ES2303361T3 - Conjugados de interferon-alfa-polimero con actividad biologica potenciada y procedimientos de preparacion de los mismos. - Google Patents

Conjugados de interferon-alfa-polimero con actividad biologica potenciada y procedimientos de preparacion de los mismos. Download PDF

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Abstract

Un procedimiento para preparar conjugados de alfa-interferón-polímero, que comprende: a) formar un conjugado de un alfa-interferón estable frente al ácido con un polímero activado, sustancialmente no antigénico, en solución; b) acidificar la solución que contiene el conjugado de (a) hasta un nivel de pH inferior a aproximadamente 3, que es eficaz para escindir selectivamente cualquier enlace que reduzca la bioactividad del interferón conjugado; y a continuación c) ajustar la solución acidificada de (b) hasta un pH fisiológicamente aceptable, en el que la proporción molar de dicho polímero sustancialmente no antigénico con respecto a dicho alfa-interferón varía desde aproximadamente 8:1 hasta aproximadamente 1:8.

Description

Conjugados de interferón-\alpha-polímero con actividad biológica potenciada y procedimientos de preparación de los mismos.
Campo de la invención
La presente invención está dirigida a preparaciones de acción prolongada que contienen interferón. En particular, la invención está dirigida a los conjugados del interferón que tienen niveles más altos de actividad biológica conservada, con relación a la actividad de los conjugados del interferón previamente conocidos, así como a los procedimientos para fabricar y usar los mismos.
Antecedentes de la invención
Se ha sugerido que la conjugación de las proteínas biológicamente activas a polímeros mejora una o más de las propiedades de tales proteínas. Las propiedades mejoradas proporcionadas por la conjugación de un material bioactivo a un polímero incluyen la vida en circulación aumentada, solubilidad con agua aumentada y/o antigenicidad reducida, con relación al mismo material bioactivo en la forma no conjugada. Por ejemplo, algunos de los conceptos iniciales del acoplamiento de péptidos o de polipéptidos, incluidas las proteínas, al polietilenglicol (PEG) y a polímeros solubles con agua similares, están descritos por Davis y col., en la Patente de EEUU Nº 4.179.337, cuya descripción se incorpora en este documento por referencia. Tales conjugados se forman generalmente haciendo reaccionar un material biológicamente activo, tal como una proteína, con un exceso molar de varias veces de un polímero activado, es decir, un polímero que tiene un grupo de enlace terminal, sin importar dónde se unirá el polímero a la proteína.
Las proteínas biológicamente activas que estuvieron entre las primeras para conjugarse de esta manera incluyen, por ejemplo, la insulina y la hemoglobina. Estas proteínas contienen varios sitios de unión amino nucleófilos libres, tales como grupos alfa amino (de preferencia N-terminal), grupos épsilon amino y residuos de histidina, que permiten la unión de varios polímeros, sin pérdida significativa de la actividad biológica.
En algunos casos, sin embargo, la reacción de conjugación encuentra complicaciones. Por ejemplo, llevar a cabo una reacción de conjugación usando cantidades excesivas de los polímeros activados puede dar lugar a conjugados biológicamente inactivos. Tal inactivación puede ser el resultado de cualquiera de una serie de reacciones indeseables, incluidas, por ejemplo, la formación de un enlace conector a la proteína que de como resultado un impedimento estérico o conformacional de un motivo de la proteína necesario para la actividad biológica. Este problema puede resultar difícil de evitar puesto que el polímero y la proteína se unen típicamente en reacciones basadas en soluciones y hay poco que pueda hacerse para preseleccionar los puntos de unión del polímero.
Se ha sugerido que puede reducirse al mínimo la unión no específica del polímero bloqueando previamente los sitios activos con materiales protectores reversibles (eliminables), tales como el fosfato de piridoxal, pero los resultados no han sido coherentes.
Los interferones (a continuación pueden denominarse como "IFNs") son un grupo de proteínas que podrían beneficiarse de las técnicas mejoradas de conjugación a polímeros. Una especie de IFN de gran potencial terapéutico que se beneficiaría especialmente de tal conjugación a polímeros es el alfa interferón (a continuación puede denominarse como "\alpha-IFN"). En el pasado, se han sugerido varios conjugados de polímero-interferón. Se cree que ninguna de las enseñanzas anteriores de la técnica, sin embargo, han descrito la posibilidad de escindir selectivamente algunos enlaces para reducir la actividad del interferón conjugado.
Las Patentes de EEUU Nº 4.766.106 y 4.917.888, describen, entre otros, conjugados de \beta-interferón-PEG. Los conjugados descritos en las patentes anteriores utilizan un enlace amida o éster para unir el metoxipolietilenglicol al interferón. Se describen proporciones molares amplias del polímero y el interferón, que varían desde 0,1 hasta 1,000:1.
La Patente de EEUU Nº 4.894.226, describe el \beta-interferón conjugado a través de un enlace amida a poliprolina usando un brazo separador flexible. De manera similar, la Patente de EEUU Nº 5.281.698, incorporada en su totalidad en este documento por referencia, describe, entre otras, la reacción de interferones con un enlace uretano que forma el polietilenglicol activado usando una proporción de polímero con respecto a la proteína, de mayor preferencia, de 5:1. También, la Patente de EEUU Nº 5.382.657, describe la formación de conjugados de interferón con enlaces amida o uretano usando una proporción de polímero-proteína de aproximadamente 3:1. Aunque en estas patentes se han descrito excesos molares relativamente bajos del polímero activado, no hay enseñanza o sugerencia del control de la localización de uniones covalentes entre el polímero y la proteína o, lo que es más importante, de cómo evitar la formación de conjugados que contengan los polímeros unidos en la área del sitio activo. Por consiguiente, no hubo mención sobre la posibilidad de someter a los conjugados a otro tratamiento para mejorar o recuperar la bioactividad perdida por la reacción de conjugación.
La Solicitud de Patente Europea que lleva Nº de publicación 0 236 987 describe la reacción de alfa y gamma interferones con altos excesos molares polietilenglicoles activados con alquil-imido ésteres. La Solicitud de Patente Europea que lleva Nº de publicación 0 510 356 describe la conjugación de alfa interferón con PEG activado con piridinil carbonilo y tiocarbonilo. En ambos casos, sin embargo, los conjugados resultantes incluyen especies que contienen una amplia variedad de especie pegiladas, incluida una cantidad sustancial que contienen más de una hebra del polímero por molécula de interferón.
En otros intentos anteriores para evitar la pérdida de bioactividad tras la conjugación del polímero, se preparó un conjugado del factor estimulante de colonias de granulocitos ("G-CSF")-polímero haciendo reaccionar el G-CSF con un PEG carboximetil-N-hidroxi succinimidil éster. El conjugado resultante se trata a continuación con hidroxilamina dos molar (pH 7,3) para eliminar los enlaces "inestables", seguido por una reducción del pH hasta 3,5. Kinstler y col., 1996, Pharmaceutical Res. 13(7): 996-1002. Los autores, sin embargo, no proporcionaron ninguna descripción o sugerencia para obtener G-CSF mejorado ni proporcionaron ninguna pauta con respecto al tratamiento de cualquier otro conjugado.
El documento WO96/11953 informa la preparación de conjugados haciendo reaccionar una proteína, ejemplificada por consenso IFN, con un polímero, a un pH ácido (pH 4). El documento WO96/11953 establece que esta reacción evita selectivamente la unión a los grupos épsilon amina de la lisina, mientras que favorece el enlace con el grupo alfa amino del extremo N-terminal. El documento WO96/11953 también describe un procedimiento de tratamiento del pH de dos etapas en el que se hace reaccionar el G-CSF con un PEG a pH 8,0, seguido por la reducción del pH hasta pH 4,0, simplemente como etapa previa a cargar el producto en una columna de separación. No se ha informado la preparación de conjugados de interferón por medio de este segundo procedimiento. Además, debe notarse que el documento WO96/11953 describe el uso de una reacción de alquilación reductora según resulta de preferencia para la unión selectiva del polímero, por ejemplo, PEG, al N-terminal y no enseña ni sugiere las ventajas de una reacción de acilación para unir los polímeros a residuos del IFN diferentes del N-terminal.
Por consiguiente, se cree que ninguna de las referencias de Kinstler y col. mencionadas anteriormente enseñan o sugieren la eliminación preferencial de un enlace conector que inhibe la bioactividad de un sitio activo del interferón.
A pesar del trabajo mencionado anteriormente en la área de los conjugados de interferón-polímero, se han buscado mejoras. En particular, sería beneficioso proporcionar conjugados del interferón que tengan niveles de bioactividad sustancialmente previsibles e incluso uniformes. También sería beneficioso preparar los conjugados del IFN sustancialmente libres de polímeros unidos a la región del sitio activo del interferón.
Si se dispusiera de un procedimiento eficaz para conseguir la conjugación del polímero, que evite al mismo tiempo la interferencia con los sitios bioactivos del alfa interferón, podrían prepararse muchos conjugados de \alpha-IFN-polímero útiles. Por consiguiente, una solución a los problemas descritos anteriormente pondría los conjugados de alfa-interferón óptimamente bioactivos disponibles para la técnica.
Resumen de la invención
Para resolver estas y otras necesidades en la técnica, la presente invención proporciona conjugados nuevos de polímeros adecuados con las proteínas del interferón que tienen actividad biológica deseable, así como los procedimientos para fabricar y usar los mismos. Los procedimientos de la invención también proporcionan conjugados que demuestran proporciones más elevadas de la actividad biológica de las proteínas nativas del interferón, con relación a los producidos por medio de procedimientos conocidos previamente.
De preferencia, tales proteínas del interferón son relativamente estables frente al ácido y exhiben o tiene potencial para al menos una actividad biológica útil. Las proteínas del interferón estables frente al ácido deseable incluyen de preferencia las proteínas del \alpha-IFN.
Por consiguiente, en un aspecto de la invención, se proporcionan los procedimientos para tratar los conjugados de polímeros del \alpha-IFN estable frente al ácido para escindir y eliminar selectivamente las hebras de polímero en el IFN, de preferencia aquellos que puedan reducir la bioactividad del interferón conjugado. El procedimiento incluye las etapas de:
a)
formar un conjugado de un \alpha-IFN estable frente al ácido con un polímero activado, sustancialmente no antigénico, en solución;
b)
acidificar la solución que contiene el conjugado de (a) hasta un nivel de pH inferior a aproximadamente 3, que es eficaz para escindir selectivamente cualquier enlace del polímero que reduzca la bioactividad del interferón conjugado; y a continuación
c)
ajustar la solución acidificada de (b) a un pH fisiológicamente aceptable.
La reacción de la etapa (c) se realiza durante un período de tiempo y a un pH eficaz para dar lugar a un producto que esté sustancialmente libre de conjugados que tengan inhibición significativa de la bioactividad del IFN nativo. Además, el producto de la etapa (c) se aísla opcionalmente de la solución con cualquier procedimiento adecuado conocido en la técnica, según necesidad. La disminución del pH, por ejemplo, la acidificación, se lleva a cabo con un ácido adecuado a una concentración y durante un tiempo tal que los conjugados resultantes conserven sustancialmente la bioactividad del IFN nativo.
Los conjugados del \alpha-IFN se preparan de preferencia haciendo reaccionar un polímero no antigénico, activado por carbamato, con el \alpha-IFN, en una proporción molar de desde aproximadamente 1:8 hasta aproximadamente 8:1 (moles del polímero, por mol del IFN). Las proporciones molares de más preferencia incluyen aquellas que varían desde aproximadamente 1:4 hasta aproximadamente 4:1 moles del polímero por mol del IFN. El polímero sustancialmente no antigénico es de preferencia un óxido del polialquileno (PAO) tal como un polietilenglicol (PEG) que tiene un peso molecular de desde aproximadamente 600 hasta aproximadamente 60.000.
De acuerdo con otra forma de realización de la presente invención, se proporcionan conjugados de \alpha-IFN-polímero que pueden incluirse como parte de soluciones farmacéuticamente aceptables. Los conjugados que pueden prepararse por medio del procedimiento descrito anteriormente incluyen los \alpha-IFN unidos a un polímero activado, sustancialmente no antigénico. La activación se logra de preferencia haciendo reaccionar el polímero con un resto formador de carbamato. Sin estar ligados a la teoría, los solicitantes creen que el enlace del carbamato se extiende entre un grupo amino del IFN y un extremo terminal del polímero sustancialmente no antigénico.
En formas de realización de preferencia, sustancialmente todos los conjugados de \alpha-IFN-polímero de la presente invención contienen una única hebra de polímero unida covalentemente a la molécula del IFN, por ejemplo, son monosustituidos. Sin la intención de estar ligados a ninguna teoría, se cree que el único polímero mencionado anteriormente se une para evitar la inhibición de la bioactividad del interferón conjugado.
Puesto que existen múltiples puntos de unión posibles para un polímero para acilar un interferón y dado el intervalo de proporciones molares aceptables, se comprenderá que, en ciertas formas de realización, el producto conjugado incluye una o más hebras poliméricas.
En otras formas de realización opcionales, donde el IFN está sustituido por más de un polímero, las sustituciones pueden variar desde 2 hasta aproximadamente 8 polímeros por molécula de IFN.
Por consiguiente, pueden producirse preparaciones farmacéuticas con conjugados diseñados para incluir un número sustancialmente uniforme de hebras de polímero por molécula del interferón, mientras se mantienen los niveles maximizados de bioactividad del interferón nativo, con relación a los conjugados del interferón previamente conocidos. Tales conjugados de interferón-polímero previamente conocidos incluyen aquellos preparados con grandes excesos molares de polímeros activados y/o de polímeros incluidos, conjugados al sitio activo del interferón.
La invención también incluye procedimientos para tratar afecciones susceptibles al \alpha-interferón en mamíferos. En este aspecto, los procedimientos de tratamiento incluyen la administración de una cantidad eficaz de conjugados del \alpha-interferón a los mamíferos que necesitan tal terapia.
Como resultado de la presente invención, se proporcionan conjugados de \alpha-interferón que tienen actividad de interferón fiable, relativamente uniforme. En una forma de realización, sin la intención de estar ligados a ninguna teoría o hipótesis, los solicitantes creen que este resultado se debe a la presencia sustancialmente uniforme de una única hebra de polímero por conjugado, en el que, como se discutió anteriormente, la única hebra de polímero está unida sustancialmente lejos del sitio activo del interferón. Otra característica de la presente invención es que se logra una mayor vida en circulación con pérdidas mínimas en la actividad conservada del interferón.
Con objeto de apreciar la presente invención, se describen los siguientes términos:
Debe entenderse que "estable frente al ácido" describe una sustancia, incluida una proteína tal como \alpha-interferón, que conserva sustancialmente todas sus propiedades deseables, incluidas sus propiedades bioactivas, cuando se somete a la etapa de reacción a pH ácido según la invención;
Los términos "bioactivo" y "biológicamente activo" deben considerarse sinónimos con objeto de la presente invención, a menos que se especifique de otra manera. Debe entenderse que el término bioactivo significa que la sustancia a la que se aplica tal término tiene la propiedad de "bioactividad", por ejemplo, utilidad médica (terapéutica y/o de diagnóstico) en un mamífero, tejidos de mamíferos y/o células de mamíferos. Por lo tanto, un interferón bioactivo, o un derivado y/o conjugado del mismo, actúa modificando o determinando un estado o función de un mamífero, de un órgano, un tejido, célula, líquido, producto de secreción de mamífero, y similares. Tal modificación es, por ejemplo, con el objeto de proporcionar un tratamiento médico terapéutico u otro efecto deseado y/o para indicar el estado o la función de un mamífero por medio de una prueba de diagnóstico. Además, debe entenderse que las funciones útiles de una sustancia bioactiva, tales como una proteína o un conjugado del interferón, pueden obtenerse in vivo, ex vivo, o in vitro, según sea adecuado;
debe entenderse que "polímeros bis-activados" incluye a los polímeros que tienen restos alfa y omega terminales que sirven como grupos salientes adecuados durante las reacciones de conjugación (de enlace) con interferones;
debe entenderse que "conjugados de bis-interferón-polímero" describe una única hebra de polímero sustancialmente no antigénico con dos moléculas de interferón unidas covalentemente, una al extremo alfa terminal y una al extremo omega terminal del polímero;
los enlaces "carbamato" y "uretano" deben considerarse sinónimos con objeto de la presente invención;
debe entenderse que "vida en circulación" significa el período de tiempo durante el que un conjugado según la invención, o un \alpha-interferón liberado de un conjugado según la invención, permanece, in vivo, en una concentración farmacéuticamente eficaz en la sangre y/o el plasma circulantes de un mamífero, al que se le ha administrado el conjugado.
debe entenderse que la "afección susceptible al interferón" incluye todo estado de enfermedad, tales como infecciones virales, trastornos inmunes, cánceres, o las afecciones relacionadas, que se benefician terapéuticamente de la administración de interferón exógeno, especialmente \alpha-interferón;
debe entenderse que "conjugados de mono-interferón-polímero" describe a un conjugado que contiene una única molécula de interferón unida covalentemente a un extremo terminal de una única hebra del polímero sustancialmente no antigénico;
debe entenderse que "pH fisiológicamente aceptable" describe un pH que sea compatible con los sistemas fisiológicos.
Para una mejor comprensión de la presente invención, se hace referencia a la siguiente descripción y su alcance se precisará en las reivindicaciones.
Breve descripción de los dibujos
La Figura 1 es un gráfico de una separación por HPLC de conjugados de PEG-\alpha-IFN tomada previo al proceso de hidrólisis selectiva de la presente invención.
La Figura 2 es un gráfico de una separación por HPLC de conjugados de PEG-\alpha-IFN tomada tras el proceso de hidrólisis selectiva de la presente invención.
Descripción detallada de la invención 1. Resumen
Por consiguiente, la presente invención incluye un procedimiento para preparar los conjugados del polímero con las proteínas biológicamente activas del interferón, en el que los conjugados producidos conservan altos niveles de actividad biológica, con relación a los mismos interferones conjugados al mismo polímero por medio de procedimientos previamente usados. En un aspecto de preferencia, el interferón es una proteína del \alpha-interferón. Por consiguiente, el procedimiento de la invención incluye:
a)
formar un conjugado de un interferón estable frente al ácido, unido a polímero, con un polímero sustancialmente no antigénico, en solución;
b)
acidificar la solución que contiene el conjugado (a) hasta un nivel de pH inferior a 3 que es eficaz para escindir selectivamente cualquier enlace del polímero que reduzca la actividad del interferón conjugado; y a continuación
c)
ajustar la solución acidificada de (b) hasta un pH fisiológicamente aceptable.
En una forma de realización de preferencia, la etapa (b) del procedimiento, descrito supra, se lleva a cabo durante un período de tiempo y a un pH eficaz para dar lugar a un producto conjugado según la invención. También resulta de preferencia que el producto conjugado esté sustancialmente libre de conjugados que tengan inhibición significativa de la bioactividad del IFN nativo, por ejemplo, inhibición provocada por interferencia del sitio activo, impedimento o bloqueo estérico por el(los) polímero(s) unido(s). El experto en la técnica, que determina y ajusta fácilmente el período de tiempo y el pH óptimos, apreciará que tales parámetros se ajustan usando procedimientos rutinarios, basados en el polímero específico, el enlace activado, la naturaleza del conjugado deseado, y así sucesivamente. El término "sustancialmente libre" indica que una proporción significativa de los conjugados no deseables con actividad más baja que la del IFN nativo, se eliminan. Por consiguiente, el producto incluye generalmente desde aproximadamente 0 hasta aproximadamente 20 por ciento de los conjugados no deseables descritos. De más preferencia, el producto incluye desde aproximadamente 5 hasta aproximadamente 20 por ciento de los conjugados no deseables, o desde aproximadamente 10 hasta aproximadamente 15 por ciento de los conjugados no deseables.
En otra forma de realización de preferencia, el producto de la etapa (c) del procedimiento de la invención se purifica o aísla de preferencia de la solución con pH ajustado por medio de cualquier procedimiento adecuado conocido en la técnica, según sea necesario. Una discusión de un procedimiento del aislamiento se discute y ejemplifica, simplemente con objeto ilustrativo, por medio del texto y los Ejemplos a continuación en este documento.
2. Interferones
Los interferones son una familia compleja de proteínas citocinas. Actualmente, los interferones se categorizan en cinco diferentes tipos: alfa IFN (IFN de leucocitos), beta IFN (IFN de fibroblastos), gammas IFN (IFN inmune), omega IFN y tau IFN (factor trofoblástico). Para una revisión de los detalles y de las relaciones de homología de las proteínas de IFN conocidas, véase, por ejemplo, Viscomi, 1997, Biotherapy 10:59-86, incorporado en este documento por referencia. Además, se han construido e informado diversos interferones recombinantes y que no se presentan en la naturaleza. Por ejemplo, el IFN humano de consenso es un alfa IFN producida de manera recombinante como consenso de las secuencias especificadas humanas del interferón. Aunque a continuación solamente se discuten los alfa interferones, el experto apreciará que la invención puede practicarse opcionalmente con otros miembros de la familia de proteínas de los interferones que sean provechosamente estables frente al ácido y que proporcionen los sitios de unión al polímero necesarios y las actividades biológicas deseadas.
\alpha-Interferones
En un aspecto de la invención, los \alpha-IFN resultan de preferencia para los procesos y conjugados de la presente invención. En general, puede prepararse u obtenerse la porción \alpha-IFN del conjugado del polímero de una diversidad de fuentes incluidas las técnicas recombinantes, tales como aquellas que usan genes sintéticos expresados en E. coli. Véase también Pestka, "Interferon a" en Human Citokines, Blackwell Scientific Publications 1-16 (1992), cuya descripción se incorpora en este documento por referencia. Otros IFN se describen en "Structure-activity of Type I Interferons" Biotherapy 10:59-86 (1997), en las Patentes de EEUU Nº 4.897.471, 5.541.293 y 5.661.009, cuyos contenidos se incorporan en este documento por referencia. Como alternativa, el \alpha-IFN puede también ser un extracto de un mamífero tal como un \alpha-IFN de ser humano, rumiante o bovino.
Se conoce una serie de proteínas de \alpha-IFN. Estas incluyen, por ejemplo, las proteínas codificadas por los ocho diferentes ADNc clonados de IFN de leucocitos humanos informados por Goeddel y col., 1981, Nature 290:20-21, cuya descripción se incorpora en este documento por referencia. Otro \alpha-IFN es el interferón humano de consenso. El interferón de consenso es un péptido que no se presenta en la naturaleza, que incluye principalmente las secuencias de aminoácidos y péptidos presentes en todos los subtipos de \alpha-IFN humanos que se presentan en la naturaleza. En las posiciones de la secuencia en las que no hay aminoácidos comunes a todos los subtipos, se selecciona el residuo que predomina entre los diversos subtipos. Más información con respecto al \alpha-IFN humano de consenso y a los procedimientos para obtener el mismo se resumen, por ejemplo, en el documento WO 96/11953, cuya descripción se incorpora en este documento por referencia.
Un \alpha-IFN particularmente de preferencia es el IFN\alpha-2b, un producto fabricado de manera recombinante del Schering Corp., Kenilworth, NJ. Otras sustancias, incluidas fracciones de IFN o del \alpha-IFN o polipéptidos o sustancias precursoras que tienen un efecto de IFN en los mamíferos, pueden también incluirse en los conjugados de la presente invención.
Según se usa en este documento, "efecto de IFN en mamíferos" significa cualquier sustancia que demuestre actividad in vivo que corresponda con la observada con los IFN. Estas sustancias se preparan usando las técnicas conocidas por los expertos en la técnica tales como el cultivo de tejidos, la extracción de fuentes animales o por medio de procedimientos de ADN recombinante. También se contemplan las fuentes transgénicas de IFN y restos relacionados. Tales proteínas se obtienen de animales transgénicos, es decir, ratones, cerdos, vacas, etc. en los que la proteína de IFN se expresa en la leche, sangre, o en los tejidos. Se entiende también que las técnicas recombinantes podrían también incluir un sitio de glicosilación para la adición de un resto carbohidrato en el polipéptido derivado de manera recombinante. El procedimiento por el que se prepara el IFN para los conjugados de la presente invención no se limita a los descritos en este documento.
Como se estableció anteriormente, el \alpha-IFN resulta de preferencia para la presente invención no sólo por sus características bioquímicas y serológicas, sino también porque tiene propiedades antivirales documentadas y difunde más con eficacia en el torrente sanguíneo que otros interferones. Además, el \alpha-interferón es estable frente al ácido por lo que se beneficia de los procedimientos de la invención. Mientras que no desea estar ligado a ninguna teoría, se cree que la eliminación catalizada por el ácido de los polímeros no deseables del \alpha-IFN contribuye a mantener la actividad del IFN nativo.
Según se indicó anteriormente, los \alpha-IFN de acuerdo con la invención son de mayor preferencia estables frente al ácido cuando se ponen en contacto durante un período de tiempo eficaz con una solución de reacción que tiene un pH ácido. El nivel del pH es suficiente para eliminar, hidrolizar o de otra manera escindir los enlaces, por ejemplo, enlaces carbamato, en una área del sitio activo de una proteína del interferón de interés. Los \alpha-interferones recombinantes adecuados que pueden usarse en la práctica de la invención incluyen, pero no se limitan al interferón alfa-2b tal como Intron® A disponible en Schering Corporation, Kenilworth, N. J., interferón alfa-2a tal como Roferon® A disponible en Hoffmann-La Roche, Nutley, N. J., e Infergen® disponible en Amgen, Thousand Oaks, CA.
3. Polímeros no antigénicos
Para formar los conjugados de interferón de la presente invención, se convierten los polímeros sustancialmente no antigénicos tales como los poli(óxidos de alquileno) (PAO) en las formas activadas, término conocido por los expertos en la técnica. Por consiguiente, uno y de preferencia ambos grupos hidroxilo del extremo terminal del polímero, (es decir, los grupos hidroxilo alfa y omega terminales) se convierten en grupos funcionales reactivos que, a su vez, permiten que el polímero se conjugue de manera covalente a una proteína de interés. A este proceso se lo denomina con frecuencia "activación" y al producto se lo llama "poli(óxido de alquileno) activado". A los polímeros que contienen los dos grupos de enlace alfa y omega se los denomina óxidos de polialquileno bis-activados. Otros polímeros sustancialmente no antigénicos tales como el polipropilenglicol (PPG) y aquellos que se describen en este documento se "activan" o funcionalizan de manera similar.
Los polímeros activados de preferencia son los que forman un enlace uretano o carbamato con un grupo amino nucleófilo, por ejemplo, un grupo \alpha-amino N-terminal, un grupo \varepsilon-amino ácido de lisina y un grupo imidazol amino de histidina, que se encuentra en las moléculas de IFN. De preferencia, el enlace uretano se forma usando un grupo oxicarbonil-oxi-N-dicarboximida terminal, tal como un grupo carbonato de succinimidilo. Los grupos activadores alternativos incluyen N-succinimida, N-ftalimida, N-tetrahidroftalimida y otros de tales grupos activadores, tal como el benzotriazol. Por consiguiente, los polímeros sustancialmente no antigénicos incluyen los grupos salientes en los extremos alfa y/u omega terminal(es). Estos grupos formadores de uretano se describen en la Patente de EEUU Nº 5.122.614 del solicitante, cuya descripción se incorpora en este documento por referencia.
La Patente de EEUU Nº 5.122.614 también describe la formación de derivados del carbonato de N-succinimida de óxidos de polialquileno incluidos los polietilenglicoles que también son capaces de formar enlaces uretano con dianas de grupos amino de lisina. Los otros grupos incluyen, carbonato del p-nitrofenilo (PNP), oxicarbonilimidazol (CI) y tiazolidintiona.
De preferencia, el polímero sustancialmente no antigénico se activa con el grupo SC. La Patente de EEUU Nº 5.122.614 también describe la formación de derivados carbonato de mono- y bis-N-succinimidilo de los óxidos de polialquileno y de los conjugados producidos de los mismos. Se comprenderá, sin embargo, que sin importar el grupo saliente del polímero activado utilizado, la reacción del enlace uretano o carbamato tendrá lugar de una manera similar que resultará evidente para el experto en la técnica sin excesiva experimentación.
Aunque los enlaces carbamato o uretano generalmente se consideran en la técnica como relativamente resistentes a la hidrólisis, se ha encontrado sorpresivamente que bajo las condiciones descritas en este documento, se considera posible que cuando el enlace carbamato que une al grupo amino de lisina o histidina al polímero está localizado cerca de un ácido glutámico o aspártico, el grupo amino libre de estas lisinas o histidinas de la región del sitio activo se regenera cuando el conjugado se expone a un pH inferior durante un tiempo suficiente, aumentando de esta manera la actividad específica del conjugado resultante, mientras que otros enlaces carbamato en la proteína no están sustancialmente afectados. Aunque los polímeros pueden unirse al interferón usando otros tipos de enlace, es decir, amida, urea, etc., usando tipos alternativos de polímeros activados, el enlace carbamato resulta de preferencia por su relativamente único grado de fuerza de enlace y susceptibilidad a la hidrólisis selectiva en la región del sitio activo del interferón.
En otro aspecto de la invención, el grupo de polímeros sustancialmente no antigénicos, incluye opcionalmente los polímeros bis-activados, por ejemplo, óxidos de polialquileno (PAO) bis-activados, tales como los polietilenglicoles bis-activados.
Los polímeros adecuados variarán sustancialmente en peso; sin embargo, los polímeros que tienen pesos moleculares que varían desde aproximadamente 600 hasta aproximadamente 60.000 se seleccionan usualmente para el objeto de la presente invención. Los pesos moleculares desde aproximadamente 1.000 hasta aproximadamente 40.000 resultan de preferencia y desde 2.000 hasta aproximadamente 20.000 son particularmente de preferencia.
Las sustancias poliméricas empleadas según la invención son también de preferencia hidrosoluble a temperatura ambiente. Una lista no limitante de tales polímeros incluye a los homopolímeros de óxido de polialquileno tales como del polietilenglicol (PEG) o polipropilenglicoles, polioles polioxietilenados, copolímeros de los mismos y copolímeros de bloque de los mismos, a condición de que se mantenga la solubilidad con agua de los copolímeros de bloque.
Como alternativa a los polímeros basados en PAO, pueden usarse con eficacia materiales no antigénicos tales como dextrano, polivinilpirrolidonas, poliacrilamidas, alcoholes polivinílicos, polímeros basados en hidrocarburos y similares. La activación de los grupos terminales de estas sustancias poliméricas puede afectarse en formas similares a la usada para convertir óxidos de poliaquileno y por lo tanto resultará evidente para los expertos en la técnica. Los expertos en la técnica se darán cuenta que la lista siguiente es meramente ilustrativa y que están contemplados todos los materiales poliméricos que tengan las cualidades descritas en este documento. Con objeto de la presente invención, "eficazmente no antigénico" significa todos los materiales comprendidos en la técnica que no sean tóxicos y que no provoquen una respuesta inmunogénica apreciable en los mamíferos.
4. Reacciones de conjugación \alpha-interferón-polímero
Los polímeros activados se utilizan de preferencia en proporciones molares cuidadosamente definidas para formar los conjugados descritos en este documento. Resulta de preferencia que el polímero formador de enlaces carbamato esté presente en cantidades molares aproximadamente iguales o inferiores al interferón. Por consiguiente, el polímero activado estará presente en cantidades desde aproximadamente 1:8 hasta aproximadamente 8:1 (moles de polímero por mol de IFN). Otras proporciones molares usadas según la invención incluyen aquellas que varían desde aproximadamente 1:4 hasta aproximadamente 4:1 moles de polímero por mol de IFN. En otro aspecto, pueden usarse proporciones molares desde aproximadamente 1:2 hasta aproximadamente 2:1 moles de polímero por mol de IFN. El experto por consiguiente apreciará que el procedimiento de la invención permite proporciones de al menos aproximadamente 8 moles de polímero por cada mol de IFN que posibilitan la formación de cantidades significativas de los conjugados deseados, que pueden a continuación tratarse para maximizar la bioactividad y, si es necesario, seleccionarse para eliminar las especies con peso molecular más elevado.
La reacción de conjugación se realiza bajo condiciones relativamente suaves para evitar la inactivación del interferón. Las condiciones suaves incluyen mantener el pH de la solución de reacción en el intervalo de 6-8 y las temperaturas de la reacción dentro del intervalo desde aproximadamente 0 hasta 30ºC y de preferencia aproximadamente a temperatura ambiente, es decir, 19-22ºC. Una lista no limitante de tampones adecuados incluye el fosfato, citrato, acetato, etc. El interferón sin modificar resultante de estas condiciones de reacción puede reciclarse fácilmente en futuros lotes para otras reacciones de conjugación.
En un aspecto opcional de la invención, se usan las formas bis-activadas de un polímero para formar los conjugados de interferón.
Las reacciones de conjugación de la presente invención que usan el polímero activado proporcionan inicialmente a una mezcla de reacción o combinación que contiene conjugados de mono-interferón, interferón sin reaccionar, el polímero sin reaccionar y algunas especies del peso molecular alto. Las especies de peso molecular alto incluyen conjugados de hebras múltiples, es decir, conjugados que contienen una pluralidad de hebras del polímero y/o especies de PEG-IFN polimerizadas (entrecruzadas), hasta el número máximo de sustituciones deseadas y que pueden conseguirse con un IFN particular. Tras eliminar las especies sin reaccionar y las especies de peso molecular alto, se recuperan las composiciones que contienen principalmente los conjugados de mono-interferón-polímero. Los conjugados tienen al menos aproximadamente el 20% de la actividad biológica asociada con el interferón nativo o sin modificar, según se mide usando de un ensayo de protección viral convencional, tal como un ensayo de CPE con desafío de células de carcinoma de pulmón humanas A549 con virus EMC. Véase, por ejemplo, Larocca, A. T., Borden, E. C., y Colby, C. B. en Human Citokynes, Handbook for Basic & Clinical Research B.B. Aggarwal & S.U. Gutterman (eds.), Blackwell Scientific Publications, Boston, 1991, cuya descripción se describe en este documento por referencia. En aspectos de preferencia de la invención, sin embargo, los conjugados tienen aproximadamente el 30% de la actividad biológica asociada con el interferón sin modificar y de mayor preferencia, la mezcla tiene aproximadamente el 40% de la actividad biológica asociada con el interferón sin modificar. Debe entenderse que estos valores actividad conservada son valores calculados previo al procedimiento de tratamiento ácido descrito en este documento.
En un aspecto opcional de la invención, se usa un tensioactivo en los procedimientos de conjugación de la presente invención. Los tensioactivos adecuados incluyen agentes de tipo iónico tales como dodecilsulfato sódico, (SDS). También pueden usarse otros tensioactivos iónicos tales como el dodecilsulfato de litio, compuestos de amonio cuaternarios, ácido taurocólico, ácido caprílico, ácido decansulfónico, etc. También pueden usarse los tensioactivos no iónicos tales como los polioxietilen sorbitán (Tween), éteres de polioxietileno (Tritones). Véase también Neugebauer, A Guide to the Properties and Uses of Detergents in Biology and Biochemistry (1992) Calbiochem Corp. Las únicas limitaciones en los tensioactivos usados en los procedimientos de la invención son que se utilicen bajo condiciones y a las concentraciones que no provoquen la desnaturalización sustancial irreversible del interferón y que no inhiban totalmente la conjugación del polímero. Los tensioactivos están presentes en las mezclas de reacción en cantidades desde aproximadamente 0,01 hasta 0,5%; de preferencia desde 0,05 hasta 0,5%; y de mayor preferencia desde aproximadamente 0,075 hasta 0,25%. También están contempladas las mezclas de los tensioactivos.
A continuación se presenta una reacción de conjugación representativa:
Se disuelve un exceso molar de aproximadamente 2 veces de un polímero activado formador de enlaces carbamato en Agua Para Inyección (pH aproximadamente 6,0) y a continuación se añade a una solución del interferón ajustada hasta un pH de aproximadamente 6,5-7,2 con el tampón de fosfato u otro tampón adecuado. Se deja incubar la reacción a temperatura ambiente (aproximadamente 20-25ºC) durante un tiempo adecuado, tal como aproximadamente 2 horas, mezclando suavemente de forma continua. Se apreciará que si se utiliza más polímero activado, será más probable que los conjugados resultantes contengan más de una hebra del polímero.
El número promedio de hebras incluidas como parte del conjugado puede determinarlo un experto, sin excesiva experimentación. De la misma manera, el experto podrá determinar fácilmente el número óptimo de hebras por conjugado y/o el número promedio óptimo de hebras por conjugado, simplemente realizando las evaluaciones rutinarias de la potencia y eficacia del conjugado para el uso previsto.
A continuación, se detiene la reacción de conjugación un exceso varias veces molar de glicina. El interferón sin modificar presente en la combinación de la reacción, tras la extinción puede reciclarse en futuras reacciones usando cromatografía de intercambio iónico o de exclusión por tamaño o técnicas de separación similares. De preferencia, las composiciones de la presente invención contienen menos de aproximadamente 5% de interferón sin modificar.
5. Mejora de la bioactividad de interferón del conjugado del polímero
Tras la preparación de los conjugados de polímero-interferón deseados y si de ser necesario, la purificación, o separación de los productos de reacción no deseados, los conjugados se tratan para eliminar sustancialmente todos los polímeros, que interfieren con la región del sitio activo, para aumentar la actividad de interferón del conjugado. Por consiguiente, en este aspecto de la invención, el procedimiento incluye:
Formar un conjugado de un \alpha-IFN estable frente al ácido con un polímero activado, sustancialmente no antigénico, en solución, y a continuación ajustar (por ejemplo, acidificar) hasta un nivel de pH inferior a aproximadamente 3 que es eficaz para escindir selectivamente cualquier enlace presente en o adyacente a un sitio activo del \alpha-IFN. A continuación, el pH de la solución acidificada se ajusta hasta un valor fisiológicamente aceptable.
Los conjugados se mantienen típicamente en una solución acuosa tamponada tras la conjugación y purificación a un pH de aproximadamente 6,0-7,5. A continuación se transfiere la solución, de ser necesario, a un recipiente adecuado al que se puede añadir el ácido. Una lista no limitante de ácidos adecuados incluye los ácidos haloacéticos tales como el ácido trifluoroacético, ácido acético, ácido clorhídrico, ácido sulfúrico, ácido fosfórico, etc. La cantidad de ácido añadido a los conjugados se describe como una cantidad que reduce el pH. Esta cantidad dependerá de varios factores incluidos el tipo de ácido seleccionado, la fuerza y concentración del ácido y la proteína de \alpha-IFN particular, etc. La cantidad puede describirse además como la cantidad suficiente para conseguir la reducción deseada del pH y la hidrólisis selectiva deseada en la región del sitio activo sin provocar desnaturalización irreversible significativa o el desplegamiento del interferón.
El pH de la solución que contiene el ácido se reduce hasta menos de 3. Por lo tanto, el pH de la solución adicidificada o que contiene ácido variará desde un pH desde aproximadamente 1 hasta aproximadamente 3. Como podrá apreciar el experto, el intervalo óptimo de pH se determinará fácilmente por medio de la manipulación rutinaria y sin excesiva experimentación, al realizar el procedimiento y cuantificar la calidad y cantidad del rendimiento, que depende de las condiciones de reacción particulares y, por ejemplo, los conjugados a tratar. De manera similar, se optimizan fácilmente los otros parámetros de la reacción de conjugación, especialmente la etapa de acidificación.
El tiempo durante el que se exponen los conjugados al pH más bajo se considera generalmente como un tiempo suficiente para conseguir el resultado deseado mientras se evitan efectos perjudiciales en el interferón. El tiempo exacto variará dependiendo del tamaño del lote, el tipo de ácido utilizado y otros parámetros del proceso que serán evidentes para el experto en la técnica. Está contemplado que los períodos de tiempo de desde aproximadamente 2 minutos hasta aproximadamente 7 horas se considerarán generalmente suficientes para conseguir la suficiente hidrólisis selectiva sin desnaturalización irreversible significativa de las proteínas. De más preferencia, se usa un período de tiempo de desde aproximadamente 2 minutos hasta aproximadamente 4 horas, o incluso un período de tiempo de desde aproximadamente 1 hasta aproximadamente 4 horas.
Según lo precisado anteriormente, mientras que los Solicitantes no están ligados a la teoría, se cree que la mejora de la bioactividad proporcionada por el tratamiento ácido se produce por la escisión de un grupo amino nucleófilo modificado por carbamato. El grupo carbamato escindido es posiblemente uno que provoca interferencia con la bioactividad del interferón, por ejemplo, al bloquear o interferir con un sitio activo, o quizás con la estructura o la conformación del interferón de alguna manera.
Tras la etapa de hidrólisis selectiva de la reacción, se vuelve a poner a los conjugados tratados con ácido de interferón y polímero sustancialmente no antigénico en un pH fisiológicamente aceptable, es decir, desde aproximadamente 6,5 hasta aproximadamente 7,5.
6. Aislamiento de los conjugados
En otra forma de realización opcional de la invención, se aíslan las diversas especies de interferón-polímero, es decir, conjugados de mono o polihebras. Esta etapa puede llevarse a cabo previo a, o de preferencia, tras la etapa del tratamiento ácido. La separación se efectúa colocando las especies mezcladas en una solución tampón que contiene desde aproximadamente 1 hasta 10 mg/ml de los conjugados de interferón-polímero. Las soluciones adecuadas tienen un pH desde aproximadamente 6,0 hasta aproximadamente 9,0 y de preferencia desde aproximadamente 7,5 hasta aproximadamente 8,5. Las soluciones contienen de preferencia una o más sales tampón seleccionadas de KCl, NaCl, K_{2}HPO_{4}, KH_{2}PO_{4}, Na_{2}HPO_{4}, NaH_{2}PO_{4}, NaHCO_{3}, NaBO_{4} y NaOH. Resultan de preferencia los tampones de fosfato de sodio.
Según el tampón de la reacción, la solución del conjugado de polímero-interferón puede tener que someterse primero a intercambio/ultrafiltración del tampón para eliminar cualquier polímero sin reaccionar. Por ejemplo, la solución del conjugado de PAO-interferón puede ultrafiltrarse a través de una membrana con un corte de bajo peso molecular (10.000 a 30.000 Dalton) para eliminar la mayoría de los materiales no deseados tales como el polímero sin reaccionar, tensioactivos (si están presentes), o similares.
El fraccionamiento de los conjugados en una combinación que incluye el producto deseado sustancialmente aislado, por ejemplo, polímero monosustituido-IFN, se realiza de preferencia usando un medio de cromatografía de intercambio aniónico. Tales medios son capaces de unir selectivamente conjugados de PAO-interferón a través de las diferencias de cargas que varían de una manera algo predecible. Por ejemplo, la carga superficial del \alpha-IFN está determinada por el número de aminoácidos cargados disponibles en la superficie de la proteína. De estos aminoácidos cargados, los grupos amino nucleófilos, por ejemplo, los grupos alfa amino, los residuos de lisina y/o los residuos de histidina sirven como el punto de unión potencial de los conjugados de óxido de polialquileno. Por consiguiente, las diversas especies de conjugados del interferón tendrán diferentes cargas y permitirán el aislamiento selectivo.
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El uso de resinas de intercambio aniónico fuertemente polares tales como las resinas de intercambio aniónico de aminas cuaternarias son especialmente de preferencia para el procedimiento de la presente invención. Incluidas entre las resinas de intercambio aniónico cuaternario disponibles en el comercio adecuadas para uso con la presente invención están Q-HD, QA TRISACRYL® y QMA-SPHEROSIL®, resinas de aminas cuaternarias recubiertas sobre una matriz de polímero, fabricadas por IBF de Garenne, Francia, para Sepracor de Marlborough, Massachusetts; también pueden usarse TMAE650M®, una resina de tetrametilamino etilo recubierta sobre una matriz de polímero, fabricada por EM-Separators de Gibbstown, Nueva Jersey; QAESS0C®, y SUPERQC®, ambas resinas de amina cuaternaria recubiertas sobre una matriz de polímero y fabricadas por TosoHaas de Montgomeryville, PA. QMA Accell, fabricado por Millipore de Millford, MA y resinas PEI fabricadas por JT Baker de Phillipsburg, NJ. También pueden usarse otras resinas de intercambio aniónico adecuadas, por ejemplo, las resinas DEAE.
Por ejemplo, la resina de intercambio aniónico se empaqueta de preferencia en una columna y se equilibra por los medios convencionales. Se usa un tampón que tiene el mismo pH y osmolalidad que la solución del interferón conjugado con el polímero. El tampón de elución contiene de preferencia una o más sales seleccionadas de KCl, NaCl, K_{2}HPO_{4}, KH_{2}PO_{4}, Na_{2}HPO_{4}, NaH_{2}PO_{4}, NaHCO_{3}, NaBO_{4} y (NH_{4})_{2}CO_{3}. La solución que contiene el conjugado se adsorbe a continuación sobre la columna con la especie de alto peso molecular y el polímero sin reaccionar que no se retiene. Al completarse la carga, se aplica a la columna un flujo de un gradiente de un tampón de elución con concentraciones crecientes de la sal para eluir la fracción deseada de interferón conjugado con óxido de polialquileno. Las fracciones combinadas eluidas se limitan de preferencia a conjugados de mono- y bis- interferón-polímero tras la etapa de separación de intercambio aniónico. Cualquier especie del interferón sin conjugar puede a continuación lavarse de la columna por medio de técnicas convencionales. Si se desea, también pueden separarse las especies de mono- y bis-interferón una de la otra por medio de otra cromatografía de intercambio iónico o por cromatografía de exclusión por tamaño.
También pueden usarse técnicas que utilizan múltiples pasos isocráticos para aumentar la concentración. Las múltiples etapas de elución isocráticas para aumentar la concentración darán lugar a la elución secuencial de conjugados de mono-interferón-polímero y a continuación, en formas de realización opcionales, conjugados de bis-interferón-polímero.
El intervalo de temperaturas para la elución está entre aproximadamente 4ºC y aproximadamente 25ºC. De preferencia, la elución se realiza a una temperatura de desde aproximadamente 6ºC hasta aproximadamente 22ºC. Por ejemplo, la elución de la fracción del PAO-\alpha-IFN se detecta por absorbancia de UV a 280 nm. La recogida de las fracciones puede conseguirse por medio de simples perfiles de tiempo de elución.
7. Procedimientos de tratamiento
Otro aspecto de la presente invención proporciona procedimientos de tratamiento para diversas afecciones en mamíferos. Los procedimientos incluyen administrar una cantidad eficaz de conjugados de interferón-polímero, que se han preparado como se describe en este documento, a un mamífero que necesita tal tratamiento. Los conjugados son útiles para, entre otras cosas, tratar las enfermedades o las afecciones susceptibles al interferón que responderían positiva o favorablemente, según se conoce a estos términos en las técnicas médicas, a la terapia basada en el interferón. Por consiguiente, sin limitación, los conjugados de interferón pueden usarse para tratar las afecciones que se beneficiarían de la inhibición de la replicación de virus sensibles al interferón. Además, los conjugados pueden usarse para modificar diversas respuestas inmunes incluidas la inhibición de la respuesta de anticuerpos al desafío antigénico, la inhibición de las reacciones de hipersensibilidad, de regulación de la potenciación de la actividad de las células NK de la actividad citotóxica de las células de T, la modulación de la producción de prostaglandinas y la potenciación de la fagocitosis por los macrófagos.
Las otras afecciones en las que pueden usarse los conjugados de interferón-polímero incluyen la leucemia de células vellosas, las verrugas venéreas o genitales (condylomata acuminata), el sarcoma de Kaposi Relacionado al SIDA, la hepatitis y afecciones virales análogas a la hepatitis incluidas la hepatitis B y la hepatitis crónica no A, no B/C, y diversos tumores sólidos. El experto comprenderá que el tratamiento proporcionado por los conjugados de la invención puede ser, por ejemplo, paliativo, por ejemplo, al proporcionar cierto control o alivio de los efectos de una afección, así como también completamente o parcialmente curativo de cualquier enfermedad o afección tratada de esa manera.
Además, también se contempla que está dentro del alcance de la invención cualquier afección para que la administración del interferón sirve para el diagnóstico.
La cantidad del conjugado de interferón-polímero administrada para tratar las afecciones descritas anteriormente está basada en la actividad del interferón del conjugado polimérico. Es una cantidad que resulta suficiente para producir significativamente una respuesta clínica positiva. La dosis máxima para los mamíferos incluidos los seres humanos es la dosis más alta que no provoca efectos laterales clínicamente importantes. Con objeto de la presente invención, tales efectos clínicamente importantes son los que requerirían el cese de la terapia por síntomas análogos a la gripe grave, la depresión del sistema nervioso central, trastornos gastrointestinales graves, alopecia, prurito grave o erupción. Las anormalidades sustanciales en los leucocitos y/o glóbulos rojos y/o enzimas hepáticas o afecciones análogas a la anemia pueden también ser limitantes de la dosis.
Naturalmente, las dosificaciones de las composiciones basadas en interferón variarán algo según el resto de interferón y del polímero seleccionados. Generalmente, sin embargo, el conjugado se administra en cantidades que varían desde aproximadamente 100.000 hasta aproximadamente varios millones de UI/m^{2} de interferón por día, en base a la afección del mamífero. El intervalo establecido anteriormente es ilustrativo y los expertos en la técnica determinarán la dosificación óptima del conjugado seleccionado en base a la experiencia clínica y la indicación del tratamiento.
Los conjugados de IFN-polímero y las composiciones que contienen los conjugados de mono- y bis-interferón polímero de la presente invención pueden incluirse en una o más composiciones farmacéuticas adecuadas para la administración a los mamíferos. Las composiciones farmacéuticas pueden estar en la forma de una solución, suspensión, un comprimido, cápsula o similares, incluidos, por ejemplo, productos liofilizados de fácil reconstitución, preparados según los procedimientos bien conocidos en la técnica. También se contempla que la administración de tales composiciones será principalmente por la vía parenteral aunque también puede usarse la vía oral o por inhalación según las necesidades del experto.
8. Ejemplos
Los siguientes ejemplos sirven para proporcionar otra apreciación de la invención pero pretenden de ninguna manera restringir el alcance eficaz de la invención.
Ejemplo 1
En este ejemplo, se usó el polietilenglicol activado con carbonato de succinimidilo, con peso molecular 12.000, para modificar el alfa interferón. El PEG activado con carbonato de succinimidilo se preparó según el procedimiento de la Patente de EEUU Nº 5.122.614 mencionada anteriormente. El interferón era \alpha-IFN-2b recombinante, (r\alpha-IFN), un producto de Schering-Plough Corporation, Madison, Nueva Jersey.
Se ajustó el pH del alfa interferón (0,28 \mumoles, 5 mg) hasta 6,5 con tampón de fosfato 100 mM. El PEG activado se disolvió en Agua Para Inyección (pH aproximadamente 6,0) y a continuación se añadió al alfa interferón en una proporción de aproximadamente medio mol del polímero activado por mol de interferón. Se incubó la reacción a temperatura ambiente (21ºC) durante aproximadamente 2 horas mezclando suavemente de forma continua. Tras 2 horas, se detuvo la reacción con un exceso molar de diez veces de glicina. Los productos de la reacción se analizaron por medio de SEC-HPLC (BioRad, Bio-Sil columna SEC-125) a un caudal de 1,0 ml/minuto usando un tampón de fosfato 0,1 molar, pH 7,0 con detección a 280 nm. Los resultados del análisis de HPLC se presentan en la Figura 1 que muestra dos picos en 7,29 y 8,13, que indican que los conjugados eran en gran parte las especies 1-PEG y 2-PEG. También se detectó una cantidad de menor importancia de una especie de peso molecular más alto.
Ejemplo 2
En este ejemplo, se trató la combinación de conjugado de PEG_{12.000}-IFN, que contiene los conjugados 1-PEG y 2-PEG resultantes del Ejemplo 1, con ácido trifluoroacético al 0,1% para reducir el pH de los conjugados hasta aproximadamente 1,6 durante aproximadamente 3 horas a 37ºC. La reacción se detuvo por la adición del tampón de fosfato de sodio (100 mM), pH 6,5, y el pH final de la solución fue de entre pH 6,0 y 6,2. Los conjugados tratados con ácido se analizaron por medio de HPLC (tampón de fosfato del sodio 100 mM, pH 7,0). Los resultados se presentan en la Figura 2 que ilustra un pico mucho más agudo en 7,95 y una meseta más pequeña así como algo de IFN nativo. Esto también indica que los conjugados tratados con ácido fueron en gran parte el 1-PEG_{12.000}-IFN. Se recogió esta fracción, se concentró por medio de un concentrador Centricon, se purificó por HPLC usando una columna de exclusión por tamaño y se analizó usando el ensayo de CPE para la actividad. Los resultados se compararon con los valores obtenidos al analizar los conjugados del Ejemplo 1 que no sufrieron la etapa del tratamiento ácido. El control representa el interferón sin modificar. Los resultados comparativos se presentan en la siguiente tabla:
Resumen de Actividades de PEG_{12.000}-IFN
1
De lo anterior, puede verse que los conjugados tratados con ácido tenían una mejora significativa en la actividad conservada y que esta etapa del tratamiento no desnaturalizó el interferón.

Claims (26)

1. Un procedimiento para preparar conjugados de \alpha-interferón-polímero, que comprende:
a)
formar un conjugado de un \alpha-interferón estable frente al ácido con un polímero activado, sustancialmente no antigénico, en solución;
b)
acidificar la solución que contiene el conjugado de (a) hasta un nivel de pH inferior a aproximadamente 3, que es eficaz para escindir selectivamente cualquier enlace que reduzca la bioactividad del interferón conjugado; y a continuación
c)
ajustar la solución acidificada de (b) hasta un pH fisiológicamente aceptable, en el que la proporción molar de dicho polímero sustancialmente no antigénico con respecto a dicho \alpha-interferón varía desde aproximadamente 8:1 hasta aproximadamente 1:8.
2. El procedimiento de la reivindicación 1, en el que el polímero no antigénico está activado con un resto formador de enlaces carbamatos.
3. El procedimiento de la reivindicación 2, en el que dicho resto formador de enlaces carbamatos se selecciona del grupo constituido por oxicarbonil-oxi-N-dicarboximida, carbonatos de para nitroarilo, carbonil diimidizol, carbonatos de benzotriazol y carbonatos de piridilo.
4. El procedimiento de la reivindicación 3, en el que dicha oxicarbonil-oxi-N-dicarboximida es un carbonato de succinimidilo.
5. El procedimiento de la reivindicación 1, en el que dicho polímero sustancialmente no antigénico está activado con un carbonato de succinimidilo.
6. El procedimiento de la reivindicación 1, en el que la proporción molar de dicho polímero sustancialmente no antigénico con respecto a dicho \alpha-interferón varía desde 4:1 hasta 1:4.
7. El procedimiento de la reivindicación 1, en el que la proporción molar de dicho polímero sustancialmente no antigénico con respecto a dicho \alpha-interferón varía desde 2:1 hasta 1:2.
8. El procedimiento de la reivindicación 1, en el que dicho polímero sustancialmente no antigénico comprende un óxido de polialquileno.
9. El procedimiento de la reivindicación 8, en el que dicho óxido de polialquileno comprende un polietilenglicol.
10. El procedimiento de la reivindicación 1, en el que la solución se acidifica con un ácido seleccionado del grupo constituido por ácidos haloacéticos, acético, clorhídrico, sulfúrico y fosfórico.
11. El procedimiento de la reivindicación 10, en el que el ácido haloacético es ácido trifluoroacético.
12. El procedimiento de la reivindicación 1, en el que el nivel de pH de la etapa (b) es inferior a aproximadamente 2.
13. El procedimiento de la reivindicación 12, en el que el nivel de pH es inferior a aproximadamente 1,6.
14. El procedimiento de la reivindicación 12, en el que el pH es aproximadamente 1,6.
15. El procedimiento de la reivindicación 1, en el que el nivel de pH de la etapa (b) varía desde aproximadamente 1 hasta aproximadamente 3.
16. El procedimiento de la reivindicación 1, en el que la porción de polímero sustancialmente no antigénico de dichos conjugados tiene un peso molecular de desde 600 hasta aproximadamente 60.000.
17. El procedimiento de la reivindicación 16, en el que la porción de polímero sustancialmente no antigénico de dichos conjugados tiene un peso molecular de desde 1.000 hasta aproximadamente 40.000.
18. El procedimiento de la reivindicación 16, en el que la porción de polímero sustancialmente no antigénico de dichos conjugados tiene un peso molecular de desde 2.000 hasta aproximadamente 20.000.
19. El procedimiento de la reivindicación 1, en el que dicho pH fisiológicamente aceptable varía desde aproximadamente 6,5 hasta aproximadamente 7,5.
20. El procedimiento de la reivindicación 1, en el que dicho \alpha-interferón es \alpha-interferón 2b.
21. El procedimiento de la reivindicación 1, en el que dicho \alpha-interferón es un interferón humano.
22. El procedimiento de la reivindicación 21, en el que dicho interferón es el interferón humano de consenso.
23. El procedimiento de la reivindicación 1, en el que dicho polímero sustancialmente no antigénico se selecciona del grupo constituido por dextrano, polivinilpirrolidonas, poliacrilamidas, alcoholes polivinílicos, polímeros basados en hidratos de carbono.
24. El procedimiento de la reivindicación 1 que además comprende sustancialmente el aislamiento y la purificación del producto de la etapa (c).
25. Los conjugados de \alpha-interferón-polímero obtenibles por medio del procedimiento de la reivindicación 1.
26. Una composición farmacéutica que comprende un conjugado de \alpha-interferón-polímero según se definió en la reivindicación 25 y un vehículo farmacéuticamente aceptable.
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