ES2303563T3

ES2303563T3 - Microorganismos para la desintoxicacion biologica de micotoxinas, a saber ocratoxinas y/o zearalenonas, asi como procedimiento y uso para ello.

Info

Publication number: ES2303563T3
Application number: ES02798239T
Authority: ES
Inventors: Gerd Schatzmayr; Dian Heidler; Elisabeth Fuchs; Eva-Maria Binder
Original assignee: Erber AG
Current assignee: DSM Austria GmbH
Priority date: 2001-12-20
Filing date: 2002-12-19
Publication date: 2008-08-16
Anticipated expiration: 2022-12-19
Also published as: BR0207398B1; BR0207398A; WO2003053161A1; DE50212242D1; CY1108107T1; PL368742A1; ATE394034T1; ZA200403653B; DK1455595T3; MXPA04005985A; NO20033664L; MA26256A1; TW200302053A; AT413540B; EA200400836A1; EP1455595A1; PT1455595E; AU2002363819A1; HU229086B1; HUP0402278A3

Abstract

Microorganismo para la desintoxicación biológica de micotoxinas, a saber ocratoxinas y/o zearalenonas, caracterizado porque se emplea, o respectivamente emplean un microorganismo, en particular bacterias o levaduras desintoxicadoras, aerobias o anaerobias, el o las cual(es) desdobla(n) el grupo de fenilalanina de las ocratoxinas, o respectivamente descomponen a zearalenonas, escogiéndose el microorganismo, particularmente las bacterias desintoxicadoras entre Sphingomonas sp. DSM 14170 y DSM 14167, Stenotrophomonas nitritreducens DSM 14168, Stenotrophomonas sp. DSM 14169, Ralstonia eutropha DSM 14171 y Eubacterium sp. DSM 14197 y/o escogiéndose las levaduras desintoxicadoras entre Trichosporon spec. nov. DSM 14153, Cryptococcus sp. DSM 14154, Rhodotorula yarrowii DSM 14155, Trichosporon mucoides DSM 14156 y Trichosporon dulcitum DSM 14162.

Description

Microorganismos para la desintoxicación biológica de micotoxinas, a saber ocratoxinas y/o zearalenonas, así como procedimiento y uso para ello.

El presente invento se refiere a un microorganismo destinado a la desintoxicación biológica de micotoxinas, a saber ocratoxinas y/o zearalenonas, así como a un procedimiento para la desintoxicación biológica de micotoxinas, a saber ocratoxinas y/o zearalenonas, en alimentos y piensos con por lo menos un microorganismo, así como a la utilización de bacterias y/o levaduras para la desintoxicación de ocratoxinas y/o zearalenonas en alimentos o piensos.

Las micotoxinas son productos finales metabólicos secundarios naturales de mohos, que infestan mundialmente a los productos agrícolas y que ya en pequeñas cantidades provocan efectos tóxicos. A causa de la infestación de los productos agrícolas con micotoxinas resultan unos daños extremadamente altos y se provocan además micotoxicosis en seres humanos y animales, que muestran parcialmente efectos espectaculares. A causa de las altas pérdidas económicas, así como de la carga de seres humanos y animales con micotoxinas, y de las micotoxicosis provocadas de esta manera, ya se buscaron desde hace mucho tiempo posibilidades de adoptar medidas contra la contaminación con micotoxinas, conociéndose a partir de la bibliografía, en principio, dos métodos. Un primer método intenta impedir el crecimiento de los mohos en alimentos o respectivamente piensos, con lo que al mismo tiempo se impide la producción de las micotoxinas. Un segundo método intenta destruir posteriormente las micotoxinas o descontaminar alimentos y/o piensos.

Así, por ejemplo, en el documento de solicitud de patente internacional WO 91/13555 se describen un aditivo para piensos así como un procedimiento para la desactivación de micotoxinas, realizándose que a un pienso se le añaden partículas de un mineral filosilicato, con el fin de desactivar a las micotoxinas. Con el fin de reforzar el efectos de estos filosilicatos, las partículas son revestidas con un agente secuestrante, con el fin de acelerar el efecto. Además, por ejemplo, a partir del documento WO 92/05706 se conoce un pienso, en el que está contenida una arcilla del tipo de montmorillonita como aditivo para los piensos. Estos minerales arcillosos naturales con grandes superficies internas, a causa de su porosidad, deben fijar superficialmente a las micotoxinas y de esta manera inmovilizarlas.

Además, a partir del modelo de utilidad austriaco AT-U 504 se ha conocido un aditivo para piensos, en el que se utiliza una formulación enzimática, que es capaz de formar epoxidasas y lactonasas, y de descomponer químicamente a las micotoxinas tanto en el pienso como también en el tracto gastrointestinal de animales. De acuerdo con este documento AT-U 504, el efecto de esta formulación enzimática puede ser reforzado mediante la adición de zeolitas y similares.

La adición de agentes fijadores de micotoxinas a piensos, que en el transcurso de la digestión pasan directamente a tomar parte, dentro del tracto digestivo, en una fijación con las micotoxinas, puede reducir al mínimo los efectos de las toxinas en la explotación ganadera de animales útiles. Junto a las posibilidades arriba mencionadas, se cuentan entre las sustancias empleadas alfalfa, bentonitas, zeolitas, arcillas, carbón activo, silicatos de aluminio, calcio y sodio hidrogenados, filosilicatos y paredes celulares de levaduras o bacterias (véanse los documentos de patentes de los EE. UU US 5.165.946; WO 99/57994; US 6.045.834; de patente europea EP 0.721.741; US 5.165.946; US 5.935.623;
WO 98/34503; WO 00/41806). La fijación de las toxinas a estos materiales es dependiente de las propiedades estructurales de las toxinas. Así, hasta hoy en día no se ha encontrado ningún efectivo agente fijador de micotoxinas para los tricotecenos. Una desventaja adicional de los agentes fijadores de micotoxinas consiste en que ellos pueden adsorber a partir de los piensos, junto a las toxinas, también importantes sustancias nutritivas, tales como vitaminas o antibióticos.

Hace poco tiempo se comprobó que se pueden descomponer micotoxinas por medio de microorganismos y por consiguiente se pueden desintoxicar parcialmente. Un ejemplo de la desintoxicación de micotoxinas, en particular de tricotecenos, está contenido en el documento de patente austriaca AT-B 406.166, en el que un cultivo puro especial de un microorganismo que pertenece al género Eubacterium, que había sido depositado bajo el número DSM 11798, así como un cultivo mixto del género Eubacterium con un enterococo, que había sido depositado bajo el número 11799, desintoxican a los tricotecenos por desdoblamiento del anillo epoxídico presente en tricotecenos.

A partir del documento de patente US-A 4.004.978 se ha conocido la utilización de Rhodotorula o de un correspondiente extracto crudo, o respectivamente de un extracto exento de células, procedente de Rhodotorula, para la descomposición de zearalenonas. Algo similar se puede deducir a partir del documento WO-A-02/076205 publicado posteriormente.

La desintoxicación de ocratoxinas mediante una hidrólisis enzimática ya fue descrita por M. J. Pitout: The hydrolysis of ochratoxin A by some proteolytic enzymes [La hidrólisis de ocratoxina A por algunas enzimas proteolíticas], Biochem. Pharmacol. 18, 485-491 (1969).

El presente invento tiene como meta, por fin, poner a disposición microorganismos especiales así como cultivos mixtos o puros y también combinaciones de los mismos, con los cuales se consiga descomponer bioquímicamente de una manera deliberada a las micotoxinas, a saber las ocratoxinas y/o zearalenonas, y convertirlas en sustancias inocuas fisiológicamente y en particular inocuas en la industria de la industria de los piensos y los alimentos.

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Para la resolución de los problemas planteados por estas misiones, el microorganismo conforme al invento del tipo mencionado al comienzo está caracterizado en lo esencial porque se emplea, o respectivamente se emplean, un microorganismo, en particular bacterias o levaduras desintoxicadoras, aerobias o anaerobias, el o las cual(es)
desdobla(n) el grupo de fenilalanina de las ocratoxinas o respectivamente descomponen a las zearalenonas, seleccionándose el microorganismo, particularmente las bacterias desintoxicadoras, entre Sphingomonas sp. DSM 14170 y DSM 14167, Stenotrophomonas nitritreducens DSM 14168, Stenotrophomonas sp. DSM 14169, Ralstonia eutropha DSM 14171 y Eubacterium sp. DSM 14197, y/o las levaduras desintoxicadoras entre Trichosporon spec. nov. DSM 14153, Cryptococcus sp. DSM 14154, Rhodotorula yarrowii DSM 14155, Trichosporon mucoides DSM 14156 y Trichosporon dulcitum DSM 14162. Por el hecho de que se emplea(n) un microorganismo, en particular bacterias o levaduras desintoxicadoras, aerobias o anaerobias, seleccionadas entre Sphingomonas sp. DSM 14170 y DSM 14167, Stenotrophomonas nitritreducens DSM 14168, Stenotrophomonas sp. DSM 14169, Ralstonia eutropha DSM 14171 y Eubacterium sp. DSM 14197, así como las levaduras desintoxicadoras, seleccionadas entre Trichosporon spec. nov. DSM 14153, Cryptococcus sp. DSM 14154, Rhodotorula yarrowii DSM 14155, Trichosporon mucoides DSM 14156 y Trichosporon dulcitum DSM 14162, el (o las) cual(es) desdoblan el grupo de fenilalanina de los ocratoxinas o respectivamente descomponen a las zearalenonas, se consigue transformar a las ocratoxinas, en particular a la ocratoxina A o a la ocratoxina B, en aquellos metabolitos que no tienen ningún grupo de fenilalanina, y por lo tanto ya no muestran el efecto tóxico de las ocratoxinas. Esta metabolización de las ocratoxinas se realiza mediante una enzima similar a la carboxipeptidasa A, que desdobla directamente al enlace de amida de la ocratoxina, o también mediante un complejo multienzimático, por medio del cual el anillo de la fenilalanina es hidroxilado, y en una sucesión ulterior es desdoblado y descompuesto. Finalmente, la aspartama remanente es separada, con lo cual se obtiene de nuevo un metabolito no tóxico de las ocratoxinas. Esta ruta puede ser representada de una manera sencilla como sigue:

Con los microorganismos conformes al invento, seleccionados entre bacterias y/o levaduras, junto a la desintoxicación de la ocratoxina A y de la ocratoxina B se consigue también la de los metabolitos 4R-hidroxi-ocratoxina A, 4S-hidroxi-ocratoxina A, ocratoxina C, éster metílico de ocratoxina A, éster metílico de ocratoxina B y éster etílico de ocratoxina B. Además, con estos microorganismos se consiguen la descomposición y por consiguiente la desintoxicación de zearalenonas.

Tales microorganismos pueden pasar a emplearse también sin peligro en alimentos y piensos, lo cual no ocurre indispensablemente en el caso de un gran número de otras bacterias y levaduras, que desdoblan o respectivamente descomponen a las micotoxinas.

El hecho de que, de acuerdo con el presente invento, se puedan emplear como microorganismos bacterias o levaduras desintoxicadoras, tanto aerobias como también anaerobias, es importante en particular, puesto que, en el caso de ingerirse alimentos y/o piensos contaminados con correspondientes microorganismos, también se puede conseguir una desintoxicación después de la ingestión del alimento y/o pienso. Esta desintoxicación es posible en este caso en cualquier etapa o respectivamente en cualquier segmento del paso del alimento o respectivamente pienso por el tracto gastrointestinal, puesto que cada vez se pueden llevar a empleo deliberadamente los correspondientes microorganismos o sus combinaciones. Tal como es conocido, las condiciones en el tracto gastrointestinal, desde el estómago hasta el intestino grueso, son crecientemente anaerobias, lo cual significa que disminuye cada vez más el potencial redox, por lo que después de una ingestión de alimentos y/o piensos contaminados con correspondientes micotoxinas o respectivamente ocratoxinas y/o zearalenonas, la desintoxicación se puede hacer empezar primeramente con bacterias y/o levaduras aerobias, y al final de un paso por el tracto digestivo, o respectivamente, si el alimento o respectivamente pienso ya se encuentra en un segmento de los intestinos en el que predominan condiciones anaerobias, la desintoxicación se puede llevar a cabo con correspondientes bacterias y/o levaduras anaerobias.

Entre estas otras bacterias o levaduras, que están capacitadas asimismo para la descomposición de microorganismos, se pueden emplear con éxito las mencionadas a continuación, pudiendo pasar a emplearse éstas ya sea en un medio o tampón, o mostrando un efecto también en ambas sustancias.

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(Tabla pasa a página siguiente)

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Se ha manifestado como especialmente ventajoso, tal como corresponde esto también a un perfeccionamiento preferido del invento, el hecho de que las bacterias y/o levaduras son estabilizadas en particular mediante una liofilización, una desecación por atomización o una microencapsulación. Mediante la estabilización de los microorganismos se mejora o respectivamente aumenta su capacidad de vivir (viabilidad) y la duración de su vida, y además de esto, ellos se pueden emplear más universalmente en el estado estabilizado, y por consiguiente se pueden emplear en cualquier momento y en cualquier aplicación deseada. La estabilización mediante liofilización, desecación por atomización o microencapsulación, es conocida de por sí, siendo éstos unos procedimientos sencillos y realizables con rapidez, que proporcionan microorganismos estables, y capaces de vivir (viables)-.

De acuerdo con un perfeccionamiento del invento, las bacterias o levaduras se emplean como un extracto exento de células o como un extracto bruto. En este caso, de acuerdo con un perfeccionamiento, en el caso de utilizarse un extracto exento de células, éste se emplea en una solución, en particular en una solución acuosa. Las soluciones acuosas de un extracto exento de células tienen la ventaja de que ellas, mediante aplicación por proyección sobre los alimentos o respectivamente piensos que se han de tratar, entran en contacto directamente sobre la superficie con las micotoxinas contaminadoras, y se puede conseguir una desintoxicación ya inmediatamente después de la aplicación por proyección del extracto. La utilización de un extracto bruto a base de bacterias y levaduras, que se ha obtenido por medio de ultrasonidos, de una disgregación enzimática, de una combinación de congelación de choque y descongelación, de un homogeneizador de paso, de una prensa French, de una autolisis en el caso de una alta concentración de NaCl y/o de un molino de bolas, presenta la ventaja de que un extracto bruto de tal tipo se puede obtener de una manera especialmente rápida y sin problemas, por lo que, en particular en casos en los que es necesario un rápido empleo de sustancias desintoxicadoras o respectivamente descomponedoras de micotoxinas, la utilización de un extracto bruto ofrece resultados rápidos y confiables. Además de esto, se pueden emplear extractos brutos directamente en la preparación de piensos, de manera tal que los piensos mezclados con microorganismos pueden ser ingeridos por los animales, y los microorganismos, en particular las levaduras o bacterias, desarrollan su efecto tan sólo cuando ya están en el tracto digestivo del animal. En este contexto, puede pasar a emplearse, de acuerdo con el invento, también una mezcla, que contiene un extracto bruto de diferentes bacterias y/o levaduras desintoxicadoras.

El empleo de los microorganismos en una solución no tamponada o tamponada, que contiene un tampón de fosfato o hidrocloruro de Tris con unos valores del pH comprendidos entre 1 y 12, en particular entre 2 y 8, tal como esto corresponde a una realización preferida, ofrece la ventaja de que los microorganismos se pueden administrar directamente con alimentos o respectivamente piensos. y desarrollan su efecto en el tracto gastrointestinal junto a las zonas donde el potencial redox es apropiado para conseguir un efecto óptimo de los microorganismos empleados. Mediante empleo de una solución tamponada, se consigue una adaptación inmediata a los respectivos valores del pH en el tracto gastrointestinal, de manera tal que los alimentos o respectivamente condimentos, mezclados con la solución tamponada junto a microorganismos, no producen ningún desplazamiento, ni respectivamente ninguna perturbación, del valor del pH que predomina en el tracto gastrointestinal, lo cual, por una parte, aumenta la fácil digestibilidad de los alimentos o respectivamente piensos mezclados y, por otra parte, no conduce a ninguna perturbación de la digestión en el medio gastrointestinal.

Una misión adicional del presente invento es la de poner a disposición sustancias o respectivamente microorganismos, que se puedan emplear para la desintoxicación de alimentos o condimentos, sin que traigan consigo para los seres vivos que los ingieren ningún daño o respectivamente perjuicio, y sin que los alimentos o respectivamente condimentos, que han sido tratados con ellos, junto a una desintoxicación de las micotoxinas, que estaban presentes en los alimentos o respectivamente condimentos, experimenten ningún tipo de perjuicios o respectivamente alteraciones.

Para la resolución de los problemas planteados por estas misiones, se encontró que la utilización de bacterias, seleccionadas entre Sphingomonas sp. DSM 14170 y DSM 14167, Stenotrophomonas nitritreducens DSM 14168, Stenotrophomonas sp. DSM 14169, Ralstonia eutropha DSM 14171 y Eubacterium sp. DSM 14197, y/o de levaduras, seleccionadas entre Trichosporon spec. nov. DSM 14153, Cryptococcus sp. DSM 14154, Rhodotorula yarrowii DSM 14155, Trichosporon mucoides DSM 14156 y Trichosporon dulcitum DSM 14162, hace posible desintoxicar, por separación del grupo de fenilalanina, a las micotoxinas, a saber a las ocratoxinas, o respectivamente descomponer a las zearalenonas, que están presentes en la superficie de alimentos o piensos, sin perjudicar ni respectivamente influir de ninguna manera a los alimentos o respectivamente piensos, que han sido tratados con ellas.

Se ha manifestado como particularmente apropiada para esta finalidad, la utilización de Trichosporon spec. nov. DSM 14153, Eubacterium sp. DSM 14197 o Stenotrophomonas nitritreducens DSM14168, con los que se consigue una descomposición particularmente total de micotoxinas, a saber de ocratoxinas y/o zearalenonas, y que no existe ningún tipo de reparo contra dichos microorganismos.

Con el fin de conseguir una desintoxicación particularmente rentable de micotoxinas, en particular en alimentos o piensos, se utilizan cultivos mixtos o combinaciones de varias bacterias y/o levaduras para la desintoxicación de ocratoxinas y/o zearalenonas en alimentos y/o piensos.

Una misión adicional del presente invento es la de poner a disposición un procedimiento para la desintoxicación biológica de micotoxinas, a saber ocratoxinas y/o zearalenonas, en alimentos y piensos, con un microorganismo, con el que se consiga descontaminar a las toxinas contaminadoras de una manera total y rápida, directamente después de una puesta en contacto con un alimento o pienso o en el tracto digestivo de los seres vivos que ingieren este alimento o pienso.

Para la resolución de los problemas planteados por estas misiones, el procedimiento conforme al invento está caracterizado en lo esencial porque se mezcla un microorganismo conforme al invento, en particular bacterias y/o levaduras conformes al invento, con el alimento o pienso, en una proporción de 0,01% en peso a 1% en peso, en particular de 0,05% en peso a 0,5% en peso. Por el hecho de que el alimento o pienso se mezcla en forma sólida con el microorganismo conforme al invento, en particular con las bacterias o levaduras conformes al invento, se puede conseguir una forma estable de alimentos o respectivamente piensos, que están mezclados con el microorganismo correspondientemente estabilizado. Cuando se ingiere un alimento o pienso de este tipo, mezclado con el microorganismo conforme al invento, se llega en el transcurso de la insalivación a la formación de una suspensión, y la desintoxicación del alimento o respectivamente pienso, en particular la descomposición de las ocratoxinas, comienza inmediatamente después de la ingestión del alimento o respectivamente pienso por el ser humano o respectivamente por el animal. De esta manera se consigue una descomposición total de micotoxinas dañinas, a saber ocratoxinas y/o zearalenonas, en el tracto gastrointestinal del animal anfitrión que las recibe, de manera tal que el organismo no es cargado de ninguna manera por medio de micotoxinas dañinas.

Cuando se pretende que sean ingeridos alimentos o respectivamente piensos ya desintoxicados, de acuerdo con un perfeccionamiento del invento la mezcladura de los alimentos o respectivamente piensos se lleva a cabo mediante agitación en una suspensión acuosa del microorganismo, que contiene de 20 a 99% en peso, en particular de 35% en peso a 85% en peso de agua, a unas temperaturas de 10 a 60ºC, en particular de 15 a 45ºC, durante 2 min. a 12 h, en particular durante 5 min. a 2 h. Mediante el hecho de que los alimentos o piensos son tratados mediante agitación en una suspensión acuosa del microorganismo, se consiguen, por una parte, un contacto íntimo del alimento o pienso que se ha de tratar con los microorganismos desintoxicadores y, por otra parte, un tratamiento moderado de los microorganismos, con lo cual se asegura que éstos no sean empeorados ni respectivamente aniquilados mediante el mezclamiento con el alimento o pienso. En el caso de este mezclamiento es importante en particular prestar atención tanto a que las temperaturas del mezclamiento no sean demasiado altas ni demasiado bajas, como también a que la duración y la composición de la suspensión o respectivamente papilla se mantengan totalmente en coincidencia con el presente invento, a fin de impedir con seguridad una destrucción o respectivamente aniquilación de los microorganismos.

El invento se explica con mayor detalle a continuación con ayuda de Ejemplos, que conciernen al aislamiento de los microorganismos y a su modo de actuar.

1. Cultivación, producción y obtención de la levadura Trichosporum spec. nov. (DSM 14153)

Para la cultivación de la levadura se utiliza la siguiente solución de cultivo:

10 g de un extracto de levadura

20 g de un extracto de malta

10 g de glucosa

5 g de una peptona

400 ppm de ocratoxina A

1 l de agua OP (purificada por ósmosis)

Valor del pH 5,5.

Esta solución se trata en un autoclave durante 25 min. a 121ºC. En un matraz de Erlenmeyer con una capacidad de 100 ml se colocan 30 ml de un cultivo preliminar (concentración de inóculo 0,33%). La incubación se efectúa durante 72 h a 25ºC en un dispositivo sacudidor. El número alcanzado de gérmenes es de aproximadamente 5 x 10^{7}/ml.

Después de ello, estos 30 ml del cultivo preliminar sirven como inóculo para una fermentación en un fermentador con una capacidad de 75 l. Para esta fermentación se utiliza el siguiente medio de cultivación:

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Como otros parámetros, se ajustan una pO_{2} de 40% y una velocidad máxima de aireación de 3 m^{3}/h. El valor del pH es, al comienzo, de 5,00, pero se modifica en el transcurso del proceso de crecimiento (aumenta hasta llegar a 8,5). Después de aproximadamente 40-44 h, se puede aprovechar el contenido como inóculo para el fermentador de producción con una capacidad de 3,6 m^{3}. Para éste se utiliza el siguiente medio:

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La velocidad de aireación es de 15 m^{3} de aire por hora. Después de 40-48 h, las células pueden ser aumentadas de concentración mediante un dispositivo separador de paso. Mediante el dispositivo separador se puede aumentar la concentración del caldo de fermentación a aproximadamente 1:10, con lo que se obtiene un número de gérmenes de aproximadamente 3 x 10^{9}/ml.

La subsiguiente estabilización se realiza por medio de una liofilización o mediante una desecación por atomización. Como agente crioprotector para la liofilización sirve un polvo de suero de leche.

Se añade un 10%, referido al volumen del concentrado. A continuación, el concentrado se congela a -80ºC. La liofilización se realiza a una presión de 0,400 mbar, con una temperatura de la superficie útil de 20ºC. La duración, en el caso de un grosor de capa de 1,5 cm, es de aproximadamente 30 h.

Los parámetros para la desecación por atomización son:

- temperatura de entrada del medio para desecación (aire): 160ºC

- temperatura de salida: 80ºC

- presión: 3 bar

2. Cultivación, producción y obtención de la bacteria Stenotrophomonas nitritreducens (DSM 14168)

La cultivación de la bacteria se realiza en un caldo nutritivo, una primera vez en Oxoid CM 001 B y una segunda vez en CM 067 B con 400 ppb (partes por mil millones) de ocratoxina A. 30 ml del medio se tratan en autoclave a 121ºC durante 25 min. en un matraz de Erlenmeyer con una capacidad de 100 ml. Como inóculo sirven 1,5 ml de un tubito procedente del "Working Cell Bank". La incubación se efectúa durante 72 h a 30ºC en un dispositivo sacudidor.

Después de ello, estos 30 ml del cultivo preliminar sirven como inóculo para una fermentación en un fermentador con una capacidad de 75 l. Para esta fermentación se emplea el siguiente medio de cultivación.

102

Como otros parámetros, se ajustan una pO_{2} de 40% y una velocidad máxima de gaseo de 3 m^{3}h. La velocidad del agitador es de 200 rpm (revoluciones por minuto). El valor del pH al comienzo es de aproximadamente 6,8 a 6,9, pero se modifica en el transcurso del proceso de crecimiento, él sube hasta llegar a 8,3. Después de aproximadamente 40-44 h, el contenido se puede aprovechar como inóculo para el fermentador de producción con una capacidad de 3,6 m^{3}. Para éste se utilizó el siguiente medio:

103

La velocidad de aireación se ajusta a 15 m^{3} de aire por hora. La velocidad del agitador es de 250 rpm.

Después de 40-48 h, las células pueden ser aumentadas de concentración mediante un dispositivo separador de paso. La relación de aumento de la concentración es de aproximadamente 1:100.

La subsiguiente estabilización se realiza mediante liofilización o mediante una desecación por atomización. Como agente crioprotector para la liofilización sirve un polvo de suero de leche.

En la mayor parte de los casos se añade un 10%, referido al volumen del concentrado. A continuación, el concentrado se congela a -80ºC (durante 10 h) o con nitrógeno líquido (durante 2 h). La liofilización se efectúa a una presión de 0,400 mbar, con una temperatura de la superficie útil de 20ºC. La duración es de aproximadamente 30 h en el caso de un grosor de capa de 1,5 cm.

Los parámetros para la desecación por atomización son:

- temperatura de entrada del medio para desecación (aire): 160ºC

- temperatura de salida: 80ºC

- presión: 3 bar.

3. Cultivación, producción y obtención de la bacteria Eubacterium sp. (DSM 14197)

Para la cultivación de esta bacteria anaerobia se aprovecha el siguiente medio:

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La cultivación se efectúa en un frasquito de Pyrex con una capacidad de 100 ml, provisto de un diafragma de silicona. 80 ml del medio tratado en autoclave se descargan y se mezclan con un tampón de KH_{2}PO_{4}/Na_{2}HPO_{4} (de
pH 7). Después de la adición del contenido de un criovial del Working Cell Bank, el espacio de cabeza del recipiente se gasea con N_{2} (durante 1 min). Después de haber cerrado el frasquito, éste se incuba a 37ºC durante 72 h.

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Después de esto, 4,5 l de la antes mencionada solución de cultivo se tratan en autoclave en un frasco de Schott con una capacidad de 5 l. Este posee una boca para retirada y 2 bocas con filtros estériles (para el gaseo del inóculo). Después del enfriamiento del medio a 37ºC, se añaden a esto primeramente la solución de tampón (1% del tampón de fosfato) y a continuación los 80 ml del inóculo. Después del gaseo del espacio de cabeza con nitrógeno (durante 5 min.), los orificios se cierran con bridas de manguera y el inóculo se incuba durante 64 h a 37ºC. Después de haber realizado el control de la pureza, éste se puede utilizar como inóculo para un fermentador con una capacidad de 1 m^{3} (volumen de llenado 700 l).

Para la producción se emplea el siguiente medio:

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Después de la esterilización del medio en el depósito de fermentación (durante 40 min., a 121ºC, 1,21 bar) y del enfriamiento de retorno a 37ºC se añade a esto el inóculo. El espacio de cabeza del fermentador se barre con N_{2}. La velocidad del agitador es de 100 rpm, y para la regulación del valor del pH se utiliza una solución de hidróxido de sodio (8 mol/l). El potencial redox está situado al comienzo en aproximadamente -240 mV y disminuye en el transcurso del crecimiento hasta por encima de -500 mV. El período de tiempo de fermentación es de aproximadamente 48 h. El aumento de la concentración se realiza mediante un dispositivo separador de paso.

La subsiguiente estabilización se realiza por medio de una liofilización, de una microencapsulación o de una desecación por atomización. Como agente crioprotector para la liofilización sirve un polvo de suero de leche.

Se añade un 10%, referido al volumen del concentrado. A continuación, el concentrado se congela a -80ºC (durante 10 h) o con nitrógeno líquido (durante 2 h). La liofilización se realiza a una presión de 0,400 mbar, a una temperatura de la superficie útil de 20ºC. La duración es de aproximadamente 30 h en el caso de un grosor de capa de 1,5 cm.

La protección del microorganismo durante el almacenamiento, o respectivamente frente a condiciones desfavorables de vida, se realiza mediante una granulación en capa turbulenta con una grasa vegetal (procedimiento de fusión en caliente [Holtmelt], proyección desde arriba [Top Spray]).

Velocidad de proyección:: aprosimadamente 80-150 g/min

Temperatura del aire de entrada:: 50ºC

Presión de proyección:: 3 bar

Cantidad de aire:: 759-1.500 m^{3}/h

Temperatura del producto:: < 47ºC

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Los parámetros para la desecación por atomización son:

- temperatura de entrada del medio para desecación (gas inerte): 160ºC

- temperatura de salida: 80ºC

- presión: 3 bar

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4. Desintoxicación de ocratoxina A (OTA) mediante productos de bacterias y levaduras de acuerdo con los Ejemplos 1 a 3

De los productos obtenidos en los Ejemplos 1 a 3 se produce una serie logarítmica de diluciones hasta la etapa de 10^{-4} en una solución fisiológica de cloruro de sodio. De las etapas desde 10^{-1} hasta 10^{-4} se añaden con pipeta en cada caso 2 ml en 18 ml de correspondiente medio (medio mínimo (Na_{2}HPO_{4} 2,44 g/l; KH_{2}PO_{4} 1,52 g/1; (NH_{3})_{2}SO_{4}
0,50 mg/l; MgSO_{4} x 7H_{2}O 0,20 g/l, CaCl_{2} x 2H_{2}O 0,05 g/l), un medio de levadura o un caldo nutritivo (Oxoid CM001B)), que se han mezclado con 200 ppb de OTA. Los matraces se incuban en el dispositivo sacudidor horizontal en las correspondientes condiciones. Después de 2,5, 5 y 24 h se sacan muestras y se investigan en cuanto al desdoblamiento de OTA mediante una cromatografía de alto rendimiento. En la etapa de dilución de 10^{-3} (que corresponde a unos números de gérmenes del producto de 10^{5}) las levaduras han desdoblado en el medio mínimo después de 5 h un 90%, y después de 24 h un 100%, de la ocratoxina A.

Si como matriz de ensayo se aprovecha el medio complejo de levadura, entonces los productos, después de 6 h en la etapa de dilución 10^{-2} muestran una tasa de desdoblamiento de 90%. Después de 24 h, la totalidad de la OTA ha sido descontaminada.

Los productos de bacterias han descontaminado en el medio mínimo en la etapa de dilución de 10^{-3} (número de gérmenes de 10^{-6} - 10^{-9}) después de 2,5 h un 40 a 100%, y después de 24 h un 100% de la ocratoxina A. En el caldo nutritivo, la descontaminación transcurre de una manera algo más lenta - en la etapa 3 se ha desintoxicado después de 2,5 h un 40 a 50% y después de 24 h un 80 a 100%. Estos ensayos mostraron que los microorganismos pueden ser transformados en productos estables, que presentan una actividad de desintoxicación tanto en un medio mínimo como también en un medio complejo.

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5. Descomposición de ocratoxinas (OTA) mediante materiales liofilizados en un medio intestinal estimulado Modelo de ensayo A

Con este modelo se investigan materiales liofilizados de las cepas de levaduras DSM 14153, DSM 14154, DSM 15155, DSM 14156 y DSM 14162, así como de las cepas de bacterias aerobias (DSM 14170, DSM 14167, DSM 14168 y DSM 14169) y anaerobias (DSM 14197). Un intestino delgado de cerdo, recibido recientemente del matadero, se corta en trozos con una longitud de aproximadamente 15 cm, los cuales a continuación se añadieron en cada caso a 100 ml de un medio mínimo que contenía OTA [200 ppb]. Las tandas fueron inoculadas finalmente de manera directa con 1 g de un material liofilizado e incubadas a 35ºC. Después de 0, 6, 24 y 48 h se sacaron muestras para un subsiguiente análisis de OTA mediante una HPLC (cromatografía de fase líquida de alto rendimiento) y se conservaron en estado profundamente congelado (a -20ºC) hasta el análisis.

Dentro de las levaduras, los gérmenes DSM 14153, DSM 14156 y DSM 14162 se mostraron como máximamente activos. Ya después de las primeras 6 horas de incubación, se había transformado un 70-90%, un 50-90% o respectivamente un 80-90% de la toxina presente (después de 24 h: un 90-95%). Las dos restantes levaduras ensayadas (DSM 14154, DSM 14155) claudicaban en lo referente a la actividad detrás de las tres cepas mencionadas (descomposición de un 0-20% después de 6 h; de un 30-50% después de 24 h; de un 80% después de 48 h).

En el caso de las bacterias aerobias la mejor era el germen DSM 14168; había reaccionado después de 6 h ya un
50-100% de la toxina presente, y después de 24 h un 80-100%. También el DSM 14169 se manifestó como enteramente "aceptable": se había desintoxicado después de 6 h un 0-90% de la OTA y después de 24 h un 70-95%. Los dos restantes gérmenes presentaban un rendimiento manifiestamente menor (un 0-40% después de 6 h; un 50-60% después de 24 h; y un 60-80% después de 48 h).

El material aislado anaerobio de intestino delgado DSM 14197 degradaba a la micotoxina presente después de 6 horas de incubación en un grado de 0 a 60%; después de 24 h se había convertido entre un 50 y un 100% de la
OTA.

Investigaciones análogas se llevaron a cabo los siguientes gérmenes:

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Este modelo mostró que la OTA en un medio tampón, que contiene un segmento de intestino con el correspondiente medio (sustancias nutritivas y la flora intestinal), puede ser desactivada mediante los productos producidos.

Modelo de ensayo B

Con este modelo se investigaron materiales liofilizados de las cepas de levaduras DSM 14153, DSM 14156 y DSM 14162 así como de las cepas de bacterias DSM 14168 (aerobias), DSM 14169 (aerobias), DSM 14169 (aerobias) y DSM 14197 (anaerobias).

Un intestino delgado de cerdo recibido recientemente del matadero, se cortó en trozos con una longitud de aproximadamente 25 cm, los cuales habían sido unidos en sus extremos mediante un hilo para atadura. 1 g del producto que se había de investigar se pesó e introdujo en un tubito de centrífuga con una capacidad de 50 ml y se volvió a suspender en 20 ml de un medio de ensayo que contenía OTA [200 ppb] (gérmenes aerobios y levaduras \rightarrow medio mínimo; gérmenes anaerobios \rightarrow tampón anaerobio). Partiendo de la suspensión bien mezclada, se produjeron opcionalmente también diluciones de diez veces. La suspensión (o las suspensiones) mezclada(s) se inyectó (inyectaron) en cada caso directamente en un trozo de intestino. Después de haber sacado la muestra nula directamente a partir del trozo de intestino, éste se incubó a 35ºC colgando dentro de un frasco de Pyrex con una capacidad de 250 ml (es decir el hilo para atadura de un extremo fue fijado con el cierre de rosca del frasco). Después de 6, 24 y 48 h se sacaron otras muestras para un subsiguiente análisis de la transformación de la OTA mediante una HPLC.

En el caso de las levaduras (aproximadamente 10^{7} unidades KBE/ml), después de 6 h se registró una descomposición de la OTA de hasta un 90% (DSM 14153). Después de como muy tarde 24 h se pudieron comprobar entonces para todos los productos unas actividades comparablemente altas (80-100%).

También con las diluciones de diez veces y de cien veces de los materiales liofilizados se consiguieron unos resultados comparables. Con las dos bacterias aerobias DSM 14168 y DSM 14169 se obtuvieron unos resultados similares. Se había transformado después de 6 h un 20-60% de la OTA, y después de 24 h un 80-95%. El germen anaerobio DSM 14197 tenía después de 6 h un rendimiento de descomposición comprendido entre 40 y 50%, que pudo ser aumentado hasta un 90% después de 24 h. Unos segmentos de intestinos, que habían sido incubados con la OTA, pero sin productos, no mostraron ninguna actividad de desintoxicación.

Con estos ensayos se demuestra que los microorganismos desintoxicadores de ocratoxinas pueden descomponer a esta toxina también en un medio correspondiente a un intestino. De esta manera, se comprueba inequívocamente en particular la utilización de los microorganismos como aditivos a alimentos o respectivamente a piensos, para la desintoxicación de ocratoxinas.

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6. Desintoxicación de alimentos y piensos

Los microorganismos que desintoxican a ocratoxinas fueron cultivados de una manera correspondiente a los Ejemplos 1 a 3 en las correspondientes condiciones durante aproximadamente 65 h. En cada caso 25 ml de las suspensiones se separaron por centrifugación a 3.200 x g durante 15 min. y se recogieron en un volumen adecuado del medio mínimo, que se había mezclado con 200 ppb de la OTA. La suspensión resultante se aprovechó para la inoculación de 25 g o respectivamente 25 l de un alimento, de polvo de café, de sémola de maíz, de sémola de trigo, de cerveza y de vino. Después de una cuidadosa mezcladura del alimento con la suspensión de microorganismos, se sacó una muestra (= muestra nula). La incubación de las tandas se efectuó durante 9 días a 25ºC. Después de esto, se analizaron 5 g de la muestra en comparación con la muestra nula. Adicionalmente, se incubaron concomitantemente valores a ciegas. Estos fueron provistos de la OTA, pero sin microorganismos. Para el análisis de la ocratoxina en los alimentos líquidos, exactamente 1 ml del alimento liberado de los microorganismos se acidificó con 0,5 ml de ácido fosfórico 1 M y se extrajo con 5 ml de cloruro de metileno. 5 ml del extracto fueron concentrados por desecación bajo nitrógeno. Cada muestra fue tratada dos veces, el residuo, después de la desecación, fue recogido una vez en una mezcla de acetonitrilo, agua y ácido acético (45:54:1) y una vez en una mezcla de tolueno y ácido acético (99:1). Los análisis de las muestras se efectuaron tanto mediante una HPLC como también mediante una TLC (cromatografía de capa fina). En el caso del análisis de la sémola de trigo, se pesaron 5 g de la muestra y se introdujeron en un frasco de Schott con una capacidad de 100 ml y se agitaron por sacudimiento durante una hora a 170 rpm con 20 ml de una mezcla de acetonitrilo y agua (60:40). Después de la separación por filtración, este extracto se analizó directamente mediante una HPLC. El tratamiento para los análisis de OTA procedente de sémola de maíz y de café era algo más costoso. Aquí se pesaron 5 g de la muestra y se introdujeron en un frasco de Schott con una capacidad de 100 ml y se agitaron por sacudimiento durante una hora con 20 ml de una mezcla de acetonitrilo y agua (60:40). Después de la separación por filtración, 4 ml del extracto se mezclaron con 44 ml de un tampón PBS [solución salina tamponada con fosfato] (con 0,1% de Tween 20) y se añadieron a una columna de inmunoafinidad. A continuación, se efectuó el análisis por HPLC. Se determinaron tanto la disminución de la OTA como también la aparición del metabolito OT\alpha. En las muestras de café y maíz no se pudo detectar nada de OT\alpha a causa de la purificación en columna empleada. Se pudieron obtener las siguientes tasas de descomposición

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7. Descomposición de micotoxinas

Los microorganismos fueron cultivados durante aproximadamente 66 h. Después de ello éstos fueron separados por centrifugación (a 3.210 x g, durante 15 min., a la temperatura ambiente) y los sedimentos obtenidos fueron vueltos a suspender en un medio mínimo. Al medio mínimo se le añadieron 1 ppm de desoxinivalenol, 1 ppm de fumonisina B_{1}, 1 ppm de zearalenona, 200 ppb de aflatoxina B_{1} y 2 ppm de citrinina. Antes de que las tandas hubieron sido incubadas a 30ºC se efectuó una toma de muestras ("muestra nula"). La duración de la incubación fue de 96 h. Los tratamientos de las tandas se llevaron a cabo en una doble determinación, investigándose para el análisis por HPLC, una vez el material sobrenadante (después de una centrifugación) y una vez toda la tanda. Para la purificación se añadieron a
15 g del material Extrelut 3 ml de los materiales sobrenadantes o respectivamente 2 ml de la muestra total. Después de 15 min., las muestras se eluyeron con 40 ml de acetato de etilo. En cada caso 7 ml del acetato de etilo se concentraron por desecación y se recogieron en el correspondiente agente eluyente. El análisis de la aflatoxina B_{1} y de la fumonisina B_{1} se efectuó después de una precedente derivatización.

Las muestras tomadas después de 96 h fueron investigadas en comparación con las muestras tomadas al comienzo para determinar la descomposición de las correspondientes toxinas. Para esto se analizaron en los casos de DON, ZON y AFB_{1} tanto los materiales sobrenadantes (separación de la biomasa por centrifugación) como también la muestra total (con biomasa). Los resultados están representados en la Tabla 2.

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A partir de estos ensayos se manifiesta con claridad que algunas micotoxinas, tales como zearalenona (ZON), aflatoxina B_{1} (AFB_{1}) y fumonisina B_{1} (FB_{1}), pueden ser descompuestas, en parte extremadamente bien, con los microorganismos de acuerdo con el presente invento. La citrinina (CIT) pudo ser descompuesta en un 100% solamente con la bacteria Sphingomonas sp. (DSM 14170).

En resumen, se puede retener que con los microorganismos de acuerdo con el presente invento es muy bien posible en particular una descomposición de ocratoxinas en alimentos y piensos y también en un medio intestinal, mostrando sin embargo buenos resultados en parte también una descomposición de zearalenona, citrinina y similares.

Anejo a la solicitud PCT/AT02/00356,

solicitante: Erber Aktiengesellschaft y colaboradores

Lista según la regla 13 bis, párrafo 4 de la ordenanza de realización acerca del convenio de la colaboración internacional en el sector de las patentes.

Todos los microorganismos mencionados en la presente solicitud PCT/AT02/00356 fueron depositados en la DSMZ - Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GbmH (Colección Alemana de Microorganismos y Cultivos Celulares) Mascheroder Weg. 1b, 38123 Braunschweig, Alemania (DE).

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Claims

1. Microorganismo para la desintoxicación biológica de micotoxinas, a saber ocratoxinas y/o zearalenonas, caracterizado porque se emplea, o respectivamente emplean un microorganismo, en particular bacterias o levaduras desintoxicadoras, aerobias o anaerobias, el o las cual(es) desdobla(n) el grupo de fenilalanina de las ocratoxinas, o respectivamente descomponen a zearalenonas, escogiéndose el microorganismo, particularmente las bacterias desintoxicadoras entre Sphingomonas sp. DSM 14170 y DSM 14167, Stenotrophomonas nitritreducens DSM 14168, Stenotrophomonas sp. DSM 14169, Ralstonia eutropha DSM 14171 y Eubacterium sp. DSM 14197 y/o escogiéndose las levaduras desintoxicadoras entre Trichosporon spec. nov. DSM 14153, Cryptococcus sp. DSM 14154, Rhodotorula yarrowii DSM 14155, Trichosporon mucoides DSM 14156 y Trichosporon dulcitum DSM 14162.

2. Microorganismo de acuerdo con la reivindicación 1, caracterizado porque las bacterias y/o levaduras son estabilizadas en particular mediante liofilización, desecación por atomización o microencapsulación.

3. Microorganismo de acuerdo con la reivindicación 1 ó 2, caracterizado porque las bacterias o levaduras se emplean como un extracto exento de células o como un extracto bruto.

4. Microorganismo de acuerdo con la reivindicación 3, caracterizado porque el microorganismo se emplea como un extracto exento de células en una solución, en particular en una solución acuosa.

5. Microorganismo de acuerdo con la reivindicación 3, caracterizado porque el extracto bruto se obtiene a partir de las bacterias y levaduras por medio de ultrasonidos, de una disgregación enzimática, de una combinación de congelación de choque y descongelación, de un homogeneizador de paso, de una prensa French, de una autolisis en el caso de una alta concentración de NaCl y/o de un molino de bolas.

6. Microorganismo de acuerdo con una de las reivindicaciones 1 a 4, caracterizado porque el microorganismo se emplea en una solución tamponada, que contiene un tampón de acetato, citrato, fosfato o hidrocloruro de Tris con unos valores del pH comprendidos entre 1 y 12, en particular entre 2 y 8.

7. Utilización de bacterias, seleccionadas entre: Sphingomonas sp. DSM 14170 y DSM 14167, Stenotrophomonas nitritreducens DSM 14168, Stenotrophomonas sp. DSM 14169, Ralstonia eutropha DSM 14171 y Eubacterium sp. DSM 14197 y/o de levaduras seleccionadas entre: Trichosporon spec. nov. DSM 14153, Cryptococcus sp. DSM 14154, Rhodotorula yarrowii DSM 14155, Trichosporon mucoides DSM 14156 y Trichosporon dulcitum DSM 14162 para la desintoxicación de micotoxinas, a saber ocratoxinas y/o zearalenonas, en alimentos y/o piensos, por separación del grupo de fenilalanina de la ocratoxina o respectivamente por descomposición de la zearalenona.

8. Utilización de acuerdo con la reivindicación 7, caracterizada porque se emplean Trichosporon spec. nov. DSM 14153, Eubacterium sp. DSM 14197 o Stenotrophomonas nitritreducens DSM 14168 para la desintoxicación de micotoxinas, a saber ocratoxinas y/o zearalenonas, en alimentos y/o piensos.

9. Utilización de acuerdo con la reivindicación 7 u 8, caracterizada porque se emplean cultivos mixtos de las bacterias y/o levaduras para la desintoxicación de micotoxinas, a saber ocratoxinas y/o zearalenonas, en alimentos y/o piensos.

10. Procedimiento para la desintoxicación biológica de micotoxinas, a saber ocratoxinas y/o zearalenonas, en alimentos y piensos, con un microorganismo, caracterizado porque un microorganismo de acuerdo con una de las reivindicaciones 1 a 8, se mezcla con los alimentos o respectivamente piensos en una proporción de 0,01% en peso a 1% en peso, en particular de 0,05% en peso a 0,5% en peso.

11. Procedimiento de acuerdo con la reivindicación 10, caracterizado porque el alimento o pienso se trata mediante agitación en una suspensión acuosa del microorganismo, que contiene de 20 a 99% en peso, en particular de 35% en peso a 85% en peso de agua, a unas temperaturas de 10 a 60ºC, en particular de 15 a 45ºC, durante 2 min. hasta 12 h, en particular durante 5 min. hasta 2 h.