ES2304131T3 - Un metodo para producir plantas que son resistentes a closterovirus. - Google Patents
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Abstract
Un método para producir plantas de pepino que son resistentes a closterovirus. El método comprende las etapas de proporcionar una planta de Cucumis sativus que contiene alelos que confieren resistencia a los closterovirus definidos con dos QTLs, cruzar dicha planta de C. sativus, recolectar las semillas resultantes de dicho cruce, regenerar las semillas en plantas, evaluar las plantas en cuanto a su resistencia frente a closterovirus e identificar plantas que son resistentes. Además, una planta de pepino resistente producida por el método, así como un fruto o semilla producido por dicha planta.
Description
Un método para producir plantas que son
resistentes a closterovirus.
Esta invención se refiere a un método para
producir plantas de pepino que son resistentes a closterovirus que
aparecen en el pepino.
Durante los últimos quince años, los virus del
amarilleamiento del pepino se han convertido en uno de los
principales problemas de los cultivadores debido a las pérdidas en
la producción de pepinos (Hassan: A Review of a Yellowing and
Stunting disorder of Cucurbits in the United Arab Emirates Emir., J.
Agric. Sci. (1991), 2: 1-16). Los virus del
amarilleamiento son closterovirus. En particular, están implicados
dos virus transmitidos por la mosca blanca. Los virus son conocidos
como pseudo-virus del amarilleamiento de la
remolacha (BPYV: Beet Pseudo-Yellows Virus) que es
sinónimo de virus de la mancha clorótica del pepino, y que es
transmitido por Trialeurodes vaporariorum, y el virus del
enanismno amarillo del pepino (CYSDV: Cucurbit Yellow Stunting
Disorder Virus), transmitido por Bemisia tabaci. El grupo de
los closterovirus comprende además, entre otros, el virus del
amarilleamiento de la lechuga (LIYV: Lettuce Infection Yellow
Virus), que es un miembro del género Crinivirus de los
closterovirus. Los virus son normalmente retenidos en los vectores
durante aproximadamente 7 días, y se transmiten por la actividad
alimenticia de las moscas blancas en la planta. La práctica común
para el control de la enfermedad es eliminando los vectores mediante
el tratamiento con insecticidas. Hasta ahora no había ninguna
fuente de resistencia conocida para los patógenos, y se han
realizado investigaciones tendentes a la eliminación del vector por
tratamiento con insecticidas o por reproducción para obtener
resistencia frente a las moscas blancas. Hasta ahora, ambos
planteamientos han carecido de éxito en el control de enfermedades.
Es un objeto de la presente invención proporcionar plantas de pepino
que son resistentes a los closterovirus que se presentan en el
pepino, en particular al BPSV y al CYSDV.
Los autores de la presente invención encontraron
que el pepino landrace Khira, PI 250147, originario de Pakistán,
confiere resistencia a BPSV y CYSDV. Cruzaron PI250147 con material
de cultivo de Cucumis sativus. Después de hecho el cruce,
las semillas se produjeron en esta planta y las semillas cosechadas
se desarrollaron dando plantas. Las plantas se evaluaron en cuanto
a su resistencia contra BPYV y CYSDV. Las plantas que demostraron
resistencia fueron retrocruzadas con líneas elite de pepino
susceptibles. Se realizó un análisis de Loci de Caracteres
Cuantitativos (QTL: Quantitative Trait Loci) usando la tecnología de
impronta dactilar AFLP, que llevó al resultado de que la
resistencia está relacionada con dos QTL.
En consecuencia, la presente invención
proporciona un método para producir plantas de pepino que son
resistentes a closterovirus que se presentan en el pepino,
comprendiendo el método las etapas de:
- a.
- proporcionar una planta Cucumis sativus que contiene alelos que confieren resistencia a los closterovirus del pepino, los cuales alelos están caracterizados por dos Loci de Caracteres Expresión Cuantitativos QTL1 y QTL2 en diferentes cromosomas, en donde QTL1 se define por los siguientes marcadores flanqueantes:
- (i)
- un marcador de aproximadamente 244 pb consistente de 5' a 3' en un cebador EcoRI que tiene la secuencia de nucleótidos SEQ ID NO:1, un fragmento genómico de pepino y un cebador MseI que tiene la secuencia de nucleótidos SEQ ID NO:2,
- (ii)
- un marcador de aproximadamente 188 pb consistente de 5' a 3' en un cebador EcoRI que tiene la secuencia de nucleótidos SEQ ID NO:1, un fragmento genómico de pepino y un cebador MseI que tiene la secuencia de nucleótidos SEQ ID NO:2, y
- (iii)
- un marcador de aproximadamente 251 pb consistente de 5' a 3' en un cebador EcoRI que tiene la secuencia de nucleótidos SEQ ID NO:3, un fragmento genómico de pepino y un cebador MseI que tiene la secuencia de nucleótidos SEQ ID NO:4,
- \quad
- o cualquier parte de la secuencia de DNA como en PI250147 entre los marcadores flanqueantes que confiere resistencia al closterovirus,
- y QTL2 se define por los marcadores siguientes:
- (i)
- un marcador de aproximadamente 260 pb consistente de 5' a 3' en un cebador EcoRI que tiene la secuencia de nucleótidos SEQ ID NO:5, un fragmento genómico de pepino y un cebador MseI que tiene la secuencia de núcleotidos SEQ ID NO:2, y
- (ii)
- un marcador de aproximadamente 107 pb consistente de 5' a 3' en un cebador EcoRI que tiene la secuencia de nucleótidos SEQ ID NO:5, un fragmento genómico de pepino y un cebador MseI que tiene la secuencia de nucleótidos SEQ ID NO:6, o cualquier parte de la secuencia de DNA como en PI250147 entre los marcadores flanqueantes que confiere resistencia al closterovirus,
- b.
- cruzar la planta Cucumis sativus proporcionada por la etapa (a) con material de producción de cultivo de Cucumis sativus,
- c.
- recolectar las semillas resultantes del cruce de la etapa (b),
- d.
- regenerar las semillas en plantas,
- e.
- evaluar las plantas de la etapa (d) en cuanto a su resistencia frente a closterovirus del pepino; y
- f.
- identificar y seleccionar plantas que son resistentes a los closterovirus del pepino, usando los marcadores que se definen en la etapa a.
La invención proporciona además semillas de una
planta de pepino que es resistente a closterovirus que aparecen en
el pepino, producidas por el método anterior.
La expresión "resistencia a closterovirus del
pepino" se usa en el presente texto con el mismo significado que
usa un cultivador: una planta sin síntomas visibles en hojas, tallo
o fruto, causados por closterovirus.
En el pepino, la variabilidad genética es
limitada. También, es virtualmente imposible cruzar Cucumis
sativus con especies relacionadas. Por consiguiente, son
difíciles de obtener fuentes de material genético que contenga
rasgos para (nuevas) enfermedades. Sin embargo, las llamadas
landraces, que son subespecies a partir de los pepinos largos y de
ensalada ("slicer") usados comercialmente, se mantienen, p.
ej., en Europa Oriental: subespecie rigidus var.
"Europea" y subespecie gracilis var. "Izmir y
Cilicium" (S. Neykov, Plant Genetic Resources Newsletter, 99,
1-2 (1994). En este artículo se sugirió que Khira PI
196289, que procede de India, tiene potencial para la selección
combinatoria especialmente por propiedades de sabor.
Sorprendentemente, se encontró que Khira PI250147 tiene una nueva
resistencia frente a BPYV y CYSDV entre las 150 entradas ensayadas y
conocidas. La presente invención implica el éxito en la
transferencia de los alelos que dan resistencia a BPYV y CYSDV a
los pepinos de tipo largo y mini usados comúnmente en Europa
y Oriente Medio.
En la bibliografía inglesa, el nombre Khira se
menciona varias veces (Neykov, 1994, Dhillon, Plant Genetic
Resources Newsletter, 119, 59-61, 1999) pero nunca
en relación con la resistencia a virus. Este es debido al hecho de
que los dos virus implicados no se encuentran en Pakistán ni en las
regiones próximas.
La presente invención implica un método para la
creación de plantas de pepino (Cucumis sativus) que son
resistentes a BPYV y CYSDV. Se dice que las plantas son resistentes
a la enfermedad si, cuando son expuestas a moscas blancas que
llevan BPYV o CYSDV, tales plantas no manifiestan síntomas de
enfermedad o muestran síntomas significativamente reducidos en
comparación con plantas susceptibles. Las plantas obtenidas por el
método de la presente invención son nuevas por la resistencia a
BPYV y CYSDV en Cucumis sativus. PI 250147 contiene alelos
que confieren resistencia a BPYV y CYSDV. Los alelos pueden ser
transferidos con éxito a líneas elite usando un sistema de
obtención asistida por marcadores. Las plantas de la presente
invención pueden prepararse por técnicas de obtención
tradicionales. Por ejemplo, pueden usarse semillas procedentes de PI
250147. Sin embargo, debido a la variable presión de la enfermedad,
la selección de marcador es esencial para la transferencia
selectiva a líneas elite que puedan competir en el mercado con
híbridos exitosos conocidos.
La herencia es recesiva oligogénica. Esto
significa que se necesitan poblaciones muy grandes de generaciones
de la planta segregantes para encontrar las plantas menos del 2 por
ciento resistentes (homocigóticas).
Ejemplo
1
Se desarrolló un ensayo usando la mosca blanca
vector (Trialeurodes y/o Bemisia). Se dejó a las moscas blancas
alimentarse sobre plantas adultas de pepino infectadas que contenían
BPYV, en un entorno de invernadero controlado. Dentro de este
invernadero se pusieron 150 entradas de bancos de genes (75 de
India, 60 de China y 15 de Pakistán), con verificaciones
susceptibles. Se pusieron plantas jóvenes individuales en la
foliación 2-4, en una bandeja (30 plantas/m^{2})
en un invernadero rodeadas por las plantas infectadas y moscas
blancas. La evaluación se duplicó 2 semanas más tarde. Esta
disposición experimental condujo al éxito de la distribución
aleatoria del virus a todas las plantas jóvenes de las bandejas. Al
cabo de 2 semanas todas las plantas se plantaron en un invernadero
que contenía vector. Después de otras 3-4 semanas se
puntuó la invención en una escala de 1 (resistente) a 8
(susceptible). Los síntomas susceptibles eran visibles
5-6 semanas después de iniciarse el experimento.
Sorprendentemente, solamente una entrada, la PI 250147 (Khira),
demostró ser resistente, como se observa por la ausencia aparente
de síntomas.
La entrada resistente fue cruzada con líneas de
producción elite. El primer retrocruzamiento (BC1) demostró ser
totalmente susceptible al virus, lo que es ilustrativo del hecho de
que la resistencia está controlada por genes recesivos. Por
consiguiente, el BC1 fue autofecundado. La semilla autofecundada se
sembró en bandejas como se describe en este ejemplo y se ensayó en
cuanto a la resistencia de las plantas. Las plantas resistentes se
pusieron en el invernadero, en el que se hizo selección visual para
el equivalente de fenotipo para la línea elite usada en el
cruzamiento inicial. Las plantas individuales seleccionadas se
retrocruzaron con el progenitor elite original, después de lo cual
se realizó la misma estrategia de producción para la transferencia
de rasgos recesivos a las líneas elite.
Ejemplo
2
Se cruzó PI250147 con una línea de producción
elite. Las semillas F1 se recogieron. Las plantas se desarrollaron
hasta madurez, y se autofecundaron. Subsiguientemente se recogió la
semilla F2. La población F2 se sembró en el invernadero bajo
condiciones de ensayo esencialmente iguales a las descritas en el
Ejemplo 1. De cada planta individual se puntuó el nivel de
resistencia, y también se obtuvieron muestras de DNA. Sobre este
material se realizó un análisis de Loci de Caracteres Cuantitativos
(QTL: Quantitative Trait Loci) de forma esencialmente igual a la
descrita en Young, Annual Review of Phytopathology 34,
479-501 (1996). El análisis se hizo en Keygene
usando la tecnología AFLP (Vos et al., Nucleic Acid Research,
1995, vol. 23, nº 21, 4407-4414). Los resultados
fueron que la resistencia está relacionada con 3 QTLs:
Un QTL principal, que explica el 42% de la
variación fenotípica (QTL1, originalmente en una región de 24 cM
que contiene 4 marcadores). Un segundo QTL intermedio que explica el
13% del fenotipo, en un cromosoma diferente (QLT2, originalmente en
una región de 24 cM que contiene 7 marcadores). Y un tercer QTL en
una región que contiene 8 marcadores. Los marcadores de cada región
QLT se usaron para identificar individuos F2 del F2 grande, que son
recombinantes en una de las 3 regiones de QTL. Los recombinantes se
reagruparon en juegos de recombinantes casi isogénicos (NIR: Near
Isogenic Recombinants) de forma que la constitución genética de la
unión dentro de un juego solamente difiere para el QTL que se está
analizando. Comparando los fenotipos F3 dentro de y entre juegos,
se realizó el mapeo fino de QTLs. Los F3 procedentes de estos juegos
de NIR fueron ensayados en cuanto a resistencia.
Los autores consiguieron estrechar 2 de las 3
regiones QTL: QTL 1 es aún solamente 16 en y QLT2 solamente 10 cM
de tamaño.
SEQ ID NO:1
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\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipGACTGCGTACCAATTCCC
\hfill
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SEQ ID NO:2
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\hskip-.1em\dddseqskipGATGAGTCCTGAGTAACAT
\hfill
\vskip1.000000\baselineskip
SEQ ID NO:3
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\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipGACTGCGTACCAATTCAA
\hfill
\vskip1.000000\baselineskip
SEQ ID NO:4
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\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipGATGAGTCCTGAGTAACAC
\hfill
\vskip1.000000\baselineskip
SEQ ID NO:5
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipGACTGCGTACCAATTCAT
\hfill
\vskip1.000000\baselineskip
SEQ ID NO:6
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipGATGAGTCCTGAGTAACGT
\hfill
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<110> De Ruiter Seeds C.V.
\vskip0.400000\baselineskip
<120> Método para producir plantas que son
resistentes a closterovirus.
\vskip0.400000\baselineskip
<130> PCTP164233
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<140> pct/n 101/00578
\vskip0.400000\baselineskip
<141>
14-09-2001
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<150> EP 00203191.2
\vskip0.400000\baselineskip
<151>
14-09-2001
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<160> 6
\vskip0.400000\baselineskip
<170> Patent In Ver. 2.1
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 1
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 18
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
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<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la secuencia
artificial: cebador
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<400> 1
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\hskip-.1em\dddseqskipgactgcgtac caattccc
\hfill18
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\vskip0.400000\baselineskip
<210> 2
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<211> 19
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<212> DNA
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<213> Secuencia artificial
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<220>
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<223> Descripción de la secuencia
artificial: cebador
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<400> 2
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\hskip-.1em\dddseqskipgatgagtcct gagtaacat
\hfill19
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<210> 3
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<211> 18
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<212> DNA
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<213> Secuencia artificial
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<223> Descripción de la secuencia
artificial: cebador
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<210> 4
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<223> Descripción de la secuencia
artificial: cebador
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<210> 5
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<212> DNA
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<213> Secuencia artificial
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<220>
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<223> Descripción de la secuencia
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<211> 19
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<212> DNA
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<213> Secuencia artificial
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<220>
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<223> Descripción de la secuencia
artificial: cebador
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<400> 6
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\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipgatgagtcct gagtaacgt
\hfill19
\vskip1.000000\baselineskip
Claims (4)
1. Un método para producir plantas de pepino que
son resistentes a closterovirus que se presentan en el pepino,
comprendiendo el método las etapas de:
- a.
- proporcionar una planta de Cucumis sativus que contiene alelos que confieren resistencia a los closterovirus del pepino, los cuales alelos están caracterizados por dos Loci de Caracteres Cuantitativos QTL1 y QTL2 en diferentes cromosomas, en donde QTL1 se define por los siguientes marcadores flanqueantes:
- (i)
- un marcador de aproximadamente 244 pb consistente de 5' a 3' en un cebador EcoRI que tiene la secuencia de nucleótidos SEQ ID NO:1, un fragmento genómico del pepino y un cebador MseI que tiene la secuencia de núcleotidos SEQ ID NO:2,
- (ii)
- un marcador de aproximadamente 188 pb consistente de 5' a 3' en un cebador EcoRI que tiene la secuencia de nucleótidos SEQ ID NO:1, un fragmento genómico del pepino y un cebador MseI que tiene la secuencia de nucleótidos SEQ ID NO:2, y
- (iii)
- un marcador de aproximadamente 251 pb consistente de 5' a 3' en un cebador EcoRI que tiene la secuencia de nucleótidos SEQ ID NO:3, un fragmento genómico del pepino y un cebador MseI que tiene la secuencia de nucleótidos SEQ ID NO:4,
- \quad
- o cualquier parte de la secuencia de DNA como en PI250147 entre los marcadores flanqueantes que confiere resistencia al closterovirus,
- y QTL2 se define por los marcadores siguientes:
- (i)
- un marcador de aproximadamente 260 pb consistente de 5' a 3' en un cebador EcoRI que tiene la secuencia de nucleótidos SEQ ID NO:5, un fragmento genómico del pepino y un cebador MseI que tiene la secuencia de nucleótidos SEQ ID NO:2, y
- (ii)
- un marcador de aproximadamente 107 pb consistente de 5' a 3' en un cebador EcoRI que tiene la secuencia de nucleótidos SEQ ID NO:5, un fragmento genómico del pepino y un cebador MseI que tiene la secuencia de nucleótidos SEQ ID NO:6,
- \quad
- o cualquier parte de la secuencia de DNA como en PI250147 entre los marcadores flanqueantes que confiere resistencia al closterovirus,
- b.
- cruzar la planta Cucumis sativus proporcionada en la etapa (a) con material de producción de cultivo de Cucumis sativus,
- c.
- recolectar las semillas resultantes del cruce de la etapa (b),
- d.
- regenerar las semillas en plantas,
- e.
- evaluar las plantas de la etapa (d) en cuanto a su resistencia frente a closterovirus del pepino; y
- f.
- identificar y seleccionar plantas que son resistentes a los closterovirus del pepino, usando los marcadores que se definen en la etapa a.
2. El método según la reivindicación 1ª, en el
que la planta de Cucumis sativus proporcionada en la Etapa
(a) es PI250147, un landrace de Khira.
3. El método según las reivindicaciones 1ª o 2ª,
en el que el closterovirus es pseudo-virus del
amarilleamiento de la remolacha (BPYV) o virus del enanismo
amarillo del pepino (CYSDV).
4. Un método para producir semillas que tienen
por resultado plantas de pepino resistentes a los closterovirus que
se presentan en el pepino, comprendiendo el método las etapas
de:
- a.
- proporcionar una planta de Cucumis sativus que contiene alelos que confieren resistencia a los closterovirus del pepino, los cuales alelos están caracterizados por dos Loci de Caracteres Cuantitativos QTL1 y QTL2 en diferentes cromosomas, en donde QTL1 se define por los siguientes marcadores flanqueantes:
- (i)
- un marcador de aproximadamente 244 pb consistente de 5' a 3' en un cebador EcoRI que tiene la secuencia de nucleótidos SEQ ID NO:1, un fragmento genómico del pepino y un cebador MseI que tiene la secuencia de nucleótidos SEQ ID NO:2,
\newpage
- (ii)
- un marcador de aproximadamente 188 pb consistente de 5' a 3' en un cebador EcoRI que tiene la secuencia de nucleótidos SEQ ID NO:1, un fragmento genómico del pepino y un cebador MseI que tiene la secuencia de nucleótidos SEQ ID NO:2, y
- (iii)
- un marcador de aproximadamente 251 pb consistente de 5' a 3' en un cebador EcoRI que tiene la secuencia de nucleótidos SEQ ID NO:3, un fragmento genómico del pepino y un cebador MseI que tiene la secuencia de nucleótidos SEQ ID NO:4, o cualquier parte de la secuencia de DNA como en PI250147 entre los marcadores flanqueantes que confiere resistencia al closterovirus,
- y QTL2 se define por los marcadores siguientes:
- (i)
- un marcador de aproximadamente 260 pb consistente de 5' a 3' en un cebador EcoRI que tiene la secuencia de nucleótidos SEQ ID NO:5, un fragmento genómico del pepino y un cebador MseI que tiene la secuencia de nucleótidos SEQ ID NO:2, y
- (ii)
- un marcador de aproximadamente 107 pb consistente de 5' a 3' en un cebador EcoRI que tiene la secuencia de nucleótidos SEQ ID NO:5, un fragmento genómico del pepino y un cebador MseI que tiene la secuencia de nucleótidos SEQ ID NO:6,
- \quad
- o cualquier parte de la secuencia de DNA como en PI250147 entre los marcadores flanqueantes que confiere resistencia al closterovirus,
- b.
- cruzar la planta de Cucumis sativus proporcionada por la etapa (a) con material de producción de cultivo de Cucumis sativus,
- c.
- recolectar las semillas resultantes del cruce de la etapa (b),
- d.
- seleccionar e identificar la semillas que dan por resultado plantas que son resistentes a los closterovirus del pepino, usando los marcadores que se definen en la etapa a.
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