 mg al día, con una dosificación recomendada de
aproximadamente 100 mg al día.
\newpage
Infliximab (REMICADE^{R}) es un anticuerpo
monoclonal quimérico que se une al factor alfa de necrosis tumoral
(TNF\alpha). Infliximab se administra de manera común en
dosificaciones entre aproximadamente 1 y 20 mg/kg de peso corporal
cada cuatro a ocho semanas. Las dosificaciones entre aproximadamente
3 y 10 mg/kg se peso corporal se pueden administrar cada cuatro a
ocho semanas dependiendo del sujeto.
Etanercept (por ejemplo ENBREL^{R}) es una
proteína de fusión dimérica que se une al factor de necrosis
tumoral (TNF) y bloquea sus interacciones con los receptores de TNF.
Las dosificaciones administradas de manera común de etanercept
están entre aproximadamente 10 y 100 mg por semana para adultos con
una dosificación preferida de aproximadamente 50 mg por semana Las
dosificaciones para los sujetos juveniles varían entre
aproximadamente 0,1 y 50 mg/kg de peso corporal por semana con un
máximo de aproximadamente 50 mg por semana.
Leflunomida (ARAVA^{R}) se administra de
manera común en dosificaciones entre aproximadamente 1 y 100 mg al
día. Una dosificación diaria común esta entre aproximadamente 10 y
20 mg al día.
Las composiciones farmacéuticas también
preferiblemente incluyen vehículos y adyuvantes adecuados que
incluyen cualquier material que cuando se combina con la molécula
de la invención (por ejemplo, una molécula mutante de CTLA4
soluble, por ejemplo, L104EA29YIg) retiene la actividad de la
molécula y es no reactiva con el sistema inmune del sujeto. Los
ejemplos de vehículos y adyuvantes adecuados, incluyen, pero no se
limitan a, albúmina sérica bovina; intercambiadores de iones;
alúmina; lecitina; sustancias tampón, tales como fosfatos; glicina;
ácido sórbico; sorbato de potasio; y sales o electrolitos, tal como
sulfato de protamina. Otros ejemplos incluyen cualquiera de los
vehículos farmacéuticos convencionales tales como solución salina
tamponada con fosfato; agua; emulsiones, tal como emulsión de
aceite/agua; y diversos tipos de agentes humectantes. Otros
vehículos también incluir soluciones estériles; comprimidos,
incluyendo comprimidos y cápsulas revestidos. Típicamente tales
vehículos contienen excipientes tales como almidón, leche, azúcar,
ciertos tipos de arcilla, gelatina, ácido esteárico o sus sales,
estearato de magnesio o estearato de calcio, talco, grasas o aceites
vegetales, gomas, glicoles, u otros excipientes conocidos. Tales
vehículos también pueden incluir aditivos de sabor y de color u
otros ingredientes. Las composiciones que comprenden tales vehículos
se formulan mediante procedimientos convencionales bien conocidos.
Tales composiciones también se pueden formular dentro de diversas
composiciones de lípidos, tales como, por ejemplo, liposomas, así
como en diversas composiciones poliméricas, tales como microesferas
de polímeros.
Las composiciones farmacéuticas de la invención
se pueden administrar modos convencionales de administración que
incluyen, pero no se limitan a, administración intravenosa (i. v),
administración intraperitoneal (i.p.), administración intramuscular
(i.m.), administración subcutánea, oral, administración en forma de
supositorio, o en forma de contacto tópico, o la implantación de un
dispositivo de liberación lenta tal como una bomba miniosmótica, al
sujeto.
Las composiciones farmacéuticas de la invención
pueden estar en una variedad de formas de dosificación, que
incluyen, pero no se limitan a, soluciones o suspensiones líquidas,
comprimidos, píldoras, polvos, supositorios, microcápsulas o
microvesículas poliméricas, liposomas, y soluciones inyectables o
infusibles; La forma preferida depende del modo de administración y
la aplicación terapéutica.
El modo más eficaz de administración y régimen
de dosificación para las composiciones de esta invención depende de
la gravedad y curso de la enfermedad, la salud del paciente y
respuesta al tratamiento y juicio del médico de tratamiento. De
acuerdo con lo anterior, las dosificaciones de las composiciones se
deben ajustar para el paciente individual.
Las moléculas mutantes de CTLA4 solubles se
pueden administrar a un sujeto en una cantidad en una cantidad y
durante un tiempo (por ejemplo duración del tiempo y/o tiempos
múltiples) suficiente para bloquear las moléculas endógenas de B7
(por ejemplo, CD80 y/o CD86) de unión a sus ligandos respectivos, en
el sujeto. El bloqueo de unión de B7 endógeno /ligando inhibe por
lo tanto las interacciones entre células
B7-positivas (por ejemplo, células CD80- y/o
CD86-positivas) con células CD28- y/o
CTLA4-positivas. La dosificación de un agente
terapéutico depende de muchos factores que incluyen, pero no se
limita al, tipo de tejido afectado, el tipo de enfermedad
autoimmune que se está tratando, la gravedad de la enfermedad, la
salud del sujeto, y la respuesta del sujeto al tratamiento con los
agentes. De acuerdo con lo anterior, las dosificaciones de los
agentes pueden variar dependiendo del sujeto y modo de
administración. Las moléculas mutantes de CTLA4 solubles se pueden
administrar en una cantidad entre 0,1 y 20,0 mg/kg del peso del
paciente/día, preferiblemente entre 0,5 y 10,0 mg/kg/día. La
administración de las composiciones farmacéuticas de la invención se
puede realizar en varias veces. En una realización, la composición
farmacéutica de la invención se puede administrar durante una o
varias horas. Además, la administración de se puede repetir
dependiendo de la gravedad de la enfermedad así como otros factores
como se entiende en la técnica.
\vskip1.000000\baselineskip
La presente invención proporciona procedimientos
para tratar enfermedades del sistema inmune y enfermedades
autoinmunes en un sujeto que comprende la administración al sujeto
de cantidad eficaz de una molécula CTLA4 o a CTLA4 mutante que se
une a moléculas CD80 y/o CD86 sobre células CD80 y/o
CD86-positivas de manera que inhiba la unión a CD80
y/o CD86 a CTLA4 y/o CD28. Los procedimientos comprenden la
administración de una composición terapéutica, que comprende
moléculas de CTLA4 o CTLA4 mutantes solubles de la invención, a un
sujeto en una cantidad eficaz para suprimir al menos uno de los
síntomas asociados a las enfermedades del sistema inmune. De manera
adicional, la invención puede proporcionar terapia a largo plazo
para las sistemas del sistema immune mediante el bloqueo de las
interacciones de las células T /células B7 positivas, bloqueando
por lo tanto la activación /estimulación de las células T mediante
las señales de coestimulación tales como unión de B7 a CD28, que
conduce a la inducción de la anergia o tolerancia a células T.
Las moléculas de CTLA4 o CTLA4 mutantes de la
invención muestran propiedades inhibidoras in vivo. En
condiciones en las que las interacciones de células T /B7
positivas, por ejemplo interacciones de células T / células B, se
producen como resultado del contacto entre las células T cells y
células B7 positivas, unión de moléculas de CTLA4 introducidas que
reaccionan con las células B7 positivas, por ejemplo células B,
pueden interferir, es decir, inhibir, las interacciones de las
células T / células B7 positivas que dan como resultado la
regulación de respuestas inmunes. La inhibición de las respuestas
de las células T mediante la administración de una molécula de
CTLA4 soluble también puede ser útil para tratar trastornos
autoinmunes que se producen por una activación inapropiada de las
T que son reactivas contra autoantígenos, y que promueven la
producción de citoquinas y autoanticuerpos que están implicados en
la patología de la enfermedad. La administración de la molécula de
L104EA29YIg en un sujeto que sufre o es susceptible a un trastorno
susceptible puede prevenir la activación de células T
autorreactivas y pueden reducir o eliminar los síntomas de la
enfermedad. Este procedimiento también puede comprender la
administración al sujeto de una molécula de L104EA29YIg de la
invención, sola o conjuntamente, con ligandos adicionales, tales
como los reactivos con IL-2, IL-4, o
\gamma-interferón.
La invención proporciona procedimientos para
regular respuestas inmunes. Las respuestas inmunes se pueden
regular hacia abajo (reducir) mediante las moléculas de CTLA4 o de
CTLA4 mutantes de la invención pueden ser mediante la inhibición o
bloqueo de una respuesta inmune que ya está en marcha o puede
prevenir la inducción de una respuesta inmune. Las moléculas de
CTLA4 o de CTLA4 mutantes de la invención pueden inhibir las
funciones de las células T, tales como proliferación de linfocitos
T y secreción de citoquinas, mediante la supresión de las
respuestas de las células T o mediante la inducción de tolerancia
específica en las células T, o ambos. Además, las moléculas de
CTLA4 o de CTLA4 mutantes de esta invención, que interfieren con la
ruta de CTLA4/CD28/B7 puede inhibir la proliferación de las células
T y/o secreción de citoquina, y de esta manera da como resultado
la destrucción de tejido e inducción de la falta de respuesta de las
células T o anergia.
La invención además proporciona procedimientos
para inhibir el rechazo de trasplantes de órganos o tejidos en
sujetos que comprenden la administración de una cantidad eficaz de
al menos una molécula de CTLA4 o CTLA4 soluble, por ejemplo,
L104EA29YIg, al sujeto antes, durante y/o después del trasplante. En
otra realización, el procedimiento de la invención incluye la
administración a un sujeto de al menos una molécula de CTLA4 o
mutante CTLA4 soluble en combinación con al menos otro agente
terapéutico, que incluye, pero no se limita a un fármaco, una
enzima, un anticuerpo, o un conjugado.
El trasplante de órganos o tejidos puede ser a
partir de cualquier tipo de órgano o tejido capaz de trasplante. En
una realización, el tejido trasplantado puede ser un tejido
pancrático. En una realización preferida, el tejido trasplantado
es células de islotes pancreáticos. La invención también proporciona
procedimientos para tratar diabetes de tipo 1 y/o diabetes de tipo
2 en sujetos mediante la inhibición del rechazo de trasplante de
células de islotes.
La presente invención además proporciona un
procedimiento para inhibir rechazo de trasplante de islotes
pancreáticos en un sujeto, siendo el sujeto un receptor de tejido
trasplantado. Típicamente, en los trasplantes de tejidos, el
rechazo de los injertos se inicia mediante su reconocimiento como
extraños por las células T, seguido de una respuesta inmune que
destruye el injerto. La administración de una molécula de CTLA4
soluble en el procedimiento de esta invención inhibe la
proliferación de las células T y/o secreción de citoquina, que da
como resultado la reducción de destrucción de tejidos e inducción de
la falta de respuesta de células T específicas de antígeno que
puede dar como resultado la aceptación a largo plazo, sin la
necesidad de inmunosupresión generalizada.
Una realización preferida de la invención
comprende el uso de la molécula mutante de CTLA4 soluble
L104EA29YIg para regular las interacciones funcionales de las células CTLA4- y CD28-positivas con las células B7 positivas, para tratar enfermedades del sistema inmune tales como diabetes y/o regular hacia abajo respuestas inmunes. La L104EA29YIg de la invención es una molécula mutante de CTLA4 soluble que comprende al menos los dos cambios de aminoácidos, la leucina (L) a ácido glutámico. (E) en la posición +104 y la alanina (A) a tirosina (Y) cambio en la posición +29. La molécula de L104EA29YIg puede abarcar además mutaciones más allá de dos especificadas en el presente documento.
L104EA29YIg para regular las interacciones funcionales de las células CTLA4- y CD28-positivas con las células B7 positivas, para tratar enfermedades del sistema inmune tales como diabetes y/o regular hacia abajo respuestas inmunes. La L104EA29YIg de la invención es una molécula mutante de CTLA4 soluble que comprende al menos los dos cambios de aminoácidos, la leucina (L) a ácido glutámico. (E) en la posición +104 y la alanina (A) a tirosina (Y) cambio en la posición +29. La molécula de L104EA29YIg puede abarcar además mutaciones más allá de dos especificadas en el presente documento.
El procedimiento puede además comprender la
administración con las moléculas mutantes de CTLA4 solubles, un
régimen inmunosupresor de base al sujeto. El régimen de base
inmunosupresor puede incluir (pero no se limita a: ciclosporina,
azatioprina, metotrexato, ciclofosfamida, globulina inmune de
linfocitos, anticuerpos anti-CD3, globulina inmune
Rho (D), adrenocorticosteroides, sulfasalzina,
FK-506. metoxsalen, micofenolato mofetil (CELLCEPT),
globulina de timocitos anti-humana de caballo
(ATGAM), anti-TAC humanizado (HAT), basiliximab
(SIMULECT), globulina de timocitos anti-humana de
conejo (THYMOGLOBULIN), sirolimus, talidomida, metotrexato,
cloroquina, hidroxicloroquina, sulfasalazina, sulfasalazopirina,
leflunomida, sales de oro, D-penicilamina,
azatioprina, anakinra, infliximab, etanercept, bloqueadores de
TNF\alpha o un agente biológico que dirige una citoquina
inflamatoria. En una realización preferida, el régimen
inmunosupersor de base no tiene esteroide. Más preferiblemente, el
régimen inmunosupersor de base comprende rapamicina y mAb
anti-humano IL-2 R.
Una realización de la invención comprende el uso
de una molécula que bloquea la interacción entre B7 y CTLA4 junto
con un agente inmunosupresor que regula una respuesta inmune con el
fin de tratar una enfermedad del sistema inmune tal como diabetes.
La molécula usada para bloquear la interacción de B7/CTLA4 puede ser
una CTLA4 soluble tal como CTLA4Ig, CTLA4Ig/CD28Ig o L104EA29YIg,
una CD28 soluble tal como CD28Ig, una B7 (B7-1 o
B7-2) soluble tal como B7Ig, anticuerpos
monoclonales anti-CTLA4, anticuerpos monoclonales
anti-CD28 o anticuerpos monoclonales
anti-B7.
Los sujetos tratados por la presente invención
incluyen sujetos de mamíferos, incluyendo, ser humano, mono, simio,
perro, gato, vaca, caballo, cabra, cerdo, conejo, ratón y rata.
La presente invención proporciona diversos
procedimientos, locales o sistémicos, para la administración de las
composiciones terapéuticas de la invención tal como una molécula de
CTLA4 soluble sula o junto con un agente inmunosupresor y / u otro
fármaco terapéutico. Los procedimientos incluyen procedimientos
intravenosos, intramusculares, intraperitoneales, orales, de
inhalación y subcutáneos, así como bomba implantable, infusión
continua, terapia génica, liposomas, supositorios, contacto tópico,
vesículas, cápsulas e inyección. El agente terapéutico, mezclado
con un vehículo, se liofiliza de manera común para almacenamiento y
se reconstituye con agua o una solución tamponada con un pH neutro
(aproximadamente pH 7 - 8, por ejemplo, pH 7,5) antes de la
administración.
Como es una práctica convencional en la técnica,
las composiciones de la invención se pueden administrar al sujeto
en cualquier forma farmacéuticamente aceptable.
De acuerdo con la práctica de la invención, los
procedimientos de la invención, los procedimientos comprenden la
administración a un sujeto de las moléculas de CTLA4 solubles de la
invención que regulan las interacciones de las células CD28- y/o
CTLA4 positivas con las células B7 -positivas. Las células B7
positivas se ponen en contacto con una cantidad eficaz de las
moléculas de CTLA4 solubles de la invención, o sus fragmentos o
derivados, de manera que formen complejos CTLA4/B7 solubles. Los
complejos interfieren con la interacción entre moléculas endógenas
CTLA4 y CD28 con las moléculas de la familia B7.
Las moléculas de CTLA4 solubles se pueden
administrar a un sujeto en una cantidad y durante un tiempo (por
ejemplo, duración del tiempo y/o tiempos múltiples) suficiente para
bloquear las moléculas endógenas de B7 a partir de su unión a sus
ligandos respectivos, en el sujeto. Por lo tanto inhibiendo el
bloqueo de la unión de B7 endógena/ligando las interacciones entre
células B7 positivas con células CD28- y/o CTLA4 positivas.
La dosificación de un agente terapéutico depende
depende de muchos factores que incluyen, pero no se limitan al,
tipo de tejido afectado, el tipo de enfermedad autoinmune que se
está tratando, la gravedad de la enfermedad de la enfermedad, la
salud del sujeto y respuesta al tratamiento con agentes. De acuerdo
con lo anterior, las dosificaciones de los agentes pueden variar
dependiendo de cada sujeto y el modo de administración. Las
moléculas de CTLA4 solubles se pueden administrar en una cantidad de
entre aproximadamente 0,1 y 100 mg/kg por peso del
paciente/día.
La invención también abarca el uso de las
composiciones de la invención conjuntamente con otros agentes
farmacéuticos para tratar enfermedades del sistema inmune. Por
ejemplo, diabetes se puede tratar con las moléculas de la invención
junto con, pero no se limita a, agentes inmunosupresores tales como
corticosteroides, ciclosporina (Mathiesen 1989 Cancer Lett.
44(2): 151 - 156), prednisona, azatioprina, (R.
Handschumacher, en: "Drugs Used for Immunosuppression" páginas
1264 - 1276), bloqueadores o antagonistas de TNF\alpha (New
England Journal of Medicine, vol. 340: 253 - 259, 1999; The Lancet
vol. 354: 1932 - 39, 1999, Annals of Internal Medicine, vol. 130:
478 - 486), o cualquier otro agente biológico que dirige cualquier
citoquina inflamatoria, fármacos antiinflamatorios no esteroides /
inhibidores de la Cox-2, hidroxicloroquina,
sulfasalazopriina, sales de oro, etanercept, infliximab,
rapamicina, micofenolato mofetil, azatioprina, tacrolismus,
basiliximab, citoxan, interferón beta-1a,
interferón beta-1b, glatiramer acetato, mitoxantrona
clorhidrato, anakinra y / u otros agente biológicos.
Las moléculas de CTLA4 solubles
(preferiblemente, L104EA29YIg) también se pueden usar en combinación
con uno o más de los siguientes agentes que regulan una respuesta
inmune: gp39 soluble (también conocida como ligando CD40 (CD40L),
CD154, T-BAM, TRAP), CD29 soluble, CD40 soluble,
CD80 soluble (por ejemplo ATCC 68627), CD86 soluble, CD28 soluble
(por ejemplo 68628), CD56 soluble, Thy-1 soluble,
CD3 soluble, TCR soluble, VLA-4 soluble,
VCAM-1 soluble, LECAM-1 soluble,
ELAM-1 soluble, CD44 soluble, anticuerpos reactivos
con gp39 (por ejemplo ATCC HB-10916, ATCC
HB-12055 y ATCC HB-12056),
anticuerpos reactivos con CD40 (por ejemplo ATCC
HB-9110), anticuerpos reactivos con B7 (por ejemplo
ATCC HB-253, ATCC CRL-2223, ATCC
CRL-2226, ATCC HB-301, ATCC
HB-11341, etc), anticuerpos reactivos con CD28 (por
ejemplo ATCC HB-11944 o mAb 9.3 como se describe por
Martin et al (J. Clin. Immun. 4(1): 18 - 22, 1980),
anticuerpos reactivos con LFA-1 (por ejemplo ATCC
HB-9579 y ATCC TIB-213),
anticuerpos reactivos con LFA-2, anticuerpos
reactivos con IL-2, anticuerpos reactivos con
IL-12, anticuerpos reactivos con
IFN-gamma, anticuerpos reactivos con CD2,
anticuerpos reactivos con CD48, anticuerpos reactivos con cualquier
ICAM (por ejemplo, ICAM-1 (ATCC
CRL-2252), ICAM-2 y
ICAM-3), anticuerpos reactivos con CTLA4 (por
ejemplo ATCC HB-304)'' anticuerpos reactivos con
Thy-1, anticuerpos reactivos con CD56, anticuerpos
reactivos con CD3, anticuerpos reactivos con CD29, anticuerpos
reactivos con TCR, anticuerpos reactivos con VLA-4,
anticuerpos reactivos con VCAM-1, anticuerpos
reactivos con LECAM-1, anticuerpos reactivos con
ELAM-1, anticuerpos reactivos con CD44. En ciertas
realizaciones, se prefieren anticuerpos monoclonales. En otras
realizaciones, se prefieren fragmentos de anticuerpos. Como las
personas expertas en la técnica entenderán fácilmente, la
combinación puede incluir las moléculas de CTLA4 solubles de la
invención y otro agente inmunosupresor, las moléculas de CTLA4
solubles con otros dos agentes inmunosupresores, las moléculas de
CTLA4 solubles con tros tres agentes inmunosupresores, etc. La
determinación de la combinación óptima y dosificaciones se pueden
determinar y optimizar usando procedimientos bien conocidos en la
técnica.
Algunas combinaciones específicas incluyen los
siguientes: L104EA29YIg y anticuerpos monoclonales (mAbs) de CD80;
L104EA29YIg y mAbs de CD86; L104EA29YIg, mAbs de CD80, y CD86;
L104EA29YIg y mAbs de gp39; L104EA29YIg y mAbs de CD40; L104EA29YIg
y mAbs de CD28; L104EA29YIg, mAbs de CD80 y CD86, y mAbs de gp39;
L104EA29YIg, mAbs de CD80 y CD86 y mAbs de CD40; y L104EA29YIg, mAb
anti-LFA1, y mAb anti-gp39. Un
ejemplo específico de un mAb de gp39 es MR1. Otras combinaciones
serán fácilmente apreciadas y entendidas por los expertos en la
técnica.
Las moléculas de CTLA4 solubles de la invención,
por ejemplo L104EA29YIg, se pueden administrar solas o conjuntamente
con otros fármacos en regímenes de inmunomodulación u otros agentes
antiinflamatorios, por ejemplo, para el tratamiento o prevención de
rechazo agudo o crónico de trasplantes homólogos o heterólogos o
trastorno inflamatorio o autoinmune, o para inducir tolerancia. Por
ejemplo, se puede usar en combinación con un inhibidor de
calcineurina, por ejemplo ciclosporina A o FK506; un macrólido
inmunosupresor, por ejemplo rapamicina o su derivado (por ejemplo
40-O-(2-hidroxi)etil-rapamicina);
a un agente buscador de de linfocitos, por ejemplo FTY720 o su
análogo; corticosteroides; ciclofosfamida; azatiopreno;
metotrexato; leflunomida o su análogo; mizoribina; ácido
micofenólico; micofenolato mofetil;
15-deoxispergualina o su análogo; anticuerpos
monoclonales inmunosupresores, por ejemplo, anticuerpos
monoclonales a receptores de leucocitos, por ejemplo, MHC, CD2, CD3,
CD4, CD 11a/CD18, CD7, CD25, CD 27, B7, CD40, CD45, CD58, CD 137,
ICOS, CD150 (SLAM), OX40, 4-1BB o sus ligandos; u
otros compuestos inmunomoduladores, por ejemplo
CTLA4/CD28-Ig, u otros inhibidores de la molécula de
adhesión, por ejemplo mAbs o inhibidores de bajo peso molecular que
incluyen antagonistas de LFA-1, antagonistas de
Selectina y antagonistas de VLA-4. El compuesto es
particularmente útil en combinación con un compuesto que interfiere
con CD40 y su ligando, por ejemplo anticuerpos con CD40 y
anticuerpos para CD40-L.
Cuando las moléculas mutantes de CTLA4 solubles
de la invención se administran junto con otra terapia
inmunosupresora/inmunomoduladora o
anti-inflamatoria, por ejemplo como se ha
especificado anteriormente en el presente documento, las
dosificaciones del compuesto inmunosupresor, inmunomodulador o
antiinflamatorio administrado conjuntamente, variará naturalmente
dependiendo del tipo de cofármaco empleado, por ejemplo si es un
esteroide o una ciclosporina, del fármaco específico empleado, de
la afección, de la afección que se está tratando y así
sucesivamente.
De acuerdo con lo anterior la presente invención
proporciona todavía en un aspecto adicional procedimientos como se
han definido anteriormente que comprende la administración conjunta,
por ejemplo de manera simultánea o en secuencia, de una cantidad
terapéuticamente eficaz de moléculas de CTLA4 solubles de la
invención, por ejemplo CTLA4Ig y/o L104EA29YIg, en la forma libre o
en la forma de sal farmacéuticamente aceptable, y una segunda
sustancia fármaco, siendo dicha segunda sustancia fármaco un fármaco
inmunosupresor, inmunomodulador o antiinflamatorio, por ejemplo
como se ha indicado anteriormente.
Además se proporcionan combinaciones
terapéuticas, por ejemplo un kit, que comprende una molécula de
CTLA4 soluble, en la forma libre o en la forma de una sal
farmacéuticamente aceptable, a usar de manera simultánea o en
secuencia con al menos una composición farmacéutica que comprende un
fármaco inmunosupresor, inmunomodulador o antiinflamatorio, por
ejemplo, NSAID, glucocorticoide o corticosteroide. El kit puede
comprender instrucciones para la administración. Los kits de la
invención se pueden usar en cualquier en cualquier procedimiento de
la presente invención.
En otra realización de la invención, el rechazo
de trasplante de tejidos u órganos se inhibe mediante la
administración a un sujeto de CTLA4 soluble y células de médula
ósea agotadas de células T al sujeto. La administración de médula
ósea agotada de células T se puede producir a aproximadamente el
mismo tiempo que el sujeto recibe el trasplante de tejido u órgano
o en un momento diferente. La administración de médula ósea a
aproximadamente el mismo tiempo indica que la médula ósea se
administra al sujeto como parte de la preparación para los
procedimientos para administrar el trasplante de tejido u órgano.
No se requiere que la médula ósea se trasplante a exactamente la
misma clase (es decir, en minutos) que el trasplante de órgano.
En realizaciones preferidas, la médula ósea
agotada de células T se administra antes del trasplante de órganos.
Las realizaciones particulares incluyen la administración de la
médula ósea agotada de células T en un día, en doce horas o en seis
horas del trasplante de órgano sólido. Sin embargo, la médula ósea
agotada de células T se puede administrar de manera temprana,
mientras que los efectos resultantes de la médula ósea agotada de
células T se logran todavía junto con el trasplante de órgano o
tejido. En realizaciones alternativas, puede ser deseable
administrar médula ósea agotada de células T después del trasplante
de órganos.
En una realización, el procedimiento comprende
la administración de una dosis de células de médula ósea agotada de
células T (dosis de tolerancia) a un sujeto, y posteriormente la
administración de una dosis adicional de células de médula ósea
agotada de células T (dosis de injerto) al sujeto. En ciertas
realizaciones, el agente inmunosupresor comprende al menos uno o
más tipos de ligandos que interfieren con la unión de antígeno de
CD28 aCD80 y/o antígeno de CD86. Como se ha descrito anteriormente,
el ligando es preferiblemente una molécula mutante de CTLA4, tal
como L104EA29YIg.
Además, la cantidad de médula ósea agotada de
células T se puede determinar mediante experimentación rutinaria
optimizar de manera empírica. Por ejemplo, la cantidad de médula
ósea agotada de células T se puede valorar durante la
experimentación de rutina para ajustar la cantidad suficiente para
lograr los efectos deseados.
Los procedimientos de la invención también se
pueden practicar mediante administración, además de la molécula
mutante de CTLA4 soluble, dos o más dosis de médula ósea agotada de
células T al sujeto, sola, o en combinación con uno o más agentes
inmunosupresores.
Como se ha descrito, en los procedimientos de la
invención, la administración de una molécula de CTLA4 o CTLA4
mutante solubles se puede llevar a cabo de muchas formas diferentes
incluyendo vías de administración locales o sistémicas. Por
ejemplo, moléculas mutantes de CTLA4 solubles se pueden administrar
por vía intravenosa, intramuscular, o intraperitoneal. Como
alternativa, CTLA4 mutante se puede administrar por vía oral o
subcutánea. Otros procedimientos de administración serán
reconocidos por los expertos en la técnica. De manera similar, la
médula ósea agotada de células T se puede administrar de muchas
formas diferentes como conocen los expertos en la técnica. Un
ejemplo es mediante infusión intravenosa.
El (los) agente inmunosupresor(s) se
puede(n) administrar (antes o después de la administración
del mutante de CTLA4 soluble y/o antes o después del trasplante de
órgano / tejido. Preferiblemente, la médula ósea y agente
inmunosupresor se administran antes de la administración de molécula
mutante de CTLA4 soluble. En una realización, una primera dosis de
médula ósea agotada de células T (dosis de tolerancia) y el agente
inmunosupresor se administra a aproximadamente el mismo tiempo que
el trasplante de órganos.
Los siguientes ejemplos se presentan para
ilustrar la presente invención. La metodología y resultados pueden
variar dependiendo del objetivo propuesto de tratamiento y los
procedimientos empleados. Los ejemplos no pretenden limitar de
ninguna manera el alcance de la invención.
Este ejemplo proporciona una descripción de los
procedimientos usados para generar las secuencias de nucleótidos
que codifican las moléculas mutantes de CTLA4 solubles de la
invención. Un mutante de un solo sitio L104EIg se generó y se
ensayó para cinética de unión a CD80 y/o CD86. La secuencia de
nucleótidos de L104EIg se usó como un molde para generar la
secuencia mutante de doble sitio CTLA4, L104EA29YIg, que se ensayó
para determinar la cinética de unión a CD80 y/o CD86.
Una estrategia de mutagénesis y selección se
desarrolló para identificar moléculas de CTLA4Ig mutantes que
tenían velocidades de disociación más lentas (velocidades de
"desconexión") a partir de las moléculas de unión de CD86. La
secuencias de nucleótidos mutantes de un solo sitio se generaron
usando CTLA4Ig (Patentes de Estados Unidos Números: 5.844.095;
5.851.795; y 5.885.796; Nº acceso de ATCC 68629) como molde. Los
cebadores de la PCR de oligonucleótidos mutagénicos se diseñaron
para mutagénesis al azar de un codón de ADNc específico permitiendo
cualquier base en las posiciones 1 y 2 del codón, pero solamente
guanina o timina en la posición 3 (XXG/T; también conocido como
NNG/T). De esta manera, un codón específico que codifica un
aminoácido se debe mutar al azar para que codifique cada uno de los
20 aminoácidos. A este respecto, la mutagénesis de XXG/T produce 32
codones potenciales que codifican cada uno de los 20 aminoácidos.
Los productos de PCR que codifican mutaciones en estrecha
proximidad a -M97- G107 de CTLA4Ig (véase la Figura 1 o 2), se
digirieron con SacI/XbaI y se subclonaron en el vector de expresión
de CTLA4Ig \piLN cortado de manera similar. Este procedimiento se
usó para generar la molécula mutante de CTLA4 de un solo sitio
L104EIg.
Para la mutagénesis en proximidad a
S25-R33 de CTLA4Ig, se introdujo primero un sitio de
restricción silencioso NheI en 5' a este bucle, mediante la
mutagénesis dirigida al cebador de la PCR. Los productos de la PCR
se digirieron con NheI/XbaI y se subclonaron en vectores similares
de CTLA4Ig o L104EIg cortados de manera similar. Este procedimiento
se usó para generar la molécula mutante de CTLA4 de doble sitio
L104EA29YIg (Figura 3). En particular, la molécula de ácido
nucleico que codifica la molécula mutante de CTLA4 de un solo sitio,
L104EIg, se usó como molde para generar la molécula mutante de
CTLA4 de doble sitio, L104EA29YIg.
Lo siguiente proporciona una descripción de los
procedimientos de selección usados para identificar los polipéptidos
mutantes de CTLA4 de un solo o doble sitio, que se expresa a partir
de las instrucciones descritos en el Ejemplo 1, que mostraron una
mayor avidez de unión por antígenos de CD80 y CD86, comparado con
las moléculas no mutadas de CTLA4Ig.
Los estudios actuales in vitro y in
vivo indican que CTLA4Ig por sí misma es incapaz de bloquear
completamente el cebado de células T activadas por antígeno
específico. Los estudios in vitro con CTLA4Ig y cualquier
anticuerpo monoclonal específico para CD80 o CD86 que miden la
inhibición la proliferación de las células T indican que el
anticuerpo monoclonal anti-CD80 no aumentó la
inhibición de CTLA4Ig. Sin embargo, el anticuerpo monoclonal
anti-CD86 no aumentó la inhibición, indicando que
CTLA4Ig no era eficaz en el bloqueo de las interacciones de CD86.
Estos datos apoyan los hallazgos anteriores por Linsley et
al. (Immunity. (1994), 1: 793 - 801) que muestran que la
inhibición de las respuestas celulares mediadas por CD80 requerían
aproximadamente 100 veces menos concentraciones de CTLA4Ig que
para las respuestas mediadas por CD86. Basándose en estos
hallazgos, se supuso que las moléculas mutantes de CTLA4 solubles
que tienen una mayor avidez por CD86 que CTLA4 de tipo salvaje debe
ser capaz de bloquear mejor el cebado de células activadas
específicas de antígeno que CTLA4Ig.
Con este fin, las moléculas mutantes de CTLA4
solubles descritas en el Ejemplo 1 anteriormente se seleccionaron
usando un procedimiento de selección novedoso para identificar
varias mutaciones en el dominio extracelular de CTLA4 que mejoran
la avidez de unión por CD80 y CD86. Esta estrategia de selección
proporcionó un procedimiento eficaz para identificar directamente
los mutantes con unas velocidades más lentas de "desconexión"
sin la necesidad de purificación o cuantificación de proteínas ya
que la determinación de la velocidad de "desconexión" es
independiente de la concentración (O'Shannessy et al., (1993)
Anal. Biochem., 212: 457 - 468).
Se transfectaron células COS con ADN de
plásmido purificado por miniprep individual y se propagó durante
varios días. Se aplicó un medio de cultivo acondicionado tres días a
procesadores biosensores de BIAcore (Farmacia Biotech AB, Uppsala,
Suecia) revestidos con CD80Ig o CD86Ig solubles. La unión y
disociación específica y de proteínas mutantes se midió mediante
resonancia de plasmón superficial (O'Shannessy, D. J., et
al., (1993) Anal. Biochem. 212: 457 - 468). Todos los
experimentos se llevaron a cabo en biosensores BIAcore^{TM} o
BIAcore^{TM} 2000 a 25ºC. Se inmovilizaron los ligandos sobre
procesadores sensores NCM5 (Farmacia) de calidad de investigación
usando acoplamiento a
N-etil-N'-(dimetilaminopropil).
carbodiimidN-hidroxisuccinimida (Johnsson, B.,
et al. (1991) Anal. Biochem. 198: 268 - 277; Khilko, S.N.,
et al. (1993) J. Biol. Chem 268: 5425 - 15434).
\vskip1.000000\baselineskip
Células COS desarrolladas en placas de tejido de
24 pocillos se transfectaron de manera transitoria con AND que
codifica CTLA4Ig mutante. Medio de cultivo que contenía CTLA4Ig
mutante soluble secretada se recogió 3 días después.
Se dejó que el medio de cultivo de células COS
cese dejara fluir sobre procesadores biosensores BIAcore
derivatizados con CD86Ig o CD80Ig (como se ha descrito en Greene
et al., 1996 J. Biol. Chem. 271: 26762 - 26771), y moléculas
mutantes se identificaron con velocidades más lentas de
"desconexión" que las observadas para CTLA4Ig de tipo salvaje.
Los ADNc correspondientes a muestras de medios seleccionadas se
secuenciaron y se prepare ADN para realizar la transfección
transitoria de células COS a mayor escala, a partir de lo cual se
preparó la proteína CTLA4Ig después de la purificación de la
proteína A del medio de cultivo.
Las condiciones del análisis de BIAcore y
análisis de datos de equilibrio se realizaron como se describe en
J. Greene et al. 1996 J. Biol. Chem.
271:26762-26771, y como se describe en el presente
documento.
\vskip1.000000\baselineskip
Las condiciones de inicio del Senosorgrama se
normalizaron hasta unidades de respuesta cero (RU) antes de
análisis. Las muestras se ensayaron sobre celdas de flujo
derivatizadas simuladas para determinar los valores de la unidad de
respuesta de fondo (RU) debido a las diferencias de índice de
refracción aparente entre soluciones. Las constantes de disociación
de equilibrio (K_{d}) se calcularon a partir de representaciones
gráficas de R_{eq} contra C, donde R_{eq} es la respuesta en
estado constante menos la respuesta sobre un procesador
derivatizado simulado y C es la concentración molar de analito. Las
curvas de unión se analizaron usando el software de ajuste de
curves no lineal comercial (Prism, GraphPAD Software).
Los datos experimentales se ajustaron primero a
un modelo a un modelo para la unión de un ligando individual a un
receptor individual (modelo de 1 solo sitio, es decir, un sistema
langmuir simple, A+B AB), y constantes de asociación de equilibrio
(K_{d}=[A]\cdot[B]\[AB]) se calcularon a partir de
la ecuación R = R_{max}\cdotC/(K_{d}+C). Posteriormente, los
datos se ajustaron al modelo de dos sitios más simple de unión a
ligando (es decir, a un receptor que tiene dos sitios de unión
independientes que no interactúan como se describe por la ecuación
R =
R_{max1}\cdotC\(K_{d1}+C)+R_{max2}\cdotC\(K_{d2}+C)).
La bondad de los ajustes de estos dos modelos
se analizaron visualmente mediante comparación con los datos
experimentales y estadísticamente mediante un ensayo F de las sumas
de cuadrados. El modelo de un sitio más simple se eligió como el
mejor ajuste, salvo que el modelo de dos sitios se ajuste
significativamente mejor (p<0.1).
Los análisis de asociación y disociación se
realizaron usando el Software de evaluación BIA 2.1 (Farmacia).
Las constantes de velocidad de asociación k_{on} se calcularon de
dos formas, asumiendo ambos ambas interacciones de un solo sitio
homogéneas e interacciones de dos sitios en paralelo. Para las
interacciones de un solo sitio, los valores de k_{on} se
calcularon de acuerdo con la ecuación R_{t} =
R_{eq}(1-exp^{-ks(t-t}_{0}),
donde R_{t} es una respuesta a un tiempo dado, t; R_{eq} es la
respuesta en tiempo constante; t_{0} es el tiempo al comienzo de
la inyección; y k_{s} = dR/dt = k_{on}\cdotCk_{off}, y donde
C es una concentración de analito, calculada en términos de sitios
de unión monomérica. Para las interacciones de dos sitios los
valores de k_{on} se calcularon de acuerdo con la ecuación
R_{t} = R_{eq1} (1-exp
^{-ks1(t-t}_{0}) + R_{eq2}
(1-exp^{ks2(t-t)}_{0}.
Para cada modelo, los valores de k_{on} se determinaron a partir
de la pendiente calculada (hasta aproximadamente 70% de asociación
máxima) de representaciones gráficas de k_{s} contra C.
Los datos de disociación se analizaron de
acuerdo con los modelos de un sitio (AB = A+B) o dos sitios (AiBj =
Ai+Bj), y las constantes de velocidad (k_{off}) se calcularon a
partir de las curvas de mejor ajuste. El modelo de sitio de unión
se usó excepto cuando los residuos eran mayor que el fondo de la
máquina (2-10 RU, de acuerdo con la máquina), en
cuyo caso se usó el modelo del sitio de dos uniones. Los tiempos
medios de ocupación del receptor se calcularon usando la relación
t_{^{1}/_{2}} = 0.693/k_{off}.
mAb L307.4 murino (anti-CD80) se
compró en Becton Dickinson (San Jose, California) y IT2.2
(anti-B7-0 [también conocido como
CD86]), de Farmingen (San Diego, California). Para la tinción
inmunológica, células CHO CD80-positivas y/o
CD86-positivas se retiraron de los recipientes de
cultivo mediante incubación en solución salina tamponada con
fosfato (PBS) que contenía EDTA 10 mM. Se incubaron primero células
CHO (1 - 10 x 10^{5}) con mAbs o proteínas de fusión de
inmunoglobulina en DMEM que contenía 10% de suero bovino fetal
(FBS), después se lavaron y se incubaron con reactivos de segunda
etapa de inmunoglobulina de anti-ratón o
anti-humano de cabra conjugados a isotiocianoato de
fluoresceína (Tago, Burlingame, California). A las células se les
proporcionó un lavado final y se analizaron sobre un FACScan
(Becton Dickinson).
Se realizó SDS-PAGE sobre geles
de Tris/glicina 4 - 20% de acrilamida (Novex, San Diego, CA). Los
geles analíticos se tiñeron con azul de Coomassie, y se obtuvieron
las imágenes de los ges húmedos obtenidos mediante barrido
diferencial. Se analizaron CTLA4Ig (25 \mug) y L104EA29YIg (25
\mug) mediante cromatografía de exclusión de tamaño usando una
columna TSK-GEL G300 SW_{XL} (7,8 x 300 mm,
Tosohaas, Montgomeryville, PA) equlibrada en solución salina
tamponada con fosfato que contenía 0,02% de NAN_{3} a un caudal de
1,0 ml/min.
CTLA4X_{C120S} de una sola cadena se preparó
como se ha descrito previamente (Linsley et al., (1995) J.
Biol. Chem., 270: 15417 - 15424). En resumen, un plásmido de
expresión de oncostatina M CTLA4 (OMCTLA4) se usó como molde, el
cebador directo,
GAGGTGATAAAGCTTCACCAATGGGTGTACTGCTCACACAG (SEQ
ID NO.: 17) se eligió para aparear las secuencias en el vector; y
el cebador inverso,
GTGGTGTATTGGTCTAGATCAATCAGAATCTGGGCACGGTTC (SEQ
ID NO.: 18) correspondía a los últimos siete aminoácidos (es decir,
aminoácidos 118 - 124) en el dominio extracelular de CTLA4, y
contenía un sitio de enzima de restricción, y un codón de parada
(TGA). El cebador inverso especificó una mutación C120S (cisteína a
serina en la posición 120). En particular, la secuencia de
nucleótidos GCA (nucleótidos 34 - 36) del cebador inverso mostrado
anteriormente se reemplaza con una de las siguientes secuencias de
nucleótidos: AGA, GGA, TGA, CGA, ACT, o GCT. Como las personas en
la técnica entenderán, la secuencia de nucleótidos GCA ies una
secuencia complementaria inversa del codón TGC para cisteína. De
manera similar, las secuencias de nucleótidos AGA, GGA, TGA, CGA,
ACT, o GCT son secuencias complementarias inversas de los codones
para serina. Los productos de la reacción en cadena de la
polimerasa se digirieron con HindIII/XbaI y se
subclonaron direccionalmente en el vector de expresión \piLN
(Bristol-Myers Squibb Company, Princeton, NJ).
L104EA29YX_{c120S} se preparó de una manera idéntica. Cada
construcción se verificó mediante secuenciación de ADN.
Se eligieron veinticuatro aminoácidos para
mutagénesis y las \sim 2300 proteínas mutantes resultantes se
ensayaron para determinar la unión a CD86Ig mediante resonancia de
plasmón superficial (SPR; como se ha descrito, anteriormente). Los
efectos predominantes de la mutagénesis en cada sitio se resumen en
la Tabla II. La mutagénesis al azar de algunos aminoácidos en el
S25-R33 aparentemente no alteraron la unión al
ligando. La mutagénesis de E31 y R33 y los restos
M97-Y102 dieron como resultado aparentemente una
reducción de la unión a ligando. La mutagénesis de los residuos,
S25, A29, y T30, K93, L96, Y103, L104, y G105, dieron como resultado
velocidades lentas de "conexión" y/o lentas de
"desconexión". Estos resultados confirman los hallazgos previos
de los residuos en la región S25-R33, y los
residuos en o cerca de M97-Y102 influencian la unión
a ligandos (Peach et al., (1994) J. Exp. Med., 180: 2049 -
2058.
La mutagénesis de los sitios S25, T30, K93, L96,
Y103, y G105 dio como resultado la identificación de algunas
proteínas mutantes que tenían velocidades más lentas de
"desconexión" de CD86Ig. Sin embargo, en estos casos, la
velocidad lenta de "desconexión" solucionó mediante una
velocidad lenta de "desconexión" que dio como resultado
proteínas mutantes con una avidez global para CD86Ig que era
aparentemente similar a la observada con CTLA4Ig de tipo salvaje.
Además, la mutagénesis de K93 dio como resultado la agregación
significativa que ha sido responsable de los cambios cinéticos
observados.
La mutagénesis al azar de L104 seguida de la
transfección de las células COS y selección por SPR de las muestras
del medio de cultivo sobre CD86Ig inmovilizada produjo seis muestras
de medio que contenían proteínas mutantes con aproximadamente 2
veces velocidades más lentas de "desconexión" que CTLA4Ig de
tipo salvaje. Cuando el ADNc correspondiente de estos mutantes se
secuenció, cada uno de ellos se encontró que codificaba una mutación
de leucina a ácido glutámico (L104E). Aparentemente, la sustitución
de leucina 104 a ácido aspártico (L104D) no afectó la unión de
CD86Ig.
Se repitió después la mutagénesis en cada sitio
enumerado en la Tabla II, esta vez usando L104E como molde de la
PCR en lugar de CTLA4Ig de tipo salvaje, como se ha descrito
anteriormente. El análisis SPR, de Nuevo usando CD86Ig
inmovilizada, identificó seis muestras de medio de cultivo de
mutagénesis de alanina 29 con proteínas que tenían
aproximadamente 4 veces más lentas las velocidades de
"desconexión" que CTLA4Ig de tipo salvaje. Las dos más lentas
eran las sustituciones de tirosina (L104EA29Y), dos eran leucina
(L104EA29L), uno era triptófano (L104EA29W), y uno era treonina
(L104EA29T). Aparentemente, no se identificaron mutantes de
velocidad lenta de "desconexión" cuando alanina 29 se mutó al
azar, sola, en CTLA4Ig de tipo salvaje.
El peso molecular relativo y estado de
agregación de L104E purificado y L104EA29YIg se determinó mediante
SDS-PAGE y cromatografía de exclusión por tamaño.
L104EA29YIg (\sim1 \mug; banda 3) y L104EIg (\sim1 \mug;
banda 2) aparentemente tenían la misma movilidad electroforética
que CTLA4Ig (\sim1 \mug; banda 1) en condiciones reductoras
(\sim50 kDa; +\betaME; más 2-mercaptoetanol) y
no reductoras (\sim100 kDa; -\betaME) (Fig. 14A). La
cromatografía de exclusión por tamaño demostró que L104EA29YIg (Fig.
14C) aparentemente tenía la misma movilidad que CTLA4Ig dimérica
(Fig. 14B). Los máximos principales representan dímero de proteína
mientras que el máximo secundario que eluía más rápido en la Fig.
14B representa agregados de peso molecular mayores. Aproximadamente
5,0% de CTLA4Ig estaba presente como agregados de peso molecular
mayores pero no existía evidencia de agregación de L104EA29YIg o
L104EIg. Por lo tanto, la unión más fuerte a CD86Ig observada con
L104EIg y L104EA29YIg no se podía atribuir a la agregación inducida
por mutagénesis.
El análisis de equilibrio y unión cinética se
realizó sobre CTLA4Ig, L104EIg, y L104EA29YIg purificada de
proteína A usando resonancia de plasmón superficial (SPR). Los
resultados se muestran en la Tabla I. Las constantes de disociación
de equilibrio observadas (K_{d}; Tabla I) se calcularon a partir
de curvas de unión generadas en un intervalo de concentraciones
(5,0 - 200 nM). L104EA29YIg se une más fuertemente a CD86Ig que lo
hace L104EIg o CTLA4Ig. El valor de K_{d} menor de L104EA29YIg
(3,21 nM) que L104EIg (6,06 nM) o CTLA4Ig (13,9 nM) indica la mayor
avidez de unión de L104EA29YIg a CD86Ig. El valor menor de K_{d}
de L104EA29YIg (3,66 nM) que L104EIg (4,47 nM) o CTLA4Ig (6,51 nM)
indica la mayor avidez de unión de L104EA29YIg a CD80Ig.
El análisis de unión cinética reveló que las
velocidades comparativas de "conexión" para CTLA4Ig, L104EIg,
y L104EA29YIg unión a CD80 eran similares, como eran las velocidades
de "conexión" para CD86Ig (Tabla I). Sin embargo, las
velocidades de "desconexión" para estas moléculas no eran
equivalentes (Tabla I). Comparado con CTLA4Ig, L104EA29YIg tenía
aproximadamente 2 veces menor velocidad de "desconexión" de
CD80Ig, y aproximadamente 4 veces menor velocidad de
"desconexión" de CD86Ig. L104E tenía velocidades de
"desconexión" intermedias entre L104EA29YIg y CTLA4Ig. Ya que
la introducción de estas no afectó significativamente a las
velocidades de "conexión", el incremento en avidez para CD80Ig
y CD86Ig observado con L104EA29YIg se debía probablemente a una
disminución en las velocidades de "desconexión".
Para determinar si el incremento en avidez de
L104EA29YIg para CD86Ig y CD80Ig se debía a las mutaciones que
afectan a la forma en que cada monómero se asocia como un dímero, o
si tenían avidez por la potenciación de los cambios estructurales
introducidos en cada monómero, se prepararon construcciones de
cadena sencilla de CTLA4 y dominios extracelulares de L104EA29Y
después de la mutagénesis de cisteína 120 a serina como se ha
descrito anteriormente, y por Linsley et al., (1995) J. Biol.
Chem., 270: 15417 - 15424. Las proteínas purificadas
CTLA4X_{C120S} y L104EA29YX_{C120S} se mostraron que eran
monoméricas mediante cromatografía de permeación de gel (Linsley
et al., (1995), anteriormente), antes de que sus
propiedades de union a ligandos se analizaran por SPR Los
resultados mostraron que la afinidad de unión de ambas proteínas
monoméricas para CD86Ig era aproximadamente 35 - 80 veces menos
que la observada para sus respectivos dímeros (Tabla I). Esto apoya
los datos publicados previamente que establecen que la dimerización
de CTLA4 era requerida para la unión de ligando de alta avidez
(Greene et al., (1996) J. Biol. Chem., 271: 26762 -
26771).
h104EA29YX_{C120s} unido con aproximadamente 2
veces mayor afinidad que CTLA4X_{C120S} a tanto CD80Ig como
CD86Ig. El aumento de afinidad se debía a que la velocidad de
disociación de ambos ligandos era aproximadamente 3 veces menor.
Por lo tanto, la unión de ligandos más fuerte por L104EA29Y era lo
más probablemente debido los cambios estructurales que potencian la
avidez que se han introducido en cada cadena monomérica mejor que
las alteraciones en las que la molécula está dimerizada.
La estructura de la solución del dominio
extracelular de tipo IgV de CTLA4 se ha determinado recientemente
mediante espectroscopía RMN (Metzler et al., (1997) Nature
Struct. Biol., 4: 527 - 531. Esto permitió la localización precisa
de leucina 104 y alanina 29 en los pliegues tridimensionales (Fig.
15A-B). Leucina 104 se sitúa cerca de la secuencia
de aminoácidos MYPPPY altamente conservada. Alanina 29 se sitúa
cerca del extremo C-terminal de la región
S25-R33, que es espacialmente adyacente a la región
MYPPPY. Mientras que existe una interacción significativa entre los
restos y la base de estas dos regiones, no existe aparentemente
interacción directa entre L104 y A29 aunque ambos comprenden parte
de un núcleo hidrófobo continuo en la proteína. Las consecuencias
estructurales de los mutantes que potencian la avidez se
determinaron mediante modelación. La mutación A29Y se puede
acomodar fácilmente en la grieta entre la región S25- R33 y la
región MYPPPY, y puede servir para estabilizar la conformación de
la región MYPPPY. En CTLA4 de tipo salvaje, L104 forma interacciones
hidrófobas extensivas con L96 y V94 cerca de la región 1VIYPPPY.
Parece altamente improbable que la mutación de ácido glutámico
adopte una conformación similar a la de L104 por dos razones.
Primero, hay un espacio insuficiente para acomodar la cadena
secundaria de ácido glutámico más larga en la estructura sin
perturbación significativa a la región S25-R33.
Segundo, el coste energético de ocultación de la carga negativa de
la cadena secundaria de ácido glutámico en la región hidrófoba
sería grande. En cambio, los estudios de modelación predicen que la
cadena secundaria del ácido glutámico se mueve hacia la superficie
donde su carga se puede estabilizar mediante solvatación. Tal
cambio conformacional se puede acomodar fácilmente mediante G105,
con una distorsión mínima otros residuos en las regiones.
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El análisis FACS (Fig. 9) de CTLA4Ig y moléculas
mutantes que se unen a células CD80+ y CD86+CHO trasnfectadas
establemente se realizó como se ha descrito en el presente
documento. Las células CHO CD80-positivas y
CD86-positivas se incubaron con concentraciones
crecientes de CTLA4Ig, L104EA29YIg, o L104EIg, y después se lavaron.
La proteína de fusión de inmunoglobulina unida se detectó se
detectó usando inmunoglobulina anti-humano de
cabra conjugado a isotiocianoato de fluoresceína.
Como se muestra en la Figura 9, células CHO
CD80-positivas y CD86-positivas (1,5
x 10^{5}) se incubaron con las concentraciones indicadas de
CTLA4Ig (cuadrados negros), L104EA29YIg (círculos), o L104EIg
(triángulos) durante 2 horas a 23ºC, se lavaron y se incubaron con
anticuerpo de inmunoglobulina anti-humano de cabra
conjugada a isotiocianoato de fluoresceína. Se analizó la unión
sobre un total de 5.000 células viables (determinación sencilla)
sobre un FACScan, y se determinó la intensidad de fluorescencia
media (MFI) a partir de los datos de histogramas que usan
PC-LYSYS. Se corrigieron los datos a partir de la
fluorescencia de fondo medida sobre células incubadas con reactivo
de segunda etapa solamente (MFT = 7). El mAb L6 de control (80
\mug/ml) proporcionó MFI < 30. Estos resultados son
representativos de cuatro experimentos independientes.
La unión de L104EA29YIg, L104EIg, y CTLA4Ig a
células CHO transfectadas con CD80 es aproximadamente equivalente
(Fig. 9A). L104EA29YIg y L104EIg se unen de manera más fuerte a las
células CHO transfectadas de manera estable con CD86 humanas que lo
hace CTLA4Ig (Fig. 9B).
\vskip1.000000\baselineskip
Se aislaron células T
CD4-positivas mediante selección negativa
inmunomagnética (Linsley et. al., (1992) J. Exp. Med. 176:
1595 - 1604). Se estimularon células T CD4-positivas
aisladas con forbal miristato acetato (PMA) más células CHO
CD80-positivas o CD86-positivas en
la presencia de concentraciones ajustadas de inhibidor. Las
células T CD4-positivas (8 -10 x 10^{4}/pocillo)
se cultivaron en presencia de 1 nM PMA con o sin estimuladores de
células CHO. Se midieron las respuestas proliferativas mediante la
adición de 1 \muCi/pocillo de [3H]timidina durante las 7
horas finales de un cultivo de 72 horas. Se realizó la inhibición de
PMA más CHO CD80-positivas, o CHO
CD86-positivas, células T estimuladas por
L104EA29YIg y CTLA4Ig. Los resultados se muestran en la Fig. 10.
L104EA29YIg inhibe la proliferación de células CHO tratadas con PMA
CD80-positivas más que CTLA4Ig (Fig. 10A).
L104EA29YIg también es más eficaz CTLA4Ig en la inhibición de la
proliferación de células CHO tratadas con PMA
CD86-positivas (Fig. 10B). Por lo tanto, L104EA29YIg
en un inhibidor más potente de la coestimulación de las células T
mediada tanto por CD80- como CD86-.
La figura 11 muestra la inhibición por
L104EA29YIg y CTLA4Ig de células T humanas aloestimuladas con una
línea celular de linfoblastos B humanos (LCL) llamada PM que
expresó CD80 y CD86 (células T a 3,0 x 10^{4}/pocillo y PM a 8,0
\times 10^{3}/pocillo). La aloestimulación primaria se produjo
durante 6 días, después las células se pulsaron con
^{3}H-timidina durante 7 horas, antes se determinó
la incorporación de etiqueta radiactiva.
La aloestimulación secundaria se realizó como
sigue. Se recogieron las células T aloestimuladas primarias de
siete días sobre medio de separación de linfocitos (LSM) (ICN,
Aurora, OH) y se dejaron en reposo durante 24 horas. Las células T
después se volvieron a estimular (secundario), en la presencia de
cantidades ajustadas de CTLA4Ig o L104EA29YIg, mediante la adición
de PM en la misma relación que antes. La estimulación se produjo
durante 3 días, después las células se pulsaron con etiqueta
radiactiva y se recogieron como antes. El efecto de L104EA29YIg
sobre las células T aloestimulaads primarias se muestra en la Fig.
11A. El efecto de L104EA29YIg sobre las células T aloestimuladas
secundarias se muestra en la Fig. 11B. L104EA29YIg inhibe las
respuestas proliferativas de células T tanto primarias como
secundarias mejor que CTLA4Ig.
Para medir la producción de citoquina (Figura
12), se habilitaron placas de aloestimulación secundarias por
duplicado. Después de 3 días, se ensayaron medios de cultivo usando
kits ELISA (Biosource, Camarillo, CA) usando las condiciones
recomendadas por el fabricante. L104EA29YIg se encontró que era más
potente que CTLA4Ig en el bloqueo de la producción de citoquinas
IL-2, IL-4, y
\gamma-IFN de células T después del estímulo
alogénico secundario (Figs. 12A-C).
Los efectos de L104EA29YIg y CTLA4Ig en la
respuesta de linfocitos mixtos de mono (MLR) se muestran en la
Figura 13. Células mononucleares de sangre periférica (PBMC'S; 3,5
x 10^{4} células/pocillo de cada mono) de 2 monos se purificaron
sobre medio de separación de linfocitos (LSM) y se mezclaron con 2
\mug/ml de fitohemaglutinina (FA). Las células se estimularon 3
días después se pulsaron con etiqueta radiactiva 16 horas aantes de
la recogida. L104EA29YIg inhibía la proliferación de de las células
T mejor que CTLA4Ig.
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Este ejemplo proporciona una descripción de
pancreatectomía de donante y aislamiento de islotes, y
procedimientos de trasplante de islotes en un modelo animal.
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Animales. Monos rhesus machos
adolescentes criados en cautividad (Macaca mulatta) (\sim 4
- 20 kg) se usaron como receptores y donantes. La ausencia de
anticuerpos donante - específico preformado en el receptor se
confirmó antes del trasplante. Todos los donantes y receptores
potenciales se ensayaron para anticuerpos anti-CMV
y solamente los animales que eran seropositivos para CMV se usaron
como receptores.
Pancreatectomía y aislamiento de islotes de
donantes. La pancreatectomía del donante se realizó un día antes
del trasplante. El procedimiento se realizó bajo anestesia general
(una combinación de ketamina parenteral e isoflurano mediante
inhalación) mediante una incisión abdominal en la línea media. Se
dividieron los ligamentos esplenorrenales y esplenocólicos de
manera que se movilizó el bazo, conjuntamente con la cola del
páncreas. La cabecera del páncreas y segunda parte del duodeno se
movilizaron después de la maniobra de Kocher. Después de la
administración de heparina (200 U/kg), la aorta se canuló justo
antes de su bifurcación y el animal se exanguinó. La pasta fría se
colocó inmediatamente en el saco inferior y detrás del cuerpo del
páncreas. El cuerpo y el cuello del páncreas se escindieron
cuidadosamente mediante una disección aguda teniendo cuidado de no
violar la cápsula pancreática. El conducto biliar común, los
conductos pancreáticos principales y accesorios se identificaron y
se ligaron, la cabecera del páncreas se diseccionó de la segunda
parte del duodeno.
Se completó el aislamiento de los islotes de los
monos rhesus mediante modificaciones secundarias del procedimiento
automático para el aislamiento de islotes humanos (Ricordi, (1988)
Diabetes, 37: 413; Ranuncoli, (2000) Cell Transplant 9: 409) usando
Liberasa (Roche/Boehringer Mannheim, Indpls, IN) a una concentración
de 0,47 - 0,71 mg/ml. Se usaron gradiente Euroficoll discontinuo,
de tres fases (densidades 1,108, 1,097, 1,037; Meditech, Hemdon,
VA) y un procesador de células sanguíneas Cobe 2991. (Gambro,
Lakewood, CO) se usaron para purificación de islotes de la
digestión pancreática. Las muestras de la preparación de islotes
finales se tiñó con ditizona (Sigma, St. Louis, MO), y la
preparación se valoró mediante conteo del número del número de
islotes en cada uno de los siguientes intervalos de tamaño: 50 -
100, 100 - 150, 150 - 200, 200 - 250, 250 - 300, 300 - 350, y 350 -
400 \mum. Los datos se convirtieron matemáticamente para
determinar el número de islotes con un diámetro medio de 150\mum
y se expresaron como equivalentes de islotes (IEQ) (Ricordi C. et
al., Acta Diabetol Lat 27: 185 - 195, 1990).
Pancreatectomía y trasplante de las células
de los islotes intrahepáticos del receptor. La pancreatectomía
total, sin duodenoctomía o esplenoctomía, se realizó al menos una
semana antes del trasplante. La cola y cuerpo del páncreas se
diseccionaron junto con la arteria y vena esplénica, que se conservó
cuidadosamente mediante ligamiento y división de las ramas
pancreáticas solamente. Las venas mesentérica inferior y cólica
media se identificaron y se conservaron durante la disección del
cuerpo del páncreas. Las venas portal y mesentérica superior se
reconocieron y las venas pancreáticas se ligaron y se
dividieron.
Se movilizó el duodeno y las ramas de los vasos
pancreáticoduodenales que entran en el páncreas se ligaron y se
dividieron, dejando las ramas duodenales intactas. El conducto
biliar común se identificó y se conservó durante la disección roma
entre la cabecera del páncreas y el bucle c del duodeno. Los
conductos pancreáticos principales y accesorios se ligaron, se
dividieron, y se retiró el páncreas de la cavidad abdominal. Todos
los animales se sometieron a tolerancia a glucosa intravenosa para
evaluar la eficacia del procedimiento de pancreatectomía. Todas se
documentaron que eran negativas al péptido c antes del trasplante de
islotes.
Durante la noche los islotes cultivados se
lavaron en medio de trasplante, que consistía en medio RPMI 1640
(Mediatech) suplementado con 2,5% de albúmina sérica bovina, y se
contó para determinar el número de IEQ. Después los islotes se
sedimentaron y se volvieron a suspender en 20 ml de medio de
trasplante complementado con 200 unidades de heparina. El
trasplante de islotes intrahepáticos se realizó mediante drenaje
por gravedad de los islotes en un sigmoide o rama de la vena cólica
izquierda que drena en la vena portal a través de un catéter
intravenoso de calibre 22.
Control de glucosa en sangre, administración
de insulina, y definición de rechazo. Los niveles de glucosa en
sangre en ayunas y post-prandial se controlaron dos
veces al día (antes del desayuno y después de la comida) mediante
una picadura en al oreja, seguido de ensayo en sangre con un
glucometer elite (Bayer, Elkhart, IN). Se administró Insulina (NPH,
Ultralente; Eli Lilly, Indinapolis, IN) tres veces al día con la
intención de mantener la glucosa en sangre en ayunas en < 300
mg/dl en animales pancreatectomizados antes del trasplante o en
aquellos que habían rechazado sus trasplantes homólogos.
Grupos experimentales y protocolos
inmunosupresores. Se ensayaron dos protocolos de de tratamiento:
(1) protocolo Edmonton - que usa Tacrolimus, Sirolimus, y
anti-IL-2R mAb (Shapiro, A.M.J.
et al, (2000), N. Eng. J. Med., 343: 230 - 238) y (2)
L104EA29Y-protocolo Edmonton - que usa L104EA29YIg,
Sirolimus, y mAb anti-IL-2R. El
grupo de control incluyó receptores tratados con un régimen
inmunosupresor de base'' que tiene rapamicina y
anti-IL-2R solo. Tacrolimus se
proporcionó a 0,05 mg/kg dos veces al día POD 0 - 14 (niveles diana
5 - 8) y 0,06 mg/kg al día (niveles diana 3 - 5) POD 15 - 120.
L104EA29YIg se administró pro vía intravenosa en la operación (10
mg/kg) y después de la operación los días 4 (15 mg/kg), 14, 28, 42,
56, 70, 84, 98, 112, 126 (20 mg/kg) para mantener los niveles en
suero mayores que 30 \mug/ml. El mAb IL-2R
anti-humano quimérico (0,3 mg/kg iv), se administró
dentro de la operación y 4 POD. Sirolimus (Rapamune®) se administró
por vía oral 1,25 mg/kg dos veces al día (niveles diana 10 - 15)
POD 0 - 50, 1 mg/kg dos veces al día (niveles diana 7 - 10) POD 50
- 100, y después se redujo para terminar la dosificación por
POD130. Sirolimus (Rapamune®) y Tacrolimus (Prograf®) se compraron
en la Farmacia del Hospital de la Universidad de Emory. El mAb de
IL-2R anti-humano quimérico
(Simulect®) fue proporcionado por Novartis Farma AG (Basel,
Suiza).
Necropsia. Todos los receptores tuvieron
una necropsia completa realizada por el personal veterinario de
Yerkes en el momento de su muerte.
Detección de anticueropos antidonante. La
presencia de aloanticuerpo específico donante detectable se
determinó usando citometría de flujo. Los leucocitos de sangre
periférica sirvieron como las células diana para los análisis antes
del trasplante. Los leucocitos aislados de ganglios linfáticos
obtenidos en el momento de trasplante eran las células diana para
los ensayos después del trasplante.
Estadística. La supervivencia de los
injertos de islotes entre los injertos de islotes entre los grupos
experimentales se compara usando el ensayo
Mann-Whitaey-Wilcoxon (Armitage
et al. (1987) Statistical methods in Medical Research,
Blackwell Scientific Publication, Oxford).
Ensayo de inmunotransferencia unido a enzima
antidonante. Las respuestas se midieron mediante ensayo de
immunotransferencia unido a enzimas (ELISpot) de
interferon-\gamma (IFN-\gamma)
usando leucocitos de sangre periférica obtenidos a partir de
animales receptores y donantes. Un número igual de estimuladores
(leucocitos donantes) y respondedores (leucocitos receptores) se
añadieron a placas con fondo de éster celulosa (Millipore, Bedford,
MA) revestidas con el anticuerpo de captura,
IFN-\gamma anti-humano de ratón
(clon GZ-4; Mabtech, Suecia). Después de 14 - 16 h
de incubación, se añadió IFN-\gamma
anti-humano de ratón biotinilado (clon
7-B6-1; Mabtech, Suecia), se retiró
el anticuerpo no unido, y se añadió peroxidasa de rábano
picante-Avidina D (Vector, Burlingame, CA). Se
desarrollaron las manchas con
3-amino-9-etilcarbazol
(Sigma). Cada mancha representa una célula que secreta
IFN-\gamma; la frecuencia de estas células se
puede determinar dividiendo el número de manchas generadas por el
número total de células respondedoras sembradas.
La terapia basada en el bloqueo de la ruta de
CD28 prolonga la supervivencia de los trasplantes homólogos ten
macacos Rhesus. Se indujo diabetes mediante pancreatectomía
quirúrgica de animales receptores y se confirmó mediante ensayo de
tolerancia a glucosa intravenosa antes del trasplante. Las parejas
donantes - receptor se definieron basándose en la tipificación
molecular usando un panel de alelos de histocompatibilidad principal
definidos anteriormente (8 clases I y 12 clases II) (Lobashevsky A,
et al., Tissue Antigens 54:254 - 263, (1999); Knapp LA,
et al., Tissue Antigens 50: 657 - 661, (1997); Watkins D.L,
Crit Rev Immunol 15: 1 - 29, (1995)). Las parejas maximizaron
disparidad a ambos loci de las clases I y II. Se definió el rechazo
como dos valores consecutivos de glucosa en sangre en ayunas
>125 mg/dl en días posteriores. La infusión intraportal de
islotes de trasplantes homólogos (>10,000 IEQ/Kg) dio como
resultado una restauración inicial de euglicemia e independencia de
insulina en monos diabéticos en ambos grupos.
El tratamiento de macacos pancreatectomizados
con régimen de
L104EA29YIg/Rapamicina/anti-1L-2R
mAb prolongaba significativamente la supervivencia de los
trasplantes homólogos de islotes (204, 190, 216, >220 y 56 días,
respectivamente). Los animales que recibían el régimen de
L104EA29YIg/Rapamicina/anti-IL-2R
dio como resultado un control adecuado de glucosa como se indica
por los niveles de glucosa en sangre (Figuras 5 y 16B). Además,
estos animales no requerían terapia de reemplazo de insulina durante
un período de tiempo significativamente prolongado (Figura 6). Por
el contrario, los animales que recibían el régimen de base solo
(Rapamicina/mAb anti-IL-2R)
rechazaron los islotes trasplantados en una semana (Figura 16C). Los
animales de control mostraron niveles significativamente elevados
de glucosa en plasma en ayunas (Figuras 5). Además, los animales de
control requirieron terapia de reemplazo de insulina en una semana
de trasplante de islotes (Figura 6). Cuatro de los cinco animales
que recibieron el régimen L104EA29YIg tuvieron supervivencia sin
rechazo durante el período de tratamiento (Tabla III). El ensayo de
tolerancia de glucosa intravenosa con medición de los niveles de
insulina y glucosa en sangre confirmó la función de los islotes
después de trasplante (animal representativo, Figuras 7 y 16D).
A los 100 días después del trasplante, la
dosificación de rapamicina disminuyó y se redujo a cero el día 121.
Los animales continuaron manteniendo la insulino dependencia
mientras se recibía monoterapia de L104EA29YIg. A \sim150 días
después del trasplante, los receptores de los islotes remanentes
recibían su dosis final de L104EA29YIg, cesando cualquier terapia
de inmunosupresor.
Como se espera, \sim 1 - 2 meses después de la
descontinuación de la terapia, los receptores se volvieron
hiperglicémicos y requirieron terapia de insulina exógena. El
análisis histológico reveló un infiltrado mononuclear, que sugería
en gran medida el rechazo como la etiología de la pérdida de control
de glucosa (Figura 17). En un ensayo de tolerancia a glucosa
intravenosa, los animales de ensayo que recibían régimen
L104EA29YIg/Rapamicina/anti-IL-2R
mAb demostraron niveles normales de glucosa después del trasplante
de islotes (Figuras 7 y 16D).
La frecuencia de células que producen
IFN-\gamma anti-donante se detectó
mediante ensayo de ELISpot y se analizó usando un sistema de
formación de imágenes de inmunotransferencia. Los animales que
recibían el régimen inmunosupresor de base demostró números
aumentados significativamente de células T que producen IFN\gamma
reactivos al donante (células 84t4.6), mientras que los animales
que recibían el régimen de L104EA29YIg no tenía respuesta
detectable (2 \pm 0,56 células).
La terapia de L104EA29YIg inhibe el cebado de
las respuestas de células T y B anti-donante.
La frecuencia de células T alo-reactivas cebadas
Tse pueden detector de manera eficaz usando el ensayo ELISpot, que
puede discriminar la producción de IFN-\gamma a
nivel de una sola célula. Muestras de sangre periférica de los
receptores de islotes se analizaron en diversos momentos tanto antes
como después del trasplante para determinar su capacidad de generar
IFN-\gamma en respuesta al antígeno del donante.
Los animales tratados con el régimen de base solo desarrollaron
rápidamente una respuesta que se puede medir
anti-donante que coincidía con el rechazo 1 semana
después del trasplante. Por el contrario, la frecuencia de células
que producen IFN-\gamma
anti-donante en animales que reciben el régimen que
contiene L104EA29YIg era indetectable hasta que se retiró la
terapia (los animales representativos, Figura 18A y B). De este
modo, el régimen de L104EA29YIg bloqueaba eficazmente la generación
de las respuestas de células T anti-donante como
se mide por la capacidad de producir
IFN-\gamma.
Se usó la citometría de flujo para examinar el
desarrollo de respuestas de anticuerpo
anti-donante. un animal dentro del grupo de control
una fuerte respuesta de Ab anti-donante Ab,
mientras que el otro no desarrollaba una respuesta detectable,
presumiblemente debido a que se sacrificaron antes de que la
respuesta del anticuerpo se pudiera medir para desarrollar una
respuesta detectable (Figura 18C). Por el contrario, cuatro de los
cinco animales no generaron una respuesta de anticuerpo mientras
recibía la terapia de L104EA29YIg. Esto es consistente con los
resultados reseñados previamente que usan CTLA4-Ig
en un modelo de trasplante de islotes (Levisetti, M.G. et
al., J Immunol 159: 5187 - 5191, 1997) así como nuestra
experiencia en un modelo de trasplante homólogo de riñón donde los
receptores no generaron anticuerpos anti-donante
(Pearsow T, ET AL., (Resumen). En los Programas y Resúmenes
de la 17ª Conferencia Anual de la Sociedad Americana de Médicos de
Trasplantes, Chicago, 10 - 14 de mayo de 1997. Chicago, Sociedad
Americana de Médicos de Trasplantes). Un animal de cinco receptores
experimentaron un episodio de rechazo mientras que recibía la
terapia de L104EA29YIg y posteriormente desarrolló una respuesta de
anticuerpo anti-donante. Como se esperaba, los
cuatro animales restantes que recibían el régimen de L104EA29YIg
desarrollaron de manera consistente respuestas de anticuerpo
anti-donante aproximadamente en el momento del
rechazo (\sim 200 días después del trasplante, 50 días después de
la dosis final de L104EA29YIg).
El trasplante de islotes se hace rápidamente una
opción de tratamiento viable para pacientes con diabetes de tipo 1
frágil. Las reseñas recientes que describen los regímenes
inmunosupresores sin esteroides, que dan como resultado una
insulina independencia exitosa después del trasplante de islotes,
han introducido un renovado optimismo para la aplicación práctica
del trasplante de islotes. Mientras que la eliminación de
glucocorticoides de regímenes inmunosupresores representa una etapa
principal hacia delante en el esfuerzo para tratar la diabetes de
tipo 1, la dependencia de la terapia del inhibidor de calcineurina
para la inmunosupresión primaria puede limitar la aplicación de
esta planteamiento. Los inhibidores de calcineurina tienen numerosos
efectos secundarios no deseados, incluyendo nefrotoxicidad,
diabetes, hipertensión, metabolismo de lípidos alterado, e
hirusitismo (Kahan B.D. et al., N Engl J Med 321: 1725 -
1738, 1989; Group TUSMFLS: A comparison of tacrolimus (FK 506) and
cyclosporine for immunosuppression in liver transplantation: the
U.S. Multicenter FK506 Liver Study Group. N Engl J Med 331:1110 -
1115, 1994; de Mattos AM et al., Am J Kidney Disease 35: 333
- 346, 2000). Incluso cuando los niveles de fármaco se mantienen
bajos, se pueden desarrollar efectos secundarios significativos.
Esto es particularmente verdad en la población de pacientes
diabéticos cuando la función renal ya puede estar alterada. De
hecho, en las reseñas más recientes de Edmonton, dos pacientes con
niveles de creatinina antes del trasplante ligeramente elevados
tenían disminuciones significativas en la función renal aunque la
terapia de inhibidor de calcineurina y por último se requería la
retirada de este fármaco (Ryan E.A., et al., Diabetes 50:
710 - 719, 2001). En la misma reseña, dos tercios de los receptores
desarrollaron algún grado de intolerancia a glucosa, desarrollando
un cuarto diabetes franca después del trasplante que se pensó que
estaba relacionado con el uso de tacrolimus. Esto subraya la
naturaleza atrayente y esencial de un régimen inmunosupresor sin
inhibidor de calcineurina, particularmente para el trasplante de
islotes.
El bloqueo de las rutas coestimuladoras de las
células T es una estrategia prometedora para el desarrollo de
regímenes inmunosupresores y potencialmente tolerogénicos. Este
planteamiento dirige a las células T que reciben la "señal 1"
durante el período de administración de fármacos. Por ejemplo, el
tratamiento durante el período después del trasplante se cree que
hace a las células T aloespecíficas impotentes tras encontrarse con
el nuevo órgano o tejido, mientras que otras células se quedan
inalteradas (Li Y, et al., Nat Med 5:1298 - 1302, 1999). El
bloqueo de la ruta CD28B7 ha demostrado ser prometedor notablemente
en modelos experimentales de autoinmunidad y trasplante, haciéndolo
una diana inmunosupresora particularmente atrayente en el trasplante
de islotes, donde presumiblemente existen obstáculos tanto auto-
como alo-inmunes. El potencial del bloqueo de CD28
en un modelo de trasplante animal de islotes se describió por
Levisetti MG, et al., (J Immunol 159: 5187 - 5191, 1997). El
tratamiento con CTLA4-Ig se encontró que prolonga de
manera significativa, aunque modestamente la supervivencia del
trasplante homólogo de islotes en primates no humanos (Levisetti
MG, et al., J Immunol 159: 5187 - 5191, 1997). La
monoterapia de CTLA4-Ig prolongaba poco la
supervivencia de trasplante homólogo renal (Pearson T. et
al., (Resumen). En Programas y Resúmenes. De la 17ª Conferencia
Anual de la Sociedad Americana de Médicos de Trasplantes, Chicago,
10 - 14 de mayo de 1997. Chicago, Sociedad Americana de
Médicos de Trasplantes). Recientemente, existen varias reseñas de
supervivencia a largo plazo de trasplantes homólogos de islotes en
modelos de primates no humanos. La terapia con mAb
anti-CD40L ha mostrado los resultados más
impresionantes hasta ahora; sin embargo, de manera similar a los
experimentos que usan un modelo de trasplante renal, no se logró
tolerancia, como la retirada de la terapia eventualmente dio como
resultado el rechazo (Kenyon, N.S. et al., Proc. Natl. Acad.
Sci. USA 96: 8132 - 8137 (1999); Kirk, A.D., et al., Nat.
Med. 5, 686 - 693 (1999). EN otra reseña alentadora, Thomas et
al. (Diabetes 50: 1227 - 1236, (2001)) describieron
recientemente el uso de una inmunotoxina anti-CD3 y
el agente modulador inmune DSG (15 deoxispergualina) para prolongar
notablemente la supervivencia de islotes en los primates con
diabetes inducida por estreptozotocina. Aunque prometedoras, estas
reseñas, usaron agentes terapéuticos cuyo potencial clínico en el
momento presente es todavía incierto.
Los datos in vivo que usan L104EA29YIg,
una forma mutante de CTLA4-Ig, en el modelo de
injerto homólogo de islotes de Rhesus es consistente con la
evidencia in vitro que indica que esta molécula de segunda
generación es un inhibidor más potente de las respuestas de las
células T que la molécula precursora. Dado que
CTLA4-Ig ha mostrado ya eficacia en un ensayo
clínico de pacientes de psoriasis (Abrams, J.R. et al., J.
Clin. Invest. 103: 1243 -
1252 (1999)), existe un entusiasmo significativo para el ensayo que usa L104EA29YIg como el inminosupersor primario. Es claramente evidente, si no sinérgico, con agentes inmunosupresores aprobados clínicamente (anti-IL-2R mAb y rapamicina) que facilita el diseño de ensayos clínicos. Los ensayos humanos iniciales con L104EA29YIg están ya en proceso en pacientes aquejados de artritis reumatoide y los sometidos a trasplante renal. Aunque uan directa comparación del protocolo basado en tacrolimus y el régimen de L104EA29YIg no se intentó debido a las toxicidades reseñadas intolerables en primates no humanos (Montgomery, S.P., et al., Am J. Transplant 1 (Suppl. 1):438, 2001), los resultados de los inventores sugieren que L104EA29YIg tiene el potencial de ser al menos tan eficaz como tacrolimus como inmunosupresor primario.
1252 (1999)), existe un entusiasmo significativo para el ensayo que usa L104EA29YIg como el inminosupersor primario. Es claramente evidente, si no sinérgico, con agentes inmunosupresores aprobados clínicamente (anti-IL-2R mAb y rapamicina) que facilita el diseño de ensayos clínicos. Los ensayos humanos iniciales con L104EA29YIg están ya en proceso en pacientes aquejados de artritis reumatoide y los sometidos a trasplante renal. Aunque uan directa comparación del protocolo basado en tacrolimus y el régimen de L104EA29YIg no se intentó debido a las toxicidades reseñadas intolerables en primates no humanos (Montgomery, S.P., et al., Am J. Transplant 1 (Suppl. 1):438, 2001), los resultados de los inventores sugieren que L104EA29YIg tiene el potencial de ser al menos tan eficaz como tacrolimus como inmunosupresor primario.
Se describe un régimen inmunosupresor sin
inhibidor/esteroide que proporciona protección significativa del
rechazo y prolonga la supervivencia de de los trasplantes homólogos
de islotes en primates no humanos. El agente biológico L104EA29YIg
es un potente inmunosupresor. L104EA29YIg puede reemplazar
Tacrolimus en el protocolo Edmonton, eliminando por lo tanto los
efectos secundarios no deseados del inhibidor de calcineurina.
Como será evidente para los expertos en la
técnica a la que la invención pertenece, la presente invención
puede ser realizada en las formas diferentes de las descritas
específicamente anteriormente sin salirse de las características
esenciales de la invención. Las realizaciones particulares de la
invención descritas anteriormente, por lo tanto, se han de
considerar como ilustrativas y no restrictivas. El alcance de la
presente invención es como se establece en las reivindicaciones
anexas en lugar de estar limitado a los ejemplos contenidos en la
descripción anterior.
<110> Bristol-Myers Squibb
Company
\vskip0.400000\baselineskip
<120> PROCEDIMIENTOS PARA PROTEGER
TRANSPLANTES DE ISLOTES ALOGÉNICOS USANDO MOLÉCULAS MUTANTES
SOLUBLES CTLA4
\vskip0.400000\baselineskip
<130> M/44335-EP
\vskip0.400000\baselineskip
<140> 02734556.0
\vskip0.400000\baselineskip
<141>
2002-05-23
\vskip0.400000\baselineskip
<150> 60/293,402
\vskip0.400000\baselineskip
<151>
2001-05-23
\vskip0.400000\baselineskip
<160> 18
\vskip0.400000\baselineskip
<170> PatentIn version 3.1
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 1
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 636
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 1
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 2
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 212
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 2
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 3
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 1152
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la secuencia
artificial: secuencia de CTLA4Ig
\newpage
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<210> 4
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 383
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
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<213> Secuencia artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la secuencia
artificial: secuencia de CTLA4Ig
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<400> 4
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<210> 5
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<211> 1152
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<212> ADN
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<213> Secuencia artificial
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<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la secuencia
artificial: secuencia de L104EA29YIg
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<212> PRT
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<213> Secuencia artificial
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<223> Descripción de la secuencia
artificial: secuencia de L104EA29YIg
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<212> ADN
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<213> Secuencia artificial
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<220>
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<212> PRT
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<213> Secuencia artificial
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<220>
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<223> Descripción de la secuencia
artificial: secuencia de L104EIg
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<213> Secuencia artificial
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<212> PRT
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<213> Secuencia artificial
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<220>
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<223> Descripción de la secuencia
artificial: secuencia de L104EA29LIg
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<212> ADN
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<213> Secuencia artificial
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<220>
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<223> Descripción de la secuencia
artificial: secuencia de L104EA29TIg
\newpage
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<211> 383
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<212> PRT
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<213> Secuencia artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la secuencia
artificial: secuencia de L104EA29TIg
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<210> 13
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<211> 1152
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la secuencia
artificial: secuencia de L104EA29WIg
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 13
\vskip1.000000\baselineskip
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 14
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 383
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la secuencia
artificial: secuencia de L104EA29WIg
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 14
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 15
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 1152
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la secuencia
artificial: secuencia de CTLA4Ig
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 15
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 16
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 383
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la secuencia
artificial: secuencia de CTLA4Ig
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 16
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 17
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 41
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la secuencia
artificial: cebador directo de Oncostatina M CTLA4 (OMCTLA4)
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 17
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipgaggtgataa agcttcacca atgggtgtac tgctcacaca g
\hfill41
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 18
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 42
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la secuencia
artificial: cebador inverso de Oncostatina M CTLA4 (OMCTLA4)
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 18
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipgtggtgtatt ggtctagatc aatcagaatc tgggcacggt tc
\hfill42
Claims (34)
1. Uso de una molécula mutante de CTLA4 soluble
en la fabricación de un medicamento para inhibir el rechazo de
trasplante de células de islotes, en el que la molécula mutante de
CTLA4 soluble comprende dominio extracelular mutado de CTLA4,
teniendo el dominio extracelular mutado de CTLA4
a) una secuencia de aminoácidos que comienza con
metionina en la posición +1 y termina con ácido aspártico en la
posición +124 como se muestra en la Figura 3. o que comienza con
alanina en la posición -1 y termina con ácido aspártico en la
posición +124 como se muestra en la Figura 3;
b) una secuencia de aminoácidos que comienza con
metionina en la posición +1 y termina con ácido aspártico en la
posición +124 como se muestra en la Figura 19, o que comienza con
alanina en la posición -1 y termina con ácido aspártico en la
posición +124 como se muestra en la Figura 19;
c) una secuencia de aminoácidos que comienza con
metionina en la posición +1 y termina con ácido aspártico en la
posición +124 como se muestra en la Figura 20, o que comienza con
alanina en la posición -1 y termina con ácido aspártico en la
posición +124 como se muestra en la Figura 20;
d) una secuencia de aminoácidos que comienza con
metionina en la posición +1 y termina con ácido aspártico en la
posición +124 como se muestra en la Figura 21, o que comienza con
alanina en la posición -1 y termina con ácido aspártico en la
posición +124 como se muestra en la Figura 21; o
e) una secuencia de aminoácidos que comienza con
metionina en la posición +1 y termina con ácido aspártico en la
posición +124 como se muestra en la Figura 22, o que comienza con
alanina en la posición -1 y termina con ácido aspártico en la
posición +124 como se muestra en la Figura 22.
\vskip1.000000\baselineskip
2. El uso de acuerdo con la reivindicación 1, en
el que el trasplante de las células de los islotes es para tratar
diabetes.
3. El uso de acuerdo con la reivindicación 2, en
el que diabetes es diabetes de tipo 1 o diabetes de tipo 2.
4. El uso de acuerdo con una cualquiera de las
reivindicaciones precedentes, en el que el trasplante de las
células de los islotes comprende células de islotes
encapsuladas.
5. El uso de acuerdo con una cualquiera de las
reivindicaciones precedentes, donde la inhibición del rechazo del
trasplante de células de islotes comprende la administración de la
molécula mutante de CTLA4 soluble antes, durante o después
trasplante de células de islotes.
6. El uso de acuerdo con una cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 5, en el que el dominio extracelular está
condensado a un resto no-CTLA4.
7. El uso de acuerdo con la reivindicación 6, en
el que el resto no-CTLA4 comprende un resto de
inmunoglobulina.
8. El uso de acuerdo con la reivindicación 7, en
el que el resto de inmunoglobulina es una región constante de
inmunoglobulina o su parte.
9. El uso de acuerdo con la reivindicación 8, en
el que la región constante de inmunoglobulina o su parte comprende
una o más mutaciones para reducir la función efectora.
10. El uso de acuerdo con la reivindicación 8 o
9, en el que la región constante de inmunoglobulina comprende las
regiones bisagra, CH2 y CH3 de una molécula de inmunoglobulina.
11. El uso de acuerdo con una cualquiera de las
reivindicaciones 8 to 10, en el que la región constante de
inmunoglobulina o su parte es una región constante de
inmunoglobulina humana o de mono.
12. El uso de acuerdo con una cualquiera de las
reivindicaciones precedentes, en el que la molécula mutante de
CTLA4 soluble es:
a) L104EA29YIg como se muestra en la Figura 3
que comienza con Ala en la posición -1 o Met en la posición +1 y
que termina con Lys en la posición +357 (SEQ ID NO:6, que comienza
con Ala en la posición 26 y que termina con Lys en la posición 383,
o que comienza con Met en la posición 27 y que termina con Lys en la
posición 383);
b) L104EIg como se muestra en la Figura 19 que
comienza con Ala en la posición -1 o Met en la posición +1 y que
termina con Lys en la posición +357 (SEQ ID NO:8, que comienza con
Ala en la posición 26 y que termina con Lys en la posición 383, o
que comienza con Met en la posición 27 y que termina con Lys en la
posición 383);
c) L104EA29LIg como se muestra en la Figura 20
que comienza con Ala en la posición -1 o Met en la posición +1 y
que termina con Lys en la posición +357 (SEQ ID NO: 10, que comienza
con Ala en la posición 26 y que termina con Lys en la posición 383,
o que comienza con Met en la posición 27 y que termina con Lys en la
posición 383);
d) L104EA29TIg como se muestra en la Figura 21
que comienza con Ala en la posición -1 o Met en la posición +1 y
que termina con Lys en la posición +357 (SEQ ID NO:12, que comienza
con Ala en la posición 26 y que termina con Lys en la posición 383,
o que comienza con Met en la posición 27 y que termina con Lys en la
posición 383; o
e) L104EA29WIg como se muestra en la Figura 22
que comienza con Ala en la posición -1 o Met en la posición +1 y
que termina con Lys en la posición +357 (SEQ ID NO:14, que comienza
con Ala en la posición 26 y que termina con Lys en la posición 383,
o que comienza con Met en la posición 27 y que termina con Lys en la
posición 383).
\vskip1.000000\baselineskip
13. El uso de acuerdo con una cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 12, en el que la molécula mutante de CTLA4
soluble se usa en combinación con al menos un compuesto adicional
que se selecciona entre el grupo constituido por compuestos
inmunosupresores, compuestos inmunomoduladores y compuestos
anti-inflammatorios.
14. El uso de acuerdo con la reivindicación 13,
en el que el compuesto se selecciona entre el grupo constituido por
anakinra, adrenocorticosteroides, azatioprina, basiliximab,
inhibidores de calcineurina, cloroquina, corticosteroides,
ciclosporina, prednisona, ciclofosfamida, citoxan,
15-deoxispergualina y sus análogos,
D-penicilamina, etanercept, acetato de glatiramer,
FTY720 y sus análogos, glucocorticoides, sales de oro, globulina de
timocitos anti-humana de caballo (ATGAM),
anti-TAC (HAT) humanizado, hidroxicloroquina,
infliximab, interferón beta-1a, interferón
beta-1b, leflunomida y sus análogos, globulina
inmune de linfocitos, agentes buscadores de linfocitos, metoxsalen,
metotrexato, clorhidrato de mitoxantrona, ácido micofenólico,
micofenolato mofetil, mizoribina, NSAIDs, globulina de timocitos
anti-humano de conejo, globulina inmune Rho (D),
sirolismus (rapamicina) y sus derivados (por ejemplo
40-0-(2-hidroxi)etilrapamicina),
sulfasalazopirina, sulfasalzinae, tacrolismus
(FK-506), talidomida, bloqueadores de TNF\alpha y
agentes biológicos que que dirigen una citoquina inflamatoria,
inhibidores TOR, compuestos que interfieren con CD40 y CD154, gp39
soluble, CD29 soluble, CD40 soluble, CD80 soluble (por ejemplo ATCC
68627), CD86 soluble, CD28 soluble, CD56 soluble,
Thy-1 soluble, CD3 soluble, TCR soluble,
VLA-4 soluble, VCAM-1 soluble,
LECAM-1 soluble, ELAM-1 soluble,
CD44 soluble, anticuerpos reactivos con gp39 (por ejemplo ATCC
HB-10916, ATCC HB-12055 y ATCC
HB-12056), anticuerpos reactivos con CD40 (por
ejemplo ATCC HB-9110), anticuerpos reactivos con B7
(por ejemplo ATCC HB-253, ATCC
CRL-2223, ATCC CRL-2226, ATCC
HB-301, ATCC HB-11341), anticuerpos
reactivos con CD28 (por ejemplo ATCC HB-11944 o mAb
9.3), anticuerpos reactivos con LFA-1 (por ejemplo
ATCC HB-9579 y ATCC TIB-213),
anticuerpos reactivos con LFA-2, anticuerpos
reactivos con IL-2, anticuerpos reactivos con
IL-12, anticuerpos reactivos con
IFN-gamma, anticuerpos reactivos con CD2,
anticuerpos reactivos con CD48, anticuerpos reactivos con cualquier
ICAM (por ejemplo, con ICAM-1 (ATCC
CRL-2252), ICAM-2 y
ICAM-3), anticuerpos reactivos con CTLA4 (por
ejemplo ATCC HB-304), anticuerpos reactivos con
Thy-1, anticuerpos reactivos con CD56, anticuerpos
reactivos con CD3, anticuerpos reactivos con CD29, anticuerpos
reactivos con TCR, anticuerpos reactivos con VLA-4,
anticuerpos reactivos con VCAM-1, anticuerpos
reactivos con LECAM-1, anticuerpos reactivos con
ELAM-1, anticuerpos reactivos con CD44, anticuerpos
monoclonales a receptores de leucocitos, por ejemplo MHC, CD2, CD3,
CD4, CDIIa/CD18, CD7, CD25, CD27, B7, CD40, CD45, CD58, CD137, ICOS,
CD150 (SLAM), OX40, 4-1BB o sus ligandos,
CTLA4/CD28-Ig; antagonistas de
LFA-1, antagonistas de selectina y antagonistas de
VLA-4 y mAbs de IL-2R
anti-humanos.
15. El uso de acuerdo con la reivindicación 13 o
14, en el que la molécula mutante de CTLA4 soluble y el compuesto
adicional se han de administrar conjuntamente.
16. El uso de acuerdo con la reivindicación 15,
en el que la molécula mutante de CTLA4 soluble y el compuesto
adicional se han de administrar de manera simultánea o en
secuencia.
17. El uso de acuerdo con una cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 12, en el que la inhibición del rechazo de
trasplante de células de islotes comprende un régimen inmunosupresor
adicional.
18. El uso de acuerdo con la reivindicación 17,
en el que el régimen inmunosupresor adicional es sin
glucocorticoide.
19. El uso de acuerdo con la reivindicación 17,
en el que el régimen inmunosupresor adicional comprende un
corticosteroide.
20. El uso de acuerdo con una cualquiera de las
reivindicaciones 17 a 19, en el que el régimen inmunosupresor
adicional es calcineurina sin inhibidor.
21. El uso de acuerdo con una cualquiera de las
reivindicaciones 17 a 20, en el que el régimen inmunosupresor
adicional comprende uno o más compuestos de la reivindicación
14.
22. El uso de acuerdo con una cualquiera de las
reivindicaciones 17 a 21, en el que el régimen inmunosupresor
adicional comprende un inhibidor TOR y/o un agente biológico que
dirige IL-2.
23. El uso de acuerdo con la reivindicación 22,
en el que el inhibidor TOR es rapamicina (sirolismus) o su
derivado.
24. El uso de acuerdo con la reivindicación 22,
en el que el agente biológico que dirige un IL-2 es
un anticuerpo reactivo con IL-2 o un mAb
IL-2R antihumano.
25. El uso de acuerdo con la reivindicación 24,
en el que el mAb IL-2R antihumano es
basiliximab.
26. El uso de acuerdo con una cualquiera de las
reivindicaciones 17 a 25, en el que el régimen inmunosupresor
adicional comprende ácido micofenólico o micofenolato mofetil.
27. El uso de acuerdo con la reivindicación 16,
en el que el régimen inmunosupresor adicional comprende un
compuesto que interfiere con la unión de CD40 a CD154.
28. El uso de acuerdo con la reivindicación 27,
en el que el compuesto que interfiere con la unión de CD40 a CD154
es un anticuerpo anti-CD40.
29. El uso de acuerdo con la reivindicación 27,
en el que el compuesto que interfiere con la unión de CD40 a CD154
es un anticuerpo anti-CD154.
30. El uso de acuerdo con una cualquiera de las
reivindicaciones precedentes, en el que el rechazo de trasplante de
las células de los islotes comprende la administración de células
de médula ósea agotada de células T.
31. El uso de acuerdo con la reivindicación 30,
en el que la administración de células de médula ósea agotada de
células T es a aproximadamente al mismo tiempo que la colocación del
trasplante de células de islotes.
32. El uso de acuerdo con la reivindicación 30,
en el que la administración de células de médula ósea agotada de
células T es anterior a la colocación del trasplante de células de
islotes.
33. El uso de acuerdo con una cualquiera de las
reivindicaciones 30 a 32, en el que la administración de células de
médula ósea agotada de células T comprende una primera dosis y una
segunda dosis.
34. Una molécula mutante de CTLA4 soluble para
uso en un procedimiento de inhibición del rechazo de trasplante de
células de islotes, en el que la molécula mutante de CTLA4 soluble
comprende un dominio extracelular mutado de CTLA4, teniendo el
dominio extracelular mutado de CTLA4
a) una secuencia de aminoácidos que comienza con
metionina en la posición +1 y termina con ácido aspártico en la
posición +124 como se muestra en la Figura 3, o que comienza con
alanina en la posición -1 y termina con ácido aspártico en la
posición +124 como se muestra en la Figura 3;
b) una secuencia de aminoácidos que comienza con
metionina en la posición +1 y termina con ácido aspártico en la
posición +124 como se muestra en la Figura 19, o que comienza con
alanina en la posición -1 y termina con ácido aspártico en la
posición +124 como se muestra en la Figura 19;
c) una secuencia de aminoácidos que comienza con
metionina en la posición +1 y termina con ácido aspártico en la
posición +124 como se muestra en la Figura 20, o que comienza con
alanina en la posición -1 y termina con ácido aspártico en la
posición +124 como se muestra en la Figura 20;
d) una secuencia de aminoácidos que comienza con
metionina en la posición +1 y termina con ácido aspártico en la
posición +124 como se muestra en la Figura 21, o que comienza con
alanina en la posición -1 y termina con ácido aspártico en la
posición +124 como se muestra en la Figura 21; or
e) una secuencia de aminoácidos que comienza con
metionina en la posición +1 y termina con ácido aspártico en la
posición +124 como se muestra en la Figura 22, o que comienza con
alanina en la posición -1 y termina con ácido aspártico en la
posición +124 como se muestra en la Figura 22.
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