ES2304191A1 - Procedimiento para producir acido-6-aminopenicilanico mediante la enzima aculeacina a acilasa de actinoplanes utahensis, purificada a partir de la bacteria recombinante streptomyces lividans cect 3377. - Google Patents
Procedimiento para producir acido-6-aminopenicilanico mediante la enzima aculeacina a acilasa de actinoplanes utahensis, purificada a partir de la bacteria recombinante streptomyces lividans cect 3377. Download PDFInfo
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Abstract
Procedimiento para producir ácido 6-aminopenicilánico mediante la enzima aculeacina A acilasa de Actinoplanes utahensis, purificada a partir de la bacteria recombinante Streptomyces lividans CECT 3377. La invención comprende un procedimiento de producción del ácido 6-aminopenicilánico mediante la hidrólisis de las penicilinas V, K, F o dihidroF utilizando la enzima aculeacina A acilasa de la bacteria Actinoplanes utahensis purificada a partir de los caldos de cultivo de células de la bacteria recombinante Streptomyces lividans CECT 3367 que portan el gen aac que codifica dicha enzima.
Description
Procedimiento para producir ácido
6-aminopenicilánico mediante la enzima aculeacina A
acilasa de Actinoplanes utahensis, purificada a partir de la
bacteria recombinante Streptomyces lividans CECT 3377.
La presente invención se encuadra dentro del
campo de la biotecnología enzimática. Más concretamente en la
obtención mediante métodos enzimáticos de ácido
6-aminopenicilánico, núcleo de los antibióticos
\beta-lactámicos denominados penicilinas,
utilizando como sustratos penicilinas naturales, y más concretamente
a partir de penicilinas V, K, F y dihidroF.
Las acilasas son enzimas ampliamente utilizadas
en la producción industrial de antibióticos y antifúngicos
semisintéticos.
En la producción de penicilinas semisintéticas
el producto de partida es el ácido
6-aminopenicilánico (en lo sucesivo
6-APA) el cual es obtenido mediante la hidrólisis
de la penicilina G con penicilina G acilasa (en lo sucesivo PGA) o
de la penicilina V con penicilina V acilasa (en lo sucesivo PVA).
Las penicilinas G y V se producen industrialmente mediante procesos
fermentativos en los que también se sintetizan otras penicilinas
alifáticas naturales (penicilinas K, F y dihidro F), las cuales
representan alrededor del 1-2% de la penicilina
total en los caldos. Las penicilina acilasas (PGAs o PVAs)
utilizadas industrialmente no son capaces de hidrolizar estas
penicilinas alifáticas cuya presencia dificulta la cristalización
del 6-APA, implicando ambos hechos un menor
rendimiento en la obtención del 6-APA, lo que
ocasiona pérdidas económicas significativas. Actualmente la única
penicilina acilasa descrita capaz de hidrolizar estas penicilinas
alifáticas eficazmente es la PVA de Streptomyces lavendulae
ATCC 13664 (Hamilton-Miller J.M.T. (1966) Bacteriol.
Rev. 30, 761-771; Torres R. et al. (1999)
Appl. Microbiol. Biotechnol. 53, 81-84;
Torres-Guzmán R. et al. (2002) Biochem.
Biophys. Res. Comm. 291, 593-597.
Kleinschmidt W.J. et al. en 1964
describieron que la bacteria Actinoplanes utahensis ATCC
14539 era capaz de producir 6-APA mediante la
hidrólisis de penicilinas producidas por células de hongos
filamentosos del género Penicillium (US Patent 3150059). Sin
embargo, la enzima o enzimas responsables de la hidrólisis y los
genes que las codifican no fueron aislados ni caracterizados.
Posteriormente se ha utilizado Actinoplanes
utahensis ATCC 14539 para la producción de antibióticos
antifúngicos semisintéticos, donde lipopéptidos cíclicos (en lo
sucesivo equinocandinas) son hidrolizados dando lugar a un
hexapéptido cíclico, núcleo de partida para la obtención de nuevas
equinocandinas semisintéticas con propiedades mejoradas (US Patent
4293482, EP0031221, US Patent 4482487, 4524135, Boeck, L.D. et
al. (1988) J. Antibiot. 41,1085-1092; Boeck,
L.D. et al. (1989) J. Antibiot. 42, 382-388;
Debono, M. (1989) J. Antibiot. 42, 389-397). En
este proceso de hidrólisis de los lipopéptidos se utiliza la enzima
aculeacina A acilasa (en lo sucesivo AAC) que produce A.
utahensis. Esta es una enzima extracelular que cataliza la
hidrólisis de la aculeacina A y de otras equinocandinas
relacionadas. La AAC de A. utahensis ha sido aislada,
purificada y caracterizada (Takeshima H. et al. (1989) J.
Biochem. 105, 606-610). Asimismo, el gen aac
que codifica para la AAC de A. utahensis ha sido clonado,
secuenciado y expresado en Streptomyces spp. (Inokoshi J.
et al. (1992) Gene 119, 29-35; Inokoshi J.
et al. (1993) Appl. Microbiol. Biotechnol. 39,
532-536). Se trata de una enzima heterodimérica, con
una subunidad pequeña (en lo sucesivo subunidad \alpha) de 19 kDa
y una subunidad grande (en lo sucesivo subunidad \beta) de 55
kDa. Aunque su estructura se asemeja a la de las penicilina G
acilasas y a la de las glutaril acilasas que hidrolizan derivados de
los ácidos fenilacético y glutárico, respectivamente, la enzima no
utiliza estos derivados como sustratos, por lo que parecía que la
función de esta enzima estaba limitada a la hidrólisis de los
lipopéptidos antes señalados y por lo tanto no se había descrito su
actividad y utilidad para la hidrólisis de penicilinas.
Para la realización de esta invención se ha
utilizado la bacteria Gram positiva Actinoplanes utahensis
NRRL 12052, que se corresponde con Actinoplanes utahensis
ATCC 14539 como donador del ácido desoxirribonucleico (en lo
sucesivo referido como ADN) productor de la enzima AAC.
En base a la secuencia conocida del gen
aac que codifica la enzima AAC de A. utahensis se
diseñaron oligonucleótidos sintéticos a fin de amplificar el gen
aac mediante el proceso de amplificación conocido como
reacción en cadena de la polimerasa (en lo sucesivo referido como
PCR), utilizando como molde el ADN genómico de A. utahensis
NRRL 12052. En estos oligonucleótidos sintéticos se incluyeron las
secuencias de unión al ribosoma de Escherichia coli (RBS),
ATG como codón de iniciación de la traducción, ya que está descrito
GTG como codón de iniciación del gen aac de A.
utahensis, y un codón de terminación de la traducción, así como
distintos sitios de restricción útiles para posteriores clonaciones.
Se obtuvo así un fragmento de ADN con la secuencia génica que
codifica la AAC incluyendo la secuencia que codifica para el
péptido señal, el cual fue donado en un vector plasmídico
bifuncional de Escherichia coli y Streptomyces
lividans que porta dos marcadores de resistencia a la
ampicilina, para su selección en E. coli, y a la
tioestreptona, para su selección en S. lividans.
Dicha construcción se comprobó mediante
secuenciación y a continuación se llevó a cabo la transformación de
la cepa Streptomyces lividans 1326. Se obtuvieron clones
recombinantes que expresaban de forma constitutiva el gen aac
bajo el control del promotor del gen de la eritromicina. Uno de
dichos clones de S. lividans que contenía el vector
plasmídico portador del gen aac y que producía la AAC de
A. utahensis se depositó en la Colección Española de
Cultivos Tipo (CECT), sita en Universidad de Valencia, Edificio de
Investigación, Campus de Burjassot, 46100 Burjassot, Valencia,
España, con el n° 3377.
Para la producción de la AAC utilizando el clon
recombinante CECT 3377 previamente seleccionado, se cultivó el
organismo en TSB (Triptona de soja, cloruro sódico, glucosa y
fosfato bipotásico) a 30°C. El microorganismo recombinante se
estabilizó mediante la adición de tioestreptona al medio de cultivo,
antibiótico para el que confiere resistencia el vector que contiene
el gen aac. La presencia del antibiótico, además de conferir
estabilidad a la producción, evita la contaminación del medio de
cultivo por otros microorganismos no deseados. La AAC producida por
S. lividans CECT 3377 es extracelular, obteniéndose a partir
del caldo de cultivo mediante separación de las células por
centrifugación. El extracto libre de células presenta una AAC con
grado de pureza elevado, pudiendo purificarse la enzima AAC a
homogeneidad mediante un procedimiento sencillo utilizando técnicas
cromatográficas convencionales.
Una vez obtenida la AAC pura se procedió a
determinar su actividad frente a las penicilinas V, K, F y dihidro
F, encontrándose que hidrolizaba dichos compuestos y determinándose
los parámetros cinéticos de la enzima con cada uno de ellos.
La novedad de esta invención radica en el hecho
de ser la primera vez que se describe la actividad penicilina
acilasa de la enzima aculeacina A acilasa de Actinoplanes
utahensis NRRL 12052 (ATCC 14539), descrita como
hexaciclolipopeptidil acilasa, lo que proporciona valor añadido al
empleo de esta enzima a escala industrial para su aplicación en la
producción del ácido 6-aminopenicilánico a partir
de la hidrólisis de penicilinas V, K, F o dihidroF, lo que tiene un
gran valor industrial.
La invención se ilustra con la siguiente
figura:
Figura 1. Obtención de 6-APA a
partir de las penicilinas V, K, dihidroF y F mediante la AAC
producida por S. lividans CECT 3377, representada en
\mumoles de 6-APA por minuto y miligramo de
enzima.
La presente invención será ilustrada con más
detalle en los ejemplos que siguen:
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo
1
Actinoplanes utahensis NRRL 12052, que se
corresponde con Actinoplanes utahensis ATCC 14539 se cultivó
según lo descrito (Takeshima H. et al. (1989) J. Biochem.
105, 606-610). En los caldos de fermentación libres
de células tras centrifugación se llevó a cabo la determinación de
la actividad penicilina V acilasa utilizando penicilina V (30 mM)
como sustrato, de acuerdo con un protocolo previamente descrito
(Torres et al. (1998) Progess in Biotechnology 15: Stability
and Stabilization of Biocatalysts, A. Ballesteros, FJ Plou, JL
Iborra and PI Hailing Eds., Elservier, Amsterdam, pp
719-724). La incubación se lleva a cabo en tampón
fosfato potásico 100 mM, pH 8, durante 20 minutos a 40°C. La
reacción se detiene añadiendo 400 \mul de acetato sódico 50 mM,
pH 4,5 y, tras centrifugación, la liberación de
6-APA se valora espectrofotométricamente por
reacción con p-dimetilaminobenzaldehído (PDAB) según las
especificaciones de Balasingham K. et al.
\hbox{(1972)
(Balasingham K. et al . (1972) Biochim. Biophys. Acta 276,
250-256).}
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo
2
La cepa de A. utahensis NRRL 12052 (ATCC
14539) se cultivó en medio YEME (extracto de levadura (0,3%),
bactopeptona (0,5%), extracto de malta (0,3%), glucosa (1%),
MgCl_{2} 5 mM), suplementado con sacarosa (34%) y glicina (0,5%).
La incubación se realizó durante 18 horas a 300 r.p.m. y 30°C.
Seguidamente, se recogió el micelio por centrifugación a 3000 x
g durante 15 minutos, se lavó con sacarosa al 10% y, a
continuación, se procedió a la lisis celular mediante tratamiento
con lisozima. Por último, se purificó el ADN siguiendo un
procedimiento previamente descrito (Hopwood D.A. et al.
(1985) Genetic Manipulation of Streptomyces. A laboratory
Manual. The John Innes Foundation, Norwich, England). Para conseguir
una mayor pureza del ADN, éste se trató con ARNasa, se extrajo
varias veces con fenol neutro y cloroformo-alcohol
isoamílico 24:1 (CIA) y posteriormente se precipitó con
isopropanol. Tras realizar lavados con etanol al 70% y etanol al
100%, el ADN se disolvió en tampón TE (Tris-HCl 10
mM pH 7,5, EDTA 1 mM).
El vector plasmídico pEM4, bifuncional con
origen de replicación en E. coli y en S. lividans,
contiene marcadores de resistencia para ampicilina y tioestreptona,
para su selección en E. coli y S. lividans
respectivamente (Quirós L.M. et al. (1998) Mol. Microbiol.
28,1177-1186). Dicho vector se preparó de acuerdo
con las condiciones descritas: las cepas de E. coli, que
poseían individualmente el plásmido antes indicado, se incubaron
durante 16 horas con agitación en un agitador orbital a 250 r.p.m.
y a 37°C en 0,05 litros de medio LB (Sambrook et al. (1989)
Molecular Cloning: A laboratory Manual, Cold Spring Harbor, New
York, USA). Transcurrido el tiempo las células se sedimentaron y
los plásmidos se extrajeron y purificaron mediante el procedimiento
High Pure Plasmid Isolation Kit (Roche) siguiendo el protocolo
proporcionado por el suministrador.
La cepa utilizada para la clonación fue E.
coli DH5\alpha. Para obtener las células competentes se
utilizó el procedimiento del RbCl (Sambrook et al. (1989)
Molecular Cloning: A laboratory Manual, Cold Spring Harbor, New
York, USA).
A partir de las secuencias amino terminales
conocidas (Inokoshi J. et al. (1992) Gene 119,
29-35) y teniendo en cuenta el uso de codones en
Streptomyces se diseñaron los oligonucleótidos sintéticos
descritos en SEQ ID NO: 1 y 2.
Para llevar a cabo la reacción de amplificación
mediante PCR se mezclaron 16 \mul (5 \muM) de cada uno de los
oligonucleótidos sintetizados con 0,5 \mug del ADN genómico de
A. utahensis, obtenido como se describe en el apartado 1 del
ejemplo 2. A la mezcla se le adicionaron 2,5 unidades de la enzima
Pfu DNA polimerasa (Promega) junto con el tampón adecuado
recomendado por los suministradores. El volumen final de cada
reacción fue de 0,1 ml conteniendo dimetilsulfóxido (DMSO) al 5%.
El preparado se sometió a un proceso de amplificación en un
termociclador Eppendorf Modelo Mastercycler Gradient en las
siguientes condiciones: 96°C (2 minutos) a continuación 5 ciclos,
siendo cada ciclo de 96°C (1 minuto), 70°C (2 minutos) y 72°C (8
minutos); a continuación otros 5 ciclos, siendo cada ciclo de 96°C
(1 minuto), 68°C (2 minutos) y 72°C (8 minutos); 5 ciclos, siendo
cada ciclo de 96°C (1 minuto), 63°C (2 minutos) y 72°C (8 minutos);
y por último 20 ciclos, siendo cada ciclo de 96°C (1 minuto), 60°C
(2 minutos) y 72°C (8 minutos). El resultado de la amplificación se
visualizó mediante tinción de bromuro de etidio después de una
electroforesis en un gel de agarosa al 1%.
El fragmento de ADN obtenido por PCR con tamaño
aproximado de 2,3 kb se purificó mediante extracción del gel de
agarosa por GeneClean de Bio 101 (Inc.) siguiendo el protocolo
recomendado.
1 \mug del fragmento purificado de ADN
resultante del procedimiento de PCR se digirió simultáneamente con
las enzimas de restricción XbaI y EcoRI (Roche),
puesto que los oligonucleótidos se diseñaron con dianas XbaI
para el extremo 5' y EcoRI para el extremo 3'. Las
digestiones se llevaron a cabo en un tampón recomendado por los
suministradores y compatible para las dos enzimas, a 37°C durante
tres horas, tras las cuales la reacción se detuvo calentando la
mezcla durante 15 minutos a 85°C. El fragmento digerido se incubó
con una muestra de 0,5 \mug de ADN del plásmido bifuncional pEM4
digerido con las enzimas XbaI y EcoRI en las mismas
condiciones que el fragmento. El fragmento de ADN se ligó al ADN
plasmídico mediante la enzima T4 ADN ligasa (USB) en presencia de
ATP usando un tampón recomendado por los suministradores.
La mezcla de ligación resultante se utilizó para
transformar células competentes de E. coli DH5\alpha. Los
transformantes se seleccionaron en medio LB sólido al que se le
había adicionado ampicilina (100 \mug/ml). Mediante este
procedimiento se obtuvieron varios clones que se analizaron
mediante electroforesis en geles de agarosa al 1% de los plásmidos
purificados. Para ello, se crecieron las colonias de E. coli
DH5\alpha transformadas en medio LB líquido a 37°C durante 16
horas y con agitación a 250 r.p.m., a continuación se extrajeron y
purificaron los plásmidos mediante el procedimiento High Pure
Plasmid Isolation Kit (Roche) siguiendo el protocolo proporcionado
por el suministrador. Uno de estos clones que contenía el plásmido
recombinante que porta el fragmento del gen aac se identificó
como pAACAU.
El fragmento de ADN contenido en el plásmido
pAACAU se secuenció por ambos extremos del fragmento mediante
secuenciación automática en un equipo ABI PRISM 3700 en el Servicio
de Secuenciación Automática de ADN (SSAD) del Centro de
Investigaciones Biológica (CIB) del Consejo Superior de
Investigaciones Científicas (CSIC). El análisis de secuencia del
plásmido constató que el fragmento de ADN clonado contenía el gen
aac desde la secuencia génica que codifica para el péptido
señal hasta el codón de terminación de la traducción, la secuencia
génica que codifica para el RBS de E. coli y ATG como codón
de iniciación.
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo
3
La cepa utilizada para la clonación y expresión
del fragmento de ADN que porta el gen aac fue S.
lividans 1326. La obtención de células recombinantes se llevó a
cabo mediante la transformación de protoplastos, los cuales se
obtuvieron siguiendo el procedimiento descrito (Hopwood DA. et
al. (1985) Genetic Manipulation of S. A laboratory Manual. The
John Innes Foundation, Norwich, England).
El plásmido pAACAU (2 \mug), purificado a
partir de un cultivo puro de una cepa recombinante de E.
coli DH5\alpha, como ya se ha descrito anteriormente, se
utilizó para transformar protoplastos de S. lividans 1326
siguiendo el método descrito (Hopwood DA. et al. (1985)
Genetic Manipulation of S. A laboratory Manual. The John Innes
Foundation, Norwich, England). Los transformantes se sembraron en
medio R2YE sólido y se incubaron a 30°C durante 24 horas, a
continuación se adicionó tioestreptona (5 \mug/ml) con el fin de
seleccionar las células recombinantes que portan el plásmido
pAACAU. Se obtuvieron numerosos clones que se analizaron mediante
electroforesis en geles de agarosa al 1% de los plásmidos
purificados, seleccionando uno de ellos al que se denominó S.
lividans pAACAU y que se depositó en la Colección Española de
Cultivos Tipo (CECT), con el n° 3377.
La cepa S. lividans CECT 3377 se fermentó
en medio TSB durante 140 horas a 30°C y 250 r.p.m. Cada 24 horas se
tomaron alícuotas de los caldos de cultivo y, tras centrifugación a
3000 x g durante 30 minutos a 4°C, se procedió a la
determinación de la actividad AAC tanto en el sobrenadante
(extracto libre de células) como en el sedimento (extracto
celular). En este último caso, se realizó una ruptura previa de las
células por sonicación. El ensayo de actividad se llevó a cabo
utilizando penicilina V como sustrato, tal y como se describe en el
ejemplo 1. La actividad AAC solo fue detectada en el sobrenadante,
donde el máximo se produce a las 96 horas de cultivo.
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo
4
La cepa S. lividans CECT 3377 se fermentó
en medio TSB durante 72 horas a 30°C y 250 r.p.m. de agitación.
Seguidamente se centrifugaron los caldos de cultivo a 3000 x
g durante 30 minutos a 4°C. Con el sobrenadante libre de
células obtenido se procedió a la purificación de la AAC. Para
ello, los caldos de producción libres de células se ajustaron a pH
6 y se sometieron a una cromatografia de intercambio catiónico
mediante su aplicación en una columna de S-Sepharose
Fast Flow (2,6 x 28 cm) de Pharmacia, equilibrada en tampón fosfato
sódico 10 mM, pH 6 y conectada a un sistema FPLC de Pharmacia. En
estas condiciones la AAC quedó retenida en la columna y se eluyó
mediante la aplicación de un gradiente discontinuo de 0 a 1,5 M de
NaCl en el mismo tampón. El conjunto de fracciones con actividad
AAC se concentraron en un lecho de polietilenglicol 35.000 (Fluka) y
se sometieron a una cromatografia de penetrabilidad en Superose12
Fast Flow (1 x 30 cm) de Pharmacia, equilibrada en tampón fosfato
potásico 50 mM, pH 7 y conectada a un sistema FPLC de Pharmacia.
Tras esta último paso cromatográfico la AAC se obtuvo pura a
homogeneidad.
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo
5
La AAC pura se caracterizó funcionalmente
determinando la estabilidad y actividad de la enzima frente a pH,
temperatura y fuerza iónica, utilizando penicilina V (30 mM) como
sustrato. La liberación del 6-APA tras la reacción
se valoró espectrofotométricamente por reacción con fluorescamina
(método de la fluorescamina) según las especificaciones de
Udenfriend et al. (1972) modificado por Reyes et al.
(1989) (Udenfriend S. et al. (1972) Science, 178,
871-872; Reyes F. et al. (1989) J. Pharma.
Pharmacol., 41, 136-137).
Respecto a la temperatura, la enzima es estable
hasta 50°C, presentando un máximo de actividad a 75°C. En cuanto al
pH, la enzima es estable entre pH 6 y 10, siendo 8.2 su pH óptimo.
Las condiciones óptimas de reacción han quedado establecidas en pH
8.2 y 45°C de temperatura.
Tras determinar las condiciones óptimas de
actividad de la AAC producida por S. lividans CECT 3377, se
caracterizó la capacidad de la enzima para producir
6-APA a partir de las penicilinas V, K, F y dihidro
F, determinando los parámetros cinéticos de la enzima para cada una
de las penicilinas. Para ello se llevaron a cabo ensayos de
actividad utilizando como sustrato penicilina V, penicilina K,
penicilina F o penicilina dihidro F a diferentes concentraciones en
tampón fosfato potásico 100 mM pH 8,2 durante 20 minutos a 45°C, de
acuerdo con el protocolo descrito en el ejemplo 1. La liberación de
6-APA se valoró espectrofotométricamente por el
método de la fluorescamina descrito en este ejemplo. Como se
describe en la figura 1, la AAC clonada y expresada en S.
lividans es capaz de generar 6-APA a partir de
penicilinas V, K, F y dihidro F, quedando recogidos en la tabla 1
los parámetros cinéticos de la enzima para cada una de las
penicilinas. Como se puede comprobar en dicha tabla, la AAC de
A. utahensis producida por S. lividans CECT 3377,
presenta mayor eficacia catalítica frente a la penicilina K.
<110> Universidad Complutense de
Madrid
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\vskip0.400000\baselineskip
<120> Procedimiento para producir ácido
6-aminopenicilánico mediante la enzima aculeacina A
acilasa de Actinoplanes utahensis, purificada a partir de la
bacteria recombinante Streptomyces lividans CECT 3377.
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<160> 2
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 1
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 44
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Artificial sequence
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Designed oligonucleotide from the
amino acid sequences of the known N-termini of AAC,
utilizing preferred codons from Streptomyces.
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (2) ... (6)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> XbaI site
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 1
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipTCTAGAGGGT ATTAATAATG ACGTCCTCGT ACATGCGCCT GAAA
\hfill44
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 2
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 31
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Artificial sequence
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Designed oligonucleotide from the
amino acid sequences of the known N-termini of AAC,
utilizing preferred codons from Streptomyces.
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (4) ... (9)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> EcoRI site
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 2
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipCCGGAATTCC TCAGCGTCCC CGCTGTGCCA C
\hfill31
\vskip1.000000\baselineskip
Claims (6)
1. Procedimiento para producir ácido
6-aminopenicilánico a partir de penicilina
utilizando la enzima aculeacina A acilasa de Actinoplanes
utahensis purificada a partir de la bacteria recombinante
Streptomyces lividans CECT 3377, caracterizado por
las siguientes operaciones:
- a)
- Cultivar células de la bacteria recombinante Streptomyces lividans CECT 3377 productoras de aculeacina A acilasa en medio definido TSB, durante al menos 96 horas a 30°C y 250 r.p.m. de agitación.
- b)
- Obtener caldos de producción libres de células mediante centrifugación a 3000 x g durante 30 minutos a 4°C y ajustarlos a pH 6.
- c)
- Someter los caldos ajustados a una cromatografia de intercambio catiónico mediante su aplicación en una columna S-Sepharose equilibrada en tampón fosfato sódico 10 mM, pH 6 y eluir la enzima retenida mediante un gradiente discontinuo de 0 a 1,5 M de NaCl en el mismo tampón.
- d)
- Concentrar en lecho de polietilenglicol 35.000 el conjunto de fracciones con actividad aculeacina A acilasa.
- e)
- Someter el conjunto de fracciones con actividad aculeacina A acilasa concentrado a una cromatografia de penetrabilidad mediante su aplicación en una columna Superose12 y aislar las fracciones más activas.
- f)
- Producir ácido 6-aminopenicilánico incubando las fracciones más activas de la enzima aculeacina A acilasa con penicilina en tampón fosfato potásico 100 mM pH 8,2 durante 20 minutos a 45°C y deteniendo la reacción mediante al adición de acetato sódico a pH 4,5.
2. Procedimiento para producir ácido
6-aminopenicilánico, según reivindicación 1, a
partir de penicilina V.
3. Procedimiento para producir ácido
6-aminopenicilánico, según reivindicación 1, a
partir de penicilina K.
4. Procedimiento para producir ácido
6-aminopenicilánico, según reivindicación 1, a
partir de penicilina F.
5. Procedimiento para producir ácido
6-aminopenicilánico, según reivindicación 1, a
partir de penicilina dihidro F.
6. Cultivo biológicamente puro de la cepa
Streptomyces lividans CECT 3377 que contiene el gen
aac de Actinoplanes utahensis, que codifica la enzima
aculeacina A acilasa, para producir ácido
6-aminopenicilánico a partir de penicilina.
Priority Applications (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| ES200402857A ES2304191B2 (es) | 2004-11-26 | 2004-11-26 | Procedimiento para producir acido-6-aminopenicilanico mediante la enzima aculeacina a acilasa de actinoplanes utahensis, purificada a partir de la bacteria recombinante streptomyces lividans cect 3377. |
| PCT/ES2005/000643 WO2006058942A2 (es) | 2004-11-26 | 2005-11-25 | Procedimiento para producir ácido 6-aminopenicilánico mediante la enzima aculeacina a acilasa de actinoplanes utahensis, purificada a partir de la bacteria 5 recombinante streptomyces lividans cect 3377 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| ES200402857A ES2304191B2 (es) | 2004-11-26 | 2004-11-26 | Procedimiento para producir acido-6-aminopenicilanico mediante la enzima aculeacina a acilasa de actinoplanes utahensis, purificada a partir de la bacteria recombinante streptomyces lividans cect 3377. |
Publications (2)
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|---|---|
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| ES2304191B2 ES2304191B2 (es) | 2009-10-29 |
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|---|---|---|---|
| ES200402857A Expired - Fee Related ES2304191B2 (es) | 2004-11-26 | 2004-11-26 | Procedimiento para producir acido-6-aminopenicilanico mediante la enzima aculeacina a acilasa de actinoplanes utahensis, purificada a partir de la bacteria recombinante streptomyces lividans cect 3377. |
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Citations (1)
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|---|---|---|---|---|
| ES2105989A1 (es) * | 1996-03-15 | 1997-10-16 | Antibioticos Sa | Procedimiento alternativo para la obtencion del acido 6-amino penicilanico (6-apa). |
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2004
- 2004-11-26 ES ES200402857A patent/ES2304191B2/es not_active Expired - Fee Related
-
2005
- 2005-11-25 WO PCT/ES2005/000643 patent/WO2006058942A2/es not_active Ceased
Patent Citations (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| ES2105989A1 (es) * | 1996-03-15 | 1997-10-16 | Antibioticos Sa | Procedimiento alternativo para la obtencion del acido 6-amino penicilanico (6-apa). |
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Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| WO2006058942A3 (es) | 2006-08-24 |
| ES2304191B2 (es) | 2009-10-29 |
| WO2006058942A2 (es) | 2006-06-08 |
| WO2006058942B1 (es) | 2006-09-21 |
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