ES2225549T3 - Modeculas de ctla4 solubles mutantes y usos de las mismas. - Google Patents

Abstract

Una molécula mutante de CTLA4 que comprende una secuencia de aminoácidos que comienza por metionina en la posición +1 y termina con ácido aspártico en la posición +124 tal como se muestra en la Figura 7, o que comienza por alanina en la posición -1 y termina con ácido aspártico en la posición +124 tal como se muestra en la Figura 7.

Description

Moléculas CTLA4 solubles mutantes y uso de las mismas.

La presente invención se refiere al campo de las moléculas de CTLA4 solubles que están mutadas a partir de CTLA4 natural para mantener la capacidad de unirse a CD80 y/o CD86.

Antecedentes de la invención

Las interacciones intercelulares no específicas de antígeno entre los linfocitos T y las células presentadoras de antígeno (APC) generan señales coestimuladoras de linfocitos T que generan respuestas de linfocitos T a los antígenos (Jenkins and Johnson (1993) Curr. Opin. Immunol. 5: 361-367). Las señales coestimuladoras determinan la magnitud de una respuesta de linfocitos T al antígeno y si esta respuesta activa o inactiva respuestas subsiguientes al antígeno (Mueller y cols. (1989) Annu. Rev. Immunol. 7: 445-480).

La activación de los linfocitos T en ausencia de coestimulación da como resultado una respuesta de linfocitos T abortada o anérgica (Schwartz, R.H. (1992) Cell 71: 1065-1068). Una señal coestimuladora clave es proporcionada por la interacción del receptor de superficie CD28 de los linfocitos T y las moléculas relacionadas con B7-2 de las células presentadoras de antígeno (por ejemplo, también conocidas como B7-1 y B7-2 o CD80 y CD86, respectivamente) (P. Linsley y J. Ledbetter (1993) Annu. Rev. Immunol. 11: 191-212).

La molécula que ahora se conoce como CD80 (B7-1) se describió originariamente como un antígeno de activación asociado a linfocitos B humanos (Yokochi, T. y cols. (1981) J. Immunol. 128: 823-827; Freeman, G.J. y cols. (1989) J. Immunol. 143: 2714-2722) y subsiguientemente se identificó como un contrarreceptor para las moléculas CD28 y CTLA4 de los linfocitos T (Linsley, P. y cols., (1990) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87: 5031-5035; Linsley, P.S. y cols. (1991a) J. Exp. Med. 173: 721-730; Linsley, P.S. y cols. (1991b) J. Exp. Med. 174: 561-570).

Más recientemente se ha identificado otro contrarreceptor para CTLA4 en las células presentadoras de antígeno (Azuma, N. y cols. (1993) Nature 366: 76-79; Freeman (1993a) Science 262: 909-911; Freeman, G.J. y cols (1993b) J. Exp. Med. 178: 2185-2192; Hathcock, K.L.S., y cols., (1994) J. Exp. Med. 180: 631-640; Lenschow, D.J. y cols., (1993) Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90: 11054-11058; Ravi-Wolf, Z. Y cols., (1993) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90: 11182-11186; Wu, Y. y cols. (1993) J. Exp. Med. 178: 1789-1793). Esta molécula, que ahora se conoce como CD86 (Caux, C. y cols. (1994) J. Exp. Med. 180: 1841-1848), pero también denominada R7-0 (Azuma y cols. (1993), referencia anterior) o B7-2 (Freeman y cols. (1993a) referencia anterior), comparte aproximadamente el 25% de la identidad de las secuencias con CD80 en su región extracelular (Azuma y cols., (1993), referencia anterior; Freeman y cols., (1993a), referencia anterior, (1993b), referencia anterior). Las células transfectadas con CD86 desencadenan respuestas de linfocitos T mediadas por CD28 (Azuma y cols., (1993), referencia anterior; Freeman y cols., (1993a), (1993b), referencia anterior).

Las comparaciones de expresión de CD80 y CD86 han sido objeto de varios estudios (Azuma y cols. (1993), referencia anterior; Hathcock y cols., (1994) referencia anterior; Larsen, C.P. y cols. (1994) J. Immunol. 152: 5208-5219; Stack, R.M., y cols. (1994), J. Immunol. 152: 5723-5733). Los datos actuales indican que la expresión de CD80 y CD86 se regulan de forma diferente y sugieren que la expresión de CD86 tiende a preceder a la expresión de CD80 durante una respuesta inmunitaria.

Se han construido formas solubles de CD28 y CTLA4 fusionando dominios extracelulares tipo (v) variables de CD28 y CTLA4 con dominios constantes de inmunoglobulinas (Ig) dando como resultado CD28Ig y CTLA4Ig (documentos US-A-5.434.131 y US-A-5.851.795). CTLA4Ig se une tanto a las células que son positivas para CD80 como a las que son positivas para CD86 con más fuerza que CD28Ig (Linsley, P. y cols. (1994) Immunity 1: 793-80). Muchas respuestas inmunitarias dependientes de linfocitos T son bloqueadas por CTLA4Ig tanto in vitro como in vivo. (Linsley, y cols., (1991b), referencia anterior; Linsley P.S. y cols., (1992a) Science 257: 792-795; Linsley, P.S. y cols., (1992b) J. Exp. Med. 176: 1595-1604; Lenschow, D.J. y cols. (1992), Science 257: 789-792; Tan, P. y cols., (1992) J. Exp. Med. 177: 165-173; Turka, L.A., (1992) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89: 11102-11105).

Peach y cols. (J. Exp. Med. (1994) 180: 2049-2058) identificaron las regiones del dominio extracelular de CTLA4 que son importantes para una unión fuerte a C80. Específicamente, se identificó un motivo hexapeptídico (MYPPPY) en la región 3 determinante de la complementariedad tipo (CDR3) que se conserva completamente en todos los miembros de la familia de CD28 y CTLA4. La mutagénesis de barrido de alanina en el motivo MYPPPY en CTLA4 y en residuos seleccionados de CD28Ig redujo o inactivó la unión a CD80.

También se construyeron moléculas quiméricas que intercambiaban regiones homólogas de CTLA4 y CD28. Se construyeron moléculas HS4, HS4-A y HS4-B injertando regiones tipo CDR3 de CTLA4, que también incluían una porción del extremo carboxi, que se extendía para incluir ciertos residuos aminoacídicos no conservados en CD28Ig. Estos mutantes homólogos demostraron una mayor avidez de unión a CD80 que CD28Ig.

En otro grupo de mutantes homólogos quiméricos, se injertó en HS4 y HS4-A la región tipo CDR1 de CTLA4, que no está conservada en CD28 y se predijo que estaba adyacente en el espacio a la región tipo CDR3. Estas moléculas mutantes de homólogos quiméricos (denominadas HS7 y HS8) demostraron una avidez de unión incluso mayor por CD80 que la de CD28Ig.

También se prepararon moléculas mutantes de homólogos quiméricos injertando en HS7 y HS8 la región tipo CDR2 de CTLA4, pero esta combinación no mejoró más la avidez de unión por CD80. De este modo, se determinó que el motivo MYPPPY de CTLA4 y CD28 era crítico para la unión a CD80, pero que ciertos residuos aminoacídicos no conservados de las regiones tipo CDR1 y CDR3 de CTALA4 eran también responsables de la avidez aumentada de la unión de CTLA4 con CD80.

La unión diferencial de CD80 y CD86 a CTLA4 se reveló además mediante análisis de 10 mutantes diferentes de CTLA4 (Morton P. A. y cols., (1996) The Journal of Immunology 156: 1047-1054). Cinco sustituciones de aminoácidos en el dominio MYPPPY de CTLA4 ejercieron efectos modestos sobre la unión de CD80, pero cada una de estas sustituciones invalidó completamente la unión de CD86. Además, las sustituciones justo en el extremo N de la región de MYPPPY y en la región tipo CDR1 de CTLA4, eliminó tanto la unión de CD80 como de CD86. Se concluye que CD80 y CD86 se unen con unas cinéticas de asociación/disociación diferentes en sitios similares, pero diferentes, de CTLA4.

Se demostró que CTLA4Ig bloqueó de forma efectiva la coestimulación de linfocitos T asociada a CD80 pero que no era tan efectiva para bloquear las respuestas asociadas a CD86. Se construyeron moléculas de CTLA4 mutantes solubles, especialmente las que tenían una avidez por CD86 mayor que CTLA4 natural, como posiblemente más capaces que CTLA4Ig de bloquear el cebado de células activadas específicas de antígeno.

El documento WO 98/33513 A describe moléculas mutantes de CTLA4 solubles. En la secuencia de aminoácidos que se muestra en la Figura 7 de este documento, el aminoácido de la posición 29 que se denomina Xaa es preferiblemente tirosina o alanina y el aminoácido de la posición 106 que se denomina Yaa es preferiblemente ácido glutámico.

Sigue existiendo la necesidad de moléculas de CTLA4 mejoradas para proporcionar mejores composiciones farmacéuticas para la supresión inmunitaria y el tratamiento del cáncer que las formas solubles de CTLA4 conocidas anteriormente.

Sumario de la invención

La presente invención proporciona moléculas mutantes de CTLA4 que comprenden una secuencia de aminoácidos que comienza por metionina en la posición +1 y que termina con ácido aspártico en la posición +124, tal como se muestra en la figura 7, o que comienza con alanina en la posición -1 y termina con ácido aspártico en la posición +124 tal como se muestra en la figura 7.

La invención proporciona además moléculas de ácido nucleico que codifican dichas moléculas mutantes de CTLA4, vectores que comprenden la secuencia de dichas moléculas de ácido nucleico, sistemas de hospedadores y vectores que comprenden dichos vectores, células hospedadoras que poseen dichos vectores, un procedimiento para producir dichas proteínas mutantes de CTLA4, composiciones farmacéuticas que comprenden dichas moléculas mutantes de CTLA4, así como procedimientos y usos que se refieren a dichas moléculas mutantes de CTLA4.

Un ejemplo de una molécula mutante de CTLA4 es L104EA29YIg (Figura 7), tal como se describe en la presente memoria. L104EA29YIg se une a CD80 y CD86 con más avidez que CTLA4Ig.

Breve descripción de las figuras

La Figura 1 muestra el análisis de unión en el equilibrio de L104EA29YIg, L104EIg, y CTLA4Ig natural a CD86Ig.

Las Figuras 2A y 2B ilustran datos de ensayos mediante FACS que muestran la unión de L104EA29YIg, L104EIg y CTLA4Ig a células CHO transfectadas con CD80 o CD86 tal como se describe en el Ejemplo 2, más adelante.

Las Figuras 3A y 3B representan la inhibición de la proliferación de células CHO positivas para CD80 y positivas para CD86 tal como se describe en el Ejemplo 2, más adelante.

Las Figuras 4A y 4B muestran que L104EA29YIg es más efectivo que CTLA4Ig en la inhibición de los linfocitos T aloestimulados primarios y secundarios tal como se describe en el Ejemplo 2, más adelante.

Las Figuras 5A-C ilustran que L104EA29YIg es más efectivo que CTLA4Ig en la inhibición de la producción de citoquinas IL-2 (FIG. 5A), IL-4 (FIG. 5B) e interferón \gamma (FIG. 5C) de linfocitos T humanos aloestimulados tal como se describe en el Ejemplo 2, más adelante.

La Figura 6 demuestra que L104EA29YIg es más efectivo que CTLA4Ig en la inhibición de la proliferación de linfocitos T de monoestimulados con fitohemaglutinina (PHA) tal como se describe en el Ejemplo 2, más adelante.

La Figura 7 representa una secuencia de nucleótidos y aminoácidos de una molécula mutante de CTLA4 (L104EA
29YIg) que comprende un péptido de señal; un dominio extracelular mutado de CTLA4 que se inicia con metionina en la posición +1 y que termina con ácido aspártico en la posición +124 o que se inicia con alanina en la posición -1 y que termina con ácido aspártico en la posición +124; y una región de Ig tal como se describe en el Ejemplo 1, más adelante.

La Figura 8 representa una secuencia de nucleótidos y aminoácidos de una molécula mutante de CTLA4 (L104EIg) que comprende un péptido de señal; un dominio extracelular mutado de CTLA4 que se inicia con metionina en la posición +1 y que termina con ácido aspártico en la posición +124, o que se inicia con alanina en la posición -1 y que termina con ácido aspártico en la posición +124; y una región de Ig tal como se describe en el Ejemplo 1, más adelante.

La Figura 9 representa una secuencia de nucleótidos y de aminoácidos de CTLA4Ig que posee un péptido de señal; una secuencia de aminoácidos natural del dominio extracelular de CTLA4 que se inicia con metionina en la posición +1 hasta ácido aspártico en la posición +124, o que se inicia con alanina en la posición -1 hasta ácido aspártico en la posición +124; y una región de Ig.

Las Figuras 10A-C son un gel de SDS (FIG. 10A) para CTLA4Ig (carril 1), L104EIg (carril 2) y L104EA29YIg (carril 3A); y cromatografías de exclusión por tamaño de CTLA4Ig (FIG. 10B) y L104EA29YIg (FIG. 10C).

Las Figuras 11A y 11B ilustran un diagrama de bandas del plegamiento tipo IgV extracelular de CTLA4 generado a partir de la estructura en solución que se determina mediante espectroscopia por RMN. La FIG. 11B muestra una vista expandida de la región S25-R33 y de la región MYPPPY que indican la localización y orientación de la cadena lateral de las mutaciones que potencian la avidez, L104 y A29.

La Figura 12 representa un diagrama esquemático de un vector, piLN-LEA29Y, que posee el inserto L104EA29YIg.

Descripción detallada de la invención Definiciones

Tal como se usa en esta solicitud de patente, las siguientes palabras o frases tienen los significados especificados.

Tal como se usa en la presente memoria "CTLA4 natural" tiene la secuencia de aminoácidos del CTLA4 natural de longitud completa (patentes de Estados Unidos nº 5.434.131, 5.844.095, 5.851.795) o su dominio extracelular, que se une a CD80 y/o a CD86 y/o interfiere con CD80 y/o CD86 a partir de la unión a sus ligandos. En realizaciones particulares, el dominio extracelular de CTLA4 natural comienza con metionina en la posición +1 y termina con ácido aspártico en la posición +124, o el dominio extracelular de CTLA4 natural comienza con alanina en la posición -1 y termina con ácido aspártico en la posición +124. CTLA4 natural es una proteína de la superficie celular, que tiene un domino extracelular en el extremo N, un dominio transmembrana y un dominio citoplasmático en el extremo C. El dominio extracelular se une a antígenos diana, tales como CD80 y CD86. En una célula, la proteína CTLA4 natural se traduce en forma de un polipéptido inmaduro, que incluye un péptido de señal en el extremo N. El polipéptido inmaduro sufre procesamiento posttraslacional, que incluye escisión y eliminación de péptido de señal para generar un producto de escisión de CTLA4 que tiene un extremo N recién generado que difiere del extremo N de la forma inmadura. Un experto en la técnica apreciará que puede darse procesamiento posttraslacional adicional, que elimine uno o más de los aminoácidos del extremo N recién generado del producto de escisión de CTLA4. La forma madura de la molécula de CTLA4 incluye el dominio extracelular de CTLA4, o cualquier porción del mismo, que se une a CD80 y/o CD86.

"CTLA4Ig" es una proteína de fusión soluble que comprende un dominio extracelular de CTLA4 natural, o una porción del mismo que se une a CD80 y/o CD86, unidos a una cola de Ig. Una realización particular comprende el dominio extracelular de CTLA4 natural que comienza con metionina en la posición +1 y termina con ácido aspártico en la posición +124; o que comienza con alanina en la posición -1 hasta ácido aspártico en la posición +124; un residuo aminoacídico de glutamina de unión en la posición +125; y una porción de inmunoglobulina que abarca ácido glutámico en la posición +126 hasta lisina en la posición +357 (Figura 9).

Tal como se usa en la presente memoria, una "proteína de fusión" se define como una o más secuencias de aminoácidos que se unen usando procedimientos notorios en la técnica y tales como los se describen en la patente de Estados Unidos nº 5.434.131 o 5.637.481. Las secuencias de aminoácidos unidas, en consecuencia, forman una proteína de fusión.

Tal como se usa en la presente memoria una "molécula mutante de CTLA4" es una molécula que puede ser CTLA4 de longitud completa o porciones de la misma (derivados o fragmentos) que tienen una mutación o mutaciones múltiples en CTLA4 (preferiblemente en el dominio extracelular de CTLA4) de forma que es similar pero ya no idéntica a la molécula de CTLA4 natural. Las moléculas mutantes de CTLA4 se unen a CD80 o a CD86, o a ambas. Las moléculas mutantes de CTLA4 pueden incluir una molécula distinta de CTLA4 biológica o químicamente activa en su interior o unidas a ellas. Las moléculas mutantes de CTLA4 pueden incluir el dominio extracelular completo de CTLA4 o porciones del mismo, por ejemplo, fragmentos o derivados. Las moléculas mutantes de CTLA4 pueden prepararse de forma sintética o recombinante.

Tal como se usa en la presente memoria, el término "mutación" es un cambio en la secuencia de nucleótidos o aminoácidos de un polipéptido natural. En este caso, es un cambio en el dominio extracelular de CTLA4 natural. El cambio puede ser un cambio de aminoácidos que incluye sustituciones, eliminaciones, adiciones o truncados. Una molécula mutante puede tener una o más mutaciones. Las mutaciones en una secuencia de nucleótidos pueden dar como resultado una mutación de la secuencia de aminoácidos o no tal como se comprende en la técnica. Ejemplos incluyen los codones de nucleótidos CGU, CGG, CGC y CGA que codifican el aminoácido arginina (R); o los codones GAU y GAC que codifican el aminoácido ácido aspártico (D): De este modo, una proteína puede ser codificada por una o más moléculas de ácido nucleico que difieren en su secuencia de nucleótidos específica, pero que sin embargo codifican moléculas proteínicas que tienen secuencias idénticas. La secuencia de codificación de aminoácidos es la siguiente:

1

Tal como se usa en la presente memoria "el dominio extracelular de CTLA4" es una porción de CTLA4 que reconoce y se une a CD80 y/o CD86. Por ejemplo, un dominio extracelular de CTLA4 comprende metionina en la posición +1 hasta ácido aspártico en la posición +124 (Figura 9). De forma alternativa, un dominio extracelular de CTLA4 comprende alanina en la posición -1 hasta ácido aspártico en la posición +124 (Figura 9). El dominio extracelular incluye fragmentos o derivados de CTLA4 que se unen a CD80 y/o CD86.

Tal como se usa en la presente memoria "secuencia proteínica distinta de CTLA4" o "molécula distinta de CTLA4" se define como cualquier molécula que no se une a CD80 y/o CD86 y que no interfiere con la unión de CTLA4 a su diana. Un ejemplo incluye, pero sin limitación, una región constante de una inmunoglobulina (Ig) o una porción de la misma. Preferiblemente, la región constante de la Ig es una región constante de de Ig humana o de mono, por ejemplo C(gamma)1 humana, que incluye las regiones de bisagra, CH2 y CH3. La región constante de la Ig puede mutarse para reducir sus funciones efectoras (patentes de Estados Unidos nº 5.637.481; y 6.132.992).

Tal como se usa en la presente memoria un "fragmento de una molécula mutante de CTLA4" es una parte de una molécula mutante de CTLA4, preferiblemente del dominio extracelular de CTLA4 o una parte del mismo, que reconoce y se une a su dominio, por ejemplo CD80 y/o CD86.

Tal como se usa en la presente memoria un "derivado de una molécula mutante de CTLA4" es una molécula que comparte al menos el 70% de similaridad de secuencia y funciona como el dominio extracelular de CTLA4, es decir, reconoce y se une a CD80 y/o CD86.

Tal como se usa en la presente memoria, una "porción de una molécula de CTLA4" incluye fragmentos y derivados de una molécula de CTLA4 que se une a CD80 y/o CD86.

Para que la invención que se describe en la presente memoria pueda ser comprendida más completamente, se acompaña la siguiente descripción.

Composiciones de la invención

La presente invención proporciona moléculas mutantes de CTLA4 solubles que reconocen y se unen a CD80 y/o CD86. En algunas realizaciones, los mutantes de CTLA4 solubles tienen una avidez mayor por CD80 y/o CD86 que CTLA4Ig.

La porción extracelular de una molécula mutante de CTLA4 comprende una secuencia de aminoácidos que comienza con metionina en la posición +1 hasta ácido aspártico en la posición +124 (Figura 7). De forma alternativa, la porción extracelular de la CTLA4 puede comprender una secuencia de aminoácidos que comienza con alanina en la posición -1 hasta ácido aspártico en la posición +124 (Figura 7).

Ejemplos de moléculas mutantes de CTLA4 incluyen L104EA29YIg (Figura 7). La secuencia de aminoácidos de L104EA29YIg puede empezar con alanina en la posición -1 y terminar con lisina en la posición +357. De forma alternativa, la secuencia de aminoácidos de L104EA29YIg puede empezar con metionina en la posición +1 y terminar con lisina en la posición de aminoácido +357. La porción de CTLA4 de L104EA29YIg engloba metionina en la posición de aminoácido +1 hasta ácido aspártico en la posición de aminoácido +124. L104EA29YIg comprende un residuo aminoacídico glutamina de unión en la posición +125 y una porción de inmunoglobulina que abarca ácido glutámico en la posición +126 hasta lisina en la posición +357 (Figura 7). L104EA29YIg se une con una avidez aproximadamente 2 veces superior a la de CTLA4Ig natural (en los sucesivo denominada CTLA4Ig) a CD80 y aproximadamente con una avidez 4 veces superior a CD86. Esta unión más fuerte da como resultado que L104EA29YIg es más efectiva que CTLA4Ig en el bloqueo de las respuestas inmunitarias.

De acuerdo con la invención, la molécula mutante de CTLA4 soluble es una proteína de fusión que comprende el dominio extracelular de CTLA4, en la que la alanina de la posición 29 de CTLA4 natural se sustituye por tirosina, y la leucina en la posición 104 de CTLA4 natural se sustituye por ácido glutámico. Una molécula mutante de CTLA4 que posee estas sustituciones se denomina L104EA29YIg en la presente memoria (Figura 7). La molécula de ácido nucleico que codifica L104EA29YIg está contenida en pD16 L104EA29YIg y se depositó el 19 de junio de 2000 en la American Type Culture Collection (ATCC), 10801 University Blvd., Manasas, VA 20110-2209 (nº de ATCC PTA-2104). El vector pD16 L104EA29YIg es un derivado del vector pcDNA3 (INVITROGEN).

La invención proporciona además una molécula mutante de CTLA4 soluble que comprende un dominio extracelular de un mutante de CTLA4 tal como se define anteriormente y un resto que altera la solubilidad, afinidad y/o valencia de la molécula mutante de CTLA4.

De acuerdo con una práctica de la invención, el resto puede ser una región constante de una inmunoglobulina o una porción de la misma. Para el uso in vivo, se prefiere que la región constante de la inmunoglobulina no provoque una respuesta inmunitaria perjudicial en el sujeto. Por ejemplo, en los protocolos clínicos, puede preferirse que las moléculas mutantes incluyan regiones constantes de inmunoglobulinas humanas o de mono. Un ejemplo de una región de inmunoglobulina adecuada en C(gamma)1 humana, que comprende las regiones de bisagra, CH2 y CH3. Otros isotipos son posibles. Además, son posibles otras regiones constantes de inmunoglobulinas (preferiblemente otras regiones constantes de inmunoglobulinas que son débilmente inmunógenas o que no son inmunógenas).

Otros restos incluyen marcas polipeptídicas. Ejemplos de marcas adecuadas incluyen, pero sin limitación, la molécula p97, la molécula env gp120, la molécula E7 y la molécula ova (Dash, B. y cols. (1994) J. Gen Virol. 75: 1389-97; Ikeda, T. y cols. (1994) Gene 138: 193-6; Falk, K. y cols. (1993) Cell. Immunol. 150: 447-52; Fujisaka, K. y cols. (1994) Virology 204: 789-93). Es posible utilizar otras moléculas como etiquetas (Gerard, C. y cols. (1994) Neuroscience 62: 721-739; Byrn, R. y cols. J. Virol. (1989) 63: 4370-4375; Smith, D. y cols., (1987) Science 238: 1704-1707; Lasky, L., (1996) Science 233: 209-212).

La invención proporciona además proteínas de fusión de mutantes de CTLA4Ig solubles que preferentemente son más reactivas que CTLA4 natural con el antígeno CD80 y/o CD86. Un ejemplo es L104EA29YIg tal como se muestra en la Figura 7.

En otra realización, la molécula mutante de CTLA4 incluye un residuo aminoacídico de unión, que se localiza entre la porción de CTLA4 y la porción de inmunoglobulina. El aminoácido de unión puede ser cualquier aminoácido, incluyendo glutamina. El aminoácido de unión puede introducirse mediante procedimientos de síntesis molecular o química conocidos en la técnica.

En otra realización, la molécula mutante de CTLA4 soluble incluye la porción de inmunoglobulina (por ejemplo, dominios de bisagra, CH2 y CH3) en los que cualquiera o todos los residuos de cisteína se sustituyen por serina, por ejemplo, las cisteínas de las posiciones +130, +136 o +139 (Figura 7). La molécula mutante puede incluir también la prolina de la posición +148 sustituida con una serina, tal como se muestra en la Figura 7.

La molécula mutante de CTLA4 soluble puede incluir un secuencia peptídica de señal ligada al extremo N del dominio extracelular de la porción de CTLA4 de la molécula mutante. El péptido de señal puede ser cualquier secuencia que permita la secreción de la molécula mutante, que incluye el péptido de señal de oncostatina M (Malik, y cols., (1989) Molec. Cell. Biol. 9: 2847-2853) o CD5 (Jones, N. H. y cols., (1986) Nature 323: 346-349) o el péptido de señal de cualquier proteína extracelular.

La molécula mutante puede incluir el péptido de señal de oncostatina M ligado al extremo N del dominio extracelular de CTLA4 y la molécula de inmunoglobulina humana (por ejemplo, bisagra, CH2 y CH3) ligada al extremo C del dominio extracelular de CTLA4. Esta molécula incluye el péptido de señal de oncostatina M que abarca una secuencia de aminoácidos que tiene metionina en la posición -26 hasta alanina en la posición -1, englobando la porción de CTLA4 una secuencia de aminoácidos que tiene metionina en la posición +1 hasta ácido aspártico en la posición +124, un residuo aminoacídico de unión, glutamina, en la posición +125 un residuo aminoacídico glutamina de unión en la posición +125 y la porción de inmunoglobulina que abarca una secuencia de aminoácidos que tiene ácido glutámico en la posición +126 hasta lisina en la posición +357.

Las moléculas mutantes de CTLA4 solubles de la invención pueden obtenerse mediante procedimientos de síntesis molecular o química. Los procedimientos moleculares pueden incluir las siguientes etapas: introducir una molécula de ácido nucleico que exprese y codifique la molécula mutante de CTLA4 soluble en una célula hospedadora adecuada; cultivar la célula hospedadora así transformada en condiciones que permitan que la célula hospedadora exprese las moléculas mutantes; y aislar las moléculas mutantes expresadas. La porción de péptido de señal de la molécula mutante permite que las moléculas de proteína se expresen en la superficie celular y que sean segregadas por la célula hospedadora. Las moléculas mutantes traducidas pueden sufrir modificación posttraslacional, que implique escisión del péptido de señal para producir una proteína madura que tiene las porciones de CTLA4 y de inmunoglobulina. La escisión puede ocurrir después de la alanina de la posición -1, dando como resultado una molécula mutante madura que tiene metionina de la posición +1 como primer aminoácido (Figura 7). De forma alternativa, la escisión puede ocurrir después de la metionina en la posición -2, dando como resultado una molécula mutante madura que tiene alanina en la posición -1 como aminoácido primero.

Una realización preferida es una molécula mutante de CTLA4 soluble que tiene el dominio extracelular de CTLA4 humana ligado a todo o una porción de una molécula de inmunoglobulina humana (por ejemplo, bisagra, CH2 y CH3). Esta molécula preferida incluye la porción de CTLA4 de la molécula soluble que abarca una secuencia de aminoácidos que tiene metionina en la posición +1 hasta ácido aspártico en la posición +124, un residuo aminoacídico de unión, glutamina, en la posición +125 y la porción de inmunoglobulina que abarca ácido aspártico en la posición +126 hasta lisina en la posición +357. La porción que tiene el dominio extracelular de CTLA4 está mutada de forma la alanina de la posición +29 se sustituye por tirosina y la leucina de la posición +104 se sustituye por ácido glutámico. La porción de inmunoglobulina de la molécula mutante puede mutarse, de forma que las cisteínas de las posiciones +130, +136 y +139 se sustituyen por serina y la prolina de la posición +148 se sustituye por serina. Esta molécula mutante se denomina L104EA29YIg en la presente memoria (Figura 7).

Otra realización de L104EA29YIg es una molécula mutante que tiene una secuencia de aminoácidos que tiene alanina en la posición -1 hasta ácido aspártico en la posición +124, un residuo aminoacídico glutamina de unión en la posición +125 y la porción de inmunoglobulina que abarca ácido glutámico en la posición +126 (por ejemplo +126 hasta lisina en la posición +357). La porción que tiene el dominio extracelular de CTLA4 está mutada de forma que la alanina de la posición +29 está sustituida por tirosina; y la leucina en la posición +104 está sustituida por ácido glutámico. La porción de inmunoglobulina de la molécula mutante está mutada, de forma que las cisteínas de las posiciones +130, +136 y +139 están sustituidas por serina y la prolina de la posición +148 está sustituida por serina. Esta molécula mutante se denomina L104EA29YIg en la presente memoria (Figura 7). Cuando se ha escindido la secuencia de señal, L104EA29YIg puede empezar con una metionina en la posición +1 o empezar con alanina en la posición -1.

La invención proporciona además moléculas de ácido nucleico que comprenden secuencias de nucleótidos que codifican las secuencias de aminoácidos que corresponden a las moléculas mutantes de CTLA4 solubles de la invención. En una realización, la molécula de ácido nucleico es una de ADN (por ejemplo ADNc) o un híbrido del mismo. De forma alternativa las moléculas de ácido nucleico son ARN o un híbrido del mismo.

De forma adicional, la invención proporciona un vector, que comprende las secuencias de nucleótidos de la invención. También se proporciona un sistema de hospedador y vector. El sistema de hospedador y vector comprende el vector de la invención en una célula hospedadora adecuada. Ejemplos de células hospedadoras adecuadas incluyen, pero sin limitación, células procariotas y eucariotas.

La invención incluye composiciones farmacéuticas para usar en el tratamiento de enfermedades del sistema inmunitario que comprenden cantidades terapéuticamente eficaces de moléculas mutantes de CTLA4 solubles. En ciertas realizaciones, las enfermedades del sistema inmunitario están mediadas por interacciones entre células positivas para CD28 y/o CTLA4 y células positivas para CD80 y/o CD86. Las moléculas mutantes de CTLA4 solubles son preferiblemente moléculas de CTLA4 que tienen una o más mutaciones en el dominio extracelular de CTLA4. La composición farmacéutica puede incluir moléculas mutantes de CTLA4 solubles y/o moléculas de ácido nucleico y/o vectores que codifican las moléculas. En realizaciones preferidas, las moléculas mutantes de CTLA4 tienen la secuencia de aminoácidos del dominio extracelular de CTLA4 tal como se muestra en la Figura 7 (L104EA29Y). Incluso más preferiblemente, la molécula mutante de CTLA4 es L104EA29YIg tal como se describe en la presente memoria. Las composiciones pueden incluir adicionalmente otros agentes terapéuticos, que incluyen, pero sin limitación, fármacos, toxinas, enzimas, anticuerpos o conjugados.

Las composiciones farmacéuticas también preferiblemente incluyen vehículos y adyuvantes adecuados que incluyen cualquier material que, cuando se combina con la molécula de la invención (por ejemplo molécula mutante de CTLA4 soluble, tal como L104EA29Y), mantiene la actividad de la molécula y no reacciona con el sistema inmunitario del sujeto. Ejemplos de vehículos y adyuvantes adecuados incluyen, pero sin limitación, albúmina de suero humana; intercambiadores de iones; alúmina; lecitina; sustancias tamponadoras, tales como fosfatos; glicina; ácido sórbico; sorbato potásico; y sales o electrolitos, tales como sulfato de protamina. Otros ejemplos incluyen cualquiera de los vehículos farmacéuticos estándar tales como solución salina tamponada con fosfato; agua; emulsiones, tales como emulsión de aceite/agua; y varios tipos de agentes humectantes. Otros vehículos pueden incluir también soluciones estériles; comprimidos, que incluyen comprimidos recubiertos y cápsulas. Típicamente los vehículos de ese tipo contienen excipientes tales como almidón, leche, azúcar, ciertos tipos de arcilla, gelatina, ácido esteárico o sus sales, magnesio o esterarato cálcico, talco, grasas o aceites vegetales, gomas, glicoles u otros excipientes conocidos. Los vehículos de ese tipo pueden incluir también aromas y aditivos colorantes u otros ingredientes. Las composiciones que comprenden vehículos de ese tipo se formulan mediante procedimientos convencionales notorios. Las composiciones de ese tipo pueden formularse también en varias composiciones lipídicas, tales como, por ejemplo, liposomas así como en varias composiciones poliméricas, tales como microesferas poliméricas.

Las composiciones farmacéuticas de la invención pueden administrarse usando modos convencionales de administración que incluyen, pero sin limitación, administración intravenosa (i.v.), administración intraperitoneal (i.p.), administración intramuscular (i.m.), administración subcutánea, administración oral, administración en forma de supositorio, o en forma de contacto tópico o por implante de un dispositivo de liberación lenta tal como una bomba miniosmótica al sujeto.

Las composiciones farmacéuticas de la invención pueden estar en una variedad de formas farmacéuticas que incluyen, pero sin limitación, soluciones o suspensiones líquidas, comprimidos, píldoras, polvos, supositorios, microcápsulas o microvesículas poliméricas, liposomas y soluciones inyectables o infundibles. La forma preferida depende del modo de administración y de la aplicación terapéutica.

El modo de administración y el régimen de dosificación más efectivos para las composiciones de esta invención dependen de la gravedad y del curso de la enfermedad, de la salud del paciente y de la respuesta al tratamiento y del juicio del médico encargado. En consecuencia, las dosis de las composiciones deberían valorarse para cada paciente individual.

Las moléculas mutantes de CTLA4 solubles pueden administrarse a un sujeto en una cantidad y durante un tiempo (por ejemplo, duración y/o veces múltiples) suficientes para bloquear la unión de las moléculas de B7 endógenas (por ejemplo CD80 y/o CD86) a sus ligandos respectivos, en el sujeto. El bloqueo de la unión endógena de B7/ligando en consecuencia inhibe las interacciones entre las células positivas para B7 (por ejemplo células positivas para CD80 y/o CD86) y las células positivas para CD28 y/o CTLA4. La dosis de un agente terapéutico depende de muchos factores que incluyen, pero sin limitación, el tipo de tejido afectado, el tipo de enfermedad autoinmunitaria que se esté tratando, la gravedad de la enfermedad, la salud del paciente y la respuesta del sujeto al tratamiento con los agentes. En consecuencia, las dosis de los agentes pueden variar dependiendo del sujeto y del modo de administración. Las moléculas mutantes de CTLA4 solubles pueden administrarse en una cantidad entre 0,1 y 20,0 mg/kg de peso del paciente/día, preferiblemente entre 0,5 y 10,0 mg/kg/día. La administración de las composiciones farmacéuticas de la invención puede realizarse en varias veces. En una realización, la composición farmacéutica de la invención puede administrarse durante una o más horas. Además, la administración puede repetirse dependiendo de la gravedad de la enfermedad así como de otros factores tal como se entiende en la técnica.

La invención proporciona además procedimientos para producir una proteína que comprende cultivar el sistema de hospedador y vector de la invención de forma que la proteína se produzca en el hospedador y recuperar la proteína producida de este modo.

Además, la invención proporciona procedimientos para regular las interacciones entre linfocitos T positivos para CTLA4 y CD28 y células positivas para CD80 y/o CD86. Los procedimientos comprenden poner en contacto las células positivas para CD80 y/o CD86 con una molécula mutante de CTLA4 soluble de la invención de forma que se formen complejos de CTLA4 mutante/CD80 y/o CTLA4 mutante/CD86, interfiriendo los complejos en la reacción del antígeno CTLA4 endógeno con CD80 y/o CD86, y/o interfiriendo los complejos en la reacción del antígeno CD28 endógeno con CD80 y/o CD86. En una realización, la molécula mutante de CTLA4 soluble comprende: una primera secuencia de aminoácidos que incluye el dominio extracelular de CTLA4 de la secuencia de aminoácidos que tiene metionina en la posición +1 hasta ácido aspártico en la posición +124, tal como se define anteriormente; y una segunda secuencia de aminoácidos que incluye las regiones de bisagra, CH2 y CH3 de la molécula de inmunoglobulina gamma 1 humana (Figura 7).

Las moléculas mutantes de CTLA4 solubles se espera que exhiban propiedades inhibidoras in vivo. En condiciones en las que se están produciendo interacciones entre linfocitos T/células APC, por ejemplo interacciones entre linfocitos T/linfocitos B como resultado del contacto entre los linfocitos T y las células APC, la unión de las moléculas mutantes de CTLA4 introducidas para que reaccionen con las células positivas para CD80 y/o CD86, por ejemplo los linfocitos B, puede interferir, es decir, inhibir, las interacciones entre los linfocitos T/células APC dando como resultado la regulación de las respuestas inmunitarias.

La invención proporciona procedimientos para regular por disminución las respuestas inmunitarias. La regulación por disminución de una respuesta inmunitaria mediante moléculas mutantes de CTLA4 solubles puede ser por vía de la inhibición o bloqueo de una respuesta inmunitaria que ya se está desarrollando o puede implicar prevenir la inducción de una respuesta inmunitaria. Las moléculas de CTLA4 solubles de la invención pueden inhibir las funciones de los linfocitos T activados, tales como la proliferación de linfocitos T y la secreción de citoquinas, suprimiendo las respuestas de linfocitos T o induciendo la tolerancia específica de los linfocitos T, o ambos.

La presente invención proporciona además procedimientos para tratar enfermedades del sistema inmunitario y para inducir tolerancia. En realizaciones particulares, las enfermedades del sistema inmunitario están mediadas por interacciones entre las células positivas para CD28 y/o CTLA4 y las células positivas para CD80/CD86. En una realización adicional, se inhiben las interacciones de los linfocitos T. Las enfermedades del sistema inmunitario incluyen, pero sin limitación, enfermedades autoinmunitarias, enfermedades inmunoproliferativas y trastornos relacionados con injertos. Estos procedimientos comprenden la administración a un sujeto de moléculas mutantes de CTLA4 solubles de la invención para regular las interacciones de los linfocitos T con las células positivas para CD80 y/o CD86. De forma alternativa, puede administrarse un híbrido de mutante de CTLA4 que tiene una glucoproteína de membrana unida a una molécula mutante de CTLA4. Ejemplos de enfermedades relacionadas con injertos incluyen la enfermedad de injerto contra huésped (GVHD) (por ejemplo, la que puede resultar a partir del trasplante de médula ósea o en la inducción de tolerancia), trastornos inmunitarios asociados al rechazo de trasplante de injertos, rechazo crónico y aloinjertos o xenoinjertos de tejidos o células, que incluyen órganos macizos, piel, islotes, músculos, hepatocitos, neuronas. Ejemplos de enfermedades inmunoproliferativas incluyen, pero sin limitación, soriasis; linfoma de linfocitos T; leucemia linfoblástica aguda de linfocitos T; linfoma de linfocitos T angiocéntrico testicular; angitis linfocítica benigna; y enfermedades autoinmunitarias tales como lupus (por ejemplo lupus eritematoso, nefritis por lupus), tiroiditis de Hashimoto, mixedema primario, enfermedad de Grave, anemia perniciosa, gastritis atrófica autoinmunitaria, enfermedad de Addison, diabetes (por ejemplo diabetes sacarina insulinodependiente, diabetes sacarina tipo I), síndrome de Goodpasture, miastenia grave, pénfigo, enfermedad de Crohn, oftalmia simpática, uveítis autoinmunitaria, esclerosis múltiple, anemia hemolítica autoinmunitaria, trombocitopenia idiopática, cirrosis biliar primaria, hepatitis de acción crónica, colitis ulcerativa, síndrome de Sjogren, enfermedades reumáticas (por ejemplo artritis reumatoide), polimiositis, escleroderma y enfermedad de tejido conectivo mixta.

La presente invención proporciona además un procedimiento para inhibir rechazos de trasplantes de órganos macizos y/o tejidos por un sujeto, siendo el sujeto el receptor de tejido trasplantado. Típicamente, en los trasplantes de tejidos, el rechazo del trasplante se inicia por su reconocimiento como extraño por los linfocitos T, seguido de una respuesta inmunitaria que destruye el injerto. Las moléculas mutantes de CTLA4 solubles de esta invención, al inhibir la proliferación de linfocitos T y/o la secreción de citoquinas, puede dar como resultado una reducción de la destrucción tisular y la inducción de una falta de respuesta de los linfocitos T específica de antígeno que puede dar como resultado una aceptación del injerto a largo plazo sin necesidad de una inmunosupresión generalizada. Además, las moléculas mutantes de CTLA4 solubles de la invención pueden administrarse con otros fármacos que incluyen, pero sin limitación, corticoesteroides, ciclosporina, rapamicina, micofenolato mofetilo, azatioprina, tacrolimo, basiliximab y/o otros productos biológicos.

La presente invención proporciona también procedimientos para inhibir la enfermedad de injerto contra huésped en un sujeto. Este procedimiento comprende la administración al sujeto de una molécula mutante de CTLA4 soluble de la invención, sola o junto con otros ligandos adicionales, que son reactivos con IL-2, IL-4 o interferón \gamma. Por ejemplo, una molécula mutante de CTLA4 soluble de esta invención puede administrarse a un receptor de un trasplante de médula ósea para inhibir la alorreactividad de los linfocitos T donantes. De forma alternativa, los linfocitos T donantes en un injerto de médula ósea pueden hacerse tolerantes a los aloantígenos de un receptor ex vivo antes del trasplante.

La inhibición de las respuestas de los linfocitos T mediante moléculas mutantes de CTLA4 solubles puede ser útil también para tratar trastornos autoinmunitarios. Muchos trastornos autoinmunitarios son resultado de una activación inapropiada de linfocitos T que son reactivos contra autoantígenos y que promueven la producción de citoquinas y autoanticuerpos que están implicados en la patología de la enfermedad. La administración de una molécula mutante de CTLA4 soluble a un sujeto que padece o que es susceptible de padecer un trastorno autoinmunitario puede prevenir la activación de linfocitos T autorreactivos y puede reducir o eliminar los síntomas de la enfermedad. Este procedimiento puede también comprender la administración al sujeto de una molécula mutante de CTLA4 soluble de la invención, sola o junto con otros ligandos adicionales, que son reactivos con IL-2, IL-4 o interferón \gamma.

La invención engloba además el uso de las moléculas mutantes de CTLA4 solubles junto con otros inmunosupresores, por ejemplo ciclosporina (véase Mathiesen, en: "Prolonged Survival and Vascularization of Xenografted Human Glioblastoma Cells in the Central Nervous System of Cyclosporin A-Treated Rats" (1989) Cancer Lett. 44: 151-156), prednisona, azatioprina y metotrexato (R. Handschumacher "Chapter 53: Drugs Used for Immunosuppression" páginas 1264-1276). Son posibles otros inmunosupresores. Por ejemplo, para el tratamiento de la artritis reumatoide, pueden administrarse moléculas mutantes de CTLA4 solubles con fármacos que incluyen, pero sin limitación, corticosteroides, fármacos antiinflamatorios no esteroideos/inhibidores de Cox-2, metotrexato, hidroxicloroquina, sulfasalazopriina, sales de oro, etanercept, infliximab, anakinra, azatioprina y/o otras sustancias biológicas tales como sustancias contra TNF. Para el tratamiento de lupus eritematoso sistémico, pueden administrarse moléculas mutantes de CTLA4 solubles con fármacos que incluyen, pero sin limitación, corticoesteroides, citoxan, azatioprina, hidrocloroquina, micofenolato mofetilo y/o otros productos biológicos. Además, para el tratamiento de la esclerosis múltiple, pueden administrarse moléculas mutantes de CTLA4 solubles con fármacos que incluyen, pero sin limitación, corticoesteroides, interferon \beta-1a, interferón \beta-1b, glatiramer acetato, mitoxantrona clorhidrato y/o otros productos biológicos.

También pueden usarse moléculas mutantes de CTLA4 solubles (preferiblemente, L104EA29YIg) combinadas con uno o más de los siguientes agentes para regular una respuesta inmunitaria: gp39 soluble (también conocido como ligando CD40 (CD40L), CD154, T-BAM, TRAP), CD29 soluble, CD40 soluble, CD80 soluble, CD86 soluble, CD28 soluble, CD56 soluble, Thy-1 soluble, CD3 soluble, TCR soluble, VLA-4 soluble, VCAM-1 soluble, LECAM-1 soluble, ELAM-1 soluble, CD44 soluble, anticuerpos que reaccionan con gp39, anticuerpos que reaccionan con CD40, anticuerpos que reaccionan con B7, anticuerpos que reaccionan con CD28, anticuerpos que reaccionan con LFA-1, anticuerpos que reaccionan con LFA-2, anticuerpos que reaccionan con IL-2, anticuerpos que reaccionan con IL-12, anticuerpos que reaccionan con IFN-gamma, anticuerpos que reaccionan con CD2, anticuerpos que reaccionan con CD48, anticuerpos que reaccionan con cualquier ICAM (por ejemplo, ICAM-2), anticuerpos que reaccionan con CTLA4, anticuerpos que reaccionan con Thy-1, anticuerpos que reaccionan con CD56, anticuerpos que reaccionan con CD3, anticuerpos que reaccionan con CD29, anticuerpos que reaccionan con TCR, anticuerpos que reaccionan con VLA-4, anticuerpos que reaccionan con VCAM-1, anticuerpos que reaccionan con LECAM-1, anticuerpos que reaccionan con ELAM-1, anticuerpos que reaccionan con CD44. En ciertas realizaciones, se prefieren los anticuerpos monoclonales. En otras realizaciones se prefieren fragmentos de anticuerpos. Como los expertos en la técnica entenderán fácilmente, la combinación puede incluir las moléculas mutantes de CTLA4 solubles de la invención y otro agente inmunosupresor más, las moléculas mutantes de CTLA4 solubles con otros dos agentes inmunosupresores, las moléculas mutantes de CTLA4 solubles con otros tres agentes inmunosupresores, etc. La determinación de la combinación y las dosis óptimas puede determinarse y optimizarse usando procedimientos notorios en la técnica.

Algunas combinaciones específicas incluyen las siguientes: L104EA29YIg y anticuerpos monoclonales (mAbs) contra CD80; L104EA29YIg y mAbs contra CD86; L104EA29YIg, mAbs contra CD80 y mAbs contra CD86; L104EA29YIg y mAbs contra gp39; L104EA29YIg y mAbs contra CD40; L104EA29YIg y mAbs contra CD28; L104EA29YIg y mAbs contra CD80 y CD86 y mAbs contra gp39, L104EA29YIg, mAbs contra CD80 y CD86 y mAbs contra CD40; y L104EA29YIg, mAb contra LFA1 y mAb contra gp39. Un ejemplo específico de un mAb contra gp39 es MR1. Un experto en la técnica apreciará y comprenderá fácilmente otras combinaciones.

Las moléculas mutantes de CTLA4 solubles de la invención, por ejemplo L104EA29Y, pueden administrarse como el único ingrediente activo o junto con otros fármacos en posologías de inmunomodulación o con otros agentes antiinflamatorios por ejemplo para el tratamiento o prevención de rechazo agudo o crónico de aloinjertos o xenoinjertos o trastornos autoinmunitarios inflamatorios o para inducir tolerancia. Por ejemplo, puede usarse combinado con un inhibidor de calcineurina, por ejemplo ciclosporina A o FK506; una macrólida inmunosupresora, por ejemplo rapamicina o un derivado de la misma; por ejemplo 40-O-(2-hidroxi)etil-rapamicina, un agente rastreador de linfocitos, por ejemplo FTY720 o un análogo del mismo; corticoesteroides; ciclofosfamida; azatiopreno; metotrexato; leflunomida o un análogo de la misma; mizorribina; ácido micofenólico; micofenolato mofetilo; 15-desoxipergualina o un análogo del mismo; anticuerpos monoclonales inmunosupresores, por ejemplo anticuerpos monoclonales contra receptores de leucocitos, por ejemplo, MHC, CD2, CD3, CD4, CD 11a/CD18, CD7, CD25, CD27, B7, CD40, CD45, CD58, CD137, ICOS, CD150 (SLAM), OX40, 4-1BB o sus ligandos; u otros compuestos inmunomoduladores, por ejemplo CTLA4/CD28-Ig u otros inhibidores de las moléculas de adhesión, por ejemplo mAbs o inhibidores de peso molecular reducido que incluyen antagonistas de LFA-1, antagonistas de Selectina y antagonistas de VLA-4. El compuesto es particularmente útil combinado con un compuesto que interfiere con CD40 y su ligando, por ejemplo anticuerpos contra CD40 y anticuerpos contra CD40-L, por ejemplo en las indicaciones descritas anteriormente, por ejemplo la inducción de tolerancia.

Cuando se administran las moléculas mutantes de CTLA4 solubles de la invención junto con otra terapia inmunosupresora/inmunomoduladora o antiinflamatoria, por ejemplo tal como se especifica en la presente memoria anteriormente, las dosis del compuesto inmunosupresor, inmunomodulador o antiinflamatorio administrado de forma conjunta variarán por supuesto dependiendo del tipo de cofármaco empleado, por ejemplo si es un esteroide o una ciclosporina, del fármaco específico empleado, de la afección que se esté tratando y así sucesivamente.

De acuerdo con lo anterior, la presente invención proporciona en un aspecto adicional más, procedimientos tal como se define anteriormente que comprenden la administración conjunta, por ejemplo de forma concomitante o secuencial, de una cantidad terapéuticamente eficaz de moléculas mutantes de CTLA4 solubles de la invención, L104EA29YIg, en forma libre o en forma salina farmacéuticamente aceptable y una segunda sustancia medicamentosa, siendo dicha sustancia medicamentosa segunda un fármaco inmunosupresor, inmunomodulador o antiinflamatorio, por ejemplo, tal como se indica anteriormente. Se proporcionan además combinaciones terapéuticas, por ejemplo un kit, por ejemplo para usarse en cualquier procedimiento tal como se define anteriormente, que comprende un L104EA29YIg, en forma libre o en forma salina farmacéuticamente aceptable para usarse de forma concomitante o secuencial con al menos una composición farmacéutica que comprende un fármaco inmunosupresor, inmunomodulador o antiinflamatorio. El kit puede comprender instrucciones para su administración.

Procedimientos para producir las moléculas de la invención

La expresión de moléculas mutantes de CTLA4 solubles puede ser en células procariotas. Los procariotas de forma más frecuente, están representados por diversas cepas de bacterias. Las bacterias pueden ser gram positivas o gram negativas. Típicamente, se prefieren bacterias gram negativas, tal como E. coli. También pueden usarse otras cepas microbianas.

Las secuencias que codifican las moléculas mutantes de CTLA4 pueden insertarse en un vector diseñado para la expresión de secuencias exógenas en células procariotas tales como E. coli. Estos vectores pueden incluir secuencias de control procariotas que se usan comúnmente que se definen en la presente memoria e incluyen promotores para la iniciación de la transcripción, opcionalmente con un operador, junto con secuencias de sitios de unión de ribosomas, que incluyen promotores que se usan comúnmente tales como los sistemas promotores de la beta-lactamasa (penicilinasa) y lactosa (lac) (Chang, y cols., (1977) Nature 198: 1056), el sistema de promotor del triptófano (trp) (Goeddel, y cols., (1980) Nucleic Acids Res. 8:4057) y el promotor P_{L} derivado de lambda y el sitio de unión de ribosomas de gen N (Shimatake, y cols., (1981) Nature 292:128).

Los vectores de expresión de ese tipo incluyen también orígenes de replicación y marcadores seleccionables, tales como el gen de la beta-lactamasa o de la neomicina fosfotransferasa que confieren resistencia a antibióticos, de forma que los vectores pueden replicarse en bacterias y pueden seleccionarse las células que portan los plásmidos cuando se cultivan en presencia de antibióticos, tales como ampicilina o canamicina.

El plásmido de expresión puede introducirse en células procariotas mediante una variedad de procedimientos estándar, que incluyen, pero sin limitación choque con CaCl_{2}(Cohen, (1972) Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 69:2110 y Sambrook y cols. (editores), "Molecular Cloning: A Laboratory Manual", 2ª Edición, Cold Spring Harbor Press (1989)) y electroporación.

De acuerdo con la práctica de la invención, las células eucariotas son también células hospedadoras adecuadas. Ejemplos de células eucariotas incluyen cualquier célula animal, ya sea primaria o inmortalizada, de levadura (por ejemplo, Saccharomyces cerevisiae, Schizosaccharomyces pombe y Pichia pastoris) y células vegetales. Las células de mieloma, COS y CHO son ejemplos de células animales que pueden usarse como hospedadoras. Células CHO particulares incluyen, pero sin limitación, DG44 (Chasin, y cols., 1986 Som. Cell. Molec. Genet. 12: 555-556; Kolkekar 1997 Biochemistry 36: 10901-10909), CHO-K1 (Nº de ATCC CCL-61), línea celular CHO-K1 Tet-On (Clontech), CHO denominada ECACC 85050302 (CAMR, Salisbury, Wiltshire, Reino Unido), CHO clon 13 (GEIMG, Génova, Italia), CHO clon B (GEIMG, Génova, Italia), CHO-K1/SF denominada ECACC 93061607 (CAMR, Salisbury, Wiltshire, Reino Unido), y RR-CHOK1 denominada ECACC 92052129 (CAMR, Salisbury, Wiltshire, Reino Unido). Células vegetales ejemplares incluyen células de tabaco (plantas completas, cultivo celular o callo), maíz, soja y arroz. También son aceptables las semillas de maíz, soja y arroz.

Las secuencias de ácidos nucleicos que codifican las moléculas mutantes de CTLA4 solubles pueden insertarse también en un vector diseñado para expresar secuencias exógenas en un hospedador eucariota. Los elementos reguladores del vector pueden variar dependiendo del hospedador eucariota particular.

Las secuencias de control eucariotas usadas comúnmente a usar en los vectores de expresión incluyen secuencias promotoras y de control compatibles con células de mamífero tales como, por ejemplo, el promotor de CMV (vector CDM8) y virus de sarcoma aviar (ASV) (vector \PiLN). Otros promotores usados comúnmente incluyen los promotores temprano y tardío del virus de simio 40 (SV40) (Fiers, y cols., (1973) Nature 273:113) u otros promotores víricos tales como los que se derivan del polioma, adenovirus 2 y virus de papiloma bovino. También puede usarse un promotor inducible, tal como hMTII (Karin, y cols., (1982) Nature 299: 797-802).

Los vectores para la expresión de moléculas mutantes de CTLA4 solubles en eucariotas pueden portar también secuencias que se denominan regiones potenciadotas. Estas son importantes para optimizar la expresión de genes y se encuentran aguas arriba o aguas abajo de la región promotora.

Ejemplos de vectores de expresión para las células hospedadoras eucariotas incluyen, pero sin limitación, vectores para células hospedadoras de mamífero (por ejemplo, BPV-1, pHyg, pRSV, pSV2, pTK2 (Maniatis); pIRES (Clontech), pRc/CMV2, pRc/RSV, pSFV1 (Life Technologies); vectores pVPakc, vectores pCMV, vectores pSG5 (Stratagene)), vectores retrovirales (por ejemplo, vectores pFB (Stratagene)), pCDNA-3 (Invitrogen) o formas modificadas del mismo, vectores adenovíricos; vectores víricos adenoasociados, vectores baculovíricos, vectores fúngicos (por ejemplo, vectores pESC (Stratagene)).

Las secuencias de ácidos nucleicos que codifican moléculas mutantes de CTLA4 pueden integrarse en el genoma de la célula hospedadora eucariota y replicarse cuando se replica el genoma hospedador. De forma alternativa, el vector de porta moléculas mutantes de CTLA4 puede contener orígenes de replicación que permiten la replicación extracromosómica.

Para expresar las secuencias de ácidos nucleicos en Saccharomyces cerevisiae, puede usarse el origen de replicación del plásmido endógeno de la levadura, el círculo 2\mu. (Broach, (1983) Meth. Enz. 101: 307). De forma alternativa pueden usarse secuencias del genoma de la levadura capaces de promover la replicación autónoma (véase, por ejemplo, Stinchcomb y cols., (1979) Nature 282: 39); Tschemper y cols., (1980) Gene 10: 157; y Clarke y cols., (1983) Meth. Enz. 101: 300).

Las secuencias de control de la transcripción para los vectores fúngicos incluyen promotores para la síntesis de enzimas glicolíticos (Hess y cols., (1968) J. Adv. Enzyme Reg. 7: 149; Holland y cols., (1978) Biochemistry 17: 4900). Promotores adicionales conocidos en la técnica incluyen el promotor de CMV que se proporciona en el vector CDM8 (Toyama y Okayama, (1990) FEBS 268: 217-221); el promotor de la 3-fosfoglicerato quinasa (Hitzeman y cols., (1980) J. Biol. Chem. 255: 2073) y los de otras enzimas glicolíticas.

Otros promotores son inducibles debido a que pueden regularse mediante estímulos ambientales o mediante el medio de crecimiento de las células. Estos promotores inducibles incluyen los de los genes de las proteínas de choque térmico, alcohol deshidrogenasa 2, isocitocromo C, fosfatasa ácida, enzimas asociadas con el catabolismo del nitrógeno y enzimas responsables de la utilización de maltosa y galactosa.

También pueden colocarse secuencias reguladoras en el extremo 3' de las secuencias de codificación. Estas secuencias pueden actuar para estabilizar el ARN mensajero. Los terminadores de ese tipo se encuentran en la región no traducida 3' a continuación de las secuencias de codificación en diversos genes derivados de levaduras y de mamíferos.

Los vectores ejemplares para las plantas y las células vegetales incluyen, pero sin limitación, plásmidos de Agrobacterium T_{i}, virus del mosaico de la coliflor (CaMV) y virus del mosaico dorado del tomate (TGMV).

Los aspectos generales de las transformaciones del sistema hospedador de células de mamíferos han sido descritos por Axel (patente de Estados Unidos nº 4.399.216 expedida el 16 de agosto de 1983). Las células de mamíferos pueden transformarse mediante procedimientos que incluyen, pero sin limitación, transfección en presencia de fosfato cálcico, microinyección, electroporación o mediante transducción con vectores víricos.

Los procedimientos para introducir secuencias de ADN exógenas en los genomas de plantas y levaduras incluyen (1) procedimientos mecánicos, tales como microinyección de ADN a células o protoplastos únicos, centrifugado de las células en un vórtice con perlas de cristal en presencia de ADN, o disparo de esferas de tungsteno u oro recubiertas con ADN al interior de las células o protoplastos; (2) introducción del ADN haciendo las membranas celulares permeables a las macromoléculas mediante tratamiento con polietilenglicol o sometiéndolas a pulsos eléctricos de elevado voltaje eléctrico (electroporación); o (3) uso de liposomas (que contienen ADNc) que se une a las membranas
celulares.

La expresión de las moléculas mutantes de CTLA4 puede detectarse por procedimientos conocidos en la técnica. Por ejemplo, las moléculas mutantes pueden detectarse mediante geles de SDS-PAGE teñidos con Coomassie e inmunotransferencia usando anticuerpos que se unen a CTLA4. La recuperación de proteínas puede realizarse usando medios de purificación de proteínas estándar, por ejemplo cromatografía por afinidad o cromatografía de intercambio de iones, para proporcionar un producto sustancialmente puro (R. Scopes en: "Protein Purification, Principles and Practice", Tercera edición, Springer-Verlag (1994)).

La invención proporciona además moléculas mutantes de CTLA4 solubles producidas en la presente memoria anteriormente.

Mutagénesis basada en codones de CTLA4Ig

En una realización, se usaron mutagénesis dirigidas específicas de sitio y un procedimiento novedoso de selección para identificar diversas mutaciones en el dominio extracelular de CTLA4 que mejoran la avidez de unión por CD86. En esta realización, las mutaciones se llevaron a cabo sobre residuos en las regiones del dominio extracelular de CTLA4 desde serina 25 hasta arginina 33, en la cadena C' (alanina 49 y treonina 51), en la cadena f (lisina 93, ácido glutámico 95 y leucina 96) y en la región desde metionina 97 hasta tirosina 102, tirosina 103 hasta glicina 107 y en la cadena G en las posiciones glutamina 111, tirosina 113 e isoleucina 115. Estos sitios se eligieron basándose en estudios sobre proteínas de fusión CD28/CTLA4 quiméricas (Peach y cols., J. Exp. Med., 1994, 180: 2049-2058) y en un modelo que predecía qué cadenas laterales de los residuos aminoacídicos podían exponerse al disolvente y en la carencia de identidad u homología de los residuos aminoacídicos entre CD28 y CTLA4. También se considera parte de la presente invención cualquier residuo que esté espacialmente cercano (5 a 20 angstrom) a los residuos identificados.

Para sintetizar y seleccionar moléculas mutantes de CTLA4 solubles con afinidades alteradas por CD80 y/o CD86, se adoptó una estrategia de dos etapas. Los experimentos comportaron primero la generación de una genoteca de mutaciones en un codón específico de una porción extracelular de CTLA4 y después la selección de estos mediante análisis de BIAcore para identificar los mutantes con una reactividad alterada por CD80 y/o CD86. El sistema de ensayo BIAcore (Pharmacia, Piscataway, N.J.) usa un sistema de detección por resonancia de plasmones superficiales que esencialmente implica la unión covalente de CD80Ig o CD86Ig a un chip sensor recubierto con dextrano que se localiza en un detector. La molécula de experimentación puede inyectarse después en la cámara que contiene el chip sensor y puede evaluarse la cantidad de proteína complementaria que se une basándose en el cambio de la masa molecular que se asocia físicamente al lado recubierto de dextrano del chip sensor; el cambio de la masa molecular puede ser medido por el sistema detector.

Ventajas de la invención

Debido a que la unión de CTLA4 a CD80 y CD86 se caracteriza por unas velocidades de asociación ("on") rápidas y unas velocidades de disociación ("off") rápidas, y debido a que los complejos de CTLA4Ig-CD86 se disocian aproximadamente de 5 a 8 veces más rápidamente que los complejos de CTLA4Ig-CD80, se razonó que al ralentizar la velocidad de disociación de CTLA4Ig de CD80 y/o CD86 se obtendría como resultado moléculas con propiedades inmunosupresoras más potentes. Por lo tanto, las moléculas mutantes de CTLA4 solubles que tienen una avidez mayor por las células positivas para CD80 y/o CD86 que CTLA4 natural o que las formas no mutadas de CTLA4Ig, es de esperar que bloqueen el cebado de las células activadas específicas de antígeno con una eficiencia mayor que CTLA4 natural o las formas no mutadas de CTLA4Ig.

Además, los costes de producción de CTLA4Ig son muy elevados. La elevada avidez de las moléculas de CTLA4Ig mutantes que tienen propiedades inmunosupresoras potentes mayores puede usarse en clínica, en dosis considerablemente menores que la CTLA4Ig no mutada, para lograr niveles similares de inmunosupresión. De este modo, las moléculas mutantes de CTLA4 solubles, por ejemplo L104EA29YIg, pueden ser muy rentables.

Los siguientes ejemplos se presentan para ilustrar la presente invención y para ayudar a una persona de experiencia ordinaria en la técnica a prepararla y usarla. No se pretende en modo alguno que los ejemplos limiten el alcance de la invención de ninguna otra manera.

Ejemplos Ejemplo 1

Este ejemplo proporciona una descripción de los procedimientos que se utilizan para generar las secuencias de nucleótidos que codifican las moléculas mutantes de CTLA4 solubles de la invención. Se generó un mutante L104EIg con una mutación en un punto único y se analizó para determinar su cinética de unión a CD80 y/o CD86. La secuencia de nucleótidos L104EIg se usó como plantilla para generar la secuencia CTLA4 con mutaciones en dos puntos, L104EA29YIg, que se analizó para determinar su cinética de unión a CD80 y/o CD86.

Mutagénesis basada en codones de CTLA4Ig

Se desarrolló una estrategia de mutagénesis y selección para identificar las moléculas de CTLA4Ig mutantes que poseían unas velocidades de disociación menores (velocidades "off") de las moléculas de CD80 y/o CD86. Se generaron secuencias de nucleótidos con mutación en un punto único usando CTLA4Ig (patentes de Estados Unidos nº: 5.844.095; 5.851.795; y 5.885.796; Nº de acceso de ATCC 68629) como plantilla. Se diseñaron cebadores de PCR de oligonucleótidos mutágenos para la mutagénesis aleatoria de un codón de ADNc específico permitiendo cualquier base en las posiciones 1 y 2 del codón, pero únicamente guanina o tiamina en la posición 3 (XXG/T; también conocida como NNG/T). De este modo, un codón específico que codifique un aminoácido podría mutarse aleatoriamente para codificar cada uno de los 20 aminoácidos. A este respecto, la mutagénesis XXG/T proporciona 32 codones potenciales que codifican cada uno de los 20 aminoácidos. Los productos de la PCR que codificaban mutaciones próximas a -M97-G107 de CTLA4Ig (véase la Figura 7 u 8), se digirieron con SacI/XbaI y se subclonaron en un vector de expresión \PiLN de CTLA4Ig cortado de forma similar. Este procedimiento se usó para generar la molécula de CTLA4 mutante en un punto único L104EIg (Figura 8).

Para la mutagénesis en la proximidad de S25-R33 de CTLA4Ig, se introdujo un sitio de restricción NheI silencioso primero en posición 5' en esta horquilla, mediante mutagénesis dirigida por cebadores de PCR. Los productos de la PCR se digirieron con NheI/XbaI y se subclonaron en vectores de expresión CTLA4Ig o L104EIg cortados de forma similar. Este procedimiento se usó para generar la molécula de CTLA4 mutante en dos sitios L104EA29YIg (Figura 7). En particular, se usó la molécula de ácido nucleico que codificaba la molécula de CTLA4 mutante en un punto único, L104EIg, como plantilla para generar la molécula de CTLA4 mutante en dos sitios, L104EA29YIg. El vector piLN que porta L104EA29YIg se muestra en la Figura 12.

Ejemplo 2

A continuación se proporciona una descripción de los procedimientos de selección usados para identificar los polipéptidos CTLA4Ig mutantes en un sitio único y en dos sitios, expresados a partir de las construcciones que se describen en el Ejemplo 1, que exhibían una avidez de unión por los antígenos CD80 y CD86 mayor que las moléculas de CTLA4Ig no mutadas.

Los actuales estudios in vitro e in vivo indican que CTLA4Ig por sí solo es incapaz de bloquear completamente el cebado de los linfocitos T adicionales específicos de antígeno. Los estudios in vitro con CTLA4Ig y anticuerpo monoclonal específico contra CD80 o CD86 que medían la inhibición de la proliferación de linfocitos T indican que el anticuerpo monoclonal contra CD80 no aumentó la inhibición de CTLA4Ig. Sin embargo, el anticuerpo monoclonal contra CD86 sí aumentó la inhibición, lo que indica que CTLA4Ig no era tan efectivo en el bloqueo de las interacciones de CD86. Estos datos apoyan los descubrimientos anteriores de Linsley y cols. (Immunity, (1994), 1: 793-801) que demuestran que la inhibición de las respuestas celulares mediadas por CD80 requerían aproximadamente unas concentraciones de CTLA4Ig 100 veces menores que para las respuestas mediadas por CD86. Basándose en estos descubrimientos, se supuso que las moléculas mutantes de CTLA4 solubles que tenían una avidez mayor por CD86 que CTLA4 natural deberían ser más capaces que CTLA4Ig de bloquear el cebado de células activadas específicas de antígeno.

Con este fin, se seleccionaron las moléculas mutantes de CTLA4 solubles que se describen en el Ejemplo 1 anterior usando un procedimiento de selección novedoso para identificar varias mutaciones del dominio extracelular de CTLA4 que mejoran la avidez de unión por CD80 y CD86. Esta estrategia de selección proporcionó un procedimiento efectivo para identificar directamente mutantes con velocidades de disociación ("off") aparentemente menores sin necesidad de purificar o cuantificar la proteína dado que la determinación de la velocidad de disociación es independiente de la concentración (O'Shannessy y cols., (1993) Anal. Biochem., 212: 457-468).

Se transfectaron células COS con ADN plasmídico purificado en minipreparación individual y se propagaron durante varios días. Los medios de cultivo condicionados durante tres días se aplicaron a chips biosensores BIAcore (Pharmacia Biotech AB, Uppsala, Suecia) recubiertos con CD80Ig o CD86Ig solubles. Se midieron la unión y disociación específicas de las proteínas mutantes mediante resonancia de plasmones superficiales (O'Shannessy, D. J., y cols., (1993) Anal. Biochem. 212: 457-468). Todos los experimentos se realizaron en biosensores BIAcore^{TM} o BIAcore^{TM} 2000 a 25ºC. Los ligandos se inmovilizaron sobre chips sensores NCM5 de calidad de investigación (Pharmacia) usando acoplamiento estándar con N-etil-N'-(dimetilaminopropil)carbodiimid-N-hidroxisuccinimida (Johnsson, B., y cols. (1991) Anal. Biochem. 198: 268-277; Khilko, S.N., y cols., (1993) J. Biol. Chem. 268: 5425-15434).

Procedimiento de selección

Células COS cultivadas en placas de cultivo de tejidos de 24 pocillos se transfectaron de forma transitoria con ADN que codificaba CTLA4Ig mutante. El medio de cultivo que contenía CTLA4Ig mutante soluble se recolectó 3 días después.

El medio de cultivo de las células COS acondicionado se dejó fluir sobre chips biosensores BIAcore derivados con CD86Ig o CD80Ig (tal como describe Greene y cols., 1996 J. Biol. Chem. 271: 26762-26771) y se identificaron las moléculas mutantes con velocidades de disociación menores que las que se observaban para CTLA4Ig natural. Los ADNc correspondientes a las muestras de medios seleccionadas se secuenciaron y se preparó ADN para realizar una transfección transitoria de células COS a mayor escala, a partir de la que se preparó proteína CTLA4Ig mutante tras la purificación con proteína A de los medios de cultivo.

Las condiciones de análisis por BIAcore y los datos de unión en equilibrio se realizaron tal como describen J. Greene y cols., 1996 J. Biol. Chem. 271: 26762-26771 y tal como se describe en la presente memoria.

Datos de análisis por BIAcore

Los niveles iniciales de los sensogramas se normalizaron a cero unidades de respuesta (UR) antes del análisis. Las muestras se procesaron sobre cubetas de flujo con derivación simulada para determinar los valores de unidades de respuesta (UR) de fondo debido a las diferencias de los índices de refracción entre las soluciones. Las constantes de disociación en el equilibrio (K_{d}) se calcularon a partir de gráficas de R_{eq} en función de C, en las que R_{eq} es la respuesta en estado estacionario menos la respuesta de un chip con derivación simulada y C es la concentración molar del analito. Las curvas de unión se analizaron usando un programa de ajuste de curvas no lineal comercial (Prism, GraphPAD Software).

Los datos experimentales se ajustaron primero a un modelo para unión de un único ligando a un único receptor (modelo de 1 sitio, es decir, un sistema de langmuir simple A+B \leftrightarrow AB) y las constantes de asociación en el equilibrio (K_{d} = [A]\cdot[B]/[AB]) se calcularon a partir de la ecuación R = R_{max}\cdotC/(K_{d}+C). Subsiguientemente, los datos se introdujeron primero en el modelo más simple de dos sitios de unión a ligandos (es decir, a un receptor que tenía dos sitios de unión independientes que no interactúan tal como se describe mediante la ecuación R = R_{max1}\cdotC/(K_{d1}+C)+ R_{max2}\cdotC/(K_{d2}+C)).

Las calidades de los ajustes de estos dos modelos se analizaron visualmente por comparación con datos experimentales y estadísticamente mediante un test F de las sumas de los cuadrados. Se eligió el modelo de un sitio más simple como el mejor ajuste, a no ser que el modelo de dos sitios se ajustase significativamente mejor (p <0,1).

Los análisis de asociación y disociación se realizaron usando el programa BIA evaluation 2.1 (Pharmacia). Las constantes de velocidad de asociación k_{on} se calcularon de dos formas distintas, asumiendo tanto interacciones en un sitio único como interacciones paralelas en dos sitios. Para las interacciones en un sitio único, los valores de K_{on} se calcularon de acuerdo con la ecuación R_{t} = R_{eq} (1-exp^{-ks(t-t}_{0}), en la que R_{t} es una respuesta en un tiempo dado, t; R_{eq} es la respuesta de estado estacionario; t_{0} es el tiempo al inicio de la inyección; y k_{s} = dR/dt = K_{on}\cdotCk_{off} y en la que C es una concentración del analito, calculada en términos de sitios de unión de los monómeros. Para las interacciones en dos sitios, los valores de k_{on} se calcularon de acuerdo con la ecuación R_{t}= R_{eq1}(1-exp^{-ks1(t-t}_{0})+R_{eq2}(1-exp^{ks2(t-t}_{0}). Para cada modelo, los valores de K_{on} se determinaron a partir de la pendiente calculada (aproximadamente al 70% de la asociación máxima) de las gráficas de k_{s} en función de C.

Los datos de disociación se analizaron de acuerdo con modelos de un sitio (AB = A+B) o dos sitios (AiBj = Ai + Bj) y las constantes de velocidad (K_{off}) se calcularon a partir de las curvas de mejor ajuste. Se usó el modelo de sitio de unión excepto cuando los residuales eran superiores al fondo del aparato (2-10 UR, dependiendo del aparato), en cuyo caso se empleaba el modelo de dos sitios de unión. Las semividas de ocupación de los receptores se calcularon usando la relación t_{1/2} = 0,693/K_{off}.

Citometría de flujo

Se compró mAb murino L307.4 (contra CD80) de Becton Dickinson (San José, California) e IT2.2 (contra B7-0 [también conocido como CD86]) de Pharmigen (San Diego, California). Para la inmunotinción, se extrajeron las células CHO positivas para CD80 y/o positivas para CD86 de sus recipientes de cultivo incubando en solución salina tamponada con fosfato (PBS) que contenía EDTA 10 mM. Las células CHO (1-10 x 10^{5}) se incubaron primero con mAbs o proteínas de fusión de inmunoglobulina en DMEM que contenía suero bovino fetal al 10% (FBS), después se lavaron y se incubaron con reactivos de la segunda etapa, inmunoglobulina de cabra conjugada con isotiocianato de fluoresceína contra ratón o contra ser humano (Tago, Burlingame, California). Se dio un último lavado a las células y se analizaron con un FACScan (Becton Dickinson).

SDS-PAGE y cromatografía y de exclusión molecular

Se realizó la SDS-PAGE en geles de arcrilamida con Tris/glicina al 4-20% (Novex, San Diego, CA). Los geles analíticos se tiñeron con azul de Coomassie y las imágenes de los geles húmedos se obtuvieron mediante barrido digital. Se analizaron CTLA4Ig (25 \mug) y L104EA29YIg (25 \mug) mediante cromatografía de exclusión molecular usando una columna de TSK-GEL G300 SW_{XL} (7,8 x 300 mm, Tosohaas, Montgomeryville, PA) equilibrada en solución salina tamponada con fosfato que contenía NAN_{3} al 0,02% con un caudal de 1,0 ml/minuto.

CTLA4X_{C120S}y L104EA29YX_{C120S}

Se preparó CTLA4X_{C120S} monocatenario tal como se ha descrito previamente (Linsley y cols., (1995) J. Biol. Chem., 270: 15417-15424). Brevemente, se usó un plásmido de expresión de oncostatina M y CTLA4 (OMCTLA4) como plantilla, el cebador directo

GAGGTGATAAAGCTTCACCAATGGGTGTACTGCTCACACAG

se eligió para que fuera complementario a las secuencias del vector; y el cebador inverso,

GTGGTGTATTGGTCTAGATCAATCAGAATCTGGGCACGGTTC

correspondía a los siete últimos aminoácidos (es decir los aminoácidos 118-124) del dominio extracelular de CTLA4 y contenía un sitio de restricción enzimática y un codón de terminación (TGA). El cebador inverso especificaba una mutación C120S (cisteína a serina en la posición 120). En particular, la secuencia de nucleótidos GCA (nucleótidos 34-36) del cebador inverso que se muestra anteriormente se sustituye por una de las siguientes secuencias de nucleótidos: AGA, GGA, TGA, CGA, ACT o GCT. Tal como entenderán los expertos en la técnica, la secuencia de nucleótidos GCA es una secuencia complementaria inversa del codón TGC para cisteína. De forma similar, las secuencias de nucleótidos AGA, GGA, TGA, CGA, ACT o GCT son las secuencias complementarias inversas de los codones de serina. Los productos de la reacción en cadena de la polimerasa se digirieron con HindIII/XbaI y se subclonaron de forma direccional en el vector de expresión \PiLM (Bristol-Myers Squibb Company, Princeton, NJ). L104EA29YX_{C120S} se preparó de forma idéntica. Cada construcción se verificó mediante secuenciación del
ADN.

Identificación y caracterización bioquímica de mutantes con avidez elevada

Se eligieron veinticuatro aminoácidos para su mutagénesis y las \sim2300 proteínas mutantes resultantes se analizaron para determinar su unión a CD86Ig mediante resonancia de plasmones superficiales (SPR; tal como se describe más arriba). Los efectos predominantes de la mutagénesis en cada sitio se resumen en la Tabla II. La mutagénesis aleatoria de algunos aminoácidos en S25-R33 aparentemente no alteró la unión a los ligandos. La mutagénesis de E31 y R33 y de los residuos M97-Y102 aparentemente dio como resultado una unión a ligandos reducida. La mutagénesis de los residuos S25, A29 y T30, K93, L96, Y103, L104 y G105 dio como resultado proteínas con velocidades de asociación lentas/o velocidades de disociación lentas. Estos resultados confirman las observaciones anteriores de que los residuos en la región S25-R33 y los residuos de M97-Y102 o próximos influencian la unión a los ligandos (Peach y cols., (1994) J. Exp. Med. 180: 2049-2058.

La mutagénesis de los sitios, S25, T30, K93, L96, Y103 y G105 dio como resultado la identificación de algunas proteínas mutantes que tenían unas velocidades de disociación de CD86Ig más lentas. Sin embargo, en estos casos, la velocidad de disociación lenta se vio comprometida por una velocidad de asociación lenta lo que dio como resultado proteínas mutantes con una avidez global por CD86Ig que era aparentemente similar a la que se observaba en CTLA4Ig natural. Además, la mutagénesis de K93 dio como resultado una agregación significativa que puede haber sido responsable de los cambios cinéticos observados.

La mutagénesis aleatoria de L104 seguida de la transfección de las células COS y la selección mediante SPR de las muestras de medios de cultivo sobre CD86Ig inmovilizado proporcionó seis muestras de medio que contenían proteínas mutantes con velocidades de disociación aproximadamente 2 veces más lentas que CTLA4Ig natural. Cuando se secuenciaron los ADNc correspondientes de estos mutantes, se encontró que cada uno codificaba una mutación de leucina a ácido glutámico (L104E). Aparentemente, la sustitución de leucina 104 por ácido aspártico (L104D) no afectó la unión de CD86Ig.

La mutagénesis se repitió después en cada sitio de los que se listan en la Tabla II, esta vez usando L104E como la plantilla para la PCR en lugar de CTLA4Ig natural, tal como se describe anteriormente. El análisis por SPR, usando de nuevo CD86Ig inmovilizado, identificó seis muestras de medios de cultivo de la mutagénesis de alanina 29 con proteínas que tenían aproximadamente velocidades de disociación 4 veces más lentas que CTLA4Ig natural. Las dos más lentas eran sustituciones de tirosina (L104EA29Y), dos eran leucinas (L104EA29L), una era triptófano (L104EA29W) y una era treonina (L104EA29T). Aparentemente, no se identificó ningún mutante con velocidades de disociación lentas cuando se mutaba alanina 29 de forma aleatoria, sola, en CTLA4Ig natural.

La masa molecular relativa y el estado de agregación de L104E y L104EA29YIg purificadas se evaluaron mediante cromatografía por SDS-PAGE y de exclusión por tamaño. L104EA29YIg (\sim1 \mug; carril 3) y L104EIg (\sim1 \mug; carril 2) aparentemente tenían la misma motilidad electroforética que CTLA4Ig (\sim1 \mug; carril 1) en condiciones reductoras (\sim50 kDa; + \betaME; más 2-mercaptoetanol) y no reductoras (\sim100 kDa; -\betaME) (FIG. 10A). La cromatografía de exclusión por tamaño demostró que L104EA29YIg (FIG. 10C) aparentemente tenía la misma motilidad que CTLA4Ig dimérico (FIG. 10B). Los picos principales representan el dímero proteínico mientras que el pico menor que eluía más rápido de la FIG. 10B representa agregados de mayor peso molecular. Aproximadamente el 5,0% de CTLA4Ig estaba presente en forma de agregados de mayor peso molecular pero no había evidencia de agregación de L104EA29YIg o L104EIg. Por lo tanto, la unión más potente a CD86Ig que se observaba con L104EIg y L104EA29YIg no podía atribuirse a la agregación inducida por la mutagénesis.

Análisis de unión en el equilibrio y cinético

El análisis de unión en el equilibrio y cinético se realizó sobre CTLA4Ig, L104EIg y L104EA29YIg purificadas con proteína A usando resonancia de plasmones superficiales (SPR). Los resultados se muestran en la Tabla I. Las constantes de disociación en el equilibrio (K_{d}; Tabla I) se calcularon a partir de las curvas de unión generadas en un intervalo de concentraciones (5,0-200 nM). L104EA29YIg se une más fuertemente a CD86Ig que L104EIg o CTLA4Ig. La K_{d} menor de L104EA29YIg (3,21 nM) que la de L104EIg (6,06 nM) o CTLA4Ig (13,9 nM) indica una avidez mayor de unión de L104EA29YIg a CD86Ig. La K_{d} menor de L104EA29YIg (3,66 nM) que la de L104EIg (4,47 nM) o CTLA4Ig (6,51 nM) indica una avidez mayor de unión de L104EA29YIg a CD80Ig.

El análisis de unión cinético reveló que las velocidades de asociación comparativas de CTLA4Ig, L104EIg y L104EA29YIg de unión a CD80 eran similares, así como las velocidades de asociación para CD86Ig (Tabla I). Sin embargo, las velocidades de disociación para estas moléculas no eran equivalentes (Tabla I). Comparado con CTLA4Ig, L104EA29YIg tenía una velocidad de disociación aproximadamente 2 veces más lenta de CD80Ig y aproximadamente 4 veces más lenta de CD86Ig. L104E tenía velocidades de disociación intermedias entre L104EA29YIg y CTLA4Ig. Dado que la introducción de estas mutaciones no afectó significativamente las velocidades de asociación, el aumento de la avidez de CD80Ig y CD86Ig observado con L104EA29YIg era probablemente debida primordialmente a un descenso de las velocidades de disociación.

Para determinar si el aumento de la avidez de L104EA29YIg por CD86Ig y CD80Ig se debía a las mutaciones que afectaban la forma en la que cada monómero se asociaba en forma de dímero, o existían cambios estructurales introducidos en cada monómero que potenciaban la avidez, se prepararon construcciones monocatenarias de los dominios extracelulares de CTLA4 y de L104EA29Y siguiendo la mutagénesis de cisteína 120 a serina tal como se describe más arriba y como describen Linsley y cols., (1995) J. Biol. Chem., 270: 15417-15424. Se demostró que las proteínas purificadas CTLA4X_{C120S} y L104EA29YX_{C120S} eran monómeras mediante cromatografía de permeación en gel (Linsley y cols., (1995), referencia anterior), antes de analizar sus propiedades de unión de ligandos mediante SPR. Los resultados demostraron que la afinidad de unión de ambas proteínas monómeras por CD86Ig era aproximadamente 35-80 veces inferior que la que se observaba para sus dímeros respectivos (Tabla I). Esto respalda los datos publicados previamente que establecen que era necesaria la dimerización de CTLA4 para una unión de ligandos de avidez elevada (Greene y cols., (1996) J. Biol. Chem. 271: 26762-26771).

L104EA29YX_{C120S} se unía con una afinidad aproximadamente 2 veces mayor que CTLA4X_{C120S} tanto a CD80Ig como a CD86Ig. Esta afinidad aumentada se debía a una velocidad de disociación de ambos ligandos aproximadamente 3 veces menor. Por lo tanto, una unión de ligandos más potente por L104EA29Y se debía lo más probablemente a la avidez que potenciaba cambios estructurales que se habían introducido en cada cadena monomérica en lugar de a alteraciones en las que la molécula se dimerizaba.

Localización y análisis estructural de mutaciones que potenciaban la avidez

La estructura en solución del dominio extracelular tipo IgV de CTLA4 ha sido determinado recientemente mediante espectroscopia por RMN (Metzler y cols., (1997) Nature Struct. Biol., 4: 527-531. Esto permitió una localización más exacta de leucina 104 y de alanina 29 en el plegamiento tridimensional (FIG. 11A-B). Leucina 104 está situada cerca del extremo C de la región S25-R33, que está espacialmente adyacente a la región MYPPPY. Aunque hay una interacción significativa entre los residuos de la base de estas dos regiones, aparentemente no hay interacción directa entre L104 y A29 aunque ambos comprenden parte de un núcleo hidrófobo contiguo de la proteína. Las consecuencias estructurales de los dos mutantes potenciadotes de la avidez se analizaron mediante diseño de modelos. La mutación A29Y puede acomodarse fácilmente en la hendidura entre la región S25-R33 y la región MYPPPY y puede servir para estabilizar la conformación de la región MYPPPY. En CTLA4 natural, L104 forma interacciones hidrófobas extensas con L96 y V94 cerca de la región MYPPPY. Es altamente improbable que la mutación del ácido glutámico adopte una conformación similar a la de L104 por dos razones. Primero, hay un espacio insuficiente para acomodar la cadena lateral más larga del ácido glutámico en la estructura sin perturbación significativa de la región S25-R33. Segundo, los costes energéticos de sepultar la carga negativa de la cadena lateral del ácido glutámico en la región hidrófoba sería grande. En su lugar, los estudios de diseño de modelos predicen que la cadena lateral del ácido glutámico sobresale en la superficie donde su carga puede estabilizarse mediante solvatación. Un cambio de configuración de ese tipo puede ser acomodado fácilmente por G105, con una distorsión mínima para los otros residuos de la región.

Unión de mutantes de avidez elevada a células CHO que expresaban CD80 o CD86

El análisis por FACS (Fig. 2) de CTLA4Ig y de las moléculas mutantes que se unen a células CHO positivas para CD80 y CD86 transfectadas de forma estable se realizó tal como se describe en la presente memoria. Las células CHO positivas para CD80 y CD86 se incubaron con concentraciones crecientes de CTLA4Ig, L104EA29YIg o L104EIg y después se lavaron. La proteína de fusión de inmunoglobulina unida se detectó usando inmunoglobulina de cabra contra ser humano conjugada con isotiocianato de fluoresceína.

Tal como se muestra en la Figura 2, las células CHO positivas para CD80 o CD86 (1,5 x 10^{5}) se incubaron con las concentraciones que se indican de CTLA4Ig (cuadrados sólidos), L104EA29YIg (círculos) o L104EIg (triángulos) durante 2 horas a 23ºC, se lavaron y se incubaron con el anticuerpo inmunoglobulina de cabra contra ser humano conjugada con isotiocianato de fluoresceína. Se analizó la unión en un total de 5.000 células viables (determinación única) en un FACScan y se determinó la intensidad de fluorescencia media (MFI) a partir de histogramas de datos usando PC-LYSYS. Los datos se corrigieron para tener en cuenta la fluorescencia de fondo medida en las células incubadas únicamente con reactivo de la segunda etapa (MFI = 7). El mAb L6 de control (80 \mug/ml) proporcionó una MFI < 30. Estos resultados son representativos de cuatro experimentos diferentes.

La unión de L104EA29YIg, L104EIg y CTLA4Ig a células CHO transfectadas con CD80 humana es aproximadamente equivalente (FIG. 2A). L104EA29YIg y L104EIg se unen con más fuerza a las células CHO transfectadas de forma estable con CD86 humana que CTLA4Ig (FIG. 2B).

Ensayos funcionales

Los linfocitos T positivos para CD4 humano se aislaron mediante selección inmunomagnética negativa (Linsley y cols., (1992) J. Exp. Med. 176: 1595-1604). Los linfocitos T positivos para CD4 aislados se estimularon con miristato acetato de forbal (PMA) más células CHO positivas para CD80 o positivas para CD86 en presencia de concentraciones de valoración de inhibidor. Los linfocitos T positivos para CD4 (8-10 x 10^{4}/pocillo) se cultivaron en presencia de PMA 1 nM con o sin estimuladores de células CHO irradiadas. Las respuestas de proliferación se midieron mediante la adición de 1 \muCi/pocillo de [^{3}H]timidina durante las 7 horas finales de un cultivo de 72 horas. Se realizó la inhibición mediante L104EA29YIg y CTLA4Ig de linfocitos T estimulados con PMA más CHO positivas para CD80, o CHO positivas para CD86. Los resultados se muestran en la FIG. 3. L104EA29YIg inhibe la proliferación de las células CHO tratadas con PMA positivas para CD80 más que CTLA4Ig (FIG. 3A). L104EA29YIg es también más efectiva que CTLA4Ig para inhibir la proliferación de células CHO tratadas con PMA positivas para CD86 (FIG. 3B). Por lo tanto, L104EA29YIg es un inhibidor más potente tanto de la coestimulación de linfocitos T mediada por CD80 como por CD86.

La Figura 4 muestra la inhibición por L104EA29YIg y CTLA4Ig de los linfocitos T humanos aloestimulados preparados anteriormente y aloestimulados además con una línea celular linfoblastoide B humana (LCL) denominada PM que expresaba CD80 y CD86 (linfocitos T a 3,0 x 10^{4}/pocillo y PM a 8,0 x 10^{3}/pocillo). La aloestimulación primaria se realizó durante 6 días, después se pulsaron las células con ^{3}H-timidina durante 7 horas, antes de determinar la incorporación del radiomarcador.

La aloestimulación secundaria se realizó de la forma siguiente. Se recolectaron linfocitos T aloestimulados primarios durante siete días con medio de separación de linfocitos (LSM) (ICN, Aurora, OH) y se dejaron reposar durante 24 horas. Después se volvió a realizar una estimulación (secundaria) a los linfocitos T en presencia de cantidades de valoración de CTLA4Ig o L104EA29YIg añadiendo PM en la misma relación que anteriormente. La estimulación se realizó durante 3 días, después las células se pulsaron con la radiomarcador y se recolectaron como anteriormente. El efecto de L104EA29YIg sobre los linfocitos T aloestimulados primarios se muestra en la FIG. 4A. El efecto de L104EA29YIg sobre los linfocitos T aloestimulados secundarios se muestra en la FIG. 4B. L104EA29YIg inhibe tanto las respuestas de proliferación de linfocitos T primarias como secundarias mejor que CTLA4Ig.

Para medir la producción de citoquinas (Figura 5), se prepararon placas de aloestimulación secundarias por duplicado. Después de 3 días, se ensayó el medio de cultivo usando kits de ELISA (Biosource, Camarillo, CA) usando las condiciones recomendadas por el fabricante. Se encontró que L104EA29YIg era más potente que CTLA4Ig para bloquear la producción de las citoquinas IL-2, IL-4 e IFN-\gamma por los linfocitos T tras un estímulo alogénico secundario (FIGS. 5A-C).

Los efectos de L104EA29YIg y CTLA4Ig sobre la respuesta de linfocitos mixtos de mono (MLR) se muestran en la Figura 6. Los mononucleocitos de sangre periférica (PBMC; 3,5 x 10^{4} células/pocillo de cada mono) de 2 monos se purificaron con medio de separación de linfocitos (LSM) y se mezclaron con 2 \mug/ml de fitohemaglutinina (PHA). Las células se estimularon 3 días y después se pulsaron con radiomarcador 16 horas antes de su recolección. L104EA29YIg inhibía la proliferación de linfocitos T de mono mejor que CTLA4Ig.

Tabla I

En la siguiente tabla se proporcionan las constantes de equilibrio y cinética aparentes (los valores son las medias \pm desviación típica de tres experimentos diferentes):

2

Tabla II

El efecto de la unión de CD86Ig mediante mutagénesis de CTLA4Ig en los sitios que se listan se determinó mediante SPR, que se describe anteriormente. El efecto predominante se indica con un signo "+".

3

Claims (42)

1. Una molécula mutante de CTLA4 que comprende una secuencia de aminoácidos que comienza por metionina en la posición +1 y termina con ácido aspártico en la posición +124 tal como se muestra en la Figura 7, o que comienza por alanina en la posición -1 y termina con ácido aspártico en la posición +124 tal como se muestra en la Figura 7.

2. La molécula mutante de CTLA4 de acuerdo con la reivindicación 1, que comprende además una secuencia de aminoácidos que altera la solubilidad, afinidad o valencia de la molécula mutante de CTLA4.

3. La molécula mutante de CTLA4 de acuerdo con la reivindicación 1, que además comprende un resto de inmunoglobulina.

4. La molécula mutante de CTLA4 de acuerdo con la reivindicación 3, en la que el resto de inmunoglobulina es una región constante de inmunoglobulina o una porción de la misma.

5. La molécula mutante de CTLA4 de acuerdo con la reivindicación 4, en la que la región constante de inmunoglobulina comprende unas regiones bisagra, CH2 y CH3 de una molécula de inmunoglobulina.

6. La molécula mutante de CTLA4 de acuerdo con la reivindicación 4 ó 5, en la que la región constante de inmunoglobulina o la porción de la misma es una región constante de inmunoglobulina humana o de mono o una parte de la misma.

7. La molécula mutante de CTLA4 de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 3 a 6, en la que el resto de inmunoglobulina comprende una o más mutaciones para reducir la función efectora.

8. La molécula mutante de CTLA4 de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 3 a 7, en la que el resto de inmunoglobulina comprende una bisagra y cualquiera o todos los residuos de cisteína de la bisagra están sustituidos por serina.

9. La molécula mutante de CTLA4 de acuerdo con la reivindicación 8, en la que una cisteína de la posición +130 se sustituye por una serina, una cisteína en la posición +136 se sustituye por una serina y una cisteína en la posición +139 se sustituye por una serina, tal como se muestra en la Figura 7.

10. La molécula mutante de CTLA4 de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 4 a 9, en la que la región constante de inmunoglobulina humana está mutada para incluir una cisteína en la posición +130 sustituida por una serina, una cisteína en la posición +136 sustituida por una serina, una cisteína en la posición +139 sustituida por una serina y una prolina en la posición +148 sustituida por una serina, tal como se muestra en la Figura 7.

11. La molécula mutante de CTLA4 de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 3 a 10, en la que el resto de inmunoglobulina comprende una secuencia de aminoácidos que comienza con ácido glutámico en la posición +126 y termina con lisina en la posición +357, tal como se muestra en la Figura 7.

12. La molécula mutante de CTLA4 de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 3 a 11, que además comprende un residuo aminoacídico de unión que se localiza entre la secuencia de aminoácidos que termina con ácido aspártico en la posición +124 y el resto de inmunoglobulina.

13. La molécula mutante de CTLA4 de acuerdo con la reivindicación 12, en la que el residuo aminoacídico de unión es glutamina.

14. La molécula mutante de CTLA4 de acuerdo con la reivindicación 1, que comprende una secuencia de aminoácidos que comienza con metionina en la posición +1 y termina con lisina en la posición +357 tal como se muestra en la Figura 7, o que comienza con alanina en la posición -1 y termina con lisina en la posición +357 tal como se muestra en la Figura 7.

15. La molécula mutante de CTLA4 de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 14, que además comprende una secuencia de aminoácidos que permite la secreción de la molécula mutante de CTLA4 soluble.

16. La molécula mutante de CTLA4 de acuerdo con la reivindicación 15, en la que la secuencia de aminoácidos comprende un péptido de señal de oncostatina M.

17. La molécula mutante de CTLA4 de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 16, que tiene una velocidad de disociación de la unión a CD86 más lenta que la CTLA4 natural.

18. La molécula mutante de CTLA4 de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 17, que es soluble.

19. La molécula mutante de CTLA4 de acuerdo con la reivindicación 1, que está codificada por la molécula de ácido nucleico depositada con el nº de ATCC PTA-2104.

20. Una molécula de ácido nucleico que comprende una secuencia de nucleótidos que codifica una secuencia de aminoácidos que corresponde a la molécula mutante de CTLA4 de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 19.

21. La molécula de ácido nucleico de acuerdo con la reivindicación 20, que comprende la secuencia de nucleótidos que comienza con guanidina en la posición de nucleótido -3 y termina con adenina en la posición de nucleótido +1071 tal como se muestra en la Figura 7, o que comprende la secuencia de nucleótidos que comienza con adenina en la posición de nucleótido +1 y termina con adenina en la posición de nucleótido +1071 tal como se muestra en la Figura 7.

22. La molécula de ácido nucleico de acuerdo con la reivindicación 20, que está depositada con el nº de ATCC PTA-2104.

23. Una molécula de ácido nucleico que comprende una porción de la molécula de ácido nucleico de la reivindicación 22, en la que la porción codifica el dominio extracelular completo de la molécula de CTLA4 mutante.

24. Un vector que comprende la secuencia de la molécula de ácido nucleico de una cualquiera de las reivindicaciones 20 a 23.

25. El vector de acuerdo con la reivindicación 24, que está depositado con el nº de ATCC PTA-2104.

26. Un sistema de hospedador y vector que comprende un vector de la reivindicación 24 ó 25 en una célula hospedadora adecuada.

27. El sistema de hospedador y vector de acuerdo con la reivindicación 26, en el que la célula hospedadora adecuada es una célula bacteriana o una célula eucariota.

28. Una célula hospedadora que posee el vector de la reivindicación 24 ó 25.

29. La célula hospedadora de acuerdo con la reivindicación 28, que es una célula eucariota.

30. La célula hospedadora de acuerdo con la reivindicación 29, en la que la célula eucariota es una célula COS.

31. La célula hospedadora de acuerdo con la reivindicación 29, en la que la célula eucariota es una célula de ovario de hámster chino (CHO).

32. La célula hospedadora de acuerdo con la reivindicación 31, en la que la célula CHO se selecciona del grupo constituido por DG44, CHO-K1, línea celular CHO-K1 Tet-On, CHO denominada ECACC 85050302, CHO clon 13, CHO clon B, CHO-K1/SF y RR-CHOK1.

33. Un procedimiento para producir una proteína mutante de CTLA4 que comprende cultivar el sistema de hospedador y vector de la reivindicación 26 ó 27 de forma que se produzca la proteína mutante de CTLA4 en una célula hospedadora y recuperar la proteína producida de este modo.

34. Una proteína mutante de CTLA4 que puede obtenerse mediante el procedimiento de la reivindicación 33.

35. Una composición farmacéutica que comprende un vehículo farmacéuticamente aceptable y la molécula mutante de CTLA4 de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 19 o la molécula mutante de CTLA4 de la reivindicación 34.

36. Un procedimiento in vitro para regular una interacción de linfocito T con una célula positiva para CD80 y/o CD86 que comprende poner en contacto la célula positiva para CD80 y/o CD86 con la molécula mutante de CTLA4 soluble de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 19 o con la molécula mutante de CTLA4 de la reivindicación 34 de forma que se forme un complejo de molécula mutante de CTLA4/CD80 o de molécula mutante de CTLA4/CD86, interfiriendo el complejo en la interacción entre el linfocito T y la célula positiva para CD80 y/o CD86.

37. El procedimiento de acuerdo con la reivindicación 36, en el que la célula positiva para CD80 y/o CD86 es una célula presentadora de antígeno.

38. El procedimiento de acuerdo con la reivindicación 36 ó 37, en el que se inhibe la interacción del linfocito T con la célula positiva para CD80 y/o CD86.

39. El uso de la molécula mutante de CTLA4 de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 19 o la molécula mutante de CTLA4 de la reivindicación 34 para preparar una composición farmacéutica para tratar una enfermedad del sistema inmunitario.

40. El uso de acuerdo con la reivindicación 39, en el que la enfermedad del sistema inmunitario está mediada por las interacciones de los linfocitos T con células positivas para CD80 y/o CD86.

41. El uso de acuerdo con la reivindicación 40, en el que se inhiben dichas interacciones de los linfocitos T.

42. El uso de la molécula mutante de CTLA4 de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 19 o la molécula mutante de CTLA4 de la reivindicación 34 y un ligando que reacciona con IL-4 para preparar una composición farmacéutica para inhibir la enfermedad de injerto contra huésped (GVHD).