ES2307746T3 - D-hidantoinasa de ochrobactrum anthropi'. - Google Patents

Abstract

Una molécula de ácido nucleico seleccionada entre el grupo constituido por: (a) una molécula de ácido nucleico que comprende una secuencia que codifica un polipéptido que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO : 2; (b) una molécula de ácido nucleico que comprende la secuencia de nucleótidos de la SEQ ID NO: 1; y (c) una molécula de ácido nucleico que tiene una secuencia complementaria, o capaz de hibridarse en condiciones rigurosas a la secuencia de nucleótidos de la SEQ ID NO: 1.

Description

D-hidantoinasa de Ochrobactrum anthropi.

Campo de la invención

La presente se refiere a una D-hidantoinasa novedosa de Ochrobactrum anthropi que de manera enantio-selectiva hidroliza las D-hidantoínas a sus D-N-carbamoil-\alpha-aminoácido; el ácido nucleico que codifica la enzima; un vector de expresión que incluye el ácido nucleico; y una célula huésped capaz de expresar la enzima.

Antecedentes de la invención

La Hidantoinasa es una enzima que cataliza la conversión de las hidantoínas 5-monosustituidas a los N-carbamoil-\alpha-aminoácidos. Los N-carbamoil-\alpha-aminoácidos ópticamente puros se pueden después hidrolizar mediante medios químicos o enzimáticos a aminoácidos. Esta importante propiedad entantioselectiva las hace valiosas para la producción de D- o L-aminoácidos ópticamente puros, que son intermedios útiles para la preparación de penicilinas semisintéticas y cefalosporinas. El uso de hidantoinasa para producir N-carbamoil aminoácidos ópticamente puros se conoce en la técnica [Syldatk, C., Muller, R., Siemann, M., Krohn, K., y Wagner, F. (1992). En la producción biocatalítica de aminoácidos y derivados (D. Rozell y F. Wagner, Ed.) p. 75 - 128 Hanser Publishers, New York]. Las enzimas de Hidantoinasa se han aislado a partir de una diversidad de fuentes que incluyen Klebsiella, Corynebacterium, Agrobacterium, Pseudomonas, Bacillus, y Streptomyces. La solicitud de Patente Europea EP/0739978 A2 describe una hidantoinasa producida a partir de Agrobacterium tumefaciens que muestra una actividad y estabilidad mejorada en medio alcalino a altas temperaturas. La Patente de Estados Unidos Nº 5.516.660 describe especímenes novedosas de la especie Arthrobacter que producen hidantoinasas que son capaces de producir L-\alpha-aminoácidos a partir de hidantoínas D-, L- y/o D, L-5-monosustituidas. La Patente de Estados Unidos Nº 5.714.355 describe un espécimen mutante de la especie Arthrobacter que tiene hasta 2,7 veces más actividad enzimática que el organismo precursor. La Publicación PCT WO 00/58449 describe hidantoinasas modificadas que muestran propiedades enzimáticas mejoradas con relación a las aisladas previamente. Existe una necesidad pendiente de nuevas enzimas que muestran enantioselectividad mejorada así como actividad catalítica.

Sumario de la invención

La presente invención se refiere a D-hidantoinasa a partir de Ochrobactrum anthropi que tienen preferiblemente la secuencia de la SEQ ID NO: 2 o una proteína que tiene al menos un 80% de identidad con la secuencia SEQ ID NO: 2.

La presente invención también se refiere a ácidos nucleicos que codifican la enzima, preferiblemente el ADN genómico de la SEQ ID NO: 1 o ADNc derivado del mismo.

La presente invención también se refiere a una célula huésped recombinante que comprende ácido nucleico que codifica la enzima de la invención.

La presente invención también se refiere a un vector de expresión que comprende ácido nucleico que codifica la enzima de la invención.

Además, la presente invención se refiere a un procedimiento para producir la enzima de la invención que comprende el cultivo de una célula adecuada que contiene ácido nucleico que codifica la enzima de la invención en un medio adecuado en condiciones adecuadas para la expresión de la enzima.

Finalmente, la presente invención se refiere a un procedimiento para convertir las hidantoínas 5-monosustituidas a los N-carbamoil-\alpha-aminoácidos usando la hidantoinasa de la invención para dar como resultado un producto de alta pureza quiral.

Breve descripción de los dibujos

Figura 1: Perfil de temperatura de la actividad de la hidantoinasa en células enteras.

Figura 2: pH óptimo de la actividad de la hidantoinasa en las células tratadas con glutaraldehído.

Figura 3: Fragmentos de ADN y polipéptido útil en la presente invención. Se usaron las sondas 1 - 4 para obtener la enzima de la invención. Las sondas 1 a 4 son, respectivamente, las SEQ ID NOS: 4 a 7. La secuencia de aminoácidos es la SEQ ID NO: 9, que está codificada por la secuencia de ADN inmediatamente por debajo de la secuencia de aminoácidos (SEQ ID NO: 8). La inversa de la SEQ ID NO: 8 es la SEQ ID NO: 10.

Figura 4: Representación esquemática del plásmido hyd13f.

Figura 5: Representación esquemática del plásmido hyd4f.

Figura 6: Secuencia de ADN genómico que codifica la enzima de la invención (SEQ ID NO: 1) y la secuencia de aminoácidos de la enzima de la invención (SEQ ID NO : 2). Secuencia N-terminal (SEQ ID NO: 3) determinada mediante la secuenciación de Edman se muestra en tipo negrita.

Figura 7: Construcción de pKSHY3

Figura 8: Construcción de pBMS1000HY-1.

Descripción detallada de la invención

La presente invención se refiere a una molécula de ácido nucleico aislada que comprende una secuencia de ácido nucleico que codifica toda o parte de hidantoinasa a partir de Ochrobactrum anthropi. Una cepa preferida de Ochrobactrum anthropi es ATCC 202035, depositada en la Colección Americana de Cultivos Tipo, Rockville, Maryland, Estados Unidos, bajo las disposiciones del Tratado de Budapest. Preferiblemente, la molécula de ácido nucleico es una molécula de ADN y la secuencia de ácido nucleico es una secuencia de ADN. Todas las secuencias de ADN se representan en el presente documento mediante fórmulas cuya orientación de izquierda a derecha está en la dirección convencional de 5' a 3'. Las abreviaturas de base de nucleótidos usadas en el presente documento son convencionales en la técnica, es decir, T es timina, A es adenina, C es citosina, y G es guanina; también, X es A, T, C, o G, Pu es purina (es decir, G o A), y Py es pirimidina (es decir, T o G). Además se prefiere una secuencia de ADN que tiene toda o parte de la secuencia de nucleótidos sustancialmente como se muestra en la Figura 6 (SEQ ID NO: 1), o una secuencia de ADN complementaria s esta secuencia de ADN; o una secuencia de ADN que se hibridiza a la SEQ ID NO: 1 o su componente. Preferiblemente, la secuencia de ADN se hibrida en condiciones rigurosas. Las condiciones de hibridación rigurosas seleccionan las secuencias de ADN de más de un 80% de homología, preferiblemente mayor de 85% o, más preferiblemente, mayor de 90% de homología. La selección de ADN en condiciones rigurosas se pueden llevar a cabo de acuerdo con el procedimiento descrito en Nature, 313: 402 - 404 (1985), cuyos contenidos se incorporan en el presente documento. Las secuencias de ADN capaces de hibridarse en condiciones rigurosas con el ADN descrito en el presente documento pueden ser, por ejemplo, variantes alélicas de las secuencias de ADN descritas, pueden estar naturalmente presentes en Ochrobactrum anthropi, pero relacionadas con la secuencia de ADN descrita, o se pueden derivar de otras fuentes bacterianas. Las técnicas generales de la hibridación de ácido nucleico están descritas por Maniatis, T. et al., en: Molecular Cloning, a Laboratory Manual, Cold Spring Harbor, N.Y. (1982), y por Haymes, B.D. et al., en: Ácido nucleico Hybridization, a Practical Approach, IRL Press, Washington, D.C. (1985), cuyas referencias se incorporan en el presente documento por referencia. En el caso de una secuencia de nucleótidos (es decir, una secuencia de ADN) que codifica parte de hidantoinasa, se prefiere que la secuencia de nucleótidos sea al menos aproximadamente de 15 nucleótidos de longitud.

Los fragmentos de ADN preferidos son las sondas de las SEQ ID NOS: 4 - 7 (sondas números 1 - 4, respectivamente en la Figura 3).

Las moléculas de hidantoinasa de la presente invención no necesitan necesariamente ser catalíticamente activas. Por ejemplo, enzimas catalíticamente inactivas o sus fragmentos pueden ser útiles en la inducción de anticuerpos para la proteína.

También se contempla que la presente invención abarca secuencias modificadas o variantes. Como se usa en la presente solicitud, el término "modificada" o "variante", cuando se refiere a una secuencia de nucleótidos o de polipéptidos, significa una secuencia de nucleótidos o polipéptidos que difiere de las secuencias de tipo salvaje descritas específicamente en el presente documento en el presente documento.

Las secuencias de ADN de la presente invención se pueden obtener usando diversos procedimientos bien conocidos por los expertos en la técnica. Al menos tres procedimientos principales alternativos se pueden emplear:

(1) el aislamiento de la secuencia de ADN de doble cadena del ADN complementario (ADNc) que contiene la secuencia;

(2) la síntesis química de la secuencia ADN; y

(3) la síntesis de la secuencia de ADN mediante la reacción en cadena de la poimerasa (PCR).

En el primer planteamiento, una genoteca genómica o de ADNc se puede seleccionar con el fin de identificar una secuencia de ADN que codifica toda o parte de la hidantoinasa. Por ejemplo, una genoteca de ADN genómico de O. anthropi se puede seleccionar con el fin de identificar la secuencia de ADN que codifica toda o parte de la enzima. Se pueden usar diversas técnicas para seleccionar el ADN genómico o genotecas de ADNc.

Por ejemplo, las secuencias de sonda de ADN de una sola cadena que duplican una secuencia presente en el ADN genómico o ADNc diana que codifica toda o parte de la enzima se puede emplear en los procedimientos de hibridación de ADN/ADN llevados a cabo en copias clonadas del ADN genómico o ADNc que se han desnaturalizado hasta la forma de una sola cadena.

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Una genoteca de ADN genómico o ADNc también se puede seleccionar para un ADN genómico o ADNc que codifica toda o parte de la hidantoinasa que usa técnicas de inmunotransferencia.

En un procedimiento de selección típico adecuado par alas técnicas de inmunotransferencia o hibridación, la genoteca de ADN genómico, que está contenida habitualmente en un vector, o genoteca de ADNc se dispersa primero sobre placas de agar, y después los clones se transfieren a membranas de filtro, por ejemplo, membranas de nitrocelulosa. Después se puede hibridar una sonda de ADN o después se puede unir un anticuerpo a los clones para identificar los clones que contienen el ADN o ADNc genómico que codifica toda o parte de la hidantoinasa.

En el segundo planteamiento, las secuencias de ADN de la presente invención que codifican toda o parte de la hidantoinasa se pueden sintetizar químicamente. Por ejemplo, la secuencia de ADN que codifica la hidantoinasa se puede sintetizar como una serie de oligonucleótidos de 100 bases que se pueden ligar secuencialmente (mediante sitios de restricción terminales apropiados o secuencias terminales complementarias) de manera que formen la secuencia lineal correcta de nucleótidos.

En el tercer planteamiento, las secuencias de ADN de la presente invención que codifican toda o parte de la hidantoinasa se pueden sintetizar usando la PCR. En resumen, pares de oligonucleótidos de ADN sintéticos de al menos 15 bases de longitud (cebadores de PCR) que se hibridan a hebras opuestas de la secuencia de ADN diana se usan para amplificar de manera enzimática la región que interviene de ADN sobre la secuencia diana. Los ciclos repetidos de desnaturalización por calor del molde, hibridación de los cebadores y extensión de los extremos 3' de los cebadores hibridazos con una ADN polimerasa da como resultado la amplificación del segmento definido por los extremos 5' de los cebadores de la PCR. Véase, White et al., Trends Genet. 5, 185 - 189 (1989).

Las secuencias de ADN de la presente invención se pueden usar de una diversidad de formas de acuerdo con la presente invención. El uso más aparente de la secuencia de ADN es para preparar la hidantoinasa que es útil para la conversión de las hidantoínas 5-monosustituidas en los correspondientes N-carbamoil-\alpha-aminoácidos. Sin embargo, ADNc y ADN genómico para seleccionar mediante hibridación de otras secuencias de ADN que codifican las proteínas relacionadas con la hidantoinasa. Además, las secuencias de ADN de la presente invención que codifican toda o parte de la hidantoinasa se pueden usar como sondas de ADN para seleccionar otras genotecas de ADNc y ADN genómico para seleccionar, mediante hibridación, secuencias de ADN que codifican las moléculas de hidantoinasa a partir de organismos diferentes de O. anthropi.

Las secuencias de ADN de la presente invención que codifican toda o parte de la hidantoinasa también se pueden modificar (es decir, mutadas) para preparar diversas mutaciones. Tales mutaciones pueden o bien degenerar, es decir, la mutación cambia la secuencia de aminoácido codificada por el codón mutado, o no degenerar, es decir, la mutación no cambia la secuencia de aminoácidos codificada por el codón mutado. Estas secuencias de ADN modificadas se pueden preparar, por ejemplo, mediante mutación de la secuencia de ADn de la hidantoinasa de manera que la mutación da como resultado la supresión, sustitución, inserción, inversión o adición de uno o más aminoácidos en el polipéptido codificado usando diversos procedimientos conocidos en la técnica. Por ejemplo, se pueden emplear los procedimientos de mutagénesis dirigida al sitio descritos en Morinaga et al., Bio/Technol. 2, 636 - 639 (1984), Taylor et al., Nucl. Acids Res. 13, 8749 - 8764 (1985) y Kunkel, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82, 482 - 492 (1985). Además, se pueden comprar los kits para la mutagenesis dirigida al sitio a partir de vendedores comerciales. Por ejemplo, un kit para realizar la mutagénesis dirigida al sitio se puede comprar de Amersham Corp. (Arlington Heights, IL). Además, los procedimientos de ruptura, supresión y truncamiento como se describe en Sayers et al., Nucl. Acids Res. 16, 791 - 802 (1988) también se puedan empelar. Las mutaciones tanto degeneradas como no degeneradas pueden ser ventajosas en la producción o uso de los polipéptidos de la presente invención. Por ejemplo, estas mutaciones pueden permitir niveles mayores de producción, o proporcionar sitios de reconocimiento de la endonucleasa de restricción adicionales. Todas estas moléculas de ADN y polipéptidos modificados se incluyen dentro de la presente
invención.

La presente invención además se refiere a vectores de expresión que comprenden una secuencia de ADN que codifica toda o parte de la hidantoinasa de la invención. Los vectores de expresión preferiblemente contienen toda o parte de las secuencias de ADN que tienen las secuencias de nucleótidos sustancialmente como se muestra en la Figura 6. Además se prefieren vectores de expresión que comprenden una o más de las secuencias de ADN unidas de manera operativa a la secuencia de ADN que codifica toda o parte de la hidantoinasa. Como se usa en este contexto, el término "unido de manera operativa" significa que las secuencias de ADN reguladoras son capaces de dirigir la replicación y/o la expresión de la secuencia de ADN que codifica toda o parte de la hidantoinasa.

Los vectores de expresión de utilidad en la presente invención están a menudo en la forma de "plásmidos", que se refieren a bucles de ADN de hebra doble circular que, en su forma de vector, no están unido al cromosoma. Sin embargo, la invención se pretende que incluya tales formas diferentes de los vectores de expresión que hacen funciones equivalentes y que se llegan a conocer en la técnica posteriormente en el presente documento.

Los vectores de expresión útiles en la presente invención típicamente contienen un origen de replicación, un promotor localizado en frente (es decir, cadena arriba de) la secuencia de ADN y seguido de la secuencia de ADN que codifica toda o parte de la proteína estructural de la hidantoinasa. La secuencia de ADN que codifica toda o parte de la proteína estructural está seguida de las secuencias de terminación de la transcripción y el vector restante. Los vectores de expresión también pueden incluir otras secuencias de ADN conocidas en la técnica, por ejemplo, las secuencias guía de estabilidad que proporcionan estabilidad del producto de expresión, las secuencias guía secretoras que proporcionan la secreción del producto de expersión, las secuencias que permiten la expresión del gen estructural a modular (es decir, mediante la presencia o ausencia de nutrientes u otros inductores en el medio de crecimiento), secuencias de marcado que son capaces de proporcionar selección fenotípica en las células huésped transformadas, elementos de estabilidad tales como centrómeros que proporcionan estabilidad mitótica al plásmido, y las secuencias que proporcionan sitios para la escisión mediante endonucleasas de restricción. Las características del real vector de expresión usado puede ser compatible con la célula huésped que se va a emplear. Por ejemplo, cuando se clona en un sistema de células fúngicas, el vector de expresión debe contener promotores aislados del genoma de células fúngicas (es decir, el promotor de trpC de Aspergillus nidulans). Ciertos vectores de expresión pueden contener una secuencia de replicación autónoma fúngica (ARS; es decir, ARS de Fusarium oxysporum y Saccharomyces cerevisiae) que promueve la producción in vivo de plásmidos de autorreplicación en huéspedes fúngicos. Se prefiere que los vectores de expresión de la invención no tienen una secuencia de ARS fúngica y de este modo se integrarán en los cromosomas del huésped tras la entrada del plásmido en las células huésped. Se prefiere tal integración debido a la estabilidad genética potenciada. Un vector de expresión como se contempla en la presente invención es al menos capaz de de dirigir la expresión en Escherichia coli e integración en células fúngicas, y preferiblemente la expresión, de la secuencia de ADN de la hidantoinasa de la presente invención. Los orígenes adecuados de la replicación en diversos huéspedes de E. coli incluyen, por ejemplo, un origen de replicación del plásmido ColEI. Los promotores adecuados incluyen, por ejemplo, el promotor trpC de A. nidulans y el promotor del gen neo-r de E. coli. Las secuencias de terminación adecuadas incluyen, por ejemplo, el terminador trp C de A. nidulans, y el terminador del gen neo-r gene de E. coli. También se prefiere que el vector de expresión incluya una secuencia que codifica un marcador seleccionable. El marcador seleccionable es preferiblemente resistencia a antibióticos. Como marcadores seleccionables, se pueden emplear de manera conveniente resistencia a fleomicina (para células fúngicas), resistencia a ampicilina, y resistencia a neomicina (para células bacterianas). Todos estos materiales se conocen en la técnica y están comercialmente
disponibles.

Los vectores de expresión adecuados que contienen las secuencias de codificación y de control deseadas se pueden construir usando las técnicas de ADN recombinante convencionales conocidas en la técnica, muchas de las cuales se describen en Sambrook et al. Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2ª edición, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY (1989).

La presente invención se refiere de manera adicional a células huésped que contienen un vector de expresión que comprende una secuencia de ADN que codifica toda o parte de la hidantoinasa. Las células huésped preferiblemente contienen un vector de expresión, que comprende toda o parte de una de las secuencias de ADN que tiene la secuencia de nucleótidos sustancialmente como se muestra en la Figura 6. Además se prefiere las células huésped que contienen un vector de expresión que comprende una o más secuencias de ADN reguladoras capaces de dirigir la replicación y/o la expresión de y unida de manera operativa a una secuencia de ADN que codifica toda o parte de la hidantoinasa. De manera adicional se incluyen las células huésped que contienen un vector de expresión que comprende una secuencia de ADN que se ha modificado (es decir, rota, suprimida o truncada) de manera que codifique una molécula de hidantoinasa que no es catalíticamente activa. Las células huésped adecuadas incluyen tanto células eucarióticas como procarióticas, por ejemplo, células de E. coli. Las células huésped eucarióticas adecuadas incluyen, por ejemplo, células de R. toruloides, Cephalosporium acremonium, y Penicillium chrysogenum. Una célula huésped preferida es E. coli ATCC 98563 que contiene el plásmido pBMS2000, depositado en la Colección Americana de Cultivos Tipo, Rockville, Maryland, Estados Unidos, bajo las condiciones del Tratado de Budapest.

Los vectores de expresión se pueden introducir en las células huésped mediante diversos procedimientos conocidos en la técnica. Por ejemplo, transfección de células huésped con los vectores de expresión se pueden llevar a cabo mediante el procedimiento de transformación de protoplastos mediado por polietilen glicol. Sin embargo, también se pueden emplear otros procedimientos para introducir vectores de expresión en las células huésped, por ejemplo, electroporación, inyección biolística, o fusión de protoplastos.

Una vez que se ha introducido un vector de expresión en una célula huésped apropiada, la célula huésped se puede cultivaren condiciones que permiten la expersión de grandes cantidades de la hidantoinasa.

Las células huésped que contienen un vector de expresión que contiene una secuencia de ADN que codifica toda o parte de la hidantoinasa se puede identificar mediante uno o más de los siguientes cinco planteamientos generales: (a) hibridación de ADN-ADN; (b) la presencia o ausencia de funciones génicas de marcador; (c) determinación del nivel de transcripción como se mide por la producción de las transcripciones de ARNm de la hidantoinasa en la célula huésped; (d) detección del producto génico inmunológicamente; y (e) ensayo de enzimas, siendo el ensayo de enzimas el procedimiento preferido de identificación.

En el primer planteamiento, la presencia de una secuencia de ADN que codifica toda o parte de la hidantoinasa se puede detectar mediante hibridación de ADN-ADN o ARN-ADN usando sondas complementarias con la secuencia de ADN.

En el segundo planteamiento, el sistema del huésped del vector de expresión se puede identificar y seleccionar basándose en la presencia o ausencia de ciertas funciones del gen marcador (es decir, utilización de acetamida, resistencia a antibióticos, resistencia a fungicida, fototrofia de uracilo, etc.). Se puede colocar un gen marcador en el mismo plásmido que la secuencia de ADN que codifica toda o parte de la hidantoinasa en la regulación del mismo o diferente promotor usado para regular la secuencia que codifica la hidantoinasa. La expresión del gen marcador en respuesta a la inducción o selección indica la presencia del vector de de expresión recombinante que lleva la secuencia de ADn que codifica toda o parte de la hidantoinasa.

En el tercer planteamiento, la producción de las transcripciones del ARNm de la hidantoinasa se puede determinar mediante ensayos de hibridación. Por ejemplo, se puede aislar ARN poliadenilado y analizarse mediante ensayo de transferencia de Northern o protección de endonucleasa usando una sonda complementaria con la secuencia de ARN. De manera alternativa, los ácidos nucleicos totales de la célula huésped se pueden extraer y ensayar para determinar la hibridación a tales sondas.

En el cuarto planteamiento, la expresión de toda o parte de la hidantoinasa se puede determinar inmunológicamente, por ejemplo, mediante transferencia de Western.

En el quinto planteamiento, la expresión de la hidantoinasa se puede determinar mediante ensayo para determinar la actividad de la enzima hidantoinasa usando procedimientos conocidos.

Las secuencias de ADN de los vectores de expresión, plásmidos o moléculas de ADN de la presente invención se pueden determinar mediante diversos procedimientos conocidos en la técnica. Por ejemplo, se puede emplear el procedimiento de terminación de la cadena didesoxi como se describe en Sanger et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 74, 5463 - 5467 (1977), o el procedimiento de Maxam-Gilbert como se describe en Proc. Natl. Acad. Sci. USA 74, 560 - 564 (1977).

Por supuesto, se debe entender que no todos los vectores de expresión y secuencias reguladoras de ADN funcionarán igualmente bien para expresar las secuencias de ADN de la presente invención. Ninguna de todas las células huésped funcionarán igualmente bien con el mismo sistema de expresión. Sin embargo, los expertos en la técnica pueden realizar una selección entre los vectores de expresión, secuencias de ADN reguladoras, y células huésped que usan la guía proporcionada en el presente documento sin excesiva experimentación y sin salirse del ámbito de la presente invención.

La presente invención además se refiere a moléculas de polipéptido que comprenden toda o parte de la hidantoinasa, teniendo dichas moléculas de polipéptidos preferiblemente toda o parte de una secuencia de aminoácidos sustancialmente como se muestra en la Figura 6. En el caso de las moléculas de polipéptidos que comprenden parte de la hidantoinasa, se prefiere que las moléculas de polipéptido sean al menos de aproximadamente de 10 aminoácidos de longitud.

Todos los restos de aminoácidos identificados en el presente documento están en la configuración natural L. De acuerdo con la nomenclatura de polipéptidos convencional, J. Biol. Chem. 243, 3557 - 3559 (1969), las abreviaturas para los restos de aminoácido son como se muestra en la siguiente Tabla de Correspondencia:

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(Tabla pasa a página siguiente)

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Todas las secuencias de aminoácidos están representadas en el presente documento mediante las fórmulas cuya orientación de izquierda a derecha está en la dirección convencional del extremo amino al extremo carboxi.

Los polipéptidos de la presente invención se pueden obtener mediante medios sintéticos, es decir, síntesis química del polipéptido de sus aminoácidos de componente, mediante los procedimientos conocidos por los expertos en la técnica. Por ejemplo, se puede emplear el procedimiento de fase sólida descrito en Houghton et al., Proc. Natl. Acad. Sci. 82, 5131 - 5135 (1985). Se prefiere que los polipéptidos se obtengan mediante la producción en células huésped procarióticas o eucarióticas que expresan una secuencia de ADN que codifica toda o parte de la hidantoinasa, o mediante traducción in vitro del ARNm codificado por una secuencia de ADN que codifica toda o parte de la hidantoinasa. Por ejemplo, la secuencia de ADN de la Figura 6 se puede sintetizar usando la PCR como se ha descrito anteriormente e insertarse en un vector de expresión adecuado, que a su vez se puede usar para transformar una célula huésped adecuada. La célula huésped recombinante después se puede cultivar para producir la hidantoinasa. Las técnicas para la producción de los polipéptidos mediante estos medios se conocen en la técnica, y se describen en el presente documento.

La D-hidantoinasa aislada y purificada de la invención preferiblemente tiene la secuencia de la SEQ ID NO: 2 o una proteína que tiene al menos un 80% de homología con la SEQ ID NO: 2.

Las secuencias de aminoácidos o ADN variantes dentro del ámbito de la invención son homólogas con las secuencias descritas específicamente en el presente documento. Se puede determinar el grado de homología (porcentaje de identidad) entre una secuencia descrita específicamente y una variante, por ejemplo, comparando las dos secuencias usando los programas de ordenador GAP, versión 6.0, descrita por Devereux et al. (Nucl. Acids Res. 12: 387, 1984) y disponible de la Universidad de Wisconsin Grupo de Ordenadores de Genética (UWGCG). El programa GAP utiliza el procedimiento de alineación de Needleman y Wunsch (J. Mol. Biol. 48: 443, 1970), revisado por Smith y Waterman (Adv. Appl Math 2: 482, 1981). En resumen, el programa GAP define similitud como el número de símbolos alineados (es decir, nucleótidos o aminoácidos) que son similares, dividido por el número total de símbolos en la más corta de las dos secuencias. Los parámetros de defectos preferidos para el programa GAP incluyen: (1) una matriz de comparación unario (que contiene un valor de 1 para las identidades y 0 para las no identidades) para los nucleótidos, y la matriz de comparación ponderada de Gribskov y Burgess, Nucl. Acids Res. 14: 6745, 1986, como se describe por Schwartz y Dayhoff, eds., Atlas of Protein Sequence y Structure, National Biomedical Research Foundation, p. 353 - 358, 1979; (2) una penalización de 3,0 para cada hueco y una penalización adicional de 0,10 para cada símbolo en cada hueco; y (3) ninguna penalización para los huecos finales.

Los polipéptidos producidos de esta manera se pueden después aislar y purificar usando diversas técnicas de purificación. Por ejemplo, se pueden emplear procedimientos cromatográficos tales como cromatografía de intercambio iónico, cromatografía de filtración en gel y cromatografía de afinidad.

Como se usa en el presente documento, el término "aislado y purificado" significa que la D-hidantoinasa está sustancialmente libre de los constituyentes presentes en un ambiente natural o celular.

Además del procedimiento de conversión de la invención, los polipéptidos de la presente invención se pueden usar en una diversidad de formas diferentes. Por ejemplo, los polipéptidos se pueden usar para preparar de una manera conocida anticuerpos policlonales o monoclonales capaces de unirse a los polipéptidos. Estos anticuerpos se pueden a su vez usar para la detección de los polipéptidos de la presente invención en una muestra, por ejemplo, una muestra de células, que usa técnicas de inmunoensayo, tales como radioinmunoensayo o inmunoensayo de enzimas. Los anticuerpos se pueden usar también en cromatografía de afinidad para purificar los polipéptidos de la presente invención y aislarlos a partir de fuentes diferentes.

Debido a la naturaleza de la degeneración del código genético, que se produce existe más de un codón para la mayoría de los restos de aminoácidos y señales de parada, otras secuencias de ADN que codifican la misma secuencia de aminoácidos como se muestra en la Figura 6 se pueden usar para la producción de los polipéptidos de la presente invención. Además, se entenderá que existen de manera natural variaciones alélicas de estas secuencias de ADN y aminoácidos, o se pueden introducir de manera adicional usando procedimientos conocidos en la técnica. Estas variaciones se pueden demostrar mediante una o más diferencias de aminoácidos en la secuencia global, o mediante supresiones, sustituciones, inserciones o adiciones de uno o más aminoácidos en dicha secuencia. Tales sustituciones aminoácidos se pueden preparar, por ejemplo, en base a la similitud en polaridad, carga, solubilidad, hidrofobicidad, hidrofilicidad y/o la naturaleza anfipática de los restos implicados. Por ejemplo, los aminoácidos cargados de manera negativa incluyen ácido aspártico y ácido glutámico; los aminoácidos cargados de manera positiva incluyen lisina y arginina; los aminoácidos con grupos principales polares no cargados polar o grupos principales no polares que tienen valores de hidrofilicidad similares incluyen los siguientes: leucina, isoleucina, valina, glicina, alanina, asparagina, glutamina, serina, treonina, fenilalanina, tirosina. Otras variaciones contempladas incluyen sales y ésteres de los polipéptidos anteriormente mencionados, así como precursores de los polipéptidos, por ejemplo, precursores que tienen sustituyentes N-terminal tales como metionina, N-formilmetionina y secuencias guía. Todas estas variaciones están incluidas dentro del ámbito de la presente invención.

La presente invención además se refiere a un procedimiento para producir hidantoinasa que comprende el cultivo de una célula huésped que contiene un vector de expresión capaz de expresar la hidantoinasa de la invención (procedimiento de "bioproducción").

La hidantoinasa de la invención es una enzima que cataliza de manera estereoselectiva la conversión de hidantoínas 5-monosustituidas en los correspondientes D-N-carbamoil-aminoácidos, y por lo tanto la invención se refiere de manera adicional a este procedimiento (procedimiento de "conversión"). El procedimiento de conversión de la invención es estereoselectivo, es decir, que produce principalmente el isómero D incluso cuando el material de partida es una mezcla racémica de los isómeros D y L. El procedimiento de conversión puede utilizar hidantoinasa pura, hidantoinasa parcialmente purificada o bruta, o células enteras.

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El procedimiento de conversión de la invención se puede mostrar como sigue:

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en la que R es H o un resto hidrocarburo. La naturaleza química específica del resto "R" no es importante ya que la enzima D-hidantoinasa de la invención específicamente actúa sobre el resto hidantoína.

El N-carbamil-D-aminoácido producido por la reacción anterior se convierte opcionalmente en una segunda etapa en un D-aminoácido como se muestra a continuación.

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en la que R es como se ha definido en el presente documento anteriormente.

La segunda etapa anterior se puede llevar a cabo mediante procedimientos químicos o enzimáticos que usan procedimientos convencionales conocidos en la técnica, tal como el procedimiento HONO de Bayer (Takehahashi, et al., J. Fermentation Technology, 57: 328, 1979).

El procedimiento de conversión de la presente invención se puede llevar a cabo después de la fermentación de la célula huésped empleada (fermentación y conversión de dos fases), o de manera simultánea con él, esto es, en el último caso, mediante fermentación y conversión in situ (fermentación y conversión de una sola etapa). En el procedimiento de una sola etapa, los microorganismos se pueden desarrollar en un medio apropiado hasta que se alcanza el crecimiento suficiente de los microorganismos. Un compuesto de la Fórmula II se puede añadir después a los cultivos microbianos y continuar la conversión enzimática estreoselectiva con la fermentación, preferiblemente hasta que se obtenga la conversión completa.

En el procedimiento de dos fases, el microorganismo puede, en la primera fase, desarrollarse en un medio apropiado para fermentación hasta que muestra la actividad enzimática deseada. Posteriormente, se pueden recoger las células mediante centrifugación, y las suspensiones de las células microbianas prepararse mediante la suspensión de las células recogidas en una solución tamponada apropiada. Se pueden usar tampones tales como tris-HCl, fosfatos, acetato de sodio y similares. También se puede usar agua para preparar suspensiones de células microbianas. En la segunda fase, el compuesto de Fórmula II se puede mezclar con las suspensiones de células microbianas, y catalizar la conversión enzimática estereoselectiva mediante la suspensión de células microbianas. La conversión se lleva a cabo preferiblemente hasta que todo o casi todo el compuesto de Fórmula II se hidroliza de manera estereoselectiva.

En el procedimiento de conversión, las células se pueden inmovilizar mediante procedimientos convencionales conocidos en la técnica (véase, por ejemplo, Immobilized Enzymes for Industrial Reactors, 1975, Ed. R. Messing, Academic Press, New York; y Immobilized Microbial Cells ACS Symposium Series 106, 1979, K. Venkasubramanian, American Chemical Society, Washington D.C.). la inmovilización puede implicar la unión covalente o atropamiento de células o extractos de hidantoinasa o pueden implicar la adsorción de células a superficies inorgánicas u orgánicas. El extracto de hidantoinasa o células enteras inducidas de manera apropiada se pueden inmovilizar mediante unión covalente en varias matrices de soporte tales como agarosa, celulosa, dextrano, vidrio, HYPOL (Hampshire Chemicals, Lexington, Massachusetts), poliacrilamide co-polímeros o poliestireno o mediante atropamiento con alginato, carragenano, agar, poliacrilamida o microencapsularse dentro de membranas de polímero tales como nitrato/acetato de celulosa, nylon, poliamida de lípidos y similares o mediante adosrción a superficies inorgánicas u orgánicas tales como sílice, alúmina, caolín, resinas de intercambio iónico, vidrio poroso, arcilla, celulosa, colágeno, gel de fosfato de calcio, carbono o bioprotadores de Tipo Z y Tipo CZ (W.R. Grace & Company). Después de que se ha completado la conversión, la enzima inmovilizada se puede separar físicamente a partir de la mezcla de reacción y usarse para reacciones posteriores.

El crecimiento de los microorganismos para o bien la bioproducción de la enzima o para la conversión enzimática in situ se puede lograr por los expertos en la técnica mediante el uso de un medio apropiado. El medio apropiado para el desarrollo de los microorganismos incluyen los que proporcionan los nutrientes necesarios para el desarrollo de las células microbianas, y pueden variar posteriormente dependiendo de los requerimientos de crecimiento de la célula huésped particular. Un medio típico para crecimiento incluye fuentes de carbono, fuentes de nitrógeno y oligoelementos necesarios. También se pueden añadir inductores. El término "inductor", como se usa en el presente documento, incluye cualquier compuesto que potencia la formación de la actividad de conversión enzimática deseada dentro de la célula microbiana. Los inductores adecuados incluyen hidantoína, ácido hidantoínico y los compuesto de Fórmula I. La cantidad de inductor está habitualmente entre aproximadamente 0,1 y aproximadamente 1,0 por ciento en peso de la mezcla de reacción total.

Las fuentes de carbono pueden incluir azúcares tales como maltosa, lactosa, glucosa, fructosa, glicerol, sorbitol, sacarosa, almidón, manitol, propilenglicol, y similares; ácidos orgánicos tales como acetato de sodiocitrato de sodio, y similares; aminoácidos tales como glutamato de sodio y similares; y alcoholes tales como etanol, propanol y similares. Las fuentes de nitrógeno pueden incluir N-Z amina, licor macerado de maíz A, harina de soja, extractor de buey, extractos de levadura, melazas, levadura de panadero, triptona, proteínas de soja, peptona, amina de levadura, nitrato de sodio, sulfato de amonio y similares.

Los oligoelementos pueden incluir fosfatos y sales de magnesio, manganeso, calcio, cobalto, níquel, hierro, sodio y potasio

El medio empleado puede incluir más de una fuente de carbono o hidrógeno u otro nutriente.

Los medios preferidos incluyen medios acuosos que contienen lo siguiente (en % de peso):

5

El pH del medio se ajusta preferiblemente hasta aproximadamente 6 a 8, lo más preferiblemente 6,5, se esteriliza, es decir, a una temperatura de 121ºC durante 30 minutos, y después se ajusta hasta un pH de aproximadamente 6,5 a 7,5, preferiblemente 7,0, después de la esterilización.

Durante el crecimiento de las células huésped, el pH del medio se mantiene preferiblemente entre 4,0 y 9,0, lo más preferiblemente entre 6,0 y 8,0. Para el procedimiento de conversión que usa la hidantoinasa formada previamente, el pH está preferiblemente entre 8 y 11, más preferiblemente entre aproximadamente 9 y 10.

La temperatura es una medida de la energía calorífica disponible para los procedimientos de bioproducción y conversión y se debe mantener para asegurar que existe suficiente energía disponible para este procedimiento. Un intervalo de temperatura adecuado para los procedimientos de la invención que implica el crecimiento de las células huésped está entre aproximadamente 15ºC y aproximadamente 60ºC. un intervalo de temperatura apropiado está entre aproximadamente 25ºC y aproximadamente 40ºC. Si se usa la hidantoinasa formada previamente para el procedimiento de conversión, la temperatura está preferiblemente entre aproximadamente 30ºC y aproximadamente 75ºC, más preferiblemente entre aproximadamente 40ºC y aproximadamente 45ºC.

No se conoce que la presión sea crítica para la práctica de la invención y por conveniencia, se emplea típicamente la presión atmosférica.

Los procedimientos de la invención que utilizan el crecimiento de las células huésped se llevan a cabo preferiblemente en condiciones aerobias. La agitación y aireación de la mezcla de reacción afecta a la cantidad de oxígeno disponible durante el procedimiento de reducción estereoselectiva que se puede llevar a cabo, por ejemplo, en cultivos de matraces de agitación o tanques de fermentador durante el crecimiento de microorganismos en un procedimiento de una sola fase o de dos fases. Es preferible un intervalo de agitación entre 50 y 500 RPM, siendo lo más preferible entre 50 y 100 RPM. La aireación de aproximadamente 0,1 a 10 volúmenes de aire por volumen de medio por minuto (es decir, 0,1 a 10 v/v) se prefiere, siendo lo más preferido la aireación de 5 volúmenes de aire por volumen de medio por minuto (es decir, 5 v/VT).

En el procedimiento de conversión estereoselectiva, la conversión completa del compuesto de Fórmula II se puede realizar, por ejemplo, desde aproximadamente 4 a 48 horas, preferiblemente 12 a 24 horas, medido desde el tiempo de tratamiento inicialmente el compuesto de Fórmula II con un microorganismo (es decir, célula huésped) o enzima como se describe en el presente documento. La formación del producto de reacción se puede controlar mediante cromatografía líquida de alta resolución (HPLC) o mediante ensayos colorimétricos sencillos.

Se prefiere emplear un líquido acuoso como medio de reacción para el procedimiento de conversión, aunque un líquido orgánico, o una mezcla de líquido orgánico/acuoso (bifásica) miscible o no miscible también se puede emplear cuando se usa hidantoinasa formada previamente.

En el procedimiento de conversión, se emplea preferiblemente 0,1 a 30% en peso del compuesto de material de partida de Fórmula II basado en el peso combinado del compuesto y medio de reacción. La alta concentración de hidantoínas se puede suspender en disolventes tales como metanol hasta concentración de aproximadamente 10% (peso.) para incrementar su solubilidad. La cantidad de enzima o microorganismo empleado con relación al material de partida se selecciona para permitir la catálisis de la conversión enzimática estereoselectiva de la presente
invención.

En el procedimiento de conversión que usa enzima formada previamente, la hidantoinasa en general se añade a una concentración de aproximadamente 0,5 a aproximadamente 10 unidades por ml.

Los productos del procedimiento de conversión estereoselectiva de la presente invención se pueden aislar y purificar mediante metodologías conocidas tales como mediante extracción, destilación, cristalización, cromatografía en columna, y similares.

Un procedimiento preferido para separar el compuesto deseado de Fórmula I de los compuestos restantes del medio de reacción es mediante el paso de la mezcla de reacción a través de un cartucho de ultrafiltración espiral S10Y3 de Amicon (Beverly, Massachusetts) o producto similar. El perneado desproteinado que contiene los N-carbamil D-aminoácidos se puede escindir al D-aminoácido correspondiente mediante tecnología química convencional. El retenido que contiene la hidantoinasa se puede usar para un procedimiento de conversión posterior.

El procedimiento de conversión de la presente invención da como resultado un alto rendimiento del compuesto de Fórmula I. Un rendimiento químico es mayor que aproximadamente 80%, preferiblemente mayor que aproximadamente 90%, más preferiblemente mayor que aproximadamente 95%, y lo más preferiblemente aproximadamente 99%. El presente procedimiento también da como resultado una excelente pureza óptica. La pureza óptica típica es mayor que aproximadamente 90%, preferiblemente mayor que aproximadamente 95% y lo más preferiblemente mayor que 99%.

Los siguientes ejemplos son además ilustrativos de la presente invención. Estos ejemplos proporcionan además entendimiento de la invención, y no se pretende que limiten el ámbito de la presente invención.

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Ejemplos Ejemplo 1 Uso de células enteras de Ochrobactrum anthropi como fuente de enzima de la Hidantoinasa 1.1 Ensayos de Conversión Consecutiva con Células Lavadas de Ochrobactrum anthropi

Se inoculó Ochrobactrum anthropi, un bucle de asa de siembra de cultivo inclinado en soja de tripticasa (pH 8,0) en dos matraces de 100 ml de medio de producción BPYNH por matraz regular de 500 ml, y se agitó a 37ºC durante 24 horas.

\newpage

Medio de producción BPYNH

\quad

0,5% de Polvo de Extracto de Buey

\quad

0,5% de extracto de Levadura

\quad

1% de Bacto-Peptona

\quad

0,15% de NaCl

\quad

0,1% de hidantoína

\quad

(pH 8,0).

Se centrifugaron los caldos completos (200 ml) 12,000 rpm a 10ºC 15 minutos, se lavaron una vez 0,9% de solución salina, se volvieron a suspender en 10 ml de solución salina en matraces de 125 ml se calentaron previamente hasta 37ºC. Se añadieron suspensiones de células, se ajustó rápidamente el pH hasta 8,5 con 1N NaOH, volumen final ajustado hasta 20 ml con H_{2}O, y se agitaron las incubaciones en matraces tapados a 37ºC. Se tomaron muestras (800 \mul) y se inactivaron con 200 \mul de 12% de TCA. Se ensayaron los sobrenadantes como se ha descrito previamente. Los resultados del porcentaje de conversión se resumen en la siguiente tabla.

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TABLA 1

6

1.2 Perfil de temperatura de la actividad de la hidantoinasa

Se inoculó el cultivo en medio de producción BPYNH 100 ml por matraz regular de 500 ml y se agitó a 37ºC durante 22 horas. Células lavadas, 1 ml se incubaron a concentración 10X en 0,45% de solución salina/100 mM TAPS pH 8,5/10 mg por ml DL-p-hidroxifenil hidantoína a 28º, 32º, 37º, y 42ºC durante 5 horas y 24 horas. Se terminaron las reacciones con 250 \mul de 12% de TCA y se ensayaron los sobrenadantes. Las actividades relativas aparecen en la Figura 1. La actividad óptima se produce a temperaturas mayores que 42ºC.

1.3 Efecto de Glutaraldehído y tratamiento de acetona de células enteras

Alícuotas de 0,5 ml de suspensión de células lavadas se trataron con 0,5 ml de glutaraldehído (G.A.) concentración final de 2% en tampón fosfato pH 7,0, o con 0,5 ml de G.A. 2% en tampón fosfato y 1 ml de acetona, o con 0,5 ml de acetona sola a temperatura ambiente durante 10 minutos. Se lavaron las células tratadas con 10 ml de 0,9% de solución salina y después con solución salina + 1 mg/ml de sulfato de amonio y se volvieron a suspender en 1 ml de tampón 100 mM TAPS pH 8,5. Las suspensiones de células resuspendidas se incubaron con 10 mg/ml de D,L-p-hidroxifenil hidantoína en 100 mM de TAPS pH 8,5 (volumen final 800 \mul) a 42ºC durante 4 horas. Las reacciones se terminaron con 200 \mul de TCA 12% y se ensayaron.

TABLA 2

7

1.4 pH óptimo de la actividad de la Hidantoinasa

Usando un concentrado de células tratado con glutaraldehído de Ochrobactrum anthropi, se hicieron las incubaciones con 10 mg/ml de DL-p-hidroxifenil hidantoína en tampón 200 mM TAPS a diversos pH y 42ºC. Se cubrió en un experimento el intervalo de pH 8,0 - 8,8 y pH 8,8 - 9,8 en otro ensayo. Los ajustes de pH de nuevo a normales se realizaron a tiempos de muestreo y al menos cada 30 minutos. La Figura 2 muestra el pH óptimo de actividad pH 8,8.

1.5 Estabilidad de la enzima a pH 8,8, 9,3 y 9,8

Células tratadas con Glutaraldehído del estudio del perfil de pH se mantuvieron a pH 8,8, 9,3 y 9,8 durante aproximadamente 4 horas. Se lavaron los sólidos, se volvieron a suspender en 25 mM TAPS pH 8,8 y 10 mg/ml D,L-p-hidroxifenil hidantoína y se incubaron a 42ºC durante 4 horas. Los resultados mostraron la mayor estabilidad de la enzima a tratamiento de pH 8,8. El pH óptimo de actividad a 8,8 en el estudio de perfil de pH era probablemente debido a la mayor estabilidad de enzima pH 8,8 en lugar de pH 9,3 ó 9,8.

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TABLA 3 Estabilidad de la hidantoinasa a pH alcalina

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8

1.6 Efecto de Concentración de Sustrato sobre la Relación de Conversión

El sustrato de D,L-p-hidroxifenil hidantoína no es completamente soluble a 5 mg/ml y de esta manera las suspensiones se realizaron y se incubaron con células tratadas con glutaraldehído. Las incubaciones fueron en 200 mM TAPS pH 8,8, 42ºC durante 6 horas, y los ajustes de pH se volvieron a los normales al menos cada hora. Las reacciones se ensayaron y el producto formado en mg/ml se registra a continuación.

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TABLA 4

9

1.7 Inmovilización de la Hidantoinasa

Se obtuvo extracto bruto de la hidantoinasa mediante fluidificación de concentrado de células lavadas. Se inmovilizó la enzima sobre celita mediante la suspensión del extracto bruto y celita con dos volúmenes de acetona y 4% de glutaraldehído y se lavaron con aguar. Se recuperaron los sólidos mediante centrifugación y tenían una actividad de aproximadamente 0,3 IU por gramo de peso húmedo.

Después de la reacción con enzima inmovilizada, la mezcla de reacción se filtró para retirar la enzima, después se evaporó hasta una décima parte del volumen. Se ajustó el pH hasta 5,0, la mezcla se trató con carbón activo y el filtrado se ajustó hasta 2,0. El N-carbamoil aminoácido cristalizó inmediatamente, y después se almacenó a 0ºC durante 1 hora, los cristales de lavaron y se lavaron con agua y se secaron.

La rotación óptica de este material se midió y se comparó con el valor para la auténtica D-N-carbamoil (4-hidroxifenil glicina) preparada en este laboratorio y con el valor de la bibliografía.

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TABLA 5

10

Esta rotación evidentemente muestra que el material aislado del biorreactor tiene la configuración D. También muestra que es al menos 98% puro.

1.8 Reuso de la Hidantoinasa inmovilizada

La enzima inmovilizada por Glutaraldehído (9,23 gramos de peso húmedo) se suspendió en 20 ml de 400 mM TAPS pH 8,7, se añadieron 400 mg de D,L-p-hidroxifenil hidantoína, se cubrieron con nitrógeno y se agitaron a 42ºC, 130 rpm durante 23 horas. Inicialmente el pH bajó hasta 4 horas o así, pero se estabilizó eventualmente e incluso ligeramente rosa. Se ajustó el pH de nuevo hasta normal aproximadamente cada hora durante las seis horas y se muestrearon 800 \mul, se inactivaron con 200 \mul de 12% de TCA y se ensayaron. A las 24 se lavaron los sólidos de enzima con agua, se añadió sustrato reciente, y se volvió a incubar como antes durante tres veces consecutivas. Se almacenó la enzima en H_{2}O entre los ensayos 2 y 3.

Los resultados en términos de mg/ml de carbamoil aminoácido aparecen en la siguiente tabla. (Los ensayos 2 y 3 reflejan una transferencia de aproximadamente 1 - 1,3 mg/ml de producto).

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TABLA 6

11

Recuperación final de hidantoína

12

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Ejemplo 2 Purificación y Caracterización de la Hidantoinasa a partir de Ochrobactrum anthropi 2.1 Purificación de la Hidantoinasa

Cultivos inclinados sobre soja tripticasa 3% o agar YNH (pH 8,0) se inocularon en 100 ml de medio YNH por matraz regular de 500 ml y se agitó a 250 rpm a 28ºC durante 24 horas. Se cruzó la siembra a 4% en 100 ml de medio CSH-8 (pH 7,0) por matraz regular de 500 ml y se agitó a 250 rpm a 28ºC durante 24 horas. (caldo entero total
pH \sim 7,9 - 8,1)

13

Se recogieron células enteras de 10 litros de caldo mediante centrifugación y se volvieron a suspender hasta 1,0 litros en H_{2}O. Se rompieron las células pasando tres veces a través de un microfluidificador (Microfluidics Corporation). La mezcla se centrifugó para retirar los desechos celulares y el sedimento resultante se lavó una vez con 200 ml. El volumen final de la enzima bruta obtenida 1,3 litros.

Se añadió sulfato de sodio hasta 60% de saturación a la fracción clarificada. La enzima precipitada se recogió mediante centrifugación. Se disolvió el sedimento en 50 mM HEPES pH 7,5 hasta un volumen final de 250 ml. Se centrifugó la enzima para retirarlos sólidos inactivos restantes. Se dializó la enzima durante toda una noche contra tampón 50 mM HEPES pH 7,5 y se concentró en un Centriprep 30 (30,000 MWCO) hasta 50 ml.

La solución de enzima concentrada se aplicó a una columna de 45 x 300 mm DEAE Trisacryl equilibrada previamente con 50 mM HEPES pH 7,5. Se lavó la columna de nuevo con 2 volúmenes de columna del mismo tampón. Se eluyó la enzima con un gradiente de 0 - 300 mM NaCl sobre 500 ml en 50 mM HEPES pH 7,5. Las fracciones se ensayaron para la determinación del contenido de proteína y actividad. Las fracciones de actividad máxima se concentraron en un Centriprep 30 (30,000 MWCO) hasta aproximadamente 2,0 ml.

El concentrado de la columna de DEAE Trisacryl se aplicó a una columna 10 x 300 mm Superose 12 (equilibrada previamente con 50 mM HEPES pH 7,5) y se eluyó con aproximadamente 60 ml del mismo tampón.

Las fracciones de actividad máxima para la columna Superose 12 se reunieron y se concentraron hasta 1,0 ml en un Centricon 30 (30,000 MWCO) y se aplicaron a un 1 mm de gel de 10% de poliacrilamida y se desarrollaron en condiciones nativas. El gel se dividió en secciones y las secciones individuales se ensayaron para determinar la actividad. Las secciones que contenían la actividad de la hidantoinasa se electroeluyeron para recuperar la enzima. La enzima obtenida mediante este procedimiento era > 90% homogénea determinada mediante SDS-Page.

2.2 Determinación del epso molecular de la Hidantoinasa

La cromatografía de filtración en gel indicó que el peso molecular de la hidantoinasa nativa era aproximadamente 100.000 a 110.000 Daltons.

Las muestras desnaturalizadas por calor del ensayo de la hidantoinasa sobre el gel de SDS reductor proporcionó una sola banda a aproximadamente 53.000 Daltons, mientras que la misma muestra del gel SDS no reductor proporcionó casi la misma intensidad a 57.000 y 53.000 Daltons que indicaban que la proteína de la hidantoinasa es probablemente un homodímero (53.000) con una estructura secundaria que se desarrolla a 57.000.

Las muestras no sometidas a ebullición sobre gel de SDS no reductor proporcionó una sola banda a aproximadamente 100.000 Daltons que confirma los resultados obtenidos mediante cromatografía de filtración en gel.

2.3 Actividad específica de la Hidantoinasa

Se ensayó el eluyente de la banda activa del gen nativo preparativo y se determinó la proteína mediante el protocolo de ensayo de Pierce Microtiter usando el patrón de BSA. Se determinó la actividad específica a más de 4 IU por mg de proteína.

2.4 valor PI de la Hidantoinasa

Se desarrolló el eluyente de la banda activa del gen nativo preparativo sobre el gel Phast System IEF-PAGE con un intervalo de pH de 3 - 9 usando marcadores de proteína de bajo Peso Molecular y se tiñó el gel con plata. PI de la proteína de la banda activa se determinó a aproximadamente 4,5.

2.5 Secuencia de aminoácidos N-terminal de la Hidantoinasa

El extremo N de la subunidad de 53.000 Da se determinó mediante la secuenciación automática de Edman que era: Ala-Lys-Val-Ile-Lys-Gly-Gly-Thr-Val-Ile-Thr-Ala-Asp-Arg-Thr-Phe (SEQ ID NO: 3)

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Ejemplo 3 Aislamiento del gen que codifica la hidantoinasa a partir de Ochrobactrum anthropi 3.1 Preparación de ADN cromosómica a partir de Ochrobactrum anthropi

Dos matraces de 125 ml que contenían 25 ml de medio de siembra se inocularon a partir de un cultivo inclinado de Ochrobactrum anthropi. Se desarrollaron los cultivos a 28ºC, 250 rpm durante 24 horas en 1,5% de extracto de levadura, 0,15% de NaCl, 0,1% de hidantoína, pH 8,0. Se recogieron las células mediante centrifugación, se lisaron y se digirieron en tampón TE (10 mM Tris-Cl pH 8,0, 1 mM EDTA) que contenía 100 \mug/ml de proteinasa K y 0,5% de SDS. La suspensión se incubó a 37ºC durante 1 hora. La mezcla se precipitó después en 10% de CTAB (bromuro de hexadeciltrimetilammonio, Sigma H-5882) en 0,7 M de NaCl a 65ºC durante 20 minutos para retirar los desechos celulares, polisacáridos, y proteínas restantes. (Wilson, K. (1994) Preparation of Genomic ADN from Bacteria, in F.M. Ausubel, R. Brent, R.E. Kingston, D.D. Moore, J.A. Smith, J.G. Seidman, y K. Struhl (Eds.), Current Protocols in Molecular Biology. John Wiley & Sons, New York.) se extrajo la mezcla dos veces, primero con cloroformo: alcohol isoamílico (24:1), después con fenol:cloroformo:alcohol isoamílico (25:24:1) y se precipitó en isopropanol. El sedimento de ADN se disolvió en TE que contenía 100 \mug/ml de ARNasa A y se incubó a 22ºC durante 16 horas. Se realizó una segunda digestión con proteinasa K/SDS y se repitieron las extracciones orgánicas y precipitación con etanol. El ADN se disolvió en TE. La concentración de ADN se determinó espectrofotométricamente a 260 nm.

3.2 Construcción de genoteca de ADN genómico de Ochrobactrum anthropi

A partir de la secuencia de aminoácidos N-terminal (sección experimental 2.5 anterior) se sintetizaron cuatro sondas de oligonucleótidos degenerados de 17 meros con el sintetizador de ADN PCR-MATE de Applied Biosystems 391 (Figura 3), se marcó en el extremo con \gamma[^{32}P]ATP (Amersham AH 9968), y se usó para sondar una transferencia de Southern (véase Southern, E.M. 1975, J. Mol. Biol. 98: 503 - 517) de ADN cromosómico de O. anthropi digerido con endonucleasas de restricción BamHI, EcoRI, y HindIII. Se llevó a cabo la hibridación en solución de tampón TMAC (3 M TMAC, 0,1 M Na3PO4, pH 6,8, 5X Denhardt's, 1% de SDS, 100 \mug/ml de ADN de esperma de salmón desnaturalizado, 1 mM EDTA) a 46ºC durante 18 horas. TMAC es cloruro de tetrametilammonio, Sigma T-3411. Las transferencias de Southern de la digestión con HindIII del ADN cromosómico identificó dos fragmentos de 6 Kb y 12 Kb, que se hibridaron a una de las sondas de oligonucleótidos N-terminal. ADN cromosómico de O. anthropi se digirió con HindIII, se sometió a electroforesis a través de un gel de agarosa preparativo de 0,8% de SeaPlaque (FMC) en tampón TAE (0,04 M Tris-acetato, 0,002 M EDTA) a 10 voltios durante 16 horas. Los sílices de gel que contenían fragmentos de ADN de 5 - 7 Kb y fragmentos de 0 - 14 Kb se escindieron y se aislaron con el sistema Glass Max ADN Spin Cartridge (BRL). Los fragmentos de HindIII se ligaron al vector pBluescript KS+ fagémido (Stratagene) que se había modificado reemplazando el marcador seleccionable de ampicilina con un marcador seleccionable de neomicina (pSTKSN), se escindió con HindIII y se desfosforiló con fosfatasa alcalina bacteriana. La mezcla de ligamiento se usó para transformar células de E. coli XL1-blue (Stratagene) mediante electroporación a 2.5 Kvoltios, 200 ohms, 25 PFd. Se seleccionaron los transformantes sobre agar LB que contenía 30 \mug/ml de neomicina.

3.3 Selección del clon que contiene el gen de la hidantoinasa

Las transferencias de la genoteca genómica se prepararon y se seleccionaron con la sonda de nucleótidos N-terminal. Se seleccionaron inicialmente doce clones de cada fragmento para la evaluación adicional. El ADN de plásmido se aisló de cada transformante usando el procedimiento de mini-prep TELT (He, et al., Nucl. Acids Res., 18: 1660 (1990)). El análisis de Southern de estos clones identificó dos que se hibridaron a la sonda. El análisis de restricción determinó que estos dos clones contenían fragmentos de HindIII de 13 Kb en la misma orientación (Figura 4). El análisis adicional del fragmento de HindIII de 13 Kb mediante la extensión del cebador y transferencia de Southern determinó la localización y orientación del gen de la hidantoinasa dentro del fragmento. Un fragmento de EcoRV de 4 Kb se aisló de uno de de los dos clones y se subclonó en el vector pSTKSN pBluescript KS+ fagémido que se había escindido con EcoRV y se desfosforiló con fosfatasa alcalina bacteriana. El ADN del plásmido se aisló a partir de 12 colonias como se ha descrito anteriormente y se analizó mediante digestión con EcoRI. Se identificaron dos clones que contenían el fragmento correcto en orientaciones opuestas (Figura 5). Estos dos clones se ensayaron para determinar la actividad y uno se mostró que producía aproximadamente dos veces la cantidad de la enzima celular total que las células originales de Ochrobactrum. La secuenciación de los nucleótidos del fragmento de EcoRV de 4 Kb identificó la secuencia que era complementaria a la sonda 4 (SEQ ID NO: 7). La traducción de la secuencia de ADN adyacente produjo una secuencia de aminoácidos que era idéntica a la secuencia de aminoácidos N-terminal determinada previamente (SEQ ID NO: 3).

3.4 Determinación de la secuencia de nucleótidos

La secuencia de nucleótidos del gen de la hidantoinasa codificado sobre el fragmento de 4 Kb EcoRV se determinó mediante el procedimiento de terminación de la cadena didesoxi (Sanger, et al., Proc. Natl. Acad. Sci.,Estados Unidos. 74: 5463 - 5467 (1977)) usando el sistema de secuenciación de de ciclos de ADN fmol (Promega). La sonda de oligonucleótidos N-terminal usada para identificar el gen (directa e inversa) y cebadores internos sintetizados se usaron para secuenciar el gen completo de ambas hebras. Se realizó la electroforesis sobre un gel de poliacrilamida Long Ranger al 7% (AT BIOCHEM) que contenía 7 M urea en tampón TBE (0,089 M Trisborato, 0,089 M ácido bórico, 0,002 M EDTA) a 2700 voltios. La secuencia de nucleótidos completa se muestra en la Figura 6. La región codificante es de 1440 pares de bases de longitud y codifica una proteína de 480 aminoácidos (P M = 53 kD). Esto es consistente con la forma desglicosilada de la enzima (sección experimental 1.5 anterior). La secuencia de proteína N-terminal determinada a partir de la traducción de la secuencia de ADN es idéntica a la secuencia de proteína identificada en la sección experimental 2.5 anterior.

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Ejemplo 4 Expresión del gen para la hidantoinasa en E. coli 4.1 Subclonación en los vectores de expresión

La región codificante del gen de la hidantoinasa se mutagenizó mediante la PCR para insertar un sitio de restricción BamHI más NcoI en el sitio de inicio de la traducción de la región codificante y un sitio BamHI en el extremo 3' del gen para facilitar la clonación en los vectores de expresión. Se sintetizaron los siguientes cebadores para la reacción de la PCR:

	5'-GGGAACGAGGATCCATGGCAAAGGT-3'	(SEQ ID NO:10)
	(contiene los sitios BamHI y NcoI)_

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	5'-AACTCATGCGCGGATCCCGAAGCTG-3'	(SEQ ID NO: 11)
	(contiene el sitio BamHI)

El fragmento de la PCR se digirió con BamHI y se purificó en columna con el sistema Glass Max ADN Spin Cartridge (BRL). Este fragmento se ligó al vector de fagémido pSTKSN de pBluescript que se había escindido con BamHI y desfosforilado con fosfatasa alcalina bacteriana. La mezcla de ligamiento se usó para transformar las células DH5\alphamcr competentes de E. coli (BRL). El ADN del plásmido se aisló a partir de 6 colonias como se describe en la sección experimental 3.3 anterior y se analizó mediante digestión con BamHI. Cinco de los clones contenían la construcción correcta y se analizaron mediante digestión con NcoI. Los cinco tenían el sitio NcoI. Uno de estos se seleccionó para subclonar en varios vectores de expresión (Figura 7). Este clon se denominó pKSHY3.

El pKSHY3 se digirió con NcoI y BamHI, después se sometió a electroforesis a través de un gel de agarosa preparativo al 0,8% SeaPlaque (FMC) en tampón TAE a 40 voltios durante 4 horas. El fragmento NcoI/BamHI de 1479 pares de bases se escindió del gel y se aisló con el sistema Glass Max ADN Spin Cartridge (BRL). Este fragmento se ligó al vector de expresión pBMS1000 (Patente de Estados Unidos Nº 6.068.991 30 de mayo de 2000, S.W. Lin y T. Franceschini, "High Expression Escherichia Coli Expression Vectors", cuyo contenido se incorpora en presente documento por referencia) que se había escindido con NcoI y BamHI. La mezcla de ligamiento se usó para transformar las células competentes DH5\alphamcr de E. coli (BRL). Se seleccionaron las colonias mediante digestión con NcoI/BamHI y todos conferían la construcción correcta (Figura 8). Este clon se denominó pBMS1000HY-1. Este clon se usó para transformar los huéspedes W3110, BL21, y nº 7 de E. coli (ATCC 23736).

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4.2 Expresión en huéspedes de E. coli

Dos clones de cada huésped se seleccionaron para evaluación en matraz de agitación. El análisis de restricción confirmó que cada clon contenía la construcción correcta. Los cultivos recientes de toda la noche se usaron para inocular cultivos de caldo T de 25 ml desarrollados en selección de neomicina. Los cultivos se incubaron a 37ºC y se desarrollaron a una A_{600} de 2. Se midió en un momento cero y después los cultivos se indujeron con 0,4 mM IPTG. Se recogieron en los momentos de una y dos horas. Se recogieron los cultivos y se ensayaron para determinar la actividad y se analizaron en momentos para determinar la expresión sobre un gel de gradiente de proteína al 4 - 20% (Enprotech), se sometieron a electroforesis en condiciones reductoras a 20 - 25 mA. Los ges de proteína indican niveles crecientes de expresión comparado con las células de Ochrobactrum. La Tabla 7 resume lo resultados de actividad. Basándose en estos resultados, BL21 se eligió como el mejor huésped para los estudios adicionales de expersión de la hidantoinasa.

TABLA 7

14

Ejemplo 5 Caracterización e Inmovilización de la hidantoinasa recombinante 5.1 Especificidad de sustrato

BL21 de E. coli que contiene el gen de la hidantoinasa se desarrolló como se ha descrito en el ejemplo 4.2. Las células se centrifugaron y se lavaron con tampón 100 mM carbonato pH 9,0 y se volvieron a suspender en el mismo tampón y se rompieron mediante sonicación. La enzima se purificó como en el ejemplo 2. La enzima purificada se ensayó para determinar la especificidad del sustrato con diversas hidantoínas como sustrato. Los resultados se resumen en la tabla 9.

TABLA 9

15

5.2 Requerimientos de ion metálico

La hidantoinasa purificada se ensayó con hidantoína con la adición de los diversos iones metálicos a concentración de 100 mM. Los resultados se resumen en la tabla 10 a continuación.

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TABLA 10 Actividad específica de ion metálico

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16

Existe actividad en la ausencia de ion metálico pero Fe (II) y Mn (II) parecían estimular la actividad de la enzima.

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5.3 Óptimo de temperatura de la hidantoinasa recombinante purificada e inmovilizada

La enzima recombinante se inmovilizó como se ha descrito para la enzima nativa en el ejemplo 1.7. La enzima inmovilizada y y la enzima purificada se ensayaron a diversas temperaturas para determinar la temperatura óptima. Los resultados se proporcionan en la tabla 11 a continuación.

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TABLA 11

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17

Aunque la presente invención se ha descrito en algún detalle a modo de ilustración y ejemplo para propósitos de claridad y comprensión. Será evidente que ciertos cambios y modificaciones se pueden poner en práctica dentro del ámbito de las reivindicaciones anexas.

<110> Compañía Bristol-Myers Squibb

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<120> D-Hidantoinasa de Ochrobactrum anthropi

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<130> H2644 EP S3

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<140> US 10/114,810

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<141> 2002-04-03

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\vskip0.400000\baselineskip

<150> US 60/281,150

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<151> 2001-04-03

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\vskip0.400000\baselineskip

<160> 10

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<170> PatentIn version 3.1

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<210> 1

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<211> 2113

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<212> ADN

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<213> Ochrobactrum anthropi

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\vskip0.400000\baselineskip

<400> 1

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18

19

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<210> 2

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<211> 484

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<212> PRT

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<213> Ochrobactrum anthropi

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\vskip0.400000\baselineskip

<400> 2

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20

21

22

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<210> 3

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<211> 16

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<212> PRT

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<213> Ochrobactrum anthropi

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\vskip0.400000\baselineskip

<400> 3

23

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<210> 4

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<211> 17

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<212> ADN

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<213> Ochrobactrum anthropi

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\vskip0.400000\baselineskip

<220>

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<221> misc_característica

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<222> (3)..(3)

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<223> en la que "n" puede ser "t" o "c"

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<220>

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<221> misc_característica

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<222> (6)..(6)

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<223> wherein "n" puede ser "a", "g", o "t"

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<220>

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<221> misc_característica

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<222> (12)..(12)

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<223> en la que "n" puede ser "t" o "c"

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\vskip0.400000\baselineskip

<220>

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<221> misc_característica

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<222> (15)..(15)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> en la que "n" puede ser "a", "g", "c", o "t"

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 4

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\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

ccnttnatca cnttngc

\hfill

17

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\vskip0.400000\baselineskip

<210> 5

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<211> 17

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

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<213> Ochrobactrum anthropi

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\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> misc_característica

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<222> (3)..(3)

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<223> en la que "n" puede ser " t" o "c"

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> misc_característica

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<222> (6)..(6)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> en la que "n" puede ser "a", "g", o "t"

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

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<221> misc_característica

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<222> (12)..(12)

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<223> en la que "n" puede ser "t" o "c"

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

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<221> misc_característica

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<222> (15)..(15)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> en la que "n" puede ser "a", "g", "t", o "c"

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 5

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\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

ccnttnatta cnttngc

\hfill

17

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 6

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<211> 17

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<212> ADN

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<213> Ochrobactrum anthropi

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\vskip0.400000\baselineskip

<220>

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<221> misc_característica

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<222> (3).. (3)

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<223> en la que "n" puede ser "t" o "c"

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<220>

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<221> misc_característica

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<222> (6)..(6)

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<223> en la que "n" puede ser "a", "g", o "t"

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<220>

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<221> misc_característica

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<222> (12)..(12)

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<223> en la que "n" puede ser "t" o "c"

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<220>

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<221> misc_característica

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<222> (15)..(15)

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<223> en la que "n" puede ser "a", "g", "t" o "c"

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<400> 6

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\hskip-.1em\dddseqskip

ccnttnataa cnttngc

\hfill

17

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<210> 7

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<211> 17

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<212> ADN

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<213> Ochrobactrum anthropi

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\vskip0.400000\baselineskip

<220>

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<221> misc_característica

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<222> (3)..(3)

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<223> en la que "n" puede ser "t" o "c"

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<220>

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<221> misc_característica

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<222> (6)..(6)

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<223> en la que "n" puede ser "a" "g", o "t"

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<220>

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<221> misc_característica

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<222> (12)..(12)

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<223> en la que "n" puede ser "t" o "c"

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<220>

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<221> misc_característica

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<222> (15)..(15)

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<223> en la que "n" puede ser "a", "g", "t", o "c"

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 7

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\hskip-.1em\dddseqskip

ccnttnatga cnttngc

\hfill

17

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\vskip0.400000\baselineskip

<210> 8

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<211> 17

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<212> ADN

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<213> Ochrobactrum anthropi

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<220>

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<221> misc_característica

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<222> (3)..(3)

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<223> en la que "n" puede ser "a", "g", "t", o "c"

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

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<221> misc_característica

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<222> (6)..(6)

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<223> en la que "n" puede ser "g" o "a"

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\vskip0.400000\baselineskip

<220>

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<221> misc_característica

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<222> (9)..(9)

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<223> en la que "n" puede ser "a", "g", "t", o "c"

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

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<221> misc_característica

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<222> (12)..(12)

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<223> en la que "n" puede ser "a", "c", o "t"

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<220>

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<221> misc_característica

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<222> (15)..(15)

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<223> en la que "n" puede ser "g" o "a"

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<400> 8

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\hskip-.1em\dddseqskip

gcnaangtna tnaangg

\hfill

17

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<210> 9

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<211> 6

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<212> PRT

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<213> Ochrobactrum anthropi

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<400> 9

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\sa{Ala Lys Val Ile Lys Gly}

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<210> 10

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<211> 17

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<212> ADN

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<213> Ochrobactrum anthropi

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<220>

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<221> misc_característica

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<222> (3)..(3)

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<223> en la que "n" puede ser "t" o "c"

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<220>

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<221> misc_característica

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<222> (6)..(6)

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<223> en la que "n" puede ser "a", "g", o "t"

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<220>

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<221> misc_característica

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<222> (9)..(9)

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<223> en la que "n" puede ser "a", "g", o "t", o "c"

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<220>

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<221> misc_característica

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<222> (12)..(12)

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<223> en la que "n" puede ser "t" o "c"

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<220>

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<221> misc_característica

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<222> (15)..(15)

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<223> en la que "n" puede ser "a", "g", "t", o "c"

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<400> 10

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\hskip-.1em\dddseqskip

ccnttnatna cnttngc

\hfill

17

Claims (14)

1. Una molécula de ácido nucleico seleccionada entre el grupo constituido por:

(a) una molécula de ácido nucleico que comprende una secuencia que codifica un polipéptido que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO : 2;

(b) una molécula de ácido nucleico que comprende la secuencia de nucleótidos de la SEQ ID NO: 1; y

(c) una molécula de ácido nucleico que tiene una secuencia complementaria, o capaz de hibridarse en condiciones rigurosas a la secuencia de nucleótidos de la SEQ ID NO: 1.

2. La molécula de ácido nucleico de la reivindicación 1 que es una molécula de ADN.

3. Un polipéptido que tiene la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 2, o que es al menos 80% idéntica a la SEQ ID NO: 2, o codificada por una secuencia de ácido nucleico capaz de hibridarse en condiciones rigurosas a un ácido nucleico que codifica la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO : 2.

4. Un vector de expresión que comprende una molécula de ácido nucleico de la reivindicación 1 ó 2.

5. El vector de expresión de la reivindicación 4 que comprende además un origen de replicación, un promotor, y una secuencia de terminación de transcripción.

6. El vector de expresión de la reivindicación 4 que comprende además un marcador de genes seleccionable.

7. El vector de expresión de la reivindicación 4 en la que dicho vector es un plásmido.

8. El vector de expresión de la reivindicación 7 en la que dicho plásmido se selecciona entre el grupo: plásmido hyd13f como se muestra en la Figura 4, y el plásmido hyd4f como se muestra en la Figura 5.

9. Una célula huésped que contiene el vector de expresión de una cualquiera de las reivindicaciones 4 a 6.

10. La célula huésped de la reivindicación 9 que se selecciona entre el grupo: eucariótico y procariótico.

11. Un procedimiento para producir un polipéptido que tiene la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 2 que comprende el cultivo de la célula huésped de la reivindicación 9 en condiciones que dan como resultado la expersión del polipéptido.

12. Un anticuerpo que se une al polipéptido de la reivindicación 3.

13. Un procedimiento de convertir de manera estereoselectiva una hidantoína 5-monosubstituida que comprende poner en contacto dicha hidantoína 5-monosubstituida con la D-hidantoinasa como se muestra en la SEQ ID NO: 2, o el polipéptido de la reivindicación 3 que tiene actividad D-didantoinasa o un fragmento de la SEQ ID NO: 2 que tiene actividad D-didantoinasa, en condiciones adecuadas para formar el correspondiente D-N-carbamoil-aminoácido.

14. El procedimiento de la reivindicación 13 en la que dicha hidantoína 5-monosustituida es una mezcla racémica.