ES2304880A1 - Uso de un vector viral mutado para la generacion in vitro de lineas celulares estables. - Google Patents
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Abstract
Uso de un vector viral mutado para la generación in vitro de líneas celulares estables. La presente invención se refiere al uso de vectores virales mutados para la generación in vitro de líneas celulares estables y la producción de proteínas de forma constitutiva. Mediante la transfección de líneas celulares con dicho vector mutado se consiguen líneas celulares no citopáticas las cuales, sorprendentemente, se mantienen estables y sintetizan proteínas heterólogas de forma constitutiva.
Description
Uso de un vector viral mutado para la generación
in vitro de líneas celulares estables.
La presente invención se puede englobar dentro
del campo de la ingeniería genética. Concretamente la invención se
refiere al uso de vectores virales mutados para la generación in
vitro de líneas celulares estables y la producción de proteínas
de forma constitutiva.
Se han desarrollado vectores de expresión de
alfavirus a partir de diferentes virus, que incluyen el virus
Sindbis (SIN) (34), el virus del Bosque de Semliki (SFV) (18) y el
virus de la encefalitis equina venezolana (VEE) (25). Normalmente,
los vectores de alfavirus están basados en replicones de ARN en los
que los genes estructurales se han sustituido por un gen
heterólogo. El replicón del alfavirus contiene una ORF que codifica
la replicasa (Rep) vírica en su extremo 5', que se traduce cuando el
ARN se transfecta en células eucariotas. La Rep se expresa como una
poliproteína que se procesa, posteriormente, en cuatro subunidades
(nsps 1 a 4) (30). La Rep sin procesar puede copiar el vector de
ARN en una cadena negativa de ARN, un proceso que sólo tiene lugar
durante las primeras 3 a 4 horas tras la transfección o infección.
Una vez procesada, la Rep utilizará el ARN de cadena negativa como
molde para sintetizar más moléculas del replicón. La Rep procesada
también puede reconocer una secuencia interna en el ARN de cadena
negativa, o promotor subgenómico, a partir del cual sintetizará un
ARN de cadena positiva subgenómico que corresponde al extremo 3'
del replicón. Este ARN subgenómico se traducirá para producir la
proteína heteróloga en grandes cantidades. El ARN del replicón
también se puede empaquetar en partículas viricas mediante la
cotransfección de las células con uno o más ARN auxiliares que son
capaces de proporcionar las proteínas estructurales viricas en trans
(2, 4, 8, 25, 29) o utilizando líneas celulares estables
empaquetadoras (24). La replicación de los vectores de alfavirus es
citopática en la mayoría de las células de mamífero debido a
mecanismos que todavía no se comprenden del todo (3, 9, 13). El
efecto citopático inducido por estos vectores está mediado por
apoptosis independiente de p53 y, normalmente, se produce entre las
48-72 horas después de la transfección o infección
(14). Se sospecha que la nsp2, uno de los 4 componentes de la
replicasa viral, podría tener un papel importante en la inducción de
la apoptosis (11, 12). Los vectores citopáticos de alfavirus se han
utilizado en una serie de aplicaciones que incluyen la producción y
caracterización de proteínas in vitro (33), así como en
estudios sobre vacunación y en terapia génica del cáncer (19, 26).
Sin embargo, un inconveniente importante de los vectores originales
es el hecho de que no se puedan utilizar en aplicaciones en las que
se desea una expresión duradera del transgén. Para solventar este
problema, varios grupos han identificado una serie de mutaciones en
la replicasa de los alfavirus que pueden convertir estos vectores
en no citopáticos, lo que permite una expresión más duradera de los
productos recombinantes expresados por el vector. Estos estudios
han conducido a la generación de vectores no citopáticos derivados
de SIN (7, 22), SFV (20-22) y, más recientemente, de
VEE y EEE (virus de la encefalitis equina oriental) (23). La
mayoría de las mutaciones no citopáticas detectadas en los
alfavirus se han localizado en la subunidad nsp2 de la Rep. Esta
proteína contiene un dominio helicasa en el extremo amino y un
dominio proteolítico en el extremo carboxilo, estando éste último
implicado en el procesamiento de la Rep en sus cuatro subunidades
(30). Se ha demostrado que las mutaciones no citopáticas descritas
para nsp2 afectan bien al dominio proteolítico de nsp2 o bien a
posiciones próximas a los sitios de escisión entre nsp1/2 o nsp2/3,
alterando, de este modo, el procesamiento de la Rep. Un mutante no
citopático aislado en SIN, que contenía un sólo cambio de
aminoácido (P por L) en la posición 726 en nsp2, mostró un
hiperprocesamiento de la Rep (7). Este mutante fue capaz de
establecer replicación continua en células BHK de manera eficaz. La
introducción de diferentes cambios de aminoácidos en la misma
posición en este mutante demostró que existe una fuerte correlación
positiva entre el nivel de replicación del ARN y la
citopatogenicidad del vector. Este vector no citopático de SIN se
ha utilizado ampliamente in vitro, ya que es capaz de
proporcionar una expresión duradera del transgén con buenos niveles
de estabilidad y niveles de expresión que eran aproximadamente el
4% de los descritos para el vector de SIN original (1).
Los vectores de alfavirus pueden expresar
niveles elevados de proteínas recombinantes en diferentes tipos de
células. Sin embargo, esta expresión es transitoria debido a la
naturaleza citopática de la replicación vírica. Para adaptar estos
vectores para estudios a largo plazo, se aislaron mutantes no
citopáticos del virus Sindbis (SIN), del virus del Bosque de
Semliki (SFV) y del virus de la encefalitis equina venezolana
(VEE). La mayoría de estos mutantes contenían cambios en nsp2, una
subunidad de la replicasa vírica. Para generar nuevos vectores no
citopáticos de SFV, se introdujeron las mutaciones descritas para
crear el vector SIN no citopático, en una posición conservada en
SFV. Curiosamente, se encontró que un replicón de SFV que contenía
la mutación P718T en nsp2 y portaba el gen LacZ como gen heterólogo
(SFV-LacZ), a pesar de que aparentemente era incapaz
de replicarse en la mayoría de las células, daba lugar a variantes
no citopáticas que formaban colonias que expresaban
\beta-galactosidasa (\beta-gal)
sin aplicarles selección. Se emitió la hipótesis de que las
variantes no citopáticas se debían a mutaciones adaptativas
secundarias. Para aislar estas variantes, se introdujo el gen de la
puromicina N-acetil-transferasa
(pac) en el mutante SFV-P718T y se seleccionaron los
clones de las células BHK que eran resistentes a la puromicina. A
partir de uno de los clones seleccionados se rescató un replicón no
citopático que contenía una segunda mutación en la señal de
localización nuclear de nsp2 (R649H). Este doble mutante
(SFV-S2-9) se replicaba a unos
niveles que eran 60 veces menores que los del vector de SFV
silvestre, hecho que correlacionaba con la ausencia de
citopatogenicidad en las células transfectadas con el vector de la
invención. Se observó un nivel similar de expresión de
\beta-gal en células transfectadas con
SFV-S2-9-LacZ y
SFV-LacZ a las 24 horas de la transfección, que
estaba en el rango de 15 pg/célula (figura 6).
Sorprendentemente el vector, en adelante vector
de la invención, fue capaz de generar líneas celulares estables
capaces de expresar \beta-gal durante al menos 10
pases en cultivo (el porcentaje de células que expresaban la
\beta-gal, determinado en cada pase mediante la
tinción con X-gal, varió entre el 70% y el 90% según
el pase, pero estaba por encima del 85% en el pase 10, lo que
indicó una gran estabilidad de la expresión del transgén en
presencia de la selección, como puede comprobarse en la figura 7),
siendo además la expresión constitutiva pues aumentó con el tiempo
en las células transfectadas con
SFV-S2-9-LacZ,
alcanzando una estabilización a aproximadamente 30 pg de
\beta-gal/célula a las 48 horas de la
transfección. Es decir, mediante la transfección con el vector
mutado se consiguió cuantitativamente el doble de expresión al
logrado a las 24 horas de post-transfección cuando
las células eran transfectadas con el vector silvestre.
El vector de la invención fue también capaz de
generar líneas celulares estables capaces de expresar, de forma
constitutiva, cardiotrofina 1 de rata a niveles similares a los
obtenidos con el vector silvestre sin las mutaciones, que eran de
aproximadamente 4.3 pg/célula. En las líneas analizadas se observó
una alta estabilidad del vector, manteniéndose los niveles de
expresión de cardiotrofina 1 durante al menos 10 pases.
Por otro lado la presente invención, tal y como
se puede comprobar en el ejemplo 8, rompe un prejuicio establecido
en el estado de la técnica al demostrar, que vectores mutados de
SFV presentes en el estado de la técnica y definidos como no
citopáticos, mantienen las características de
citopatogenicidad.
Tal y como se expresa en la presente invención
el término "línea celular estable" se refiere a líneas
celulares donde el porcentaje de células que expresan la proteína
heteróloga en el pase 10 es superior al 85%, pudiendo mantenerse o
superarse dicho porcentaje en pases sucesivos o posteriores.
Por otro lado, el término "expresión
constitutiva" se refiere a la capacidad adicional, que
sorprendentemente presentan las líneas celulares estables arriba
citadas, de expresar la proteína heteróloga a un nivel
cuantitativamente alto (superior al 50% respecto al conseguido a
las 24 horas de post-trasducción cuando las células
se transducen con el vector silvestre).
Tal y como se conoce en el estado de la técnica,
un replicón de ARN es una secuencia que se replica de forma
unitaria utilizando como intermedio un ARN complementario que sirve
como molde para producir más moléculas del ARN original. Para ello
generalmente son necesarias secuencias específicas en los extremos
del ARN. El replicón citado en la presente invención comprende el
extremo 5' necesario para la replicación de SFV, la secuencia
codificante de la encima replicasa de SFV con las mutaciones P718T
y R649H en la región nsp2, un promotor subgenómico viral de SFV,
genes de selección, genes heterólogos o de interés y el extremo 3'
necesario para la replicación de SFV que contiene una secuencia
terminal de poliadeninas (Poli A).
Figura 1. Evaluación de la citopatogenicidad de
los vectores de SFV que llevan mutaciones derivadas de SIN. Los
plásmidos pSFV-LacZ que contienen mutaciones P718T
(pSFV-S2-LacZ) y P718F
(pSFV-S3-LacZ) en nsp2 se
construyeron tal y como se describe en los ejemplos. Se transcribió
el ARN in vitro a partir de cada uno de estos plásmidos así
como del pSFV3-LacZ original y se electroporó en
células BHK que se sembraron en placas de 35 mm de diámetro con una
confluencia baja y se tiñeron con X-gal después de
cultivarse durante los tiempos indicados. En el caso de
SFV-S2-LacZ o
SFV-S3-LacZ, se dio un pase 1:5 a
las células transfectadas con dichos vectores después de 96 horas
en cultivo. Se muestra una representación esquemática del ARN de
cada vector encima de cada conjunto de imágenes. Cap: círculo en el
extremo izquierdo de los vectores; nsp: proteínas no estructurales;
flecha horizontal: promotor subgenómico del SFV; An: poli A.
Figura 2. Células BHK resistentes a puromicina
seleccionadas después de ser electroporadas con diferentes ARNs.
Las células BHK se electroporaron con los vectores de ARN de SFV
indicados o sin ARN (no RNA), se sembraron en placas de 35 mm de
diámetro y se dejaron recuperar durante 24 horas antes de añadir la
puromicina a 5 \mug/ml. Las placas se tiñeron con violeta de
metilo en los tiempos indicados después de la transfección.
Figura 3. Localización intracelular de nsp2 en
las células transfectadas con ARN del SFV. Las células BHK se
electroporaron con los vectores de ARN de SFV o sin ARN (no RNA) y
se analizaron mediante inmunofluorescencia a las 24 horas de la
transfección. Como anticuerpos primarios se utilizaron anticuerpos
monoclonales de ratón específicos de las formas nucleares
(\alphansp2-n) o citoplásmicas
(\alphansp2-c) de nsp2, y como anticuerpo
secundario se utilizó un suero policlonal de conejo específico para
IgGs de ratón conjugado con FITC. Los núcleos teñidos con dapi de
las mismas células se visualizaron con un filtro de UV (Dapi).
Figura 4. Análisis de los ARN de SFV en las
células BHK transfectadas. Se extrajo el ARN total de una línea
celular estable de BHK obtenida después de la electroporación del
replicón
SFV-S2-9-pac y de la
selección con puromicina (calle 1) o de las células BHK
electroporadas con
SFV-S2-9-pac (calles
2-4), SFV-pac (calle 5),
SFV-LacZ (calle 6) o coelectroporadas con los
replicones
SFV-S2-9-pac y
SFV-pac (calle 7) y se analizó a las 24 horas
(calles 2, 5 a 7), 48 horas (calle 3) o 72 horas (calle 4) de la
electroporación. La presencia de los ARNs genómico (g) y subgenómico
(sg) de SFV se analizó mediante transferencia Northern con un
oligonucleótido marcado con ^{32}P específico del promotor
subgenómico de SFV. Los números en la parte inferior de los geles
indican la proporción de ARN subgenómico/genómico (sg/g) en cada
caso. En la calle 7, se refieren a la proporción sg/g de
SFV-S2-9-pac (pac) o
de SFV-LacZ (LacZ), respectivamente. La parte
izquierda del gel se expuso durante 72 horas mientras que la parte
derecha se expuso durante 1 hora.
Figura 5. Expresión in vitro e in
vivo de las proteínas no estructurales. A) El ARN de
SFV-pac original (tipo silvestre) o los ARN de
SFV-pac que contienen las mutaciones indicadas se
tradujeron en lisados de reticulocitos de conejo en presencia de
[^{35}S]-metionina y
[^{35}S]-cisteína, y se analizaron mediante
SDS-PAGE en geles al 8% y luego se
autorradiografiaron. Dos geles que contenían las mismas muestras se
corrieron tiempos diferentes para obtener una mejor separación de
las bandas de peso molecular elevado (gel superior, migración más
larga) y para detectar los monómeros nsp1 y 3 de peso molecular más
pequeño (gel inferior, migración más corta). B) Análisis de la
expresión de la replicasa en las células transfectadas. Los lisados
de las células BHK control, de una línea celular estable de BHK
obtenida después de la electroporación con el replicón
SFV-S2-9-pac y
selección con puromicina (S2-9) o de células
electroporadas con los ARN de SFV-pac original (tipo
silvestre) o del mutante
SFV-RHR-pac (RHR) se analizaron
mediante inmunotransferencia utilizando un antisuero policlonal de
conejo específico contra nsp2 (gel superior) o contra nsp3 (gel del
centro). Como control interno, se analizaron las mismas muestras con
un anticuerpo específico contra la
\beta-actina.
Figura 6. Análisis de la expresión de
\beta-gal. Se electroporaron células BHK con los
ARNs indicados y se determinó el nivel de expresión de
\beta-gal por célula a los tiempos indicados
después de la electroporación. En el eje de abscisas se representa
el tiempo post-transfección en horas y en el eje de
ordenadas los picogramos de \beta-gal por
célula.
Figura 7. Estabilidad de la expresión de
\beta-gal en las células transfectadas con el
vector
SFV-S2-9-LacZ-pac.
Las células BHK se electroporaron con ARN de
SFV-S2-9-LacZ-pac
y se seleccionaron en presencia de puromicina a 5 pg/ml. Las
células seleccionadas se pasaron cada 2-3 días con
o sin puromicina y se determinó el porcentaje de células que
expresaban \beta-gal en cada pase mediante tinción
con X-gal. Los datos corresponden a la media de
tres experimentos diferentes, mostrándose la desviación estándar.
La figura muestra un campo típico de células BHK que contienen el
vector
SFV-S2-9-LacZ-pac
pasadas 10 veces en presencia de puromicina y teñidas con
X-gal. En el eje de abscisas se representa el número
de pases y en el eje de ordenadas se representa el porcentaje de
células teñidas de azul.
Figura 8. Representación esquemática de 3
ejemplos de realizaciones, en forma de ARN, del vector viral para
la generación de líneas celulares estables y producción de
proteínas estables. El replicón SFV está flanqueado por las
secuencias 5' y 3' necesarias para la replicación de SFV, donde la
secuencia 3' incorpora una secuencia terminal de poliadeninas (Poli
A). Dentro del replicón se incluye la replicasa con las subunidades
nsp1 a nsp4 y el promotor subgenómico de SFV solapado con nsp4
(SG1). Sobre nsp2 se representan las mutaciones R649H y P718T
características de la replicasa del vector. El replicón incorpora
también un gen de selección (PAC) y un gen de interés (GOI) que
codifica la proteína recombinante que interesa producir de forma
constitutiva. En los ejemplos A y C el replicón incorpora también un
segundo promotor subgenómico (SG2) de manera que la expresión de
PAC y GOI está controlada por un promotor SG distinto,
indistintamente SG1 o SG2 según la construcción A o C elegida. En
el ejemplo B la expresión de PAC y GOI está controlada por el mismo
promotor SG1, produciendo una proteína híbrida que es cortada por
proteasas en un sitio específico intercalado entre PAC y GOI. cap:
estructura cap.
Figura 9. Evaluación del efecto citopático de
SFV-LacZ. Se transcribió ARN in vitro a
partir del plásmido pSFV-LacZ (vector silvestre) y
se electroporó en células BHK. Las células se distribuyeron en
placas de 35 mm a baja confluencia y se fijaron y tiñeron con
X-gal a los tiempos indicados (d, día).
Figura 10. Evaluación del efecto citopático de
SFV-SF2A-LacZ. Se transcribió ARN
in vitro a partir del plásmido
pSFV-SF2A-LacZ y se electroporó en
células BHK. Las células se distribuyeron en placas de 35 mm a baja
confluencia y se fijaron y tiñeron con X-gal a los
tiempos indicados (d, día). Las células fueron pasadas 1:5 cuatro
días tras la transfección.
Figura 11. Evaluación del efecto citopático de
SFV-SF2C-LacZ. Se transcribió ARN
in vitro a partir del plásmido
pSFV-SF2C-LacZ y se electroporó en
células BHK. Las células se distribuyeron en placas de 35 mm a baja
confluencia y se fijaron y tiñeron con X-gal a los
tiempos indicados (d, día). Las células fueron pasadas 1:5 cuatro
días tras la transfección.
Figura 12. Evaluación del efecto citopático de
SFV-PD-LacZ. Se transcribió ARN
in vitro a partir del plásmido
pSFV-PD-LacZ y se electroporó en
células BHK. Las células se distribuyeron en placas de 35 mm a baja
confluencia y se fijaron y tiñeron con X-gal a los
tiempos indicados (d, día).
Figura 13. Evaluación del efecto citopático de
SFV-S2-LacZ. Se transcribió ARN
in vitro a partir del plásmido
pSFV-S2-LacZ y se electroporó en
células BHK. Las células se distribuyeron en placas de 35 mm a baja
confluencia y se fijaron y tiñeron con X-gal a los
tiempos indicados (d, día). Las células fueron pasadas 1:5 cuatro
días tras la transfección. Este mutante S2 fue capaz de dar lugar a
la formación de colonias de células que expresan
\beta-gal.
Figura 14. Evaluación del efecto citopático del
vector SFV-S2-9-LacZ
que lleva las mutaciones P718T y R649H. Se transcribió ARN in
vitro a partir del plásmido
pSFV-S2-9-LacZ,
pSFV-S2-LacZ o
pSFV-LacZ y se electroporó en células BHK. Las
células se distribuyeron en placas de 35 mm a baja confluencia y se
fijaron y tiñeron con X-gal a los tiempos indicados
(d, día).
Figura 15. Análisis de la expresión de
cardiotrofina 1 de rata (CTr). A) Esquema de los dos vectores de
SFV no citopáticos que portan el gen pac y el gen de la CTr. nsp,
subunidades de la replicasa; SG, promotor subgenómico; 2A,
autoproteasa 2A del virus FMDV. B) Análisis de la expresión de CTr.
Se electroporaron células BHK con ARN de
SFV-S2-9-CTr-pac
(CTr-pac),
SFV-S2-9-pac2A-CTr
(Pac-2A-CTr) o
SFV-S2-9-pac
(S2-9-pac) como control negativo y
se seleccionaron en presencia de puromicina a 5 \mug/ml. Las
células seleccionadas se lisaron y se analizó la expresión de CTr
mediante inmunotransferencia utilizando un anticuerpo específico
para cardiotrofina (gel superior). Como control de cantidad las
mismas muestras se analizaron con un anticuerpo frente a actina
(gel inferior). wtCT, lisado de células BHK transfectadas con
SFV-CTr obtenido a las 24 h postransfección y
utilizado como control positivo. M, marcadores de peso molecular
(kDa).
Figura 16. Análisis de la estabilidad de la
expresión de CTr en células BHK electroporadas con ARN de
SFV-S2-9-pac2A-CTr
(pac2A-CTr) y seleccionadas en presencia de
puromicina a 5 \mug/ml. Las células seleccionadas se pasaron cada
2-3 días hasta 10 pases sucesivos (p1 a p10), y en
cada pase se analizó la expresión de CTr en lisados celulares
mediante inmunotransferencia con un anticuerpo específico para
cardiotrofina. Como control de cantidad se utilizaron varias
cantidades de CTr recombinante purificada (recCT). Se muestra un
experimento representativo de dos realizados que dieron el mismo
resultado de expresión y estabilidad.
S2-9-pac, control negativo de
células electroporadas con el vector
SFV-S2-9-pac. M,
marcadores de peso molecular (kDa).
Los vectores de alfavirus presentan varias
ventajas, como niveles elevados de expresión del transgén, amplio
tropismo y fácil manipulación. La citopatogenicidad que estos
vectores producen en la mayoría de las células de vertebrados puede
ser ventajosa en algunas aplicaciones, como la vacunación o la
terapia génica del cáncer, en la que la apoptosis de las células
transducidas puede conducir a la liberación de antígenos que
podrían ser captados por las células inmunitarias, lo que
favorecería una respuesta inmune contra el antígeno recombinante
expresado o contra los antígenos tumorales, respectivamente (19).
Sin embargo, el uso de estos vectores en aplicaciones en las que se
necesita una expresión duradera del transgén está obstaculizado por
su naturaleza citopática. La posibilidad de adaptar los vectores de
alfavirus para expresión a largo plazo ha sido explorada por
laboratorios diferentes, lo que ha conducido al aislamiento de
variantes no citopáticas de SIN, SFV, VEE y EEE (7,
20-23). En la mayoría de los casos, las mutaciones
no citopáticas se han aislado utilizando vectores que llevan un gen
heterólogo que codifica una proteína que confiere resistencia a un
antibiótico eucariótico, como la puromicina o el G418. Cuando las
células transfectadas con este tipo de vector se incubaron en
presencia del antibiótico, sólo se seleccionaron las que albergaban
replicones no citopáticos mutantes que expresaban el gen de la
resistencia. Aunque la mayoría de los mutantes de alfavirus que se
han descrito llevan mutaciones en nsp2, estas mutaciones alteran
diferentes residuos de la proteína en diferentes virus, a pesar de
existir un elevado grado de homología de secuencia entre los
diferentes alfavirus. Tomando como base esta homología de
secuencia, se investigó el efecto de una mutación no citopática bien
caracterizada de SIN, que afectaba el residuo 726 de nsp2 en este
virus, en el contexto de SFV. Las mutaciones P726L y P726T han sido
descritas como no citopáticas por Frolov y col. (7) y Perri y col.
(22), respectivamente. En el primer estudio, el residuo 726 también
se mutó a todos los otros posibles amino ácidos, lo que generó una
colección de mutantes de SIN con diferentes grados de
citopatogenicidad. Frolov y col. pudieron establecer una
correlación entre el nivel de replicación del ARN y la
citopatogenicidad, llegando a la conclusión de que cambios en el
residuo 726 de nsp2 que reducían los niveles de ARN a menos del 5%
de los niveles observados en el vector silvestre producían un
fenotipo no citopático (7). Se eligieron dos cambios diferentes,
P726T y P726F, que habían sido capaces de reducir los niveles de ARN
en SIN al 5,1% y al 1,6% de los niveles silvestres,
respectivamente, y se introdujeron las correspondientes mutaciones
en la posición 718 de nsp2 de SFV, generándose los mutantes S2 y
S3, respectivamente. Ninguno de estos cambios fue capaz de producir
un fenotipo no citopático en SFV por sí mismo. Los estudios
realizados transfectando células BHK con estos mutantes en los que
se había incorporado el gen indicador LacZ demostraron que sólo un
pequeño porcentaje de las células transfectadas podían mantener la
replicación del vector. El mutante S2 (P718T) parecía ser más
estable que el S3 (P718F), y dio lugar a colonias grandes de
células que expresaban \beta-gal en ausencia de
selección. Por lo tanto se intuyó que estas colonias contenían
replicones con mutaciones adaptativas adicionales. Para seleccionar
estas colonias e identificar las posibles mutaciones secundarias
presentes en los replicones, se clon el gen de la
N-acetil-transferasa (pac) en el
mutante S2 de SFV y se aislaron las colonias de las células
cultivadas en presencia de puromicina. En uno de los clones
analizados, se encontró una segunda mutación en la posición 649 de
nsp2 (R649H) que, en combinación con la mutación P718T, fue capaz
de proporcionar un fenotipo no citopático para el vector SFV. La
mutación R649H afecta la señal de localización nuclear ^{648}RRR
del SFV que se ha descrito que es la responsable del transporte
parcial de nsp2 al núcleo de la célula (27). El cambio de Arg por
Hys en la posición 649 constituye un cambio muy conservador, que
podría explicar el hecho de que no se observara ningún efecto
evidente sobre el transporte al núcleo de nsp2 ni en el doble
mutante S2-9 ni en el mutante sencillo R649H. El
último mutante no mostró ninguna reducción en la citopatogenicidad
al compararse con el vector SFV original, lo que indicó que ambas
mutaciones en las posiciones 649 y 718 eran necesarias para
eliminar el efecto citopático. Fazakerley y col. habían descrito un
cambio más drástico en la posición 649 (R649D), que condujo a la
atenuación de la neurovirulencia de SFV en el contexto de un genoma
vírico completo (6). En ese caso, la mutación R649D interrumpió
completamente el transporte de nsp2 al núcleo, aunque no suprimió
el efecto citopático del virus sobre las células BHK. Todos estos
datos sugieren que la secuencia ^{648}RRR de nsp2 podría estar
implicada en la citopatogenicidad del SFV.
El mutante S2-9 pudo replicarse
a niveles que eran aproximadamente 60 veces más bajos que los
observados para el vector SFV de tipo silvestre, lo que podría
explicar la ausencia de citopatogenicidad de este vector. El nivel
del ARN subgenómico en S2-9 era sólo 30 veces más
bajo que el del vector SFV de tipo silvestre, lo que indicó que la
proporción de los ARN subgenómico/genómico había aumentado
aproximadamente dos veces en el mutante no citopático. Esta
proporción fue incluso mayor al poco tiempo de la transfección, lo
que sugiere que la síntesis del ARN genómico en el vector no
citopático podría estar retrasada en relación con la del ARN
subgenómico. Tanto la disminución de la cantidad de ARN como el
aumento de la proporción de los ARNs subgenómico/genómico
observados para S2-9 fueron muy similares a los
descritos en los vectores de SIN que contienen mutaciones no
citopáticas en la posición 726 de nsp2 (7, 22). Sin embargo, estos
resultados se contradecían con los descritos por Perri y col. para
los mutantes de SFV no citopático, en los que la cantidad de los
ARNs mutantes era mayor que la del virus de tipo silvestre, y en el
que también disminuyeron las proporciones de los ARN
subgenómico/genómico (22), lo que sugiere que en los mutantes de
SFV aislados por este grupo podrían estar implicados mecanismos
diferentes para el establecimiento de la replicación duradera. El
menor nivel de replicación del ARN en S2-9 no se
debía a un efecto en cis de las mutaciones presentes en la
secuencia del ARN, ya que una replicasa de tipo silvestre aportada
en trans por el vector original de SFV permitía recuperar los
niveles de los ARNs genómico y subgenómico de S2-9
hasta valores próximos a los del vector SFV de tipo silvestre.
Varios estudios realizados con los mutantes de alfavirus han
demostrado que las mutaciones no citopáticas en nsp2 pueden alterar
la actividad proteolítica de esta proteína, lo que conduce, bien a
un hiperprocesamiento de la replicasa (7), o bien a un
procesamiento más lento de esta poliproteína (22). En la presente
invención no se detectaron diferencias claras en el procesamiento de
la replicasa entre el mutante S2-9 y el vector de
tipo silvestre, ni mediante traducción in vitro, ni mediante
análisis por inmunotransferencia.
A pesar de los bajos niveles de replicación del
mutante S2-9, la cantidad de
\beta-galactosidasa (\beta-gal)
producida por el vector
SFV-S2-9-LacZ a las
24 horas de la transfección fue muy similar a la obtenida con un
vector de SFV de tipo silvestre que expresa el mismo transgén. El
nivel de expresión de S2-9 aumentó aproximadamente
dos veces a tiempos más tardíos tras la transfección, lo que
correlaciona con el aumento observado en los niveles de ARN. El
nivel de expresión de la proteína recombinante en otros vectores no
citopáticos descritos ha mostrado una gran variabilidad, que oscila
desde sólo el 4% de la expresión de tipo silvestre en el caso del
mutante de SIN P726L (1) al 1000% en el caso del doble mutante
SFV-PD desarrollado por Lundström et al
(21). Sin embargo, el carácter no citopático de este vector quedó
cuestionado cuando los mismos autores mostraron que la expresión de
\beta-gal o GFP en células BHK infectadas con un
vector SFV-PD que porta LacZ o GFP como gen
marcador alcanza un máximo a las 48 horas para después disminuir
drásticamente en los 3-4 días subsiguientes (20). En
este aspecto cabe añadir que el ejemplo 8 de la presente invención
rompe un prejuicio en el estado de la técnica al demostrar que el
vector SFV-PD desarrollado por Lundström et
al (21) es citopático. Algunos mutantes adicionales descritos
por este grupo que contienen mutaciones termosensibles también
fueron capaces de expresar niveles elevados de proteínas
recombinantes, pero solamente a la temperatura permisiva (20, 21).
La razón por la que el mutante S2-9 podía expresar
mayores cantidades de la proteína recombinante que el vector de
tipo silvestre que tiene unos niveles de ARN mucho más bajos podría
estar relacionada con la fuerte inhibición de la síntesis de
proteínas inducida por este último vector. Dos publicaciones
recientes señalan que la fosforilación de eIF2alfa es el mecanismo
mediante el cual los alfavirus inducen una inhibición de la
traducción en la célula hospedadora a tiempos tardíos durante la
infección (15, 31). Al mismo tiempo, estos autores demuestran que
el elemento potenciador de la traducción presente en el extremo 5'
del gen de la cápsida permite una traducción eficaz de la
poliproteína estructural viral en presencia del eIF2alfa
fosforilado. Se ha demostrado que cuando el potenciador de la
traducción de la cápsida se fusiona en fase con el extremo amino de
una proteína recombinante en el vector de SFV o de SIN, aumenta el
nivel de expresión de la proteína recombinante unas 8 veces (10,
28). Este efecto no se observó en el contexto del vector
S2-9, probablemente porque en las células
transfectadas con este vector no se estaba produciendo inhibición de
la traducción por fosforilación de elF2alfa. La ausencia de
inhibición de la síntesis de proteínas en las células transfectadas
con el vector S2-9 podría ser la responsable de que
se generen niveles de expresión elevados con unos niveles de ARN
más bajos que los alcanzados con el vector de SFV silvestre.
La eficacia de empaquetamiento del mutante
S2-9 era aproximadamente 6 logaritmos más baja que
la del vector de SFV silvestre que lleva el mismo transgén. Esto se
podría deber o bien a los bajos niveles de replicación del ARN o a
una deficiencia en el empaquetamiento del doble mutante de SFV. Los
experimentos de empaquetamiento en los que se replicó el ARN de
S2-9 a niveles casi normales mediante la
cotransfección de las células con un vector de SFV de tipo silvestre
fueron sólo capaces de aumentar unas 15 veces el título de las
partículas víricas de S2-9 , lo que indicó que los
bajos niveles de ARN eran responsables sólo parcialmente de la baja
eficacia de empaquetamiento de este vector. El vector del SFV que
contiene sólo la mutación R649H se empaquetó a los niveles del SFV
silvestre, mientras que el vector de SFV que contiene solamente la
mutación P718T (SFV-S2) se empaquetó de forma
deficiente. Aunque el hecho de que el vector SFV-S2
no sea capaz de replicarse en la mayoría de las células
transfectadas podría ser el factor responsable de esta baja
eficacia de empaquetamiento, todo indica que esta mutación sola o en
combinación con la mutación R649H afecta a la encapsidación del ARN
del SFV en partículas víricas. Las señales de empaquetamiento del
SFV se han cartografiado en una región del genoma que comprende los
nucleótidos 2767 a 2824 (32), y que no se superpone con ninguna de
las mutaciones presentes en S2-9, localizadas en las
posiciones 3643 (R649H) y 3849-51 (P718T). Sin
embargo, no se puede descartar que estas mutaciones pudieran
afectar a la estructura secundaria del ARN genómico, alterando la
accesibilidad de las señales de empaquetamiento. Serán necesarios
más estudios de mutagénesis para determinar la función precisa de
estas secuencias en el empaquetamiento del SFV.
Se demostró también que el vector
SFV-S2-9 se podía utilizar
eficazmente para generar líneas celulares estables BHK que expresen
proteínas recombinantes de forma constitutiva. Para ese propósito,
el vector debe contener, además de las mutaciones P718T y R649H, el
transgén deseado y un gen de resistencia a un antibiótico útil para
la selección de las células que han sido eficazmente transducidas.
Utilizando LacZ como el transgén indicador y el gen pac como gen de
selección, generamos una línea celular que mostraba una estabilidad
muy elevada, expresando \beta-gal aproximadamente
el 85% de las células después de 10 pases en el cultivo, y con unos
niveles de expresión que eran similares a los del vector SFV
silvestre. Esto contrasta con lo que se había observado en una
línea celular similar generada con un vector de SIN no citopático
que llevaba la mutación P726L en nsp2 y el gen LacZ como gen
indicador y que expresaba \beta-gal a niveles
aproximadamente 25 veces más bajos que el vector SIN silvestre (1).
En este último caso, la expresión de LacZ se perdió en el 45% de las
células después de 5 pases, aunque se podía alcanzar una mayor
estabilidad con este sistema si la línea celular se derivaba de una
población clonada de células que expresaban la
\beta-gal.
El vector
SFV-S2-9 también fue capaz de
generar líneas celulares estables que expresaban cardiotrofina 1 de
rata (CTr) de forma constitutiva. En particular, el vector
SFV-S2-9-pac2A-CTr,
en el que el gen pac y el gen que codifica la CTr están fusionados
en fase usando la proteasa 2A del virus de la fiebre aftosa (FMDV)
como conector, dio lugar a la generación de líneas estables que
mantuvieron una expresión de cardiotrofina elevada, y similar a la
obtenida con un vector de SFV silvestre, durante al menos 10 pases
en cultivo.
El vector
SFV-S2-9-pac puede
utilizarse para la generación rápida de líneas estables de células
de mamífero capaces de producir proteínas recombinantes en grandes
cantidades.
Por lo tanto, en un primer aspecto la presente
invención se refiere al uso de un vector viral basado en el virus
del Bosque de Semliki (SFV) para la generación in vitro de
líneas celulares estables con capacidad de expresar
constitutivamente proteínas heterólogas. Dicho vector viral
contiene un replicón de SFV cuya replicasa comprende las mutaciones
P718T y R649H en la subunidad nsp2.
Cada una de estas mutaciones afecta a un
triplete de nucleótidos, situados ambos en la secuencia que
codifica para la subunidad o proteína no estructural nsp2 de la
replicasa. La mutación P718T indica que la Prolina (P), situada en
la posición 718 de la secuencia de la proteína nsp2 codificada por
el vector salvaje, es sustituida por una Treonina (T) en la
proteína nsp2 codificada por el vector mutado. Del mismo modo, la
mutación R649H indica que la Arginina (R) situada en la posición 649
es sustituida por una Histidina (H) en la subunidad nsp2 que
codifica el vector mutado. Ambas posiciones 718 y 649 se refieren a
la posición del aminoácido sustituido en la secuencia de la
subunidad nsp2 ya cortada y procesada.
En una realización concreta de la invención, se
utiliza un vector viral que comprende la SEQ ID NO: 1 y la SEQ ID
NO: 2:
- \bullet
- La SEQ ID NO: 1 incluye el extremo 5' necesario para la replicación de SFV, la replicasa de SFV con las mutaciones P718T y R649H en nsp2 y, solapado con la replicasa, un promotor subgenómico viral de SFV;
- \bullet
- La SEQ ID NO: 2 incluye el extremo 3' necesario para la replicación de SFV que contiene una secuencia terminal de poliadeninas (Poli A).
Estas dos secuencias conjuntamente constituyen
el esqueleto del vector y entre ellas se intercalan los genes de
selección y los genes heterólogos que codifican para las proteínas
de interés.
En una realización particular, el vector de SFV
utilizado para la generación in vitro de líneas celulares
estables comprende:
- a)
- el gen de interés (GOI) que codifica para la proteína heteróloga, cuya expresión está controlada por un promotor subgenómico de SFV; y preferentemente también
- b)
- un gen de selección, y cuya expresión está controlada también por un promotor subgenómico de SFV, que puede ser el mismo promotor que controla la expresión del gen de selección u otro distinto.
El gen de selección y el gen de interés GOI
están situados dentro del replicón de SFV, entre el promotor
subgenómico solapado en la replicasa y el extremo 3' necesario para
la replicación de SFV (Figura 8).
En una realización particular el gen de interés
GOI se sitúa corriente abajo del promotor subgenómico (SG1)
solapado en la replicasa y su expresión está controlada por dicho
promotor SG1. A continuación se incorpora otro promotor subgenómico
SG2 que controla la expresión del gen de selección, que se sitúa
corriente abajo de SG2 (Figura 8A).
En otra realización particular, el vector se
construye también con los mismos 2 promotores subgenómicos SG1 y
SG2 pero permutando las posiciones del gen de interés y del gen de
selección, de manera que SG1 controla la expresión del gen de
selección y SG2 la expresión del gen de interés GOI (Figura 8C).
\newpage
En otra realización particular alternativa,
corriente abajo del promotor subgenómico SG1 se introduce una
construcción que comprende: el gen de selección y el gen de interés
GOI, fusionados en fase con un conector interpuesto de DNA que
corresponde a la secuencia que codifica un sitio de corte
autoproteolítico post-traduccional (Figura 8B).
Este conector de DNA con una secuencia codificante del sitio de
corte autoproteolítico puede derivarse de un virus, por ejemplo un
picornavirus. En una realización más particular codifica la región
2A de la poliproteína del virus de la fiebre aftosa (FMDV). De esta
manera se produce la cotraducción de ambos genes (de selección y
GOI) en una única poliproteina, que después de la traducción es
cortada rápidamente mediante rotura en el sitio de corte
autoproteolítico produciendo la proteína de selección y la proteína
heteróloga de interés. La utilización de estos sitios de rotura
autoproteolítica postraduccional ha sido descrita previamente en
EP00736099 y también por Ryan y Drew (35), particularmente la
utilización de la secuencia codificante de la región 2A de FMDV,
cuyo contenido se incluye en su integridad por referencia.
En una realización particular, el vector de la
invención incluye como gen de selección el gen pac, que codifica
para el enzima puromicina
N-acetil-transferasa, cuya
expresión confiere a las células portadoras del vector resistencia
al antibiótico puromicina. De esta manera, añadiendo al medio
puromicina será posible seleccionar las células portadoras del
vector de entre aquellas que no han sido transfectadas o que lo han
perdido.
El gen pac podría ser sustituido por cualquier
otro gen que confiera resistencia a un antibiótico tóxico para
células de mamífero, como por ejemplo el gen que confiere
resistencia a higromicina (hph) o el gen que confiere resistencia a
neomicina (neoR). Podría sustituirse también por otro gen que
permita sintetizar un nutriente esencial que sea omitido en el
medio de cultivo, o por cualquier otro gen que ofrezca una ventaja
selectiva a las células transfectadas.
El gen de interés podría ser cualquier gen o
ácido nucleico que codifica una proteína indicadora
(\beta-gal,...), o una proteína terapéutica, o
cualquier otra proteína o polipéptido recombinante de interés.
En una realización particular, el gen de interés
codifica para una proteína terapéutica seleccionada entre el factor
de crecimiento semejante a la insulina I (IGF-I), la
cardiotrofina 1 (CT1), la oncostatina M (OSM), el interferón alfa
(por ejemplo IFNa5), la anfiregulina (AR), el factor neurotrófico
derivado de la glia (GDNF), el receptor endotelial de la proteína
C/proteína C activada (EPCR) o anticuerpos de interés terapéutico o
diagnóstico.
De esta manera, el conjunto "replicasa mutada
-gen de interés- gen de selección" flanqueado por las secuencias
5' y 3' necesarias para la replicación forma un replicón de ARN que
es capaz de autoamplificarse dentro de la célula.
El vector de la invención puede ser utilizado en
forma de ARN o también en forma de ADN.
Cuando se utiliza en forma de ARN, el vector se
completa con la adición de una estructura de cap en su extremo
5'.
Cuando se utiliza en forma de ADN, el vector
completo incluiría un promotor eucariótico, por ejemplo el promotor
CMV, la secuencia del replicón de SFV en cualquiera de las
realizaciones definidas previamente, y una secuencia señal de la
terminación de la transcripción, por ejemplo una secuencia señal
derivada de SV40. De esta manera, el vector se transcribe a ARN
dentro de las células transfectadas donde se autoamplificará.
Las construcciones de ARN o ADN para la
preparación del vector de la invención pueden obtenerse mediante
métodos convencionales de biología molecular, recogidos en manuales
generales de laboratorio, por ejemplo en "Molecular cloning: a
laboratory manual" (Joseph Sambrook, David W. Russel Eds. 2001,
3ª ed. Cold Spring Harbor, Nueva York) o en "Current protocols in
molecular biology" (F. M. Ausubel, R. Brent, R. E. Kingston, D.
D. Moore, J. A. Smith, J. G. Seidman y K. Struhl Eds, vol. 2.
Greene Publishing Associates y Wiley Interscience, Nueva York, N.
Y.. Actualizado hasta Septiembre 2006.
En un segundo aspecto la invención se refiere a
una línea celular estable con capacidad de expresar
constitutivamente proteínas heterólogas o recombinantes,
caracterizada porque es una línea celular transfectada con un vector
viral de la invención, que contiene un replicón de SFV cuya
replicasa comprende las mutaciones P718T y R649H en la subunidad
nsp2, en cualquiera de las realizaciones descritas anteriormente al
definir el vector de la invención.
En una realización particular es una línea
celular estable que está transfectada con un vector de la invención
cuyo replicón de SFV comprende las secuencias SEQ ID NO: 1 y SEQ ID
NO: 2.
En un aspecto adicional la invención se refiere
a un método para la generación in vitro de líneas celulares
estables con capacidad de sintetizar proteínas heterólogas de forma
constitutiva que comprende:
- I.
- transfectar células con un vector viral que contiene un replicón de SFV cuya replicasa comprende las mutaciones P718T y R649H en la subunidad nsp2, por ejemplo una replicasa que comprende las secuencias SEQ ID NO: 1 y SEQ ID NO: 2;
- II.
- seleccionar las células estables, generadas en el paso I; y
- III.
- crecer y mantener las células estables.
La célula que se transfecta es una línea celular
eucariótica que permite la replicación del vector. Está línea
celular puede ser una línea procedente de mamífero. En una
realización particular, es una línea celular derivada de
fibroblastos de riñón de hámster, por ejemplo la línea
BHK-21.
La transfección de las células se realiza
mediante cualquier procedimiento convencional, físico o químico,
que permita la introducción del vector viral de la invención en las
células, por ejemplo por electroporación o por conjugación del
material genético con lípidos catiónicos. Estos procedimientos
servirían para la transfección del vector como ARN y como ADN.
En una realización particular la transfección se
realiza por electroporación ("Current protocols in molecular
biology"; Ausubel FM et al.; citado supra).
La selección de las células estables se
realizará de manera distinta en función del gen de selección
incorporado en el vector SFV con el que se transfectan las células.
Como ya se ha explicado anteriormente, la expresión del gen de
selección confiere a las células transfectadas una ventaja que
permite su selección. Bastará con someter a las células a las
condiciones selectivas para las células transfectadas. Cuando se
utiliza el gen pac como gen de selección, su expresión en las
células transfectadas las hace resistentes a la puromicina. En este
caso, bastará con añadir puromicina al medio de cultivo para
eliminar las células no transfectadas o que hayan perdido el
vector.
Las células estables se crecen y mantienen en
medios y condiciones convencionales de cultivo, en función del tipo
celular transfectado, y manteniéndolas bajo el estimulo selectivo
para las células transfectadas (por ejemplo en presencia de
puromicina). Cuando las células son BHK-21 se
crecen en las condiciones ya descritas ("Current protocols in
molecular biology"; Ausubel FM et al.; citado
supra).
En otro aspecto la invención se refiere al uso
de esta línea celular estable, transfectada con el vector de la
invención, para la producción in vitro de proteínas.
En otro aspecto adicional la invención se
refiere también a un método para la producción in vitro de
proteínas recombinantes que comprende:
- I.
- transfectar células con un vector viral que contiene un replicón de SFV cuya replicasa comprende las mutaciones P718T y R649H en la subunidad nsp2, por ejemplo una replicasa que comprende las secuencias SEQ ID NO: 1 y SEQ ID NO: 2;
- II.
- seleccionar las células estables, generadas en el paso I;
- III.
- crecer y mantener las células estables; y
- IV.
- extraer la proteína.
Los pasos I, II y III corresponden propiamente a
la generación de la línea celular estable que expresa
constitutivamente la proteína recombinante de interés. En este
caso, la célula se transfectará con un vector viral SFV de la
invención que incluya como gen de interés el gen que codifica la
proteína recombinante que queremos producir. Como ya se ha indicado
anteriormente, este gen está insertado en el vector en una posición
tal que su expresión está controlada por un promotor subgenómico de
SFV.
La proteína recombinante a producir puede ser
una proteína indicadora (\beta-gal,...), o una
proteína terapéutica, o cualquier otra proteína o polipéptido
recombinante de interés.
En una realización particular, es una proteína
terapéutica seleccionada entre el factor de crecimiento semejante a
la insulina I (IGF-I), la cardiotrofina 1 (CT1), la
oncostatina M (OSM), el interferón alfa (por ejemplo, IFNa5), la
anfiregulina (AR), el factor neurotrófico derivado de la glia
(GDNF), el receptor endotelial de la proteína C/proteína C activada
(EPCR) o anticuerpos de interés terapéutico o diagnóstico.
Los pasos para la generación de la línea celular
estable se realizarán como se ha descrito anteriormente en el
método para la generación de líneas celulares estables.
La extracción de la proteína se realiza a partir
de un lisado celular cuando la proteína recombinante sea
intracelular, o a partir del sobrenadante de las células estables
cuando se trate de proteínas recombinantes de secreción.
Para la extracción puede utilizarse cualquier
procedimiento convencional de extracción y purificación de
proteínas adecuado para la extracción de la proteína concreta que
se desea producir, dependiendo de la naturaleza de la proteína.
Entre otros, podrían utilizarse procedimientos de separación por
tamaño y/o carga eléctrica (precipitación en sulfato amónico,
filtración en gel, ultracentrifugación, electroforesis,
electroenfoque,...), por inmunopurificación (columna de afinidad,
inmunoprecipitación,...), separación por unión a un ligando
específico.
Los siguientes ejemplos tienen el objetivo de
ilustrar la invención sin pretender ser limitantes de la misma.
Un posible enfoque para generar nuevos vectores
no citopáticos de alfavirus es introducir las mutaciones
previamente descritas en otros alfavirus, aprovechándose de la
homología de secuencia compartida por los diferentes virus de este
género. Siguiendo este enfoque, se evaluó el efecto de las
mutaciones no citopáticas descritas en el virus SIN en un vector de
expresión derivado de SFV. Previamente, se había demostrado que las
mutaciones que afectaban el residuo 726 de la subunidad nsp2 de la
Rep de SIN reducen considerablemente la citopatogenicidad de este
virus, hecho que correlacionaba con un menor nivel de replicación
del ARN en los mutantes (7, 22). Dos mutaciones que afectaban a
este residuo, P726T y P726F, que se habían descrito como
parcialmente citopáticas y no citopáticas para el SIN,
respectivamente, se introdujeron en el residuo homólogo de nsp2 en
el vector pSFV-1, lo que generó los mutantes
pSFV-S2 y pSFV-S3, que llevaban las
mutaciones P718T o P718F en nsp2, respectivamente. Para evaluar la
citopatogenicidad de estos nuevos vectores, se clonó el gen
indicador LacZ a continuación del promotor subgenómico viral, lo que
generó los vectores pSFV-S2-LacZ y
pSFV-S3-LacZ. Se sintetizó el ARN
in vitro para cada uno de estos plásmidos y se electroporó
en células BHK-21, que se cultivaron y en las que
se analizó la expresión de \beta-gal mediante
tinción con X-gal a diferentes tiempos tras la
transfección (figura 1). A diferencia de las células electroporadas
con el ARN del SFV-LacZ control en las que, a las
24 horas de la transfección, más del 95% de las células expresaron
\beta-gal y mostraron un fenotipo citopático, sólo
un pequeño porcentaje de las células transfectadas con los ARNs de
SFV-S2-LacZ o de
SFV-S3-LacZ expresaron
\beta-gal a las 24 horas tras la transfección, sin
mostrar una morfología citopática. En el caso de
SFV-S2-LacZ, el número de células
positivas aumentó con el tiempo, siendo capaces de formar grandes
colonias de células que expresaban \beta-gal 5
días después de la electroporación. Este efecto fue mucho más
atenuado en SFV-S3-LacZ, con el que
nunca se observaron colonias azules a día 5 después de la tinción
con X-gal. Estos datos sugieren que las mutaciones
P718T y P718F podrían estar bloqueando la replicación vírica o la
expresión del transgén, pero que dan lugar a variantes no
citopáticas con una frecuencia relativamente elevada que podrían ser
el resultado de mutaciones adaptativas secundarias durante la
transcripción in vitro o la replicación del SFV.
Para seleccionar las poblaciones de células que
contienen replicones no citopáticos de SFV, se sustituyó el gen
indicador LacZ en el plásmido
pSFV-S2-LacZ por el gen que
codifica el marcador de selección dominante puromicina
N-acetil-transferasa (pac) que
confiere resistencia a la puromicina, lo que generó el plásmido
pSFV-S2-pac. Utilizando este
plásmido como molde, se sintetizó ARN in vitro y se
electroporó en células BHK-21. A las 24 horas de la
electroporación, se añadió puromicina a 5 \mug/ml, lo que condujo
a la selección de colonias resistentes al fármaco que,
posteriormente, se expandieron. Para identificar las posibles
mutaciones adaptativas en los replicones presentes en las células
seleccionadas, se extrajo el ARN total de clones individuales, y se
amplificó por RT-PCR con cebadores específicos un
fragmento de 3,9 kb de la replicasa de SFV que comprende la
secuencia completa de nsp2. Se eligió amplificar la región nsp2 de
la replicasa porque en esta región se habían cartografiado la
mayoría de las mutaciones no citopáticas descritas en los
alfavirus. El fragmento de ADNc rescatado de cada clon se subclonó
en el plásmido pSFV-pac original sustituyendo la
secuencia de la nsp2 de tipo silvestre. Para comprobar si se habían
rescatado mutaciones no citopáticas, se sintetizó ARN in
vitro de cada uno de los nuevos plásmidos y se utilizó para
electroporar células BHK-21. A las 24 horas de la
transfección, se añadió la puromicina a 5 \mug/ml y se tiñeron las
células con violeta de metilo a diferentes tiempos para comparar su
crecimiento con el observado en las células transfectadas con el
mutante SFV-S2-pac inicial o con el
SFV-pac original. Uno de los clones, el
SFV-S2-9-pac, mostró
un claro fenotipo no citopático, ya que confirió resistencia a la
puromicina a la mayoría de las células transfectadas (figura 2).
Otros clones probados mostraron un patrón similar al del
SFV-S2 y no se analizaron más en este estudio. Las
células transfectadas con el SFV-pac original
mostraron un claro efecto citopático y la mayoría de ellas murieron
antes del día 4. La secuenciación del fragmento de nsp2 de
pSFV-S2-9-pac mostró
que, además de la mutación original P718T, había una segunda
mutación adaptativa en la posición 649 de nsp2 en la que se había
sustituido Arg por Hys. Esta nueva mutación afecta la señal de
localización nuclear ^{648}RRR (27) de la nsp2 de SFV que, en
SFV-S2-9, cambia a ^{648}RHR.
Para comprobar el efecto de la mutación R649H
por sí misma sobre la citopatogenicidad de SFV, se introdujo esta
mutación en el plásmido pSFV-pac, generándose de
esta forma el plásmido pSFV-RHR-pac.
Se transcribió el ARN de este plásmido y se electroporó en células
BHK-21, que se dejaron recuperar durante 24 horas.
Entonces se añadió la puromicina a 5 \mug/ml y se analizó el
crecimiento de las células a diferentes tiempos tiñendo las células
con violeta de metilo tal y como se describió anteriormente (figura
2, columna derecha). El SFV-RHR-pac
mostró un patrón muy similar al observado para el vector original
SFV-pac, induciendo un fuerte efecto citopático
temprano que condujo a la muerte de la mayoría de las células antes
del día 4. Estos resultados sugieren que la ausencia de
citopatogenicidad del vector
SFV-S2-9 se debía a la combinación
de las mutaciones P718T y R649H. Para comprobar el efecto de la
mutación R649H sobre la localización nuclear de la nsp2, se
transfectaron células BHK-21 con el ARN de los
vectores que contenían esta mutación
(SFV-S2-9-pac y
SFV-RHR-pac) o con vectores que no
la contenían (SFV-pac y
SFV-S2-pac) y se analizaron mediante
inmunofluorescencia con anticuerpos monoclonales específicos de la
forma nuclear o de la forma citoplásmica de nsp2 de SFV,
respectivamente (figura 3), En todos los casos, se detectó nsp2
tanto en el núcleo como en el citoplasma de las células
transfectadas, lo que sugiere que la mutación RHR no afectaba el
transporte al núcleo de esta proteína.
Para determinar el nivel de replicación del ARN
del doble mutante no citopático de SFV, se electroporaron células
BHK-21 con ARN de
SFV-S2-9-pac, se
extrajo el ARN total a las 24, 48 y 72 horas de la electroporación
y se analizó mediante transferencia "Northern" con un
oligonucleótido marcado con ^{32}P específico de la secuencia del
promotor subgenómico de SFV, que está presente tanto en el ARN
genómico como en el ARN subgenómico (figura 4, calles 2 a 4). La
cantidad de los ARNs genómico y subgenómico de
SFV-S2-9-pac, así
como la proporción entre ellos, se comparó con la obtenida en
células transfectadas con ARN de SFV-pac a las 24
horas de la electroporación (figura 4, calle 5). Los ARNs genómicos
y subgenómicos de
SFV-S2-9-pac
aumentaron con el tiempo y parecieron alcanzar un pico a las 48
horas de la electroporación. Se observaron unos niveles de ARN
similares en una línea celular de BHK resistente a la puromicina
obtenida con el vector
SFV-S2-9-pac
(figura 4, calle 1). En todos los casos, los ARNs de
SFV-S2-9 se produjeron en mucha
menor cantidad que la obtenida en células transfectadas con ARN del
SFV-pac original (obsérvese que la calle 5 estuvo
expuesta 72 veces más que las calles 1 a 4). La proporción de los
ARNs subgenómico/genómico observada en las células transfectadas
con SFV-S2-9-pac y
seleccionadas con puromicina fue aproximadamente 1,5 veces mayor
que la observada en células transfectadas con
SFV-pac (figura 4, números de la parte inferior).
Sin embargo, en las células transfectadas con
SFV-S2-9-pac no
seleccionadas esta proporción fue considerablemente mayor,
especialmente a las 24 horas después de la transfección, pero
disminuyó con el tiempo, lo que indicó que la síntesis del ARN
genómico en el doble mutante podría estar retrasada en relación con
la del ARN subgenómico. También se detectaron dos bandas
adicionales de ARN con un tamaño intermedio entre los ARNs genómicos
y subgenómicos en las células transfectadas con
SFV-S2-9-pac (figura
4, calles 1 a 4). Estas bandas no se caracterizaron pero podrían
corresponder a ARNs defectivos interferentes que pueden aparecer
durante la replicación del doble mutante de SFV. Finalmente, para
determinar si se podían recuperar los bajos niveles de replicación
del ARN de
SFV-S2-9-pac con una
replicasa de tipo silvestre suministrada en trans, se
electroporaron las células BHK-21 simultáneamente
con los ARNs de
SFV-S2-9-pac y de
SFV-LacZ (vector silvestre). Después de 24 horas, se
extrajo el ARN total de las células coelectroporadas y se analizó
mediante transferencia "Northern" (figura 4, calle 7). Los ARNs
de las células electroporadas con el SFV-pac
original (figura 4, calle 5) y SFV-LacZ (figura 4,
calle 6) se analizaron en el mismo gel y se utilizaron como
marcadores de tamaño molecular para cada uno de los ARNs genómicos y
subgenómicos. Los ARNs genómicos y subgenómicos de
SFV-LacZ y
SFV-S2-9-pac se
detectaron fácilmente en las células coelectroporadas después de
exponer el gel durante 1 hora, lo que indicó que la replicasa de
tipo silvestre era capaz de, al menos parcialmente, recuperar la
replicación del doble mutante. Sin embargo, aunque la cantidad de
ambos ARNs subgenómicos era muy similar, el ARN genómico de
SFV-LacZ se produjo a unos niveles aproximadamente
2-3 veces mayores que los del mutante
SFV-S2-9-pac.
La menor cantidad de ARN detectada en las
células transfectadas con el replicón de
SFV-S2-9-pac se
podría deber a una alteración en el procesamiento de la replicasa.
La replicasa de SFV se sintetiza como la poliproteína nsp1234 que,
con posterioridad, se escinde en sus componentes monoméricos
maduros mediante la actividad proteasa presente en el dominio del
extremo carboxilo de nsp2 (30), en el que se han cartografiado las
mutaciones P718T y R649H. Para examinar el efecto de estas
mutaciones sobre el procesamiento de la replicasa, los ARNs de
SFV-S2-9-pac,
SFV-RHR-pac y
SFV-S2-pac sintetizados in
vitro se tradujeron mediante incubación con lisados de
reticulocitos de conejo en presencia de
[^{35}S]-metionina y
[^{35}S]-cisteína. Se comparó el patrón de
procesamiento de la replicasa en estos mutantes con el obtenido
para el ARN SFV-pac original mediante
SDS-PAGE seguida de autorradiografia (figura 5A).
No se observó ninguna diferencia en el procesamiento de la replicasa
entre los tres mutantes analizados y la replicasa de tipo
silvestre, lo que dio lugar a una acumulación similar de los
monómeros nsp en todos los casos. Para determinar si el
procesamiento de la replicasa resultaba afectado in vivo, los
lisados de una línea celular BHK-21 resistente a la
puromicina portadora del vector
SFV-S2-9-pac o de
células BHK-21 transfectadas con ARN de
SFV-pac original o con ARN de
SFV-RHR-pac obtenidos a las 24
horas de la electroporación se analizaron mediante
inmunotransferencia con un antisuero de conejo específico contra
nsp2 (figura 5B, panel superior) o contra nsp3 (figura 5B, panel
central) como anticuerpos primarios, respectivamente. En ambos
casos, las muestras derivadas de SFV-pac y de
SFV-RHR-pac mostraron un patrón muy
similar, pues expresaban cantidades comparables de los monómeros
nsp2 y nsp3. La cantidad de nsp2 y nsp3 en la línea celular
resistente a puromicina
BHK-SFV-S2-9-pac
fue aproximadamente 1,5 veces más baja, lo que se podía deber a la
menor replicación de este vector. Aunque sólo se detectaron
cantidades insignificantes de productos de alto peso molecular en
las muestras analizadas, se podían observar algunas bandas
diferenciales entre SFV-S2-9 y los
otros dos vectores con el antisuero contra nsp2, lo que podría
indicar una pequeña alteración del procesamiento de la replicasa de
S2-9 in vivo.
Para determinar el nivel de expresión del gen
heterólogo en el mutante SFV-S2-9,
se clon el gen indicador Lac-Z a continuación del
promotor subgenómico de SFV en este vector, lo que generó el
plásmido
pSFV-S2-9-Lac-Z.
Se sintetizó in vitro ARN a partir de este plásmido y se
utilizó para electroporar células BHK-21, en las que
se analizó la expresión de \beta-gal a diferentes
tiempos después de la electroporación. Se transfectaron células
también con ARN del vector SFV-LacZ original, pero
sólo se analizaron a las 24 horas tras la electroporación, debido
al efecto citopático inducido por este vector. Se observó un nivel
similar de expresión de \beta-gal en las células
transfectadas con
SFV-S2-9-LacZ y
SFV-LacZ a las 24 horas de la transfección, siendo
éste de aproximadamente 15 pg/célula (figura 6). Este nivel de
expresión aumentó con el tiempo en las células transfectadas con
SFV-S2-9-LacZ,
alcanzando una estabilización a aproximadamente 30 pg de
\beta-gal/célula a las 48 horas de la
transfección. Para determinar la eficacia de empaquetamiento del
doble mutante SFV-S2-9, se
coelectroporaron células BHK-21 con ARN de
SFV-S2-9-LacZ y los
ARNs auxiliares SFV-helper-S2 y SFV
helper-C-S219A tal y como está
descrito (29). Se recogieron los sobrenadantes de las células a las
24 horas de la electroporación y se titularon sobre monocapas de
células BHK-21 mediante tinción con
X-gal. El ARN de
SFV-S2-9-LacZ se
empaquetó con poca eficacia, lo que proporcionó unos títulos de 7 x
10^{3} pv/ml, que eran mucho más bajos que los obtenidos con el
SFV-LacZ original (5 x 10^{9} pv/ml). Para
comprobar si la presencia de la replicasa de tipo silvestre podría
aumentar la eficacia de empaquetamiento del doble mutante
S2-9, se coelectroporaron las células
BHK-21 con los ARNs de
SFV-S2-9-LacZ,
SFV-pac y ambos ARNs SFV auxiliares. En este caso,
se observó que el vector SFV original era capaz de aumentar con
moderación la producción de partículas de
SFV-S2-9-LacZ, que
alcanzaron un título de 1 x 10^{5} pv/ml a las 24 horas de la
electroporación, que se determinó mediante la tinción con
X-gal de las células BHK infectadas. El
empaquetamiento del ARN SFV-pac original disminuyó
aproximadamente 5 veces en las células en las que este vector se
coelectroporó con
SFV-S2-9-LacZ (2,6 x
10^{8} pv/ml), en comparación con los títulos obtenidos cuando el
SFV-pac se empaquetó solo (1,2 x 10^{9} pv/ml), lo
que se determinó mediante inmunofluorescencia indirecta de las
células infectadas utilizando un antisuero policlonal de conejo
específico contra la nsp2 del SFV como anticuerpo primario. Para
determinar el efecto que cada una de las dos mutaciones
individuales presentes en SFV-S2-9
tienen sobre el empaquetamiento, se coelectroporaron las células
BHK-21 con ambos ARNs auxiliares de SFV y con los
ARNs de SFV-RHR-pac o
SFV-S2-pac, y se titularon las
partículas víricas tal y como se describió anteriormente para
SFV-pac. SFV-RHR-pac
se empaquetó con títulos elevados (6,5 x 10^{8} pv/ml) mientras
que SFV-S2-pac mostró una eficacia
muy baja de empaquetamiento (2 x 10^{4} pv/ml).
Tal y como se ha demostrado en este estudio, se
puede utilizar el vector
SFV-S2-9-pac para
seleccionar las células que son capaces de mantener el replicón en
presencia de puromicina. Para estudiar si era posible utilizar este
tipo de vector para generar líneas celulares estables que expresen
otros transgenes, se introdujo el gen indicador LacZ en
pSFV-S2-9-pac, lo
que generó el plásmido
pSFV-S2-9-LacZ-pac,
en el que los genes pac y LacZ están colocados cadena abajo de
promotores subgenómicos independientes. Se sintetizó in
vitro el ARN de este plásmido y se electroporó en las células
BHK-21. A las 24 horas de la electroporación, se
añadió puromicina a 5 \mug/ml y, cuando las células seleccionadas
alcanzaron la confluencia, se realizaron diez pases en presencia del
antibiótico durante un periodo de 30 días. El porcentaje de células
que expresaban \beta-gal, determinado en cada pase
mediante tinción con X-gal, varió entre el 70% y el
90% según el pase, pero estaba por encima del 85% en el pase 10, lo
que indicó una gran estabilidad de la expresión del transgén en
presencia de selección (figura 7). Cuando las células seleccionadas
se pasaron sin puromicina, el porcentaje de las células que
expresaban \beta-gal disminuyó muy rápidamente,
estando por debajo del 5% después de 3 pases. El nivel de la
expresión de \beta-gal en las células
seleccionadas con puromicina se determinó después de 6 y 8 pases,
alcanzando 13 y 18 pg/célula, respectivamente. Estos valores son
muy similares a los obtenidos en las células transfectadas con el
vector SFV-LacZ original a las 24 horas de la
transfección, lo que indica que las líneas celulares generadas con
el vector SFV-S2-9 se podían
utilizar para expresar proteínas recombinantes en grandes
cantidades.
Las mutaciones que habían sido descrito
previamente como no citopáticas para SFV se introdujeron en el gen
de la subunidad nsp2 de la replicasa de SFV, en el plásmido
pSFV-1, que contiene la secuencia del vector. Estas
mutaciones incluyeron:
- -
- L1 OT (cambio de TTG por ACC): mutante SF2A (22).
- -
- L713P (cambio de CTA por CCT): mutante SF2C (22).
Además, el plásmido pSFV-PD que
contiene la secuencia del vector de SFV con las mutaciones S259P y
R650D en nsp2 fue cedido amablemente por el Dr. K. Lundström
(21).
\newpage
De esta forma se generaron (u obtuvieron) los
plásmidos pSFV-SF2A, pSFV-SF2C y
pSFV-PD, en los que se clonó el gen LacZ bajo el
control del promotor subgenómico viral, obteniéndose los plásmidos:
pSFV-SF2A-LacZ,
pSFV-SF2C-LacZ y
pSFV-PD-LacZ, respectivamente.
Estos plásmidos se utilizaron para sintetizar
ARN in vitro, que fue electroporado en células
BHK-21. Tras la electroporación las células fueron
distribuidas en diferentes placas que se fijaron y tiñeron con
X-gal a diferentes tiempos posttransfección. La
tinción con X-gal produce una coloración azul en las
células que están expresando \beta-gal a partir
del gen LacZ, lo cual nos permite determinar el número de células
que portan el vector y que han sobrevivido a diferentes tiempos así
como analizar la morfología de las mismas, que es un indicador de
citopatogenicidad. En este experimento se utilizó como control
negativo células electroporadas con ARN de
SFV-LacZ, que es citopático para las células BHK.
Asimismo se utilizó como control positivo ARN de
SFV-S2-LacZ, que lleva la mutación
P718T en nsp2 y da lugar a un fenotipo no citopático en un cierto
porcentaje de las células.
Como puede observarse en las figuras 10 y 12 los
mutantes SFV-SF2A y SFV-PD
mostraron un fenotipo muy similar al del vector silvestre de SFV,
induciendo un fuerte efecto citopático en las células
transfectadas, que se tradujo en la aparición de numerosos cuerpos
apoptóticos a partir del día 3 y en una casi total ausencia de
expresión a tiempos largos (7 días). Los datos referentes al
carácter citopático del vector SFV-PD están además
apoyados por resultados publicados posteriormente por el propio K.
Lundström en los que se muestra como la expresión de
\beta-gal o GFP en células BHK infectadas con un
vector SFV-PD que porta LacZ o GFP como gen
marcador alcanza un máximo a las 48 horas para después disminuir
drásticamente en los 3-4 días subsiguientes (20,
ver figura 2 de esta referencia). El mutante
SFV-SF2C mostró un fenotipo algo menos citopático,
pero a día 3 aparecen muchos cuerpos apoptóticos y aunque
aparentemente a día 4 hay niveles altos de expresión, esta
desaparece casi completamente a día 7, indicando que probablemente
este mutante permita expresiones algo más prolongadas que el vector
silvestre, pero sin dejar de ser citopático. El vector
SFV-S2 es el único que no da lugar a la aparición de
cuerpos apoptóticos y que permite mantener la expresión durante al
menos 7 días dando lugar a la aparición de colonias. El vector
SFV-S2-9 que porta las mutaciones
P718T y R649H se seleccionó a partir de una de las colonias
obtenidas con SFV-S2 cuando el gen LacZ se
sustituyó por el gen pac en dicho vector. En la figura 14 se
incluyen fotos de células transfectadas con ARN del vector
SFV-S2-9-LacZ y
teñidas a diferentes tiempos con X-gal. El vector
S2-9 no produjo efecto citopático en las células
transfectadas, que fueron capaces dividirse.
Previamente se han descrito los plásmidos
pSFV-1 y pSFV3-LacZ, que fueron
proporcionados amablemente por el Dr. P. Liljeström (Instituto
Karolinska, Estocolmo) (18). Para construir los plásmidos
pSFV-S2 y pSFV-S3, un fragmento de
3,5 kb que contenía el área de la nsp2 a mutagenizar se extrajo de
pSFV-1 con SacI/XhoI y se subclonó en el plásmido
pBluescript SK (Stratagene, La Jolla, EE. UU.) digerido con las
misma enzimas, lo que generó el plásmido Blu-nsp2.
Se introdujeron las mutaciones P718T y P718F en la nsp2 en este
plásmido mediante PCR de entrecruzamiento. Se combinaron en
secuencia los cebadores externos SF3669-VS (SEQ ID
NO: 3) y SF4096-RS (SEQ ID NO: 4) con los pares de
oligonucleótidos diseñados para introducir las respectivas
mutaciones. Para S2, el par de oligonucleótidos internos utilizados
fue mutS2-VS (SEQ ID NO: 5) y
mutS2-RS (SEQ ID NO: 6) que se solapan en 25
nucleótidos y en los que el codón CCC que codifica la Pro 718 en
nsp2 se ha mutado a ACG que codifica Thr (subrayada). Para S3, los
oligonucleótidos internos utilizados fueron mutS3-RS
(SEQ ID NO: 7) y mutS3-RS (SEQ ID NO: 8) que se
solapan en 25 nucleótidos y en los que el codón CCC que codifica la
Pro 718 de la nsp2 se ha mutado a TTT que codifica Phe (subrayada).
La PCR de entrecruzamiento se realizó con la Pfu y produjo
fragmentos de ADN de 430 pb que se digirieron con EagI/NarI y se
clonaron en Blu-nsp2 después de digestión parcial
con EagI y digestión total con NauI, lo que generó los plásmidos
Blu-nsp2-S2 o
Blu-nsp2-S3, respectivamente. Se
confirmó la presencia de las mutaciones S2 o S3 en estos plásmidos
por secuenciación. Finalmente, un fragmento SacI/XhoI de 3,5 kb que
contenía la nsp2 mutada se extrajo de
Blu-nsp2-S2 o de
Blu-nsp2-S3 y se subclonó en
pSFV-1 digerido con las mismas enzimas, lo que
generó los plásmidos pSFV-S2 y
pSFV-S3, respectivamente. Para clonar LacZ en estos
plásmidos, un fragmento de ADN de 3,86 kb que contenía este gen se
extrajo con XbaI/XmaI de pSFV3-LacZ y se clonó en
pSFV-S2 o pSFV-S3 digeridos con las
mismas enzimas, lo que generó los plásmidos
pSFV-S2-LacZ y
pSFV-S3-LacZ, respectivamente.
Para generar el plásmido
p.SFV-pac, un fragmento de ADN de 0,95 kb que
contenía el gen de la puromicina
N-acetil-transferasa (pac) se
extrajo del plásmido pBSpac (5) (amablemente proporcionado por el
Dr. J. Ortin, CNB, Madrid, España) mediante digestión con NotI y
HpaI. Después de hacer romo el extremo NotI con Klenow, se clonó
este fragmento en pSFV-1 digerido con SmaI, lo que
generó pSFV-pac. El plásmido
pSFV-S2-pac se generó al sustituir
el fragmento SacI/XhoI de 3,5 kb que contenía la mayor parte de la
nsp2 en pSFV-pac por el mismo fragmento obtenido de
Blu-nsp2-S2, que contiene la
mutación S2.
El plásmido
pSFV-S2-9-LacZ se
generó al sustituir el fragmento RsrII/XhoI de 3,2 kb en
pSFV3-LacZ por el mismo fragmento obtenido de
pSFV-S2-9-pac que
cubre el área de la replicasa que contiene las mutaciones P718T y
R649H de nsp2. Para generar el doble vector
pSFV-S2-9-LacZ-pac,
un casete de 1,9 kb que contenía el promotor subgenómico de SFV
seguido del gen pac se extrajo de pSFV-pac con
MscI/SpeI, y se clonó en
pSFV-S2-9-LacZ
digerido con SmaI/SpeI.
Para generar
pSFV-RHR-pac, primero se introdujo
la mutación R649H de nsp2 en Blu-nsp2 por PCR.
Brevemente, se obtuvo un fragmento de PCR de 1,67 kb con los
oligonucleótidos SF1947-VS (SEQ ID NO: 9) y
SF3623-S29-RS (SEQ ID NO: 10) con
la Pfu utilizando el pSFV-1 como molde. En el último
oligonucleótido se ha sustituido el codón CGC por CAC, lo que
conduce a la mutación R649H en nsp2 (subrayada; adviértase que el
cebador contiene la secuencia reversa). La secuencia de este
oligonucleótido abarca el sitio NarI de nsp2 próximo a la mutación
R649H (señalado en cursiva). El fragmento de PCR se digirió con
BstEII/NarI, lo que dio lugar a un fragmento de ADN de 1,36 kb que
se clonó en Blu-nsp2 digerido con las mismas
enzimas, lo que generó, de este modo,
Blu-nsp2-RHR. Finalmente, un
fragmento SacI/XhoI de 3,5 kb que contenía la nsp2 mutada se extrajo
del Blu-nsp2-RHR y se subclonó en
pSFV-pac digerido con las mismas enzimas, lo que
generó el plásmido
pSFV-RHR-pac.
Los ADN plasmídicos purificados se hicieron
lineales mediante digestión con SpeI y se transcribieron en
presencia de un análogo de cap (New England Biolabs, EE. UU.)
utilizando la polimerasa SP6 (Amersham-Pharmacia).
Los ARNs sintetizados in vitro se transfectaron en células
BHK-21 mediante electroporación tal y como se
describió previamente (17).
El empaquetamiento del ARN recombinante de SFV
en partículas víricas (pv) se realizó mediante la coelectroporación
de las células BHK-21 con el ARN recombinante y con
ambos ARNs auxiliares SFV helper-S2 y
helper-C-S219A tal y como está
descrito (29). Las partículas de SFV que llevaban LacZ como gen
indicador se titularon por tinción con X-gal de las
células BHK-21 infectadas con diluciones seriadas
del virus. Para las partículas de SFV que llevaban el gen pac, la
titulación se realizó mediante inmunofluorescencia indirecta de las
células BHK-21 infectadas con un antisuero
policlonal de conejo específico contra la nsp2 de SFV como
anticuerpo primario (E. Casales, resultados sin publicar).
Se prepararón una solución de puromicina (Sigma,
St. Louis, EE. UU.) 1 mg/ml en MEM, se filtró, alicuoteó y se
guardó a -20°C. Después de la transfección de las células BHK con
los ARNs recombinantes de SFV que llevaban el gen pac, se permitió
que las células se recuperaran durante 24 horas antes de añadir la
puromicina a 5 \mug/ml. Para seleccionar las células resistentes
a la puromicina, se reemplazó el medio cada 2 a 3 días por un medio
nuevo que contenía puromicina. Tras la selección, siempre se hacían
los pases de las células en presencia de puromicina a la
concentración indicada. En el caso de las células transfectadas con
SFV-S2-pac, se clonaron focos
individuales, se expandieron y se guardaron congelados en nitrógeno
líquido. El medio utilizado para crecer las células fue
BHK-21 Glasgow MEM (Invitrogene, EE.UU.)
suplementado con de suero fetal bovino al 5%, medio triptosa
fosfato (Invitrogene, EE.UU.) al 10%, glutamina 2 mM, HEPES 20 mM,
estreptomicina a 100 \mug/ml y penicilina a 100 IU/ml (medio BHK
completo).
El ARN celular total de las células resistentes
a la puromicina obtenidas después de la transfección con el ARN del
SFV-S2-pac se aisló con el kit
RNeasy (Qiagen, Alemania). Se utilizaron 5 \mug de ARN de cada
clon para sintetizar un ADNc con la transcriptasa inversa de
M-MLV (Promega, Madison, EE. UU.) utilizando un
oligonucleótido de sentido negativo complementario a los nucleótidos
4977 a 5010 del SFV (SEQ ID NO: 11) como cebador. Después de la
transcripción inversa, se amplificaron los ADNc mediante 30 ciclos
de PCR con Taq Plus Long (Stratagene, La Jolla, EE. UU.), con el
mismo cebador de sentido negativo y un oligonucleótido de sentido
positivo complementario a los nucleótidos 1040 a 1074 de SFV (SEQ ID
NO: 12). El fragmento resultante de 3971 pb se digirió con BcII
(1106) y Bsu36I (4916) y se clonó en los correspondientes sitios de
pSFV-pac. El ADN plasmídico derivado de cada clon
individual se hizo lineal y se utilizó como molde para sintetizar el
ARN in vitro, que se transfectó posteriormente en las
células BHK-21 para determinar su capacidad para
conferir resistencia a la puromicina. Cuando la subregión
comprendida entre las posiciones 1106 a 4916 fue capaz de permitir
la supervivencia y la división de las células en presencia de
puromicina, como fue el caso del clon S2-9, se
secuenció completamente a partir de dos clones plasmídicos
independientes.
Se extrajo el ARN total de las células
transfectadas o de determinadas líneas celulares utilizando un
minikit de RNeasy (Qiagen, Alemania) y se analizó mediante
transferencia Northern. Se fraccionaron por tamaño 3 \mug de ARN
total en un gel de agarosa al 1,2% con formaldehído, se transfirió
a una membrana de nitrocelulosa (Hybond-N+,
Amersham) y se hibridó con un oligonucleótido marcado con ^{32}P
específico del promotor subgenómico de SFV (SEQ ID NO: 13). Se
determinaron las cantidades relativas de los ARNs genómicos y
subgenómicos de SFV utilizando un Phosphorlmager (Cyclone, Packard,
EE. UU.) y el software Optiquant (versión 4.0, Packard).
Para los experimentos de la traducción in
vitro, los ARNs de SFV primero se transcribieron in
vitro tal y como se describió previamente, se purificaron con el
kit RNeasy (Qiagen, Alemania), se mezclaron con lisados de
reticulocitos de conejo tratados con nucleasa (Promega) en
presencia de una mezcla de [^{35}S]-metionina y
[^{35}S]-cisteína (Amersham, EE. UU.) y se
incubaron durante 90 minutos a 30°C según las instrucciones del
fabricante. Cada reacción de traducción contenía 2,3 \mug de ARN
transcrito purificado. Las reacciones de traducción se finalizaron
al añadir el tampón de carga de Laemmli y se analizaron por
SDS-PAGE en geles de poliacrilamida al 8% seguido
de una autorradiografla. Para los experimentos de análisis por
inmunotransferencia, se obtuvieron lisados de las células
BHK-21 transfectadas con los vectores de SFV
mediante incubación en un tampón que contenía Igepal al 1% (Sigma,
EE. UU.), Tris HC1 a 50 mM, pH 7,6, NaCl a 150 mM, EDTA a 2 mM y
PMSF a 1 \mug/ml (Sigma, St. Louis, EE. UU), se clarificaron por
centrifugación durante 6 minutos a 6000 rpm en una microcentrífuga
refrigerada y se cuantificaron mediante un análisis de Bradford.
Los lisados se analizaron mediante SDS-PAGE en
geles de poliacrilamida al 8%, se transfirieron a una membrana de
nitrocelulosa y se incubaron con antisueros policlonales de conejo
específicos contra la nsp2, la nsp3 de SFV (E. Casales, resultados
sin publicar) o actina (Sigma, St. Louis, EE. UU.) como anticuerpos
primarios, respectivamente. Se utilizó un antisuero de oveja
especifico para inmunoglobulinas de conejo conjugado con HRP como
anticuerpo secundario. Se visualizaron las proteínas utilizando
Western Lightning Chemiluminiscence Reagent Plus (Perkin Elmer Life
Sciences, EE. UU.), de acuerdo con las instrucciones del
fabricante. Para los estudios de localización nuclear, se realizó la
inmunofluorescencia indirecta de las células transfectadas
utilizando como anticuerpo primario un Acm específico contra la
nsp2 citoplásmica de SFV (amablemente proporcionado por W. Bodemer)
o un Acm específico contra la nsp2 nuclear de SFV (amablemente
proporcionado por el Dr. L. Kaariainen) (16).
Se lisaron las células transfectadas tal y como
se describió anteriormente y se midió la actividad total de la
\beta-gal presente en el lisado tal y como está
descrito (17), o se tiñeron a los tiempos indicados con
X-gal. La cantidad de la proteína producida por
cada célula se obtuvo al dividir la cantidad media de
\beta-gal detectada por placa entre la cantidad
media de las células transfectadas en cada placa.
Con objeto de generar líneas celulares estables
que expresen constitutivamente cardiotrofina, proteína de interés
terapéutico, se generaron plásmidos basados en
SFV-S2-9-pac
incorporando el gen de la cardiotrofina de rata (CTr) según 2
realizaciones distintas:
- -
- el plásmido pSFV-S2-9-CTr-pac, en el que los genes pac y CTr están colocados cadena abajo de promotores subgenómicos independientes (Figura 15A); y
- -
- el plásmido pSFV-S2-9-pac2A-CTr, construido siguiendo la estructura general descrita en la Figura 8B, que contenía el gen pac y el gen CTr fusionados cadena abajo de un único promotor subgenómico (figura 15A).
En este segundo plásmido se introdujo entre los
dos genes la secuencia de la autoproteasa 2A de FMDV (SEQ ID NO:14)
(35) para permitir la liberación de la cardiotrofina de la proteína
de fusión (Figura 15-A).
Para construir el plásmido
pSFV-S2-9-CTr-pac
previamente se generó el vector de clonaje
pSFV-S2-9-mcs-pac,
que contiene la replicasa de
SFV-S2-9, un primer promotor
subgenómico seguido de un sitio múltiple de clonaje y un segundo
promotor subgenómico seguido del gen pac.
\newpage
Brevemente se hibridaron los oligonucleótidos
SEQ ID NO: 15 y SEQ ID NO: 16, generándose un fragmento de DNA
sintético con extremos 5' protuberantes compatibles con BamHI, y
cuya secuencia contiene un sitio multiple de clonaje con dianas
para los enzimas AvrII, ApaI, NruI y BstBI, tres codones de
terminación de la traducción en las tres posibles fases de lectura
y la secuencia del promotor subgenómico de SFV. Este fragmento se
clonó en el sitio BamHI de
pSFV-S2-9-pac
generándose el plásmido
pSFV-S2-9-mcs-pac.
En una segunda etapa se sintetizó un fragmento
de PCR de 645 pb que contenía el gen de la cardiotrofina de rata a
partir del plásmido pRSET-CTr (36) utilizando los
oligonucleótidos SEQ ID NO: 17 y SEQ ID NO: 18, que hibridan con el
comienzo y el final del gen CTr respectivamente y contienen sitios
BamHI en los extremos para facilitar el clonaje. El fragmento de
PCR se digirió con BamHI y se clonó en el sitio BamHI de
pSFV-S2-9-mcs-pac,
obteniéndose el plásmido
pSFV-S2-9-CTr-pac.
De una manera similar el mismo fragmento de PCR fue clonado en
pSFV-1 digerido con BamHI, generándose el plásmido
pSFV-CTr.
Para construir el plásmido
pSFV-S2-9-pac2A-CTr
se generó previamente el vector de clonaje
pSFV-S2-9-pac2A, que
contiene la secuencia del vector
SFV-S2-9-pac en la
que el gen pac está fusionado en fase en su extremo 3' con la
secuencia de la proteasa 2A del virus de la fiebre aftosa (FMDV)
(35), conteniendo al final de esta secuencia el sitio de clonaje
SmaI/XmaI. Brevemente, utilizando el plásmido
pSFV-S2-9-pac como
molde se hizo una PCR cruzada con los oligonucleótidos externos: SEQ
ID NO: 19 y SEQ ID NO: 20, e internos: SEQ ID NO: 21 y SEQ ID NO:
22, generándose un fragmento de ADN de 842 pb que se digirió con
BamHI y XmaI y se clonó en
pSFV-S2-9-pac
digerido con los mismos enzimas, obteniéndose de esta forma el
plásmido
pSFV-S2-9-pac2A. La
PCR cruzada se hizo con el doble objetivo de introducir la secuencia
2A-XmaI en el extremo 3' del gen pac y
simultáneamente eliminar un sitio XmaI presente en el interior de
ese gen.
Finalmente para generar
pSFV-S2-9-pac2A-CTr
se sintetizó un fragmento de PCR de 645 pb que contenía el gen de
la cardiotrofina de rata a partir del plásmido
pRSET-CTr (36), utilizando los oligonucleótidos:
SEQ ID NO: 23 y SEQ ID NO: 24, que hibridan con el comienzo y el
final del gen de CTr respectivamente y contienen sitios XmaI en los
extremos para facilitar el clonaje. El fragmento de PCR se digirió
con XmaI y se clonó en el sitio XmaI de
pSFV-S2-9-pac2A,
obteniéndose el plásmido pSFV-S2-9-
pac2A-CTr.
El ARN de cada plásmido sintetizado in
vitro (ejemplo 17) se electroporó en células
BHK-21. A las 24 horas de la electroporación, se
añadió puromicina a 5 \mug/ml y, cuando las células seleccionadas
alcanzaron confluencia, se analizó la expresión de cardiotrofina en
los lisados celulares mediante inmunotransferencia con un anticuerpo
específico para cardiotrofina (Figura 15B).
Para los experimentos de análisis por
inmunotransferencia, se obtuvieron lisados de las células
BHK-21 transfectadas con los vectores de SFV
mediante incubación en un tampón que contenía Igepal al 1% (Sigma,
EE. UU.), Tris HC1 a 50 mM, pH 7,6, NaCl a 150 mM, EDTA a 2 mM y
PMSF a 1 \mug/ml (Sigma, St. Louis, EE. UU), se clarificaron por
centrifugación durante 6 minutos a 6000 rpm en una microcentrifuga
refrigerada y se cuantificaron mediante un análisis de Bradford. Los
lisados se analizaron mediante SDS-PAGE en geles de
poliacrilamida al 12%, se transfirieron a una membrana de
nitrocelulosa y se incubaron con un antisuero policlonal específico
contra cardiotrofina CT-1 murina (R&D Systems) o
actina (Sigma, St. Louis, EE. UU.) como anticuerpos primarios,
respectivamente. Se utilizó un antisuero de cabra u oveja
especifico para inmunoglobulinas de rata o conejo, respectivamente,
conjugado con HRP como anticuerpo secundario. Las proteínas se
visualizaron utilizando Western Lightning Chemiluminiscence Reagent
Plus (Perkin Elmer Life Sciences, EE. UU.), de acuerdo con las
instrucciones del fabricante.
Para cuantificar los niveles de CTr se
analizaron por inmunotransferencia diferentes cantidades de lisados
de las células que expresaban CTr y se compararon con cantidades
conocidas de cardiotrofina recombinante, utilizando par ello el
programa Imagequant TL (Amersham).
Los niveles de expresión de cardiotrofina en las
líneas generadas con cada uno de los vectores eran similares a los
obtenidos en células electroporadas con ARN del vector con la
replicasa silvestre SFV-CTr (figura 15B). La
expresión de CTr en las líneas seleccionadas era aproximadamente de
4,3 pg/célula. En las líneas generadas con el vector
SFV-S2-9-pac2A-CTr
se observó que la mayor parte de la CTr se había liberado de la
proteína de fusión, aunque había una fracción no digerida que
también se detectaba por inmunotransferencia.
Para valorar la estabilidad del vector en las
células transfectadas se realizaron diez pases sucesivos de las
células que lo contenían, en presencia de puromicina durante un
periodo de unos 20 días. Se determinó la expresión de CTr en cada
pase en lisados celulares mediante inmunotransferencia, y se
observó que la expresión de la CTr se mantenía estable en todos los
pases (Figura 16).
\newpage
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<120> USO DE UN VECTOR VIRAL MUTADO PARA
LA GENERACIÓN IN VITRO DE LÍNEAS CELULARES ESTABLES
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<130> FIMA06022
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<160> 24
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<170> PatentIn version 3.3
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 1
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 7382
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Semliki Forest virus
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> 5'UTR
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)..(86)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Extremo 5' UTR no traducido que
incluye las secuencias necesarias para la replicación
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> misc_feature
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (87)-(89)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Triplete de inicio de la traducción
de la replicasa
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> misc_feature
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (3642)..(3644)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Triplete correspondiente a la
mutación R649H
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> misc_feature
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (3849)..(3851)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Triplete correspondiente a la
mutación P718T
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> misc_feature
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (7351)..(7374)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Promotor subgenómico viral
solapado
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> misc_feature
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (7380)..(7382)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Triplete de terminación de la
traducción de la replicasa
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 1
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 2
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<211> 841
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
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<213> Semliki Forest virus
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> 3'UTR
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)..(841)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Extremo 3' no traducido de SFV que
incluye las secuencias necesarias para la replicación
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> misc_feature
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<222> (772)..(841)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Cola de
poli-adeninas (Poli A)
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 2
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\vskip0.400000\baselineskip
<210> 3
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<211> 21
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<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Cebador
SF3669-VS
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\vskip0.400000\baselineskip
<400> 3
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\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 4
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<211> 21
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<212> DNA
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<213> Artificial
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<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Cebador
SF4096-RS
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<400> 4
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\vskip1.000000\baselineskip
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<210> 5
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<211> 37
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<212> DNA
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<213> Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
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<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Cebador mutS2-VS
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<400> 5
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<210> 6
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<211> 38
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<212> DNA
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<213> Artificial
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<220>
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<223> Cebador mutS2-RS
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<400> 6
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<210> 7
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<211> 37
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<212> DNA
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<213> Artificial
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<220>
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<223> Cebador mutS3-VS
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<400> 7
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\newpage
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<210> 8
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<211> 38
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<212> DNA
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<213> Artificial
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<220>
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<223> Cebador mutS3-RS
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<400> 8
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<210> 9
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<212> DNA
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<213> Artificial
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<220>
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<223> Cebador
SF1947-VS
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<400> 9
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<210> 10
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<211> 71
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<212> DNA
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<213> Artificial
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<220>
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<223> Cebador
SF3623-S29-RS
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<400> 10
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<211> 34
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<212> DNA
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<213> Artificial
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<223> Cebador
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<400> 11
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<211> 35
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<212> DNA
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<213> Artificial
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<223> Cebador
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<211> 21
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<212> DNA
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<223> Cebador
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<210> 14
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<211> 51
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<212> DNA
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<213> Aphthovirus
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<400> 14
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<210> 15
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<211> 92
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<212> DNA
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<213> Artificial
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<223> Cebador
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<223> Cebador
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<223> Cebador
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<211> 91
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<211> 41
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<211> 40
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<212> DNA
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<223> Cebador
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<400> 24
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Claims (18)
1. Uso de vectores virales para la generación
in vitro de líneas celulares estables con capacidad de
expresar constitutivamente proteínas heterólogas donde dichos
vectores contienen un replicón del virus del Bosque de Semliki (SFV)
que codifica la enzima replicasa viral la cual comprende las
mutaciones P718T y R649H en la subunidad nsp2.
2. Uso de vectores virales, según las
reivindicación 1, donde la proteína heteróloga expresada de forma
constitutiva es la cardiotrofina 1.
3. Uso de vectores virales, según cualquiera de
las reivindicaciones anteriores, donde el replicón de SFV comprende
las secuencias SEQ ID NO: 1 y SEQ ID NO: 2, entre las cuales se
intercalan genes de selección y genes heterólogos.
4. Uso de vectores virales, según la
reivindicación 3, donde el gen heterólogo intercalado entre las
secuencias SEQ ID NO: 1 y SEQ ID NO: 2 es el gen que codifica la
proteína cardiotrofina 1.
5. Líneas celulares estables con capacidad de
expresar constitutivamente proteínas heterólogas,
caracterizadas porque son líneas celulares transfectadas con
vectores virales que contienen un replicón de SFV que codifica la
enzima replicasa viral la cual comprende las mutaciones P718T y
R649H en la subunidad nsp2.
6. Líneas celulares estables con capacidad de
expresar constitutivamente proteínas heterólogas, según la
reivindicación 5, donde la proteína heteróloga expresada de forma
constitutiva es la cardiotrofina 1.
7. Líneas celulares estables, según las
reivindicaciones 5 ó 6, donde las líneas celulares han sido
transfectadas con vectores virales que contienen un replicón de SFV
que comprende las secuencias SEQ ID NO: 1 y SEQ ID NO: 2, entre las
cuales se intercalan genes de selección y genes heterólogos.
8. Líneas celulares estables, según las
reivindicación 7, donde el gen heterólogo intercalado entre las
secuencias SEQ ID NO: 1 y SEQ ID NO: 2 es el gen que codifica la
proteína cardiotrofina 1.
9. Método para la generación in vitro de
líneas celulares estables con capacidad de sintetizar proteínas
heterólogas de forma constitutiva que comprende:
- I.
- transfectar células con vectores virales que contienen un replicón de SFV que codifica la enzima replicasa viral la cual comprende las mutaciones P718T y R649H en la subunidad nsp2;
- II.
- seleccionar las células estables generadas en el paso I; y
- III.
- crecer y mantener las células estables.
10. Método, según la reivindicación 9, donde la
proteína heteróloga sintetizada de forma constitutiva es la
cardiotrofina 1.
11. Método para la generación in vitro de
líneas celulares estables, según las reivindicaciones 9 ó 10, donde
las células son transfectadas con vectores virales que contienen un
replicón de SFV que comprende las secuencias SEQ ID NO: 1 y SEQ ID
NO: 2, entre las cuales se intercalan genes de selección y genes
heterólogos.
12. Método, según la reivindicación 11, donde el
gen heterólogo intercalado entre las secuencias SEQ ID NO: 1 y SEQ
ID NO: 2 es el gen que codifica para la proteína cardiotrofina
1.
13. Uso de líneas celulares estables, según
cualquiera de las reivindicaciones 5 a 8, para la producción in
vitro de proteínas recombinantes.
14. Uso de líneas celulares estables, según las
reivindicación 13, donde la proteína recombinante producida de
forma constitutiva es la cardiotrofina 1.
15. Método para la producción in vitro de
proteínas recombinantes que comprende:
- I.
- transfectar células con vectores virales que contienen un replicón de SFV que codifica la enzima replicasa viral la cual comprende las mutaciones P718T y R649H en la subunidad nsp2;
- II.
- seleccionar las células estables, generadas en el paso I;
- III.
- crecer y mantener las células estables; y
- IV.
- extraer la proteína.
\newpage
16. Método, según la reivindicación 15, donde la
proteína recombinante sintetizada de forma constitutiva es la
cardiotrofina 1.
17. Método para la producción in vitro de
proteínas recombinantes, según la reivindicaciones 15 ó 16, donde
las células son transfectadas con vectores virales que contienen un
replicón de SFV que comprende las secuencias SEQ ID NO: 1 y SEQ ID
NO: 2, entre las cuales se intercalan genes de selección y genes
heterólogos.
18. Método según la reivindicación 17 donde el
gen heterólogo intercalado entre las secuencias SEQ ID NO: 1 y SEQ
ID NO: 2 es el gen de la cardiotrofina 1.
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