JPH08509873A

JPH08509873A - ヘリコバクター感染に対する免疫組成物、該組成物に用いられるポリペプチドおよび該ポリペプチドをコードする核酸配列

Info

Publication number: JPH08509873A
Application number: JP7514170A
Authority: JP
Inventors: ラビニュ、アグネ; シュールボーム、セバスチャン; フェレーロ、リシャール
Original assignee: Institut Pasteur
Current assignee: Institut Pasteur
Priority date: 1993-05-19
Filing date: 1993-11-19
Publication date: 1996-10-22
Also published as: JP2008086316A; CA2144307C; WO1994026901A1; ES2288753T3; EP0703981B1; JP2004337170A; WO1995014093A1; EP0703981A1; ATE364083T1; DK0703981T3; AU689779B2; JP3955317B2; AU6929094A; DE69434985D1; JPH08510120A; US6248330B1; CA2144307A1; DE69434985T2; SG52480A1

Abstract

(57)【要約】この発明は、ヘリコバクター感染に対する防御抗体を誘発することが可能な免疫組成物であって、ｉ）ヘリコバクター・ピロリ由来のウレアーゼ構造ポリペプチドの少なくとも１つのサブユニット、もしくはヘリコバクター・フェリス．ウレアーゼと反応する抗体によって認識されるそれらの断片、および／またはヘリコバクター・フェリス由来のウレアーゼ構造ポリペプチドの少なくとも１つのサブユニット、もしくはヘリコバクター・ピロリ・ウレアーゼと反応する抗体によって認識されるそれらの断片、ii）任意に、ヘリコバクター由来のウレアーゼ関連熱ショック蛋白質（ＨＳＰ）、すなわちシャペロニン、もしくは該蛋白質の断片を包含することを特徴とする免疫組成物に関する。

Description

【発明の詳細な説明】ヘリコバクター感染に対する免疫組成物、該組成物に用いられるポリペプチドおよび該ポリペプチドをコードする核酸配列この発明は、ヘリコバクター種［Helicobacler spp.］感染に対する防御抗体を誘導する免疫組成物に関する。また、ヘリコバクター由来の蛋白様物質、およびそれらをコードする核酸配列にも関する。これらの蛋白様物質に対する抗体もまた、この発明に含まれる。Ｈ．ピロリ［H．pylori］はヒト胃粘膜に感染する微生物であり、進行性慢性胃炎に関連付けられている。それはまた、胃十二指腸潰瘍の病因であることが示されており（Pelerson，1991）、最近の２つの研究では、Ｈ．ピロリに感染した人間は胃ガン発生の危険性が高いことが報告されている（Nomura et al，1991； Parsonnel et al，1991）。この菌のイン・ビボにおける研究、並びに、その結果として適当な予防または治療剤の開発についての研究は、ヘリコバクター・ピロリが非常に小数の動物宿主に由来する胃タイプの上皮とのみ関連し、それらの中で研究所でのモデルとして適したものがないという事実によって妨げられてきた。ネコの胃粘膜から単離され（Lee et al，1988，1990）、ヘリコバクター属の一員であると同定された螺旋菌を用いて、胃コロニー形成のマウスモデルが開発されている。この菌は、Ｈ．フェリス［H．felis］と命名されている（Paster e t al，1990）。現時点では、Ｈ．フェリスに関する限られた情報とそのＨ．ピロリとの類似および相違の程度しか利用できない。したがって、このマウスモデルのＨ．ピロリ感染治療の開発についての信頼性は不明である。したがって、この発明の目的は、ヘリコバクター感染において用いられ、さらに実験動物において試験することが可能な、治療および予防組成物を提供することにある。Ｈ．ピロリがウレアーゼ活性を発現すること、並びにウレアーゼが細菌性コロニー形成および特定の病原性プロセスの介在に重要な役割を果たすことは周知である（Ferrero and Lee，1991；Hazel et al，1991）。Ｈ．ピロリのウレアーゼ構造ポリペプチドをコードする遺伝子（ＵＲＥＡ、ＵＲＥＢ）は、Ｈ．ピロリにおけるウレアーゼ活性に必要な“アクセサリー” ポリペプチドをコードする遺伝子を含む（国際特許出願WO 93/07273）ものとして、クローン化および配列決定がなされている（Labigne et al，1991）。Ｈ．ピロリウレアーゼ遺伝子クラスター由来の核酸配列を、プローブとして、Ｈ．フェリス中のウレアーゼ配列の同定に用いる試みがなされている。しかしながら、これらの試みは１つも成功していない。さらに、イン・ビトロにおけるＨ．フェリスクラスターの確立および維持は非常に困難であり、細菌中に存在する大量のヌクレアーゼがＤＮＡの抽出を繁雑にしている。しかしながら、本発明者らは、Ｈ．フェリスのウレアーゼ構造ポリペプチド並びにアクセサリーポリペプチドの遺伝子のクローン化および配列決定に成功した。これにより、この発明において、Ｈ．フェリスとヘリコバクター・ピロリとのｕｒｅ遺伝子産生物のアミノ酸配列データの比較が可能となり、ウレアーゼサブユニット間の高度の保存性が見出された。この２つのウレアーゼの間には免疫学的な関係が存在し、ウレアーゼサブユニットまたはそれらの断片を免疫原として用いてヘリコバクター感染に対する防御抗体を誘導することができる。本発明者らはまた、この発明において、ヘリコバクター中に、ウレアーゼ活性に対する増強効果を有する新規熱ショック蛋白質、すなわちシャペロニンを同定した。したがって、免疫組成物中でこのシャペロニンを用いることにより、防御を増強することができる。この発明は、ヘリコバクター感染に対する防御抗体を誘発することが可能な免疫組成物であって、ｉ）ヘリコバクター・ピロリ由来のウレアーゼ構造ポリペプチドの少なくとも１つのサブユニット、もしくはヘリコバクター・フェリスウレアーゼと反応する抗体によって認識されるそれらの断片、および／またはヘリコバクター・フェリス由来のウレアーゼ構造ポリペプチドの少なくとも１つのサブユニット、もしくはヘリコバクター・ピロリウレアーゼと反応する抗体によって認識されるそれらの断片； ii）任意に、ヘリコバクター由来のウレアーゼ関連熱ショック蛋白質（ＨＳＰ）、すなわちシャペロニン、もしくはこの蛋白質の断片、を含有することを特徴とする免疫組成物に関する。この発明の免疫組成物は、ヘリコバクター・ピロリおよび／またはヘリコバクター・フェリス由来のウレアーゼ構造ポリペプチドの少なくとも１つのサブユニットを主要活性成分として含有する。この発明において、“ウレアーゼ構造ポリペプチド”という表現は、ヘリコバクター．ピロリまたはヘリコバクター・フェリスの酵素を示す。これは、恐らく、２つの繰り返しモノマー性サブユニット、メジャーサブユニット（ｕｒｅＢ遺伝子の産生物）およびマイナーサブユニット（ｕｒｅＡ遺伝子の産生物）、からなる主要表面抗原であり、ウレアーゼ遺伝子クラスターのアクセサリー遺伝子の産生物の存在によって補われている場合には、２つのヘリコバクター種におけるウレアーゼ活性、すなわち遊離ＮＨ⁴⁺への尿素の加水分解、の原因である。ヘリコバクター・ピロリウレアーゼ構造ポリペプチドは、Labigne et al，199 1に記述され、配列決定されている。この論文に記載されるポリペプチドは、この発明の組成物における使用に特に適している。しかしながら、抗ヘリコバクター・フェリスウレアーゼ抗体との交叉反応性が関与する範囲内でその免疫学的特徴が維持されるのであれば、核酸置換、欠失または挿入を含む、この公開された配列と機能的な相同性を示す変異体を用いることもできる。一般的に述べると、このポリペプチド変異体は、公開された配列と少なくとも90％の相同性を示す。ヘリコバクター・ピロリウレアーゼ構造ポリペプチドの断片もまた、その断片がヘリコバクター・フェリスウレアーゼと反応する抗体によって認識されるのであれば、この発明の免疫組成物において使用することができる。そのような断片には、一般に、少なくとも６個のアミノ酸、例えば６ないし 100個、好ましくは約20-25個のアミノ酸が含まれる。この断片がヘリコバクターに独特のエピトープを担持していると好都合である。この発明において、核酸およびアミノ酸配列は、遺伝子暗号およびアミノ酸略語をそれぞれ示す図11および12を参照することにより説明される。この発明に用いるに適切なヘリコバクター・フェリスウレアーゼ構造ポリペプチドは、（ＣＮＣＭＩ−1355という番号で1993年８月25日にＣＮＣＭに寄託された）プラスミドｐＩＬＬ205の一部によってコードされ、図３（サブユニットＡおよびＢ）にそのアミノ酸配列が示されるものが好ましい。さらに、図３の配列についてアミノ酸置換、欠失または挿入を含む、この配列の変異体も、ヘリコバクター・ピロリウレアーゼとの免疫学的交叉関係［cross-relationship］を維持する限りにおいて用いることもできる。このような変異体は、通常、図３の配列と少なくとも90％の相同性を示す。このウレアーゼの断片も、この断片がヘリコバクター・ピロリウレアーゼと反応する抗体によって認識される限りにおいて、免疫組成物に用いることができる。さらに、この断片の長さは通常少なくともアミノ酸６個、例えば６ないし100個であり、好ましくは約20ないし25である。好ましくは、この断片は、ヘリコバクターに独特のエピトープを担持している。この発明の免疫組成物に天然ウレアーゼ配列の変異体または断片が用いられる場合には、この断片または変異体を抗体、好ましくは天然もしくは組換えウレアーゼのいずれか、あるいは全ヘリコバクターに対して生じたポリクローナル抗体と接触させることにより、他のヘリコバクター種由来のウレアーゼと反応する抗体との交叉反応性を試験することができる。毒性の危険性を最少にしつつ全ポリペプチドの免疫学的特性を保全することができるので、ウレアーゼ構造遺伝子の断片を用いることが特に好ましい。この発明の免疫組成物の活性成分は、それぞれｕｒｅＡおよびｕｒｅＢ遺伝子のサブユニットＡまたはサブユニットＢ産生物のいずれかである、ウレアーゼ構造ポリペプチドのただ１つのサブユニットからなるものでもよい。しかしながら、この組成物は、通常別のポリペプチドとして存在するサブユニットＡおよびＢの両者を含むことが好ましい。しかしながら、ポリペプチドが組換え手段によって生成される場合には、隣接する２つのコーディング配列を分け隔てる停止コドンを抑制することによってＡおよびＢ遺伝子産生物の全配列を含む融合蛋白質を用いることもできる。この発明の免疫組成物は、“シャペロニン”としても知られるヘリコバクター由来の熱ショック蛋白質を含んでいてもよい。これらのシァペロニンは、本願明細書において発明者らにより明らかにされている。好ましくは、シャペロニンはヘリコバクター・ピロリに由来する。このＨＳＰは、図６に示されるアミノ酸配列を有する、ＨＳＰＡまたはＨＳＰＢまたはこの２つの混合物であってもよい。これらのポリペプチドは、（1993年８月25日にＣＮＣＭＩ−1356という番号でＣＮＣＭに寄託されている）プラスミドｐＩＬＬ689によってコードされる。この発明によると、ＨＳＰ成分として、図６に示される配列のアミノ酸が置換され、挿入され、もしくは欠失し、天然ウレアーゼ関連ＨＳＰと通常少なくとも 75％、好ましくは少なくとも85％の相同性を示すポリペプチド変異体を用いることもできる。この変異体は、さらに、天然ポリペプチドとの機能的相同性を示してもよい。ＨＳＰ成分の場合、“機能的相同性”は、活性ウレアーゼを発現することができる微生物においてウレアーゼ活性を増強する能力を意味する。この性質は、下記実施例に記載される定量ウレアーゼ活性アッセイを用いて試験することができる。好ましくは、少なくとも６個のアミノ酸を有する、ＨＳＰＡおよびＨＳＰＢポリペプチドのいずれかもしくは両者の断片を組成物に用いることができる。この発明の免疫組成物に用いられるＨＳＰ成分の断片もしくは変異体は、好ましくは、ＨＳＰによって通常示されるウレアーゼ増強効果を妨げる抗体を産生することが可能である。この性質も、実施例に記述される定量アッセイによって試験することができる。組成物中にシャペロニン類が存在することにより、ヘリコバクター・ピロリおよびフェリスに対する防御が増強される。好ましい態様によると、この免疫組成物には、ヘリコバクター・フェリスのＡおよびＢサブユニットの両者が（すなわち、Ｈ．ピロリウレアーゼなしで）、ウレアーゼ成分として、ヘリコバクター・ピロリのＨＳＰＡおよびＨＳＰＢと共に含まれる。あるいは、ヘリコバクター・フェリスウレアーゼのＡおよびＢサブユニットを、Ｈ．ピロリのＡおよびＢサブユニットと共に、ただしシャペロニン成分は含めずに用いることができる。２種の異なるヘリコバクター種のウレアーゼ間の免疫学的交叉反応性が、組成物中でのただ１種のウレアーゼ、好ましくはヘリコバクター・フェリスのウレアーゼの使用を可能にする。しかしながら、共通のエピトープによって誘発される防御抗体は、ヘリコバクター・ピロリおよびヘリコバクター・フェリスの両者に対して活性である。この組成物は、ウレアーゼポリペプチドまたは断片が他の種にも生じるエピトープを担持する場合には、他の種のヘリコバクターに対する防御抗体をも誘発することが可能である。この発明の組成物は、生理学的に許容し得る賦形剤および担体、並びに、任意のアジュバント、ハプテン、担体、安定化剤等と共に、ワクチンとして有益に用いられる。適切なアジュバントには、ムラミルジペプチド［muranmyl dipeptide ］（ＭＤＰ）、完全もしくは不完全フロインドアジュバントおよびミョウバンが含まれる。ワクチン組成物は、通常、経口投与用に処方される。このワクチンは好ましくはヒトに用いられるものであるが、非ヒト動物に投与することもでき、例えば、家畜治療用、またはマウス、ネコおよびイヌのような実験動物に用いることができる。この発明はまた、免疫組成物に用いられる蛋白様物質およびＡおよびＢウレアーゼ構造サブユニット以外のウレアーゼ遺伝子クラスターによってコードされる蛋白様物質にも関する。“蛋白様物質”は、精製され、もしくは他の蛋白様もしくは非蛋白様物質との混合物のいずれかの形態の、他のアミノ酸鎖、例えばペプチド、ポリペプチドまたは蛋白質を含んでなる分子を包含［englobes］するものとして解釈される。この発明において、“ポリペプチド”という用語は、その長さにかかわらずアミノ酸の鎖を表わし、“ペプチド”という用語を包含するものと理解される。“断片”という用語は、親の配列よりも少なくともアミノ酸１個だけ短く、親の配列において連続している、好ましくは少なくとも６残基の長さのアミノ酸を含む、いかなるアミノ酸配列をも意味する。特には、この発明は、プラスミドｐＩＬＬ205（ＣＮＣＭＩ−1355）のウレアーゼ遺伝子クラスターによってコードされるヘリコバクター・フェリスポリペプチドの少なくとも１つを含むことを特徴とする蛋白様物質であって、構造およびアクセサリーウレアーゼポリペプチド、または前記ポリペプチドと少なくとも 90％の相同性を有するポリペプチド、またはそれらの断片を含む蛋白様物質に関する。特に興味深いのは、図３に示されるｕｒｅＡおよびｕｒｅＢ遺伝子の遺伝子産生物、または少なくとも90％の相同性を有するそれらの変異体もしくは少なくともアミノ酸６個を有する断片である。この断片および変異体は、ヘリコバクター・ピロリウレアーゼと反応する抗体によって認識される。ウレアーゼ遺伝子クラスターのアクセサリー遺伝子によってコードされるポリペプチドの中でも、図９に示されるｕｒｅＩの遺伝子産物もこの発明の一部を形成する。少なくとも75％、好ましくは少なくとも85％の相同性を有するｕｒｅＩ産生物の変異体、または少なくともアミノ酸６個を有する、この遺伝子産物もしくは変異体の断片もまた含まれる。この変異体は、好ましくはｕｒｅＡおよびｕｒｅＢ遺伝子産物を、残りのウレアーゼアクセサリー遺伝子産生物の存在下において活性化する能力を有する。この機能的相同性は、以下の試験を用いて検出することができる：ｕｒｅＩ遺伝子産生物変異体を有する細菌10⁹個を尿素−インドール培地１ｍｌに懸濁させ、37℃でインキュベートする。尿素が加水分解することによりアンモニウムが放出され、これがｐＨを増加させてオレンジ色から暗赤色への色の変化を誘発する。そのような色変化が観察されることは、試験中のｕｒｅＩ遺伝子産生物の変異体がｕｒｅＡおよびＢ遺伝子産生物を活性化し得ることを示している。ｕｒｅＩ遺伝子産生物の断片もまた、それが、例えば少なくともアミノ酸70 ないし100個の長さを有しているならば、この全ポリペプチドとの機能的相同性を表わすことが可能である。ｕｒｅＩポリペプチドまたは変異体の断片は、ウレアーゼ熟成プロセスを妨げる抗体の形成を誘発することが可能であることが好ましい。換言すると、この断片は、ｕｒｅＩとｕｒｅＡ／ｕｒｅＢ遺伝子産生物との間の相互作用において決定的な役割を果たすエピトープを担持する。この発明はまた、ウレアーゼ関連熱ショック蛋白質またはヘリコバクター・ピロリのシャペロニン類またはそれらの断片の少なくとも１種を含む蛋白様物質にも関する。図６に示されるＨＳＰＡおよびＨＳＰＢポリペプチド、またはこのポリペプチドと少なくとも75％、好ましくは80もしくは90％の相同性または同一性を有するポリペプチドが特に好ましい。ヘリコバクター・ピロリＨＳＰＡポリペプチドの特に好ましい断片は、Ｃ−末端配列：または、少なくとも６個の連続したアミノ酸を有するこの配列のサブ断片である。このＣ−末端配列は、例えばニッケルの結合を可能にする、金属結合ドメインとして作用することが教示されている。この発明はまた、上述の蛋白様物質に対するモノクローナルもしくはポリクローナル抗体にも関する。より詳細には、この発明は、構造およびアクセサリーウレアーゼポリペプチド、すなわち、構造遺伝子ｕｒｅＡおよびｕｒｅＢ、並びにｕｒｅＣ、ｕｒｅＤ、ｕｒｅＥ、ｕｒｅＦ、ｕｒｅＧ、ｕｒｅＨおよびｕｒｅＩとして知られるアクセサリー遺伝子を有するプラスミドｐＩＬＬ205（ＣＮＣＭＩ−1355）のウレアーゼ遺伝子クラスターによってコードされるヘリコバクター・フェリスポリペプチドの１種に対する抗体またはそれらの断片に関する。これらの抗体は、前記ウレアーゼポリペプチドとの少なくとも 90％の相同性を有するポリペプチド、または、好ましくは少なくとも６個のアミノ酸を有するそれらの断片にも向けられる。この発明の抗体は、ウレアーゼ遺伝子クラスターによって発現されるヘリコバクター・フェリスポリペプチドを特異的に認識することができる。この場合には、この抗体によって認識されるエピトープはヘリコバクター・フェリスに独特のものである。あるいは、この抗体は、ヘリコバクター・フェリスウレアーゼポリペプチドおよびヘリコバクター・ピロリウレアーゼポリペプチドに共通のエピトープに対する抗体からなり、またはそれを含んでいてもよい。この抗体がアクセサリー遺伝子産生物を認識する場合には、それらがヘリコバクター・ピロリアクセサリー遺伝子産生物と交叉反応することが特に都合がよい。このようにして、ウレアーゼ熟成プロセスを阻害することにより、ヒトにおけるヘリコバクター・ピロリ感染の治療処置にこの抗体を用いることができる。この発明の特に好ましい抗体は、ヘリコバクター・フェリスｕｒｅＡおよび／またはｕｒｅＢ遺伝子産生物、すなわちＡおよびＢウレアーゼサブユニットを認識する。好ましくは、これらの抗体はまた、ヘリコバクター・ピロリＡおよびＢウレアーゼサブユニットと交叉反応するが、他の尿素分解バクテリア［ureolyti c bacteria］とは交叉反応しない。このような抗体は、ヘリコバクターに独特のエピトープ（図４参照）に対して調製し、あるいは全ポリペプチドに対して調製した後に他の尿素分解バクテリアと反応するあらゆる抗体をスクリーニングで除外すればよい。この発明はまた、ウレアーゼ関連ＨＳＰ類またはそれらの断片、特に、図６に示されるＨＳＰＡおよび／またはＨＰＳＢ蛋白質に対するモノクローナルもしくはポリクローナル抗体にも関する。ＨＳＰ類と少なくとも75％、好ましくは 80％、または90％の相同性を有するポリペプチドもまた、抗体形成の誘発に用いることができる。これらの抗体は、認識されるエピトープにより、ヘリコバクター・ピロリシャペロニン類に特異的であっても、あるいはヘリコバクター以外のバクテリアに由来するＧｒｏＥＬ様蛋白質もしくはＧｒｏＥＳ様蛋白質と交叉反応してもよい。図７は、それぞれ種々のバクテリアに由来するＧｒｏＥＳ様蛋白質およびＧｒｏＥＬ様蛋白質とのＨＳＰＡおよびＨＳＰＢの相同領域を示す。特に好ましい抗体は、ＨＳＰＡまたはＨＳＰＢシャペロニンのいずれかについて特異的な抗体、または金属結合機能を有するＨＳＰＡのＣ末端配列を特異的に認識する抗体である。さらに、抗体誘発に特異的な配列を使用することにより、ヘリコバクター特異的抗体の産生が確実となる。この発明の抗体は、古典的な技法を用いて調製することができる。例えば、モノクローナル抗体は、ハイブリドーマ法により、もしくはヒト抗体を調製するための周知技術により、あるいはMarks et al（Journal of Molecular Biology，1 991，222，p581-597）に記述される方法により生成させることができる。この発明はまた、酵素切断により生成する、上記抗体の断片をも包含する。ＦａｂおよびＦ（ａｂ´）₂が特に興味深い。Ｆａｂｃ断片もまた興味の対象この発明は、さらに、上記のあらゆる蛋白様物質をコードする核酸配列に関する。特には、この発明は、 i）ヘリコバクター・フェリスウレアーゼおよび上記アクセサリーポリペプチドをコードする配列、および上述のＨ．ピロリのＨＳＰをコードする配列；またはii）配列（i）に相補的な配列；またはiii）過酷な条件下において、配列（i）もしくは（ii）とハイブリダイズし得る配列；またはiv）少なくとも10個のヌクレオチドを含む配列（i）、（ii）もしくは（i ii）の断片、を包含することを特徴とする核酸配列に関する。好ましい核酸配列は、プラスミドｐＩＬＬ205（ＣＮＣＭＩ−1355）の配列の全部または一部、例えば図３の配列、特にｕｒｅＡの遺伝子産生物およびｕｒｅＢをコードする配列、または図９（ｕｒｅＩ）の配列、または過酷な条件下でこれらの配列とハイブリダイズし得る配列、またはこれらの配列に相補的な配列、またはこれらの配列の少なくとも10個の保全ヌクレオチドを含む断片を包含する配列である。他の好ましい配列は、プラスミドｐＩＬＬ689（ＣＮＣＭＩ−1356）の配列の全部もしくは一部、例えば図６の配列、特にはＨＳＰＡおよび／またはＨＳＰＢをコードする配列、またはこの配列に相補的な配列、または過酷な条件下でこの配列とハイブリダイズし得る配列、またはそれらの断片を包含する配列である。この発明における、非常に過酷なハイブリダイゼーション条件とは以下の通りである： −５×ＳＳＣ； −50％ホルムアミド、37℃；または： −６×ＳＳＣ； −デンハード［Denhard］培地、68℃。この発明の配列には、非過酷条件下、すなわち： −５×ＳＳＣ； −0.1％ＳＤＳ； −30もしくは40％、好ましくは30％ホルムアミド、42℃、において上述の配列（i）、（ii）および（iii）と反応する配列が含まれる。この発明において、“相補的配列”という用語は、“相補的”および“逆［in verse］”配列を意味する。核酸配列はＤＮＡであっても、あるいはＲＮＡであってもよい。この発明の配列は、適切な標識手段と関連付けて、核酸プローブとして用いることができる。そのような手段には、放射活性同位体、酵素、化学的もしくは化学発光マーカー、蛍光色素、ハプテン、または抗体が含まれる。このマーカーは、任意に固体支持体、例えば膜もしくは粒子、に固定することができる。このプローブ配列の５′末端に、好ましいマーカーとして、放射活性リン（³² Ｐ）が組み込まれる。この発明のプローブには、記載された核酸配列のあらゆる断片が含まれ、例えば少なくとも45個のヌクレオチド、例えば60、80または100 個以上のヌクレオチドの長さを有し得る。好ましいプローブは、ｕｒｅＡ、ｕｒｅＢ、ｕｒｅＩ、ＨＳＰＡおよびＨＳＰＢ遺伝子に由来するものである。この発明のプローブは、任意の遺伝子増幅反応後の、生物学的試料におけるヘリコバクター感染のイン・ビトロ検出に用いることができる。最も好ましくは、これらのプローブは、ヘリコバクター・フェリスもしくはヘリコバクター・ピロリ、またはその両者の検出に用いられる。いずれに用いられるかは、プローブとして選択される配列が一方もしくは他方のいずれに特異的であるか、あるいは両者にハイブリダイズすることができるのかによる。一般に、そのような検出を行なうにあたっては、ハイブリダイゼーション条件は過酷である。この発明はまた、ヘリコバクター感染のイン・ビトロ検出のためのキットであって： −請求の範囲第14項または第24項に記載のヌクレオチドプローブ； −ヘリコバクターの核酸とプローブとのハイブリダイゼーション反応を行なうための適切な培地； −形成されたあらゆるハイブリッドを検出するための試薬を包含することを特徴とするキットにも関する。この発明のヌクレオチド配列は、核酸増幅反応において、プライマーとしても機能し得る。このプライマーは、通常、上述の配列の少なくとも10個、好ましくは少なくとも18個の連続ヌクレオチドを含む。典型的な長さは、連続ヌクレオチド25ないし30個であり、100個以上もの長さであることもある。このようなプライマーは一対で用いられ、増幅される断片の５’および３’末端とハイブリダイズするように選択される。この増幅反応は、例えばＰＣＲ法を用いて行なうことができる（欧州特許出願EP 200363，201184および229701）。Ｑ−β−複製法（B iothechnology ，vol.6，Oct.1988）もまた、増幅反応において用いることができる。この発明はまた、この発明の核酸配列のいずれかを含むことを特徴とする発現ベクターにも関する。特に好ましい発現ベクターは、プラスミドｐＩＬＬ689およびｐＩＬＬ205（それぞれ、ＣＮＣＭＩ−1356およびＣＮＣＭＩ−1355）である。この発現ベクターは、通常、適切なプロモーター、ターミネーターおよびマーカー遺伝子、並びに十分な発現に必要な他の調節信号を含む。発現ベクターは、同様にこの発明の一部を形成する宿主微生物中に含まれる。これらのベクターにとって好ましい宿主は、大腸菌ＨＢ101のような大腸菌である。この発明の安定に形質転換された微生物を培養することにより、ヘリコバクターウレアーゼポリペプチド物質および、適用可能である場合には、ＨＳＰ物質を、組換え手段により生成させることができる。次いで、この蛋白様物質を収集し、精製する。この組換え物質を適切な賦形剤、アジュバントおよび、任意に、安定化剤のような他の添加剤と組合せることにより、医薬組成物が調製される。この発明の異なる側面が図中に示される：図１：ｐＩＬＬ205のトランスポゾン変異誘発および配列決定。組換えコスミドｐＩＬＬ199および組換えプラスミドｐＩＬＬ205の線形制限地図（並びに相対スケールマーカー）が示される。括弧内の数字は、クローニングベクターの１つ（それぞれ、ｐＩＬＬ575およびｐＩＬＬ570）に挿入されたＨ．フェリスＤＮＡ断片のサイズを示す。円内の“プラス”および”マイナス”記号は、ｐＩＬＬ205におけるＭｉｎｉＴｎ３-Ｋｍ［MiniTn3-Km］トランスポゾンの挿入部位に相当する。“プラス”記号は、トランスポゾンがウレアーゼの発現を不活性化しなかったことを示す。これに対して、マイナス記号はウレアーゼ発現が無効となったことを示す。文字は、定量的なウレアーゼ活性およびウレアーゼ遺伝子産生物の合成についてさらに特徴付けられた変異体クローンを示す。ｐＩＬＬ205上の構造ウレアーゼ遺伝子（ｕｒｅＡおよびｕｒｅＢ）の位置がボックスで示されており、その長さは各々のオープンリーディングフレームのサイズに比例している。矢印は転写の方向を示す。図の底部のスケールはＨｉｎｄIIIおよびＰｓｔＩ制限断片の（キロ塩基での）サイズを示している。制限部位は以下のように表わされている：Ｂ、ＢａｍＨＩ；Ｐｖ、ＰｖｕII；Ｂｇ、ＢｇｌII；Ｅ、ＥｃｏＲＩ；Ｈ、ＨｉｎｄIII；Ｃ、ＣｌａＩ；Ｐｓ、ＰｓｔＩ。括弧内の文字は、クローニングベクター起源の部位を示す。図２：Ｈ．フェリスバクテリアに対して生成したウサギポリクローナル抗血清（１：１に希釈、1000）と反応した、組換えプラスミドを有する大腸菌ＨＢ101細胞の全細胞抽出物のウェスタンブロット解析。Ａ）抽出物は：プラスミドベクターｐＩＬＬ570（レーン１）；組換えプラスミドｐＩＬＬ205（レーン２）；および遺伝子座“ａ”、“ｂ”、“ｃ”、“ｄ”および“ｅ”（レーン３−７）で分断されたｐＩＬＬ205誘導プラスミドを有する大腸菌細胞の抽出物。Ｂ）抽出物は：Ｈ．ピロリｕｒｅＡおよびｕｒｅＢ遺伝子を含む組換えプラスミドｐＩＬＬ 753（Labigne et al.，1991）（レーン１）；および遺伝子座“ｆ”、“ｇ”、 “ｈ”および“ｉ”（レーン２−５）で分断されたｐＩＬＬ205誘導プラスミドを有する大腸菌細胞の抽出物。小さな矢の頭は、Ｈ．フェリスの推定ｕｒｅＡおよびｕｒｅＢ遺伝子産生物を表わす約30および66キロダルトンのポリペプチドを示す。パネルＢにおける大きな矢の頭は、抗−Ｈ．フェリス血清と交叉反応するＨ．ピロリの対応遺伝子産生物を示す。数字は、蛋白標準の分子量（1000を単位として）を示す。図３：Ｈ．フェリス構造ウレアーゼ遺伝子のヌクレオチド配列。配列の上の数字は、２つのＵｒｅＡおよびＵｒｅＢポリペプチドの各々において、アミノ酸位置の他にヌクレオチド位置を示す。ＵｒｅＡ（ｂｐ43ないし753）およびＵｒｅＢ（766ないし2616 ）の予想されるアミノ酸配列が配列の下に示される。椎定リボソーム結合部位（シャイン−ダルガーノ配列、ＳＤ）には下線が付されている。図４：Ｈ．フェリスの構造ウレアーゼ遺伝子の配列と：ａ）Ｈ．ピロリウレアーゼの２つのサブユニット配列（Labigne et al.，1991）；ｂ）プロテウス．ミラビリス［Proteus mirabilis］の３つのサブユニットの配列（Jones and Mobley，198 9）；ｃ）タチナタマメウレアーゼの単一サブユニットの配列との比較。最良の配列（アラインメント）を確実にするために（ダッシュで示される）ギャップが導入されている。★、Ｈ．フェリス配列のアミノ酸と同一のアミノ酸；＝、種々のウレアーゼによって共有されるアミノ酸；・、ヘリコバクターウレアーゼに独特のアミノ酸。パーセンテージは、Ｈ．フェリスウレアーゼサブユニットのアミノ酸と同一のアミノ酸の数に関連する。Ｈ．ｆ．、ヘリコバクター・フェリス；Ｈ．ｐ．、ヘリコバクター．ピロリ；Ｐ．ｍ．、プロテウス・ミラビリス；Ｊ．ｂ．、タチナタマメ。図５：組換えプラスミドｐＩＬＬ689、ｐＩＬＬ685、およびｐＩＬＬ691の制限地図。これらのプラスミドの構築は、表１に詳細に記載されている。三角内のＫｍは、プラスミドｐＩＬＬ687、ｐＩＬＬ688およびｐＩＬＬ696の構築につながるカナマイシンカセットの挿入部位を表わす（表２）。地図の下のボックスは、核酸配列から推測された３つの遺伝要素、すなわちＩＳ５、ＨＳＰＡおよびＨＳＰＢの位置を示す。図６：ヘリコバクター・ピロリ熱ショック蛋白質遺伝子クラスターのヌクレオチド配列。配列の上の最初の数字はヌクレオチド位置を示し、二番目の数字は、ＨＳＰＡおよびＨＳＰＢ蛋白質の各々について、アミノ酸残基位置に数字を振ったものである。椎定リボソーム結合配列（シャイン−ダルガーノ［ＳＤ］部位）には下線が付されている。図７：ヘリコバクター・ピロリＨｓｐＡ（Ａ）またはＨｓｐＢ（Ｂ）の椎定アミノ酸配列と他のＧｒｏＥＬ様（Ａ）またはＧｒｏＥＳ様（Ｂ）蛋白質の推定アミノ酸配列との比較。アスタリスク印がついたアミノ酸は、ヘリコバクター・ピロリＨｓｐＡまたはＨｓｐＢ配列のアミノ酸と同一である。図８：大腸菌ミニ細胞におけるヘリコバクター・ピロリＨｓｐＡ熱ショック蛋白質の発現。ヘリコバクター・ピロリＨｓｐＡおよびＨｓｐＢ熱ショック蛋白質に相当する、58および13ｋＤＡの明らかな分子塊を伴う蛋白質バンドが、プラスミドｐＩＬＬ689およびｐＩＬＬ692に相当するレーンに明瞭に視認され、対照ベクター（各々、ｐＩＬＬ570およびｐＡＣＹＣ177）には見られない。図９：ヘリコバクター・フェリスｕｒｅＩ遺伝子のヌクレオチド配列および推定アミノ酸配列。図10：ヘリコバクター・フェリスおよびヘリコバクター・ピロリの、ｕｒｅＩ遺伝子のヌクレオチド配列から推定されるｕｒｅＩ蛋白質のアミノ酸配列の比較。図11：遺伝暗号。図12：一文字および三文字アミノ酸略語の意味。実施例Ｉ−Ｈ．フェリスウレアーゼ遺伝子のクローニング、発現および配列決定：パートＩの実験手順：細菌株および培養条件：Ｈ．フェリス（ＡＴＣＣ 49179）を、５％溶血ウマ血液（BioMerieux）並びに 10ｎｇｍｌ^-1のバンコマイシン（Lederle Laboralories）、2.5μｇｍｌ^-1 のポリミキシンＢ（Pfizer）、５μｇｍｌ^-1のトリメトプリム（Sigma Chemic al Co.）および2.5μｇｍｌ^-1のアンホテリシンＢ（E.R Squibe and Sons，In c．）からなる抗生補足物質で補足された血液寒天培地no.２（Oxoid）で成育させた。バクテリアを要時調製した寒天プレートで培養し、一番上に蓋を置いて、好気状態下、37℃で２−３日間インキュベートした。クローニング実験において用いられる大腸菌株ＨＢ101 （Boyer and Roulland-Dussoix，1969）およびＭＣ1061（Maniatis et al.，198 3）は、グルコース無添加ルリアブロス［Luria broth］中あるいはルリア寒天培地上において、37℃で、所定の通りに成育した。窒素−制限条件下で成育したバクテリアを、0.4％（ｗ／ｖ）Ｄ−グルコースおよび10ｍＭＬ−アルギニンを補足したアンモニア無添加Ｍ９最小培地（ｐＨ7.4）からなる窒素−制限固形培地上で継代した（Cussac et al.，1992）。ＤＮＡ操作：全ての標準ＤＮＡ操作および分析は、別に言及されない限り、Maniatis et al ．（1983）によって記述された方法に従って行われた。Ｈ．フェリスＤＮＡの単離：全てのゲノムＤＮＡはザルコシル−プロテイナーゼＫ溶解法（Labingne-Pouss el et al.，1988）により抽出した。Ｈ．フェリスを接種した12枚の血液寒天プレートを、触媒無添加の嫌気性ガスパック（ＢＢＬ70304）を用いた嫌気ジャー（ＢＢＬ）中で、37℃にて１−２日インキュベートした。プレートを15％（Ｖ／Ｖ）グリセロール−９％（Ｗ／Ｖ）ショ糖溶液50ｍｌに集め、（ソルバール［So rvall］遠心機で）5,000ｒｐｍ、４℃にて30分間遠心した。ペレットを５ｍｇｍｌ^-1リゾチームを含む、25ｍＭトリス−10ｍＭＥＤＴＡ（ｐＨ8.0）中に50 ｍＭＤ−グルコースを含む溶液0.2ｍｌに再懸濁し、ＶＴｉ65ポリアロマークイックシールチューブに移した。この懸濁液に、20ｍｇｍｌ^-1プロテイナーゼＫの溶液0.2ｍｌ及び５Ｍ過塩素酸ナトリウム0.02ｍｌを添加した。0.5ＭＥＤＴＡ−10％（Ｗ／Ｖ）ザルコシル0.65ｍｌを添加することによって細胞を溶解し、懸濁液が透明になるまで65℃にてインキュベートした（約５分間）。チューブの容量は126ｇ塩化セシウム、１ｍｌアプロチニン、99ｍｌＴＥＳバッファー（30ｍＭトリス、５ｍＭＥＤＴＡ、50ｍＭ塩化ナトリウム（ｐＨ7.5）からなる（100ｍｌ当り）塩化セシウム溶液で満たした。溶解液を18℃で15−18時間、45000ｒｐｍで遠心した。全ＤＮＡを収集し、ＴＥバッファー（10ｍＭトリス、１ｍＭＥＤＴＡ）に対して４℃で透析した。コスミドクローニング：Ｈ．フェリスに由来する染色体ＤＮＡを、既に記述されているように（Labigb e et al.，1991）、コスミドベクターｐＩＬＬ575にクローニングした。簡潔に述べると、Ｓａｕ３Ａでの部分的切断により生じたＤＮＡ断片を（10から40％）ショ糖密度勾配で分画し、次いでＢａｍＨＩで切断して、脱リン酸化したｐＩＬＬ575ＤＮＡ調製物に連結させた。コスミドをファージラムダ粒子に組込み（Ame rsham、イン・ビトロ・パッケージングキット）、大腸菌ＨＢ101への感染に用いた。ウレアーゼ発現をスクリーニングするために、カナマイシン−耐性形質導入株を、マイクロタイタープレート（Becion Dickinson）の個々のウェルに分配されている、（20μｇｍｌ^-1）カナマイシンを含む窒素−制限［mimiting］固体培地（上記参照）上にレプリカプレートした［replica-plated］。各々のウェルにウレアーゼ試薬（Hazell et al.，1987 ）0.1ｍｌを添加する前に、マイクロタイタープレートを２日間37℃で有酸素的にインキュベートした。試薬の色調変化によって37℃で５−６時間以内に尿素分解が検出された。幾つかのウレアーゼ陽性反応コスミドクローンの制限地図を作成し、そのうちの一つをサブクローニングのために選択した。Ｈ．フェリスＤＮＡのサブクローニング：コスミドＤＮＡの大規模な塩化セシウムプラスミド調製物を、部分的にＳａｕ３Ａで切断した。ＤＮＡ断片（７−11ｋｂ）をアガロースゲルから電気溶出し、フェノール−クロロホルム抽出を用いて精製した。冷却エタノールで沈殿させた後、この断片をＢｇ／III−切断プラスミドｐＩＬＬ570に連結し（Labigne et al.，1991）、その組換えプラスミドを十分な資格を有する大腸菌ＭＣ1061細胞の形質転換に用いた。スペクチノマイシン−耐性形質転換体を、窒素−過多（ルリア寒天）および窒素−制限条件下でウレアーゼ発現について選択し、かつスクリーニングした。定量性ウレアーゼ活性： 37℃で2.5日間好気的に成育した培養体を集め、0.85％（Ｗ／Ｖ）塩化ナトリウムで２回洗浄した。ペレットをＰＥＢバッファー（0.01ＭＥＤＴＡ含有0.1 Ｍリン酸ナトリウムバッファー（ｐＨ7.4））に再懸濁し、次いで30Ｗ、50％サイクルにセットしたブランソンソニファイヤーモデル450［Brnaon Sonifier model 450］を用いて30秒間の破砕を４回行なうことにより超音波処理した。細胞片は遠心によって破砕物から除いた。破砕物のウレアーゼ活性を、バースロット反応［Berthelot reaction］の変法（Cussac et al.，1992）により、ＰＥＢで調製された0.05Ｍウレアーゼ溶液中において測定した。ウレアーゼ活性は、μｍｏｌ尿素ｍｉｎ^-1ｍｇ^-1バクテリア蛋白として表現した。蛋白質測定：蛋白質濃度は、ブラッドフォードアッセイの市販品（Sigma Chemicals）で評価した。トランスポゾン突然変異：ＭｉｎｉＴｎ３−Ｋｍデリバリー系（Labigne et al.，1992）によってクローン化されたＨ．フェリス中に、無作為挿入突然変異を生じさせた。簡単に説明すると、トランスポザーゼをコードするプラスミドｐＴＣＡを含む大腸菌ＨＢ101 細胞を、クローン化Ｈ．フェリスＤＮＡを含むプラスミドｐＩＬＬ570で形質転換した。ｐＩＬＬ570誘導体プラスミドへのＭｉｎｉＴｎ３−Ｋｍエレメントの移動は接合によって行なった。その後、得られた共組込み体［cointefrates］を、高濃度のカナマイシン（500ｍｇｌ^-1）およびスペクチノマイシン（300ｍｇｌ^-1 ）の存在下で、解析された構造に対して選択した。ＳＤＳ−ＰＡＧＥおよびウェスタンブロッティング：可溶化された細胞抽出物を、4.5％アクリルアミドスタッキングゲルおよび12. 5％解析ゲルを含むスラブゲルで、レムリーの方法（Laemmli，1970）に従って分析した。電気泳動は、ミニ−スラブゲル装置（Bio-Rad）で200Ｖにて行なった。 100Ｖで１時間（冷却しながら）に設定されたミニ・トランス−ブロット・トランスファー・セル［Mini Trans-Blot transfer cell］（Bio-Rad）において、蛋白質をニトロセルロース紙に転写した（Towbin et al.，1979）。ニトロセルロースメンブランを、リン酸バッファー生理食塩水（ＰＢＳ、ｐＨ7.4）に溶解した５％（Ｗ／Ｖ）精製カゼイン（ＢＤＨ）で、室温にて２時間ブロックした（ Ferrero et al.，1992）。メンブランを、ＰＢＳで調製された１％（Ｗ／Ｖ）カゼインで希釈した抗血清で、４℃にて一晩反応させた。その後、免疫反応体を、アビジン−ペルオキシダーゼ（ＫＰＬ）と組み合わされたビオチニル化２次抗体（Kirkegaard and Perry Lab．）を用いて検出した。反応生成物を可視化するために、0.3％（Ｗ／Ｖ）４-クロロ-１-ナフトール（Bio-Rad）からなる基質溶液を用いた。ＤＮＡ配列決定：配列決定しようとするＤＮＡ断片を、Ｍ13ｍｐ18およびＭ13ｍｐ19バクテリオファージベクター（Pharmacia）中にクローニングした（Meissing and Vieira， 1982）。組換えファージＤＮＡを十分な資格を有する大腸菌ＪＭ101細胞に感染させ、Ｘ−ガル［X-gal］（５-ブロモ-４-クロロ-３-インドリル−β−Ｄ−ガラクトピラノシド）およびイソプロピル−β−Ｄ−チオガラクトピラノシドを含む培地上に塗布した。組換えファージＤＮＡに感染したバクテリアから生じたプラークを、ポリエチレングリコール処理による一本鎖ＤＮＡテンプレートの調製（Sanger et al.，1977）のために選択した。シークエナーゼキット［Sequena se kit］（United State Biochemical Corp.）を用いたジデオキシヌクレオチド・チェイン・ターミネイション法に従って、一本鎖ＤＮＡの配列を決定した。ヌクレオチド配列受託番号：ヌクレオチド受託番号［accession number］は、Ｘ69080（ＥＭＢデータライブラリー）である。パートＩ実験の結果：Ｈ．フェリス・コスミド・クローンによるウレアーゼ活性の発現：コスミドベクターｐＩＬＬ575中にＨ．フェリス染色体ＤＮＡの部分的に切断された断片（大きさが30から45ｋｂ）をクローニングした結果、約700のコスミドクローンが単離された。ウレアーゼ発現を誘発させるために、窒素−制限培地でクローンをサブカルチャーした（Cussac et al.，1992）。これらのうちの６株については、５−６時間のインキュベーションの後（実験手順の項に記載したように）ウレアーゼ−陽性になることが同定された。さらに一晩インキュベーションを行なったものの、他にウレアーゼ−陽性コスミドクローンは同定されなかった。ウレアーゼをコードするコスミドを持つ３つのクローンの制限酵素の分析により、共通の28ｋｄＤＮＡ断片が示された。両末端に共通の断片のＤＮＡ領域を有するコスミド（消化されたｐＩＬＬ199）を、サブクローニングのために選択した。大腸菌細胞中へのクローニングの際に、ウレアーゼ発現に必要とされるＨ．フェリス遺伝子の同定：大腸菌細胞におけるウレアーゼ発現に対して必要な最小ＤＮＡ領域を明らかにするために、ウレアーゼをコードするコスミドｐＩＬＬ199をＳａｕ３Ａで部分的に切断し、その断片をプラスミドｐＩＬＬ570にサブクローニングした。この形質転換株を窒素−過多および窒索−制限培地でサブカルチャーし、ウレアーゼ陽性表現型についてスクリーニングを行なった。窒素−制限状態下で成育した場合には、５つの形質転換導入株がウレアーゼ活性を発現した。一方、窒素−過多培地での成育の後には活性は検出されなかった。制限マッピング分析により、ウレアーゼをコードするプラスミドは７ないし11ｋｂのインサートを含んでいることが示された。ｐＩＬＬ205と呼ばれるプラスミドが、さらなる実験のために選ばれた。大腸菌におけるウレアーゼ発現に対して必須である推定領域を調べるために、かつウレアーゼ構造遺伝子を含むクローン化ＤＮＡ領域を局在化するために、クローン化Ｈ．フェリスＤＮＡの無作為突然変異を行なった。このため、ＭｉｎｉＴｎ３−Ｋｍエレメント（Labigne et al.，1992）を用いて、プロトタイププラスミドｐＩＬＬ205の無作為挿入突然変異を発生させた。ｐＩＬＬ205の各々の突然変異コピーについて挿入の部位をマップし、これらのプラスミドを持つ細胞をウレアーゼ活性に対して定性的に分析した（図１）。（“ａ” ないし“ｉ”と呼ばれる）ｐＩＬＬ205の突然変異誘導体を持つ大腸菌ＨＢ101細胞の選択は、ウエスタンブロッティングによる椎定ウレア−ゼサブユニットの検出の他に、定量的なウレアーゼ活性の決定にも用いられた。ｐＩＬＬ205を有する大腸菌ＨＢ101細胞のウレアーゼ活性は、1.2±0.5μｍｏｌ尿素ｍｉｎ^-1ｍｇ^-1バクテリア蛋白であった（表１）。これはクローニングに用いられた親Ｈ．フェリス株の活性の約５分の１である。“ａ”、“ｃ”、“ｄ ”、“ｆ”および“ｇ”の位置へのトランスポゾンの挿入は陰性の表現型となり、一方“ｂ”、“ｅ”、“ｈ”および“ｉ”の位置での突然変異は、これらの突然変異したｐＩＬＬ205のコピーを有するクローンのウレアーゼ活性には重大な影響は与えなかった。このように、ＭｉｎｉＴｎ３−ＫｍエレメントでのｐＩＬＬ205の突然変異により、大腸菌細胞におけるＨ．フェリスウレアーゼ遺伝子発現に必要な３つのドメインが同定された。Ｈ．フェリスウレアーゼ構造遺伝子の局在：ｐＩＬＬ205を有する大腸菌細胞の抽出物のウエスタンブロット分析により、ポリクローナルＨ．フェリスウサギ抗体と交叉反応する約30および66ｋＤａの２つのポリペプチドの存在が示された（図２Ａ）。これらの蛋白質は、ベクター（ｐＩＬＬ570）を有する細菌によっては生産されなかった。本来のＨ．フェリスウレアーゼは、算出分子量30および69ｋＤａの繰り返しモノマーサブユニットからなることが報告されている（Turbett et al.，ターべットら、1992）。このため、30および66ｋＤａ蛋白は、各々ｕｒｅＡおよびｕｒｅＢ遺伝子産生物に対応するものと思われた。興味深いことに、ヘリコバクター・ピロリｕｒｅＡおよびｕｒｅＢ遺伝子を含む組換えプラスミドｐＩＬＬ763を有する大腸菌細胞の抽出物（Cussac et al.，1992）は、抗-Ｈ．フェリス抗体と交叉反応する約30および62ｋＤａの分子サイズを有する２つのポリペプチドを発現した（図２Ｂ）。ｐＩＬＬ205の突然変異誘導株を持つクローンは、１株の例外を除いて全てが、ｕｒｅＡおよびｕｒｅＢ遺伝子産生物を発現した（図２Ａ，Ｂ）。幾つかの変異株（すなわち“ｃ”、“ｄ”、“ｆ”および“ｇ”変異株）ではウレアーゼサブユニットは合成されるものの、活性酵素は産生されなかったことから、ウレアーゼ活性発現に必須の補助機能がトランスポゾン挿入により破壊されていた可能性が推測できる。対照的に、ｐＩＬＬ205::ａと呼ばれる変異体は、ｕｒｅＢ産生物を産生せず、ウレアーゼ陰性であった。したがって、トランスポゾン挿入部位はｕｒｅＢ遺伝子に局在しているものと椎定された。Ｈ．フェリスウレアーゼの構造ポリペプチドをコードする潜在的なオープンリーディングフレームを明らかにするために、挿入部位“ａ”に対応するＤＮＡ領域の配列決定分析を行なった。Ｈ．フェリス構造ウレアーゼ遺伝子の配列決定分析：トランスポゾン挿入部位“ａ”に隣接したＨ．フェリスＤＮＡの2.4ｋｂ領域の配列決定分析により、同じ方向に転写されるｕｒｅＡおよびｕｒｅＢと呼ばれる２つのオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）が同定された（図３）。トランスポゾンはｕｒｅＢの末端から240ｂｐ上流に局在していることが確かめられた。両方のＯＲＦはＡＴＧ開始コドンで始まり、大腸菌コンセンサス・リボゾーム結合配列に類似する部位が先行する（Shine and Dalgarno，1974）。これらのＨ．フェリス構造遺伝子間に介在する遺伝子［intergenic space］は３つのコドンからなっており、それらは隣接するオープンリーディングフレームと同位相である。すでにヘリコバクター・ピロリに対するｃａｓ（Labigne et al.，1991）において観察されているように、これはｕｒｅＡ遺伝子の停止コドンにおける単一突然変異により、理論的には融合した単一ポリペプチドが生じるであろうということを示唆している。Ｈ．フェリスｕｒｅＡおよびｕｒｅＢ遺伝子は各々26074ｋＡおよび61663Ｄａの算出分子量を有するポリペプチドをコードしており、Ｈ．ピロリのｕｒｅＡおよびｕｒｅＢ遺伝子産生物とアミノ酸配列レベルで高い類似性を示している。２つのヘリコバクター種の対応するｕｒｅＡおよびｕｒｅＢ遺伝子産物間の同一性の程度は、各々73.5％および88,2％であると計算された。アミノ酸配列情報によると、Ｈ．フェリスおよびＨ．ピロリのｕｒｅＡおよびｕｒｅＢポリペプチドの推定分子量（Labigne et al.，1991）は、非常に類似している。それにもかかわらず、ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動を行なった場合には、Ｈ．フェリスのｕｒｅＢ産生物はヘリコバクター・ピロリの対応する遺伝子産生物よりも移動度が低かった（図２Ｂ）。 II−ヘリコバクター・ピロリｈｓｐＡ−Ｂ熱ショック遺伝子クラスター：ヌクレオチド配列、発現及び機能：ヘリコバクター・ピロリのウレアーゼ（ニッケル金属酵素）と密接な関連があると報告されたＧｒｏＥＬクラスの熱ショック蛋白質（ＨＳＰ）の相同体が、最近になってDunnらとEvansらによりＨ．ピロリの細胞から精製された（それぞれ Infect．Immun.，60:1946，1992，1946及び2125参照）。この免疫学的に優勢な［immunodominant］蛋白質の報告されたＮ末端のアミノ酸配列に基づき、Ｈ．ピロリ85Ｐ株の染色体中のＧｒｏＥＬ様蛋白質をコードする遺伝子（ｈｓｐＢ）を標的とするために、変性オリゴヌクレオチドを合成した。遺伝子増幅の後、ＨｓｐＢ蛋白質の初めの36アミノ酸をコードする108塩基対断片を精製し、プローブを用いてＨ．ピロリ・ゲノムバンク［genomic bank］中でＨｓｐＢをコードしている全遺伝子をもつ組換えコスミドを同定した。ｈｓｐＢ遺伝子はｐＩＬＬ684 コスミドの3.15キロベース（Kb）のＢｇｌII制限酵素切断断片に存在した。ｐＩＬＬ570プラスミドベクター（ｐＩＬＬ689）にサブクローニングされたその断片の塩基配列により、ｈｓｐＡ及びｈｓｐＢと命名された２つのオープンリーディングフレーム（ＯＦＲ）の存在が明らかにされ、その構成は他の細菌種におけるｇｒｏＥＳＬバイシストロン性オペロン［bicistronic operons］と非常に類似したものであった。ｈｓｐＡ及びｈｓｐＢはそれぞれ118及び545アミノ酸のポリペプチドをコードしており、それぞれ13.0キロダルトン（ｋＤａ）及び58.2ｋＤａの分子量に相当する。アミノ酸配列の比較研究により以下のことが明らかとなった。ｉ）Ｈ．ピロリのＨｓｐＡ及びＨｓｐＢ蛋白質はそれらの細菌の相同物に非常に類似していた；ii）Ｈ．ピロリのＨｓｐＡ蛋白質は他の細菌のＧｒｏＥｓ相同物にはないカルボキシル基末端での顕著なモチーフを特徴とする；この独特なモチーフは、ニッケル結合のような金属結合ドメインに似た、一連の８個のヒスチジン残基からなる。驚くべきことに、この遺伝子クラスターのすぐ上流にＩＳ５挿入エレメントが見いだされた。それはＨ．ピロリのゲノムには存在せず、コスミドクローニングの過程で積極的に選択されたものであった。そのＩＳ５はｐＩＬＬ689内でｈｓｐＡ及びｈｓｐＢ遺伝子の発現に関連していることが見いだされた。ｐＩＬＬ689プラスミドからのＨｓｐＡ及びＨｓｐＢ蛋白質の発現は、ミニ細胞生産株にて分析された。両ポリペプチドは大腸菌細胞内で構成的に発現されることが示された。ｐＩＬＬ689組換え体プラスミドがＨ．ピロリウレアーゼ遺伝子クラスターと共に大腸菌宿主株に導入されると、ウレアーゼ活性の増加が観察された。これは熱ショック蛋白質とウレアーゼ酵素との間の密接な相互作用を示唆している。ＨｓｐＡシャペロンに関する特異的な機能の概念を支えているのは、ｈｓｐＢのコピーがＨ．ピロリゲノム内では１つだけ見い出される一方で、ｈｓｐＡのコピーはゲノム内に２つ見い出され、その内の１つはｈｓｐＢ遺伝子に連結し、もう１つはｈｓｐＢ遺伝子に連結していないという事実である。ｈｓｐＡ及びｈｓｐＢ遺伝子に関して同遺伝子型のＨ．ピロリ変異株を構築する試みは不成功に終わり、このことはこれらの遺伝子が細菌の生存に関して必須であることを示唆する。パートIIIの実験手順：細菌の株、プラスミド、及び培養条件：クローニング実験はＨ．ピロリ85Ｐ株から調製されたゲノムＤＮＡを用いて行なった。Ｈ．ピロリＮ６株は、それらが好都合な形質転換能をもつという理由からエレクトロポーレーション実験の受容株として用いた。大腸菌ＨＢ101株もしくは大腸菌ＭＣ1061株はそれぞれコスミドクローニング及びサブクローニングの実験用宿主として用いた。大腸菌Ｐ678- 54株はミニ細胞の調製に用いた。本研究において用いたベクター及び組換えプラスミドを表１に示した。Ｈ．ピロリ株は、バンコマイシン（10ｍｇ／ｌ）、ポリミキシンＢ（2,500Ｕ／Ｉ）、トリメトプリム（５ｍｇ／ｌ）、及びアンホテリシンＢ（４ｍｇ／ｌ）を補足したウマ血液寒天培地上で生育させた。プレートはＣＯ₂発生器［carbon dioxide generator envelope］（ＢＢＬ70304）を備えた嫌気性ジャー内で微好気性条件下、37℃にてインキュベートした。大腸菌株はグルコース無添加のＬ−ブロース中（１Ｌ中に10ｇのトリプトン、５ｇの酵母抽出物及び５ｇの塩化ナトリウム；ｐＨ7.0）、もしくはＬ−寒天培地（1.5％寒天）上で37℃にて生育させた。ウレアーゼ活性測定のために用いられた窒素制限培地は、炭素源として0.4％Ｄ−グルコースを含み、新しく調製され、かつ濾過滅菌したＬ−アルギニンが最終濃度10ｍＭになるように加えられた、アンモニウムフリーのＭ９最小寒天培地（ｐＨ7.4）よりなる。組換え体クローンの選択のための抗生物質の濃度は以下のとおりである（１Ｌ中のミリグラム）：カナマイシン、20；スペクチノマイシン、100；カーベニシリン、100。ＤＮＡの調製：Ｈ．ピロリ由来のゲノムＤＮＡは、従来記述されているようにして調製した。コスミドＤＮＡとプラスミドＤＮＡは、アルカリ溶菌法により調製し、引き続いて従来記述されているセシウムクロライド−臭化エチジウム勾配により精製した。コスミドクローニング：Ｈ．ピロリｈｓｐＡ−Ｂ遺伝子クラスターのクローニングに用いられた、大腸菌ＨＢ101内でのＨ．ピロリ85Ｐのコスミド遺伝子バンクの構築は以前に示された通りである。ＤＮＡ分析及びクローニング手法：制限エンドヌクレアーゼ、Ｔ４ＤＮＡライゲース、ＤＮＡポリメラーゼＩ大（クレノウ）フラグメント及びＴａｑポリメラーゼはAmershamから購入し、Ｔ４ＤＮＡポリメラーゼはBiolabsから、及びコウシ腸ホスファターゼ［calf int estinal phosphatase］はpharmaciaから購入した。全ての酵素は製造者の指示に従って用いた。ＤＮＡ断片はトリス酢酸緩衝液の存在下で泳動させるアガロースゲル上で単離した。Bethesda Research Laboratoriesから入手した１ｋｂのラダーを断片サイズ標準として用いた。必要な場合には、ＤＮＡ断片は、従来記載されるようにアガロースゲル上から電気溶出により単離し、イルティップデー・ミニカラム［Elutip-d minicolum］（Schleicher and Schuell，Dassel，ドイツ）により移動緩衝液［migration buffer］から回収した。基本的なＤＮＡ操作はSa mbrookらによって記述されたプロトコルに従って行なわれた。ハイブリダイゼーション：Ｈ．ピロリ・コスミド・バンクのスクリーニング及びサブクローンの同定のためのコロニーブロットは、Sambrookら（43）のプロトコルに従い、ニトロセルロースメンブラン（Schlecher and Schuell，Dassel,ドイツ）上で調製した。ＰＣＲ産物の放射活性標識は、ファルマシア社のランダムヘキサマーをプライマーとして用い、ランダムプライミング［random Priming］により行なった。コロニーハイブリダイゼーションは非常に厳しい条件下で行なった（５×ＳＳＣ、0.1％ＳＤＳ、50％ホルムアミド、42℃）（１×ＳＳＣ；150ｍＭ塩化ナトリウム、15ｍＭクエン酸ナトリウム、ｐＨ7.0）。サザンブロットハイブリダイゼーションのために、ＤＮＡ断片をアガロースゲルからニトロセルロースシートへ転写し（0.45μｍポアサイズ；Schleicher & Schuell，Inc.）、そしてあまり厳しくない条件下（５×ＳＳＣ、 0.1％ＳＤＳ、30％もしくは40％ホルムアミド、42℃）で、³²ｐ標識されたデオキシリボヌクレオチドプローブを用いてハイブリダイズした。ハイブリダイゼーションはアマシャム・ハイパーフィルム −ＭＰ［Amersham Hyperfilm-MP］を用い、オートラジオグラィーにより示された。ＤＮＡ配列決定：プラスミドＤＮＡの適当な断片をＭ13ｍｐ18/19ベクターにサブクローニングした。一本鎖のＤＮＡを大腸菌ＪＭ101株のファージ感染により調製した。配列決定は、ユナイテッドステーツバイオケミカルシークエナーゼキット［United S tates Biochemicals Sequenase kit］を用い、ジデオキシヌクレオチド鎖終結法により行なった。Ｍ13ユニヴァーサルプライマー［M13 universal primer］と補助的な特異的プライマーの両方（図１）を、コーディングおよびノンコーディングＤＮＡ鎖の双方の配列決定に用いた。二本鎖ＤＮＡの配列決定は従来記述される通りに行なった。ＰＣＲ産物の直接配列決定［direct sequencing］を、増幅し、電気溶出したＰＣＲ産物をイルティップデー・ミニカラム（Schleicher and Schuell）に通して精製した後に行なった：シークエナーゼ・キットを用いる配列決定の伝統的なプロトコルは、以下の改良を加えてから用いられた：ＰＣＲ産物は、プライマーとして200ピコモルのオリゴヌクレオチドを含み、最終濃度を１％とするＤＭＳＯを含むアニーリング混合物を３分間煮沸することにより変性した；その混合物はすぐに氷上で冷却した；標識工程はマンガンイオン（ｍＭ）の存在下で行なった。Ｈ．ピロリのエレクトロポーレーション：Ｈ．ピロリ変異株構築のための試みにおいて、カナマイシン耐性遺伝子（ａｐｈ３′-III）を含むカセットで分断された標的遺伝子を持つ適当なプラスミド構造物で、従来記載されているエレクトロポーレーション手法により、Ｈ．ピロリＮ６株を形質転換した。ｆｌａＡ遺伝子で分断されたカナマイシンをもつプラスミドｐＳＵＳ10をエレクトロポーレーションのポジティブコントロールとして用いた。エレクトロポーレーションの後、抗生物質耐性を発現させるためバクテリアを非選択プレートにて48時間生育し、その後カナマイシン含有プレートへ移した。選択プレートは６日目までインキュベートした。ポリメラーゼ．チェイン・リアクション（ＰＣＲ）：ＰＣＲは、パーキンエルマー・シータス・サーマルサイクラー［Perkin-Elmer Cetus thermal cycler］を使用したジーンアンプキット［GeneAmp kit］（Perk in-Elmer cetus）を用いて行なった。伝統的な増幅反応は、50ピコモルの各プライマーと少なくとも５ピコモルの標的ＤＮＡを包含する。標的ＤＮＡは増幅反応に加える前に熱変性させた。反応は以下に示す３つの工程の25サイクルから構成された：変性（94℃、１分間）、アニーリング（算出されたプライマーの融解温度［melting temperatures］により、42℃から55℃の範囲の温度で、２分間）、伸長（72℃、２分間）。変性されたオリゴヌクレオチドを厳しくない条件下で用いた場合には、それぞれのオリゴヌクレオチドは1000ピコモルまで加え、50サイクル実行し、アニーリングは42℃で行なった。ミニ細胞内で発現した蛋白質の分析：適当なハイブリッドプラスミドを有するミニ細胞を単離し、［³⁵Ｓ］メチオニン（50μＣｉ／ｍｌ）で標識した。アセトン沈殿性物質約100,000ｃｐｍを12.5 ％のゲルでドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）−ポリアクリルアミドゲル電気泳動にかけた。94,000から14,000までの範囲の分子量をもつ標準蛋白質（Bio-Rad Laboratories社の低〈分子量キット［low〈molecular-weights kit］）を並行に流した。ゲルを染色し、En³Hance（New England Nuclear）を用いて蛍光間接撮影法により検査した。ウレアーゼ活性：ウレアーゼ活性は従来記載されている手法で修正を加え、ベルテロット［Bert helot］反応により定量した。ウレアーゼ活性は細菌の蛋白質のミリグラム当り、１分間に加水分解される尿素のマイクロモルとして示した。パートII実験の結果：ヘリコバクター・ピロリのＧｒｏＥＬ様熱ショック蛋白質をコードする遺伝子を持つ組換え体コスミドの同定：Ｈ．ピロリの精製熱ショック蛋白質の公表されたＮ末端のアミノ酸配列を基に、２つの変性されたオリゴヌクレオチドを、Ｈ．ピロリ85Ｐ株の染色体中の目的の遺伝子を標的とするために合成した。初めの１つは5′-GCNAARGARATHAA RTTYT CNG-3′である。ここでＮは４つのヌクレオチドを表し、ＲはＡとＧを、ＹはＴとＣを、ＨはＴ、Ｃ及びＡを表す。このオリゴヌクレオチドは蛋白質（AKEIKFSD ）の初めの８アミノ酸に由来する；２番目は5′-CRTTNCKNCCNCKNGGNCCCAT-3′であり、ＫはＧとＴを表わす。このオリゴヌクレオチドは29番目から36番目のアミノ酸（MGPRGRNV，参照）を指定する相補的なコドンに相当する。ＰＣＲ産物について期待される大きさは108塩基対（ｂｐ）であった。増幅反応は、“材料と方法”の項で示された、あまり厳しくない条件下で行なわれ、400ｂｐから100ｂｐまでの範囲の大きさを持つ６つの断片が合成された。３つの最も小さな断片をアクリルアミドゲルから電気溶出し、精製した。ＰＣＲ産物の直接配列決定により、公知の配列に相当するアミノ酸をコードするＤＮＡ断片の同定が可能となった。そこで、この断片を標識し、Ｈ．ピロリのＧｒｏＥＬ様蛋白質をコードする遺伝子の５′部分と相同性を示す組換え体コスミドを同定するために、コロニーハイブリダイゼーションにおけるプローブとして用いた；さらにこの遺伝子はｈｓｐＢと名付けられた。遺伝子バンクは、組換え体コスミドを持つ400個の独立したカナマイシン耐性大腸菌形質導入体からなる。それらのうち、１つの単一コロニーがプローブとハイブリダイズした。それはｐＩＬＬ684と命名された組換えプラスミドを持ち、その大きさは46ｋｂであった。ｈｓｐＢ遺伝子を検出する際に見られた低い頻度（400分の１）は、幾つかのクローン化された遺伝子が一貫して５から７個の組換え体コスミドで検出されるのと比較すると異常なものであった。ｈｓｐＢ遺伝子を同定するために、３ｋｂから４ｋｂまでの大きさを持つ断片をエンドヌクレアーゼＳａｕ３ＡによるｐＩＬＬ684コスミドＤＮＡの部分制限により生成させ、精製し、プラスミドベクターｐＩＬＬ570のＢｇｌII部位に連結した。100個のサブクローンのうち、ｘがポジティブクローンであった。このうち１つをさらに研究した（ｐＩＬＬ 689）；それは両側に２つのＢｇｌII制限酵素サイトを従える3.15ｋｂのインサートを持ち、その部分は詳細にマップされた（図５）。³²Ｐ標識されたプローブを用いてＰＣＲを行なうことにより、ｈｓｐＢ遺伝子の５′末端がｐＩＬＬ689 の632bｐのＨｉｎｄIII−ＳｐｈＩ中央制限酵素断片に存在することが見い出された。これは、ｐＩＬＬ689組換え体プラスミドにおけるｈｓｐＢの全遺伝子の存在が期待できることを示している。Ｈ．ピロリのｈｓｐＡ−Ｂ遺伝子クラスターのＤＮＡ配列及びそれにより推定されたアミノ酸配列：図５で示された3200ｂｐのｐＩＬＬ689は、非対称的な制限酵素断片であるＢｇｌII−ＳｐｈＩ、ＳｐｈＩ−ＨｉｎｄIII、ＨｉｎｄIII−ＢｇｌIIをＭ13ｍｐ 18及びＭ13ｍｐ19にクローニングすることにより配列決定した：それぞれのクローン化された断片は二本鎖のそれぞれで別々に配列決定した。16個のオリゴヌクレオチドプライマー（図１）を、解読の確認をするため、及び／または別々に配列決定された断片をオーバーラップする配列を作製するために合成した；これらは二本鎖ＤＮＡの配列決定分析におけるプライマーとして用いた。配列の分析により、２つの明確な遺伝子的な因子が明らかにされた。第１は、図５に示される同じ方向に転写される２つのオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）の存在である。それらはｈｓｐＡ及びｈｓｐＢと命名された；この２つのＯＲＦのヌクレオチド配列とそれにより予測されるアミノ酸配列を図６に示す。ｈｓｐＡの第一番目のコドンはｐＩＬＬ68９のＨｉｎｄIIIの左方向323ｂｐ上流で始まる（図５）。そしてそれはシャイン−ダルガーノ・リボゾーム結合部位（ＲＢＳ）（GGAGAA）により先導されている。ｈｓｐＡＯＲＦは118アミノ酸のポリペプチドをコードしている。ｈｓｐＢＯＲＦの初めのコドンはｈｓｐＡ終始コドンの25塩基下流で始まる；それはＲＢＳ部位（AAGGA）により先導されている。ｈｓｐＢＯＲＦは545アミノ酸のポリペプチドをコードしており、ＴＡＡコドンにより終了し、さらにｒｈｏ−独立［rho-inde pendent］転写ターミネーター（自由エネルギー、△Ｇ＝−19.8Ｋｃａｌ／ｍｏｌ）に類似したパリンドローム配列が続く（図６）。予測されるＨｓｐＢ蛋白質のＮ末端のアミノ酸配列は、既に公知である精製されたＨ．ピロリの熱ショック蛋白質のＮ末端配列と、Ｎ末端のメチオニンを除いては同一であった。そのメチオニンは精製された蛋白質には欠けており、転写後に除去されるのかもしれず、その結果成熟蛋白質は544個のアミノ酸よりなる。Ｈ．ピロリＨｓｐＡ及びＨｓｐＢの推定されるアミノ酸配列をＧｒｏＥＳ及びＧｒｏＥＬクラスのＨｓｐの幾つかのアミノ酸配列と比較した（図７）。ＨｓｐＢはアミノ酸レベルでレジオネラ．ニュウモフィラ［Legionella pneumophila］ＨｔｐＢ蛋白質（82.9％の類似性）、大腸菌ＧｒｏＥＬ蛋白質（81.0％の類似性）、クラミジア・プシタッキ［Chlamydia Psittaci］もしくはＣ．トラコマティス［C．trachomatis］のＨｙｐＢ蛋白質（79.4％の類似性）、クロストリジウム・パーフリンゲンス［Clostridium perfringens］のＨｓｐ60蛋白質（80.7％の類似性）との間で高い相同性を示し、マイコバクテリアのＧｒｏＥＬ様蛋白質に対してはこれらよりは低い類似性を示した。しかしながら、ほとんど全てのＧｒｏＥＬ相同体と同様に、Ｈ．ピロリＨｓｐＢは、最近になって大腸菌ＧｒｏＥＬシャペロニン内で必須ではないことが示された、カルボキシル基末端のグリシン −メチオニンモチーフ（MGGMGGMGGMGGMM）を保存していることを示した。Ｈ．ピロリＨｓｐＡ蛋白質と他のＧｒｏＥＳ様蛋白質との間の、アミノ酸レベルでの相同性の程度を図７に示す。示された配列は、Ｈ．ピロリＨｓｐＡ蛋白質のカルボキシルキ末端では他の細菌のＧｒｏＥＳ相同体には欠如している顕著なモチーフが特徴的であることを示している。この独自に高度に保存されたモチーフは、２つの２重のシステイン残基の間でループを形成することができる、27個の付加的なアミノ酸より構成されている；27個のアミノ酸のうち、８個はヒスチジン残基であり、それらは金属結合ドメインを強く示唆する。配列決定分析により明らかにされた第２の遺伝子的な因子は、ｈｓｐＡ遺伝子の84ｂｐ上流での挿入配列（ＩＳ５）の存在であった。このエレメントの核酸配列は、ＩＳ５に隣接する２つの逆方向反復配列のうちの１つに相当する16個の核酸配列（CTTGTTCGCACCTTCC）が存在する点において、大腸菌内のＩＳ５に関して従来記載されているものと完全に一致していた。ＤＮＡレベルで完全に一致したことから、我々はこのＩＳ５はＨ．ピロリ染色体に初めから存在していたものでなく、むしろクローニング過程でｈｓｐＡ−ＨｓｐＢ遺伝子クラスターの上流に挿入されたものと推測した。ただし、この仮説はさらなる分析により確かめられる必要がある。Ｈ．ピロリ染色体中のｈｓｐＡ−Ｂ遺伝子クラスターの上流配列の同定：ｉ）Ｈ．ピロリ85Ｐ株の染色体中、ii）初めのコスミドｐＩＬＬ684中、及びi ii）ｐＩＬＬ684組換え体コスミドのＳａｕ３Ａ部分的制限酵素分解の結果生じた100個のサブクローン中の推定配列を標的とするために、２つのオリゴヌクレオチドを用いた遺伝子増幅によりＩＳ５の存在を検査した。その２つのオリゴヌクレオチドの１つはＩＳ５エレメントの内部に存在するもので、もう１つはＩＳ５エレメントの下流に存在するものである（オリゴ♯１及び♯２、図６）。ＩＳ５はＨ．ピロリの染色体には存在せず、コスミドｐＩＬＬ684を有する大腸菌株のごく初期のサブカルチャー中に存在していた。ＩＳ５配列の全部もしくは一部を含んでいると推定される100個のｐＩＬＬ684サブクローン誘導体において、我々はＩＳ５の左末端に加えて、元来のｈｓｐＡ−ｈｓｐＢ遺伝子クラスターの上流配列を探した。このスクリーニングは、Ｓａｕ３Ａで部分的に生成した異なるサブクローンの制限酵素分析をすることにより行なった。これらの基準を満たしているプラスミドの１つ（ｐＩＬＬ694）の制限酵素地図を図５に示す。ＩＳ５の左末端側のヌクレオチド配列を決定した；ＩＳ５エレメントの16ｂｐの逆方向反復配列の両端における４ｂｐの重複CTAAの存在（図６）により、我々は、ＩＳ５エレメントは転移により最近取り込まれたことを確信することができた。その後、ＩＳ５エレメントのすぐ上流に位置する245個のヌクレオチド配列を決定した（図６に示す）。この配列は非コード領域からなり、その中には推定される共通の熱ショックプロモーター配列［heat shock promoter sequence］の存在が検出された；そこには完全に保存された-35領域（TAACTCGCTTGAA）と、より一致の程度が低い-10 領域（CTCAATTA）が存在した。組換え体コスミド中に存在するＩＳ５エレメントの両端に位置する配列に対応する２つのオリゴヌクレオチド（図２に示される♯３と♯４）を合成した；これらの２つのオリゴヌクレオチドは、ＩＳ５配列が存在する場合にはXXXXｂｐの断片を増幅させるはずであり、ＩＳ５が存在しない場合にはある断片を増幅させるはずである。標的ＤＮＡとしてｐＩＬＬ684コスミド、ｐＩＬＬ694プラスミド、及びＨ．ピロリ85Ｐ株染色体を用いたＰＣＲ反応の結果は予測に適合した（結果は記載せず）。さらにＨ．ピロリ染色体から得られたＰＣＲ産物の直接配列決定を行ない、図６（Ｂ）に示される再構築されたｈｓｐＡ−ｈｓｐＢ上流配列を確認した。配列決定された全ての領域の遺伝子構成をさらに確認にするために、オリゴヌクレオチドの♯５及び♯ ６、並びに♯７及び♯８（図６）を用い、プラスミドｐＩＬＬ689の遺伝子を増幅することにより２つのプローブを調製した；それらを、Ｈ．ピロリ85Ｐ株染色体のＨｉｎｄIII制限酵素消化物に対するあまり厳しくない条件下でのサザンハイブリダイゼーション実験において、プローブとして用いた。その結果、クローニング過程において検出可能な転位は他には存在しないことが明らかとなった（データは記載せず）。これらの実験により、Ｈ．ピロリ85Ｐ株の染色体中にｈｓｐＢ遺伝子のコピーは１つしか存在しないのに対して、サザンハイブリダゼーションによりｈｓｐＡ遺伝子の２つのコピーが検出されることを我々は示し得た。ミニ細胞中で発現するポリペプチドの分析：ｐＩＬＬ689組換えプラスミドとｐＩＬＬ692組換えプラスミド及びそれぞれのクローニングベクターｐＩＬＬ570とｐＡＣＹＣ177を、形質転換により、ミニ細胞生産株である大腸菌ｐ678-54に導入した。ｐＩＬＬ689 とｐＩＬＬ692プラスミド（図５）は、２つのベクターにクローン化された、同じ3.15ｋｂのインサートを有する。ｐＩＬＬ570はポリクローニングサイトの上流に転写及び翻訳の終結点をもつ；ｐＩＬＬ689内でのインサートの向きは、転写の終結点がＩＳ５断片の上流に位置し、従ってｈｓｐＡ及びｈｓｐＢ遺伝子の上流に位置するように作製された。見かけ上の分子量が60ｋＤａと14ｋＤａであるポリペプチドと同様に泳動した２つのポリペプチドがミニ細胞実験においてｐＩＬＬ689及びｐＩＬＬ692から明らかに検出されたが（結果は示さず）、一方それらは当該ベクターからは検出されなかった；これらの結果により、ｈｓｐＡ及びｈｓｐＢ遺伝子はＩＳ５エレメント内に位置するプロモーターから構造的に発現していることが示された。さらに、ＳＤＳゲル上で視認されたポリペプチドの量はそれぞれのベクターのコピー数に十分に一致していたが、一方で、２つのポリペプチドのバンドの強度は２つの遺伝子のポリシストロン性転写［polycistro nic transcription］を示唆していた。ＨｓｐＡ及びＨｓｐＢ蛋白質の役割を理解するための試み：プラスミドｐＩＬＬ686及びプラスミドｐＩＬＬ691のｈｓｐＡ遺伝子もしくはｈｓｐＢ遺伝子内に、従来記述されているＫｍカセットを挿入することにより、大腸菌内で、遺伝子を２箇所で分断した。これは、エレクトロポーレーションによりＨ．ピロリ内で分断された遺伝子を元に戻すため、そして対立遺伝子の置換に関して選択するために行なった。結果として生じたｐＩＬＬ696プラスミドは、Ｃ末端のアミノ酸配列の欠失に相当する、一部が欠けた形態のＨｓｐＡ蛋白質をコードしていた；そのプラスミドにおいて、Ｋｍカセットは、Ｋｍ遺伝子のプロモーターがｈｓｐＢの下流遺伝子のプロモーターとして働くような方法で挿入された。ｐＩＬＬ687プラスミドとｐＩＬＬ688プラスミドは、ｈｓｐＢ遺伝子内でＫｍカセットをいずれかの向きで挿入することにより生じた。精製されたｐＩＬＬ687プラスミド、ｐＩＬＬ688プラスミド及びｐＩＬＬ696プラスミド（表２、図５）をエレクトロポーレーション実験に用いた際には、これらのどの構築物からも、Ｈ．ピロリＮ６株のカナマイシン形質転換株を単離することはできなかった。一方ポジティブコントロールとして用いられたｐＳＵＳ10プラスミドでは常に単離することができた。これらの結果により、Ｈ．ピロリのＨｓｐＡ及びＨｓｐＢ蛋白質はＨ．ピロリの生存に必須の蛋白質であることが示唆された。ｉ）文献におけるＨｓｐＢ蛋白質とウレアーゼサブユニットとの密接な関連性についての一定の記述；ii）ニッケル結合ドメインを連想させるＣ末端配列を有するＨｓｐＡ蛋白質の独特な構造；及びiii）Ｈ．ピロリの視認可能なｈｓｐＡ及びｈｓｐＢ変異株が存在しないことのため、我々は大腸菌内での機能相補実験により、Ｈ．ピロリのウレアーゼとの関係におけるＨ．ピロリのＨｓｐ蛋白質の役割を示すことを試みた。ウレアーゼ遺伝子クラスターをコードしているプラスミドｐＩＬＬ763もしくはプラスミドｐＩＬＬ753（両方ともｐＩＬＬ570の誘導体、表２）を、ミニ細胞内で視認されるように構造的にＨｓｐＡ及びＨｓｐＢポリペプチドを発現する共存可能なｐＩＬＬ692プラスミド（ｐＡＣＹＣ177誘導体）と共に導入した。どちらの相補実験においても、同じ大腸菌内でＨｓｐＡ及びＨｓｐＢ蛋白質が発現することにより、制限された窒素源として10ｍＭ L-アルギニンが添加された最小培地で、ウレアーゼ遺伝子の誘導に引き続いてウレアーゼ活性が３倍以上増加することが観察された。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号庁内整理番号ＦＩＣ１２Ｎ 1/21 8828−4ＢＣ１２Ｎ 1/21 9/80 9152−4Ｂ 9/80 ＺＣ１２Ｐ 21/08 9358−4ＢＣ１２Ｐ 21/08 Ｃ１２Ｑ 1/68 9453−4ＢＣ１２Ｑ 1/68 Ａ //(Ｃ１２Ｎ 9/80 Ｃ１２Ｒ 1:19） (72)発明者シュールボーム、セバスチャンフランス国、75116 パリ、リュ・スポンティーニ 40 (72)発明者フェレーロ、リシャールフランス国、75013 パリ、アブニュ・デ・ゴブラン 60

Claims

【特許請求の範囲】１．ヘリコバクター感染に対する防御抗体を誘発し得る免疫組成物であって、ｉ）ヘリコバクター・ピロリ由来のウレアーゼ構造ポリペプチドの少なくとも１つのサブユニット、もしくはヘリコバクター・フェリス・ウレアーゼと反応する抗体によって認識されるそれらの断片、および／またはヘリコバクター・フェリス由来のウレアーゼ構造ポリペプチドの少なくとも１つのサブユニット、もしくはヘリコバクター・ピロリ・ウレアーゼと反応する抗体によって認識されるそれらの断片； ii）任意に、ヘリコバクター由来のウレアーゼ関連熱ショック蛋白質（ＨＳＰ）、もしくはシャペロニン、または該蛋白質の断片、を含有することを特徴とする免疫組成物。２．プラスミドｐＩＬＬ205（ＣＮＣＭＩ−1355）ｕｒｅＡおよび／またはｕｒｅＢ遺伝子によってコードされるヘリコバクター・フェリス・ウレアーゼ構造ポリペプチド、該ポリペプチドと少なくとも90％の相同性を示すポリペプチド、または少なくとも６個のアミノ酸を有し、ヘリコバクター・ピロリ・ウレアーゼと反応する抗体によって認識されるそれらの断片を含み、あるいはそれらからなる成分（i）を包含する請求の範囲第１項記載の免疫組成物。３．ヘリコバクター・ピロリ由来のＨＳＰ、またはそれらの断片である成分（ ii）を包含することを特徴とする請求の範囲第１項記載の免疫組成物。４．ウレアーゼ関連ＨＳＰが、プラスミドｐＩＬＬ689（ＣＮＣＭＩ−1356 ）のｈｓｐＡおよび／またはｈｓｐＢによって各々コードされるＨＳＰＡおよび／またはＨＳＰＢ、または該ＨＳＰと少なくとも75％の相同性を示すポリペプチド、または少なくとも６個のアミノ酸を有する、これらの蛋白質のいずれかもしくは両方の断片であることを特徴とする請求の範囲第１項ないし第４項のいずれか１項に記載の免疫組成物。５．ヘリコバクター感染、特にヘリコバクター・ピロリおよびヘリコバクター・フェリスに対する防御においてワクチンとして用いられる医薬組成物であって、生理学的に許容し得る賦形剤および、可能であればアジュバントとの組合せで、請求の範囲第１項ないし第４項のいずれか１項に記載の免疫組成物を包含することを特徴とする医薬組成物。６．プラスミドｐＩＬＬ205（ＣＮＣＭＩ−1355）のウレアーゼ遺伝子クラスターによってコードされるヘリコバクター・フェリス・ポリペプチドの少なくとも１つを含むことを特徴とする蛋白様物質であって、構造およびアクセサリー・ウレアーゼ・ポリペプチド、または該ポリペプチドと少なくとも90％の相同性を有するポリペプチド、またはそれらの断片を含む蛋白様物質。７．図３に示されるｕｒｅＡおよび／またはｕｒｅＢの遺伝子産生物、または少なくとも６個のアミノ酸を有する断片、または少なくとも90％の相同性を有する該遺伝子産生物の変異体からなり、あるいはこれらを包含することを特徴とする請求の範囲第６項記載の蛋白様物質であって、該断片および該変異体が、ヘリコバクター・ピロリ・ウレアーゼと反応する抗体によって認識される蛋白様物質。８．図９に示されるｕｒｅＩの遺伝子産生物、または少なくとも６個のアミノ酸を有するそれらの断片、または少なくとも75％の相同性を有する該遺伝子産生物の変異体からなり、あるいはそれらを包含する請求の範囲第６項記載の蛋白様物質であって、該断片および該変異体が、残余のウレアーゼ“アクセサリー”遺伝子産生物の存在下において、ｕｒｅＡおよびｕｒｅＢ遺伝子産生物を活性化する能力を有する蛋白様物質。９．（i）請求の範囲第５項ないし第８項のいずれか１項に記載される蛋白様物質をコードする少なくとも１つの配列；または（ii）配列（i）に相補的な配列；または（iii）過酷な条件下において、配列（i）もしくは（ii）とハイブリダイズし得る配列；または（iv）少なくとも10個の保全ヌクレオチドを含む配列（i）、（ii）もしくは（iii）のいずれかの断片、を包含することを特徴とする核酸配列。 10．プラスミドｐＩＬＬ205（ＣＮＣＭＩ−1355）の配列、例えば図３の配列、特にｕｒｅＡの遺伝子産生物およびｕｒｅＢをコードする配列、または図９（ｕｒｅＩ）の配列、または過酷な条件下でこれらの配列とハイブリダイズし得る配列、またはこれらの配列に相補的な配列、またはこれらの配列の少なくとも 10個の保全ヌクレオチドを含む断片を包含することを特徴とする請求の範囲第９項記載の核酸配列。 11．請求の範囲第９項または第10項に記載の核酸配列を包含することを特徴とする発現ベクター。 12．プラスミドｐＩＬＬ205（ＣＮＣＭＩ−1355）。 13．核酸増幅反応におけるプライマーとしての利用に適しているオリゴヌクレオチドであって、請求の範囲第９項または第10項に記載の配列の10ないし100個の保全ヌクレオチドを包含することを特徴とするオリゴヌクレオチド。 14．適切な標識手段を有する、請求の範囲第９項または第10項のいずれか１項に記載の配列を包含することを特徴とするヌクレオチドプローブ。 15．請求の範囲第11項または第12項に記載の発現ベクターによって安定に形質転換された微生物。 16．ヘリコバクター・ピロリのウレアーゼ関連熱ショック蛋白質（ＨＳＰ）、もしくはシャペロニンの少なくとも１つ、またはそれらの断片を包含することを特徴とする蛋白様物質。 17．図６に示されるアミノ酸配列を有するＨＳＰＡおよび／またはＨＳＰＢ、または該ポリペプチドと少なくとも75％、好ましくは少なくとも80％の相同性を有するポリペプチド、または少なくとも６個のアミノ酸を有するそれらの断片を包含し、あるいはそれらからなることを特徴とする請求の範囲第16項記載の蛋白様物質。 18．ＨＳＰＡＣ−末端配列：またはこの配列の少なくとも６個の保全アミノ酸を有する断片を包含し、あるいはそれらからなることを特徴とする請求の範囲第17項記載の蛋白質様物質。 19．ｉ）請求の範囲第16項ないし第18項のいずれか１項に記載される蛋白様物質、または請求の範囲第６項ないし第８項に記載の蛋白様物質のいずれか１つをコードする配列；またはii）配列（ｉ）に相補的な配列；またはiii）過酷な条件下において、配列（ｉ）もしくは（ii）とハイブリダイズし得る配列；またはiv）少なくとも10個のヌクレオチドを含む配列（ｉ）、（ii）もしくは（ iii）のいずれかの断片、を包含することを特徴とする核酸配列。 20．プラスミドｐＩＬＬ689（ＣＮＣＭＩ−1356）の配列の全部もしくは一部、例えば図６の配列、特にはＨＳＰＡおよび／またはＨＳＰＢをコードする配列、または該配列に相補的な配列、または過酷な条件下で該配列とハイブリダイズし得る配列、またはそれらの断片を包含することを特徴とする請求の範囲第19項記載の核酸配列。 21．請求の範囲第19項または第20項に記載の核酸配列を包含することを特徴とする発現ベクター。 22．プラスミドｐＩＬＬ689（ＣＮＣＭＩ−1356）。 23．核酸増幅反応におけるプライマーとしての利用に適したオリゴヌクレオチドであって、請求の範囲第19項または第20項に記載の配列の10ないし100個の保全ヌクレオチドを包含することを特徴とするオリゴヌクレオチド。 24．適切な標識手段を有する、請求の範囲第19項または第 20項のいずれか１項に記載の配列を包含することを特徴とするヌクレオチドプローブ。 25．請求の範囲第21項または第22項に記載の発現ベクターによって安定に形質転換されている微生物。 26．請求の範囲第７項ないし第９項のいずれか１項に記載の蛋白様物質に対するモノクローナルもしくはポリクローナル抗体、またはそれらの断片であって、ヘリコバクター・フェリス物質に対して特異的であるか、あるいはヘリコバクター・ピロリのウレアーゼ遺伝子クラスターの遺伝子産生物と交叉反応するかのいずれかであることを特徴とする抗体またはそれらの断片。 27．ヘリコバクター・フェリスｕｒｅＡおよび／またはｕｒｅＢ遺伝子産生物、並びにヘリコバクター・ピロリｕｒｅＡおよび／またはｕｒｅＢ遺伝子産生物の両者を認識することを特徴とする請求の範囲第26項に記載のモノクローナルまたはポリクローナル抗体。 28．請求の範囲第16項または第17項に記載の蛋白様物質に対するモノクローナルもしくはポリクローナル抗体またはそれらの断片であって、ヘリコバクター・ピロリ物質に特異的であるか、あるいはヘリコバクター以外のバクテリアに由来するＧｒｏＥＬ様蛋白質もしくはＧｒｏＥＳ様蛋白質と交叉反応するかのいずれかであることを特徴とする抗体またはそれらの断片。 29．ＨＳＰＡＣ−末端配列を特異的に認識することを特徴とする請求の範囲第28項に記載のモノクローナルもしくはポリクローナル抗体。 30．ヒトおよび動物における使用に適した、ヘリコバクター感染、特にヘリコバクター・ピロリおよびヘリコバクター・フェリスに対するワクチンの調製への、請求の範囲第１項に記載の免疫組成物の使用。 31．ヒトまたは動物での、ヘリコバクター、特にヘリコバクター・ピロリおよびヘリコバクター・フェリスによる感染を治療するための治療組成物における、請求の範囲第26項ないし第29項に記載の抗体の使用。 32．請求の範囲第５項に記載の医薬組成物の製造方法であって、請求の範囲第 15項記載の形質転換された微生物、および任意に請求の範囲第25項記載の微生物、を培養し、ヘリコバクター・ウレアーゼ・ポリペプチド物質、および適用可能である場合にはＨＳＰ物質をも収集して精製し、かつこれらの物質を適切な賦形剤、アジュバントおよび、任意に、他の添加剤と組合わせることを特徴とする製造方法。 33．任意に遺伝子増幅反応を行なった後の、生物学的試料におけるヘリコバクターによる感染のイン・ビトロ検出への、請求の範囲第14項ないし第24項のいずれか１項に記載のヌクレオチド配列の使用。 34．ヘリコバクター感染のイン・ビトロ検出のためのキットであって： ‐請求の範囲第14項または第24項に記載のヌクレオチドプローブ； ‐ヘリコバクターの核酸と該プローブとのハイブリダイゼーション反応を行なうための適切な培地； ‐形成されるあらゆるハイブリッドを検出するための試薬、を包含することを特徴とするキット。