ES2303723T3 - Proteina que confiere una resistencia de tipo inducible frente a glicopeptidos, especialmente en bacterias gram-positivas. - Google Patents
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Abstract
LA INVENCION SE REFIERE A UNA PROTEINA VANB IMPLICADA EN BACTERIAS GRAMPOSITIVO, EN UNA RESISTENCIA A GLICOPEPTIDOS, EN PARTICULAR A LA VANCOMICINA, SIENDO ESTA RESISTENCIA DEL TIPO INDUCIBLE POR LA VANCOMICINA Y NO INDUCIBLE POR LA TEICOPLANINA. LA INVENCION SE REFIERE TAMBIEN A LA UTILIZACION DE FRAGMENTOS DE NUCLEOTIDOS DEL GEN VAN B PARA LA DETECCION DE RESISTENCIAS A GLICOPEPTIDOS.
Description
Proteína que confiere una resistencia de tipo
inducible frente a glicopéptidos, especialmente en bacterias
gram-positivas.
La invención se refiere a los polipéptidos
asociados con la expresión de una resistencia frente a antibióticos
de la familia de los glicopéptidos, siendo esta resistencia de tipo
inducible por la vancomicina y no inducible por la teicoplanina,
especialmente en bacterias gram-positivas, en
particular de la familia de los cocos
gram-positivos. La invención tiene por objetivo
igualmente una secuencia nucleotídica que codifica para estos
polipéptidos. También se refiere al uso de estos polipéptidos y de
su secuencia nucleotídica en cuando a medios de detección in
vitro de una resistencia frente a glicopéptidos. Entre los cocos
gram-positivos, la invención tiene por objetivo
particularmente los enterococos, los estreptococos y los
estafilococos.
Los glicopéptidos, entre los cuales están la
vancomicina y la teicoplanina, son antibióticos inhibidores de la
síntesis de la pared bacteriana. Estos antibióticos se utilizan
mucho para el tratamiento de las infecciones graves debidas a cocos
gram-positivos (enterococos, estreptococos y
estafilococos), en particular en los casos de alergia y de
resistencia a las penicilinas.
Hasta 1986, la vancomicina ha resultado ser
eficaz contra casi la totalidad de las cepas de enterococos.
La actividad de los glicopéptidos depende de la
formación de un complejo entre el antibiótico y los precursores del
peptidoglucano, más que de la interacción directa con enzimas del
metabolismo de la pared celular. En particular se ha constatado que
los glicopéptidos se fijan a los residuos terminales
D-alanil-D-alanina
(D-ala-D-ala) de los
precursores del peptidoglucano.
Se han puesto en evidencia varios fenotipos de
resistencia a los glicopéptidos; se han distinguido especialmente
cepas resistentes a un alto nivel de glicopéptidos y las cepas
resistentes a un bajo nivel de concentración.
Por cepa resistente a un alto nivel, se entiende
una cepa de bacterias, en particular una cepa de cocos
gram-positivos para la cual las concentraciones
mínimas inhibidoras (CMI) de vancomicina y de teicoplanina son
respectivamente superiores a 32 y 8 \mug/ml. Las CMI de la
vancomicina frente a cepas resistentes a bajo nivel están
comprendidas entre 8 y 32 \mug/ml. El fenotipo VanB se
caracteriza por una resistencia inducible por la vancomicina, pero
no inducible por la teicoplanina. Una vez inducida, esta resistencia
puede existir frente a diferentes glicopéptidos, en particular
frente a la vancomicina y/o la teicoplanina, y ello a niveles
variables.
Las cepas de enterococos que responden al
fenotipo VanB (clase B) son especialmente cepas de E.
faecalis y E. faecium.
Al-Obeid S. et al (FEMS
Microbiology Letters 70 (1990) 101-106) compararon
así las proteínas de resistencia frente a glicopéptidos, inducibles
por la vancomicina, en cuatro cepas de enterococos, y dedujeron de
su comparación la existencia de tres tipos de proteínas, estando
uno de estos tipos presente en la cepa E. faecium resistente
a bajo nivel de vancomicina. Según los autores de esta publicación,
se induce una proteína de peso molecular de aproximadamente 39,5
kDa en las cepas a bajo nivel de resistencia y esta resistencia está
unida a una inducción por la vancomicina. Estas cepas presentan
también una resistencia frente a la teicoplanina, igualmente
inducida por la vancomicina.
Según Al-Obeid et al,
esta proteína de 39,5 kDa está presente en múltiples formas pero no
se ha estudiado la naturaleza de esta multiplicidad. Según estos
autores, puede existir una especificidad de estructura en función de
las especies afectadas de bacterias y del nivel de resistencia, lo
que es necesario confirmar.
En esta publicación, Al-Obeid
et al describieron 11 aminoácidos de la secuencia
N-terminal de esta proteína de 39,5 kDa y
observaron que esta secuencia comprendía aproximadamente el 70% de
homología con numerosas proteínas de membrana de origen procariota
o eucariota, que tienen diversas funciones. Esta comparación no
permitía según los autores establecer la función eventual de la
proteína. Finalmente, Al-Obeid et al
constataron que se inducen otras proteínas, no obstante en un menor
grado.
La invención se refiere a péptidos, polipéptidos
o proteínas implicados en la expresión de una resistencia frente a
antibióticos de la familia de los glicopéptidos y especialmente
frente a la vancomicina y/o la teicoplanina, así como a las
secuencias nucleotídicas que codifican para tales polipéptidos. La
resistencia de la que se trató anteriormente es del tipo inducible
por la vancomicina y no por la teicoplanina.
Las expresiones "implicado en la expresión de
una resistencia" o "implicado en una resistencia" significan
que la proteína de la invención es necesaria para que se manifieste
la resistencia.
La invención tiene por objetivo igualmente
sondas nucleotídicas utilizables para la detección de una
resistencia frente a los glicopéptidos, especialmente mediante la
reacción de polimerización en cadena (PCR), o mediante pruebas que
hacen intervenir anticuerpos.
\newpage
La invención tiene por tanto por objeto una
proteína VanB caracterizada porque comprende la secuencia de
aminoácidos siguiente I, y porque participa en la resistencia
frente a glicopéptidos, en particular frente a la vancomicina,
siendo esta resistencia de tipo inducible por la vancomicina y no
por la teicoplanina, en bacterias
gram-positivas.
Por la expresión "resistencia inducible" se
entiende la capacidad para una bacteria
gram-positiva determinada, en particular para una
cepa de enterococos determinada, de producir una proteína VanB en
presencia de una concentración de 0,05 a 1 \mul/ml de
vancomicina.
La resistencia frente a uno o varios
glicopéptidos determinados puede traducirse en la persistencia de
una infección debida a gérmenes habitualmente sensibles a los
glicopéptidos, o puede detectarse por medio de un antibiograma
(sobretodo para los altos niveles de resistencia), de la CMI, de la
hibridación con sondas (tras amplificación por ejemplo mediante
PCR).
Según un primer modo particular de realización
de la invención, la proteína VanB se caracteriza porque está
implicada en una resistencia de tipo inducible frente a
glicopéptidos y en particular frente a la vancomicina, en
enterococos y por ejemplo en cepas del género E. faecium o
E. faecalis.
La invención se refiere igualmente a una
proteína VanB caracterizada porque comprende una secuencia de
aminoácidos modificada con respecto a la secuencia I, por deleción,
inserción o sustitución de uno o varios aminoácidos, ya que la
proteína VanB así modificada está implicada en bacterias
gram-positivas, en una resistencia frente a
glicopéptidos, en particular frente a la vancomicina, siendo esta
resistencia de tipo inducible por la vancomicina, y no inducible por
la teicoplanina.
Entra igualmente en el marco de la invención,
todo fragmento peptídico de la proteína VanB caracterizado porque
corresponde a la secuencia de aminoácidos I o a cualquier parte de
esta secuencia funcionalmente asociada con la resistencia de tipo
inducible frente a glicopéptidos, en particular frente a la
vancomicina, en bacterias gram-positivas, por
ejemplo bacterias de la familia de los enterococos.
Ventajosamente, los fragmentos peptídicos de la
invención presentan además, o alternativamente, propiedades
antigénicas y por tanto se reconocen por anticuerpos formados contra
la proteína VanB.
Un fragmento particular de la secuencia I
corresponde por ejemplo a la secuencia siguiente, o comprende esta
secuencia:
Según otro modo de realización de la invención,
estos antígenos son específicos de la proteína VanB y por tanto no
se reconocen por anticuerpos que reconocen a las proteínas VanA y
VanC tal como se describieron en la solicitud de patente EP
91920753.
La invención se refiere además a una secuencia
de nucleótidos caracterizada porque codifica para una proteína VanB
implicada en bacterias gram-positivas, en una
resistencia frente a glicopéptidos, en particular frente a la
vancomicina, siendo esta resistencia de tipo inducible por la
vancomicina y no inducible por la teicoplanina, comprendiendo dicha
proteína VanB la secuencia de aminoácidos I, o porque se trata de
una secuencia de ADN complementaria a esta secuencia codificante, o
una secuencia de ARN correspondiente.
Por secuencia complementaria se entiende
cualquier secuencia de ADN cuyos nucleótidos son complementarios a
los de la secuencia I, y cuya orientación está invertida.
Una secuencia nucleotídica particular que
responde a esta definición se caracteriza porque comprende la cadena
de nucleótidos II siguiente o un cadena nucleotídica modificada con
respecto a II, ya que codifica para una proteína implicada en
bacterias gram-positivas, en una resistencia frente
a glicopéptidos, en particular frente a la vancomicina, siendo esta
resistencia de tipo inducible por la vancomicina y no inducible por
la teicoplanina.
De manera general la invención tiene igualmente
por objeto un fragmento nucleotídico caracterizado porque puede
hibridarse en condiciones rigurosas con una secuencia tal como se
definió en la cadena II anterior.
Las condiciones rigurosas son las
siguientes:
* temperatura de la reacción de 65ºC durante una
noche en una disolución que contiene el 0,1% de SDS, el 0,7% de
leche en polvo desnatada, 6 x SSC (1 x SSC = NaCl 0,15 M y citrato
de sodio 0,015 M a pH = 7,0)
* lavados a temperatura ambiente en 2 x SSC -
SDS al 0,1% y después a 65ºC en 0,2 SSC - SDS al 0,1%.
\vskip1.000000\baselineskip
Ventajosamente, un fragmento nucleotídico que
responde a la definición anterior tendrá al menos 15 nucleótidos,
preferiblemente al menos 20.
\newpage
Una secuencia nucleotídica particular comprende
con respecto a esto la cadena siguiente:
Los péptidos y polipéptidos de la invención
permiten definir una clase genotípica, caracterizada por la
capacidad de las secuencias nucleotídicas que codifican para estos
péptidos, de hibridarse en condiciones rigurosas con la secuencia II
que constituye una sonda.
Estos fragmentos pueden ponerse en práctica como
cebadores para la realización de reacciones de amplificación, o como
sondas.
Cebadores particularmente interesantes responden
a las secuencias siguientes:
- cebador 1: 5' ATGGGAAGCCGATAGTC 3' (posiciones
241-258 de los nucleótidos de la secuencia I)
- cebador 2: 5' GATTTCGTTCCTCGACC 3' (secuencia
inversa-complementaria del fragmento de los
nucleótidos 860 a 877 de la secuencia I).
Las sondas nucleotídicas según la invención
pueden ser específicas para detectar en bacterias
gram-positivas secuencias que codifican para una
proteína VanB implicada en la resistencia frente a glicopéptidos
especialmente frente a la vancomicina y/o la teicoplanina, siendo
esta resistencia inducible según la definición anterior, pudiendo
además estas sondas ser universales entre estas secuencias.
Por sondas específicas de vanB, se entiende
cualquier oligonucleótido que se hibrida con una secuencia
nucleotídica que codifica para una proteína VanB según la
invención, tal como se describió en las páginas anteriores, y que
no presenta reacción de hibridación cruzada ni de amplificación
(PCR) con secuencias presentes en el conjunto de las cepas
sensibles.
Un fragmento nucleotídico particular según la
invención se caracteriza porque no se hibrida en condiciones
rigurosas con el ADN de cepas de enterococos sensibles a la
vancomicina, en particular con el ADN de las cepas E.
faecalis JH2-2 y E. faecium BM4107.
Estas cepas de referencia se describieron
respectivamente por Jacobs y Hobbs (J. Bacteriol. 117, 1974,
360-372) y Leclercq et al (Antimicrob.
Agentes Chemother 33, 1989).
Otro fragmento nucleotídico interesante en el
marco de la invención, es específico del gen vanB, en cuanto a que
no se hibrida en condiciones rigurosas con los genes vanA y vanC tal
como se describen en la solicitud PCT 91920753.
Un fragmento nucleotídico particularmente
interesante en el marco de la invención, es el fragmento que
responde a la secuencia II.
Este fragmento es un fragmento interno
procedente del gen implicado en la resistencia frente a cepas de
enterococos. La resistencia puede existir a niveles variables de
concentración de glicopéptidos.
La invención también se refiere a fragmentos de
nucleótidos modificados con respecto a los anteriores, mediante
mutación, adición o deleción de nucleótidos, siempre que el
fragmento así modificado o bien codifique para un fragmento de la
proteína VanB funcional que se trata de su asociación a la
resistencia frente a glicopéptidos, en particular frente a la
vancomicina, en las condiciones descritas anteriormente, o bien se
hibride con el gen vanB.
En el caso hipotético de un uso de los
fragmentos nucleotídicos como sondas, se realizará un marcado,
mediante técnicas clásicas. A título de ejemplo, se utilizarán
marcadores radiactivos o enzimáticos.
\global\parskip0.900000\baselineskip
Pueden ponerse en práctica fragmentos de
nucleótidos según la invención como cebadores, para realizar la
amplificación, por ejemplo mediante PCR, del ácido nucleico
contenido en una muestra biológica dada.
La invención tiene además por objetivo una
secuencia de ADN recombinante, caracterizada porque comprende una
secuencia de nucleótidos descrita anteriormente, bajo el control de
elementos de regulación susceptibles de intervenir en la clonación
o la expresión de un gen implicado en una resistencia de tipo
inducible por la vancomicina y no inducible por la teicoplanina,
frente a antibióticos de la familia de los glicopéptidos,
especialmente la vancomicina, en un huésped determinado.
Este gen implicado en la resistencia es por
ejemplo el gen vanB que comprende la secuencia de nucleótidos II o
cualquier parte funcional en cuanto a resistencia inducible,
procedente de una secuencia que se hibrida con la secuencia II.
La invención también se refiere a un vector
recombinante para la clonación o la expresión, caracterizado porque
comprende una secuencia nucleotídica descrita anteriormente en un
sitio no esencial para su replicación, según el caso bajo el
control de elementos de regulación susceptibles de intervenir en la
expresión de una resistencia de tipo inducible por la vancomicina y
no inducible por la teicoplanina, frente a antibióticos de la
familia de los glicopéptidos, especialmente la vancomicina, en un
huésped determinado.
Vectores particulares son por ejemplo plásmidos,
fagos, cósmidos, YAC.
Un vector preferido es el plásmido pAT201,
depositado en la C.N.C.M. el 11 de diciembre de 1992 con el número
I-1277.
Otro vector preferido es el plásmido pAT202
formado a partir del plásmido pUC19\Omega que contiene un
fragmento de 3,3 kb que contiene el gen vanB de Enterococcus
faecalis V583 (HindIII/KpnI).
Se introdujo pAT202 en E. coli JM83 y se
depositó en la CNCM el 29 de marzo de 1993, con el número
I-1291 (identificación E. coli BM2973).
Estos vectores pueden utilizarse para
transformar o transfectar huéspedes celulares con el fin de clonar o
expresar las secuencias nucleotídicas de la invención.
Un huésped celular recombinante según la
invención se caracteriza porque está modificado por una secuencia
nucleotídica o un vector descritos anteriormente.
Preferiblemente el huésped celular está
modificado por esta secuencia en condiciones que permiten la
expresión de una proteína VanB funcional que se trata de la
resistencia inducible frente a glicopéptidos.
La invención tiene también por objeto una
proteína VanB recombinante tal como se obtiene a partir de un
huésped celular recombinante según la definición anterior,
caracterizándose la proteína VanB obtenida porque su esqueleto
peptídico comprende la secuencia de aminoácidos anterior, y porque
está implicada en bacterias gram-positivas, en una
resistencia frente a glicopéptidos, en particular frente a la
vancomicina, siendo esta resistencia de tipo inducible por la
vancomicina y no inducible por la teicoplanina.
La proteína VanB según la invención permite
preparar anticuerpos monoclonales o policlonales caracterizados
porque reconocen específicamente la proteína VanB o un fragmento
peptídico descrito anteriormente.
Estos anticuerpos pueden obtenerse según los
métodos clásicos de producción de anticuerpos. En particular para
la preparación de los anticuerpos monoclonales se recurrirá al
método de Kohler y Milstein según el cual se preparan anticuerpos
monoclonales mediante fusión celular entre células de mieloma y
células esplénicas de ratón previamente inmunizadas con un
polipéptido o una composición según la invención, según el
procedimiento clásico.
Los anticuerpos de la invención son
ventajosamente utilizables para la detección de la presencia de
proteínas características de una resistencia frente a los
glicopéptidos, en particular frente a la vancomicina y frente a la
teicoplanina, siendo esta resistencia del tipo inducible por la
vancomicina y no inducible por la teicoplanina.
Entra igualmente en el marco de la invención, un
kit para el diagnóstico in vitro en un muestra biológica, de
la presencia de cepas resistentes a glicopéptidos tras la inducción
especialmente por la vancomicina y no por la teicoplanina,
perteneciendo estas cepas en particular a los cocos
gram-positivos, especialmente porque se trata de
cepas de enterococos, por ejemplo E. faecium, caracterizado
porque comprende:
- anticuerpos descritos anteriormente, según el
caso marcados,
- un reactivo para la detección de una reacción
inmunológica del tipo anticuerpo-antígeno,
- según el caso reactivos para realizar la lisis
de las células de la muestra sometida a prueba,
- según el caso una concentración determinada de
vancomicina, para inducir la resistencia.
\global\parskip1.000000\baselineskip
La invención también se refiere a un kit tal
como se definió anteriormente, que comprende además anticuerpos
dirigidos específicamente contra la proteína VanA y/o anticuerpos
dirigidos específicamente contra la proteína VanC.
Según otro modo de realización de la invención,
el kit permite indiferentemente la detección de una resistencia que
corresponde a un fenotipo VanA, VanB o VanC, y comprende anticuerpos
que reconocen VanA, VanB y VanC. Estos anticuerpos pueden
seleccionarse por su capacidad para reconocer un epítopo común a las
tres proteínas. Puede tratarse igualmente de una mezcla de
anticuerpos que reconocen epítopos diferentes, propios a cada una de
las proteínas.
Según otro modo de realización de la invención,
un kit para el diagnóstico in vitro de la presencia de cepas
resistentes a bajo nivel, frente a glicopéptidos, en particular
resistentes a la vancomicina, se caracteriza porque comprende:
- una sonda nucleotídica que puede hibridarse en
condiciones rigurosas con una secuencia nucleotídica del gen vanB, y
según el caso,
- nucleósido trifosfatos dATP, dCTP, dTTP,
dGTP,
- un agente de polimerización de ADN.
Otro kit de detección comprende además una sonda
de nucleótidos que puede hibridarse específicamente con el gen vanA
y una sonda que puede hibridarse específicamente con el gen
vanC.
Este kit puede utilizarse ventajosamente para la
detección de una resistencia en cocos gram-positivos
especialmente en enterococos, por ejemplo en E. faecium.
La invención tiene también por objetivo un kit
para la detección in vitro de una resistencia frente a
glicoproteínas, especialmente frente a la vancomicina,
correspondiendo esta resistencia a uno de los fenotipos VanA, VanB o
VanC, comprendiendo el kit
- una sonda nucleotídica que se hibrida con los
genes vanA, vanB y vanC,
- nucleósido trifosfatos dATP, dCTP, dTTP y
dGTP,
- un agente de polimerización de ADN.
La invención tiene también por objetivo un
procedimiento de detección in vitro de la presencia de cepas
resistentes a glicopéptidos, en particular a la vancomicina y/o a la
teicoplanina, perteneciendo estas cepas en particular a la familia
de cocos gram-positivos, especialmente porque se
trata de cepas de enterococos, por ejemplo E. faecium o E.
faecalis, caracterizado porque comprende:
a) poner en contacto una muestra biológica
susceptible de contener las cepas resistentes, con un cebador
constituido por un fragmento nucleotídico según la invención, tal
como se describió anteriormente, que puede hibridarse con una
secuencia nucleotídica buscada, implicada en la expresión de la
resistencia, utilizándose esta secuencia como matriz, en presencia
de los 4 nucleósidos trifosfatos diferentes, y de un agente de
polimerización, en condiciones de hibridación tales que para cada
secuencia nucleotídica que se haya hibridado con un cebador, se
sintetiza un producto de elongación de cada cebador complementario
de la matriz,
b) separar la matriz y el producto de elongación
obtenido, pudiendo comportarse entonces igualmente éste último como
una matriz,
c) repetir la etapa a) de manera que se obtiene
una cantidad detectable de las secuencias nucleotídicas
buscadas,
d) detectar el producto de amplificación de las
secuencias nucleotídicas.
Por tanto, la sonda utilizada puede ser
específica de la secuencia nucleotídica II o de una secuencia que
se hibrida en condiciones rigurosas con la secuencia II. En estas
condiciones, el procedimiento según la invención permite la
detección de una resistencia frente a glicopéptidos, siendo esta
resistencia inducible por la vancomicina y no inducible por la
teicoplanina.
Según un modo de realización particular de la
invención, este procedimiento comprende igualmente poner en
contacto la muestra biológica con un fragmento nucleotídico
específico del gen vanA y/o un fragmento nucleotídico específico
del gen vanC. En este caso el procedimiento según la invención
permite ventajosamente la detección de diferentes fenotipos de
resistencia.
Según otro modo de realización, se detectará
indiferentemente una resistencia correspondiente a un fenotipo
VanA, VanB o VanC, utilizando una sonda común a los genes vanA, vanB
o vanC. Puede realizarse una sonda de este tipo a partir de las
secuencias polipeptídicas alineadas de la figura 2.
Otras características y ventajas de la invención
aparecerán en los ejemplos y las figuras siguientes:
Figura
1
Secuencia de nucleótidos y de aminoácidos
correspondiente al gen vanB. La secuencia de nucleótidos de las dos
cadenas se determinó a partir del inserto contenido en pUC18,
mediante el método didesoxi de terminación de cadena (Sanger et
al, 1977, Proc. Natl. Acad. Sci. USA,
74:5463-5467) utilizando la ADN polimerasa de T7. La
secuencia subrayada RBS representa la secuencia
Shine-Dalgarno de unión al ribosoma.
\vskip1.000000\baselineskip
Figura
2
Alineación de la secuencia de aminoácidos
deducida de la proteína VanB y de las regiones correspondientes de
VanA, VanC, DdLA y DdLB de E. coli
(Dutka-Malen et al, 1992 Gene,
112:53-58), Ddl de En. faecalis V583 y DdlA
de S. typhimurium (Daub et al - Biochemistry 27, 1988,
3701-3708). Los aminoácidos idénticos (I) y las
substituciones conservadoras (C) en las 7 secuencias se indicaron
bajo la alineación. Para que se conserve la clasificación en cuando
a la substitución, se reagruparon los aminoácidos tal como sigue:
RK, LFPMVI, STQNC, AGW, H, ED e Y. Los dominios 1, 2, 3 y 4
corresponden a regiones de fuerte homología.
\vskip1.000000\baselineskip
Figura
3
Oligonucleótidos V1 y V2 utilizados para
amplificar el ADN del gen vanB.
\vskip1.000000\baselineskip
Figura
4
Secuencia de nucleótidos del gen ddl de En.
faecalis V583 y secuencia de aminoácidos correspondiente. Se
construyó el plásmido pAT203 subclonando el ADN de un
bacteriófago-\lambda recombinante parcialmente
digerido con Sau3AI (Pharmacia), en pUC19 digerido con BamHI
(Pharmacia). El inserto de 15 kb de pAT203 comprende el gen ddl. La
secuencia de nucleótidos de 1079 pb consecutiva a pAT203 se
determinó en las dos cadenas mediante el método didesoxi de
terminación de la cadena. El primer par de bases de la secuencia se
define en la posición 1. La secuencia de unión al ribosoma RBS está
en la posición 19 en sentido 5' del codón de iniciación TTG. Se
indica el codón de parada TTA. Se presenta la secuencia de
aminoácidos deducida de la proteína Ddl.
\vskip1.000000\baselineskip
Los antibióticos de la familia de los
glicopéptidos, tales como la vancomicina (Vm) y la teicoplanina (Te)
se fijan a los residuos D-Ala
C-terminales de los precursores del peptidoglucano,
bloqueando así su incorporación en la pared celular bacteriana
(Reynolds, P.E. 1989 Eur. J. Clin. Microbiol. Infect. Dis.
8:943-950). Los residuos D-Ala se
incorporan en los precursores a nivel de la pared celular, en forma
de dipéptidos sintetizados por ligasas
D-Ala:D-Ala (DDL) (Walsh, C.T. 1989
J. Biol. Chem. 264:2393-2396). La ligasa VanA
sintetiza el dipéptido D-Ala-Dlac
que sustituye a
D-Ala-D-Ala lo que
conduce a la síntesis de precursores que se unen la vancomicina con
una afinidad reducida (Bugg et al, Biochemistry
30:10408-10415 (1991), Handwerger et al, J.
Bacteriol. 174:5982-5984 (1992), Messer y Reynolds,
FEMS Microbiol. Letters 94:195-200 (1992)).
La resistencia frente a los glicopéptidos en los
enterococos es heterogénea (Dutka-Malen et
al, 1990 Antimicrobiol Agents Chemother
34:1875-1879).
Las proteínas de resistencia VanA y VanC (véase
la solicitud de patente EP 91920753.0 del 29 de octubre de 1991)
muestran una homología del 30 al 37% (los detalles se facilitan en
la tabla III) en los aminoácidos con las D-Ala:DAla
ligasas (Ala = alanina) de E. coli
(Dutka-Malen et al, 1992 Gene
112:53-58). Los genes de estructura para las
proteínas VanA y VanC no se hibridan con el ADN de las cepas de
fenotipo VanB (Dutka-Malen et al, 1990,
Leclercq et al, Antimicrob. Agents Chemother
36:2005-2008 (1992)).
Los inventores han logrado identificar la
secuencia nucleotídica implicada en las propiedades de resistencia
frente a la vancomicina de cepas de enterococos que tienen el
fenotipo VanB y que resisten, tras la inducción con la
vancomicina.
Cepas bacterianas: se estudiaron 39
aislados de E. faecium (28 cepas) y E. faecalis (11
cepas) resistentes a de bajas o fuertes concentraciones de
vancomicina y sensibles a la teicoplanina (tabla II). Entre estas
cepas, 24 aislados entre ellos E. faecalis V583 (Sahm D.
et al, Antimicrob. Agents Chemother. 1989,
33:1588-91) y E. faecium D366 (Gutmann L.
et al, Antimicrob. Agents Chemother 1992,
36:77-80) eran resistentes a bajas concentraciones
de vancomicina basándose en una prueba de sensibilidad sobre placa.
Estas cepas pertenecen al fenotipo de clase B. También se
estudiaron 15 aislados resistentes a fuertes concentraciones de
vancomicina (CIM \geq 128 \mug/ml) entre ellos la cepa
V583-2 de E. faecalis (Zarlenga LJ. et
al, Antimicrob. Agents Chemother. 1992,
36:902-5), que es un mutante espontáneo de V553, así
como UMH-1 (Schwalbe R. et al, Abstract
A-117, en los resúmenes del 91ª reunión general de
la Sociedad Americana de Microbiología. Dallas, TX: American
Society for Microbiology, 1991). Las cepas control eran cepas de
enterococos bien caracterizadas que pertenecen a los fenotipos A y
C y se hibridan con las sondas VanA y VanC respectivamente. Se
trata en particular de 6 aislados clínicos de E. faecium
altamente resistentes a la vancomicina y a la teicoplanina,
incluyendo BM4147. Se utilizaron igualmente cepas de E.
gallinarum incluyendo BM4174 que pertenecen a la clase C como
control. Igualmente hacen parte de los controles las cepas de E.
casseliflavus, entre ellas la cepa ATCC 25788, que son aislados
intrínsecamente resistentes a bajos niveles de vancomicina y
sensibles a la teicoplanina (Leclercq R. et al, Antimicrob.
Agents Chemother. 1992, 36:2005-8).
Se estudiaron igualmente las siguientes cepas:
Erysipelothrix rhusiopathiae A 124 (Institut Pasteur
Collection), Lactobacillus brevis ATCC 14869,
Lactobacillus casei ATCC 393, Lactobacillus confusus
ATCC 10881, Lactobacillus fermentum ATCC 9338,
Lactobacillus plantarum ATCC 8014, Lactobacillus
reuteri ATCC 23272, Lactobacillus rhamnosus ATCC 7469,
Lactobacillus salivarius ATCC 11741, Pediococcus
acidilacti ATCC 8042, Pediococcus pentosaceus ATCC
33316, y Leuconostoc mesenteroides CIP 16407. Los siguientes
enterococos sensibles a antibióticos de la familia de los
glicopéptidos se utilizan como controles negativos: E.
durans ATCC 19432, E. faecium ATCC 19434, BM4107
(Leclercq R. et al, Antimicrob. Agents Chemother. 1992,
36:2005-8), y MT10R (GutmannL et al,
Antimicrob. Agents Chemother, 1992, 36:77-80), cepa
sensible a la vancomicina derivada de D366; E. faecalis ATCC
29212, ATCC 33186, JH2-2 (Leclercq R. et al,
Antimicrob. Agents Chemother. 1992, 36:2005-8), y
V583-C1, cepa sensible a la vancomicina derivada de
V583, (tabla II), y un aislado clínico de E. faecium y E.
faecalis. En la tabla I se describen características de cepas
de referencia. Se utilizaron E. faecium BM4107 y E.
faecalis JH2-2, a la vez resistentes a la
rifampicina y al ácido fusídico (Leclercq R. et al,
Antimicrob. Agents Chemother. 1992, 36:2005-8), como
cepas receptoras para experimentos de conjugación.
\vskip1.000000\baselineskip
Se identificaron los enterococos mediante el
método de Facklam y Collins, J. Clin. Microbiol. 1989,
27:731-4). La identificación de las especies se
basaba en las pruebas de reducción del telurito de potasio y de
producción de ácidos a partir de hidratos de carbono sobre bandas
de estreptococos API 20 (bioMérieux, Marcy l'Etoile, Francia). Se
utilizaron las pruebas de movilidad a 30ºC y de fermentación de los
hidratos de carbono para distinguir E. gallinarum y E.
casseliflavus de E. faecium y E. faecalis. Se
distinguieron las cepas de E. casseliflavus de las cepas de
E. gallinarum basándose en la producción de un pigmento
amarillo sobre el agar.
\vskip1.000000\baselineskip
Se utilizaron medios de
corazón-cerebro y agar (Difco Laboratoires, Detroit,
MI). Se realizaron pruebas de sensibilidad sobre el agar
Mueller-Hinton (Diagnostics Pasteur, Marne La
Coquette, Francia). Todas las incubaciones se realizaron a 37ºC.
\vskip1.000000\baselineskip
Se utilizó la prueba de difusión sobre placa con
placas que contenían 30 \mug de vancomicina o 30 \mug de
teicoplanina (Diagnostics Pasteur) para el cribado inicial. Se
utilizó el método de Steers et al con 10^{4} UFC por
mancha para determinar la CMI de los antibióticos (Steers E. et
al, Antibiot. Chemother. (Basel) 1959,
9:307-11).
\vskip1.000000\baselineskip
Se realizó la conjugación sobre filtros según la
técnica descrita por Dutka-Malen S. et al,
Antimicrob. Agents Chemother. 1990, 34:1875-9. Las
concentraciones en antibióticos para la selección de los
transconjugados eran las siguientes: rifampicina: 20 \mug/ml;
ácido fusídico: 10 \mug/ml y vancomicina: 4 y 8 \mug/ml.
\vskip1.000000\baselineskip
Se obtuvo la lisozima de Sigma Chemical Co. (St
Louis, MO). Se obtuvieron la ARNasa A (páncreas bovino) y la
proteinasa K de Calbiochem. Co. (San Diego, CA). Se obtuvieron el
[\alpha-^{32}P]dCTP y la sal de
trietilamonio (actividad específica de 3000 CI/mmol) de
Radiochemical Center, Amersham, Gran Bretaña. La teicoplanina
procede de Gruppo Lepetit (Milán, Italia) y la vancomicina procede
de Eli Lilly & Co (Indianápolis, IN).
Los oligonucleótidos V1 y V2 descritos en la
solicitud de patente EP 91920753.0, permitieron la amplificación
mediante la técnica de PCR, de fragmentos internos a los genes que
codifican para las proteínas VanA, VanC y
D-Ala:D-Ala ligasas
(Dutka-Malen et al, 1992 Gene
112:53-58).
Se realizó la amplificación del gen vanB con los
oligonucleótidos V1 y V2 y el ADN (20 ng) de Enterococcus
faecalis V583 (Sahm et al, 1989 Antimicrob. Agents
Chemother 33:1588-1591).
Para realizar esta amplificación, se utilizó la
técnica descrita en la publicación de Dutka-Malen
et al., 1992. Se separaron los fragmentos obtenidos sobre
gel de agarosa (1%) en un tampón TAE, lo que permitió revelar una
banda única de aproximadamente 600 pb, que se extrajo del gel
utilizando un kit de purificación del ADN (GeneClean, Bio101 Inc.,
la Jolla, CA). Utilizando un kit que permite la obtención de
extremos romos a nivel del ADN (Amersham, Amersham, Gran Bretaña),
se trataron los fragmentos con la ADN polimerasa de T4 y ligamientos
a nivel del sitio SmaI de un plásmido pUC18 digerido y
desfosforilado (Norrander et al, 1983, Gene
26:101-106).
Se determinó la secuencia de 632 pb (sonda vanB)
correspondiente al inserto del plásmido recombinante (figura 1)
mediante el método didesoxi de terminación de la cadena (Sanger
et al, 1977, Proc. Natl. Acad. Sci. USA,
74:5463-5467) utilizando la ADN polimerasa de T7
(Pharmacia, Uppsala, Suecia) y el
[\alpha-^{35}S]dATP (Amersham,
Radiochemical center, Amersham, Gran Bretaña).
Teniendo en cuenta que la amplificación con la
ADN polimerasa de Taq puede conducir a incorporaciones erróneas de
nucleótidos, se confirmó la secuencia tal como sigue: se sintetizó
un oligonucleótido complementario a las posiciones 513 a 530 de la
secuencia nucleotídica de la figura 1 mediante el método con
fosforamidita (unidad de química orgánica, Institut Pasteur,
Francia) y se utilizó con el cebador V1 para realizar una
amplificación mediante PCR de un fragmento de vanB. Se secuenció el
producto PCR directamente (Mabilat et al, 1990, Plasmid
23:27-34) o después de la clonación en un vector
pUC18, con el fin de revelar la identidad de los nucleótidos con el
fragmento del clon obtenido con V1 y V2.
Se realizó una hibridación de tipo Southern
según el método de Johnson et al, Gene Anal. Téchnol. 1:
3-8 (1984). Se preparó el ADN total de cepas de
enterococos (tabla 1) según la técnica descrita por Le Bouguénec
et al, 1990, J. Bacteriol. 172:727-734, se
digirió con las enzimas HindIII y KpnI (Estados Unidos, Biochemical
Corporation, Cleveland, Ohio) y se resolvió sobre geles de agarosa
al 1%. Se transfirió el ADN sobre membranas de nylon (Nytran,
Schleicher & Schuell, Dassel, Alemania) con un aparato de
transferencia a vacío (Trans. Vac. TE80, Hoefer Scientific
Instruments, San Francisco, CA). Se obtuvo la sonda marcando el
fragmento de PCR clonado con un kit de traslado de mellas (Bethesda
Research Laboratories Life Technologies Inc., Gaithersburg, MD) y
(\alpha-^{32}P)dCTP (Amersham,
Radiochemical Center, Amersham, Gran Bretaña). Se realizó la
hibridación en condiciones rigurosas a 68ºC (Johnson et al,
1984, Gene Anal. Technol. 1:3-8). Se lavaron las
membranas a 65ºC en un 0,1% de SDS-2 X SSC.
La sonda vanA consistía en un fragmento de PstI
de 265 pb interno al gen vanA (Dukta Malen S. et al, Mol.
Gen. Genet. 1990, 224:364-72). La sonda vanC
consistía en un fragmento de EcoRI-HincII de 690 pb,
interno al gen vanC (Leclercq R. et al, Antimicroh. Agents
Chemother 1992, 36:2005-8. Dukta Malen S. et
al Gene, 1992, 112:53-8). La sonda vanB
corresponde a la secuencia II.
Se comparó la secuencia de aminoácidos deducida
del inserto contenido en el plásmido pUC18 con diferentes
secuencias de proteínas [figura 2]: la tabla 5 resume los
porcentajes de identidad de aminoácidos comparados dos a dos para
las secuencias de las proteínas VanB, VanA, VanC, ElDdl, DdlA y
DdlB. En las condiciones de hibridación de tipo Southern, el
fragmento del clon se hibridaba con el fragmento de 3,3 kb de
HindIII-KpnI de E. faecalis V583. La sonda
no se hibrida con el ADN de un derivado de V583 sensible a la
vancomicina o al ADN de las cepas de E. faecalis y E.
faecium sensibles a la vancomicina utilizadas como referencia.
El fragmento de ADN del clon obtenido mediante PCR corresponde a un
fragmento interno del gen implicado en la resistencia. Este gen
codifica para una enzima parecida a las
D-Ala:D-Ala ligasas, denominada
VanB, que podría estar implicada en la síntesis de un producto que
sustituye a
D-Ala-D-Ala.
Estas pruebas permitieron poner en evidencia un
único grupo de genes parecidos a vanB, y responsables de un bajo y
de un alto nivel de resistencia frente a la vancomicina en los
enterococos (tablas 1 y 2).
No se observó ninguna hibridación entre la sonda
VanB y el ADN de cepas sensibles a la vancomicina sin inducción o
que llevan los genes vanA o vanC o intrínsecamente resistentes.
Se clonó la secuencia completa del gen vanB
poniendo en práctica las siguientes etapas:
Se obtuvo el plásmido pAT202 subclonando en
pUC19 un fragmento de HindIII-KpnI de 3,3 kb del
bacteriófago recombinante \lambda que contiene el gen vanB. Se
realizó la clonación con endonucleasas de restricción (Boehringer,
Mannheim, Alemania y Pharmacia LKB Biotechnology Inc. Uppsala,
Suecia), ADN ligasa de T4 (Boehringer) y fosfatasa alcalina
(Pharmacia) según las recomendaciones del fabricante. Se determinó
la secuencia nucleotídica de 1090 pb consecutivos de pAT202 para
las dos cadenas mediante el método didesoxi de terminación de la
cadena (Sanger et al, 1977) utilizando la ADN polimerasa de
T7 modificada (Amersham Radiochemical Center, Amersham, Gran
Bretaña) y oligonucleótidos complementarios de la secuencia,
sintetizados mediante el método con metoxifosforamidita (Institut
Pasteur, Paris, Francia). Se resolvieron los productos de las
reacciones mediante electroforesis sobre gel de poliacrilamida al
6% desnaturalizante. El primer par de bases de la secuencia
presentado corresponde a la posición 1 (figura 1). El posible sitio
de unión al ribosoma (RBS) (Moran et al, Mol. Gen. Genet.
186 (1982) 339-346) en sentido 5' del codón ATG de
iniciación en la posición 46 está subrayado. El codón de parada
(TGA) está indicado mediante un asterisco. La secuencia de
aminoácidos está alineada con el primer nucleótido de cada
codón.
\newpage
Se observó la transferencia del carácter de
resistencia frente a la vancomicina (en 6 aislados de enterococos de
17) mediante conjugación sobre filtro, en cepas de E. faecium
y E. faecalis resistentes a bajas o a fuertes concentraciones
de antibióticos.
Entre los otros fragmentos de aproximadamente
600 pb amplificados a partir de los oligonucleótidos V1 y V2, un
inserto se hibridaba con el ADN de cepas Vm^{R} o Vm^{S} de
En. faecalis pero no con el ADN de cepas de otras 18
especies. Este gen codifica para una
D-Ala:D-Ala ligasa en En.
faecalis. Ya que no se ha detectado ningún otro gen de ligasa en
En. faecalis, este gen se denominó ddl.
La clonación y la secuenciación del gen ddl
insertado en el vector pUC19 (Norrander et al, Gene 26, 1983,
101-106) permitieron constatar que el contenido en
bases G y C de ddl (37,5%) y del cromosoma de En. faecalis
(37-39%) eran muy parecidos.
Diferentes observaciones sugieren que el gen
vanB tiene un origen exógeno: (i) el gen puede transferirse mediante
conjugación. (ii) No se han detectado secuencias de nucleótidos que
se parezcan a van B en el ADN de cepas Vm^{S} de En.
faecalis y En. faecium y los representantes de otras 16
especies de enterococos (tabla III). (iii) El contenido en bases GC
del gen vanB difiere de manera notable del cromosoma de En.
faecalis. (iv) El bajo nivel de similitud entre Ddl de En.
faecalis y VanB (34% de identidad) indica que los genes
correspondientes no tienen su origen en una duplicación
reciente.
\vskip1.000000\baselineskip
La incubación de En. faecalis V583 antes
de la inducción de cepas En. faecalis JH2-2
Vm^{R} o Vm^{S} (Jacob y Hobbs - J. Bacteriol. 117, 1974,
360-372) con ramoplanina (9 \mug/ml) inhibidor de
la pared celular condujo a la acumulación del precursor de la pared
celular
UDP-N-acetilmuramil-L-Ala-D-Glu-L-Lys-D-Ala-D-Ala
(UDP-Mur-NAc-pentapéptido)
que se utiliza en el ciclo normal de la síntesis del
peptidoglucano.
Tras la inducción de la resistencia, En.
faecalis V583 acumuló tres productos intermedios de la pared
celular cuando se incubó la cepa con ramoplanina (tabla IV). Se
identificaron estos productos intermedios como
UDP-MurNAc-pentapéptidos,
UDP-MurNAc-tetrapéptido carente de
la parte c-terminal D-Ala del
UDP-MurNAc-pentapéptido; y de
manera predominante,
UDP-MurNAc-tetrapéptido-D-lactato
en el que la parte C-terminal D-Ala
del UDP-MurNAc-pentapéptido está
sustituida por D-lactato. La presencia de
UDP-MurNAc-tetrapéptido-D-lactato
sugiere que las cepas de fenotipos VanA y VanB tienen el mismo
mecanismo de base de resistencia frente a los glicopéptidos; es
decir, sintetizan D-lactato que puede unirse a VanB
(o VanA) por el D-Ala para sintetizar
D-Ala-D-lactato que
a continuación se incorpora en el precursor de peptidoglucano.
Se purificaron los precursores de la pared
mediante cromatografía de intercambio iónico y desalado mediante
filtración sobre gel. La identificación se basó en una
espectroscopía de masas ("positive ion electrospray mass
spectroscopy" - espectroscopía de masas con electrospray de iones
positivos), un análisis con espectro de UV (para el uracilo)
automatizado de los aminoácidos tras la hidrólisis durante 4 h y 24
h (para el ácido murámico y las tasas de aminoácidos) y el análisis
mediante reacciones enzimáticas específicas del residuo terminal
obtenido mediante reacción con la
D,D-carboxipeptidasa de Actinomadura R39
(Messer y Reynolds, FEMS Microbiol Letter 94, 1992,
195-200).
195-200).
La cantidad total de precursores acumulada en
cada cultivo era aproximadamente parecida a 65 \mumol/g de peso
seco en un periodo de incubación correspondiente a 0,6 de la
duración media de la síntesis.
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(Tabla pasa a página
siguiente)
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\global\parskip0.000000\baselineskip
(1) INFORMACIÓN GENERAL:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- SOLICITANTE:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- NOMBRE: INSTITUT PASTEUR
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- CALLE: 25-28, rue du Dr. Roux
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- CIUDAD: PARIS
\vskip0.500000\baselineskip
- (E)
- PAÍS: FRANCIA
\vskip0.500000\baselineskip
- (F)
- CÓDIGO POSTAL: 75724 CEDEX 15
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TÍTULO DE LA INVENCIÓN: PROTEÍNA QUE CONFIERE UNA RESISTENCIA DE TIPO INDUCIBLE, FRENTE A GLICOPÉPTIDOS, ESPECIALMENTE EN BACTERIAS GRAM-POSITIVAS. SECUENCIA DE NUCLEÓTIDOS QUE CODIFICA PARA ESTA PROTEÍNA.
\vskip0.800000\baselineskip
- (iii)
- NÚMERO DE SECUENCIAS: 8
\vskip0.800000\baselineskip
- (iv)
- FORMA LEGIBLE POR ORDENADOR:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- TIPO DE SOPORTE: Disquete
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- ORDENADOR: PC IBM compatible
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- SISTEMA DE EXPLOTACIÓN: PC-DOS/MS-DOS
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- SOFTWARE: PatentIn Release 1.0, Versión 1.25 (OEB)
\vskip0.800000\baselineskip
- (v)
- DATOS DE LA SOLICITUD ACTUAL:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- NÚMERO DE PRESENTACIÓN: PCT/FR93/01264
\vskip0.800000\baselineskip
- (vi)
- DATOS DE LA SOLICITUD ANTERIOR:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- NÚMERO DE PRESENTACIÓN: FR 9215671
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- FECHA DE PRESENTACIÓN: 18-DIC-1992
\vskip0.800000\baselineskip
- (vi)
- DATOS DE LA SOLICITUD ANTERIOR:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- NÚMERO DE PRESENTACIÓN: FR 9308356
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- FECHA DE PRESENTACIÓN: 07-JUL-1993
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO: 1:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 196 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- NÚMERO DE CADENAS: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- CONFIGURACIÓN: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: proteína
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 1:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO: 2:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 1140 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- NÚMERO DE CADENAS: doble
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- CONFIGURACIÓN: circular
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico)
\vskip0.800000\baselineskip
- (ix)
- CARACTERÍSTICA ADICIONAL:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- NOMBRE/CLAVE: misc_feature
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- POSICIÓN: 241..258
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- OTRAS INFORMACIONES: /nota= "CEBADOR 1"
\vskip0.800000\baselineskip
- (ix)
- CARACTERÍSTICA ADICIONAL:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- NOMBRE/CLAVE: misc_feature
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- POSICIÓN: 860..877
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- OTRAS INFORMACIONES: /nota= "CEBADOR 2: INVERSO COMPLEMENTARIO"
\vskip0.800000\baselineskip
- (ix)
- CARACTERÍSTICA ADICIONAL:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- NOMBRE/CLAVE: RBS
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- POSICIÓN: 52..58
\newpage
\vskip0.800000\baselineskip
- (ix)
- CARACTERÍSTICA ADICIONAL:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- NOMBRE/CLAVE: CDS
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- POSICIÓN: 68..1092
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 2:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO: 3:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 341 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- CONFIGURACIÓN: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: proteína
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 3:
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO: 4:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 589 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- NÚMERO DE CADENAS: doble
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- CONFIGURACIÓN: circular
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico)
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 4:
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO: 5:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 17 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- NÚMERO DE CADENAS: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- CONFIGURACIÓN: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico)
\vskip0.800000\baselineskip
- (ix)
- CARACTERÍSTICA ADICIONAL:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- NOMBRE/CLAVE: misc_feature
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- POSICIÓN: 1..17
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- OTRAS INFORMACIONES: /nota= "posiciones 241-258 de la secuencia de nucleótidos de SEQ ID NO: 2"
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 5:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipATGGGAAGCC GATAGTC
\hfill17
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO: 6:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 17 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- NÚMERO DE CADENAS: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- CONFIGURACIÓN: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico)
\vskip0.800000\baselineskip
- (ix)
- CARACTERÍSTICA ADICIONAL:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- NOMBRE/CLAVE: misc_feature
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- POSICIÓN: 1..17
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- OTRAS INFORMACIONES: /nota= "Inverso complementario del fragmento de los nucleótidos 860 a 877 de SEQ ID NO: 2"
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 6:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipGATTTCGTTC CTCGACC
\hfill17
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO: 7:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 1079 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- NÚMERO DE CADENAS: doble
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- CONFIGURACIÓN: circular
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico)
\vskip0.800000\baselineskip
- (ix)
- CARACTERÍSTICA ADICIONAL:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- NOMBRE/CLAVE: RBS
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- POSICIÓN: 19..25
\vskip0.800000\baselineskip
- (ix)
- CARACTERÍSTICA ADICIONAL:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- NOMBRE/CLAVE: CDS
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- POSICIÓN: 33..1076
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 7:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO: 8:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 348 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- CONFIGURACIÓN: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: proteína
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 8:
Claims (23)
1. Proteína VanB caracterizada porque
comprende la secuencia de aminoácidos siguiente, y porque participa
en bacterias gram-positivas, en una resistencia
frente a la vancomicina, siendo esta resistencia de tipo inducible
por la vancomicina y no inducible por la teicoplanina.
2. Proteína VanB según la reivindicación 1,
caracterizada porque tiene la capacité de conferir una
resistencia de tipo inducible frente a la vancomicina, en
enterococos y por ejemplo en cepas del género E. faecium o
E. faecalis.
3. Proteína VanB caracterizada porque
comprende una secuencia de aminoácidos modificada con respecto a la
secuencia según la reivindicación 1 mediante deleción o inserción o
sustitución de uno o varios aminoácidos, ya que la proteína VanB así
modificada es necesaria para establecer una resistencia frente a la
vancomicina en bacterias gram-positivas, siendo esta
resistencia de tipo inducible por la vancomicina y no inducible por
la teicoplanina.
4. Fragmento peptídico de la proteína VanB,
caracterizado porque corresponde a la secuencia de
aminoácidos según la reivindicación 1 o a cualquier parte de esta
secuencia suficiente para conferir la resistencia frente a la
vancomicina, en bacterias gram-positivas, por
ejemplo bacterias de la familia de los enterococos, siendo esta
resistencia de tipo inducible por la vancomicina y no inducible por
la teicoplanina.
5. Fragmento peptídico de la proteína VanB,
caracterizado porque corresponde a la secuencia de
aminoácidos según la reivindicación 1 o a cualquier parte de esta
secuencia y porque se reconoce específicamente por anticuerpos
dirigidos contra la proteína VanB, y porque carece de reacción
inmunológica con anticuerpos que reconocen las proteínas VanA y/o
VanC.
6. Secuencia de nucleótidos caracterizada
porque codifica para una proteína VanB implicada en bacterias
gram-positivas, en una resistencia frente a la
vancomicina, siendo esta resistencia de tipo inducible por la
vancomicina y no inducible por la teicoplanina, comprendiendo dicha
proteína VanB en su esqueleto peptídico la secuencia de aminoácidos
1 según reivindicación 1, o porque se trata de una secuencia de ADN
complementaria a esta secuencia codificante, o una secuencia de ARN
correspondiente.
7. Secuencia de nucleótidos según la
reivindicación 6, caracterizada porque comprende la cadena de
nucleótidos siguiente o un cadena nucleotídica modificada mediante
mutación, adición o deleción de nucleótidos con respecto a la cadena
de nucleótidos siguiente, ya que codifica para una proteína
implicada en bacterias gram-positivas, en una
resistencia frente a la vancomicina, siendo esta resistencia de tipo
inducible por la vancomicina y no inducible por la teicoplanina.
8. Fragmento nucleotídico, caracterizado
porque puede hibridarse en condiciones rigurosas con una secuencia
según una cualquiera de las reivindicaciones 6 ó 7, o porque es
complementario al fragmento nucleotídico que se hibrida:
(a) codificando dicho fragmento para un
fragmento de VanB, definida según una cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 3, suficiente para conferir la resistencia
frente a la vancomicina, siendo esta resistencia de tipo inducible
por la vancomicina y no inducible por la teicoplanina o,
(b) permitiendo dicho fragmento la detección
específica de secuencias que codifican para el gen vanB, definido en
la reivindicación 6 ó 7.
9. Fragmento nucleotídico según la
reivindicación 8, caracterizado porque no se hibrida en
condiciones rigurosas con el ADN de cepas de enterococos sensibles a
la vancomicina, en particular con el ADN de las cepas E.
faecalis JH2-2, E. faecium BM4107.
10. Fragmento nucleotídico según una cualquiera
de las reivindicaciones 8 ó 9, caracterizado porque su
secuencia consiste en la cadena nucleotídica ilustrada en la
reivindicación 7.
11. Fragmento nucleotídico según una cualquiera
de las reivindicaciones 8 a 10, caracterizado porque está
marcado.
12. Fragmento nucleotídico según la
reivindicación 8, caracterizado porque se trata de una de las
secuencias siguientes:
- cebador 1: 5' ATGGGAAGCCGATAGTC 3'
- cebador 2: 5' GATTTCGTTCCTCGACC 3'.
13. Secuencia de ADN recombinante,
caracterizada porque comprende una secuencia de nucleótidos
según una cualquiera de las reivindicaciones 6 a 11, bajo el control
de elementos de regulación susceptibles de intervenir en la
expresión de una resistencia frente a la vancomicina, en un huésped
determinado, siendo esta resistencia inducible por la vancomicina y
no inducible por la teicoplanina.
14. Vector recombinante para la clonación o la
expresión en un huésped determinado, caracterizado porque
comprende una secuencia nucleotídica según una cualquiera de las
reivindicaciones 6 a 11, en un sitio no esencial para su
replicación, bajo el control de elementos de regulación
susceptibles de intervenir en la expresión de una resistencia frente
a la vancomicina, siendo esta resistencia inducible por la
vancomicina y no inducible por la teicoplanina.
15. Vector recombinante según la reivindicación
14, caracterizado porque se trata del plásmido pAT201
depositado en la CNCM con el número I-1277 o del
plásmido pAT202 depositado en la C.N.C.M. con el número
I-9291.
16. Huésped celular recombinante,
caracterizado porque comprende una secuencia nucleotídica
según una cualquiera de las reivindicaciones 6 a 11, o un vector
según la reivindicación 14 o la reivindicación 15, seleccionándose
este huésped de las bacterias, especialmente los cocos
gram-positivos.
17. Anticuerpos monoclonales o policlonales
caracterizados porque reconocen específicamente a la proteína
VanB según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3 o un
fragmento peptídico según una cualquiera de las reivindicaciones 4 a
5.
18. Kit para el diagnóstico in vitro en
una muestra biológica, de la presencia de cepas resistentes a la
vancomicina, perteneciendo estas cepas a los cocos
gram-positivos, especialmente porque se trata de las
cepas de enterococos, por ejemplo E. faecium,
caracterizado porque comprende:
- anticuerpos según la reivindicación 17, según
el caso marcados,
- un reactivo para la detección de una reacción
inmunológica del tipo anticuerpo-antígeno,
- según el caso des reactivos para realizar la
lisis de las células de la muestra sometida a prueba,
- según el caso una concentración determinada de
vancomicina para inducir la resistencia.
19. Kit según la reivindicación 18,
caracterizado porque comprende además anticuerpos dirigidos
específicamente contra la proteína VanA y/o anticuerpos dirigidos
específicamente contra la proteína VanC.
20. Kit para el diagnóstico in vitro de
la presencia de cepas resistentes a la vancomicina, perteneciendo
estas cepas en particular a los cocos
gram-positivos, especialmente porque se trata de
cepas de enterococos, por ejemplo E. faecium,
caracterizado porque comprende:
- una sonda nucleotídica según la reivindicación
11, y según el caso,
- nucleósido-trifosfatos dATP,
dCTP, dTTP, dGTP,
- un agente de polimerización de ADN.
21. Kit según la reivindicación 20,
caracterizado porque comprende además sondas nucleotídicas
específicas de los genes vanA y/o vanC.
22. Procedimiento de detección in vitro
de la presencia de cepas resistentes a la vancomicina y/o a la
teicoplanina, perteneciendo estas cepas a la familia de los cocos
gram-positivos, especialmente porque se trata de
cepas de enterococos, por ejemplo E. faecium o E.
faecelis, caracterizado porque comprende:
a) poner en contacto una muestra biológica
susceptible de contener las cepas resistentes, con un cebador
constituido por un fragmento nucleotídico según una cualquiera de
las reivindicaciones 8 ó 9, que puede hibridarse con una secuencia
nucleotídica buscada, necesaria para la expresión de la resistencia,
utilizándose esta secuencia como matriz, en presencia de los 4
nucleósidos trifosfatos diferentes, y de un agente de
polimerización, en condiciones de hibridación tales que para cada
secuencia nucleotídica que se ha hibridado con un cebador, se
sintetiza un producto de elongación de cada cebador complementario
de la matriz,
b) separar la matriz y el producto de elongación
obtenido, pudiendo comportarse entonces igualmente éste último como
una matriz,
c) repetir la etapa a) de manera que se obtiene
una cantidad detectable de las secuencias nucleotídicas
buscadas,
d) detectar el producto de amplificación de las
secuencias nucleotídicas.
23. Procedimiento de detección in vitro
de cepas resistentes a la vancomicina y/o a la teicoplanina,
perteneciendo estas cepas a la familia de los cocos
gram-positivos, especialmente porque se trata de
cepas de enterococos, por ejemplo E. faecium o E.
faecalis, caracterizado porque comprende:
a) poner en contacto una muestra biológica
susceptible de contener las cepas resistentes, con un cebador
constituido por un fragmento nucleotídico según una cualquiera de
las reivindicaciones 8 ó 9, y con un fragmento nucleotídico del gen
vanA y un fragmento nucleotídico específico del gen vanC, que puede
hibridarse con una secuencia nucleotídica buscada, necesaria para la
expresión de la resistencia, utilizándose esta secuencia como
matriz, en presencia de los 4 nucleósidos trifosfatos diferentes, y
de un agente de polimerización, en condiciones de hibridación tales
que para cada secuencia nucleotídica que se ha hibridado con un
cebador, se sintetiza un producto de elongación de cada cebador
complementario de la matriz,
b) separar la matriz y el producto de elongación
obtenido, pudiendo comportarse entonces igualmente éste último como
una matriz,
c) repetir la etapa a) de manera que se obtiene
una cantidad detectable de las secuencias nucleotídicas
buscadas,
d) detectar el producto de amplificación de las
secuencias nucleotídicas.
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| FR9215671A FR2699539B1 (fr) | 1992-12-18 | 1992-12-18 | Protéine conférant une résistance de type inductible, à des glycopeptides, notamment chez des bactéries à gram-positif. Séquence de nucléotides codant pour cette protéine. |
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