ES2280107T3 - Conjugados de proteina-polimero por histidina sustancialmente puros. - Google Patents
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Abstract
Una composición de conjugado de proteína-polímero que comprende una mezcla de isómeros de posición de un conjugado de proteína de polímero, en la que una mayoría de los conjugados tiene el polímero conjugado covalentemente a la proteína en un residuo de histidina y una minoria son otros isómeros de posición.
Description
Conjugados de proteína-polímero
por histidina sustancialmente puros.
La presente invención se refiere a conjugados de
proteína-polímero substancialmente puros. En
particular, la invención se refiere a conjugados de
proteína-polímero ligados por histidina y los
procedimientos para fabricar los mismos.
Las proteínas activas biológicamente conjugadas
a polímeros se han indicado para mejorar una o más de las
propiedades de la vida circulante, solubilidad en agua o
antigenicidad in vivo. Por ejemplo, algunos de los conceptos
iniciales de la unión de péptidos o polipéptidos a polietilenglicol
(PEG) y polímeros solubles en agua parecidos se describen en la
Patente de los Estados Unidos número 4.179.337.
La insulina y hemoglobina están entre los
primeros agentes terapéuticos conjugados. Estos polipéptidos
relativamente largos contienen varios sitios de unión de
\epsilon-amino lisina libre. Varios polímeros se
podrían unir sin pérdida significativa de actividad biológica.
Para muchos materiales activos biológicamente,
el procedimiento de conjugación, sin embargo, no se realiza sin
complicaciones. El procedimiento de conjugación no es específico con
respecto a los sitios de unión. Se debe tener cuidado para limitar
la pérdida de la actividad biológica causada por la reacción de
conjugación. Por ejemplo, si demasiado polímero activado se une a la
proteína o polipéptido diana, se puede reducir o perder gravemente
la actividad biológica. Además, si se usa el ligando equivocado para
unir el polímero a la proteína o si una cantidad insuficiente de
polímero se une a la diana, el valor terapéutico del conjugado
resultante está bastante limitado. A menudo, dichos conjugados no
demuestran que haya un aumento en la vida circulante para compensar
la pérdida de bioactividad. También pueden resultar problemas cuando
un sitio del resto activo terapéutico (es decir, cuando se
encuentran grupos asociados con la bioactividad) se llega a bloquear
como resultado de la unión del polímero. Este problema puede ser
difícil de evitar hasta que el polímero y proteína se unen
normalmente en unas reacciones basadas en la disolución y el
procedimiento de conjugación del polímero no es específico con
respecto a los sitios de unión. Se han sugerido sitios de actividad
prebloqueantes con materiales tales como fosfato de piridoxal, pero
los resultados han sido contradictorios. La falta de variantes de
proteínas de lisina también se ha sugerido como una vía de control
de unión del polímero. Esta técnica, sin embargo, es a menudo nada
práctica hasta se añade considerablemente al coste del producto
final. Los problemas son especialmente graves con proteínas y
péptidos de peso molecular más bajo. Esos materiales bioactivos a
menudo tienen poco sitios de unión no asociados con la
bioactividad.
En otro intento para evitar la pérdida de
bioactividad tras la conjugación del polímero, se conjugó factor de
estimulación de colonias de granulocitos
("G-CSF") con un éster
carboximetil-N-hidroxisuccinimidílico
de mPEG luego se trató con hidroxilamina dos molar (pH 7,3) para
eliminar los ligandos "inestables", seguido por una reducción
del pH a 3,5. Kinstler y col., 1996, Pharmaceutical Res.
13(7): 996-1002. No se proporcionó ninguna
descripción o sugerencia para lograr G-CSF mejorado
ni orientación con respecto al tratamiento de cualesquiera otros
conjugados de
proteínas.
proteínas.
Los interferones, más adelante también referidos
como IFN, son un ejemplo particular de proteínas las cuales podrían
ser benéficas como técnicas de conjugación de polímeros mejoradas.
Véanse, por ejemplo, las Patentes de los Estados Unidos número
4.766.106 y 4.917.888 las cuales describen entre otros el interferón
beta conjugado con polimeros activados que incluye
mPEG-2,4,6-tricloro-S-triazina,
glutarato de mPEG-N-succinimidilo,
succinato de mPEG-N-succinimidilo.
Las patentes describen que la modificación covalente de la proteína
se hace a un pH de 5 a 9 y cuando la proteína reacciona a través de
sus residuos de lisina, la modificación covalente de la proteína se
hace a un pH de 8 a 9. También se usan excesos molares relativamente
altos (10, 20 y 50 veces) del polímero activado.
La Solicitud de Patente Europea que lleva a la
publicación número 0 236 987 describe la reacción de interferones
alfa y gama con excesos molares altos de éster
imidoalquílico-polietilenlicoles activados bajo
condiciones las cuales incluyen preferiblemente incluyen un pH desde
aproximadamente 7 a 9. La Solicitud de Patente Europea que lleva a
la publicación número 0 510 356 describe conjugación de interferón
alfa con PEG activado con piridinilcarbonilo y PEG activado con
tiocarbonilo a un pH de 7 a 9. No hubo mención en estas
descripciones de que los aminoácidos distintos de la lisina
estuvieran implicados en la conjugación o de que sería ventajoso
hacerlo así.
El documento WO 96/11953 informa que los
conjugados se prepararon mediante reacción de una proteína,
ilustrada por IFN consenso, con un polímero, a un pH ácido (pH 4)
usando una reacción de alquilación reductora para la unión
selectiva de polímero, por ejemplo, PEG, al
N-terminal. El documento WO 96/11953 afirma que esta
reacción impide selectivamente la unión a grupos amino épsilon de
lisina, mientras favorece el enlace con el grupo amino alfa
N-terminal. El documento WO 96/1195 también describe
un procedimiento de tratamiento de pH en dos etapas en el que
G-CSF se hace reaccionar con un PEG a pH 8,0,
seguido mediante la reducción del pH a pH 4,0, simplemente como un
preludio para cargar el producto en una columna de separación. El
documento WO 96/11953 no enseña o sugiere las ventajas de una
reacción de acilación de una reacción de acilación para unir
selectivamente a residuos de IFN distintos aparte del
N-terminal o las lisinas.
El documento WO 95/00162 se refiere a un
procedimiento para sintetizar un polipéptido que contiene un
polímero sustancialmente no antigénico en un sitio predeterminado,
en el que se inicia la síntesis del polipéptido y se introduce el
polímero en un punto en la síntesis el cual corresponde al sitio
predeterminado. El procedimiento usa un polímero de aminoácido
conjugado para introducir el polímero a un punto seleccionado en la
síntesis. Se menciona que el aminoácido se puede seleccionar de
arginina, ácido glutámico, lisina, ácido aspártico, cisteína,
histidina, triptófano, tirosina, asparagina, glutamina, serina y
treonina. La enseñanza actual sin embargo se restringe a la lisina
como el sitio de unión.
El documento WO 98/51784 publicado el 19 de
noviembre de 1998 y que reivindica datos de prioridad del 12 de mayo
de 1997 y 13 de febrero de 1998, se refiere a deiminasa de arginina
(ADI) unida covalentemente mediante un grupo de unión a un
polietilenglicol (PEG) que tiene un peso molecular promedio del peso
total del peso total entre 12.000 y 40.000. El grupo enlazante se
puede seleccionar a partir de muchos grupos, especialmente un grupo
maleimida, un grupo amida, un grupo imida, un grupo carbamato, un
grupo éster, un grupo epoxi, un grupo carboxilo, un grupo hidroxilo,
un carbohidrato, un grupo tirosina, un grupo cisteína, y un grupo de
histidina. Generalmente, el PEG se une a una amina primaria de ADI,
especialmente de varias lisinas en ADI. No se describe la unión
específica de una histidina de ADI.
El documento WO 95/13090 enseña un procedimiento
para preparar una composición que contiene un interferón alfa de
acción prolongada que comprende una reacción de conjugación de
interferón alfa con un polímero en presencia de un tensioactivo. Los
conjugados formados en este procedimiento tienen el polímero
predominantemente unido a grupos \epsilon-amino de
lisinas.
Gotoh y col., Bioconjugate Chem. Vol. 4,
No. 6, 1993, 554-559, analiza el sitio de reacción
de fibra de seda (SF) cuando reacciona con
poli(etilenglicol) activado-cloruro cianúrico
mediante espectroscopia RMN ^{1}H. Se enseñó que más de 3,3 moles
en % de los residuos en SF se modificaron mediante la reacción y que
la lisina (0,32 moles en %), histidina (0,18 moles en %) y residuos
de tirosina (5 moles en %) reaccionaron con el PEG activado.
En vista de las descripciones descritas
anteriormente, se cree que aumentos adicionales en conjugados
interferón-polímero son deseables con el fin de
tratar diversas deficiencias. La presente invención proporciona
mejorías adicionales al campo y así trata estos defectos.
En un aspecto, la presente invención se refiere
a composiciones sustancialmente puras de conjugados de
proteína-polímeros unidos a His. Los conjugados
incluyen una proteína, tal como un interferón alfa, covalentemente
conjugada a un polímero, tal como un polietilenglicol, en un residuo
de histidina (His) de la proteína. En el caso de un interferón alfa,
la histidina es preferiblemente la histidina 34. Preferiblemente, el
interferón alfa es interferón \alpha2b y los conjugados contienen
aproximadamente una hebra de polímero por molécula de interferón
alfa. Los conjugados monopolímeros unidos a histidina de otras
proteínas, tales como IL-10, se incluyen también
como parte de la invención. Las composiciones que contienen los
conjugados unidos a histidina monopolímeros preferidos pueden
contener también cantidades menores de otras especies de
proteína-mono-PEG, si se desea.
En otra realización de la invención, se
proporcionan procedimientos de preparación de dichas composiciones
sustancialmente puras de conjugados de
proteína-polímero proporcionan conjugados de
proteína-polímero unidos por histidina. En
particular, los procedimientos se refieren a preparar los conjugados
de polímero unidos a residuos de histidina de proteína. Los
procedimientos incluyen la formación de una pluralidad de especies
de conjugados proteína-polímero o isómeros de
posición haciendo reaccionar una proteína tal como interferón alfa,
con una cantidad suficiente de polímero adecuadamente activado bajo
condiciones suficientes para facilitar la unión covalente de
moléculas de proteína a hebras de polímero activadas y a partir de
entonces aislar sustancialmente las especies conjugadas o isómeros
de posición en los cuales el enlace de His entre la proteína y el
polímero se establece a partir de las especies conjugadas restantes.
En un aspecto preferido de esta realización, el polímero activado es
un polímero activado de carbonato de benzotriazol. En un aspecto
alternativo, el polímero activado es un polímero activado de
oxicarboniloxi-N-dicarboximida tal
como carbonato de succinimidilo (SC-PEG). Estos
polímeros activados permiten al trabajador formar una mezcla de
reacción en la cual una parte sustancial de los conjugados incluye
la hebra del polímero covalentemente unido a un residuo de histidina
en el interferón alfa más que en un residuo de lisina o
N-terminal.
Algunas de las condiciones las cuales permiten
al isómero de posición de His de proteína, tal como el isómero
IFN-\alpha His 34, formarse en cantidades
relativamente altas con respecto a otros isómeros de posición
incluyen dirigir la reacción de congelación del polímero acilante al
polímero acilante dentro de un intervalo de pH particular, es decir
preferiblemente menor que aproximadamente 7 y más preferiblemente de
aproximadamente 4,5 a aproximadamente 6,8. Esto facilita la unión
covalente preferente de al menos una parte de las hebras del
polímero a grupos amino de residuos de histidina de la proteína. Los
conjugados de proteína deseados, sustancialmente puros, se aíslan
después preferiblemente a partir de los conjugados de proteína
restantes en la mezcla de reacción usando columnas de cromatografía
tales como filtración de gel seguida por intercambio catiónico o
intercambio aniónico seguido por intercambio catiónico.
Los interferones alfa adecuados incluyen
interferones alfa recombinantes y no recombinantes aislados a partir
de mamíferos. La parte de polímeros del conjugado es preferiblemente
un óxido de polialquileno (PAO), tal como un
monometoxipolietilenglicol (mPEG). En realizaciones alternativas,
también se pueden usar otros polímeros sustancialmente no
antigénicos. Los polímeros preferiblemente tienen un peso molecular
desde aproximadamente 200 a aproximadamente 35.000.
La composición de la invención es útil en
procedimientos para tratar diversas afecciones médicas tales como
afecciones susceptibles al interferón alfa en mamíferos. En este
aspecto, el tratamiento incluye administrar una cantidad efectiva de
una composición que contiene los conjugados de proteína descritos en
el presente documento para mamíferos que requieren tal terapia.
Para propósitos de la presente invención, el
término "isómero de posición" se entendería que describe
generalmente un conjugado que tiene una hebra de polímero unida a
uno de los residuos de aminoácidos adecuados. Los isómeros de
posición específicos se describen en el presente documento en
referencia al punto de unión del residuo de aminoácido. Por ejemplo,
el isómero de posición de
proteína-Lys31-polímero se refiere a
un conjugado monopolímero de una proteína que tiene el polímero
unido a la Lys31. Otros isómeros de posición, es decir aquellos
conjugados que tienen el polímero unido a otro lugar sobre la
proteína se designarían de manera similar.
Para propósitos de la presente invención, el
término "sustancialmente puro" se entendería para designar el
nivel o grado de pureza de una composición que contiene un isómero
de posición deseado de un conjugado
polímero-proteína. Dependiendo de la proteína
conjugada y la técnica de separación conjugada empleada, se estimará
que las composiciones de acuerdo con la presente invención son
sustancialmente puras si ellas contienen una mayoría del isómero de
posición deseado.
También para propósitos de la presente
invención, "separando sustancialmente "se entendería para
describir una parte del procedimiento de la invención en el que un
isómero de posición deseado se recupera a partir del espectro de los
isómeros de posición como un resultado de usar (preferiblemente)
cromatografía líquida de alta resolución. Los aislados resultantes
contienen aislados sustancialmente puros del isómero de posición
deseado y posiblemente cantidades menores, por ejemplo, menos del
15%, de otros isómeros de posición.
Como un resultado de la presente invención, se
ha encontrado de modo inesperado que son posibles mejoras
adicionales en composiciones de conjugados de
proteína-polímero. Por ejemplo, ahora es posible
obtener isómeros de posición sustancialmente puros, incluyendo
aquellos que tienen niveles relativamente altos de bioactividad en
rendimientos relativamente altos. En el caso de
IFN-\alpha, los isómeros de posición preferidos,
es decir los conjugados
IFN-\alpha-2b unidos al
mono-polímero His34, demuestran de modo inesperado
altos niveles de bioactividad no sólo en relación al interferón alfa
nativo sino también a otro isómeros de posición. Los otros isómeros
de posición, es decir, aquellos conjugados que tienen el polímero
unido en otro lugar en el interferón, como el extremo
N-terminal o un grupo amino de lisina, a menudo
muestran cantidades más bajas pero sin embargo útiles de
bioactividad y se pueden incluir en algunas composiciones de la
invención en cantidades menores.
También se ha encontrado sorprendentemente que
cuando la reacción de conjugación incluye ciertos polímeros
activados, tales como polímeros activados de carbonato de
benzotriazol (BTC), de modo inesperado se forman cantidades altas de
isómeros de posición unidos por histidina.
Para un mejor entendimiento de la presente
invención, se hace referencia a las siguientes descripción y
dibujos.
La figura 1 es un cromatograma referido en el
Ejemplo 1.
La figura 2 es un cromatograma referido en el
Ejemplo 2.
La figura 3 es una gráfica referida en el
Ejemplo 7 que ilustra la actividad biológica de diversos isómeros de
posición en el suero humano normal.
Para propósitos de la presente invención el
término "proteína" se entendería para abarcar no solamente
proteínas sino también polipéptidos, enzimas, péptidos y similares
que tengan al menos una histidina disponible para la unión del
polímero. Además, las proteínas contempladas para usar en el
presente documento no se limitan a aquellas que tienen actividades
psicológicas o farmacológicas. Por ejemplo, también se incluyen las
enzimas conjugadas las cuales son capaces de catalizar reacciones
en disolventes orgánicos. Asimismo, algunos conjugados de polímeros
de la invención también son útiles como diagnósticos de laboratorio.
Dos características clave de todos los conjugados es que se unen
preferiblemente mediante residuos His y mantienen al menos alguna
parte de la actividad asociada con la proteína no modificada.
Proteínas, polipéptidos y péptidos de interés
incluyen, pero no se limitan a, hemoglobina, proteínas de suero
tales como factores de sangre que incluyen factores VII, VIII y IX;
inmunoglobulinas, citoquinas tales como interleuquinas, es decir,
de IL-1 a IL-13, interferones
\alpha, \beta y \gamma, preferiblemente
interferón-\alpha descrito con más detalle a
continuación, los factores de crecimiento de colonias que incluyen
factores estimuladores de colonias de granulocitos, factores de
crecimiento derivado de plaquetas y proteína activada de fosfolipasa
(PLAP). Otras proteínas de biología general o interés terapéutico
incluyen insulina, proteínas vegetales tales como lectinas y
ricinas, factores de necrosis tumoral y proteínas relacionadas,
factores de crecimiento tales como factores de crecimiento
transformantes, tales como TGF\alpha o TGF\beta y factores de
crecimiento epidérmico, hormonas, somatomedinas, erittopoietina,
hormonas pigmentarias, factores de liberación hipotalámicos,
hormonas antidiuréticas, prolactina, gonadotrofina coriónica,
hormona estimulante de los folículos, hormona de estimulación del
tiroides, activador de plasminógeno de tejidos, y similares. Las
inmunoglobulinas de interés incluyen IgG, IgE, IgM, IgA, IgA, IgD y
fragmentos de las mismas.
Algunas proteínas tales como las interleuquinas,
interferones y los factores de crecimiento de colonias también
existen en la forma de no glicosilada, usualmente como un resultado
de las técnicas de recombinación. Las versiones no glicosiladas
están también entre las proteínas de la presente invención.
Las enzimas de interés incluyen enzimas
específicas de carbohidrato, enzimas proteolíticas, oxidoreductasas,
transferasas, hidrolasas, liasas, isomerasas y ligasas. Sin
limitarse a enzimas particulares, ejemplos de enzimas interés
incluyen asparaginasa, arginasa, arginina deaminasa, adenosina
deaminasa, superóxido dismutasa, endotoxinasas, catalasas,
quimotripsina, lipasas, uricasas, adenosina difosfatasa, tirosinasas
y bilirrubina oxidasa. Enzimas específicas de car-
bohidratos de interés incluyen glucosa oxidasas, glucodasas, galactosidasas, glucocerebrosidasas, glucuronidasas, etc.
bohidratos de interés incluyen glucosa oxidasas, glucodasas, galactosidasas, glucocerebrosidasas, glucuronidasas, etc.
También se incluye en el presente documento
cualquier parte de un polipéptido que demuestre bioactividad in
vivo. Esto incluye histidina que contiene secuencias de amino
ácidos, fragmentos de anticuerpos, proteínas de unión a antígenos de
cadena sencilla, véase, por ejemplo la Patente de los Estados Unidos
número 4.946.778, que unen moléculas que incluyen fusiones de
anticuerpos o fragmentos, anticuerpos policlonales, anticuerpos
monoclonales y anticuerpos catalíticos.
Las proteínas o partes de las mismas se pueden
preparar o aislar mediante el uso de técnicas conocidas para
aquellos de habilidad ordinaria en la técnica tales como cultivo de
tejidos, extracción a partir de fuentes animales, o mediante
metodologías de recombinación de ADN. También se contemplaron
fuentes transgénicas de las proteínas, polipéptidos, secuencias de
aminoácidos y similares. Dichos materiales se obtienen a partir de
animales transgénicos, es decir, ratones, cerdos, vacas, etc., en
los que las proteínas se expresan en leche, sangre o tejidos.
También se contemplan sistemas de expresión de baculovirus e
insectos transgénicos como fuentes. Además, las versiones mutantes
de proteínas, tales como interferones mutantes también están dentro
del alcance de la invención.
Otras proteínas de interés son proteínas
alérgenas tales como ambrosía, Antígeno E, veneno de abeja,
alergenos diminutos y similares.
Una proteína preferida es el interferón alfa
descrito con más detalle a continuación. Lo anterior es ilustrativo
de las proteínas las cuales son adecuadas para la presente
invención. Se entiende que aquellas proteínas, tal como se definen
en el presente documento, no se mencionan específicamente pero
también se desea que tengan grupo histidina disponible y están
dentro del alcance de la presente invención.
También se entendería por el trabajador de
habilidad ordinaria que la invención incluye proteínas, como se
definen en el presente documento, que se han manipulado
específicamente para incluir una histidina para usar como un sitio
de unión de polímero.
En aquellos aspectos de la invención donde la
proteína es un interferón (IFN), se entendería que la proteína se
puede preparar u obtener a partir de una diversidad de fuentes que
incluyen técnicas de recombinación tales como aquellos que usan
genes sintéticos expresados en E. coli. Véase también Pestka,
"Interferon \alpha" en Human Cytokines, Blackwell
Scientific Publications 1-16 (1992). Además, el IFN
es preferiblemente un IFN-\alpha y también puede
ser un extracto de fuente mamífera tal como
IFN-\alpha humano, de rumiante o bovino. Un IFN
particularmente preferido es
IFN-\alpha-2b, un producto
fabricado recombinantemente de Schering Corp., Kenilworth, NJ.
El término "interferón" o "IFN" tal
como se usa en el presente documento significa la familia de
proteínas altamente homólogas que inhiben la replicación viral y la
proliferación celular y modelan la respuesta inmune. Los
interferones humanos se agrupan dentro de tres clases basadas en su
origen celular y antigenicidad: \alpha-interferón
(leucocitos), \beta-interferón (fibroblastos) y
\gamma-interferón (células B). Se han desarrollado
y están disponibles comercialmente las formas recombinantes de cada
grupo. Los subtipos en cada grupo se basan en las características
estructurales/antigénicas. Se han identificado al menos 24
interferones alfas (agrupados en subtipos de la A a la H) que tienen
secuencias de aminoácidos distintas aislando y secuenciando ADN que
codifica estos péptidos. Véase también Viscomi, 1996 Biotherapy
10:59-86. Los términos
"interferón-\alpha", "alfa interferón",
"interferón alfa" e "interferón de leucocitos humanos" se
usa intercambiablemente en esta aplicación para describir los
miembros de este grupo. Se pueden usar en la practica de la
invención ambos interferones-\alpha recombinantes
que se dan en la naturaleza, incluyendo el interferón consenso tal
como aquel descrito en la Patente de Estados Unidos número
4.897.471.
La purificación del interferón alfa a partir de
leucocitos humanos aislados a partir de la fracción de la capa
leucocitaria de sangre completa se describe en la Patente de los
Estados Unidos número 4.503.035. El interferón de leucocitos humanos
preparado de esta forma contiene una mezcla de interferones de
leucocitos humanos que tienen secuencias de aminoácidos diferentes.
Se pueden usar \alpha-interferones humanos
naturales purificados y mezclas de los mismos los cuales se pueden
usar en la practica de la invención incluyendo pero no limitados a
interferón alfa-n1 Sumiferon® disponible de
Sumitomo, Japón, alfa-n1 interferón Wellferon® (Ins)
disponible de Glaxo-Wellcome Ltd., Londres, Gran
Bretaña, e interferón alfa-n3 Alferon ® disponible
de la Purdue Frederick Co., Norwalk, CT.
La llegada de la tecnología de ADN recombinante
aplicada a la producción del interferón ha permitido que diversos
interferones humanos se sinteticen con éxito, permitiendo de este
modo la fermentación, producción, aislamiento y purificación a gran
escala de diversos interferones hasta homogeneidad. El interferón
producido recombinantemente retiene sus actividades antivirales e
inmunomodulatoriaa in vitro e in vivo. También se
entiende que las técnicas de recombinación también podrían incluir
un sitio de glicosilación para la adición de un resto de
carbohidrato en el polipéptido recombinantemente derivado.
La construcción de plásmidos de ADN recombinante
que contienen secuencias que codifican al menos parte de interferón
de leucocitos humanos y la expresión en E. coli. de un
polipéptido que tiene actividad inmunológica o biológica de
interferón de leucocitos humanos se describe en la Patente de
Estados Unidos número 4.530.901 y la Patente Europea número EP 0 032
134.
La construcción de genes de
interferón-\alpha híbridos que contiene
combinaciones de diferentes subtipos de secuencias (por ejemplo, A y
D, A y B, A y F) se describe en las Patentes de los Estados Unidos
números 4.414.150, 4.456.748 y 4.678.751. Los
interferones-\alpha recombinantes adecuados
típicos que se pueden usar en la práctica de la invención incluyen
pero no se limitan a interferón alfa-2b tal como
Intron® A disponible de Schering Corporation, Kenilworth, N.J.,
interferón alfa-2a tal como Roferon® A disponible de
Hoffmann-La Roche, Nutley, N.J., e Infergen®
disponible de Amgen, Thousand Oaks, CA.
Realizaciones alternas, donde el
IFN-\alpha precedente no es completamente
autólogo, se pueden usar también si se desea. Una clave, sin
embargo, es que el IFN-\alpha no autólogo tiene
suficiente bioactividad o efecto de IFN-\alpha tal
como una actividad antiviral en el mamífero objetivo. Otras
sustancias que incluyen fracciones IFN-\alpha o
polipéptidos predecesores también se pueden en los conjugados de la
presente invención. Como se usa en el presente documento, "efecto
de IFN-\alpha en los mamíferos" significa
actividad in vivo correspondiente a aquello observado con
IFN-\alpha. Estas sustancias se preparan usando
técnicas conocidas por aquellos de habilidad ordinaria en la técnica
tal como cultivo de tejido, extracción a partir de fuentes animales
o mediante metodologías de ADN recombinante. También se contemplan
fuentes transgénicas de IFN-\alpha y restos
relacionados. Tales materiales se obtienen a partir de animales
transgénicos, por ejemplo ratones, cerdos, vacas, etc. donde la
proteína IFN-\alpha se expresa en leche, sangre u
otros tejidos. El procedimiento por el cual el
IFN-\alpha se prepara para los conjugados de la
presente invención no se limita a aquellos descritos en el presente
documento. Para propósitos de la presente invención, se prefieren
los IFN-\alpha debido a sus propiedades
bioquímicas y serológicas. En particular,
IFN-\alpha ha documentado en propiedades
antivíricas y se difunde más efectivamente en el torrente sanguíneo
que otros interferones.
Para conjugar la proteína a polímeros tales como
poli(óxidos de alquileno), uno de los grupos finales hidroxilo de
polímeros se convierte en un grupo funcional reactivo el cual
permite la conjugación. Este procedimiento se refiere
frecuentemente como "activación" y el producto se denomina
polímero "activado" o poli(óxido de alquileno) activado. Otros
polímeros sustancialmente no antigénicos se "activan" o
funcionalizan de forma similar.
De acuerdo con la presente invención, los
polímeros activados se hacen reaccionar con una proteína tal como
IFN-\alpha tal que tenga lugar la unión del
polímero preferiblemente en grupos amino en histidinas, y, a una
menor extensión, en grupos \epsilon-amino de
lisinas y en el grupo amino N-terminal. Grupos de
ácidos carboxílicos libres, grupos carbonilo activados de manera
adecuada, restos de carbohidrato oxidados y grupos mercapto si están
disponibles en la proteína se pueden usar también como sitios de
unión suplementarios, si se desea.
En un aspecto preferido de la invención, los
ligandos de uretano (carbamato) se forman preferiblemente entre un
residuo del grupo amino de histidina de la proteína y el polímero
activado. En un aspecto preferido de la invención, el polímero
activado es un polímero activado de carbonato de benzotriazol tal
como aquellos descritos en la Patente de los Estados Unidos número
5.650.234. En un aspecto alternativo, el ligando de uretano se forma
usando un grupo
oxicarbonil-oxi-N-dicarboximida
terminal tal como un grupo carbonato de succinimidilo. Grupos
activadores alternativos incluyen N-succinimida,
N-ftalimida, N-glutarimida,
N-tetrahidroftalimida y
N-norboreno-2,3-dicarbóxido.
Estos grupos formadores de uretano se describen en la Patente de los
Estados Unidos número 5.122.614.
Cuando se usaron como una parte de la invención,
estos polímeros activados preferidos permiten al trabajador formar
una pluralidad de conjugados de proteína-polímero
que pueden o no pueden incluir el espectro entero de isómeros de
posición. La colección agregada de conjugados formada en la reacción
basada en la solución, sin embargo, contendrá una parte
significativa de los conjugados los cuales que incluyen la hebra de
polímero unida covalentemente por un resido de histidina en la
proteína diana, es decir, interferón alfa, con cantidades menores de
hebras de polímeros unidas a residuo de lisina o unidos a extremo
N-terminal.
Entre los polímeros sustancialmente no
antigénicos, se prefieren mono-activados, óxidos de
polialquileno alcoxi terminados (PAO), tales como polietilenglicoles
monometoxi terminados (mPEG): los óxidos de polietileno
bis-activados (glicoles) también se contemplan para
propósitos de proteínas de reticulación o para proporcionar un medio
para unir otros restos tales como agentes diana para localizar el
conjugado de proteína-polímero en un área particular
tal como, por ejemplo, el hígado.
Los polímeros adecuados variarán sustancialmente
en peso. Los polímeros que tienen pesos promedio en número molecular
que varían desde aproximadamente 200 a aproximadamente 35.000 se
seleccionan usualmente para propósitos de la presente invención. Se
prefieren pesos moleculares desde aproximadamente 1.000 a
aproximadamente 25.000 y en particular se prefieren de 2.000 a
aproximadamente 20.000.
Las sustancias polímeras incluidas son también
preferiblemente solubles en agua a temperatura ambiente. Una lista
no limitante de dichos polímeros incluye homopolímeros de óxidos
de polialquilenos tales como polietilenglicol (PEG) o
polipropilenglicoles, polioles polioxietilenados, copolímeros del
mismo y copolímeros de bloque del mismo, siempre que se mantenga la
solubilidad en agua de los copolímeros de bloque. Además de mPEG,
también son útiles los polímeros de alquilo
C_{1-4} terminales.
Se pueden usar como una alternativa a los
polímeros basados en PAO, materiales efectivamente no antigénicos
tales como dextrano, polivinilpirrolidonas, poliacrilamidas tales
como hidroxipropilmetacrilamidas-HPMA, alcoholes de
polivinilo, polímeros basados en carbohidratos, copolímeros de los
precedentes, y similares. Aquellos de habilidad normal en la técnica
se darán cuenta de que la lista precedente es meramente ilustrativa
y que se contemplan todos los materiales polímeros que tienen las
cualidades descritas en el presente documento. Para propósitos de la
presente invención, "no-antigénico sustancialmente
o efectivamente" quiere decir que todos los materiales se
entiende en la técnica que son no tóxicos y que no provocan una
respuesta inmunógena apreciable en mamíferos.
Las reacciones de conjugación, algunas veces
referidas como reacciones de PEGilación, a menudo se llevan a cabo
en solución sin tomar en consideración donde el polímero se unirá a
la proteína. Tales técnicas también se llevan a cabo usualmente a
pHs ligeramente alcalinos, es decir, pH 7 + a aproximadamente 9
para conjugar IFN-\alpha. Una clave de la presente
invención, sin embargo, es que en ciertos casos, tales como con
IFN-\alpha, la bioactividad de la proteína
retenida puede ser maximizada si una hebra de polímero simple se une
a una histidina más una lisina o al N-terminal. En
el caso de los IFN-\alpha, y de
IFN-\alpha 2b en particular, el punto de unión
preferido es His34. Se apreciará por el trabajador que aunque varias
especies del IFN-\alpha pueden o no pueden tener
una histidina en el aminoácido 34, las condiciones de la reacción
sin embargo proporcionarían preferiblemente al menos algunos
isómeros de posición que contengan un polímero unido por una
histidina disponible. El trabajador también apreciará que para
proteínas distintas de IFN-\alpha, el residuo de
histidina óptimo para la unión de polímero se determinaráe sin
experimentación indebida.
Los procedimientos de la presente invención lo
por tanto incluyen:
1) hacer reaccionar una solución que contenga
una cantidad suficiente de una proteína tal como un interferón alfa
con una cantidad suficiente de un polímero adecuadamente activado,
tales polímeros de carbonato de benzotriazol activados o de
oxicarbonil-oxi-N-dicarboximida
activados bajo condiciones suficientes para facilitar la unión
covalente de la proteína al polímero activado y formar una
pluralidad de conjugados de proteína-polímero; y
2) separar sustancialmente los conjugados de
proteína-polímero que contienen un polímero
conjugado a un residuo de histidina de la proteína desde la
pluralidad de los conjugados de proteína-polímero
restantes.
En aspectos preferidos cuando la proteína es
IFN-\alpha-2b, las composiciones
sustancialmente puras contienen sustancialmente un polímero
conjugado a la His34 de la
IFN-\alpha-2b.
La reacción se lleva a un pH el cual es
suficiente para facilitar la unión covalente de al menos una parte
de las hebras del polímero a una histidina encontrada en la proteína
diana. En particular, el pH es preferiblemente ligeramente ácido, es
decir, menos que aproximadamente 7,0; más preferiblemente, menos que
aproximadamente 6,8 y más preferiblemente en el intervalo desde
aproximadamente 4,5 a aproximadamente 6,8.
Las condiciones de reacción para efectuar la
conjugación incluyen además la conducción de la reacción de unión
con desde aproximadamente equimolar a aproximadamente un pequeño
exceso molar relativamente del polímero activado con respecto a la
proteína. En esta consideración, el procedimiento se puede llevar a
cabo con aproximadamente 1-25 veces el exceso molar
de polímero; preferiblemente aproximadamente 1,5-7
veces el exceso molar de polímero y lo más preferible
aproximadamente 1,75-5 el veces exceso molar de
polímero. Se entendería que, dependiendo de las preferencias del
trabajador, el polímero activado se puede añadir como un sólido o en
solución a la proteína diana. La reacción de conjugación se puede
llevar a cabo a lo largo de un relativamente amplio intervalo de
temperatura, por ejemplo aproximadamente 0-25ºC. El
tiempo de reacción también variaría de acuerdo con la preferencia
del trabajador y puede variar desde menos de una hora a veinticuatro
horas o incluso más largo, dependiendo del polímero activado
seleccionado. La inactivación de la reacción es opcional. Estas
condiciones de reacción proporcionan una mezcla de isómeros de
posición de proteína-polímero que cuentan de modo
inesperado con cantidades relativamente altas de isómeros de
posición His. Preferiblemente, cada isómero contiene una hebra de
polímero sencilla unida a la proteína mediante un residuo de
aminoácido. En realizaciones alternativas, puede haber más de una
hebra de polímero unida como resultado del procedimiento de
conjugación. Las soluciones que contienen estos conjugados de
polímero también son útiles como se procesa o se puede procesar
adicionalmente para separar los conjugados en las bases del peso
molecular para obtener conjugados mono-polímero.
Aunque el procedimiento de la invención produce
una cantidad sustancial de conjugados que tienen una hebra de
polímero única, conjugados que tienen grados que varían de la
sustitución del óxido de polialquileno y así también se genera el
peso molecular. También pueden estar presentes PAO no conjugados
residuales y proteínas. Esta mezcla normalmente está en una reacción
tampón que contiene uno o más de aniones fosfato, cloruro y
bicarbonato. Preferiblemente se fraccionan el PAO, la proteína y la
mezcla conjugada en una solución tampóna que contiene desde
aproximadamente 1 a aproximadamente 10 mg/ml de conjugados de
proteína. Soluciones de fraccionamiento adecuadas tienen un pH de
desde aproximadamente 7,0 a aproximadamente 9,0 y preferiblemente
desde aproximadamente 7,5 a aproximadamente 8,5. Las soluciones
preferiblemente contienen una o más sales tamponadas seleccionadas
de KCl, NaCl, K_{2}HPO_{4}, KH_{2}PO_{4}, Na_{2}HPO_{4},
NaH_{2}PO_{4}, NaHCO_{3}, NaHCO_{3}, NaBO_{4},
(NH_{4})_{2}CO_{3} y NaOH de glicina. Se prefieren
tampones de fosfato de sodio.
Dependiendo del tampón de reacción, el conjugado
proteína-polímero contiene una solución que puede
primero tiene que sufrir un tampón de intercambio/ultrafiltración.
Por ejemplo, las soluciones conjugadas IFN-\alpha
pueden ultrafiltrarse a través de una membrana de corte peso
molecular bajo (10.000 a 30.000 Dalton) que también elimina más
tensioactivo, si está presente, también.
La división de los conjugados en las especies
deseadas basadas en el peso se lleva a cabo usando preferiblemente
un medio de intercambio de aniones. Tales medios son capaces de
unir selectivamente aquellos conjugados de
proteína-polímero que tengan un polímero en exceso y
proteína no modificada predeterminados, es decir una o más hebras de
polímero. Este fraccionamiento tiene lugar partiendo de que las
moléculas de proteínas de diversos grados de sustitución tendran
puntos isoeléctricos los cuales varían en un modo algo predecible.
Por ejemplo, el punto isoeléctrico de proteínas se determina por el
número disponible de grupos amino disponible en la superficie de la
proteína. Estos grupos amino también sirven como el punto de unión
de conjugados de óxido polialquileno. Por lo tanto, como el grado de
sustitución del óxido de polialquileno aumenta, el punto
isoeléctrico disminuye y la capacidad del conjugado para unirse a
una resina de intercambio aniónico se debilita. La HPLC de
filtración de gel también se puede usar para eliminar los conjugados
de peso molecular más alto (de multihebra).
El uso de resinas de intercambio aniónico
fuertemente polares se prefieren especialmente para el procedimiento
de la presente invención. Por esta razón, se utilizan las resinas
de intercambio aniónico recubiertas de amina cuaternaria. La resina
de amina cuaternaria se puede recubrir en una matriz polimérica o de
sílice; sin embargo se prefieren las matrices poliméricas. Un número
de tetrametilamina, o metilamina cuaternaria, resinas de intercambio
iónico están disponibles comercialmente, recubriendo las matrices de
apoyo. Entre las se incluyen las resinas de intercambio aniónico
cuaternarias comercialmente disponibles adecuadas para usar con la
presente invención están Q-HD disponible de
BioSepra, QMA TRISACRYL® y QMA-SPHEROSIL®, resinas
de amina cuaternaria recubriendo una matriz de polímero, fabricadas
por IBF de Garenne, Francia, por Sepracor, Inc. de Marlborough,
Massachussets; TMAE650M®, una resina de etiltetrametilamino
recubriendo una matriz polimérica, fabricada por
EM-Separators of Gibbstown, Nueva Jersey; se pueden
usar también QAE550C® y SUPERQC®, cada una de ellas una resina de
amina cuaternaria recubriendo una matriz de polímero y fabricada por
TosoHaas of Montgomeryville, PA. QMA Accell, fabricado por Millipore
of Millford, MA y resinas PEI fabricadas por JT Baker of
Phillipsburg, NJ.
La resina de intercambio iónico se empaqueta en
la columna y se equilibra por medios convencionales. Se usa un
tampón que tiene el mismo pH y osmolalidad que la solución de
proteína conjugada. La solución que contiene el conjugado luego se
adsorbe en la columna. A la finalización de la carga, un flujo de
gradiente de un tampón de elución con aumento de las concentraciones
de la sal se aplica a la columna para eluir las fracciones deseadas
de proteína conjugadas con óxido de polialquileno. Las fracciones
son esencialmente de peso molecular uniforme y grado de sustitución
uniforme. La separación de diversos isómeros de posición, sin
embargo, no se efectúa durante este tipo de separación.
Dependiendo de la proteína, las fracciones
conjugadas preferidas tienen de 1-4 hebras de
polímero por molécula de proteína. Más preferiblemente, la fracción
contiene aproximadamente 1-2 y, más preferiblemente,
aproximadamente 1 hebra de polímero por molécula de proteína. El
tampón de elución contiene preferiblemente uno o más sales
seleccionadas de KCl, NaCl, K_{2}HPO_{4}, KH_{2}PO_{4,}
Na_{2}HPO_{4}, NaH_{2}PO_{4}, NaH_{2}PO_{4},
NaHCO_{3}, NaBO_{4} y (NH_{4})_{2}CO_{3}. Estas
fracciones están sustancialmente libres de otros conjugados.
Cualquier especie no conjugada luego se puede volver a lavar desde
la columna mediante técnicas convencionales.
También se puede usar técnicas utilizando
múltiples etapas isocráticas para aumentar la concentración. Las
etapas múltiples de elución isocráticas para aumentar la
concentración resultarían en la elución secuencial de los conjugados
proteína-polímero. El grado de conjugación del
polímero dentro de cada fracción sería uniforme sustancialmente. Sin
embargo, el grado de conjugación del polímero por cada fracción
disminuirá con el tiempo de elección. La purificación del
intercambio iónico de los conjugados también se lleva a cabo con,
por ejemplo, una columna Q-HD desde BioSepra, Inc.
junto con una solución de fosfato de sodio diluido. Por ejemplo,
muestras que contienen muestras de PEG-IFN se lavan
con NaPO_{4} 10 mM para eliminar cualquier PAO que no ha
reaccionado y a partir de entonces se usa una etapa de elución del
gradiente con NaCl. La elución con NaCl 10 mM recupera las
fracciones que contienen conjugados con más de 3 hebras de polímero
PAO por IFN; la elución con 50 mM NaCl recupera conjugados que
contienen de 1-2 hebras; la elución con 150 mM NaCl
recupera el IFN no modificado.
El intervalo de temperatura para la elución está
entre aproximadamente 4ºC y aproximadamente 25ºC. Preferiblemente,
la elución se lleva a cabo a una temperatura desde aproximadamente
6ºC a aproximadamente 22ºC. La elución de la fracción
PAO-IFN-\alpha se detecta mediante
la absorbancia de UV a 254 nm. La recolección de la fracción se
puede lograr a través de perfiles del tiempo de elución simples.
Otros conjugados de proteína se eluyen de manera similar.
De acuerdo con el procedimiento, los isómeros de
posición de la proteína-polímero seleccionados están
sustancialmente separados de la mezcla de la reacción,
preferiblemente después los conjugados
mono-polímeros se han separado a partir de otros
reactivos. Debido a la naturaleza de las reacciones de conjugación
basadas en la solución, los conjugados son una mezcla heterogénea de
especies que contienen las hebras de polímero unidos a diferentes
sitios en la proteína. En cualquier solución o mezcla de reacción
que contiene los conjugados, es probable que sustancialmente esté
presente el espectro entero de isómeros de posición. En el caso de
IFN-\alpha-2b, las soluciones que
contienen conjugados preferidas continenen conjugados en los que el
polímero se une a uno de tres residuos de histidina disponibles ,
tales como His34 y opcionalmente a uno o mas de Cysl, Lys31, Lys49,
Lys83, Lys121, Lys131 y Lys134 del
interferón-alfa-2b. Cuando se
emplean las condiciones de reacción y los polímeros activados
descritos en el presente documento, la unión del polímero a un
residuo de His en un interferón alfa 2b es al menos aproximadamente
el 50% del total de la mezcla de la reacción, preferiblemente al
menos aproximadamente el 75% y más preferiblemente al menos
aproximadamente el 85% de los conjugados en la mezcla de reacción.
Por ejemplo, cuando se usa BTC-activado mPEG para
formar conjugados IFN-\alpha-2b,
aproximadamente el 90% de los conjugados formados eran isómeros de
posición IFN-His-PEG. También se han
encontrado cantidades menores de otros isómeros de posición. Se
entendería que el IFN alternativo tan bien como otras proteínas
proporcionará distribuciones alternativas de los isómeros de
posición, dependiendo de la secuencia de aminoácido del material de
partida.
Los solicitantes han determinado que dentro del
espectro de los isómeros de posición para cualquier conjugado de
proteína, diferirá la actividad biológica de los isómeros de
posición individuales. Mientras que los solicitantes no se limitan a
la teoría, se cree que las diferencias en la actividad para los
diversos isómeros de posición no son generalmente predecibles. En
vista de esta determinación, los procedimientos de la presente
invención permiten al trabajador determinar cuales isómeros
proporcionan altas cantidades de isómeros de posición particular y
cual medio para aislar los isómeros de posición particular a partir
de la mezcla de reacción es altamente deseable.
La separación de los isómeros de posición His
deseados u otros isómeros de posición a partir del espectro de
conjugados se pueden efectuar mediante procedimientos tales como
cromatografía de intercambio iónico. Para los propósitos de la
presente invención, el intercambio iónico incluye el intercambio
catiónico y/o aniónico. El procedimiento de la conjugación conduce a
la formación de diversos resultados de isómeros de posición en los
isómeros de posición individuales que se forman teniendo diferentes
distribuciones de carga. La diferencia en las distribuciones de
carga luego se puede usar para resolver (recuperar) cualquier
isómero de posición deseado usando cromatografía de intercambio
iónico (es decir, catiónico y/o aniónico). Por ejemplo, previamente
a la separación, el espectro de diversos isómeros de posición que
resulta a partir de la reacción de conjugación se coloca en una
solución reguladora que contiene desde aproximadamente el 0,5 a
aproximadamente el 10% de conjugados en peso. Se prefieren las
soluciones reguladoras que contienen una o más sales reguladoras
seleccionadas a partir de la lista no limitante de KCl, NaCl,
K_{2}HPO_{4}, KH_{2}PO_{4,} Na_{2}HPO_{4},
NaH_{2}PO_{4}, NaH_{2}PO_{4}, NaHCO_{3}, NaBO_{4,}
(NH_{4})_{2}CO_{3} y reguladores de NaOH de glicina
para usar en la presente invención. Las condiciones de elución
dependerían, por supuesto, de la necesidad de los trabajadores y el
movimiento del isómero de posición.
Generalmente se siguen las técnicas de
cromatografía líquida de alta resolución convencionales. Uno de
tales aparatos para efectuar la separación deseada es un sistema de
HPLC que comprende una columna de intercambio catiónico
Mini-S, disponible a partir de Pharmacia Biotech.
Será patente para aquellos de habilidad normal que el aparato
alternativo y las columnas como un sistema de HPLC que comprende
una columna SP-5PW, disponible de Toso Haas, se
usará también para lograr la separación deseada. Una lista no
limitante de resinas adecuadas para llevar a cabo la separación
incluye las resinas de intercambio catiónico o aniónico tales como
Sefarosa SP y CM, Q o DEAE (de Pharmacia) y Sefarosa CM,
Q-Hyper D de BioSepra.
Como un ejemplo ilustrativo, una composición que
contiene conjugados de polímeros His I
IFN-\alpha-2b sustancialmente
puros, es decir \geq90%, se puede aislar a partir de conjugados de
polímero IFN en una mezcla de reacción usando columnas de
cromatografía tales como filtración de gel seguida por el
intercambio catiónico o intercambio aniónico seguido por intercambio
catiónico. Dichas técnicas proporcionan una composición que contiene
al menos aproximadamente el 85% de conjugados de polímero His34
IFN-\alpha-2b y preferiblemente al
menos aproximadamente el 90% de conjugados de polímero His34
IFN-\alpha-2b. El porcentaje
restante de las composiciones incluirá otros isómeros de posición
que no restan mérito apreciablemente de la efectividad terapéutica
del isómero de posición deseado sustancialmente puro. Otros isómeros
de posición de interferón u otras proteínas se aíslan de manera
similar. Para otros conjugados de proteína se usa una técnica de
separación parecida. También se entenderá a partir de lo anterior
que las técnicas de separación de gradiente lineales y/o de etapa
también son útiles en obtener los conjugados correspondientes a un
pico particular. Además, los conjugados asociados con cada uno de
los picos se pueden aislar de este modo, si se desea. Si es
necesario, las fracciones recogidas se pueden volverse a inyectar en
el aparato de cromatografía con la misma relación de volumen de
alimentación a volumen del lecho de la columna para aumentar la
pureza de la fracción recogida. Los isómeros de posición
sustancialmente puros se pueden someter a una secuencia de péptido
con el fin de determinar el residuo de amino ácido modificado.
Como un ejemplo adicional de las técnicas
descritas anteriormente, los correspondientes conjugados de polímero
I IFN-\alpha-2b para picos
particulares se pueden recuperar usando una resina de intercambio
catiónico tal como mini-S en un sistema de HPLC.
Cada pico se purifica en el sistema de cromatografía de intercambio
catiónico usando un gradiente lineal (A- acetato de sodio 40 mM, B-
acetato de sodio 40 mM, NaCl 100mM) a pH 4,7 a 5,3, longitud de onda
de 214 nanómetros. Las técnicas que usan múltiples etapas
isocráticas de aumento de concentración del tampón de elución, tal
como se discute anteriormente, para los propósitos de recuperación
los conjugados de monopolímeros también se pueden adaptar para la
recuperación de los conjugados deseados correspondientes a un pico
particular.
El procedimiento de la presente invención toma
ventaja del descubrimiento que el sitio de unión del polímero la
mayoría de proteínas está influido en gran medida por el pH del
sistema de reacción. Como el pH de la solución de reacción varía, la
reactividad hacia formas especificas de polímeros activados de los
diversos grupos funcionales tales como alfa-aminas,
imidazoles y aminas épsilon variarán. Típicamente, las reacciones de
conjugación del polímero se llevan a cabo a pHs básicos con el fin
de maximizar la unión a grupos amino epsilon de lisina. Por ejemplo,
Zalipsky y col. Biotech. & App. Biochem, Vol. 15,
p.100-114; (11992) evaluó el reactivo
SC-PEG para la pegilación e informó de que la
reactividad óptima estaba aproximadamente a pH 9,3. El procedimiento
de la presente invención, sin embargo, incluye conducir la reacción
a pHs significativamente más bajos con el fin de permitir unir una
parte sustancial de las hebras de polímero activado a los grupos
amino histidina y quitar importancia, pero no eliminar, los sitios
de unión de lisina y el extremo N-terminal.
También se determina de modo inesperado que la
distribución relativa de los isómeros de posición es, en gran parte
dependiente del pH al cual se lleva a cabo la reacción de
conjugación. Por ejemplo, cambiar el pH de básico a ligeramente
ácido (aproximadamente de 4,5 a 6,8) favorece la formación de
conjugados unidos a His34 en IFN-\alpha 2b y en
una menor extensión, al extremo N-terminal (Cysl) y
los residuos de lisina. Usar pH (8-10) durante la
reacción de conjugación, por el contrario, favorece la formación de
sitios de unión relacionados con lisina, confirmado mediante
cromatografía de intercambio catiónico. Por supuesto, cuando no se
incluye IFN-\alpha 2b, el residuo de His será
diferente. Las condiciones de reacción sin embargo permiten la unión
covalente de un polímero activado a una His.
Según lo señalado anteriormente, las
composiciones preferidas de la presente invención no contienen una
mezcla heterogénea de especies de polímero-IFN en la
cual la(s) hebra(s) de polímero este(n) unidas
a diferentes sitios en la molécula de interferón. Así, las
composiciones tienen perfiles de farmacocinética y bioactividad
in vivo predecibles los cuales maximizan el efecto
terapéutico de la proteína conjugada.
En el caso de IFN-\alpha,
algunas composiciones preferidas son isómeros de posición
PEG-His34-IFN sustancialmente puros.
Las composiciones retienen al menos aproximadamente el 20%,
preferiblemente al menos aproximadamente el 35% y más
preferiblemente al menos aproximadamente el 50% de la bioactividad
de la proteína no modificada. Se entenderá que la cantidad de
actividad retenida y la duración de la vida circulante dependerán de
varios factores incluyendo la proteína y el número y peso de las
hebras de polímero unidas a la proteína.
La presente invención permite los procedimientos
de tratamiento de diversas afecciones médicas en mamíferos,
preferiblemente humanos. Los procedimientos incluyen administrar una
cantidad efectiva de un conjugado de
proteína-polímero que se ha preparado como se
describe en el presente documento a un mamífero en necesidad de
dicho tratamiento. Los conjugados son útiles para, entre otras
cosas, tratar afecciones que se tratan con la proteína no
modificada. Por ejemplo, mamíferos en necesidad de terapia de
sustitución de enzima o factores de sangre pueden estar dando
conjugados de polímeros sustancialmente puros que contienen el
material deseado. En el caso del interferón alfa, afecciones
susceptibles a interferón o afecciones las cuales responderían
positivamente o favorablemente según estos términos se conocen en
las técnicas médicas a terapia basada en interferón.
Las afecciones que se pueden tratar de acuerdo
con la presente invención son generalmente aquellas que son
susceptibles para el tratamiento con interferón alfa. Por ejemplo,
las afecciones susceptibles incluyen afecciones que responderían
positivamente o favorablemente según se conocen estos términos en
las técnicas médicas a terapia basada en interferón alfa. Para
propósitos de la invención, las afecciones que se pueden tratar con
la terapia de interferón alfa incluyen aquellas afecciones en las
cuales el tratamiento con un interferón alfa muestra alguna
eficacia, pero las cuales no pueden ser tratables con interferón
alfa porque los efectos secundarios negativos son mayores que los
beneficios del tratamiento. Por ejemplo, los efectos secundarios que
acompañan la terapia alfa han descartado virtualmente el tratamiento
del virus Epstein Barr usando interferón alfa. La práctica de la
invención resulta en los efectos secundarios sustancialmente
eliminada o reducida comparada con el tratamiento de interferón alfa
convencional.
Las afecciones ejemplares las cuales se pueden
tratar con interferón incluyen aunque no se limitan a trastornos de
proliferación celular, en particular el cáncer (por ejemplo,
leucemia de células velludas, sarcoma de Kaposi, leucemia mielógena
crónica, mieloma múltiple, carcinoma de célula basal y melanoma
maligno, cáncer de ovario, linfoma de célula T cutánea), e
infecciones virales. Sin limitación, el tratamiento con interferón
se puede usar para tratar afecciones las cuales se beneficiarían a
partir de inhibir la replicación de los virus sensibles a
interferón. Las infecciones víricas las cuales se pueden tratar de
acuerdo con la invención incluyen hepatitis A, hepatitis B,
hepatitis C, otras hepatitis no A/no B, virus del herpes, virus de
Epstein-Barr (EBV), citomegalovirus (CMV), herpes
simplex, virus del herpes humano de tipo 6 (HHV-6)),
papiloma, poxvirus, picornavirus, adenovirus, rinovirus, virus
linfotrópico T humano tipo 1 y tipo 2 (HTLV-1/-2),
rotavirus humano, rabia, retrovirus que incluyen el virus de
inmunodeficiencia humana (VIH), encefalitis e infecciones virales
respiratorias. El procedimiento implantado mediante medios de la
invención también puede usarse para modificar diversas respuestas
inmunes.
Las variantes de interferón alfa actualmente
están aprobadas en los Estados Unidos y otros países para el
tratamiento de la leucemia de células velludas, verrugas venéreas,
Sarcoma de Kaposi y hepatitis crónica no A/no B; interferón
alfa-2b, comercializado bajo el nombre comercial
INTRON® A (Schering Corporation, Kenilworth N.J.), e interferón
alfa-2a comercializado bajo el nombre comercial
Roferon® A (Hoffmann-La Roche, Nutley, N.J.) y el
interferón consenso comercializado bajo el nombre comercial
Infergen^{TM} (Amgen, Thousand Oaks, CA). Dado que el interferón
alfa-2b, entre todos los interferones, tiene la
aprobación más amplia por todo el mundo para tratar la infección de
hepatitis C crónica, es el más preferido para usar en el tratamiento
de hepatitis C crónica de acuerdo con las composiciones de la
invención.
La administración de las dosificaciones
descritas puede ser en días alternos, pero es preferible una o dos
veces por semana. Las dosis son normalmente administradas durante al
menos un periodo de 24 semanas por inyección.
La administración de la dosis puede ser
intravenosa, subcutánea, intramuscular o cualquier otro
procedimiento sistémico aceptable. En base al criterio del clínico a
cargo, la cantidad de fármaco administrado y el régimen de
tratamiento usado será, por supuesto, dependiente de la edad, el
sexo y el historial médico del paciente que se trata, el recuento de
neutrófilos (por ejemplo la gravedad de la neutropenia), la gravedad
de la afección de la enfermedad específica y la tolerancia del
paciente al tratamiento como se evidencie mediante efectos
secundarios de toxicidad local o efectos secundarios sistémicos. La
cantidad de dosificación y frecuencia se puede determinar durante
los rastreos iniciales de recuento de neutrófilos.
Las formulaciones farmacéuticas convencionales
también se pueden preparar usando los conjugados sustancialmente
puros que contienen composiciones de la presente invención. Las
formulaciones comprenden una cantidad terapéuticamente efectiva de
la composición del conjugado de polímero interferón sustancialmente
puro junto con los vehículos farmacéuticamente aceptables. Por
ejemplo, coadyuvantes, diluyentes, conservantes y/o solubilizantes,
si es necesario, se pueden usar. Composiciones farmacéuticas de
interferón que incluyen aquellas de la presente invención pueden
incluir diluyentes de varios tampones (por ejemplo,
Tris-HCl, acetato, fosfato) que tienen un intervalo
de pH y fuerza iónica, vehículos (por ejemplo, seroalbumina humana),
solubilizantes (por ejemplo, tween, polisorbato) y conservantes (por
ejemplo, timerosol, alcohol bencílico). Véase por ejemplo, la
Patente de los Estados Unidos 4.496.537.
La cantidad de conjugado de polímero
IFN-\alpha sustancialmente puro administrada para
tratar las afecciones descrita anteriormente se basa en la actividad
por IFN del conjugado polimérico. Es una cantidad que es suficiente
para afectar significativamente la respuesta clínica positiva.
Aunque la dosis clínica causará algún nivel de los efectos
secundarios en algunos pacientes, la dosis máxima para mamíferos
incluyendo seres humanos es la dosis más alta que no causa efectos
secundarios clínicamente importantes inmanejables. Para los
propósitos de la presente invención, tales efectos secundarios
clínicamente importantes son aquellos que requerirían el cese de la
terapia debida a síntomas similares a los de una gripe graves,
depresión del sistema nervioso central, trastornos
gastrointestinales graves, alopecia, prurito grave, erupción
cutánea. También son limitantes de dosis las anormalidades
enzimáticas de leucocitos y/o eritrocitos y/o hígado o afecciones
similares a anemia.
Naturalmente, las dosificaciones de las diversas
dosificaciones de IFN-\alpha variarán algo
dependiendo del resto de IFN-\alpha y del polímero
seleccionado. En general, sin embargo, el conjugado se administra en
cantidades que varían desde aproximadamente 100.000 a
aproximadamente varios millones de IU/m^{2} por día, en base a las
afecciones de los mamíferos. El intervalo expuesto anteriormente es
ilustrativo y aquellos expertos en la técnica determinarán la
dosificación óptima del conjugado seleccionado en base a la
experiencia clínica y a la indicación del tratamiento.
Las composiciones farmacéuticas pueden estar en
la forma de una solución, suspensión, comprimido, cápsula, polvo
liofilizado o similar, preparado según los procedimientos ya
conocidos en la técnica. También se contempla que la administración
de tales composiciones será principalmente por vía parenteral aunque
también se pueden usar vías oral o de inhalación dependiendo de las
necesidades del trabajador.
Los siguientes ejemplos sirven para proporcionar
apreciación adicional de la invención pero no significan de ningún
modo restringir el ámbito efectivo de la invención.
En este ejemplo, el interferón
\alpha-2b recombinante,
(rIFN-\alpha), un producto de la Schering
Corporation, Kenilworth, Nueva Jersey se conjugó con carbonato de
polietilenglicol-N-succinimidilo
activado (SC-PEG), peso molecular 12.000 que se
preparó tal como se describe en la Patente de los Estados Unidos
número 5.122.614. La reacción de conjugación se lleva a cabo a
temperatura ambiente y a un pH de aproximadamente 6,5. Se usó una
proporción de 2,6 gramos de SC-PEG_{12.000} a 1
gramo de IFN. El SC-PEG se añadió como un sólido y
la reacción se llevó a cabo a una temperatura de aproximadamente
4ºC. Al final de la reacción, se añadió glicina inactivando
cualquier reactivo de PEGilación residual. El producto a partir de
la reacción se purificó luego usando una resina
Q-HyperD a pH 8 con elución de sal eliminando los
ingredientes puros y las especies multi-PEGiladas.
El mono-PEG-IFN recuperado a partir
de la resina Q-HyperD fue aproximadamente un 55% del
PEG-IFN unido por His-34, 20% unido
al extremo N-terminal, 12% unido a
lisina-121 con el equilibrio siendo Lys 131, Lys
1134, Lys 49 y Lys 83. Este material que contiene los diversos
isómeros de posición se dializó luego frente a tampón de acetato 20
mM a pH 4,9 y cargado en una columna empaquetada con
SP-Sefarosa de Alta Resolución equilibrada con
tampón de acetato 10 mM a pH 4,9 (aproximadamente 4 mg de material
para 4 ml de resina). El material se eluyó usando un gradiente de
cloruro de sodio (0-500 mM) en el regulador de
acetato. La figura 1 muestra el perfil de elución a partir de la
columna. Se encontró que el pico 1 es PEG-IFN unido
por His34 por encima del 90%.
En este Ejemplo, el procedimiento de conjugación
del Ejemplo 1 se repitió varias veces. La identificación de los
diversos isómeros de posición, sin embargo, se determinó usando un
intercambio aniónico seguido por intercambio catiónico.
Se empleó una columna de intercambio catiónico
Mini-S (Pharmacia Biotech) usando un HPLC
determinando los sitios de unión del polímero e identificando los
isómeros de posición individuales. La fase móvil A incluye tampón de
pH 5,3 de acetato de sodio 10 mM y 2-propanol 25%.
La fase móvil B contenía cloruro de sodio 500 mM disuelto en fase
móvil A. La velocidad de flujo se puso a 0,5 ml/min y la proteína
eluida se detectó a 214 nm. Las soluciones individuales de
PEG-IFN se diluyeron con acetato de sodio 10 mM de
pH 5,3, que contenía 2-propanol (5%) a concentración
de proteína de 1 mg/ml. Los volúmenes de inyección variaron desde 10
a 30 \mul, dependiendo de la concentración de proteína. Se usó el
siguiente gradiente lineal:
Los resultados se proporcionan en la Tabla 1 más
abajo y se ilustran gráficamente en la figura 2. En referencia ahora
a la figura, se puede ver que se determinó que el pico 3 era el
componente principal. Además, la separación por cromatografía dio
como resultado la recuperación de los picos principales de diferente
intensidad. Se destacará, sin embargo que las especies individuales,
es decir los isómeros de posición, no están totalmente separadas las
unas de las otras en este sistema. Por ejemplo, la fracción
incorporada en el pico 3 se determinó que contiene aproximadamente
el isómero de posición His-34 al 90% y
aproximadamente el 10% del isómero de posición
Lys-31. El aislamiento y la recuperación de esta
fracción dieron como resultado una composición que contenía un
IFN-\alpha-2b-His-34-PEG
sustancialmente puro. Hay algún solapamiento en la elución del
isómero de posición. Se puede ver, sin embargo, que el pico o la
fracción 3 representaron aproximadamente el 50% del total de las
especies de PEG-interferón.
Principal pico asignado: Pico 2:
PEG-IFN unido por Lys-134; Pico 3/4:
PEG-IFN unido por His-34; Pico 6:
PEG-IFN unido por Lys-121 y
PEG-IFN unido por Lys-131; Pico 8:
PEG-IFN unido por Cys-1.
Estos resultados ilustran que una mayoría de los
conjugados se encontró en los picos 3 y 4 (PEG-IFN
unido por His-34). Los resultados muestran también
que al contrario de lo que se esperaba, la mayoría de los conjugados
se formaron uniendo el polímero a una histidina más que a uno de los
grupos amino de lisina.
En este ejemplo, se identificaron los diversos
isómeros de posición en el ejemplo 2 se recuperaron usando varios
ciclos de un intercambio catiónico mono-S. Cada una
de las fracciones de cromatografía recuperadas luego se probó por
bioensayo de CPE (actividad antivírica). Más abajo la tabla 2
muestra la bioactividad relativa para interferón nativo (nativa=
100%).
Se puede ver a partir de la Tabla 2 que el sitio
del isómero de posición de His34 (que también incluye una cantidad
menor de Lys31) posee la bioactividad inherente más alta comparada
con interferón nativo (51%). Así, las composiciones sustancialmente
puras que contenían solamente esta fracción, que es principalmente
el isómero de posición His-34, tienen ventajas sobre
conjugados que contienen el espectro de los isómeros de
posición.
Luego las fracciones se caracterizan usando un
esquema de análisis de digestión enzimática usando Tripsina y
Proteasa V-8 seguido por una etapa de cromatografía
de exclusión por tamaño limpiando. El material se sometió a análisis
de secuencia de proteínas en el que la presencia del residuo
aminoácido pegilado en el péptido interferón se dedujo por una
vacante en la secuencia de proteína. El trabajo de caracterización
reveló que el PEG se une a 8 sitios diferentes en la molécula de
interferón-\alpha-2b; Cys1, Lys31,
His34, Lys49, Lys83, Lys121, Lys131 y Lys134. Los detalles se
proporcionan a continuación.
\vskip1.000000\baselineskip
En este ejemplo, el procedimiento del Ejemplo 1
se repitió usando PEG activado con carbonato de benzotriazol
(BTC-PEG) obtenido a partir de Shearwater Polymers,
Inc. (peso molecular 12.000). En particular, el
IFN-\alpha-2b se hizo reaccionar
con BTC-PEG usando una razón de 2,6 gramos de BTC
por gramo de IFN. La reacción se llevó a cabo a temperatura ambiente
durante 4 horas a una concentración de 2 mg de interferón/ml antes
de ser inactivada con glicina. Se usó un total de 60 mg de IFN. La
mezcla de reacción se dializó contra un regulador de gel de
filtración que contenía un tampón de fosfato sódico 100 mM y cloruro
sódico 150 mM, pH 5. Se cargaron 5 ml de material dializado en
columna Superdex 200 de 200 ml equilibrada con el tampón de gel de
filtración separando las especies mono-PEG a partir
de las especies de multihebra.
Antes de llevar a cabo la caracterización de los
diversos isómeros de posición, la mezcla de reacción
mono-PEG-IFN se sometió a prueba de
sensibilidad a hidroxilamina determinando el porcentaje de los
conjugados que estaban pegilados en los sitios de histidina,
incluyendo el IFN-His34. Se sabe que la
hidroxilamina escinde selectivamente el PEG a partir de residuos de
histidinas de IFN. Se diluyó una alícuota de cada una de las
muestras (50 \mul) con 0,45 ml de fosfato de sodio de pH 7,0 10
mM. Una alícuota de esta solución de proteína (150 \mul) se trató
con 150 \mul de hidroxilamina 0,5 M y se incubó a temperatura
ambiente durante 60 minutos. Se determinó que más del 90% de los
conjugados era hidroxilamina-sensitivo lo cual
indica que sobre el 90% del material es
interferón-PEG unido por His. La caracterización
adicional de la mezcla de reacción verificó que el His34 era el
único residuo conjugado de histidina. La cromatografía HPLC de la
mezcla Superdex 200 indicó que efectivamente His34 era el sitio
principal de pegilación. Esto se confirmó adicionalmente mediante
caracterización del producto final usando un esquema de análisis de
digestión enzimática similar al procedimiento descrito en el Ejemplo
3 el cual indicó que el His34 era el sitio principal de pegilación.
La actividad específica de este isómero de posición se encontró que
era 89 MIU/mg.
Los conjugados
IFN-His34-PEG sustancialmente puros
también se recuperaron a partir de la mezcla de reacción
BTC-PEG-IFN usando solamente un
ciclo de cromatografía de intercambio catiónico. La mezcla de
reacción se dializó en contra del tampón de acetato de sodio 40 mM a
pH 5,1. Aproximadamente 3,2 ml de la mezcla de reacción dializada se
cargaron en 4 ml de una columna SP-5PW y el pico
His34-PEG-IFN se eluyó usando un
gradiente de NaCl (0 a 500 mM) a pH 5,1. La pureza de
His34-PEG-IFN de la mezcla del
producto era al menos del 94%. Se determinó que el
diPEG-IFN en la mezcla era aproximadamente del
3-5%.
Ejemplos
5-6
En estos ejemplos, el procedimiento del Ejemplo
4 se repitió usando BTC-PEG (peso molecular 5.000,
Ej. 5. y 20.000, Ej. 6, respectivamente. La cantidad del
interferón-His-PEG para el ejemplo 5
se determinó mediante la reacción de la hidroxilamina que era
aproximadamente el 90-95% mientras que en el Ejemplo
6 se determinó que era aproximadamente el 91%. El aislamiento de los
diversos isómeros de posición del PEG-IFN usando
filtración de gel se llevó a cabo después eliminando los conjugados
no mono hebrados. La actividad específica de los conjugados de
PEG_{5.000} se determinó que era aproximadamente 119 MIU/mg
mientras que la actividad específica del isómero de posición
PEG_{20.000}-His34 era 89 MIU/mg.
En este ejemplo, las actividades biológicas de
los isómeros de posición individuales (His34,
Lys-121 y extremo N-terminal)
identificados anteriormente se probaron después de la incubación en
un suero humano normal a 37ºC durante la subida a 72 horas y se
compararon con interferón nativo no PEGilado. Los resultados se
muestran en la figura 3.
En referencia ahora a la figura 3, se puede ver
que inesperadamente sólo la actividad del isómero de posición His34
aumenta durante el tiempo mientras la actividad de los otros
isómeros de posición permanece relativamente constante. El
interferón nativo, por el contrario, demuestra un descenso
predecible en la actividad durante el periodo de observación.
Mientras los solicitantes no se enlazan por la teoría, el aumento en
la actividad con el material unido por His34 se cree que está
relacionado con la hidrólisis relativamente lenta del enlace
His-PEG y la liberación subsiguiente de IFN libre.
Esta figura muestra las propiedades únicas del enlace
His-PEG en que bajo ciertas condiciones es más débil
que los enlaces Lys-PEG y como tal su análisis
proporciona un mecanismo de administración prolongado o de
"liberación lenta".
Ejemplos
8-9
En estos ejemplo, la proteína
IL-10, un homodímero no covalente, se conjugó a
BTC-PEG_{12.000} (Ej. 8) o
SC-PEG_{12.000} (Ej. 9) a pH 6,5 con el fin de
determinar el grado de isómeros de posición unidos a histidina en la
mezcla de reacción resultante. El IL-10 tiene 3
histidinas disponibles.
Los procedimientos de pegilación descritos
anteriormente con respecto a IFN se siguieron con el fin de llevar a
cabo la conjugación. En particular, sin embargo, en cada caso se
usó un exceso molar de 2-3 veces del polímero
activado y la filtración de gel. La prueba de sensibilidad de
hidroxilamina se hizo en cada lote determinando la cantidad de
isómeros de posición que contienen His. El conjugado basado en BTC
se encontró que contenía aproximadamente 50% más de conjugados
lábiles por hidroxilamina que de conjugados basados en SC. La
bioactividad específica de los conjugados basados en BTC se
determinó que era aproximadamente el 84% usando el bioensayo de
MC-9. Se encontró que los conjugados basados en
SC-PEG tenían una bioactividad específica de
aproximadamente el 49%.
Claims (31)
1. Una composición de conjugado de
proteína-polímero que comprende una mezcla de
isómeros de posición de un conjugado de proteína de polímero, en la
que una mayoría de los conjugados tiene el polímero conjugado
covalentemente a la proteína en un residuo de histidina y una
minoría son otros isómeros de posición.
2. La composición de la reivindicación
1, en la que dicho polímero comprende un óxido de polialquileno.
3. La composición de la reivindicación
2, en la que dicho óxido de polialquileno es un
polietilenglicol.
4. La composición de la reivindicación
3, en la que dicho polietilenglicol es un
monometoxi-poletilenglicol, (mPEG).
5. La composición de la reivindicación
1, en la que dicho polímero tiene un peso molecular desde 200 a
35.000.
6. La composición de la reivindicación
5, en la que dicho polímero tiene un peso molecular desde 1,000 a
25,000.
7. La composición de la reivindicación
6, en la que dicho polímero tiene un peso molecular desde 2.000 a
20.000.
8. La composición de la reivindicación
1, en la que al menos el 60% de los conjugados tienen el polímero
conjugado covalentemente en la proteína a un residuo de
histidina.
9. La composición de la reivindicación
8, en la que al menos el 80% de los conjugados tiene el conjugado
covalentemente del polímero en la proteína a un residuo de
histidina.
10. La composición de la reivindicación 1,
en la que dicha proteína es un interferón alfa o
IL-10.
11. La composición de la reivindicación 10,
en la que dicho interferón alfa es interferón alfa 2b.
12. La composición de la reivindicación 10,
en la que al menos el 85% de los conjugados tiene el conjugado del
polímero covalentemente al residuo de histidina en la posición 34 de
interferón alfa 2b.
13. Una composición farmacéutica comprende
una composición tal como se definió en cualquiera de las
reivindicaciones 1-12 y un vehículo
farmacéuticamente aceptable.
14. Un procedimiento de preparación de una
composición conjugado de polímero-proteína, que
comprende:
a) formar una mezcla de isómeros de posición de
un conjugado de proteína-polímero mediante reacción
de una proteína con una cantidad suficiente de un polímero activado
bajo condiciones suficientes para facilitar la unión covalente de
dicha proteína a dicho polímero activado; y
b) separar un conjugado de polímero proteína que
tiene el polímero conjugado covalentemente a una histidina de la
proteína a partir de otros isómeros de posición para obtener una
composición en la que una mayoría de los conjugados son otros
isómeros de posición.
15. El procedimiento de la reivindicación
14, en el que dicha proteína es un interferón alfa o
IL-10.
16. El procedimiento de la reivindicación
14, en el que dicho polímero activado es polímero de carbonato de
benzotriazol activado.
17. El procedimiento de la reivindicación
14, en el que dicho polímero activado es un polímero
oxicarbonil-oxi-N-dicarboximida
activado.
18. El procedimiento de la reivindicación
17, en el que dicho
oxicarbonil-oci-N-dicarboximida
es carbonato succinimidilo.
19. El procedimiento de la reivindicación
14, en el que dicha separación se efectúa por cromatografía de
filtración de gel seguido por cromatografía de intercambio
iónico.
20. El procedimiento de la reivindicación
19, en el que dicha cromatografía de intercambio iónico es una
cromatrografía de intercambio aniónico.
21. El procedimiento de la reivindicación
14, en el que dicha separación se efectúa mediante la cromatografía
seguida por cromatografía de intercambio catiónico.
22. El procedimiento de la reivindicación
14, en el que dichas condiciones incluyen llevar a cabo dicha
reacción a un pH menor que 7,0.
23. El procedimiento de la reivindicación
22, en el que dichas condiciones incluyen llevar a cabo dicha
reacción a un pH menor que 6,8.
24. El procedimiento de la reivindicación
23, en el que dichas condiciones incluye llevar a cabo dicha
reacción a un pH desde 4,5 a 6,8.
25. El procedimiento de la reivindicación
15, en el que dicho interferón alfa es interferón alfa 2b.
26. El procedimiento de la reivindicación
14, en el que dicho polímero activado esta presente en un exceso
molar con respecto a dicha proteína.
27. El procedimiento de la reivindicación
14, en el que dicho polímero comprende un óxido de
polialquileno.
28. El procedimiento de la reivindicación
27, en el que dicho óxido de polialquileno es un
polietilenglicol.
29. El procedimiento de la reivindicación
14, en el que dicho polímero tiene un peso molecular desde 200 a
35.000.
30. El procedimiento de la reivindicación
29, en el que dicho polímero tiene un peso molecular desde 1.000 a
25.000.
31. El procedimiento de la reivindicación
30, en el que dicho polímero tiene un peso molecular desde 2.000 a
20.0000.
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