ES2304455T3 - Promotor 7s alfa especifico de la semilla para expresion de los genes en las plantas. - Google Patents
Promotor 7s alfa especifico de la semilla para expresion de los genes en las plantas. Download PDFInfo
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Abstract
Una planta transformada que contiene una molécula de ácido nucleico que comprende en la dirección 5'' a 3'': un promotor que tiene una secuencia de ácido nucleico seleccionada del grupo que consiste de las SEQ ID NOs: 11 y 12, una secuencia de ácido nucleico que exhibe una identidad con las SEQ ID NOs: 11 y 12 superior al 90% y complementos de las mismas, y una secuencia estructural de ácido nucleico operativamente enlazada, en donde el promotor es heterólogo con respecto a la secuencia estructural de ácido nucleico, y en donde el promotor es específico de la semilla.
Description
Promotor 7S\alpha específico de la semilla
para expresión de los genes en las plantas.
La presente invención se relaciona con el campo
de la genética de las plantas. Más específicamente, la presente
invención se relaciona con la expresión de genes específicos de la
semilla.
Las semillas proveen una importante fuente de
proteína de dieta para humanos y ganado. Sin embargo, el contenido
de proteína de las semillas a menudo es incompleto. Por ejemplo,
muchas proteínas de semilla son deficientes en uno o más
aminoácidos esenciales. Esta deficiencia se puede superar
modificando genéticamente las proteínas nativas o las no nativas
para tener una composición nutricionalmente más completa de
aminoácidos (o algunas otras características deseables) y para
sobreexpresar las proteínas modificadas en las plantas transgénicas.
Alternativamente, se podrían introducir uno o más genes en una
planta de cultivo para manipular sus rutas metabólicas y modificar
el contenido de aminoácidos libres. Estas propuestas son útiles en
la producción de cultivos que exhiben importantes rasgos
agronómicos, y propiedades nutricionales y farmacéuticas.
A pesar de la disponibilidad de muchas
herramientas moleculares, la modificación genética de las semillas
a menudo se ve restringida por una acumulación insuficiente de la
proteína desarrollada por ingeniería genética. Muchos procesos
intracelulares pueden impactar la acumulación total de proteína,
incluyendo transcripción, traducción, ensamble de proteínas y
plegado, metilación, fosforilación, transporte y proteólisis. La
intervención en uno o más de estos procesos puede incrementar la
cantidad de proteína producida en semillas modificadas por
ingeniería
genética.
genética.
La introducción de un gen puede causar efectos
nocivos sobre el crecimiento y desarrollo de la planta. Bajo tales
circunstancias, la expresión del gen puede necesitar ser limitada al
tejido objetivo deseado. Por ejemplo, puede ser necesario expresar
un gen de desregulación de un aminoácido en una forma específica
para la semilla para evitar un fenotipo indeseado que pueda afectar
el rendimiento u otros rasgos agronómicos.
La porción promotora de un gen juega un papel
central en el control de la expresión del gen. A lo largo de la
región promotora, se ensambla la maquinaria de transcripción y se
inicia la transcripción. La iniciación de la transcripción en el
promotor puede ser regulada en varias formas. Por ejemplo, un
promotor puede ser inducido por la presencia de un compuesto
particular, expresar un gen únicamente en un tejido específico, o
constitutivamente a través de la planta. Por lo tanto, se puede
modificar la transcripción de una secuencia de codificación
enlazando operativamente la secuencia de codificación a promotores
con diferentes características reguladoras.
La presente invención incluye promotores capaces
de generar una transcripción específica en la semilla, y métodos de
modificar, producir, y utilizar los mismos. La invención también
provee composiciones, células huésped transformadas, plantas
transgénicas, y semillas que contienen a los promotores de expresión
alta, y métodos para preparar y utilizar los mismos.
La presente invención incluye y provee una
planta transformada que contiene una molécula de ácido nucleico que
comprende en la dirección 5' a 3': un promotor que tiene una
secuencia de ácido nucleico seleccionada del grupo que consiste de
las SEQ ID NOs: 11 y 12, una secuencia de ácido nucleico que exhibe
una identidad con las SEQ ID NOs: 11 y 12 aproximadamente superior
al 90% y complementos de los mismos, en donde el promotor es
específico de la semilla, está operativamente enlazado a una
secuencia estructural de ácido nucleico, en donde el promotor es
heterólogo con respecto a la secuencia estructural de ácido
nucleico.
La presente invención incluye y provee un método
de transformar una planta de soja que comprende: proveer una
molécula de ácido nucleico que incluye en la dirección 5' a 3': un
promotor que tiene una secuencia de ácido nucleico seleccionada del
grupo que consiste de las SEQ ID NOs: 11 y 12, una secuencia de
ácido nucleico que exhibe una identidad con las SEQ ID NOs: 11 y 12
aproximadamente superior al 90% y complementos de los mismos, en
donde el promotor es específico de la semilla, está operativamente
enlazado a una secuencia nucleica estructural; y transforma a la
planta con la molécula nucleica.
La presente invención provee un método de
expresión de una molécula estructural de ácido nucleico en una
semilla que comprende: el cultivo de una planta transformada que
contiene una molécula de ácido nucleico que comprende en la
dirección 5' a 3': un promotor que tiene una secuencia de ácido
nucleico seleccionada del grupo que consiste las SEQ ID NOs: 11 y
12, una secuencia de ácido nucleico que exhibe una identidad con las
SEQ ID NOs: 11 y 12 aproximadamente superior al 90% y complementos
de los mismos, en donde el promotor es específico de la semilla,
está operativamente enlazado a la molécula estructural de ácido
nucleico, en donde la planta transformada produce la semilla y la
molécula estructural de ácido nucleico se transcribe en la semilla;
y aislamiento de la semilla.
La presente invención provee un método de
obtener una semilla mejorada en un producto de un gen estructural
que comprende: cultivar una planta transformada que contiene una
molécula de ácido nucleico que comprende en la dirección 5' a 3':
un promotor que tiene una secuencia de ácido nucleico seleccionado
del grupo que consiste de las SEQ ID NOs: 11 y 12, una secuencia de
ácido nucleico que exhibe una identidad con las SEQ ID NOs: 11 y 12
aproximadamente superior al 90% y complementos de los mismos, en
donde el promotor es específico de la semilla, está operativamente
enlazado a la molécula estructural de ácido nucleico, en donde la
planta transformada produce la semilla y la molécula estructural de
ácido nucleico se transcribe en la semilla; y aislamiento de la
semilla a partir de la planta transformada.
La presente invención provee un método de
obtener harina mejorada en un producto de un gen estructural que
comprende: cultivar una planta transformada que contiene una
molécula de ácido nucleico que comprende en la dirección 5' a 3':
un promotor que tiene una secuencia de ácido nucleico seleccionada
del grupo que consiste de las SEQ ID NOs: 11 y 12, una secuencia de
ácido nucleico que exhibe una identidad con las SEQ ID NOs: 11 y 12
aproximadamente superior al 90% y complementos de los mismos, en
donde el promotor es específico de la semilla, está operativamente
enlazado a la molécula estructural de ácido nucleico, en donde la
planta transformada produce la semilla y la molécula estructural de
ácido nucleico se transcribe en la semilla; y preparar la harina
que contiene a dicha planta transformada o parte de la misma.
La presente invención provee un método de
obtener materia prima mejorada en un producto de un gen estructural
que comprende: cultivar una planta transformada que contiene una
molécula de ácido nucleico que comprende en la dirección 5' a 3':
un promotor que tiene una secuencia de ácido nucleico seleccionada
del grupo que consiste de las SEQ ID NOs: 11 y 12, una secuencia de
ácido nucleico que exhibe una identidad con las SEQ ID NOs: 11 y 12
aproximadamente superior al 90% y complementos de los mismos, en
donde el promotor es específico de la semilla, está operativamente
enlazado a la molécula estructural de ácido nucleico, en donde la
planta transformada produce la semilla y la molécula estructural de
ácido nucleico se transcribe en la semilla; y preparar la harina
que contiene a dicha planta transformada o parte de la misma.
La presente invención provee un método de
obtener aceite mejorado en un producto de un gen estructural que
comprende: cultivar una planta transformada que contiene una
molécula de ácido nucleico que comprende en la dirección 5' a 3':
un promotor que tiene una secuencia de ácido nucleico seleccionada
del grupo que consiste de las SEQ ID NOs: 11 y 12, una secuencia de
ácido nucleico que exhibe una identidad con las SEQ ID NOs: 11 y 12
aproximadamente superior al 90% y complementos de los mismos, en
donde el promotor es específico de la semilla, está operativamente
enlazado a la molécula estructural de ácido nucleico, en donde la
planta transformada produce la semilla y la molécula estructural de
ácido nucleico se transcribe en la semilla; y aislar el aceite.
La presente invención incluye y provee una
molécula de ácido nucleico sustancialmente purificada que contiene
secuencias de ácido nucleico seleccionadas del grupo que consiste de
las SEQ ID NOs: 11 y 12, una secuencia de ácido nucleico que exhibe
una identidad con las SEQ ID NOs: 11 y 12 aproximadamente superior
al 90% y complementos de los mismos, en donde la molécula de ácido
nucleico es un promotor específico de la semilla.
La presente invención incluye y provee un vector
que contiene una secuencia de ácido nucleico, como se definió
anteriormente.
La presente invención incluye y provee una
célula que contiene un vector como se definió anteriormente.
La Figura 1 exhibe una alineación de secuencia
de dos secuencias de ADNc 7S\alpha.
La Figura 2 exhibe la secuencia de
p-GEM-T1T.
La Figura 2a es un mapa del plásmido para el
vector pMON55548.
La Figura 3 es un mapa del plásmido para el
vector pMON8677.
La Figura 3a es un mapa del plásmido para el
vector pMON55546.
La Figura 4 es un mapa del plásmido para
pMON55547.
La Figura 5 es un mapa del plásmido para el
vector pMON55554.
La Figura 6 es un mapa del plásmido para el
vector pMON55542.
La Figura 7 es una comparación entre el promotor
7S\alpha y el promotor tARC5.
La Figura 8 es un mapa del plásmido para el
vector pMON55553.
La Figura 9 es un mapa del plásmido para el
vector pMON55541.
\newpage
SEQ ID NO: 1 es una secuencia del promotor
7S\alpha de soja (Glicina max L.).
SEQ ID NO: 2 es una secuencia del promotor
7S\alpha de soja (Glicina max L.).
SEQ ID NO: 3 es una secuencia del promotor
7S\alpha de soja (Glicina max L.).
SEQ ID NO: 4 es una secuencia del promotor
7S\alpha de soja (Glicina max L.).
SEQ ID NO: 5 es un iniciador adaptador
(HindIII-P stI) para amplificar al gen GlcA de
soja.
SEQ ID NO: 6 es un iniciador primario 7S\alpha
para amplificar al gen GlcA de soja.
SEQ ID NO: 7 es un iniciador 7S\alpha anidado
(BglII/NcoI) para amplificar al gen GlcA de soja.
SEQ ID NO: 8 es un iniciador 7S\alpha
(NcoI/BglII) diseñado para amplificar la región del
iniciador del gen GlcA de soja.
SEQ ID NO: 9 es un iniciador adaptador del gen
7S\alpha.
SEQ ID NO: 10 es un iniciador específico del gen
7S\alpha.
SEQ ID NO: 11 es una secuencia del promotor
7S\alpha de soja (Glicina max L.).
SEQ ID NO: 12 es una secuencia del promotor
7S\alpha de soja (Glicina max L.).
SEQ ID NO: 13 es una secuencia del promotor
7S\alpha de soja (Glicina max L.).
SEQ ID NO: 14 es una secuencia del promotor
7S\alpha de soja (Glicina max L.).
Se proveen las siguientes definiciones como una
ayuda para entender la descripción detallada de la presente
invención.
Las frases "secuencia codificadora",
"secuencia estructural" y "secuencia estructural de ácido
nucleico" se refieren a una estructura física que comprende una
disposición ordenada de ácidos nucleicos. Los ácidos nucleicos
están dispuestos en una serie de tripletes de ácido nucleico que
forman cada uno un codón. Cada codón codifica para un aminoácido
específico. Por lo tanto, la secuencia de codificación, la secuencia
estructural, y la secuencia estructural de ácido nucleico codifican
una serie de aminoácidos que forman una proteína, un polipéptido, o
secuencia de péptidos. La secuencia de codificación, la secuencia
estructural, y la secuencia estructural de ácido nucleico pueden
estar contenidas dentro de una molécula mayor de ácido nucleico,
vector, o similar. Además, la disposición ordenada de ácidos
nucleicos en estas secuencias pueden ser descritas en la forma de
un listado de secuencia, figura, tabla, medio electrónico, o
similar.
Las frases "secuencia de ADN", "secuencia
de ácido nucleico" y "molécula de ácido nucleico" se
refieren a una estructura física que comprende una disposición
ordenada de ácidos nucleicos. La secuencia de ADN o la secuencia de
ácido nucleico pueden estar contenidas dentro de una molécula mayor
de ácido nucleico, vector, o similar. Además, la disposición
ordenada de ácidos nucleicos en estas secuencias pueden ser
descritas en la forma de un listado de secuencia, figura, tabla,
medio electrónico, o similar.
El término "expresión" se refiere a la
transcripción de un gen para producir al ARNm correspondiente y la
traducción de este ARNm para producir al correspondiente producto
génico (esto es, un péptido, polipéptido, o proteína).
El término "expresión de ARN antisentido"
se refiere a la transcripción de un ADN para producir una primera
molécula de ARN capaz de hibridar hasta una segunda molécula de ARN.
La formación del híbrido ARN-ARN inhibe la
traducción de la segunda molécula de ARN para producir un producto
génico.
"Homología" se refiere al nivel de
similitud entre dos o más secuencias de ácido nucleico o de
aminoácidos en términos del porcentaje de identidad posicional
(esto es, similitud de secuencia o de identidad). Homología también
se refiere al concepto de propiedades funcionales similares entre
diferentes ácidos nucleicos o proteínas.
La frase "heterólogo" se refiere a la
relación entre dos o más secuencias de ácido nucleico o de proteína
que se derivan de diferentes fuentes. Por ejemplo, un promotor es
heterólogo con respecto a una secuencia de codificación si tal
combinación no se encuentra normalmente en la naturaleza. Además,
una secuencia particular puede ser "heteróloga" con respecto a
una célula u organismo dentro del cual se inserta (esto es, no se
presenta en forma natural en ese organismo o célula
particular).
"Hibridación" se refiere a la habilidad de
una hebra de ácido nucleico para unirse con una hebra complementaria
a través de un apareamiento de bases. La hibridación se presenta
cuando las secuencias complementarias de ácido nucleico en las dos
hebras de ácido nucleico hacen contacto entre sí bajo condiciones
apropiadas.
La frase "operativamente enlazado" se
refiere a la disposición espacial funcional de dos o más regiones de
ácido nucleico o secuencias de ácido nucleico. Por ejemplo, una
región promotora se puede posicionar con relación a una secuencia
de ácido nucleico de tal manera que la transcripción de una
secuencia de ácido nucleico está dirigida por medio de la región
promotora. Por lo tanto, una región promotora está "operativamente
enlazada" a la secuencia de ácido nucleico.
El término "promotor" o "región
promotora" se refiere a una secuencia de ácido nucleico,
usualmente encontrada secuencia arriba (5') a una secuencia de
codificación, que es capaz de dirigir la transcripción de una
secuencia de ácido nucleico en ARNm. El promotor o la región
promotora proveen típicamente un sitio de reconocimiento para la
ARN polimerasa y otros factores necesarios para una iniciación
apropiada de la transcripción. Como se contempla aquí, un promotor
o región promotora incluye variaciones de promotores derivadas por
medio de la inserción o supresión de regiones reguladoras,
sometiendo al promotor a mutagénesis aleatorias o dirigidas al
sitio, etc. La actividad o fuerza de un promotor se puede medir en
términos de las cantidades de ARN que él produce, o la cantidad de
la acumulación de proteína en una célula o tejido, con relación a un
promotor cuya actividad transcripcional ha sido previamente
evaluada.
El término "vector recombinante" se refiere
a cualquier agente tal como un plásmido, cósmido, virus, secuencia
de replicación autónoma, fago, o secuencia de nucleótidos de ARN o
de ADN monocatenario lineal, monocatenario circular, bicatenario
lineal, o bicatenario circular. El vector recombinante se puede
derivar de cualquier fuente; es capaz de integración genómica o de
replicación autónoma.
"Secuencia reguladora" se refiere a una
secuencia de nucleótidos localizada secuencia arriba (5'), en, o
secuencia abajo (3') a una secuencia de codificación. La
transcripción y expresión de la secuencia de codificación es
típicamente impactada por la presencia o la ausencia de la secuencia
reguladora.
El término "sustancialmente homólogo" se
refiere a dos secuencias que son al menos aproximadamente 90%
idénticas en secuencia, de acuerdo a lo medido por medio del
programa Best Fit descrito aquí (Versión 10; Genetics Computer
Group, Inc., University of Wisconsin Biotechnology Center, Madison,
WI), utilizando parámetros por defecto.
El término "transformación" se refiere a la
introducción de ácido nucleico en un huésped receptor. El término
"huésped" se refiere a células bacterianas, hongos, animales o
células animales, plantas o semillas, o a cualquiera de las partes
de la planta o tejidos incluyendo células de plantas, protoplastos,
callos, raíces, tubérculos, semillas, tallos, hojas, brotes,
embriones, y polen.
Como se lo utiliza aquí, el término "planta
transgénica" se refiere a una planta en donde se introduce en
forma estable ácido nucleico en un genoma de una planta, por
ejemplo, el genoma nuclear o el genoma del plástido.
Como se lo utiliza aquí, el término
"sustancialmente purificado" se refiere a una molécula separada
sustancialmente de todas las otras moléculas normalmente asociadas
con ella en su estado nativo. Más preferiblemente, una molécula
sustancialmente purificada es la especie predominante presente en
una preparación. Una molécula sustancialmente purificada puede
estar libre en más de un 60%, preferiblemente aproximadamente libre
en un 75%, más preferiblemente aproximadamente libre en un 90%, y
lo más preferible aproximadamente libre en un 95% de las otras
moléculas (exclusivas o de solvente) presentes en la mezcla
natural. El término "sustancialmente purificada" no pretende
abarcar moléculas presentes en su estado nativo.
La presente invención provee promotores capaces
de transcribir una secuencia heteróloga estructural de ácido
nucleico en una semilla, y métodos de modificar, producir, y
utilizar los mismos. La invención también provee composiciones,
células huésped transformadas y plantas que contienen promotores
específicos de la semilla, y métodos para preparar y utilizar los
mismos.
La presente invención provee moléculas de ácido
nucleico seleccionadas a partir del grupo que consiste de la SEQ ID
NOs: 11, 12 y una secuencia de ácido nucleico que es en más de un
90% idéntica a las SEQ ID NOs: 11 y 12 y complementos de las
mismas, en donde la molécula de ácido nucleico es un promotor
específico de la semilla.
La hibridación de ácido nucleico es una técnica
bien conocida por aquellos capacitados en el arte de la manipulación
el ADN. La propiedad de hibridación de un par dado de ácidos
nucleicos es una indicación de su similitud o identidad.
Se pueden utilizar condiciones restrictivas
bajas para seleccionar secuencias de ácido nucleico con más bajas
identidades de secuencia con una secuencia de ácido nucleico
objetivo. Uno puede querer emplear condiciones tales como
aproximadamente 0,15 M hasta aproximadamente 0,9 M de cloruro de
sodio, en rangos de temperatura aproximadamente desde 20ºC hasta
aproximadamente 55ºC.
Se pueden utilizar condiciones altamente
restrictivas para seleccionar secuencias de ácido nucleico con
grados de identidad superiores con las secuencias de ácido nucleico
divulgadas (Sambrook y colaboradores, 1989). (Nota: Todas las
citaciones de las referencias se suministran aquí más adelante).
Las condiciones altamente restrictivas
involucran típicamente hibridación de ácido nucleico en
aproximadamente 2X hasta aproximadamente 10X de SSC (diluido a
partir de una solución patrón de SSC 20X que contiene cloruro de
sodio 3 M y citrato de sodio 0,3 M, pH 7,0 en agua destilada),
aproximadamente desde 2,5X hasta aproximadamente 5X de solución de
Denhardt (diluida a partir de una solución patrón de SOX que
contiene albúmina de suero bovino al 1% (p/v), Ficoll al 1% (p/v),
y polivinilpirrolidona al 1% (p/v) en agua destilada),
aproximadamente desde 10 mg/mL hasta aproximadamente 100 mg/mL de
ADN de esperma de pescado, y SDS aproximadamente desde 0,02% (w/v)
hasta aproximadamente 0,1% (p/v), con una incubación aproximadamente
desde 50ºC hasta aproximadamente 70ºC durante varias horas hasta
toda la noche. Las condicionas altamente restrictivas son
preferiblemente proveidas por SSC 6X, solución de Denhardt 5X, 100
mg/mL de ADN de esperma de pescado, y SDS al 0,1% (p/v), con
incubación a 55ºC durante varias horas.
La hibridación es generalmente seguida por
varias etapas de lavado. Las composiciones de lavado generalmente
contienen SSC desde 0,5X hasta aproximadamente 10X, y SDS desde el
0,01% (p/v) hasta aproximadamente el 0,5% (p/v) con una incubación
de 15 minutos aproximadamente desde 20ºC hasta aproximadamente 70ºC.
Preferiblemente, los segmentos de ácido nucleico permanecen
hibridados después del lavado al menos una vez en SSC 0,1X a
65ºC.
En una modalidad alternativa, la molécula de
ácido nucleico comprende una secuencia de ácido nucleico que es
superior aproximadamente a 91, aproximadamente a 92, aproximadamente
a 93, aproximadamente a 94, aproximadamente a 95, aproximadamente a
96, aproximadamente a 97, aproximadamente a 98, o aproximadamente a
99% de identidad con una secuencia de ácido nucleico seleccionada
del grupo que consiste de las SEQ ID NOs: 11 y 12 y complementos de
las mismas.
El porcentaje de identidad de secuencia se
determina preferiblemente utilizando el programa "Best Fit" o
el programa "Gap" del Sequence Analysis Sftware Package^{TM}
(Versión 10, Genetics Computer Group, Inc., University of
Winsconsin Biotechnology Center, Madison, WI). "Gap" utiliza el
algoritmo de Needleman y Wunsch (Needleman y Wunsch, 1970) para
encontrar la alineación de dos secuencias que maximiza el número de
concordancias y minimiza el número de vacios. "Best Fit"
realiza una alineación óptima del mejor segmento de similitud entre
dos secuencias e inserta vacios para maximizar el número de
concordancias utilizando el algoritmo de homología local de Smith y
Waterman, 1981; Smith y colaboradores, 1983). El porcentaje de
identidad se determina más preferiblemente utilizando el programa
"Best Fit" usando parámetros por defecto.
Las moléculas divulgadas de ácido nucleico son
promotoras 7S\alpha específicas de la semilla. En una modalidad
particularmente preferida el promotor preferencialmente expresa
genes estructurales asociados en el endospermo o el embrión.
En un aspecto, se considera un promotor a un
tejido u órgano específico si el nivel de un ARNm en ese tejido u
órgano se expresa en un nivel que es al menos 10 veces superior,
preferiblemente al menos aproximadamente 100 veces superior o al
menos aproximadamente 1.000 veces superior que otro tejido u órgano.
El nivel de ARNm se puede medir ya sea en un solo momento o en
múltiples momentos y como tal, el incremento en el número de veces
puede ser un incremento promedio en el número de veces o un valor
extrapolado derivado de valores medidos experimentalmente. Como es
una comparación de niveles, se puede utilizar cualquier método que
mida los niveles de ARNm. En un aspecto preferido, el tejido o los
órganos comparados son una semilla o tejido de semilla con una hoja
o tejido de hoja. En otro aspecto preferido, se comparan múltiples
tejidos u órganos. Una comparación múltiple preferida es una
semilla o tejido de semilla comparada con dos, tres, cuatro o más
tejidos u órganos seleccionados del grupo que consiste de tejido
floral, ápice floral, polen, hoja, embrión, ápice de vástago, raíz,
extremo de la raíz, tejido vascular y cotiledón. Como se utiliza
aquí, los ejemplos de órganos de la planta son semilla, hoja, raíz,
etc., y ejemplos de tejidos son la primodia de la hoja, el ápice del
vástago, el tejido vascular, etc.
La actividad o fuerza de un promotor puede ser
medida en términos de la cantidad de ARNm o de acumulación de
proteína que el produce específicamente, con relación a la cantidad
total de ARNm o de proteína. El promotor expresa preferiblemente
una secuencia de ácido nucleico operativamente enlazada en un nivel
superior aproximadamente al 2,5%; más preferiblemente
aproximadamente superior al 5, aproximadamente 6, aproximadamente 7,
aproximadamente 8, o aproximadamente 9%; aún más preferiblemente
aproximadamente superior al 10, aproximadamente 11, aproximadamente
12, aproximadamente 13, aproximadamente 14, aproximadamente 15,
aproximadamente 16, aproximadamente 17, aproximadamente 18, o
aproximadamente 19%; y lo más preferible aproximadamente superior al
20% del ARNm total.
Alternativamente, la actividad o fuerza de un
promotor se puede expresar con relación a un promotor bien
caracterizado (para el cual la actividad transcripcional fue
previamente evaluada). Por ejemplo, un promotor de interés puede
estar operativamente enlazado a una secuencia reportera (por
ejemplo, GUS) e introducido en un tipo específico de célula. Un
promotor conocido puede ser preparado en forma similar e introducido
en el mismo contexto celular. La actividad transcripcional del
promotor de interés es luego determinada por medio de la
comparación de la cantidad de expresión del reportero, con relación
al promotor conocido. El contexto celular es preferiblemente
soja.
soja.
Los promotores de la presente invención pueden
estar operativamente enlazados a una segunda secuencia de ácido
nucleico que es heteróloga con respecto a la secuencia de ácido
nucleico del promotor. La segunda secuencia de ácido nucleico puede
ser generalmente cualquier secuencia de ácido nucleico para la cual
se desea un nivel superior de transcripción. La segunda secuencia
de ácido nucleico codifica preferiblemente a un polipéptido que es
adecuado para incorporación en la dieta de un humano o de un animal,
o provee algunas otras características importantes desde el punto
de vista agrícola.
Las segundas secuencias adecuadas de ácido
nucleico incluyen, sin limitación, a aquellas que codifican a las
proteínas de almacenamiento de la semilla, a las enzimas de la ruta
del ácido graso, a las enzimas biosintéticas del tocoferol, enzimas
biosintéticas de aminoácido, y enzimas de ramificación del
almidón.
Las proteínas preferidas de almacenamiento de la
semilla incluyen zeinas (patentes estadounidenses Nos.
4.886.878, 4.885.357, 5.215.912, 5.589.616, 5.508.468, 5.939.599, 5.633.436 y 5.990.384;: WO 90/01869, WO 91/
13993, WO 92/14822, WO 93/08682, WO 94/20628, WO 97/28247, WO 98/26064 y WO 99/40209), a las proteínas 7S (patentes estadounidenses Nos. 5.003.045 y 5.576.203), la proteína de la nuez del Brasil (patente estadounidense No. 5.850.024), a las proteínas libres de fenilalanina (WO 96/17064), a la albúmina (WO 97/35023), a la \beta-conglicinina (WO 00/19839), 11S (patente estadounidense No. 6.107.051), a la alfa-hordotionina (patentes estadounidenses Nos. 5.885.802 y 5.885.801), a las proteínas arcelinas de almacenamiento de la semilla (patente estadounidense No. 5.270.200), a las lectinas (patente estadounidense No. 6.110.891) y a las gluteninas (patentes estadounidenses Nos. 5.990.389 y 5.914.450).
4.886.878, 4.885.357, 5.215.912, 5.589.616, 5.508.468, 5.939.599, 5.633.436 y 5.990.384;: WO 90/01869, WO 91/
13993, WO 92/14822, WO 93/08682, WO 94/20628, WO 97/28247, WO 98/26064 y WO 99/40209), a las proteínas 7S (patentes estadounidenses Nos. 5.003.045 y 5.576.203), la proteína de la nuez del Brasil (patente estadounidense No. 5.850.024), a las proteínas libres de fenilalanina (WO 96/17064), a la albúmina (WO 97/35023), a la \beta-conglicinina (WO 00/19839), 11S (patente estadounidense No. 6.107.051), a la alfa-hordotionina (patentes estadounidenses Nos. 5.885.802 y 5.885.801), a las proteínas arcelinas de almacenamiento de la semilla (patente estadounidense No. 5.270.200), a las lectinas (patente estadounidense No. 6.110.891) y a las gluteninas (patentes estadounidenses Nos. 5.990.389 y 5.914.450).
Las enzimas preferidas de la ruta del ácido
graso incluyen tioesterasas (patentes estadounidenses Nos.
5.512.482, 5.530.186, 5.945.585, 5.639.790, 5.807.893, 5.955.650,
5.955.329, 5.759.829, 5.147.792, 5.304.481, 5.298.421,
5.344.771 y 5.760.206), y desaturasas (patentes estadounidenses Nos. 5.689.050, 5.663.068, 5.614.393, 5.856.157,
6.117.677, 6.043.411, 6.194.167, 5.705.391, 5.663.068, 5.552.306, 6.075.183, 6.051.754, 5.689.050, 5.789.220,
5.057.419, 5.654.402, 5.659.645, 6.100.091, 5.760.206, 6.172.106, 5.952.544, 5.866.789, 5.443.974 y 5.093.249). Las enzimas biosintéticas preferidas de tocoferol incluyen tyrA, slr173, ATPT2, dxs, dxr, GGPPS, HPPD, GMT, MT1, AANT1, slr1737, y una construcción antisentido para la dioxigenasa del ácido homogentísico (Kridl y colaboradores, Seed Sci. Res. 1:209:219 (1991); Keegstra, Cell 56(2):247-53 (1989); Nawrath, y colaboradores, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 91:12760-12764 (1994); Xia y colaboradores, J. Gen. Microbiol. 138:1309-1316 (1992); Cyanobase http://www.kazusa.or.jp/cyanobase; Lois y colaboradores, Proc. Natl. Acad Sci. U.S.A. 95(5):2105-2110 (1998); Takahashi y colaboradores, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 95(17), 9879-9884 (1998); Norris y colaboradores, Plant Physiol. 117:1317-1323 (1998); Bartley y Scolnik, Plant Physiol. 104:1469-1470 (1994), Smith y colaboradores, Plant J. 11:83-92 (1997); WO 00/32757; WO 00/10380; Saint Guily, y colaboradores, Plant Physiol., 100(2):1069-1071 (1992); Sato y colaboradores, J. DNA Res. 7(1):31-63 (2000)).
5.344.771 y 5.760.206), y desaturasas (patentes estadounidenses Nos. 5.689.050, 5.663.068, 5.614.393, 5.856.157,
6.117.677, 6.043.411, 6.194.167, 5.705.391, 5.663.068, 5.552.306, 6.075.183, 6.051.754, 5.689.050, 5.789.220,
5.057.419, 5.654.402, 5.659.645, 6.100.091, 5.760.206, 6.172.106, 5.952.544, 5.866.789, 5.443.974 y 5.093.249). Las enzimas biosintéticas preferidas de tocoferol incluyen tyrA, slr173, ATPT2, dxs, dxr, GGPPS, HPPD, GMT, MT1, AANT1, slr1737, y una construcción antisentido para la dioxigenasa del ácido homogentísico (Kridl y colaboradores, Seed Sci. Res. 1:209:219 (1991); Keegstra, Cell 56(2):247-53 (1989); Nawrath, y colaboradores, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 91:12760-12764 (1994); Xia y colaboradores, J. Gen. Microbiol. 138:1309-1316 (1992); Cyanobase http://www.kazusa.or.jp/cyanobase; Lois y colaboradores, Proc. Natl. Acad Sci. U.S.A. 95(5):2105-2110 (1998); Takahashi y colaboradores, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 95(17), 9879-9884 (1998); Norris y colaboradores, Plant Physiol. 117:1317-1323 (1998); Bartley y Scolnik, Plant Physiol. 104:1469-1470 (1994), Smith y colaboradores, Plant J. 11:83-92 (1997); WO 00/32757; WO 00/10380; Saint Guily, y colaboradores, Plant Physiol., 100(2):1069-1071 (1992); Sato y colaboradores, J. DNA Res. 7(1):31-63 (2000)).
Las enzimas biosintéticas preferidas de
aminoácido incluyen a la antanilato sintasa (patente estadounidense
No. 5.965.727 y WO 97/26366, WO 99/11800, y WO 99/49058), a la
triptófano descarboxilasa (WO 99/06581) y a la treonina
descarboxilasa (patentes estadounidenses Nos. 5.534.421 y 5.942.660
y WO 95/19442), a la treonina desaminasa (WO 99/02656 y W
O98/55601), a la dihidrodipicolinato sintasa (patente estadounidense
No. 5.367.110), a la lisina ketoglutarato reductasa (WO 98/42831) y
a la aspartato quinasa (patentes estadounidenses Nos. 5.367.110,
5.858.749 y 6.040.160).
Las enzimas preferidas de ramificación del
almidón incluyen a aquellas expuestas en las patentes
estadounidenses Nos. 6.232.122 y 6.147. 279, y WO 97/22703.
Alternativamente, se pueden diseñar un promotor
y una segunda secuencia de ácido nucleico para reducir la expresión
de una secuencia específica de ácido nucleico. Esto se logra
típicamente enlazando al promotor a una segunda secuencia de ácido
nucleico que está orientada en la dirección antisentido. Alguien
ordinariamente entrenado en el arte está familiarizado con tal
tecnología antisentido. Cualquier secuencia de ácido nucleico puede
ser regulada en forma negativa en esta forma.
Alguien ordinariamente entrenado en el arte
reconocerá también que se puede diseñar también un promotor de la
presente invención para reducir la expresión de una secuencia
específica de ácido nucleico utilizando el fenómeno de la
cosupresión. Se ha descrito la cosupresión de un gen endógeno
utilizando tanto secuencias de ADNc de longitud completa como
parcial (Napoli y colaboradores. The Plant Cell
2:279-289 (1990)).
Adicionalmente, también se puede reducir la
expresión de una secuencia específica de ácido nucleico por medio
de regiones no codificadoras de dicha secuencia de ácido nucleico.
Alguien capacitado en el arte puede aislar fácilmente ADN genómico
que contiene secuencias que flanquean la región de codificación de
dicha secuencia de ácido nucleico, o intrones de dicha región de
codificación, y utilizar las regiones no codificadoras para
inhibición antisentido o cosupresión.
Los objetivos de tal regulación pueden incluir
polipéptidos que tienen un bajo contenido de aminoácidos esenciales,
no obstante se expresan a un nivel relativamente alto en un tejido
particular. Por ejemplo, la \beta-conglicinina y
la glicinina se expresan abundantemente en semillas, pero son
nutricionalmente deficientes con respecto a aminoácidos esenciales.
Esta aproximación antisentido puede ser utilizada también para
remover en forma efectiva otras proteínas indeseables, tales como
rechazantes al alimento (por ejemplo, lectinas), albúmina, y
alérgenos, a partir de harinas derivadas de la planta o para reducir
la expresión de enzimas catabólicas involucradas en la degradación
de compuestos deseados tales como aminoácidos esenciales.
Los promotores de la presente invención pueden
también estar operativamente enlazados a una secuencia estructural
modificada de ácido nucleico que sea heteróloga con respecto al
promotor. La secuencia estructural de ácido nucleico puede ser
modificada para proveer diferentes características deseables. Por
ejemplo, una secuencia estructural de ácido nucleico puede ser
modificada para incrementar el contenido de aminoácidos esenciales,
mejorar la traducción de la secuencia de aminoácidos, alterar las
modificaciones postraduccionales (por ejemplo, sitios de
fosforilación), transportar un producto traducido a un
compartimiento dentro o fuera de la célula, mejorar la estabilidad
de la proteína, insertar o suprimir motivos de señalización celular,
etc.
En una modalidad preferida, se mejora la
secuencia estructural de ácido nucleico para codificar un
polipéptido que tiene un contenido incrementado de al menos uno, y
más preferiblemente aproximadamente 2, aproximadamente 3, o
aproximadamente 4 de los aminoácidos esenciales seleccionados a
partir del grupo que consiste de histidina, lisina, metionina, y
fenilalanina. Los aminoácidos no esenciales pueden ser también
añadidos, según se requiera, para mejoramiento estructural y
nutritivo del polipéptido. Las secuencias estructurales de ácido
nucleico particularmente adecuadas para tales mejoras incluyen a
aquellas que codifican a polipéptidos nativos que se expresan en
niveles relativamente altos, tienen un contenido particularmente
bajo de aminoácidos esenciales, o ambos. Un ejemplo de estas son
las proteínas de almacenamiento de la semilla, tal como la glicinina
y la \beta-conglicinina. Otros objetivos
adecuados incluyen arcelina, faseolina, lectina, zeinas, y
albúmina.
Debido a la degeneración del código genético, se
pueden utilizar diferente codones de nucleótidos para codificar por
un aminoácido particular. Una célula huésped a menudo muestra un
patrón preferido de utilización de un codón. Las secuencias
estructurales de ácido nucleico se construyen preferiblemente para
usar el patrón de utilización del codón de la célula huésped
particular. Esto generalmente mejora la expresión de la secuencia
estructural de ácido nucleico en una célula huésped transformada.
Cualquiera de los ácidos nucleicos y de las secuencias de
aminoácidos anteriormente descritas puede se modificada para
reflejar la utilización preferida del codón de una célula huésped u
organismo en el cual están contenidos. La modificación de una
secuencia estructural de ácido nucleico para utilización óptima del
codón en plantas en plantas, es descrita en la patente
estadounidense No. 5.689.052.
Las variaciones adicionales en las secuencias
estructurales de ácido nucleico descritas anteriormente, pueden
codificar proteínas que tienen características equivalentes o
superiores cuando se las compara con las proteínas a partir de las
cuales ellas son modificadas por ingeniería genética. Las mutaciones
pueden incluir supresiones, inserciones, truncamientos,
sustituciones, fusiones, mezcla de secuencias de motivos, y
similares.
Las mutaciones a una secuencia estructural de
ácido nucleico se pueden introducir ya sea en una forma específica
o aleatoria, siendo ambas bien conocidas por aquellos capacitados en
el arte de la biología molecular. Existen innumerables técnicas de
mutagénesis dirigida al sitio, típicamente utilizando
oligonucleótidos para introducir mutaciones en ubicaciones
específicas en una secuencia estructural de ácido nucleico. Los
ejemplos incluyen rescate de una única hebra (Kunkel y
colaboradores, 1985), eliminación de un sitio único (Deng y
Nickloff, 1992), protección de punto crítico (Vandeyar y
colaboradores, 1988), y PCR (Costa y colaboradores, 1996). Se
pueden generar mutaciones aleatorias o no específicas por medio de
agentes químicos (para una revisión general, ver Singer y
Kusmierek, 1982) tales como nitrosoguanidina
(Cerda-Olmedo y colaboradores, 1968; Guerola y
colaboradores, 1971) y 2-aminopurina (Rogan y
Bessman, 1970); o por medio de métodos biológicos tales como el
paso a través de cepas mutadoras (Greener y colaboradores, 1997).
Los métodos adicionales de hacer las alteraciones descritas
anteriormente son descritos por Ausubel y colaboradores (1995);
Bauer y colaboradores (1985); Craik (1985); Frits Eckstein y
colaboradores (1982); Sambrook y colaboradores (1989); Smith y
colaboradores (1981); y Osuna y colaboradores (1994).
Las modificaciones pueden resultar ya sea en
cambios conservadores o no conservadores en la secuencia de
aminoácidos. Los cambios conservadores son cambios que no alteran
la secuencia final de aminoácidos de la proteína. En una modalidad
preferida, la proteína tiene aproximadamente entre 5 y
aproximadamente 500 cambios conservadores, más preferiblemente
aproximadamente entre 10 y aproximadamente 300 cambios
conservadores, aún más preferiblemente aproximadamente entre 25 y
aproximadamente 150 cambios conservadores, y lo más preferible
aproximadamente entre 5 y aproximadamente 25 cambios conservadores
o aproximadamente entre 1 y aproximadamente 5 cambios
conservadores.
Los cambios no conservadores incluyen adiciones,
supresiones, y sustituciones que resultan en una secuencia alterada
de aminoácidos. En una modalidad preferida, la proteína tiene
aproximadamente entre 5 y aproximadamente 500 cambios no
conservadores de aminoácidos, más preferiblemente aproximadamente
entre 10 y aproximadamente 300 cambios no conservadores de
aminoácidos, aún más preferiblemente aproximadamente entre 25 y
aproximadamente 150 cambios no conservadores de aminoácidos, y lo
más preferiblemente aproximadamente entre 5 y aproximadamente 25
cambios no conservadores de aminoácidos o aproximadamente entre 1 y
aproximadamente 5 cambios no conservadores.
Pueden hacerse modificaciones a las secuencias
de proteína descritas aquí y a las secuencias de ácido nucleico que
las codifican, que mantienen las propiedades deseadas de la
molécula. La siguiente es una discusión con base en el cambio de la
secuencia de aminoácidos de una proteína para crear una molécula
equivalente de segunda generación, o posiblemente mejorada. Los
cambios de aminoácidos se pueden lograr cambiando los codones de la
secuencia estructural de ácido nucleico, de acuerdo con los codones
dados en la Tabla 1.
\vskip1.000000\baselineskip
Ciertos aminoácidos pueden ser sustituidos por
otros aminoácidos en una secuencia de proteína sin una pérdida
apreciable de la actividad deseada. Se contempla entonces que se
puedan hacer varios cambios en secuencias de péptidos o secuencias
de proteínas, o en sus correspondientes secuencias de ácido nucleico
sin una pérdida apreciable de la actividad biológica.
En la realización de tales cambios, se puede
considerar el índice hidropático de los aminoácidos. La importancia
del índice hidropático del aminoácido en conferir una función
biológica interactiva sobre una proteína es generalmente
comprendida en el arte (Kyte y Doolittle, 1982). Se acepta que el
carácter hidropático relativo del aminoácido contribuye a la
estructura secundaria de la proteína resultante, que a su vez define
la interacción de la proteína con otras moléculas, por ejemplo,
enzimas, sustratos, receptores, ADN, anticuerpos, antígenos, y
similares.
A cada aminoácido se le ha asignado un índice
hidropático sobre la base de sus características de carga y de
hidrofobicidad. Estos son: isoleucina (+4,5); valina (+4,2); leucina
(+3,8); fenilalanina (+2,8); cisteína/cisteína (+2,5); metionina
(+1,9); alanina (+1,8); glicina (-0,4); treonina (-0,7); serina
(-0,8); triptófano (-0,9); tirosina (-1,3); prolina (-1,6);
histidina (-3,2); glutamato/glutamina/aspartato/asparagina (-3,5);
lisina (-3,9); y arginina (-4,5).
Se conoce en el arte que ciertos aminoácidos
pueden ser sustituidos por otros aminoácidos que tienen un índice
hidropático similar o puntaje y aún resultan en una proteína con
actividad biológica similar, esto es, aún se obtiene una proteína
biológicamente funcional. En la realización de tales cambios, se
prefiere la sustitución de aminoácidos cuyos índices hidropáticos
están entre \pm2, se prefieren aún más aquellos que están entre
\pm1, y los más preferidos son aquellos que están entre
\pm0,5.
También se entiende en el arte que la
sustitución de aminoácidos parecidos puede hacerse efectivamente con
base en la hidrofilicidad. La patente estadounidense No. 4.554.101
establece que la hidrofilicidad local promedio más grande de una
proteína, que es gobernada por la hidrofilicidad de sus aminoácidos
adyacentes, se correlaciona con una propiedad biológica de la
proteína. Se han asignado los siguientes valores de hidrofilicidad a
los aminoácidos: arginina/lisina (+3,0); aspartato/glutamato
(+3,01); serina (+0,3); asparagina/glutamina (+0,2); glicina (0);
treonina (-0,4); prolina (-0,51); alanina/histidina (-0,5); cisteína
(-1,0); metionina (-1,3); valina (-1,5); leucina/isoleucina (-1,8);
tirosina (-2,3); fenilalanina (-2,5); y triptófano (-3,4).
Se entiende que un aminoácido puede ser
sustituido por otro aminoácido que tenga una hidrofilicidad similar
o puntaje y aún resultar en una proteína con actividad biológica
similar, esto es, aún se obtiene una proteína biológicamente
funcional. En la realización de tales cambios, se prefiere la
sustitución de aminoácidos cuyos índices hidropáticos están entre
\pm2, se prefieren aún más aquellos que están entre \pm1, y los
más preferidos son aquellos que están
entre \pm0,5.
entre \pm0,5.
Como se reseñó anteriormente, las sustituciones
de aminoácidos se basan por lo tanto en la similitud relativa de
los sustituyentes de la cadena lateral de aminoácidos, por ejemplo,
su hidrofobicidad, hidrofilicidad, carga, tamaño, y similares. Los
ejemplos de sustituciones que toman varias de las características
anteriores en consideración son conocidos por aquellos capacitados
en el arte e incluyen: arginina y lisina; glutamato y aspartato;
serina y treonina; glutamina y asparagina; y valina, leucina, e
isoleucina. También se pueden utilizar cambios que no se espera que
sean convenientes si estas proteínas resultantes han mejorado su
resistencia al rumen, si han incrementado la resistencia a la
degradación proteolítica, o han mejorado tanto su resistencia al
rumen como incrementado la resistencia a la degradación
proteolítica, con relación al polipéptido no modificado a partir
del cual ellos son modificados por ingeniería genética.
Alternativamente, podrían hacerse cambios para mejorar las
cinéticas de las enzimas metabólicas.
En un aspecto preferido, la proteína modificada
se selecciona de las proteínas de almacenamiento de la semilla, de
enzimas de la ruta del ácido graso, de enzimas biosintéticas del
tocoferol, de enzimas biosintéticas de aminoácido y de enzimas de
ramificación del almidón.
Cualquiera de los promotores y secuencias
estructurales de ácido nucleico descritas anteriormente pueden ser
proveídos en un vector recombinante. Un vector recombinante
típicamente comprende, en una orientación 5' a 3': un promotor para
dirigir la transcripción de una secuencia estructural de ácido
nucleico y una secuencia estructural de ácido nucleico. Los
promotores adecuados y las secuencias estructurales de ácido
nucleico incluyen a aquellos descritos aquí. El vector recombinante
puede comprender además un terminador transcripcional 3', una señal
de poliadenilación 3', otras secuencias no traducidas de ácido
nucleico, secuencias de ácido nucleico objetivo y de tránsito,
marcadores seleccionables, potenciadores, y operadores, según se
desee.
Los medios para preparar vectores recombinantes
son bien conocidos en el arte. Los métodos para elaborar vectores
recombinantes particularmente adecuados para transformación de una
planta son descritos en las patentes estadounidenses Nos.
4.971.908, 4.940.835, 4.769.061 y 4.757.011. Estos tipos de vectores
también han sido revisados (Rodríguez y colaboradores, 1988; Glick
y colaboradores, 1993).
Los vectores típicos útiles para expresión de
ácidos nucleicos en plantas superiores son bien conocidos en el
arte e incluyen a los vectores derivados del plásmido que induce al
tumor (Ti) del Agrobacterium tumefaciens (Rogers y
colaboradores, 1987). Otros vectores recombinantes útiles para
transformación de la planta, incluido el vector de control de
transferencia pCaMVCN, también han sido descritos (Fromm y
colaboradores, 1985).
En una modalidad, múltiples promotores
7S\alpha son operativamente enlazados en una construcción única a
cualquier combinación de genes estructurales. En una modalidad
preferida, cualquier combinación de una, dos, tres, cuatro, cinco o
seis o más de las SEQ ID NOs: 11, 12, 13 y 14 puede ser
operativamente enlazada en una construcción única a cualquier
combinación de genes estructurales.
Uno o más promotores adicionales pueden también
ser proveídos en el vector recombinante. Estos promotores pueden
estar operativamente enlazados, por ejemplo, sin limitación, a
cualquiera de las secuencias estructurales de ácido nucleico
descritas anteriormente. Alternativamente, los promotores pueden
estar operativamente enlazados a otras secuencias de ácido
nucleico, tal como aquellas que codifican a péptidos de tránsito,
proteínas marcadoras seleccionables, o secuencias antisentido.
Estos promotores adicionales se pueden
seleccionar con base en el tipo de célula dentro de la cual se
insertará el vector. También, los promotores que funcionan en
bacterias, levaduras y plantas son todos enseñados en el arte. Los
promotores adicionales también se pueden seleccionar con base en sus
características reguladoras. Los ejemplos de tales características
incluyen la mejora de la actividad transcripcional, la
inducibilidad, la especificidad del tejido, y la especificidad de
la etapa de desarrollo. En las plantas, los promotores que son
inducibles, de origen viral o sintético, constitutivamente activos,
regulados temporalmente, y regulados espacialmente han sido
descritos (Poszkowski y colaboradores, 1989; Odell y colaboradores,
1985; Chau y colaboradores, 1989).
Los promotores constitutivos a menudo utilizados
incluyen al promotor CaMV 35S (Odell y colaboradores, 1985), al
promotor mejorado CaMV 35S, al promotor del Virus del Mosaico de la
Escrofularia (FMV) (Richins y colaboradores, 1987), al promotor de
la manopina sintasa (mas), al promotor de la nopalina sintasa (nos),
y al promotor de la octopina sintasa (ocs).
Los promotores inducibles útiles incluyen a los
promotores inducidos por medio del ácido salicílico o los ácidos
poliacrílicos (PR-1; Williams y colaboradores,
1992), inducidos por medio de la aplicación de aseguradores
(herbicidas sustituidos de bencenosulfonamida; Hershey y Stoner,
1991), promotores de choque térmico (Ou-Lee y
colaboradores, 1986; Ainley y colaboradores, 1990), un promotor
inducible por nitrato derivado de la secuencia estructural de ácido
nucleico de la nitrito reductasa de la espinaca (Back y
colaboradores, 1991), promotores inducibles por hormonas
(Yamaguchi-Shinozaki y colaboradores, 1990; Kares y
colaboradores, 1990), y promotores inducibles por luz asociados con
la pequeña subunidad de RuBP carboxilasa y familias de LHCP
(Kuhlemeier y colaboradores, 1989; Feinbaum y colaboradores, 1991;
Weisshaar y colaboradores, 1991; Lam y Chua, 1990; Castresana y
colaboradores, 1988; Schulze-Lefert y colaboradores,
1989).
Los ejemplos de promotores específicos útiles de
tejido o de órgano incluyen \beta-conglicinina,
(Doyle y colaboradores, 1986; Slighton y Beachy, 1987), y otros
promotores específicos de la semilla (Knutzon y colaboradores,
1992; Bustos y colaboradores, 1991; Lam y Chua, 1991). Los
promotores funcionales de la planta útiles para expresión
preferencial en plástidos de semilla incluyen a aquellas de las
proteínas de almacenamiento de la planta y de las proteínas
involucradas en la biosíntesis de ácido graso en semillas
oleaginosas. Los ejemplos de tales promotores incluyen a las
regiones reguladoras 5' de tales secuencias estructurales de ácido
nucleico como napina (Kridl y colaboradores, 1991), faseolina,
zeina, inhibidor de la tripsina de la soja, ACP, ACP desaturasa de
estearoilo, y oleosina. La regulación específica de la semilla es
discutida adicionalmente en EP 0 255 378.
Otro ejemplo de un promotor específico de la
semilla es un promotor de lectina. La proteína lectina en semillas
de soja es codificada por una secuencia única estructural de ácido
nucleico (Le1) que se expresa únicamente durante la maduración de
la semilla. Se han caracterizado una secuencia estructural de ácido
nucleico para la lectina y un promotor específico de la semilla, y
utilizado para dirigir la expresión específica de la semilla en
plantas de tabaco transgénico (Vodkin y colaboradores, 1983;
Lindstrom y colaboradores, 1990).
Los promotores adicionales particularmente
preferidos en el vector recombinante incluyen a los promotores de
la nopalina sintasa (nos), de la manopina sintasa (mas), y de la
octopina sintasa (ocs), que son portados sobre los plásmidos que
inducen el tumor de Agrobacterium tumefaciens; los promotores
19S y 35S del virus del mosaico de la coliflor (CaMV); el promotor
mejorado CaMV 35S, el promotor 35S del Virus del Mosaico de la
Escrofularia (FMV); el promotor inducible por luz de la pequeña
subunidad de la
ribulosa-1,5-bisfosfato carboxilasa
(ssRUBISCO); el promotor EIF-4A del tabaco (Mandel y
colaboradores, 1995); sucrosa sintetasa 1 del maíz (Yang y Russell,
1990); alcohol deshidrogenasa 1 del maíz (Vogel y colaboradores,
1989); complejo liviano de cosecha de maíz (Simpson, 1986);
proteína de choque térmico del maíz (Odell y colaboradores, 1985);
la promotora de quitinasa de Arabidopsis (Samac y
colaboradores, 1991); los promotores de LTP (Proteína de
Transferencia de Lípidos) del brócoli (Pyee y colaboradores, 1995);
chalcona isomerasa de petunia (Van Tunen y colaboradores, 1988);
glicina de la alubia rica en proteína 1 (Keller y colaboradores,
1989); patatina de la patata (Wenzler y colaboradores, 1989); el
promotor de la ubiquitina del maíz (Christensen y colaboradores,
1992); y el promotor de la actina del arroz (McElroy y
colaboradores, 1990).
Un promotor adicional es preferiblemente
selectivo de la semilla, selectivo del tejido, constitutivo, o
inducible. El promotor es más preferiblemente la nopalina sintasa
(nos), octopina sintasa (ocs), manopina sintasa (mas), los virus
del mosaico de la coliflor 19S y 35S (CaMV19S, CaMV35S), CaMV
mejorado (eCaMV), ribulosa 1,5-bisfosfato
carboxilasa (ssRUBISCO), el virus del mosaico de la escrofularia
(FMV), CaMV derivado de AS4, RB7 de tabaco, POX1 de trigo,
EIF-4 de tabaco, proteína lectina (Le1), o el
promotor RC2 del arroz.
El vector recombinante puede contener también
una o más secuencias estructurales adicionales de ácido nucleico.
Estas secuencias estructurales adicionales de ácido nucleico puede
ser generalmente cualquier secuencia adecuada para uso en un vector
recombinante. Tales secuencias estructurales adicionales de ácido
nucleico incluyen, sin limitación, a cualquiera de las secuencias
estructurales de ácido nucleico, y formas modificadas de las
mismas, descritas anteriormente. Las secuencias estructurales
adicionales de ácido nucleico pueden también estar operativamente
enlazadas a cualquiera de los promotores anteriormente descritos.
Una o más de las secuencias estructurales de ácido nucleico pueden
estar cada una operativamente enlazadas a promotores separados.
Alternativamente, las secuencias estructurales de ácido nucleico
pueden estar operativamente enlazadas a un promotor único (esto es,
un operón único).
Las secuencias estructurales adicionales de
ácido nucleico incluyen, sin limitación, a aquellas que codifican a
las proteínas de almacenamiento de la semilla, a las enzimas de la
ruta del ácido graso, a las enzimas biosintéticas del tocoferol,
enzimas biosintéticas de aminoácido, y enzimas de ramificación del
almidón.
Las proteínas preferidas de almacenamiento de la
semilla incluyen zeinas (patentes estadounidenses Nos.
4.886.878, 4.885.357, 5.215.912, 5.589.616, 5.508.468, 5.939.599, 5.633.436 y 5.990.384;: WO 90/01869, WO 91/
13993, WO 92/14822, WO 93/08682, WO 94/20628, WO 97/28247, WO 98/26064 y WO 99/40209), a las proteínas 7S (patentes estadounidenses Nos. 5.003.045 y 5.576.203), la proteína de la nuez del Brasil (patente estadounidense No. 5.850.024), a las proteínas libres de fenilalanina (WO 96/17064), a la albúmina (WO 97/35023), a la \beta-conglicinina (WO 00/19839), 11S (patente estadounidense No. 6.107.051), a la alfa-hordotionina (patentes estadounidenses Nos. 5.885.802 y 5.885.801), a las proteínas arcelinas de almacenamiento de la semilla (patente estadounidense No. 5.270.200), a las lectinas (patente estadounidense No. 6.110.891) y a las gluteninas (patentes estadounidenses Nos. 5.990.389 y 5.914.450).
4.886.878, 4.885.357, 5.215.912, 5.589.616, 5.508.468, 5.939.599, 5.633.436 y 5.990.384;: WO 90/01869, WO 91/
13993, WO 92/14822, WO 93/08682, WO 94/20628, WO 97/28247, WO 98/26064 y WO 99/40209), a las proteínas 7S (patentes estadounidenses Nos. 5.003.045 y 5.576.203), la proteína de la nuez del Brasil (patente estadounidense No. 5.850.024), a las proteínas libres de fenilalanina (WO 96/17064), a la albúmina (WO 97/35023), a la \beta-conglicinina (WO 00/19839), 11S (patente estadounidense No. 6.107.051), a la alfa-hordotionina (patentes estadounidenses Nos. 5.885.802 y 5.885.801), a las proteínas arcelinas de almacenamiento de la semilla (patente estadounidense No. 5.270.200), a las lectinas (patente estadounidense No. 6.110.891) y a las gluteninas (patentes estadounidenses Nos. 5.990.389 y 5.914.450).
Las enzimas preferidas de la ruta del ácido
graso incluyen tioesterasas (patentes estadounidenses Nos.
5.512.482, 5.530.186, 5.945.585, 5.639.790, 5.807.893, 5.955.650,
5.955.329, 5.759.829, 5.147.792, 5.304.481, 5.298.421,
5.344.771 y 5.760.206), y desaturasas (patentes estadounidenses Nos. 5.689.050, 5.663.068, 5.614.393, 5.856.157,
6.117.677, 6.043.411, 6.194.167, 5.705.391, 5.663.068, 5.552.306, 6.075.183, 6.051.754, 5.689.050, 5.789.220,
5.057.419, 5.654.402, 5.659.645, 6.100.091, 5.760.206, 6.172.106, 5.952.544, 5.866.789, 5.443.974 y 5.093.249).
5.344.771 y 5.760.206), y desaturasas (patentes estadounidenses Nos. 5.689.050, 5.663.068, 5.614.393, 5.856.157,
6.117.677, 6.043.411, 6.194.167, 5.705.391, 5.663.068, 5.552.306, 6.075.183, 6.051.754, 5.689.050, 5.789.220,
5.057.419, 5.654.402, 5.659.645, 6.100.091, 5.760.206, 6.172.106, 5.952.544, 5.866.789, 5.443.974 y 5.093.249).
Las enzimas preferidas biosintéticas de
tocoferol incluyen tyrA, slr1736, ATPT2, dxs, dxr, GGPPS, HPPD, GMT,
MT1, AANT1, slr 1737, y una construcción antisentido para la
dioxigenasa del ácido homogentísico (Kridl y colaboradores, Seed
Sci. Res. 1:209:219 (1991); Keegstra, Cell
56(2):247-53 (1989); Nawrath, y
colaboradores, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A.
91:12760-12764 (1994); Xia y colaboradores, J. Gen.
Microbiol. 138:1309-1316 (1992); Cyanobase
http://www.kazusa.or.jp/cyanobase; Lois y colaboradores, Proc. Natl.
Acad. Sci. U.S.A. 95(5):2105-2110 (1998);
Takahashi y colaboradores, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A.
95(17), 9879-9884 (1998); Norris y
colaboradores, Plant Physiol. 117:1317-1323 (1998);
Bartley y Scolnik, Plant Physiol. 104:1469-1470
(1994), Smith y colaboradores, Plant J. 11:83-92
(1997); WO 00/32757; WO 00/10380; Saint Guily, y colaboradores,
Plant Physiol., 100(2):1069-1071 (1992);
Sato y colaboradores, J. DNA Res. 7(1):31-63
(2000)).
Las enzimas biosintéticas preferidas de
aminoácido incluyen antranilato sintasa (patente estadounidense
No.
5.965.727, y WO 97/26366, WO 99/11800 y WO 99/49058) triptófano descarboxilasa (WO 99/06581) y treonina descarboxilasa (patentes estadounidenses Nos. 5.534.421 y 5.942.660, y WO 95/19442), treonina desaminasa (WO 99/02656 y WO 98/55601) y aspartato quinasa (patentes estadounidenses Nos. 5.367.110, 5.858.749 y 6.040.160).
5.965.727, y WO 97/26366, WO 99/11800 y WO 99/49058) triptófano descarboxilasa (WO 99/06581) y treonina descarboxilasa (patentes estadounidenses Nos. 5.534.421 y 5.942.660, y WO 95/19442), treonina desaminasa (WO 99/02656 y WO 98/55601) y aspartato quinasa (patentes estadounidenses Nos. 5.367.110, 5.858.749 y 6.040.160).
Las enzimas preferidas de ramificación del
almidón incluyen a aquellas expuestas en las patentes
estadounidenses Nos. 6.232.122 y 6.147. 279, y WO 97/22703.
Alternativamente, la segunda secuencia
estructural de ácido nucleico puede ser diseñada para reducir la
expresión de una secuencia específica de ácido nucleico. Esto se
logra típicamente enlazando operativamente al segundo aminoácido
estructural, en una orientación antisentido, con un promotor.
Alguien normalmente capacitado en el arte está familiarizado con
tal tecnología antisentido. Cualquier secuencia de ácido nucleico
puede ser regulada negativamente en esta forma. Las secuencias
preferibles de ácido nucleico objetivo contienen un bajo contenido
de aminoácidos esenciales, no obstante ser expresadas a niveles
relativamente altos en tejidos particulares. Por ejemplo, la
\beta-conglicinina y la glicinina se expresan
abundantemente en semillas, pero son nutricionalmente deficientes
con respecto a aminoácidos esenciales. Esta aproximación antisentido
puede ser usada también para remover efectivamente otras proteínas
indeseables, tales como rechazantes al alimento (por ejemplo,
lectinas), albúmina, y alérgenos, a partir de harinas derivadas de
la planta, o para reducir la expresión de enzimas catabólicas
involucradas en la degradación de compuestos deseados tales como
aminoácidos esenciales.
Un vector o construcción puede incluir también
un marcador seleccionable. Los marcadores seleccionables pueden ser
utilizados también para seleccionar plantas o células de plantas que
contienen al material genético exógeno. Los ejemplos de los mismos
incluyen, pero no se limitan a: un gen neo (Potrykus y
colaboradores, 1985), que codifica para resistencia a la kanamicina
y puede ser seleccionado para utilizar kanamicina, RptII, G418, hpt
etc.; un gen bar que codifica para resistencia a bialafos; un gen
mutante para la EPSP sintasa (Hinchee y colaboradores, 1988;
Reynaerts y colaboradores, 1988), aadA (Jones y colaboradores, 1987)
que codifica para resistencia al glifosato; un gen para la
nitrilasa que confiere resistencia a bromoxinilo (Stalker y
colaboradores, 1988); un gen mutante para la acetolactato sintasa
(ALS) que confiere resistencia a la imidazolinona o la sulfonilurea
(Solicitud de Patente Europea 154.204, 1985), ALS (D'Halluin y
colaboradores, 1992), y un gen DHFR de resistencia al metotrexato
(Thillet y colaboradores, 1988). El marcador seleccionable es
preferiblemente GUS, proteína fluorescente verde (GFP), neomicina
fosfotransferasa II (nptII), luciferasa (LUX), una secuencia que
codifica para resistencia a un antibiótico, o una secuencia que
codifica para resistencia a un herbicida (por ejemplo, glifosato).
El marcador seleccionable es más preferiblemente un marcador de
resistencia a la kanamicina, higromicina, o un herbicida.
Un vector o construcción puede incluir también
un marcador seleccionable. Los marcadores seleccionables pueden ser
utilizados para monitorear la expresión. Los ejemplos de marcadores
seleccionables incluyen: un gen para la
\beta-glucuronidasa o un gen uidA (GUS) que
codifica a una enzima para la cual se conocen diferentes sustratos
cromogénicos (Jefferson, 1987); un gen locus R, que codifica a un
producto que regula la producción de pigmentos de antocianina
(color rojo) en tejidos de planta (Dellaporta y colaboradores,
1988); un gen \beta-lactamasa (Sutcliffe y
colaboradores, 1978), un gen que codifica a una enzima para la cual
se conocen diferentes sustratos cromogénicos (por ejemplo, PADAC,
una cefalosporina cromogénica); un gen para luciferasa (Ow y
colaboradores, 1986); un gen xylE (Zukowsky y colaboradores, 1983)
que codifica una catecol dioxigenasa que puede convertir catecoles
cromogénicos; un gen para \alpha-amilasa (Ikatu y
colaboradores, 1990); un gen para tirosinasa (Katz y colaboradores,
1983) que codifica a una enzima capaz de oxidar tirosina hasta DOPA
y dopaquinona que a su vez condensa a melanina; una
\alpha-galactosidasa, que se convertirá en un
sustrato cromogénico de \alpha-galactosa.
Incluido dentro de los términos "genes
marcadores seleccionables o cribables" se encuentran también
genes que codifican a un marcador que puede ser secretado cuya
secreción puede ser detectada como un medio para identificar o
seleccionar células transformadas. Los ejemplos incluyen marcadores
que codifican a un antígeno que puede ser secretado que puede ser
identificado por medio de interacción con un anticuerpo, o incluso
enzimas que pueden ser secretadas que pueden ser detectadas
catalíticamente. Las proteínas que pueden ser secretadas caen
dentro de una variedad de clases, incluidas las proteínas pequeñas
que pueden difundirse que son detectables, (por ejemplo, por medio
de ELISA), enzimas activas pequeñas que pueden ser detectadas en
solución extracelular (por ejemplo,
\alpha-amilasa, \beta-lactamasa,
fosfinotricín transferasa), o proteínas que están insertadas o
atrapadas en la pared de la célula (tal como proteínas que incluyen
una secuencia líder tal como aquella encontrada en la unidad de
expresión de extensión o PR-S del tabaco).
Otros genes marcadores seleccionables y/o cribables posibles serán evidentes para aquellos capacitados en el arte.
Otros genes marcadores seleccionables y/o cribables posibles serán evidentes para aquellos capacitados en el arte.
Se pueden incluir diferentes secuencias
reguladoras 5' y 3' no traducidas que actúan sobre cis, en el vector
recombinante de ácido nucleico. Cualquiera de tales secuencias
reguladoras puede ser suministrada en un vector recombinante con
otras secuencias reguladoras. Tales combinaciones pueden ser
diseñadas o modificadas para producir características reguladoras
deseables.
Una región no traducida 3' provee típicamente
una señal de terminación transcripcional, y una señal de
poliadenilación que funciona en plantas para provocar la adición de
nucleótidos adenilato al extremo 3' del ARNm. Estos pueden ser
obtenidos de las regiones 3' de la secuencia de codificación de la
nopalina sintasa (nos), una secuencia de codificación de la
proteína de almacenamiento 7S\alpha' de soja, la secuencia de
codificación de arcelina-5, la secuencia de
codificación de albúmina, y la secuencia de codificación para
ssRUBISCO E9 de guisante. Típicamente, las secuencias de ácido
nucleico localizadas unos pocos cientos pares de bases secuencia
abajo del sitio de poliadenilación sirven para terminar la
transcripción. Se requiere de estas regiones para una
poliadenilación eficiente del ARNm transcrito.
También se pueden incorporar potenciadores de
traducción como parte del vector recombinante. De este modo, el
vector recombinante puede contener preferiblemente una o más
secuencias líder 5' no traducidas que sirven para potenciar la
expresión de la secuencia de ácido nucleico. Tales secuencias
potenciadoras pueden ser deseables para incrementar o alterar la
eficiencia de la traducción del ARNm resultante. Las secuencias
preferidas de ácido nucleico 5' incluyen dSSU 5', PetHSP70 5', y
GmHSP17.9 5' (patente estadounidense No. 5.362.865).
El vector recombinante puede comprender además
una secuencia de ácido nucleico que codifica a un péptido de
tránsito. Este péptido puede ser útil para dirigir una proteína al
espacio extracelular, a un plástido, o a algún otro compartimiento
dentro o fuera de la célula (ver, por ejemplo, EP 0 218 571, las
patentes estadounidenses Nos. 4.940.835, 5.88.624, 5.610.041,
5.618.988 y 6.107.060).
La secuencia estructural de ácido nucleico en el
vector recombinante puede comprender intrones. Los intrones pueden
ser heterólogos con respecto a la secuencia estructural de ácido
nucleico. Los intrones preferidos incluyen al intrón de la actina
del arroz y al intrón HSP70 del maíz.
Cualquiera de las secuencias estructurales de
ácido nucleico anteriormente descritas, y las formas modificadas de
las mismas, pueden estar enlazadas con secuencias adicionales de
ácido nucleico para codificar proteínas de fusión. Las secuencias
adicionales de ácido nucleico codifican preferiblemente al menos 1
aminoácido, péptido, o proteína. Existen muchas combinaciones de
fusión posibles.
Por ejemplo, la proteína de fusión puede proveer
un epítopo "etiquetado" para facilitar la detección de la
proteína de fusión, tal como GST, GFP, FLAG, o poliHIS. Tales
fusiones preferiblemente codifican aproximadamente entre 1 y
aproximadamente 50 aminoácidos, más preferiblemente aproximadamente
entre 5 y aproximadamente 30 aminoácidos adicionales, y aún más
preferiblemente aproximadamente entre 5 y aproximadamente 20
aminoácidos.
Alternativamente, la fusión puede proveer
funciones reguladoras, enzimáticas, de señalización celular, o de
transporte entre células. Por ejemplo, se puede añadir una secuencia
que codifica a un péptido de tránsito del plástido para dirigir una
proteína de fusión a los cloroplastos dentro de las semillas. Tales
socios de fusión preferiblemente codifican aproximadamente entre 1
y aproximadamente 1000 aminoácidos adicionales, más preferiblemente
aproximadamente entre 5 y aproximadamente 500 aminoácidos
adicionales, y aún más preferiblemente aproximadamente entre 10 y
aproximadamente 250 aminoácidos.
En la presente invención, la similitud o
identidad de secuencia se determina preferiblemente utilizando los
programas "Best Fit" o "Gap" del Sequence Analysis
Software Package^{TM} (Versión 10, Genetics Computer Group, Inc.,
University of Winsconsin Biotechnology Center, Madison, WI).
"Gap" utiliza el algoritmo de Needleman y Wunsch (Needleman y
Wunsch, 1970) para encontrar la alineación de dos secuencias que
maximiza el número de concordancias y minimiza el número de vacios.
"Best Fit" realiza una alineación óptima del mejor segmento de
similitud entre dos secuencias. Las alineaciones óptimas se
encuentran por medio de la inserción de vacios para maximizar el
número de concordancias utilizando el algoritmo de homología local
de Smith y Waterman (Smith y Waterman, 1981; Smith y colaboradores,
1983).
El Sequence Analysis Software Package descrito
anteriormente contiene una cantidad de otras herramientas útiles de
análisis de secuencia para identificar homólogos del nucleótido ya
divulgado y secuencias de aminoácido. Por ejemplo, el programa
"BLAST" busca las secuencias similares para una secuencia en
duda (ya sea de un péptido o de ácido nucleico) en una base de
datos especificada (por ejemplo, bases de datos de secuencia
mantenidas en el National Center for Biotechnology Information
(NCBI) en Bethesda, Maryland, Estados Unidos de América);
"FastA" (Lipman y Pearson, 1985; ver también Pearson y Lipman,
1988; Pearson, 1990) lleva a cabo una búsqueda de Pearson y Lipman
para encontrar la similitud entre una secuencia en duda y un grupo
de secuencias del mismo tipo (ácido nucleico o proteína);
"TfastA" lleva a cabo una búsqueda de Pearson y Lipman para
encontrar la similitud entre una secuencia en duda y cualquier
grupo de secuencias de nucleótidos (traduce las secuencias de
nucleótidos en todos los seis marcos de lectura antes de llevar a
cabo la comparación); "FastX" realiza una búsqueda de Pearson
y Lipman para encontrar la similitud entre una secuencia de
nucleótidos en duda y un grupo de secuencias de proteína, tomado en
cuenta los marcos de lectura. "TfastX" realiza una búsqueda de
Pearson y Lipman para encontrar la similitud entre una secuencia de
proteína en duda y cualquier grupo de secuencias de nucleótidos,
tomando en cuenta los marcos de lectura (traduce ambas hebras de la
secuencia de ácido nucleico antes de llevar a cabo la
comparación).
Se pueden producir secuencias cortas de ácido
nucleico que tienen la habilidad de hibridar específicamente a
secuencias complementarias de ácido nucleico y utilizarlas en la
presente invención. Tales moléculas cortas de ácido nucleico pueden
ser utilizadas como sondas para identificar la presencia de una
secuencia complementaria de ácido nucleico en una muestra dada. De
esta forma, por medio de la construcción de una sonda de ácido
nucleico que es complementaria con una porción pequeña de una
secuencia particular de ácido nucleico, la presencia de esa
secuencia de ácido nucleico puede ser detectada y evaluada.
Alternativamente, se pueden utilizar las
secuencias cortas de ácido nucleico como iniciadoras de
oligonucleótidos para amplificar o mutar una secuencia
complementaria de ácido nucleico utilizando tecnología PCR. Estos
iniciadores pueden facilitar también la amplificación de secuencias
complementarias de ácido nucleico relacionadas (por ejemplo,
secuencias relacionadas de ácido nucleico de otras especies).
Las secuencias cortas de ácido nucleico pueden
ser utilizadas como iniciadores y específicamente como iniciadores
para PCR. Una sonda PCR es una molécula de ácido nucleico capaz de
iniciar la actividad de la polimerasa mientras está en una
estructura bicatenaria con otro ácido nucleico. Existen diferentes
métodos en el estado del arte para determinar la estructura de
iniciadores para PCR y de técnicas de PCR. Se pueden utilizar las
búsquedas generadas por computador utilizando programas tales como
Primer3
(www.genome.wi.mit.edu/cgi-bih/primer/primer3.cgi),
STSPipeline
(www-genome.wi.mit.edu/cgi-bin/www.STS_Pipeline),
o GeneUp (Pesole y colaboradores, 1998), por ejemplo, para
identificar iniciadores potenciales para PCR.
Cualquiera de las secuencias de ácido nucleico
divulgadas aquí puede ser utilizada como iniciador o como sonda. El
uso de estas sondas o iniciadores puede facilitar mucho la
identificación de plantas transgénicas que contienen a los
promotores ya divulgados y secuencias estructurales de ácido
nucleico. Tales sondas o iniciadores pueden ser utilizados también
para seleccionar ADNc o bibliotecas genómicas para secuencias
adicionales de ácido nucleico relacionados con, o que comparten
homología con los promotores ya divulgados y con secuencias
estructurales de ácido nucleico.
\newpage
Un iniciador o una sonda son generalmente
complementarios con una porción de una secuencia de ácido nucleico
que va a ser identificada, amplificada, o mutada, y con suficiente
longitud para formar una molécula dúplex estable específica para la
secuencia con su complemento. El iniciador o la sonda son
preferiblemente aproximadamente de 10 hasta aproximadamente 200
nucleótidos de largo, más preferiblemente aproximadamente desde 10
hasta aproximadamente 100 nucleótidos de largo, aún más
preferiblemente aproximadamente desde 10 hasta aproximadamente 50
nucleótidos de largo, y lo más preferible aproximadamente desde 14
hasta aproximadamente 30 nucleótidos de largo.
El iniciador o la sonda pueden, por ejemplo, sin
limitación, ser preparados por medio de síntesis química directa,
por medio de PCR (patentes estadounidenses Nos. 4.683.195 y
4.683.202), o cortando al fragmento específico de ácido nucleico a
partir de una molécula mayor de ácido nucleico.
La invención está también dirigida a plantas
transgénicas y a células huésped transformadas que comprenden, en
una orientación 5' a 3', a un promotor operativamente enlazado a una
secuencia estructural heteróloga de ácido nucleico. Otras
secuencias de ácido nucleico también pueden ser introducidas en la
planta o en la célula huésped junto con el promotor y la secuencia
estructural de ácido nucleico. Estas otras secuencias pueden
incluir terminadores transcripcionales 3', señales de
poliadenilación 3', otras secuencias no traducidas de ácido
nucleico, secuencias de tránsito u objetivo, marcadores
seleccionables, potenciadores, y operadores. Las secuencias
preferidas de ácido nucleico de la presente invención, incluyendo
vectores recombinantes, secuencias estructurales de ácido nucleico,
promotores, y otros elementos reguladores, son descritos más
arriba.
Los medios para preparar tales vectores
recombinantes son conocidos en el estado del arte. Por ejemplo, se
describen métodos para elaborar vectores recombinantes
particularmente adecuados para transformación de la planta en las
patentes estadounidenses Nos. 4.971.908, 4.940.835, 4.769.061 y
4.757.011. Estos vectores también han sido revisados (Rodríguez y
colaboradores, 1988; Glick y colaboradores, 1993).
Los vectores típicos útiles para expresión de
ácidos nucleicos en células y plantas superiores son conocidos en
el estado del arte e incluyen a vectores derivados del plásmido
inductor del tumor (Ti) de Agrobacterium tumefaciens (Rogers
y colaboradores, 1987). Otros vectores recombinantes útiles para la
transformación de la planta, también han sido descritos (Fromm y
colaboradores, 1985). Los elementos de tales vectores recombinantes
incluyen, sin limitación, lo discutido anteriormente.
Una célula huésped transformada puede ser
generalmente cualquier célula que sea compatible con la presente
invención. Una planta huésped o célula transformada pueden ser o
derivadas de una planta monocotiledonea o de una planta
dicotiledónea incluyendo, pero sin limitarse a canola, crambe, maíz,
mostaza, semilla de ricino, sésamo, semilla de algodón, linaza,
soja, Arabidopsis, Phaseolus, cacahuete, alfalfa,
trigo, arroz, avena, sorgo, colza, centeno, tritordeum, mijo,
cañuela, ballico perenne, caña de azúcar, arándano, papaya,
plátano, cártamo, palmas de aceite, lino, melón, manzana, pepino,
dendrobium, gladiolo, crisantemo, liliácea, algodón, eucalipto,
girasol, Brassica campestris, Brassica napus, césped,
remolacha, café y ñame (Christou, En: Particle Bombardment for
Genetic Engineering of Plants, Biotechnology Intelligence Unit,
Academic Press, San Diego, California (1996)), con canola, maíz,
Brassica campestris, Brassica napus, colza, soja,
cártamo, trigo, arroz y girasol como preferidos, y canola, colza,
maíz, Brassica campestris, Brassica napus, soja,
girasol, cártamo, palmas de aceite y cacahuete como más preferidos.
En una modalidad particularmente preferida, la planta o célula es,
o se deriva de canola. En otra modalidad particularmente preferida,
la planta o la célula es, o se deriva de Brassica napus. En
otra modalidad particularmente preferida, la planta o célula es, o
se deriva de soja.
La célula o planta de soja es preferiblemente
una línea celular seleccionada de soja. Una "línea
seleccionada" es cualquier línea que haya resultado de la cría y
selección para un desempeño agronómico superior. Los ejemplos de
líneas seleccionadas son líneas que están comercialmente disponibles
para agricultores o cultivadores de soja tal como HARTZ^{TM}
variedad H4994, HARTZ^{TM} variedad H5218, HARTL^{TM} variedad
H5350, HARTZ^{TM} variedad H5545, HARTZ^{TM} variedad H5050,
HARTZ^{TM} variedad H5454, HARTZ^{TM} variedad H5233,
HARTZ^{TM} variedad H5488, HARTZ^{TM} variedad HLA572,
HARTZ^{TM} variedad H6200, HARTZ^{TM} variedad H6104,
HARTZ^{TM} variedad H6255, HARTZ^{TM} variedad H6586,
HARTZ^{TM} variedad H6191, HARTZ^{TM} variedad H7440,
HARTZ^{TM} variedad H4452 Roundup Ready^{TM}, HARTZ^{TM}
variedad H4994 Roundup Ready^{TM}, HARTZ^{TM} variedad H4988
Roundup Ready^{TM}, HARTZ^{TM} variedad H5000 Roundup
Ready^{TM}, HARTZ^{TM} variedad H5147 Roundup Ready^{TM},
HARTZ^{TM} variedad H5247 Roundup Ready^{TM}, HARTZ^{TM}
variedad H5350 Roundup Ready^{TM}, HARTZ^{TM} variedad H5545
Roundup Ready^{TM}, HARTZ^{TM} variedad H5855 Roundup
Ready^{TM}, HARTZ^{TM} variedad H5088 Roundup
Ready^{TM},
HARTZ^{TM} variedad H5164 Roundup Ready^{TM}, HARTZ^{TM} variedad H5361 Roundup Ready^{TM}, HARTZ^{TM} variedad H5566 Roundup Ready^{TM}, HARTZ^{TM} variedad H5181 Roundup Ready^{TM}, HARTZ^{TM} variedad H5889 Roundup
Ready^{TM}, HARTZ^{TM} variedad H5999 Roundup Ready^{TM}, HARTZ^{TM} variedad H6013 Roundup Ready^{TM}, HARTZ^{TM} variedad H6255 Roundup Ready^{TM}, HARTZ^{TM} variedad H6454 Roundup Ready^{TM}, HARTZ^{TM} variedad H6686 Roundup Ready^{TM}, HARTZ^{TM} variedad H7152 Roundup Ready^{TM}, HARTZ^{TM} variedad H7550 Roundup Ready^{TM},
HARTZ^{TM} variedad H8001 Roundup Ready^{TM} (HARTZ SEED, Stuttgart, Arkansas, Estados Unidos de América); A0868, AG0901, A1553, A1900, AG1901, A1923, A2069, AG2101, AG2201, A2247, AG2301, A2304, A2396, AG2401, AG2501, A2506, A2553, AG2701, AG2702, A2704, A2833, A2869, AG2901, AG2902, AG3001, AG3002, A3204, A3237, A3244, AG3301, AG3302, A3404, A3469, AG3502, A3559, AG3601, AG3701, AG3704, AG3750, A3834, A03901, A3904, A4045, AG4301, A4341, AG4401, AG4501, AG4b01, AG4602, A4604, AG4702, AG4901, A4922, AG5401, A5547, AG5602, A5704, AG5801, AG5901, A5944, A5959, AG6101, QR4459 y QP4544 (Asgrow Seeds, Des Moines, Iowa, Estados Unidos de América); DeKalb variedad CX445 (DeKalb, Illinois).
HARTZ^{TM} variedad H5164 Roundup Ready^{TM}, HARTZ^{TM} variedad H5361 Roundup Ready^{TM}, HARTZ^{TM} variedad H5566 Roundup Ready^{TM}, HARTZ^{TM} variedad H5181 Roundup Ready^{TM}, HARTZ^{TM} variedad H5889 Roundup
Ready^{TM}, HARTZ^{TM} variedad H5999 Roundup Ready^{TM}, HARTZ^{TM} variedad H6013 Roundup Ready^{TM}, HARTZ^{TM} variedad H6255 Roundup Ready^{TM}, HARTZ^{TM} variedad H6454 Roundup Ready^{TM}, HARTZ^{TM} variedad H6686 Roundup Ready^{TM}, HARTZ^{TM} variedad H7152 Roundup Ready^{TM}, HARTZ^{TM} variedad H7550 Roundup Ready^{TM},
HARTZ^{TM} variedad H8001 Roundup Ready^{TM} (HARTZ SEED, Stuttgart, Arkansas, Estados Unidos de América); A0868, AG0901, A1553, A1900, AG1901, A1923, A2069, AG2101, AG2201, A2247, AG2301, A2304, A2396, AG2401, AG2501, A2506, A2553, AG2701, AG2702, A2704, A2833, A2869, AG2901, AG2902, AG3001, AG3002, A3204, A3237, A3244, AG3301, AG3302, A3404, A3469, AG3502, A3559, AG3601, AG3701, AG3704, AG3750, A3834, A03901, A3904, A4045, AG4301, A4341, AG4401, AG4501, AG4b01, AG4602, A4604, AG4702, AG4901, A4922, AG5401, A5547, AG5602, A5704, AG5801, AG5901, A5944, A5959, AG6101, QR4459 y QP4544 (Asgrow Seeds, Des Moines, Iowa, Estados Unidos de América); DeKalb variedad CX445 (DeKalb, Illinois).
La invención está también dirigida a un método
para producir plantas transformadas que comprende, en una
orientación 5' a 3', a un promotor operativamente enlazado a una
secuencia estructural heteróloga de ácido nucleico. También pueden
ser introducidas otras secuencias en las plantas junto con el
promotor y la secuencia estructural de ácido nucleico. Estas otras
secuencias pueden incluir terminadores transcripcionales 3', señales
de poliadenilación 3', otras secuencias no traducidas, secuencias
objetivo o de tránsito, marcadores seleccionables, potenciadores, y
operadores. Los vectores recombinantes preferidos, las secuencias
estructurales de ácido nucleico, los promotores, y otros elementos
reguladores incluyen, sin limitación, a todos aquellos descritos
aquí.
El método generalmente comprende las etapas de
seleccionar una planta adecuada, transformar la planta con un
vector recombinante, y obtener la célula huésped transformada.
Existen muchos métodos para introducir ácidos
nucleicos en las plantas. Los métodos adecuados incluyen infección
bacteriana (por ejemplo, Agrobacterium), vectores del tipo de
cromosoma bacteriano artificial binario, suministro directo de
ácidos nucleicos (por ejemplo, a través de transformación mediada
por PEG, incorporación de ácido nucleico mediada por
desecación/inhibición, electroporación, agitación con fibras de
carburo de silicio, y aceleración de partículas recubiertas de
ácido nucleico, etc. (revisadas en Potrykus y colaboradores,
1991)).
La tecnología para introducción de ácidos
nucleicos en las células es bien conocida por aquellos capacitados
en el arte. Los métodos se pueden clasificar generalmente en cuatro
categorías: (1) métodos químicos (Graham y van der Eb, 1973;
Zatloukal y colaboradores, 1992); (2) métodos físicos tales como
microinyección (Capecchi, 1980), electroporación (Wong y Neumann,
1982; Fromm y colaboradores, 1985; patente estadounidense No.
5.384.253), y aceleración de partículas (Johnston y Tang, 1994;
Fynan y colaboradores, 1993); (3) vectores virales (Clapp, 1993; Lu
y colaboradores, 1993; Eglitis y Anderson, 1988); y (4) mecanismos
mediados por un receptor (Curiel y colaboradores, 1992; Wagner y
colaboradores, 1992). Alternativamente, los ácidos nucleicos pueden
ser introducidos directamente en el polen por medio de inyección
directa en los órganos reproductores de la planta (Zhou y
colaboradores, 1983; Hess, 1987; Luo y colaboradores, 1988; Pena y
colaboradores, 1987). En otro aspecto, también se pueden inyectar
los ácidos nucleicos en embriones inmaduros (Neuhaus y
colaboradores, 1987).
La regeneración, el desarrollo, y cultivo de
plantas a partir de protoplastos o de explantes de plantas
transformadas son enseñados en el estado del arte (Weissbach y
Weissbach, 1988; Horsch y colaboradores, 1985). Los transformantes
se cultivan generalmente en presencia de un medio selectivo que
selecciona a las células transformadas exitosamente e induce la
regeneración de vástagos de la planta (Fraley y colaboradores,
1983). Tales vástagos se obtienen típicamente en dos o cuatro
meses.
Se transfieren luego los vástagos a un medio de
inducción de raíces apropiado que contiene el agente selectivo y un
antibiótico para prevenir el crecimiento bacteriano. Muchos de los
vástagos desarrollarán raíces. Éstos son luego trasplantados al
suelo o a otro medio para permitir el desarrollo continuado de
raíces. El método, como se reseñó, variará generalmente dependiendo
de la planta particular empleada.
Preferiblemente, las plantas transgénicas
regeneradas se autopolinizan para proveer plantas transgénicas
homocigotas. Alternativamente, el polen obtenido de las plantas
transgénicas regeneradas se puede cruzar con plantas no
transgénicas, preferiblemente líneas endogámicas de especies
agronómicamente importantes. Contrariamente, el polen de plantas no
transgénicas puede ser utilizado para polinizar a las plantas
transgénicas regeneradas.
Una planta transgénica puede pasar junto con la
secuencia de ácido nucleico que codifica la expresión potenciada
del gen a su progenie. La planta transgénica es preferiblemente
homocigota para el ácido nucleico que codifica la expresión
potenciada del gen y trasmite aquella secuencia a toda su progenie
como resultado de reproducción sexual. La progenie puede
desarrollarse a partir de semillas producidas por la planta
transgénica. Estas plantas adicionales pueden ser entonces
autopolinizadas para generar una verdadera línea de crianza de
plantas.
Se evalúa la progenie de estas plantas, entre
otras cosas, por expresión génica. La expresión génica se puede
detectar por medio de diferentes métodos comunes tales como
transferencias hacia el occidente, transferencias hacia el norte,
inmunoprecipitación, y ELISA.
Las plantas o los agentes de la presente
invención se pueden utilizar en métodos, por ejemplo sin limitación,
para obtener una semilla que exprese a una molécula estructural de
ácido nucleico en esa semilla, para obtener una semilla mejorada en
un producto de un gen estructural, para obtener harina mejorada en
un producto de un gen estructural, para obtener materia prima
mejorada en un producto de un gen estructural, y para obtener
aceite mejorado en un producto de un gen estructural.
Las plantas utilizadas en tales métodos se
pueden procesar. Una planta o parte de una planta se pueden separar
o aislar a partir de otras partes de la planta. Una parte preferida
de la planta para este propósito es una semilla. Se entiende que
aún después de la separación o el aislamiento de otras partes de la
planta, la parte aislada o separada de la planta se puede
contaminar con otras partes de la planta. En un aspecto preferido,
la parte separada de la planta es aproximadamente superior al 50%
(p/p) del material separado, más preferiblemente, aproximadamente
superior al 75% (p/p) del material separado, y aún más
preferiblemente aproximadamente superior al 90% (p/p) del material
separado. Las plantas o partes de la planta de la presente invención
generadas por medio de tales métodos se pueden procesar en
productos utilizando técnicas conocidas. Los productos preferidos
son harina, materia prima y aceite.
Cualquiera de las plantas o partes de la misma
de la presente invención se pueden procesar para producir una
preparación de pienso, harina, proteína o aceite. Una parte
particularmente preferida de la planta para este propósito es una
semilla. En una modalidad preferida, se diseña la preparación de
pienso, harina, proteína o aceite para animales rumiantes. Los
métodos para producir preparaciones de pienso, harina, proteína o
aceite son conocidos en el arte. Ver, por ejemplo, las patentes
estadounidenses Nos. 4.957.748, 5.100.679, 5.219.596, 5.936.069,
6.005.076, 6.146.669 y 6.156.227. En una modalidad preferida, la
preparación de proteína es una preparación de alto contenido de
proteína. Tal preparación con alto contenido de proteína tiene
preferiblemente un contenido de proteína aproximadamente superior
al 5% p/v, más preferiblemente aproximadamente del 10% p/v, y aún
más preferiblemente aproximadamente del 15% p/v. En una preparación
preferida de aceite, la preparación de aceite es una preparación
con alto contenido de aceite con un contenido de aceite derivado de
una planta o de parte de la misma de la presente invención
aproximadamente superior al 5% p/v, más preferiblemente
aproximadamente del 10% p/v, y aún más preferiblemente
aproximadamente del 15% p/v. En una modalidad preferida la
preparación de aceite es un líquido y de un volumen aproximadamente
superior a 1, aproximadamente 5, aproximadamente 10 o
aproximadamente 50 litros. La presente invención provee un aceite
producido a partir de plantas de la presente invención o generado
por medio de un método de la presente invención. Tal aceite puede
ser un componente menor o mayor de cualquier producto resultante.
Además, tal aceite puede estar mezclado con otros aceites. En una
modalidad preferida, el aceite producido a partir de plantas de la
presente invención o generado por medio de un método de la presente
invención constituye un componente de aceite de cualquier producto
aproximadamente superior al 0,5, aproximadamente 1, aproximadamente
5, aproximadamente 10, aproximadamente 25, aproximadamente 50,
aproximadamente 75 o aproximadamente 90% en volumen o en peso. En
otra modalidad, la preparación de aceite puede ser mezclada y puede
constituir una cantidad aproximadamente superior al 10,
aproximadamente 25, aproximadamente 35, aproximadamente 50 o
aproximadamente 75% de la mezcla en volumen. El aceite producido a
partir de una planta de la presente invención puede ser mezclado
con uno o más solventes orgánicos o destilados de petróleo.
Las semillas de las plantas se pueden colocar en
un contenedor. Como se lo utiliza aquí, un contenedor es cualquier
objeto capaz de contener a tales semillas. Un contenedor contiene
preferiblemente una cantidad aproximadamente superior a 500,
aproximadamente 1.000, aproximadamente 5.000, o aproximadamente
25.000 semillas donde al menos aproximadamente 10, aproximadamente
25, aproximadamente 50, aproximadamente 75 o aproximadamente 100% de
las semillas se derivan de una planta de la presente invención.
Las plantas de la presente invención pueden ser
parte de, o generadas a partir de un programa de crianza. La
escogencia de un método de crianza depende de la forma de
reproducción de la planta, de la capacidad de heredar
el(los)
rasgo(s) que está(n) siendo mejorado(s), y del tipo de variedad cultivada utilizada comercialmente (por ejemplo, variedad cultivada híbrida, variedad cultivada de línea pura, etc.). Las aproximaciones no limitantes, seleccionadas, para la crianza de las plantas de la presente invención se exponen más abajo. Un programa de crianza se puede mejorar utilizando una selección asistida de marcadores de la progenie de cualquier cruzamiento. Se entiende además que cualquier variedad cultivada comercial y no comercial puede ser utilizada en un programa de crianza. Factores tales como, por ejemplo, el vigor de surgimiento, el vigor vegetativo, la tolerancia al estrés, la resistencia a las enfermedades, las ramificaciones, la floración, la aparición de semillas, el tamaño de las semillas, la densidad de las semillas, la capacidad de erguirse, y la capacidad de desgranado, etc., generalmente dictarán la escogencia.
rasgo(s) que está(n) siendo mejorado(s), y del tipo de variedad cultivada utilizada comercialmente (por ejemplo, variedad cultivada híbrida, variedad cultivada de línea pura, etc.). Las aproximaciones no limitantes, seleccionadas, para la crianza de las plantas de la presente invención se exponen más abajo. Un programa de crianza se puede mejorar utilizando una selección asistida de marcadores de la progenie de cualquier cruzamiento. Se entiende además que cualquier variedad cultivada comercial y no comercial puede ser utilizada en un programa de crianza. Factores tales como, por ejemplo, el vigor de surgimiento, el vigor vegetativo, la tolerancia al estrés, la resistencia a las enfermedades, las ramificaciones, la floración, la aparición de semillas, el tamaño de las semillas, la densidad de las semillas, la capacidad de erguirse, y la capacidad de desgranado, etc., generalmente dictarán la escogencia.
Para los rasgos altamente heredables, será
efectiva una escogencia de plantas individuales superiores evaluadas
en una sola ubicación, mientras que para los rasgos poco
heredables, la selección debe hacerse con base en los valores
medios obtenidos a partir de las evaluaciones replicadas de familias
de plantas relacionadas. Los métodos populares de selección
comúnmente incluyen la selección de linaje, la selección de masa, y
la selección recurrente. En una modalidad preferida, se emprende un
programa de retrocruzamiento o de reproducción recurrente.
La complejidad de la herencia influencia la
escogencia del método de reproducción. La reproducción por
retrocruzamiento se puede utilizar para transferir uno, o unos
pocos genes favorables para un rasgo altamente heredable en una
variedad cultivada deseable. Esta aproximación ha sido utilizada
extensivamente para la reproducción de variedades de cultivo
resistentes a enfermedades. Se utilizan diferentes técnicas
recurrentes de selección para mejorar los rasgos heredados
cuantitativamente controlados por numerosos genes. El uso de una
selección recurrente en cultivos de autopolinización depende de la
facilidad de la polinización, de la frecuencia de híbridos exitosos
de cada polinización, y del número de vástagos híbridos de cada
cruzamiento exitoso.
Las líneas de reproducción pueden ser analizadas
y comparadas para estándares apropiados en ambientes representativos
del(de las) área(s) comercial(es) objetivo
para dos o más generaciones. Las mejores líneas son candidatas para
nuevas variedades de cultivo comerciales; aquellas aún deficientes
en rasgos pueden ser utilizadas como padres para producir nuevas
poblaciones para selección adicional.
Un método de identificar una planta superior es
observar su desempeño con relación a otras plantas experimentales y
a una amplia variedad cultivada de crecimiento estándar. Si una sola
observación no es concluyente, las observaciones replicadas pueden
proveer una mejor estimación de su valor genético. Un cultivador
puede seleccionar y cruzar dos o más líneas parentales, seguido por
autofertilización y selección, produciendo muchas nuevas
combinaciones genéticas.
El desarrollo de nuevas variedades de cultivo
requiere del desarrollo y selección de variedades, del cruzamiento
de estas variedades y de la selección de cruces híbridos superiores.
La semilla híbrida se puede producir por medio de cruces manuales
entre padres fértiles machos o por medio del uso de sistemas de
esterilización de machos. Los híbridos se seleccionan por ciertos
rasgos genéticos únicos tales como el color de la vaina, el color
de la flor, la producción de semilla, el color de la pubescencia, o
la resistencia al herbicida, que indica que la semilla es
verdaderamente un híbrido. Datos adicionales sobre las líneas
parentales, así como el fenotipo del híbrido, influyen sobre la
decisión del cultivador de si continuar con el cruzamiento de
híbridos específicos.
Se pueden utilizar métodos de reproducción de
linajes y de crianza de selección recurrente para desarrollar
variedades de cultivo de poblaciones para reproducción. Los
programas de crianza combinan rasgos deseables de dos o más
variedades de cultivo o diferentes fuentes de base amplia en
reservas de crianza a partir de las cuales se desarrollan las
variedades de cultivo por autofertilización y selección de fenotipos
deseados. Se pueden evaluar nuevas variedades de cultivo para
determinar cuales tienen potencial comercial.
Se utiliza comúnmente la reproducción de linajes
para la mejora de cultivos de autopolinización. Dos padres que
poseen rasgos favorables complementarios se cruzan para producir una
población F_{1}. Se produce una población F_{2} por
autofertilización de una o varias de las poblaciones F_{1}. Se
lleva a cabo la selección de los mejores individuos de las mejores
familias. El análisis replicado de familias puede comenzar en la
generación de F_{4} para mejorar la efectividad de la selección
por rasgos que se heredan poco. En una etapa avanzada de endogamia
(esto es, F_{6} y F_{7}), se analizan las mejores líneas o
mezclas de líneas fenotípicamente similares para la liberación
potencial como nuevas variedades de cultivo.
Se ha utilizado reproducción por
retrocruzamiento para transferir genes por un rasgo altamente
heredable, heredado en forma simple en una variedad de cultivo
homocigoto deseable o línea endógama, que es el padre recurrente.
La fuente del rasgo que va a ser transferido es llamado el padre
donante. Se espera que la planta resultante tenga los atributos del
padre recurrente (por ejemplo, variedad de cultivo) y el rasgo
deseable transferido del padre donante. Después del cruzamiento
inicial, se seleccionan los individuos que poseen el fenotipo del
padre donante y se cruzan repetidamente (retrocruzamiento) con el
padre recurrente. Se espera que el padre resultante tenga los
atributos del padre recurrente (por ejemplo, variedad de cultivo) y
el rasgo deseable transferido del padre donante.
El procedimiento de descendencia única de la
semilla en estricto sentido se refiere a la plantación de una
población segregadora, cosechando una muestra de una semilla por
planta, y utilizando la muestra de una semilla para plantar la
siguiente generación. Cuando la población se ha desarrollado a
partir de F_{2} hasta el nivel deseado de endogamia, las plantas
a partir de las cuales se derivan las líneas, cada una reconstruirá
diferentes individuos F_{2}. El número de plantas en una población
declina cada generación, debido a la falla de algunas semillas para
germinar o de algunas plantas para producir al menos una semilla.
Como resultado, no todas las plantas F_{2} originalmente
muestreadas en la población estará representada por una progenie
cuando se complete la generación en desarrollo.
En un procedimiento de semillas múltiples, los
criadores comúnmente cosecharán una o más vainas de cada planta en
una población y las desgranarán para formar un cierto volumen. Parte
de este volumen es utilizado para plantar la siguiente generación y
parte es colocado en reserva. El procedimiento ha ido denominado
como de descendencia de una semilla única o la técnica de volumen
de vainas.
El procedimiento de semillas múltiples ha sido
utilizado para ahorrar trabajo en la cosecha. Es considerablemente
más rápido desgranar vainas con una máquina que remover una semilla
de cada una a mano para el procedimiento de una semilla única. El
procedimiento de semillas múltiples también hace posible plantar el
mismo número de semillas de una población cada generación de
endogamia.
Las descripciones de otros métodos de crianza
que son comúnmente utilizados para diferentes rasgos y cultivos se
pueden encontrar en uno de los muchos libros de referencia (por
ejemplo, Fehr, Principles of Cultivar Development Vol. 1, páginas
2-3 (1987)).
Una planta transgénica de la presente invención
puede ser reproducida utilizando también la apomixis. La apomixis
es un método controlado genéticamente de reproducción en plantas
donde el embrión se forma sin la unión de un óvulo y el esperma.
Existen tres tipos básicos de reproducción apomíctica: (1) la
aposporia donde el embrión se desarrolla a partir de un óvulo no
reducido cromosómicamente en un saco embrionario derivado del
núcleo, (2) la diplosporia donde el embrión se desarrolla a partir
de un óvulo no reducido en un saco embrionario derivado a partir de
la célula madre megaspora, y (3) el adventicio embrionario donde el
embrión se desarrolla directamente a partir de una célula somática.
En la mayoría de las formas de apomixis, es necesaria la pseudogamia
o fertilización del núcleo polar para producir endospermo para la
viabilidad de la semilla. En la aposporia, se puede utilizar una
variedad de cultivo nodriza como fuente de polen para la formación
del endospermo en las semillas. La variedad de cultivo nodriza no
afecta la genética de la variedad de cultivo apomíctica apospórica
ya que el óvulo no reducido de la variedad de cultivo se desarrolla
partenogenéticamente, pero hace posible la producción de
endospermo. La apomixis es económicamente importante, especialmente
en plantas transgénicas, debido a que causa que cualquier genotipo,
no importa cuán heterocigoto, se engendre verdaderamente. Por lo
tanto, con la reproducción apomíctica, las plantas transgénicas
heterocigotos pueden mantener su fidelidad genética a todo lo largo
de los ciclos repetidos de vida. Los métodos para la producción de
plantas apomícticas son conocidos en el estado del arte. Ver, la
patente estadounidense No. 5.811.636.
Se puede introducir un ácido nucleico de la
presente invención en cualquier célula u organismo tal como en una
célula de mamífero, en un mamífero, en una célula de pez, en un pez,
en una célula de ave, en un ave, en células de alga, en algas, en
células de hongo, en hongos, o en células bacterianas. El huésped
preferido y los transformantes incluyen: células de hongo tales
como Aspergillus, levaduras, mamíferos, particularmente
bovinos y porcinos, insectos, bacterias, y algas. Las bacterias
preferidas son E. coli y Agrobacterium
tumefaciens.
Los métodos para trasformar tales células u
organismos son conocidos en el estado del arte (EP 0 238 023;
Yelton y colaboradores, 1984; Malardier y colaboradores, 1989;
Becker y Guarente; Ito y colaboradores, 1983; Hinnen y
colaboradores, 1978; y Bennett y LaSure, 1991). Los métodos para
producir proteínas a partir de tales organismos son también
conocidos (Kudla y colaboradores, 1990; Jarai and Buxton, 1994;
Verdier, 1990; MacKenzie y colaboradores, 1993; Hartl y
colaboradores, 1994; Bergeron y colaboradores, 1994; Demolder y
colaboradores, 1994; Craig, 1993; Gething y Sambrook, 1992; Puig y
Gilbert, 1994; Wang y Tsou, 1993; Robinson y colaboradores, 1994;
Enderlin y Ogrydziak, 1994; Fuller y colaboradores, 1989; Julius y
colaboradores, 1984; y Julius y colaboradores, 1983).
Se suministran los siguientes ejemplos y no
deben ser interpretados de ninguna manera como limitantes para el
alcance de la presente invención.
Se obtiene un promotor 7S\alpha a partir de
ADN genómico de soja (Asgrow A3244) utilizando un Universal Genome
Walker Kit (Clontech Laboratories, Inc., Palo Alto, California) y
siguiendo las instrucciones del fabricante. El procedimiento
consiste de dos amplificaciones por PCR, utilizando un iniciador
adaptador y un iniciador específico para el gen para cada reacción
de amplificación. Para identificar una reacción de homología mínima
que sería adecuada como AND molde, se alinean las secuencias de las
regiones de codificación de los genes 7S\alpha y 7S\alpha'
(GlcX (7S\alpha') y GlcA (7S\alpha)) y se identifican dos
regiones de no homología (Figura 1). Con base en las regiones
identificadas de no homología, se preparan los siguientes
iniciadores específicos del gen:
Para la amplificación primaria por PCR,
GlcA-GW-primaria: extremo 3'
(complementario con la secuencia subrayada en la Figura 1)
- 5'-CTTCTGATGAGGTGGGGGTGGGAATGGGAA-3'
- [SEQ ID NO: 6]
\vskip1.000000\baselineskip
Para la amplificación secundaria por PCR,
GlcA-GW-anidada (con los sitios de
clonación BglII y NcoI añadidos al extremo 5' del
iniciador): extremo 3' (complementario con la secuencia en negrilla
en la Figura 1)
- 5'-CCATGGAGATCTATCTTGTTCTCATCCTCATCCTCATC-3'
- [SEQ ID NO: 7]
\vskip1.000000\baselineskip
Se utiliza el siguiente iniciador adaptador en
esta metodología:
Extremo 5' Primario: AP 1 seq:
- 5'-GTATACGACTCACTATAGGGC-3'
- [SEQ ID NO: 9]
\vskip1.000000\baselineskip
AP5 (con los sitios de clonación HindIII
y PstI añadidos al extremo 5' del iniciador)
Extremo 5' anidado
- 5'-AAGCTTCTGCAGGGTCGACGGCCCGGGCTGGT-3'
- [SEQ ID NO: 5]
\newpage
A partir de este procedimiento, se aislaron y
secuenciaron tres clones. Una alineación de secuencia ilustra que
los tres clones representan al mismo gen 7S\alpha con el clon 8A
mientras que los clones más largos se identifican como 8A (2,3Kb de
longitud), 7C (1,5Kb de longitud) y 9C (1,3 Kb de longitud). Estos
clones iniciales contienen la secuencia asociada tanto con el
promotor como con una porción de la región de codificación de un gen
7S\alpha (una de las subunidades de
\beta-conglicinina). Para confirmar que el clon es
un gen 7S\alpha, se alinea la secuencia 3' del clon 8A con una
secuencia publicada de ADNc (Número de Acceso X17698 en el GenBank).
Tal alineación confirma que el producto PCR es homólogo a la región
secuencia arriba del gen 7S\alpha y no al gen 7S\alpha'.
Se subclona entonces a los clones 7C, 8A, y 9C
para proveer fragmentos más pequeños que contienen únicamente al
promotor y a las regiones 5' UTR del gen 7S\alpha. Las regiones de
amplificación por PCR como se las describió anteriormente se llevan
a cabo utilizando a los clones 7C, 8A, y 9C como moldes. El
iniciador AP5 es el iniciador adaptador, y el iniciador específico
del gen es:
- 5'-CGATGGAGATCTAAGGAGGTTGCAACGAGCGTGGCAT-3'
- [SEQ ID NO: 10]
Este iniciador específico del gen está diseñado
para introducir un sitio de restricción BglII y NcoI
en el extremo 3' para facilitar la clonación posterior. Los clones
resultantes se secuencian utilizando metodología estándar y se
subclona en un nuevo vector acondicionado pGEM-T
(Promega, Madison, WI, Estados Unidos; Patente estadounidense No.
4.766.072) generando lo siguiente:
p-GEM-T 1A.
Inserto de 1,7 Kb derivado del clon original 8A,
p-GEM-T 2A.
Inserto de 1,3 Kb derivado del clon original 7C, y
p-GEM-T 3A.
Inserto de 1,1 Kb derivado del clon original 9C.
Las secuencias de nucleótidos de
p-GEM-T 1A,
p-GEM-T 2A, y
p-GEM-T 3A se utilizan para predecir
las secuencias correspondientes de aminoácidos. Luego se alinean
las secuencias predichas de aminoácidos con la secuencia de
traducción de la proteína del producto del gen 7S\alpha (GlcA)
(Número de Acceso X17698 en el GenBank y Número de Acceso P13916 en
el SWISS-PROT) para identificar un codón de inicio.
Se alinean las secuencias utilizando la función de alineación de
secuencia del software GCG (Genetics Computer Group, Oxford
Molecular Group, Inc.). Se utilizan entonces los clones 1A, 2A, y
3A como moldes para otra reacción PCR utilizando al AP5 como el
iniciador adaptador y la siguiente secuencia como el iniciador
específico del gen:
- 5'-C CATGGAGATCTAGTATCTTAATTATTTATTAAGGTAT- 3'
- [SEQ ID NO: 8]
Adicionalmente, se añaden los sitios NcoI
y BglII en el extremo 5' del iniciador (mostrados en
caracteres itálicos). Los productos PCR de esta reacción se
purifican y se clonan nuevamente dentro del vector acondicionado
pGEM-T resultando en:
p-GEM-T 1T, inserto de 1.724 pares
de bases derivado del clon 1A;
p-GEM-T "nuevo" 2A, inserto de
1.135 pares de bases derivado del clon 2A; y
p-GEM-T "nuevo" 3A, inserto de
918 pares de bases derivado del clon 3A. La secuencia de
p-GEM-T 1T se observa en la Figura
2.
Este ejemplo demuestra que las actividades del
promotor de las nuevas variantes 7S\alpha clonadas se confirman
en cotiledones de soja transformados en forma transitoria.
Los tres clones del ejemplo 1 (1T, nuevo 2A, y
nuevo 3A) se purifican por medio de electroforesis en gel (kit
QIAquick, Cat. No. 28704, Qiagen Company, Valencia, California) y se
subclona dentro de pMON8677 (Figura 3), en la posición
originalmente ocupada por el promotor e35S, secuencia arriba del gen
reportero GUS. Los mapas del plásmido resultante se observan en la
Figura 2a como pMON55548 (1T), Figura 3a como pMON55546 (nuevo 2A)
y Figura 4 como pMON55547 (nuevo 3A). Dos de estos plásmidos,
pMON55546 y pMON55548, se utilizan en los ensayos transitorios de
cotiledones de soja.
Las semillas de las plantas de soja (Asgrow
A3244) se cosechan 25-28 días después de la
floración y se las trata osmóticamente durante la noche a 25ºC en
la oscuridad sobre medio de GAMBORG (G5893, Sigma Company, St.
Louis, Missouri) suplementado con glutamina 50 mM, maltosa 111 mM,
rafinosa 125 mM, manitol 125 mM y 3 g/l de agar purificado, pH 5,6.
Los 125 cotiledones resultantes se cortan por la mitad y se
bombardean con ADN purificado superenrrollado de las construcciones
del promotor 7S\alpha de pMON55546 y pMON55548 utilizando
tecnología de pistola de partículas (Maliga y colaboradores, 1995,
"Methods in Plant Molecular Biology, A Laboratory Course
Manual", Cold Spring Harbor Laboratory Press, página 47). Una
construcción separada de luciferasa dirigida e35S está incluida en
una proporción molar 1:1 con cada una de las construcciones del
promotor como control de baja expresión. Se incuban luego los
tejidos durante 48 horas a 25ºC.
Las proteínas se extraen de seis cotiledones
bombardeados de soja utilizando 1 ml de amortiguador de extracción
que contiene fosfato de potasio 0,1 M (pH 7,8), DTT 10 mM, EDTA 1
mM, glicerol al 5%, e inhibidor de proteinasa (1 tableta/50 ml,
Roche Molecular Biochemicals, Indianapolis, IN). Se utiliza una
alícuota de 100 \mul del extracto de proteína para el ensayo de
la Luciferasa siguiendo un procedimiento
"Steady-Glo" de Promega (Cat. No. E2510,
Promega Corporation Madison, WI). Se utiliza una alícuota de 50
\mul del extracto de proteína para un protocolo estándar del
ensayo GUS con modificaciones menores (Maliga y colaboradores, 1995,
"Methods in Plant Molecular Biology, A Laboratory Course
Manual", Cold Spring Harbor Laboratory Press, página 29). Se
analiza cada muestra dos veces y se utiliza el valor promedio para
el análisis de datos. Se normaliza la actividad de GUS utilizando
la actividad de la luciferasa y los resultados indican que todas las
variantes de los promotores 7S\alpha son funcionales en tejidos
de cotiledones de soja.
Se subclona el casete de expresión en pMON55548
(7S\alpha-1T-GUS-NOS-3')
para generar al vector pMON55554, un vector de transformación de
Agrobacterium capaz de demostrar la efectividad de un promotor
7S\alpha en plantas de soja (Figura 5). Se incluye también un
marcador de selección resistente a glifosato (CP4) en pMON55554. Se
introduce el vector en una cepa bacteriana de Agrobacterium
tumefaciens ABI y se utilizan las células transformadas
resultantes para infectar cotiledones de soja (Asgrow A3244). Como
control, se utiliza un promotor truncado de Arcelina 5 en lugar de
7S\alpha-1T para generar pMON55542 (Figura 6). Se
introduce el vector en una cepa bacteriana de Agrobacterium
tumefaciens ABI y se utilizan las células trasformadas
resultantes para infectar cotiledones de soja (Asgrow A3244).
Se seleccionan las plantas resistentes a
glifosato después de la regeneración de las plantas de los tejidos
infectados por A. tumefaciens. Se analizan las semillas
maduras de las plantas seleccionadas por la actividad GUS. Para
analizar la actividad GUS, se muelen individualmente ocho semillas
de cada evento (línea) transgénico. Se extraen aproximadamente 20
mg de tejido molido de semilla utilizando 200 \mul de amortiguador
de extracción que contiene fosfato de potasio 0,1 M (pH 7,8), DTT
10 mM, EDTA 1 mM, glicerol al 5%, e inhibidor de proteinasa (1
tableta/50 ml, Roche Molecular Biochemicals, Indianapolis, IN). El
contenido de proteína del extracto se determina utilizando
Bio-Rad Protein Assay (Bio-Rad,
#61234A) y la actividad GUS se mide utilizando un protocolo
estándar del ensayo GUS con modificaciones menores (Maliga y
colaboradores, 1995, "Methods in Plant Molecular Biology, A
Laboratory Course Manual", Cold Spring Harbor Laboratory Press,
página 29). La actividad GUS se normaliza contra la concentración
de proteína. Se analizó cada muestra dos veces y se utilizó el valor
promedio para el análisis de datos.
Se rechaza un evento (línea) si ninguna de las
ocho semillas tenía actividad GUS detectable. Entre cada uno de los
eventos que muestran actividad GUS, se selecciona la semilla que
tiene la actividad más alta. Se repite el ensayo de actividad GUS
para las semillas seleccionadas y se resumen los resultados en la
Figura 7. La comparación entre 28 eventos positivos de pMON55554 y
11 eventos positivos de pMON55542 muestra que el promotor
7S\alpha es, como mínimo, tan fuerte como el promotor truncado de
Arcelina 5 (Figura 7).
La expresión de GUS dirigida ya sea por el
promotor 7S\alpha1T en pMON55553 (Figura 8) o de tArc5 en
pMON55541 (Figura 9) se examina en Arabidopsis thaliana. La
expresión de GUS pMON55553
(7S\alpha1T-GUS-NOS) y de GUS
pMON55541 (tArc5-GUS-NOS) se examina
en un brote de una semana y en una planta madura. Las plantas y los
brotes que expresan al plásmido pMON55553 muestran que GUS está
ausente en raíces o en hojas maduras cuando se utiliza el promotor
7S\alpha1T. La actividad se observa en hipocotiledones y en
cotiledones, que es causada por la proteína GUS residual
sintetizada durante la embriogénesis. Las plantas y los brotes que
expresan pMON55541 muestran que GUS está presente en raíces y en
hojas maduras además de las señales detectadas en hipocotiledones y
cotiledones cuando se utiliza el promotor tArc5. Los datos ilustran
que el promotor 7S\alpha ha mejorado la especificidad de la
semilla comparada con el promotor tArc5.
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<110> Renessen LLC
\hskip1cm wang, Qi
\hskip1cm Dubois, Patrice
\vskip0.400000\baselineskip
<120> Promotor alfa 75 Específico de la
semilla para Expresar implantes de Genes
\vskip0.400000\baselineskip
<130> 60/316.975
\vskip0.400000\baselineskip
<150> 60/316.975
\vskip0.400000\baselineskip
<151>
2001-09-05
\vskip0.400000\baselineskip
<160> 14
\vskip0.400000\baselineskip
<170> PatentIn versión 3.1
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 1
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 1318
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Glicina max
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 1
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 2
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 1724
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Glicina max
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 2
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 3
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 1135
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Glicina max
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 3
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 5
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 32
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> construcción sintética
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 5
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipaagcttctgc agggtcgacg gcccgggctg gt
\hfill32
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 6
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 30
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> construcción sintética
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 6
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipcttctgatga ggtgggcgtg ggaatgggaa
\hfill30
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 7
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 38
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> construcción sintética
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 7
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipccatggagat ctatcttgtt ctcatcctca tcctcatc
\hfill38
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 8
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 38
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> construcción sintética
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 8
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipccatggagat ctagtatctt aattatttat taaggtat
\hfill38
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 9
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 21
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> construcción sintética
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 9
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipgtatacgact cactataggg c
\hfill21
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 10
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 37
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
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<213> construcción sintética
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 10
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipccatggagat ctaaggaggt tgcaacgagc gtggcat
\hfill37
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 11
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 1318
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Glicina max
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 11
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
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<210> 12
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 1724
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Glicina max
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 12
\vskip1.000000\baselineskip
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<210> 13
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 1135
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<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Glicina max
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 13
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\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 14
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<211> 918
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Glicina max
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 14
\vskip1.000000\baselineskip
Claims (18)
1. Una planta transformada que contiene una
molécula de ácido nucleico que comprende en la dirección 5' a 3':
un promotor que tiene una secuencia de ácido nucleico seleccionada
del grupo que consiste de las SEQ ID NOs: 11 y 12, una secuencia de
ácido nucleico que exhibe una identidad con las SEQ ID NOs: 11 y 12
superior al 90% y complementos de las mismas, y una secuencia
estructural de ácido nucleico operativamente enlazada, en donde el
promotor es heterólogo con respecto a la secuencia estructural de
ácido nucleico, y en donde el promotor es específico de la
semilla.
2. La planta transformada de la reivindicación
1, en donde dicha segunda secuencia de ácido nucleico codifica a
una proteína seleccionada del grupo que consiste de zeinas, proteína
7S, proteína de la nuez del Brasil, proteína libre de fenilalanina,
\beta-conglicinina, proteína 11S,
alfa-hordotionina, proteína arcelina de
almacenamiento de la semilla, lectina y glutenina.
3. La planta transformada de la reivindicación
1, en donde dicha segunda secuencia de ácido nucleico codifica a una
proteína seleccionada del grupo que consiste de tyrA, slr173,
ATPT2, dxs, dxr, GGPPS, HPPD, GMT, MT1, AANT1, slr1737, y una
dioxigenasa del ácido homogentísico.
4. La planta transformada de la reivindicación
1, en donde dicha segunda secuencia de ácido nucleico codifica a
una proteína seleccionada del grupo que consiste de antranilato
sintasa, triptófano descarboxilasa, treonina descarboxilasa,
treonina desaminasa, dihidrodipicolinato sintasa, lisina
ketoglutarato reductasa y aspartato quinasa.
5. La planta transformada de la reivindicación
1, en donde al menos un fragmento de dicha segunda secuencia de
ácido nucleico se expresa en una forma tal que suprime la expresión
de dicho segundo ácido nucleico.
6. La planta transformada de la reivindicación
5, en donde dicha segunda secuencia de ácido nucleico se orienta
para expresar una molécula de ARN antisentido.
7. La planta transformada de la reivindicación
1, en donde la planta transformada se selecciona del grupo que
consiste de canola, crambe, maíz, mostaza, semilla de ricino,
sésamo, semilla de algodón, linaza, soja, Arabidopsis,
Phaseolus, cacahuete, alfalfa, trigo, arroz, avena, sorgo,
colza, centeno, tritordeum, mijo, cañuela, ballico perenne, caña de
azúcar, arándano, papaya, plátano, cártamo, palmas de aceite, lino,
melón, manzana, pepino, dendrobium, gladiolo, crisantemo, liliácea,
algodón, eucalipto, girasol, Brassica campestris,
Brassica napus, césped, remolacha, café y ñame.
8. La planta transformada de la reivindicación
7, en donde la planta transformada es soja.
9. La planta transformada de la reivindicación
1, en donde la concentración de ARNm o de proteína codificada por la
secuencia estructural de ácido nucleico es aproximadamente del 2%
(p/p) en una semilla de dicha planta transformada.
10. La planta transformada de la reivindicación
1, en donde dicha secuencia estructural de ácido nucleico se expresa
en una semilla.
11. Un método para transformar una planta que
comprende: proveer una molécula de ácido nucleico que comprende en
la dirección 5' a 3': un promotor que tiene una secuencia de ácido
nucleico seleccionada del grupo que consiste de las SEQ ID NOs: 11
y 12, una secuencia de ácido nucleico que exhibe una identidad con
las SEQ ID NOs: 11 y 12 superior al 90%, y complementos de las
mismas, operativamente enlazada a una secuencia estructural de
ácido nucleico, en donde el promotor es heterólogo con respecto a la
secuencia estructural de ácido nucleico en donde el promotor es
específico de la semilla; y transformar una planta con la molécula
de ácido nucleico.
12. El método de la reivindicación 11, en donde
dicha planta transformada produce una semilla y dicha secuencia de
ácido nucleico se transcribe en dicha semilla; y dicha semilla se
aísla de dicha planta transformada.
13. Una molécula sustancialmente purificada de
ácido nucleico que comprende una secuencia de ácido nucleico
seleccionada del grupo que consiste de las SEQ ID NOs: 11 y 12, una
secuencia de ácido nucleico que es idéntica en más de un 90% a las
SEQ ID NOs: 11 y 12, y complementos de las mismas, en donde la
molécula de ácido nucleico es un promotor específico de la
semilla.
14. Un vector que comprende al ácido nucleico
sustancialmente purificado de la reivindicación 13.
15. Una célula que comprende al vector de la
reivindicación 14.
16. La célula de acuerdo a la reivindicación
15, en donde dicha célula se selecciona del grupo que consiste de
una célula bacteriana, una célula de mamífero, una célula de
insecto, una célula de planta y una célula de hongo.
\newpage
17. La célula de acuerdo a la reivindicación 16,
en donde dicha célula bacteriana es Agrobacterium tumefaciens
o E. coli.
18. La célula de acuerdo a la reivindicación
16, en donde dicha célula de planta es una célula de soja.
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